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Biotechnology Department, Chemical faculty The Autonomous Coahuila State University Saltillo Coahuila Mex e-mail: jrodrigu@mail.uadec.mx
Biocatalysis
In the living and animals thousand of catalytic processes go on between the tissues and the fluids, and produce the amount of dissimilar chemical syntheses for whose formation from the common raw material
En el mundo verde, en seres vivos y tejidos ocurren miles de procesos catalticos, que realizan una gran cantidad de diferentes rutas de sntesis a partir de un mismo material inicial Berzelius, 1836
Biocatalysis
Globular proteins
Catalytic antibodies
Biofilms caracterization
Biocatalysis milestones
Effective methods for enzyme and protein production (from lab to industry scale) Kinetics and mechanisms of action Industrial biocatalysis Genetic engineering of enzymes, site specific mutagenesis DNA polymerase: methods for gene amplification Structure (sequence and 3D) of proteins and enzymes active sites Methods for enzyme immobilization and stabilization, enzymes in organic solvents Directed evolution Bioinformatics and molecular modeling
Organophosphate hydrolase
His55 His57
O NH O N K s +
Asp301
His55 NH
NH Lys169
C H 2O
S
His230
NH Lys169
k2
His230
His201
O2
(EtO ) 2 P
+ O
- O (C 6 H 4 )N O 2
H B H O H R A BH+ HO R A
R COO R
NH + OH
+ OH + H
Mg
2+
Mg
2+
+ OH + H
Biocatalytic technology
Industrial biocatalysis
- Food and meals production - Detergents - Medicine and pharmacy - Environment biotechnology and bioremediation - Fine organic synthesis - Analysis - Energy conversion systems
FUNDAMENTOS DE ENZIMOLOGIA Las enzimas son catalizadores de naturaleza proteica, por lo tanto para la explicacin de los detalles del mecanismo de accin es necesario conocer la qumica de estas, as como las particularidades de catalizar reacciones. Los organismos vivos pueden existir solamente gracias a su asombrosa capacidad de controlar cinticamente las reacciones qumicas y de esta manera tender alcanzar el equilibrio termodinmico. Un papel no menos importante en sta funcin, lo juegan los catalizadores biolgicos (enzimas); las cuales concuerdan en cantidad aproximadamente con el nmero de reacciones bioqumicas conocidas.
CLASIFICACIN DE LAS ENZIMAS DE ACUERDO CON LA UNIN INTERNACIONAL DE BIOQUMICA OXIDORREDUCTASAS. Enzimas que catalizan las reacciones de oxidacin y reduccin. TRANSFERASAS. Enzimas que catalizan reacciones de transporte de grupos funcionales. HIDROLASAS. Enzimas que catalizan reacciones de hidrlisis. LIASAS. Enzimas que catalizan reacciones de adicin de grupos funcionales a enlaces qumicos insaturados o lo contrario desprendimiento de grupos funcionales con la formacin de dobles ligaduras. ISOMERASAS. Enzimas que catalizan reacciones de isomerizacin. LIGASAS. Enzimas que catalizan reacciones de condensacin de dos molculas, enlaces conjugados con el rompimiento del enlace pirofosfato en la molculas de ATP.
Comparacin de velocidades relativas de la catlisis enzimtica VE y no enzimtica Vo Fuente: Koshland D., Jr., J. Cell. Comp. Physiol., 47 suppl. 1- 217 (1956).
ENZIMA SUSTRATO VE/vO
glucosa 3.10-3 M ATP 2.10-3 Etanol (4.10-2) Creatinino (2.10-2M ATP - (4.10-3 M)
Comparacin de corriente de velocidades de segundo orden para reacciones catalizadas. Fuente: Haidler k. J. The Chemical Kinetics of Enzyme Action. London, Oxford, Spirnger Verlog, 1969
REACCIN Y SUSTRATO CATALIZADOR CONSTANTE DE VELOCIDAD M-1 S-1 TEMPERATURA C
Hidrlisis de pptidos
Glicinglicina Carbobenzoxi-L-glutamilL-tirosina Carbobenzoxiglicil-Lfenilalanina
H3O+ Pepcina 1.1 0.8 3.104 10-6 54 32
Carboxipetidasa
25
Hidrlisis de la Urea
Urea
H3O+ ureasa H3O+ OH quimotropsina 7.4 5.0 10-7 10 6 10-6 10-6 14.9 62 21
Hidrlisis de amidas
Benzamidas Amid N - benzoil-L-tirosina
2.4 8.5 52 53 25
1/2 Cistena
CyS
Triptofano
Trp
Esta estructura proteica es condicionada por enlaces covalentes, en este caso no nos referimos solamente a los enlace peptdico que une un aminocido con otro, si no tambin los enlaces disulfuro si se tienen, como es el caso dos residuos de cistena, un ejemplo es el caso de la lisozima compuesta de 1 9 aminocidos que cuenta con cuatro sitios de enlaces disulfuro en la molcula.
Estructura primaria
Estructura secundaria En la naturaleza, la estructura secundaria que ms se encuentra es la E espiral que se origina por la interaccin de grupos funcionales para formar los puentes de hidrgeno
O ........................................................ H N H H R
n
N O
En E espiral las lneas punteadas representan los puntos donde se genera el puente de hidrgeno generalmente en cada significado de n = 3
Estructura F antiparalela
Estructura terciaria. Esta cadena polipeptdica en forma compacta tridimensional (en el las enzimas, sta estructura es generada por un buen numero de enlaces tal como se explica en la figura 6
Tyr Val
Asp
Leu
Estructura cuaternaria. Esta se presenta cundo la macromolcula proteica tiene mas de una cadena polipeptdica y no estn unidas entre si por enlaces covalentes sino solamente por los enlaces arriba mencionados figura 7
En muchas enzimas no se encuentran grupos proteicos en su composicin y en sus centros activos, solamente entran grupos bsicos o cidos de residuos de aminocidos que son residuos de las cadenas polipeptdicas de la protena de un conjunto de sustituyentes de aminocidos proteicos en las enzimas estudiadas, los que tienen ms significado son: 1) grupo imidazol de la histidina ( is); 2) grupo carboxlico del cido asprtico, cido glutmico y 3) S grupo de la cistina (Cis). El Imidazol en una solucin de p 7 se encuentra en forma no protonada y es una base fuerte de Lewis. Imidazol es considerado como una sustancia anftera porque es capaz de atrapar como desprenderse de un protn.
C C C
base + +
cido +
ECUACIN DE MICHAELIS-MENTEN
were pioneers in enzyme kinetics
S+E
KS
[ES]
K2
P+E
?E A?S A v ! K 2 ?ES A
?E A0 ! ?ES A ?E A
K 2 ?E A0 ?S A v! K s ?S A
v { f S
Vmax ! K 2 ?E A0
S+E k1 K-1 [ES] K2 P+E
v =1/2Vmax
v ! f ?E A0
v ! f ?S A
KM = [S]
k1 K-1
[ES]
k2 K-2
P+E
d ?P A ! K 2 ?ES A dt
?E A?S A
?E A0 ! ?ES A ?E A
k1>k-2
[ES]
d ?ES A ! k1 ?E A?S A k 1 k 2 ES A ? ; dt
? ?ES A! k EkA0 ?S A 2 1 ?S A
k1
k 2 ?E A ?S A 0 v! k 2 k 1 ?S A k1 KM ! k 2 k 1 k ;@ K M ! K S 2 k1 k1
si, k 1 k 2 , entonces , K M ! K S
KM>KS
INTERPRETACIN DE LOS PARAMETROS CINTICOS EN UNA REACCIN CON UN SOLO SUSTRATO EN EL MECANISMO DE MICHAELIS-MENTEN S+E KS [ES] Kcat P + E Esquema I
v!
k 2 ?E A ?S A 0 K M ?S A
Inicialmente se forma el complejo ES en forma rpida y reversiblemente, adems no o va acompaado de ningn cambio qumico, la asociacin de la E con el S Es gracias a fuerzas de naturaleza fsica, en la segunda etapa ocurre un proceso qumico, que se caracteriza por una constante de velocidad de primer rden kcat (numero de vueltas).
Ks !
?E A?S A ! K ; k k ?ES A M 2 1
S+E
Entonces, entre menor es el significado de KM, mayor es la concentracin de la partcula [ES] Ks ES K ES K ES K4 PE Esquema II
KM y kcat son la combinacin de diferentes constantes de velocidad y una constante de equilibrio, particularmente cuando se forman mas de una partcula intermedia.
[ES] = k [ES],
[ES] = k [ES]
KS KM ! d 1 K KK d d k 4 KK d kcat ! d 1 K KK d
KS KM ! d 1 K KK d d k 4 KK d kcat ! 1 K KK
[ES]
k2
P+E
Cuando se tiene un solo complejo de ES y todas las dems etapas son lo suficientemente rpida, entonces kcat es una constante de velocidad de reaccin de primer orden de la trasformacin qumica del complejo ES en EP, en casos mas complicados kcat es una funcin de todas las constantes de primer orden y cuando el complejo EP se disocia lo suficiente mente rpido tambin kcat = k2 sin embargo s la constante de disociacin del complejo EP surge lentamente, entonces la constante de velocidad de este proceso adquiere el carcter de kcat, en este ltimo caso la velocidad de disociacin de la partcula EP es considerablemente menor que la etapa qumica y la kcat ser igual a la constante de velocidad de disociacin de la partcula EP
Del esquema II, se aprecia que en este caso kcat es una funcin de las constantes K2,K3 y k4,,sin embargo, si alguna de las constantes es menor que las demas, entonces Kcat ser igual a la constante de menor valor; por ejemplo si k4<k3<k2, entonces Kcat = k4, de esto se concluye que la constante kcat nunca ser mayor a una constante de primer orden
Con frecuencia al parmetro de kcat se le llama el numero de vueltas de la enzima Debido a que este determina el numero mximo de molculas de sustrato que se trasforman en producto por un sitio activo en una unidad de tiempo
Sentido de la KM:
Independientemente que KM es igual a la Ks, que es la constante real de disociacin Del complejo ES, solamente para el mecanismo simple propuesto Michaelis y Menten En la solucin de problemas determinados a KM se le puede ver como una constante Aparente de disociacin, por ejemplo a la concentracin de la enzima libre se le puede Determinar de la siguiente ecuacin: A la suma de la concentracin de todas las formas ?E A?S A Donde ?ES A! Que contienen enzima KM !
?ES A
KM es una medida de la cantidad de enzima unida de una forma u otra unida al sustrato Esto se ilustra con el siguiente esquema.
KS E S np ES k 2 ES `' k3 E P p p
Utilizando las condiciones estacionarias para el complejo [ES]`obtenemos: V1 = k2[ES] y v2 = k3[ES]` y k2[ES] = k3[ES]
Las velocidades de la reaccin se pueden obtener con la ayuda de los mtodos concurrentes de la cintica estacionaria o de la ecuacin de Michaelis-Menten; pero si a nosotros nos interesa la relacin de las velocidades, entonces se puede utilizar la siguiente y sencilla expresin:
[EB [B [E]
k P1 + E p
b
VB ! K B ?EB A
V A ! K A [EA]
p [EA] A P2 + E
k
[ ]
[ EB ] !
[ E ][ B ] KM
Donde
V A ! K A [EA]
[ EA] !
[ E ][ A] KM
KM } KS
KB dB ! VB ! K dt M
[ E ][ B ] !
KB KM KA KM
KA dA ! VA ! K dt M [ B ] [ A]
[ E ][ A]
VB VA
La especificidad de la Enzima con respecto a los sustratos concurrentes, s e puede apreciar que la eleccin de la Enzima por uno de los concurrentes, es determinada solamente por el factor la relacin
KC T KM Importante resaltar que la relacin kcat/KM consiste en que esta une la velocidad de la reaccin Con la concentracin de la enzima libre y no con la concentracin general, esto se puede Apreciar, cuando se tienen bajas concentraciones de sustrato [S], cuando [S]<<KM; bajo Esta condicin la enzima ventajosamente se encuentra en estado libre [E] [E]0, por lo tanto la velocidad de la reaccin ser igual: v = [E] [S](kcat/KM), esta ecuacin es justa para cualquier concentracin de sustrato
La relacin kcat/KM es una constante de velocidad aparente de segundo orden y refleja el limite mnimo para constante de la velocidad con la que se une la enzima con el sustrato
K 2 ?E Ao ?S A V! K 2 K 1 ?S A K1
K 2 K 1 ! K M @ K 2 ?E A0 ! VMAX . K1
Edy Hofstee o Augustinsson
LINEAWEAVER - BURK Invirtiendo la ecuacin de la velocidad dada como una funcin de (S) obtenemos la siguiente forma lineal )
v v! f( ) ?s A
K 1 1 1 ! M y V VMAX VMAX ?S A
v( K M ?S A ! Vmax ?S A )
KM v v ! VMAX ?S A
v ! VMAX K M
1 v
v ?s A
v
KM tg E ! VMAX
= 1/Vmax 1/[S]
Vmax
E
- tgE = -KM
VMAX KM
(1/KM)
v [S ]
INHIBICION
Adems de la inactivacin de las enzimas por calentamiento o bajo la accin de reactivos qumicos, tambin puede ocurrir inhibicin reversible en el transcurso de unin no covalente, para esto se diferencian 4 tipos de inhibicin: Inhibicin concurrente. Si el inhibidor [I] se une con el centro o sitio activo de la enzima y obstaculiza la unin del sustrato [S] o en forma inversa [I] y [S] entran en concurrencia por el sitio activo
K S E np ES Kp E P
S CAT
I Ki EI
[ E ][ I ] KI ! IE
[ EI ] !
[E]0= [ES] +
[ E ][ I ] KI
+ [E]
[ E ]0 [ ES ] [E] = [I ] 1 KI
[ S ][ E ]O ES ! K I K1 [ S ] K 2 K 1 [ I ]( K 2 K 1 )
V = KCAT[ES]
K CAT K I K 1[ S ][ E ]0 V! K I ( K1 [ S ] K 2 K 1 ) [ I ]( K 2 K 1 )
V!
K 2 K 1 ! KM K1
K CAT } K 2
K CAT K I [ S ][ E ] K 2 K 1 K K 1 K I [ I ] 2 K I [S ] K K1 1
K CAT K I [ S ][ E ]O V! K I [S ] K M (K I I )
V!
K CAT [ S ][ E ]O [I ] [ S ] K M (1 ) KI
K M [I ] 1 1 1 ! V VMAX VMAX [ S ] KI
K M [I ] 1 1 1 ! V VMAX VMAX [ S ] KI
1 V
Aumenta
[I]0
K tg E ! M E VMAX
1 VMAX
[I ] K M K M 1 ! V V KI MAX MAX
[I ] K I
KM
1 [S ]
de esta manera se concluye que tg E crece con el aumento de la concentracin del [I] as es que para una reaccin de este tipo, se vern las siguientes curvas en el sistena de coordenadasde lineaweaver - urk :
Mtodos de anlisis
[I]o
INFLUENCIA DE EFECTOS REVERSIBLES (INHIBIDORES Y ACTIVADORES) SOBRE LA CINETICA DE ACCIN DE LAS ENZIMAS) La influencia de un efecto que acta reversiblemente () sobre una reaccin enzimtica de 2 etapa puede ser representado por el siguiente esquema, si suponemos, que el efecto forma un complejo con la enzima ( la enzima con el sustrato) en un correlacin de 1:1
K E S np ES K E P p
S 2
KEfector
s
E KEfector
2
Para la velocidad inicial de la reaccin enzimtica a un [S]0,[]>>[E]o con el equilibrio establecido es justo la siguiente expresin de la velocidad:
K2
EK Efector [ Efector ]
[ E ]0 [ S ]0
La ecuacin de la velocidad, que describe todas las opciones que pueden dar la interaccin de la Enzima con el sustrato y otras partculas, que pueden ser inhibidores o activadores, depender mucho del significado de E y
En la dependencia del significado de los coeficientes E y F relacionado con la participacin del efector [Efector], este puede participar, ya sea como inhibidor (I) activador (A promotor) de la reaccin enzimtica. INHIBICIN CONCURRENTE COMPLETA (E p g; F no tiene un significado determinado). En el caso de inhibicin completa, concurrente, la velocidad inicial de la reaccin enzimtica se determina por la siguiente expresin (E p ; F
EK i F [ I ] [ E ]0 [ S ]0 EK i [ I ] v! K i [I ] EK S [ S ]0 EK i [ I ] K2
EK i F ?I A !1 EK i ?I A
EK i E ?I A ?I A ! K S 1 KS EK ?I A Ki i
K [ E ] [ S ]o V! [I ] [S ] Ks Ki
Y en el sistema de coordenadas de lneas de lineaweaver - Burk , esta ecuacin tiene significado de un puado de lneas rectas que intersectan un mismo punto al eje de ordenadas La constante de inhibicin concurrente Ki, se puede determinar, sabiendo el valor de la magnitud de: KM(aparente)
K M ( aparente ]
[I ] ! K s 1 Ki
EK i F [ I ] [ E ]0 [ S ]0 EK i [ I ] v! K [I ] EK S i [ S ]0 EK i [ I ] K2
EK i F ?I A !1 EK i ?I A
KM
TangE ! Ks
Ks Ki
EK i E ?I A ?I A KS EK ?I A ! K S 1 K i i
[ I]
K M ( aparente ]
K M ( aparente )
[I ] ! K s 1 Ki
KS ! KS ?I A
Ki
1 V
Aumenta
[I]0
[I ] K M K M 1 ! V V KI MAX MAX [I ] K I
tg E !
1 VMAX
KM VMAX
KM
1 [S ]
K M [I ] 1 1 1 ! V VMAX VMAX [ S ] KI
K 2 [ E ]0 [ S ]o V! [I ] [ S ]0 K s 1 Ki
Inhibicin no concurrente completa (E = 1, F = 0). En el caso de la inhibicin no concurrente completa, la expresin para la velocidad inicial de la reaccin enzimtica tiene la siguiente ecuacin:
K2 v!
EK i F [ I no competitivo ]
La ecuacin en el sistema de coordinadas de lnea LINEAWEAVER - BURK, se refleja como un puado de lneas rectas, que se intersectan en un mismo punto en el eje de las obsisas. La constante de inhibicin no concurrente se puede determinar conociendo la magnitud
1 K 2 K i K 2 F I no co
K CAT !
K2 [I ] 1 Ki
Ki
1 ,[ I ] K CAT
? 1
I 1 K i ? noco
A!
K2Ki K i I no co
A
K2 I no co
p
A
1 K cat
Ks [ E ]0 [ S ]0 [I ] 1 Ki v! K S [ S ]0
Tg E = K2 [ I]
1 K2Ki
INHIBICION SIN CONCURRENCIA En el caso inhibicin sin concurrencia, los significados de las constantes KCAT y KM (aparte) de la reaccin enzimtica con el aumento de la concentracin del efecto disminuye en igual orden, por que E ! F 1
K2
EK Efector F [ Efector ]
[ E ]0 [ S ] 0
K i [I ] [ E ]0 [ S ]0 EK i [ I ] v! K i [I ] EK S [ S ]0 EK i [ I ] EK 2
Las grficas obtenidas para este caso en un sistema de coordinado de Lneaweaver-Burk, se observaron como una familia de lneas rectas en forma paralela
K CAT
Ki [I ] ! EK 2 EK i [ I ]
1 V
1 K CAT 1 K2
EK i 1 1 y E 1 E 1 [I ]
K cat 1 K2
TgE !
EK i E 1
1 E 1
1 S
1 ?I A
independientemente uno del otro, con el sitio activo, formado un complejo de tres componentes
(E - S -
?E A0
v
1 2
K2
1 KS
1 K2
4 5
v!
K A F [ A] [ E ]0 [ S ] 0 K A [ A] K S [ S ]0
K CAT ! K 2
K A F [ A] K A [ A]
1 KCAT 1 K2
KA 1 1 ! y F 1 F 1 [ A]
1 K cat 1 K2
Tang E ! KA F 1
1 ?S A0
1 F 1
1 ?AA
ACTIVACIN SINERGETICA
(E < 1, F = 1). En algunos casos la adicin de un activador no influye sobre la magnitud de la constante KCAT, pero conduce a la disminucin de la constante aparente de Michaelis - Menten, de la reaccin enzimtica (fig. 77). En el empleo del esquema general (I) y la ecuacin (1), esto corresponde al caso de activacin, la cual se le puede llamar Sinergtica, debido a que la unin del activador con el sitio activo de la enzima aumenta la afinidad de la enzima hacia el sustrato y lo contrario el complejo se une al activador ms efectivamente que con la enzima libre, para este caso (E < 1, F = 1), de est manera, en este caso el esquema (I) se puede escribir de la siguiente forma
1 v
1 2 3
1 S
K E S np ES K E P p
S 2
KA
[A]
s
E
2
KA
EK AE S np AES K p AE P
v !
K S [ E ]0 [ S ]0 K A [A] EK S [S ]0 EK A [A]
Para la determinacin de los parmetros cinticos y de equilibrio de la ecuacin (10), la expresin para la constante de Michalis - Menten aparente es la siguiente:
K M ! EK 2
K A [ A] EK A [ A]
1
La ecuacin (11) puede transformar y obtener la siguiente:
1
Acomodando el significado obtenido experimentalmente, se puede obtener el significado de (E y KA). 1 1 , [ A] K CAT K 1 2
K M ( aparente ) Ks
EK A 1 1 y 1 E 1 E [ A]
1 KM 1 KS
tg E !
1 1E
EK A 1E
1 ?A A
E S n pES pE P
E E AE SnK pAESK pAE P
s 2
KS
K2
EK 2
v!
EK A [ A] K A [ A] [ S ]0 EK S EK A [ A]
[ E ]0 [ S ] 0
Para la determinacin del significado de las constantes E y KA, la expresin para las constantes de la ecuacin (13) se puede transformar obteniendo:
1 K (CAT ) K2 1
1 1 EK A y E 1 E 1 [ A]
1
1 v
1 2 3
K cat 1 K2 1 S
TangE !
1 E 1
EK A E 1
1 A
((E { 1, F {1)). En el caso de tipos combinados de inhibicin activacin, las grficas en las coordenadas de lneaweaver- urk, tiene el aspecto de un grupo de lneas rectas que corresponden a diferentes concentraciones del efecto, las cuales se interceptan en un punto en los cuadrantes, derecho superior, izquierdo izquierdo inferior (en la dependencia del significado numrico de E y F y correlacin entre ellas) como proviene de la ecuacin (1) las coordenadas del punto de interseccin siempre sern las siguientes:
1 1 F 1 ! y [ S ]0 Ks E F
posicin del punto en cual ocurre la interseccin del puado de lneas, las cuales corresponden a la funcin de
1 1 E 1 ! y v V F E
1 1 ! f [S ] V 0
1 , mM R
1
A diferentes concentraciones del efecto se determina solamente por los significados de las constantes E y F y no depende de la magnitud de KEfector (esquema I) De sta manera, la forma de la grfica en las coordenadas de Lineaweaver- urker, puede ser utilizada para determinar el tipo de influencia del efecto sobre la reaccin enzimtica y para valorar los intervalos de los valores de E y F (, ver [6]). En calidad de ilustracin de los tipos combinados de inhibicin y activacin de la reacciones enzimticas se pueden presentar los datos en la influencia de la adicin del n- utanol sobre la velocidad de hidrlisis de un Ester (fig. 79) E= 0.27, F= 0 y de un pptido (fig. 80, E= 0.2, F= 2.3) de sustrato para la carboxipeptidasa, F. as como la mencionada anticoncurrente (F = 0, Ki = g, EKi { g ) influencia del efecto sobre la catlisis de acetilcalinesterasa (fig. 81).
, seg
500
300
-20
20
40
60
1 , mM ?S A0
1
Figura 79
Figura 80
1 , mM R
1
Figura 81
1 2 3 4 1.0
, seg
200
1 R
3 1.5 2 1
100
5 0.5
-10
10
20
1 , mM ?S A0
1
20
40
60
80
1 , mM ?S A0
1
Resumiendo, sealaremos que el enfoque ms razonable en el anlisis de la influencia de los efectores sobre la cintica de accin enzimtica, consiste en que la ecuacin (1) es cmoda expresarla de forma siguiente:
v !
V [S ]0 [S ]0 ( aparente )
De esta manera, se pueden determinar las magnitudes efectivas de V y KM por el mtodo de Lineweaver urk y despus, analizar en forma individual la funcionalidad de stos parmetros en funcin de la concentracin de los efectores (ver los ejemplos de la fig. 79, 80 y 81). Con la ayuda de ste enfoque, es fcil descubrir y analizar casos ms complejos, cuando por ejemplo la enzima y el efector forman un complejo en correlaciones estequiomtricas ms altas que 1:1.
Unin de dos molculas de un inhibidor concurrente con el mismo sitio activo de la enzima
Esquema de la unin de dos molculas de un inhibidor concurrente con el sitio activo de una enzima, donde KM depende en forma no lineal de la concentracin cuadrtica del inhibidor
E S n K ES K E P p p
s 2
Ki K'i
[I]
Ecuacin para la velocidad de reaccin bajo los equilibrios establecidos y la condicin de: [S]0, [I]0 >> [E]0, puede representarse de la siguiente forma Si consideramos la ecuacin del balance de materia con respecto a la enzima [E]0 = [E] + [ES] + [EI]+ [IEI]; y las ecuaciones para las diferentes constantes de disociacin para cada uno de los complejos correspondientes tenemos
[I]
[IEI]
v!
K 2 [ E ]0 [ S ]0
[ I ] [ I ]2 [ S ]0 K s 1 Ki Ki Ki
Ks !
Ki !
[ E ][ S ] [ ES ]
[ E ][ I ] [ EI ] [ EI ][ I ] ' Ki ! [ IEI ]
1 1 K M ( aparente ) [I ] 1 ! K K K K' [I ] s i i i
1 [I ]
M ( aparente )
Ks
-Ki'
1
Tang E !
1 K i K i`
1/Ki
[I] El anlisis cintico de esta misma reaccin, se tambin representar de la siguiente manera: de la ecuacin se deduce la ecuacin:
Dividiendo ente [ I ] K s [I ] [ I ] [ I ]2 ambas partes de la 1 1 1 Ks 1 1 ! ! v v K V [ S ] 1 K ' ' ecuacin tenemos: [I ] i vi v V [ S ]0 K i K i K i i i 0 1 1 1 K s [I ] 1 1 1 ! v v K V [ S ] 1 K ' [ I ] vi v [I ] i i 0 i
En este sentido aumenta La concentracin de [S]0
Ks K iV [S ]0
TangE !
KS K i K i V ?S A0
[I]
Finalmente, la ecuacin
[ S ]0 1 1 K s [ I ] ! v v K V 1 K ' [I ] i i i
[ S ]0 1 1 [ I ] vi v
TangE !
[I]
-Ki'
Ks K iV
KS K i K i V
Mtodos cinticos de dos componentes de inhibicin reversible sobre las Reacciones enzimticas
Una informacin importante relacionada con la estructura del sitio activo de las enzimas, se puede lograr con la ayuda del mtodo de dos inhibidores competitivos reversibles, para esto es necesario introducir el concepto de inhibidores interdependientes y no interdependientes. Por definicin, los inhibidores no interdependientes, pueden al mismo tiempo (y independientemente) unirse con el sitio activo de la enzima, al mismo tiempo que los inhibidores interdependientes esto no se da, veamos el primer caso (INHIBIDORES COMPETITIVOS INTERDEPENDIENTES
EI 2
Ki' Ki
Esquema de dos etapas de una reaccin enzimtica en presencia de dos inhibidores competitivos interdependientes
k 2 [ E ]0 [ S ] V! K M ( ap .) [ S ]
velocidad inicial de las reacciones enzimticas con inhibicin competitiva interdependiente
K E S np ES k E P p
S 2
Resolviendo este esquema de acuerdo al mtodo de concentraciones estacionarias obtenemos los valores de KM (ap.) y KCAT para las velocidades iniciales de las reacciones enzimticas
v!
K 2 ?E A?S A ?I 1 A ?I 2 A K S 1 ! Ki Ki
EI
K M ( aparente )
Ks tg E ! KI
K M ( aparente )
[ I1 ] [ I 2 ] ! K s 1 ' ; K CAT ! k 2 KI K1
[I ] K s 1 2 K1 '
[ I1 ]
De esta manera, conociendo el significado de Ks de los experimentos efectuados en ausencia de inhibidores, se puede determinar las magnitudes de KI y KI' KM aparente en funcin de la concentracin del inhibidor [I1] cuando [I2] es constante en presencia de dos inhibidores competitivos interdependientes
INFLUENCIA DE INHBIDORES COMPETITIVOS NO INETRDEPENDIENTES SOBRE PARMETROS CINTICOS DE UNA REACCIN CATALIZADA POR ENZIMAS
EI 2
Ki
EI 1 I 2
' i
E Sn p ES p E P
Ki
EI 1
El anlisis de este esquema bajo condiciones de concentraciones estacionarias, obtenemos los valores de KM y KCAT
Ks
k2
K i'
V! k 2 [ E ]0 [ S ] K M ( ap ) [ S ]
Los significados de las cantidades de KI y KI' se pueden determinar al construir una grfica (KM;[I2]) igual como el caso anterior, solamente que la tg E del ngulo es como muestra la grfica. En este caso la tangente de la pendiente depende de la concentracin del segundo inhibidor y solamente despus se pueden definir los valores de KI y KI' de los puntos de interseccin
KM (ap)
[I1]
Ks tg E ! KI
[I 2 ] 1 KI '
K M ( ap )
[ I ] [ I ] ! K s 1 1 1 2 K I KI
-KI
K CAT ! K 2
K s (1
[I 2 ] KI '
La KM( en funcin de la concentracin de [I1] bajo [I2] constante en presencia de dos inhibidores competitivos no interdependientes
[ I1 ]
INFLUENCIA DE INHIBIDORES NO COMPETITIVOS INTERDEPENDIENTES SOBRE LOS PARMETROS CINTICOS DE REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS
EI 2 S m EI 2 S
KI' KI'
KCAT [ E]0 [S ] V! K M [S ]
Un tratamiento cintico del esquema que representa esta influencia nos conduce a obtener los parmetros cinticos bajo la presencia de dos inhibidores no competitivos interdependientes.
KS p E S np ES k2 E P
K CAT !
KI
KI
k2 [ I1 ] [I 2 ] 1 KI K I'
KS EI1 S np EI1S
K M ( ap ) ! K s
El anlisis grfico de la ecuacin es necesario efectuarlo en las coordenadas [1/KCAT, [I1]] semejante al tratamiento de la ecuacin (36). En este caso de la grfica que es semejante a la figura 1. Se pueden encontrar los valores de KI y KI'
1 K cat
?A
Aumenta I2
1 Ki K2
Tang E !
1 ?I 2 A 1 `1 K2 Ki
?I1 A
V !
INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIN DE INHIBIDORES NO COMPETITIVOS NO INTERDEPENDIENTES SOBRE LOS PARMETROS CINTICOS DE UNA REACCIN CATALIZADA POR ENZIMAS K [E ] [S ]
CAT 0
K M [S ]
EI
Ki KS
2 K n S p EI 2
S
`! i
"ESQUEMA DE DOS ETAPAS" En el tratamiento de este esquema bajo condiciones estacionarias encontramos la relacin de los parmetros cinticos de la reaccin:
EI1 I 2
ESI1I2
K
k2
K CAT !
K
`! i
E
KS
KS
k2 [ I ] [I 2 ] 1 1 1 1 K I KI K
cat
K M ( ap ) ! K s
ES p E P
Ki
EI 1
ESI 1
1 K cat
-KI
?A
1 ?I 2 A 1 `1 K2 Ki
Aumenta I2
1 Ki K2
La determinacin de los significados de Ki y KI' en este caso queden ser encontrados por el anlisis de la ecuacin 41 en el eje de las coordenadas (1/KCAT; [I1]), semejante al anlisis de la ecuacin 36 y la figura 2.
Tang E !
?I1 A