Haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae
Haemophilus son bacterias Gram negativas pleomorficas. pleomorficas. H. influenzae tipo b es un patgeno importante para el hombre. hombre. encuentra sobre las mucosas del aparato respiratorio superior. superior.
Se El Los

Es causa importante de meningitis en nios y puede producir infecciones del aparato respiratorio en nios y adultos. adultos. En cultivos jvenes sobre medio enriquecido poseen una cpsula definida, pero tienen tendencia a perderla. perderla. Se cultivan en caldo BHI adicionado de sangre, en 24h se desarrollan colonias pequeas, 24h convexas , iridiscencia. iridiscencia.

No hemoltico Necesita de factores de crecimiento, factor X (hemina), factor V (NAD). (NAD). Fermentacin poca e irregular de carbohidratos. carbohidratos. Resistentes a ampicilina y cloranfenicol controlado por genes codificados en plasmidos transferibles. transferibles.

H. influenzae encapsulados tiene seis tipos polisacridos capsulares ( (a-f)) (a-

de

El antigeno capsular tipo b es fosfato de polirribosarribitol (PRP). (PRP). La mayora en la flora normal del aparato respiratorio son no encapsulados. encapsulados. Contienen protenas de membrana externa .

Phenotypic variation in Haemophilus influenzerae: influenzerae: The interrlationship of colony opacity, capsule and lipopolysaccharide. R. Jhon Roche and E. Richard Moxon.
Molecular infectious diseases group, Department of paediatrics, institute of molecular medicine, Jhon Radcliffe hospital, Headington, Oxford OX3 9DU, U. K.

Microbial pathogenesis 1995

INTRODUCCIN


El Haemophilus influenzae serotipo b causa enfermedades como meningitis, septicemia, neumona en infantes y nios jvenes, epiglotitis en nios y adultos. adultos. Cepas de H. influenzae no tipificable que no expresan cpsula de polisacridos son causa importante de otitis media Muchas vacunas disponibles generan inmunidad a la cpsula serotipo b

La expresin de la cpsula de fosfato de polirribosarribitol (PRP) es un determinante importante en la virulencia H. influenzae tipificable y no tipificable expresan un LPS variable que tambin es un determinante en la virulencia. virulencia. Poseen una expresin variable de epitopes especficos de oligosacaridos de LPS

La variacin en la opacidad de las colonias se atribuye a una variacin en las cepas Fuju de H. influenzae. influenzae. Se aisl una cepa llamado Eagan en la cual se demostr que las diferencias en el fenotipo de la opacidad de la colonia esta influenciada por factores ambientales dentro del husped. husped. Se realizaron estudios sobre adherencia a nasofaringe con cepas traslucidas y opacas y se encontraron diferentes hallazgos. hallazgos.

Los organismos encontrados en sangre se demostr que provenan de colonias opacas. opacas.

Se demostr que cepas opacas y traslucidas demostraron diferencias sutiles en la electroforesis (TSDS-PAGE) (TSDS-

OBJETIVOS.


Investigar la correlacin entre cpsula, LPS y fenotipos de opacidad en H. influenzae. influenzae. Determinar la resistencia al suero por parte de colonias opacas y traslcidas. traslcidas. Relacionar la importancia del PRP como factor determinante en la virulencia del Haemophilus influenzae. influenzae.

MATERIALES Y MTODOS.
1. BACTERIA Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO:  Cepas Rd H. influenzae son deficientes de capsula ( mutantes de la cepa H. influenzae tipo d y de la cepa transformante Rd: b+: 01 tipo b).  Cepa RM7004 es un serotipo b encapsulado aislado en clnica.  Cepa Eagan es un serotipo b aislado en clnica.

Cepa Rd: b+: 01 lic2 es una cepa mutante a la cual inserto el gen lic2(kan) se realizo usando plasmidos de DNA. Estas cepas fueron cultivadas en BHI suplementado (Factores V y X ) .

2. Sensibilidad de los organismos de colonias translucidas y opacas frente al suero: suero:



Las colonias fueron observadas por su fenotipo opaco y tambin observadas directamente usando luz oblicua transmitida y usando microscopio. microscopio. Las colonias fueron dispersadas y diluidas a una concentracin de 104 org/mL en fosfato bufferado salino-B (PBS-B) (0.5mM CaCl2, salino(PBS0.5mM MgCl2 y 0.1% albmina srica bovina). bovina). Suero humano fue obtenido de 4 voluntarios con exposicin previa con H. influenzae. influenzae.

La sangre fue congelada y la fraccin de suero fue obtenida a 0 C y las alcuotas fueron almacenadas a -70 C para su uso. 70 uso. Los organismos fueron incubados a una concentracin de 104/mL en PBS-B con 20% PBS20% suero, 1 h a 37 C, despus de la incubacin se 37 tomaron alcuotas de 50uL que fueron inoculadas 50uL en BHIs. BHIs. El suero que fue calentado a 56 C fue usado 56 como control negativo. negativo. El numero de unidades formadoras de colonias fue registrado luego de 18 h de incubacin a 37 37 C.

RESULTADOS.
Suero de individuos Colonia opaca Colonia translucida Muerte del 15% (SD 10 %) Muerte 45% (SD 2.2 %)

Opacidad de la colonia y resistencia al suero

41% opaca

Rd: b+: Rd: b+: 01

Px

Fig. 1

59% translucidas
Cultivo en sBHI

Se hall cambio en la generacin de bacterias en 2% en ambas direcciones

Fig. Fig. 1, Light photomicrographs of colonies from (A and B): B): Rd:b+:01, Rd:b+:01, showing opaque-translucent opaquecolony differences

Fig. Fig. 1, Light photomicrographs of colonies from (A and B): B): Rd:b+:01, Rd:b+:01, showing opaque-translucent opaquecolony differences

Fig. 1, Light photomicrographs of colonies from Rd, showing constitutively translucent colonies.

3. Cuantificacin de PRP en variantes opacas y translucidas por ELISA:  Colonias opacas y translucidas fueron inoculadas en BHIs y crecieron en fase logartmica.  Muestras de estos cultivos fueron diluidas y nuevamente sembradas en BHIs para confirmar la estabilidad del fenotipo opaco y se contaron las CFU/mL  Los casos que fueron resembrados y cambiaron de fenotipo fue del 1.6 y 2.2%

1 mL de alcuota de cada uno de los cultivos. Sobrenadante se llevo a tubos individuales.

Los Pellets celulares fueron resuspendidos 1mL PBS Y las clulas fueron lisadas para que liberaran el PRP.

Muestras fueron diluidas a un factor 103 y el contenido PRP fue analizado por la prueba de ELISA.

Fig. 2

Padres de Rd: b+: 01 (deficientes de cpsula)

Px

Colonias translucidas

Para comprobar si esta cualidad de opacidad se relacionaba directamente con la produccin de la capsula, se crearon mutantes acapsulados.
Solo colonias translucidas, constitutivamente como Rd.
Px

ANTICUERPOS MONOCLONALES. Mab 7E7 es un Ac tipo IgG3 los cuales se incrementan con el LPS en una infeccin por H. aegyptius. Mabs 4C4, 6 A2, 5G8 y 12D9 reconocen diferentes eptopes de superficie expuestos en el LPS de la cepa DL42 de H. influenzae. Este estudio demuestra que el cambio de colonia opaca y translcida se relaciona mayormente con la variacin de la cpsula y no con la influencia del LPS.

DISCUSIN.


La cepa Eagan del Haemophilus influenzae presenta colonias tipo O y T. Cepa Rd: b+: 01 produce colonias tipo O y T Rd: b+: que exhiben cambios variante O es mas resistente al suero Que la T. Asociacin entre cpsula y la resistencia al suero. suero. Cpsula: Cpsula: Principal candidato como productor de opacidad. opacidad.

Se compar la cantidad de PRP de colonias O y T : Colonias O: Contienen mas PRP. Colonias T: Liberar mas PRP al sobrenadante. Cepas Rd: b+: O1 Eagan, RM7004. Relacin entre el LPS: LPS: Colonias O: LPS bajo peso molecular. Colonias T: LPS alto peso molecular.

Relacin entre la cpsula y el LPS: Comprende mas microorganismos

Cepas capsuladas tipo O: Rd: b+: O RM7004 Eagan

Expresan LPS de Bajo peso molecular

Cepas no capsuladas tipo T: Rd: b+: 01 RM7004 Eagan

Expresan LPS de alto peso molecular

Proceso del Haemophilus influenzae cpsulado para producir meningitis: Colonizacin a la nasofaringe, paso a travs de las barreras epiteliales y endoteliales, supervivencia en la sangre, paso barrera hemato-enceflica.

Es razonable que el microorganismo desarrolle estrategias de supervivencia para cada una de estas fases. fases. Weiser: Weiser: Encontr un incremento de las variantes T a colonizar la nasofaringe, pero estas son sensibles al suero mientras que las variantes O eran sero-resistentes. sero-resistentes.

Resistencia al suero de las variantes O: Relaciona con la alta proporcin de PRP y expresin de LPS de bajo peso molecular. molecular. Existe una interrelacin entre la cpsula y el LPS que llevan a cambios en la variedad del repertorio de la bacteria pero sin la prdida sustancial de las molculas de este repertorio. repertorio.