1

Ing. Sergio Duarte

ESTEQUIOMETRA Y CINTICA
MICROBIANA
Cintica del crecimiento microbiano y de la
formacin de producto
2
Temario
3.0 Cintica del crecimiento microbiano y de la formacin de producto
3.1 Requisitos para el crecimiento microbiano
3.2 Cuantificacin del crecimiento
3.3 Parmetros cinticos
3.3.1 Velocidades volumtricas
3.3.2 Velocidades especficas
3.3.3 Tiempo de duplicacin
3.3.4 Grado de duplicacin
3.3.5 Productividad volumtrica
3.3.5 Edad del cultivo
3.4 Fases de crecimiento en cultivo por lotes (batch)
3.5 Cintica de la utilizacin de substrato y de la formacin de producto
3.6 Modelos cinticos
3.6.1 Modelos cinticos para el crecimiento
3.6.2 Modelos cinticos para la formacin de producto
3.7 Modelado de un cultivo por lotes (batch) simple
3.8 Cintica del decaimiento microbiano
3.9 Relacin entre el ambiente y el crecimiento microbiano
3
3.1 Requisitos para el crecimiento microbiano
Los requisitos para el crecimiento microbiano son:
Inculo viable
Fuente de energa
Medio de cultivo con los nutrientes necesarios
Ausencia de inhibidores
Condiciones ambientales apropiadas.
4
El estudio cuantitativo de la cintica microbiana requiere
contar con mtodos confiables y sencillos para medir el
crecimiento de poblaciones.
Las medidas ms usadas de la cantidad de microorganismos
son el nmero de clulas y la masa celular en base seca
(biomasa). Esta ltima es la ms usada desde el punto de
vista ingenieril.
No existe necesariamente una relacin proporcional entre la
biomasa y el nmero de clulas. Esta relacin es ms
compleja para los microorganismos que crecen formando
agregados o ramificaciones (cultivos miceliales).
En el caso de cultivos miceliales (hongos, actinomicetos), los
microorganismos pueden desarrollarse en forma difusa en
toda la masa de lquido o en forma discreta adoptando la
forma esfrica (pellets).
3.2 Cuantificacin del crecimiento
5
La biomasa y el nmero de clulas que interesan
determinar son los correspondientes a los
microorganismos activos, aquellos que realmente participan
en el bioproceso.
No todos los microorganismos vivos o medidos como
viables estn realmente activos.
La actividad microbiana se mide por la velocidad para
realizar la transformacin de inters por cantidad de
microorganismos presentes en el sistema considerado
(velocidades especficas).
La biomasa que debiera usarse en las ecuaciones que
describen y cuantifican procesos microbianos es la
biomasa activa. En la prctica, se mide la masa celular
total y paralelamente se hacen de medidas de viabilidad o
actividad celular.
6
Recuento directo de clulas en celda
Recuento de colonias crecidas en placa
NMP
Medida de peso seco por gravimetra
Nefelometra
Turbidimetra
Correlacin entre microorganismos y el nivel de un componente
celular (nitrgeno, protena, ADN, ATP, etc.)
Correlacin entre microorganismos y una actividad metablica
(consumo de substrato, formacin de producto, emisin de luz, etc.)
Lista parcial mtodos para cuantificar el crecimiento de
poblaciones microbianas
7
3.3 Parmetros cinticos
Los parmetros definidos en esta seccin se refieren
bsicamente a cultivos en medio lquido homogneneos.

3.3.1 Velocidades volumtricas
Se define como el cambio de un componente por unidad de
volumen y de tiempo.
volumen x tiempo
i componente en cambio
r
i
=
(17)
t
S
r
S
d
d
=
t
r
X
d
dX
=
t
r
P
d
dP
=
r
S
: velocidad volumtrica de consumo de substrato
r
X
: velocidad volumtrica de crecimiento microbiano
r
P
: velocidad volumtrica de formacin de producto
(18) (19) (20)
En trminos de concentraciones, se pueden expresar:
8
3.3.2 Velocidades especficas
tiempo x biomasa
componente el en cambio
especfica Velocidad =
En trminos de concentraciones:
t X
S
q
S
d
d
=
t X

d
X d
=
t X
P
d
d
=
P
q
Se denominan tambin actividades o cocientes metablicos
Velocidad especfica de consumo de substrato:
Velocidad especfica de formacin de producto:
Velocidad especfica de crecimiento:
(21)
(22)
(23)
A partir de la ecuacin 23, se puede expresar tambin como:
t
lnX

d
d
=
(24)
9
La pendiente de la curva ln X vs t es .
Para cultivos microbianos sin limitaciones en la
disponibilidad de substrato, es generalmente constante y
corresponde al valor mximo (
m
) para las condiciones
existentes.
El cultivo bajo dichas condiciones sigue una cintica de
primer orden. Sigue el comportamiento cintico de una
reaccin autocataltica.
El perodo durante en el cual el crecimiento tiene lugar con
constante se denomina fase exponencial o logartmica,
segn se describa el crecimiento en base a X o al ln X. Si
es constante, a partir de la ecuacin 23 se tiene:
t
X
X
ln
0
=
t
0
e X X = (25) (26)
10
11
3.3.3 Tiempo de duplicacin
Se denomina tiempo de duplicacin (t
d
) el intervalo de tiempo
que insume duplicar la biomasa. A partir de la ecuacin 25 o 26
con X = 2X
0
y t = t
d
, se tiene:

2 ln
t
d
=
(27)
3.3.4 Grado de duplicacin
Es el nmero de veces n que se duplica una poblacin
microbiana en un tiempo dado. Se denomina tambin nmero
de generaciones.
n
0
2
X
X
=
(28)
12
Tipo de organismo t
d
(h)
Bacterias 0,3 2,0
Levaduras 1,0 4,0
Hongos filamentosos 2,0 4,0
Microalgas 18 35
Clulas animales (in vitro) 20 - 40
Tabla 4. Valores tpicos de tiempo de duplicacin (t
d
)
13
3.3.5 Productividad volumtrica
Es un parmetro cintico que se utiliza para evaluar un
proceso desde el punto de vista industrial.
volumen x tiempo
producida masa
a volumtric dad Productivi = (29)
Q
X
: productividad volumtrica de biomasa
Q
P
: productividad volumtrica de producto
3.3.6 Edad del cultivo

Intervalo de tiempo que transcurre entre la inoculacin y un
tiempo dado, generalmente cuando el cultivo se interrumpe
para usarlo como inculo u otra aplicacin.
t
X
Q
X
=
t
P
Q
P
=
(30) (31)
14
3.4 Fases de crecimiento en cultivo por lotes (batch)
Fase
I Lag o de retardo
II Aceleracin
III
Exponencial
(logartmica), de
produccin
IV Desaceleracin
V Estacionaria
VI Decaimiento o muerte
15
ln X
X

r
X

Variaciones de X, ln X,
y r
X
con el tiempo
16
Crecimiento por lotes (batch) usando dos substratos
como fuente de carbono (crecimiento diaxico)
17
3.5 Cintica de la utilizacin de substrato y de la
formacin de producto
La formacin de producto y el crecimiento estn
relacionados con la utilizacin (consumo) de nutrientes. En
esta seccin se establecern las relaciones entre ellos,
mediante ecuaciones de balance de materiales.
En base a la ecuacin 4, se tiene:
t
S
t
S
t
S
t
S
P M G
d
d
d
d
d
d
d
d
=
(32)
Se define velocidad especfica de consumo de substrato
para mantenimiento celular m como:
tiempo x biomasa
nto mantenimie para substrato de consumo
m =
t X
S
m
M
d
d
= En trminos de concentraciones se expresa:
(33)
(34)
18
Tabla 5. Valores tpicos de velocidad especfica de
consumo de substrato para mantenimiento (m)
Organismo m (g/gh)
Lactobacillus casei 0,135
Aerobacter cloacae 0,094
Saccharomyces cerevisiae 0,036
Penicillium chrysogenum 0,022
Candida utilis 0,170
Azobacter vinelandii 0,15
Klebsiella aerogenes 0,04
19
Introduciendo los parmetros cinticos y los coeficientes
de rendimiento en la ecuacin 32, se tiene:
X/S
Y
X
t
S
=
d
d
P
P
G
Y
X q
X m
Y
X
t
S
+ + =
d
d
X/S
S
Y

q =
P
P
G
S
Y
q
m
Y

q + + =
P X/S
P/S
G X/S
Y
1
Y
Y

m
Y
1
Y
1
+ + =
(35)
(36)
(37)
(38)
(39)
Definiendo Y
P/X
como el coeficiente de rendimiento de
producto por cantidad de biomasa producida, se tiene:
X/S
P/S
P/X
Y
Y
X
P
Y = =
d
d
P
P/X
G X/S
Y
Y

m
Y
1
Y
1
+ + =
(40) (41)
20
Cuando no hay formacin de producto, q
p
= 0 y las ecuaciones
36, 38 y 39 se pueden expresar:
X m
Y
X
t
S
G
+ =
d
d
m
Y

q
G
S
+ =

m
Y
1
Y
1
G X/S
+ =
(45)
(46)
(47)
X Y X
Y
Y
X q
P/X
X/S
P/S
S
= = = =
P/S P
Y X q
t
P
d
d
S
q
P/S P
Y q =
Y
P/X
=
P
q
Para la formacin de producto:
(42)
(43)
(44)
Si los consumos de substrato para mantenimiento celular y
formacin de producto son despreciables, m 0, q
P
0,
entonces Y
X/S
Y
G
.
21
La relacin cintica entre crecimiento y formacin de producto
depende del papel del producto en el metabolismo microbiano.
Segn lo expresado en el numeral 2.5 se tiene:
a) Formacin de producto asociada al crecimiento (clase 1)
b) Formacin de producto parcialmente asociada al crecimiento,
cintica mixta (clase 2, situacin intermedia entre 1 y 3)
c) Formacin de producto no asociada al crecimiento (clase 3).
22
V
e
l
o
c
i
d
a
d
e
s

e
s
p
e
c

f
i
c
a
s


q
S

q
P

23
Wang et al. p. 79
24
Bailey & Ollis, 2nd. Ed. pp. 422 423.
25
26
3.6 Modelos cinticos
Permiten predecir comportamientos y simular el efecto de
variar las condiciones de operacin dentro de su rango de
validez.
La formulacin de un modelo puede ser experimental, terica
o mixta.
Modelos ms simples idealizan a la poblacin celular como:
No estructurada
No segregada
Estado de crecimiento balanceado: la composicin celular
media no se afecta por la proliferacin
Representan comportamiento promedio de las poblaciones
de clulas a travs de la cuantificacin de propiedades del
cultivo (tales como X, S, P, , q
S
, q
P
).
27
3.6.1 Modelos cinticos para el crecimiento
El modelo cintico ms difundido es el propuesto por
Monod (1942).
Establece una relacin funcional entre y la
concentracin de un nico nutriente esencial limitante.
Es un modelo sencillo de dos parmetros.
Se aplica bsicamente para el cultivo de un
microorganismo que crece formando clulas aisladas
(separadas) sobre un substrato simple y cuando no hay
inhibidores del crecimiento.
Modelo flexible, ha mostrado predecir adecuadamente el
crecimiento de cultivos que no cumplen totalmente los
requisitos anteriores.
Si bien se basa en la forma de las isotermas de adsorcin
de Langmuir y en la cintica enzimtica de Michaelis &
Menten, es un modelo de base esencialmente emprica.
28
S
m
K S
S

+
= (48)

m
: es la velocidad especfica de crecimiento mxima.
K
S
: constante de saturacin, tambin llamada constante
del modelo de Monod.
=
m
/2 para S = K
S

Generalmente S >> K
S
y ~
m
, ( es constante).

El modelo de Monod se aplica bsicamente para la fase de
crecimiento exponencial.
Existen modificaciones del modelo de Monod para extender
su aplicacin a otros casos: inhibicin, crecimiento
diuxico (varios substratos), substrato complejos no
definidos, cultivos mixtos, etc.
29
30
31
Tabla 5. Valores tpicos de la constante de
saturacin (K
S
) del modelo cintico de Monod
Substrato Organismo (gnero) K
S
(mg/L)
Glucosa Escherichia 0,07 2,0
Glucosa Aspergillus 5,0
Glucosa Saccharomyces 25
Lactosa Escherichia 20
Glicerol Candida 4,5
Oxgeno Candida 0,04 0,5
Metanol Pseudomonas 0.7
Fosfato Escherichia 1,6
Mg
2+
Klebsiella 0,6
Triptofano Escherichia 0,0005 0,001
Arginina Aspergillus 0,5
32
Modelos cinticos para inhibicin por substrato o producto
Modelo para inhibicin del crecimiento por alta
concentracin de substrato (Modelo de Andrews o Haldane).
I
2
S
m
K
S
S K
S

+ +
=
(49)
Modelo para inhibicin del crecimiento por alta
concentracin de producto.
P
f
S
m
K S
S

+
=
a
m
P
P
1
|
|
.
|

\
|
=
P
f
P K
P
e

=
P
f
P K
K
P
P
+
=
P
f
(50)
f
P
puede tener diferentes expresiones y puede usarse tambin
para corregir la ecuacin 49 cuando existen ambos tipos de
inhibiciones.
(51) (52) (53)
33
34
3.6.2 Modelos cinticos para la formacin de producto
Formacin de producto asociado al crecimiento
(fermentaciones de clase 1, metabolitos primarios).
q
P
=
es un coeficiente cintico y en particular se demuestra
que = Y
P/X
(ver ecuaciones 40 y 44).
Formacin de producto parcialmente asociada al
crecimiento (fermentaciones de clase 2, cintica mixta).
Modelo de Leudeking & Piret (1959) de dos parmetros, y .
q
P
+ =
Formacin de producto no asociada al crecimiento
(fermentaciones de clase 3, metabolitos secundarios)
q
P
=
(54)
(55)
(56)
35
3.7 Modelado de un cultivo por lotes (batch) simple
X
t
X
=
d
d
S / X
0
0
Y
X X
S S

=
X
X) X Y S Y (K
X) X Y (S
t
X
0 X/S 0 X/S S
0 X/S 0 m
+ +
+
=
d
d
} }
=
+
+ +
t
0
m
X
X
0 X/S 0
0 X/S 0 X/S S
t X
X X) X Y (S
X) X Y S Y (K
0
d d
Suponemos el cultivo por lotes simple limitado solamente por
un substrato y que sigue el modelo cintico de Monod.
De la ecuacin 3 se tiene:
(57)
(58)
Introduciendo en la ecuacin 57, las ecuaciones 48 y 58:
(59)
(60)
36
t
Y S
X X Y S
ln
X Y S
Y K
X
X
ln
X Y S
) X Y S Y (K
m
X/S 0
0 X/S 0
0 X/S 0
X/S S
0 0 X/S 0
0 X/S 0 X/S S
=
|
|
.
|

\
|
+
+

|
|
.
|

\
|
+
+ +
(61)
La ecuacin 61 da una curva X vs t tipo s para el cultivo
microbiano por lotes donde para t , X Y
X/S
S
0
+ X
0
.
Para condiciones en las que K
S
<< S, la ecuacin 61 se
puede simplificar y aproximar por la ecuacin 25,
ln(X/X
0
) = t, donde =
m
.
Las ecuaciones 25 y 61 permiten estimar el tiempo de
fermentacin.
37
3.8 Cintica del decaimiento microbiano
El decaimiento microbiano generalmente es significativo al
fin de la fase exponencial, cuando existe agotamiento de
nutrientes.
Sin embargo puede darse tambin cuando existen
condiciones adversas (cambios en las condiciones
operativas, acumulacin de sustancias inhibidoras, etc.)
El decaimiento microbiano expresado en trminos de
biomasa puede presentar dos aspectos:
Muerte y lisis celular
Las clulas consumen su propio material celular de
reserva (autoconsumo) y se denomina metabolismo
endgeno.
Ambos se describen usualmente como ecuaciones cinticas
de primer orden.
38
X k X
t
X
d
=
d
d
k
d
se denomina velocidad especfica de decaimiento
microbiano.
Si el proceso es la muerte celular, k
d
se denomina
velocidad especfica de muerte.
Si el proceso es el consumo endgeno de biomasa k
d
se
denomina coeficiente endgeno y se denota usualmente
k
e
.

Generalmente, bajo condiciones activas de
crecimiento celular, k
d
es despreciable, k
d
<< .
(62)
39
El resultado exitoso de un bioproceso implica optimizar el binomio
microorganismo - ambiente.
Los factores ambientales inciden en la cintica y por lo tanto en los
parmetros cinticos.
Los principales factores ambientales son:
Formulacin del medio de cultivo
Tipo de nutrientes (simples, complejos, naturaleza qumica)
Solubilidad de los nutrientes,
Concentracin de nutrientes y otros componentes
Tipo de medio (complejo, definido, mnimo)
pH
Temperatura
Concentracin de oxgeno disuelto
Actividad de agua
3.8 Relacin entre el ambiente y el crecimiento microbiano
40
Medio de cultivo (h
-1
)
Glucosa y caldo nutriente 1,2
Glucosa y sales minerales 0,82
Acetato y sales minerales 0,52
Succinato y sales minerales 0,14
Velocidad especfica de crecimiento de Escherichia coli
sobre diferentes tipos de medios de cultivo
Wang et al. p. 85.
41
Para pensar y hacer cuentas
Si en lugar de construir la curva X vs t para un cultivo por
lotes se mide concentracin celular vs tiempo, qu forma
tendra?
Cul es el significado fsico de P
m
en la ecuacin 51?
Cules son los valores tpicos de para diferentes
microorganismos: bacterias, hongos, levaduras,
microalgas?
Grafica X vs t para el cultivo por lotes de una bacteria en
condiciones ideales. Grafica luego para las siguientes
situaciones: a) hay inhibicin por alta concentracin de
substrato, b) hay inhibicin por alta concentracin de
producto, c) existe en el medio de cultivo un inhibidor
qumico. Idem para P vs t, suponiendo que la formacin de
producto est asociada al crecimiento.