FIXAO BIOLGICA DO NITROGNIO

O ciclo do nitrognio

I- INTRODUO
O nitrognio o quarto elemento mais abundante nas plantas, superado apenas pelo carbono, oxignio e hidrognio. constituinte essencial de aminocidos, protenas, bases nitrogenadas, cidos nuclicos, hormnios e clorofila, entre outras molculas. A maioria das plantas obtm o nitrognio do solo sob a forma de on nitrato (NO3-), havendo algumas que o absorvem sob a forma de on amnio (NH4+).

O nitrognio pode ser um nutriente crtico para as plantas porque seu suprimento no solo limitado e, alm disso, ele tambm utilizado pelos microrganismos que habitam esse solo. Embora constitua quase 80% da atmosfera terrestre, o nitrognio gasoso, N2, quimicamente inerte a temperaturas comuns, e, diferentemente de outros elementos que ocorrem na natureza, suas reservas minerais so relativamente raras.

No entanto, os organismos eucariontes so incapazes de absorver o N2 e convert-lo a uma forma assimilvel.

Assim, o N2 move-se para dentro da planta atravs dos estmatos, saindo logo em seguida, sem que possa ser utilizado. Na natureza, somente um pequeno nmero de microrganismos, denominados diazotrficos ou fixadores de nitrognio, capaz de reduzir nitrognio atmosfrico a amnia.

II - Fixao industrial - temperaturas de 400-600oC - presses de 100-200 atm Reao:

N2 + 3 H2 ---> 2 NH3
Requer uma elevada energia de ativao.

III - A Fixao Biolgica Realizado pelo complexo protico nitrogenase, a enzima que catalisa a reao. da

Devido a presena de um sistema enzimtico, a reao pode ocorrer temperatura ambiente e presso atmosfrica. Reao:
N2 + 16 ATP + 8 e- + 8H+ ---> 2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi.

IV - ORGANISMOS FIXADORES DE NITROGNIO

Procariontes que possuem a enzima nitrogenase.

Os organismos fixadores podem ser:

-de vida livre

- viver em associaes

TABELA 1: Exemplos de organismos de vida livre fixadores de nitrognio.

Bactrias Autotrficas - Thiobacillus ferrooxidans - Rhodospirillum rubrum - Gloeothece, Oscillatoria, Plectonema, Anabaena, Nostoc Bactrias Heterotrficas - Clostridium pasteurianum - Klebsiella pneumoniae - Azotobacter vinelandii
Fonte: adaptado de Smith & Gallon, 1993.

- A fixao de nitrognio efetuada pelos organismos de vida livre est estimada em menos de 5 kg/ha/ano.
- Nesse grupo encontram-se bactrias autotrficas e heterotrficas, as quais distinguem-se quanto eficincia do processo de fixao.

- Destacam-se as cianobactrias ou cianofceas (Gloeothece, Oscillatoria, Plectonema, Anabaena, Nostoc) que realizam a fotossntese de uma maneira muito semelhante aos vegetais superiores, havendo a liberao de O2 e, a bactria Klebsiella pneumoniae, na qual foram identificados e estudados os primeiros genes nif.

- Os genes nif, aparentemente esto envolvidos com a sntese da nitrogenase.

- Os genes fix produzem as molculas que regulam o processo de fixao

considerada uma associao simbitica perfeita.

TABELA 2: Exemplos de organismos fixadores de nitrognio que formam associaes.

Procarionte Fixador
Rhizobiaceae Azorhizobium, Bradyrhizobium, Rhizobium Actinomycetales Frankia Cianobactrias Anabaena, Nostoc Azospirillum Beijirinckia Bacillus Azotobacter

Eucarionte Associado
Leguminosas Papilionoideae, Caesalpinioideae, Mimosoideae e Parasponia (Ulmaceae) Plantas Actinorrizas Elaeagnus, Myrica, Alnus, Casuarina Angiospermas (Gunnera), Gimnospermas (Macrozamia), Pteridfitas (Azolla), Brifitas (Sphagnum), Diatomceas (Rhizosolenia), Fungos (liquens) e Esponjas (Siphonochalina) Gramneas

Tabela 3. Hospedeiros de Rhizobium e Bradyrhtzobium

V- A SIMBIOSE COM AS GRAMNEAS

Milho, arroz e trigo - bactrias do gnero Azospirillum. Cana-de-acar - bactrias do gnero Beijirinckia Grama batatais (Paspalum notatum) Azotobacter paspali Determinados cultivares de trigo com espcies do gnero Bacillus.

VI- FIXAO SIMBITICA DE NITROGNIO EM LEGUMINOSAS

- O gnero Azorhizobium com o gnero Sesbania
-Bradyrhizobium japonicum com Glycine max (soja) - Rhizobium meliloti com Medicago sativa (alfafa) - Rhizobium leguminosarum biovar viciae com Vicia faba e com Pisum sativum (ervilha) - Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli com Phaseolus vulgaris (feijo).

- As bactrias vivem saprofiticamente no solo quando em liberdade.

- A presena de uma planta hospedeira percebida por sinais qumicos, principalmente pelos flavonides liberados pelas razes.

- Devido ao dos flavonides, as bactrias so atradas em direo s razes, por um quimiotaxismo positivo e, produzem um composto denominado Fator NOD (fator de nodulao). (Especificidade)

O Fator NOD responsvel, entre outras coisas, pelo reconhecimento entre bactria e planta hospedeira e pela induo de uma intensa diviso celular na crtex da raiz.

FIGURA 1: Incio da formao de ndulo radicular em uma planta leguminosa.

Figura 2: Assimilao do Nitrognio por organismo fixador do N2.

FORMAO DO NDULO
1) Liberao de flavonides pelas razes da planta 2) Quimotaxia do rizbio em direo superfcie das razes 3) Proliferao do rizbio na rizosfera e induo da diferenciao do primrdio do ndulo 4) Aderncia do rizbio s razes 5) Diferenciao do meristema secundrio do ndulo (conexo vascular) 6) Encurvamento do plo radicular e formao da via de infeco 7) Mltipla infeco das clulas do ndulo e crescimento do ndulo f) Crescimento do ndulo, diferenciao dos bacteriides, e comeo da fixao simbitica de N

Figura 3. Fases da formao da simbiose entre a planta e o rizbio.

Figura 4. Esquema mostrando as fases da infeco da raiz de uma planta pelo rizbio.

Figura 5. Formao do simbiossoma pelo englobamento do rizbio pela membrana plasmtica da clula hospedeira.

Figura 6. Tipos de infeco radicular: a- via plo radicula (soja)r; b-via emergncia de razes laterais(amendoim); c via epiderme intacta

CLULAS NO-FUNCIONAIS

Figura 7. Esquema da estrutura de ndulos de leguminosas determinado (A) e ideterminado (B): r- raiz; c-crtex; sv-sistema vascular; tc-tecido infectado; mameristema apical

SENSIBILIDADE DA ENZIMA NITROGENASE ALTAS CONCENTRAES DE OXIGNIO (O2) - estratgia anatmica: o parnquima do ndulo funciona como uma barreira de difuso do O2. Os espaos intercelulares so pequenos e pouco numerosos, podendo ser preenchidos com gua. Logo, a entrada de O2 no interior do ndulo muito dificultada. - estratgia bioqumica: as clulas vegetais da regio central do ndulo produzem a leghemoglobina (hemoglobina das leguminosas). Essa molcula um carregador de O2, que garante que os bacteriides recebam o O2 necessrio para sua respirao, evitando que o gs circule livremente no ndulo.

Figura 8. Estrutura geral da estrutura de um ndulo apresentando a localizao dos bacteriides e da barreira de excluso do oxignio

Figura 9. Estrutura geral e especfica de alguns compostos secretados pelas razes que induzem a quimiotaxia e a expresso dos genes nod em rizbio

Ndulos distribudos no sistema radicular (os maiores e mais prximos raiz principal so mais efetivos)

VII- A NITROGENASE E A REAO DE FIXAO DE NITROGNIO

Caracteriza-se pela reduo do N2 NH3

A nitrogenase formada por duas unidades proticas, a Ferro-protena (Fe-protena) e a Molibdnio-Ferro-protena (MoFe-protena).

Durante a reao de reduo do N2, a nitrogenase auxiliada por uma terceira molcula transportadora de eltrons, a ferridoxina.

 a ferridoxina, na sua forma reduzida, transfere um eltron para a unidade Fe-protena da nitrogenase.
a Fe-protena, ento reduzida, doa o eltron recebido para a MoFeprotena. a MoFe-protena acumula os eltrons. Aps 8 transferncias, essa unidade ter acumulado 8 eltrons e, ento, far a reduo do N2 NH3. para cada eltron transferido da Feprotena para a MoFe-protena so consumidos 2 ATPs. Para reduzir uma molcula de N2 so necessrios 8 eltrons e, portanto, 16 ATPs.
Esquema da estrutura da nitrogenase e de sua reao de fixao do nitrognio atmosfrico.
FIGURA 10:

OBSERVAES:

- Para cada molcula de N2 fixada produzida uma molcula de H2. A produo do H2 durante o processo inevitvel e acaba por consumir parte dos eltrons que poderia ser utilizada na fixao de N2.

- O H2, gasoso, perdido para a atmosfera. Alguns organismos fixadores possuem a enzima hidrogenase, que oxida o H2 antes que seja perdido, formando H2O e ATP, que pode ser utilizado para a fixao de nitrognio. Logo, as bactrias portadoras da hidrogenase so menos prejudicadas e, at mesmo, mais eficientes na fixao do nitrognio porque possuem uma fonte adicional de ATP.

Medida da reduo do acetileno: base da tcnica para avaliao da taxa de fixao do nitrognio

Reaes catalizadas pela nitrogenase

Assimilao do NH4+ produzido nos ndulos

A fixao do nitrognio atmosfrico d origem amnia (NH3), que em contato com o substrato aquoso do citoplasma dos bacteriides convertida, rapidamente, em on amnio (NH4+).

O NH4+ inibe a fixao do nitrognio, no podendo acumular-se no interior dos bacteriides.

Assim, logo depois de ser formado, ele retirado dos bacteriides, atingindo o citoplasma da clula vegetal hospedeira, clula da regio central do ndulo radicular.

 Duas enzimas, a glutamina sintetase (GS) e a glutamato sintase (GOGAT), so responsveis pela converso do NH4+ em aminocidos. Os aminocidos gerados pela ao dessas enzimas so a glutamina e o glutamato.

FIGURA 11: Assimilao do NH4+ produzido na fixao do N2 nos ndulos radiculares de leguminosas.

Figura12. Herbaspirillum rubrisubalbicans formando glbulos no xilema de sorgo envolvidos com paredes formadas pela planta.

Figura 13. Colonizao do xilema de cana-de-acar com Herbaspirillum spp formando glbulos parecendo os envelopes membranosos nos ndulos de leguminosas

Figura 14. Herbaspirillum seropedicae iniciando a colonizao de xilema de sorgo.

Figura 15. Nitrognio fixado por virias associaes rizbio/leguminosas

HERBICIDA X AMENDOIM X FIXAO BIOLGICA DO NITROGNIO

Tabela 1- Nmero de ndulos aos 42 e 56 dias aps o plantio, nos tratamentos capina e herbicida.

Gentipos

Capina

42 dias Herbicida

56 dias Capina Herbicida

BR1 BR151 L7 Vagem Lisa Pelcula Havana

242,00 aA 246,50 aA 182,00 aA 265,75 aA

273,75 aA 130,50 aA 257,75 aA 182,00 aA

230,50 aA 199,75 aA 272,25 aA 323,00 aA

151,50 aA 209,50 aA 194,75 aA 182,00 bA

Mdias seguidas da mesma letra minscula na horizontal e maiscula na vertical, dentro de cada perodo, no diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade

Trifluralina

Pendimethalin

Alachlor 25a

Testemunha 22a 24a 16b

25 20 15 10 5 0 11,8a 8,7b 11,2a 7,6b

MSN

NN

Fig. 1- Massa seca dos ndulos (MSN g planta-1) e nmero de ndulos (NN no planta-1) de plantas de amendoim aos 30 dias aps a emergncia , submetidas a diferentes tratamentos com herbicidas (FONTE: Peixoto et al., 2002)

A FIXAO BIOLGICA CONTRIBUI COM

25 A 50% DO N TOTAL DAS SEMENTES DE LEGUMINOSAS DESENVOLVIDAS EM

SOLO FRTIL. O RESTANTE SAI DO SOLO

(NO3- e NH4+).

FATORES QUE AFETAM A FIXAO

BIOLGICA DO NITROGNIO Caractersticas intrnsecas das espcies hospedeiras (gentipo e idade da planta) conhece-se apenas a capacidade de nodular de 23% das espcies de leguminosas. Edficos e climticos acidez, toxidez do Al e Mn, teor de fsoforo (ATP), temperatura, teor de N mineral (reduz). Agrotxicos no se pode generalizar (prejudicial, benfico ou nenhum efeito) Populao nativa de rizbio pode competir com as introduzidas atravs da inoculao, por stios de infeco na planta hospedeira, diminuindo a contribuio da FBN para a espcie vegetal.

NO3- INIBE A ADESO DO RIZBIO NOS

PELOS RADICULARES, IMPEDE A FORMAO DA CORRENTE DE INFECO E REDUZ O DESENVOLVIMENTO DOS NDULOS

Inoculantes para leguminosas

O que um inoculante para leguminosa?
um produto biolgico composto por bactrias (microorganismos unicelulares) capazes de associar-se com a raiz da planta, transformando o nitrognio atmosfrico em nitrognio assimilvel. Em troca as bactrias recebem da planta os nutrientes necessrios para seu sustento. A esta associao denomina-se simbiose ao processo de transformao de nitrognio atmosfrico, fixao biolgica de nitrognio (FBN).

Qualidade

quantidade

dos

inoculantes

Os inoculantes turfosos, lquidos ou outras formulaes devem conter uma populao mnima de 1x108 clulas de bactrias/g ou ml de inoculante e devem ter comprovada a eficincia agronmica, conforme normas aprovadas pelo Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento (MAPA).

Cuidados ao adquirir inoculantes a) adquirir inoculantes recomendados pela pesquisa e devidamente registrados no MAPA. O nmero de registro dever estar impresso na embalagem; b) no adquirir e no usar inoculante com prazo de validade vencido e que no tenha uma populao mnima de 1x108 clulas viveis por grama ou por ml do produto. c) certificar-se de que o mesmo estava armazenado em condies satisfatrias de temperatura e arejamento;

Cuidados na inoculao
a) fazer a inoculao sombra e efetuar a semeadura no mesmo dia, mantendo a semente inoculada protegida do sol e do calor excessivo;
b) evitar o aquecimento em demasia, pois altas temperaturas reduzem o nmero de bactrias viveis aderidas semente. c) para melhor aderncia dos inoculantes turfosos, recomenda-se umedecer a semente com 300 ml/50 kg semente de gua aucarada a 10% (100 g de acar e completar para um litro de gua); d) umedecer a semente com a soluo aucarada, homogeneizar, adicionar o inoculante, homogeneizar e deixar secar sombra. A homogeneizao das sementes pode ser feita em mquinas prprias, tambor giratrio ou betoneira.