PRODUCCIN MICROBIANA DE DIVERSOS COMPUESTOS

En microbiologa, la fermentacin se define como el proceso metablico que lleva a la generacin de ATP y, en el cual, los productos de degradacin de los compuestos orgnicos sirven tanto como donadores como aceptores de hidrgeno. El oxgeno no es un reactivo en los procesos de fermentacin. La larga historia de la produccin de vino y cerveza ha producido tecnologa refinadas para fermentaciones a gran escala y para la recuperacin de etanol.

3.1 PRODUCCIN DE ETANOL

La larga historia de la produccin de vino y cerveza ha producido tecnologa refinadas para fermentaciones a gran escala y para la recuperacin de etanol. Adems de su uso popular como bebida, el etanol puede servir tambin como un combustible y como materia prima para la produccin de compuestos como el cido actico, acetaldehdo, butanol y etileno.

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Mientras que actualmente las industrias utilizan compuestos fsiles (petrleo y gas natural) como materia prima en la produccin de compuestos qumicos orgnicos y combustibles, el dramtico incremento en su costo ha llevado a buscar fuentes alternativas para su produccin; siendo el etanol una de ellas. Con el pretratamiento apropiado, varias formas de biomasa pueden servir como sustratos para la fermentacin de alcohol.

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Tanto las bacterias como las levaduras se han utilizado para la produccin de etanol. La figura siguiente describe de manera general la conversin de varios sustratos en alcohol:

En la primera etapa, los sustratos polimricos se rompen en monosacridos mediante vas fsicas, qumicas o enzimticas, segn sea necesario.

En la segunda etapa, la fermentacin microbiana (generalmente levaduras) convierten los azcares a alcohol.

En la tercera etapa, se recupera el alcohol por destilacin ( como una mezcla constante de 95.6% de alcohol y 4.4% de agua en volumen) Se requieren adems procedimientos de destilacin posteriores para obtener el etanol anhidro.

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Entre las bacterias ms ampliamente utilizadas se encuentra Zymomonas

mobilis.

Saccharomyces cerevisiae es la levadura ms utilizada, pero Klyuveromyces fragilis

tambin tiene un uso significativo.
Bajo condiciones aerobias y en presencia de altas concentraciones de glucosa, Saccharomyces cerevisiae crece adecuadamente, pero no produce alcohol.

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Sin embargo, bajo condiciones anaerobias el

crecimiento disminuye y el piruvato se rompe o divide por la va glicoltica por la accin de la piruvato descarboxilasa para producir acetaldehdo y CO2, como se muestra de manera general en la siguiente figura:

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ETAPA 1: De los sustratos a los azcares fermentables. Como se indic anteriormente, los sustratos que contienen carbohidratos se deben someter a pretratamiento de manera que

permitan que los azcares que contienen estn disponibles para los

microorganismos. Los principales sustratos usados para la produccin de alcohol por fermentacin microbiana son los azcares, los almidones y la celulosa:

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Azcares: La sacarosa es el endulzante ms utilizado para consumo humano.

La caa de azcar y las remolachas contienen ms de 20% de sacarosa en peso,

siendo sus otros componentes principales el agua (75%), la celulosa (5%) y sales inorgnicas (1%). El sustrato para la fermentacin se obtiene por extraccin de sacarosa con agua, despus de moler mecnicamente la caa de azcar o las races de remolacha.

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Azcares: La sacarosa de la caa de azcar es un sustrato particularmente favorable para la produccin de

etanol por fermentacin por levaduras, que producen la enzima invertasa en forma citoplsmica o excretada, la cual hidroliza la sacarosa para convertirla en glucosa y fructosa, las cuales a su vez son fermentadas por las levaduras. La conversin de otros sustratos en alcohol involucra pretratamiento adicional. Saccharomyces cerevisiae puede tomar y metabolizar otros azcares tambin, como glucosa, fructosa, galactosa, maltosa, entre otras.

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Almidones:

El almidn de maz es el sustrato ms utilizado en EUA para la produccin de etanol como combustible, y consiste de una fraccin soluble en agua de 20% amilosa y una fraccin de alto peso molecular insoluble en agua llamada amilopectina (80%).

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Almidones: Para obtener el almidn, el maz seco es
molido, se aade agua y la suspensin resultante se manda a un horno, donde el calentamiento de la suspensin solubiliza el almidn y lo hace vulnerable a la hidrlisis enzimtica. Se aade a-amilasa para licuar el almidn y se aade tambin glucoamilasa antes de la fermentacin para catalizar la sacarificacin. La hidrlisis de los polmeros de almidn producen glucosa.

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Celulosa:

La celulosa es el principal componente de la lignocelulosa. El pretratamiento de la celulosa la hace ms accesible para que las enzimas hidrolticas comiencen a romper, al menos parcialmente, la estructura altamente cristalina de las fibras de celulosa. Se han desarrollado varios pretratamientos para materiales lignocelulsicos, como por ejemplo:

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Celulosa:

Las astillas o pedazos de madera se calientan con vapor a 500 F y se mantienen a esta temperatura por 20 s, sufriendo una descompresin rpida posteriormente. Despus de esta descompresin la celulosa es ms susceptible a la hidrlisis enzimtica. Esta explosin de vapor tambin tiene el efecto de solubilizar la hemicelulosa para que pueda ser retirada por lavado. Entonces se puede separar la celulosa y la lignina por otros mtodos. Otro mtodo consiste en hacer crecer una cepa de Trichoderma reesei en materiales lignocelulsicos que resulta en una conversin del 45% de celulosa en glucosa por accin enzimtica, aadiendo posteriormente la solucin a un tanque de fermentacin para la produccin de alcohol.

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ETAPA 2: De los azcares al alcohol. La segunda etapa utiliza azucares simples como sustratos (liberados por polisacridos en la etapa 1) en fermentaciones microbianas para producir alcohol.

Levaduras

Muchas levaduras (pero pocas bacterias) llevan a cabo una conversin casi cuantitativa de la glucosa a alcohol. Los procesos industriales utilizan levaduras del gnero Saccharomyces.

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Levaduras

A pesar de sus ventajas, tienen algunas limitaciones como su tolerancia limitada al

alcohol y su pequeo intervalo de sustratos utilizables. Intervalo de sustratos:

La principal limitante de las levaduras como agentes fermentadores es su limitado intervalo de sustratos que son capaces de usar (ver tabla siguiente). Por ejemplo, las levaduras no fermentan la mayora de los oligosacridos formados durante la hidrlisis del almidn. Estos compuestos resistentes incluyen las maltodextrinas ms largas que la maltotriosa e isomaltosa.

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Levaduras

Por ello, las levaduras requieren la adicin de glucoamilasas para utilizar el almidn completamente.

Tampoco pueden utilizar la celulosa, hemicelulosa o gran parte de las pentosas.

Tolerancia al etanol Debido a que la separacin del etanol del agua

en la etapa III cuenta tambin en la energa utilizada en el proceso global de produccin,

mientras ms alta sea la concentracin de etanol en el fermentador, menor ser el costo de destilacin por litro de producto.

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Levaduras: Tolerancia al etanol Sin embargo, el etanol es txico para las

clulas de levadura en concentraciones entre 8-18% en peso, dependiendo de la cepa y el estado metablico del cultivo. La fermentacin se inhibe totalmente en concentraciones de etanol cercanas a 11% en volumen. Para comprender lo anterior, se deben considerar las propiedades de las membranas citoplsmicas:

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Estructura y funcin de las membranas citoplsmicas Las membranas citoplasmicas de las levaduras y bacterias consisten de una bicapa de complejos protenicos. Algunas de estas protenas transmembrnicas sirven como canales, a travs de los cuales la parte interna de las clulas interacta con el medio externo. Otras son complejos transportadores de electrones responsables de la creacin de gradientes inicos o protnicos entre el interior y el exterior de la membrana citoplsmica. Un ejemplo es la casi ubicua F0F1 ATPasa, complejo enzimtico que utiliza un gradiente protnico a travs de la membrana para la sntesis de ATP.

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Estructura y funcin de las membranas citoplsmicas

El transporte de nutrientes hacia la clula es dependiente de la clase de complejos protenicos o protenas transmembrnicas, llamadas permeasas; las cuales controlan el paso de molculas hidrfilas a travs de la membrana. La permeasa de glucosa, por ejemplo, facilita el transporte de glucosa hacia la clula por un gradiente de concentracin mediante un proceso de difusin. Esto depende de la enzima hexokinasa que somete a un proceso de fosforilacin rpidamente a la glucosa libre dentro de la clula y, por ello, mantiene bajos los niveles de glucosa intracelular.

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Estructura y funcin de las membranas citoplsmicas

Otras permeasas catalizan el transporte activo

de nutrientes contra las concentraciones de nutrientes internos que son varios rdenes de magnitud mayores que aquellos en el medio extracelular. Muchas de estas protenas activas de transporte utilizan el pH o la concentracin de iones (fuerza motriz protnica) a travs de la membrana citoplsmica para proveer de energa para el transporte activo. El transporte de maltosa, aminocidos y amonio en las clulas de levadura dependen del transporte activo de las protenas transportadoras.

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Estructura y funcin de las membranas citoplsmicas

La membrana citoplsmica provee una barrera a la difusin de protones y otros iones, as como molculas polares pequeas desde la clula hacia el exterior y viceversa. Sin tal frontera altamente eficiente, la homestasis interna, esencial para la supervivencia de las clulas, no se podra mantener.

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El efecto del etanol en la estructura y funcin de la membrana.

Aunque la bicapa de lpidos de la membrana citoplsmica es una barrera eficiente para molculas hidrfilas, tambin

permite que pequeas cantidades de molculas amfiflicas (que contiene tanto un

grupo soluble como otro insoluble en agua) pasen libremente sin la necesidad de una permeasa especfica. Consecuentemente, la concentracin de alcohol dentro de la clula es la misma que en medio circundante.

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El efecto del etanol en la estructura y funcin de la membrana.

Conforme la concentracin de alcohol se incrementa, ste rompe la estructura del agua y, como resultado, la contribucin entrpica a la estabilizacin de la bicapa lipdica es menor en mezclas de aguaalcohol que el agua sola.

Adems, como el alcohol se distribuye en el interior de la membrana, ste trastorna las interacciones lpido-lpido y lpidoprotena.

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El efecto del etanol en la estructura y funcin de la membrana.

Por lo tanto, conforme los niveles de alcohol aumentan, la membrana se convierte cada vez ms dbil y permeable. Entonces, la membrana colapsa gradualmente debido a los gradientes inicos, provocando que pequeas molculas se salgan de la clula. En algunas clulas de levaduras, un 50% de disminucin en la velocidad de retencin de azcares, iones y aminocidos se observa en presencia de concentraciones de etanol tan bajas como 4% en volumen.

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Influencia de la composicin de la membrana en la resistencia al etanol.

Algunas cepas de levaduras muestran mayor resistencia que otras a concentraciones altas de etanol. Lo anterior debido a que la estructura de la bicapa lipdica se estabiliza por la presencia de cadenas ms largas de hidrocarburos en las molculas de lpidos. En otros casos, la permeabilidad de la membrana se minimiza debido a un alto contenido de esterol en ella, ya que los esteroles disminuyen la permeabilidad no especfica de las bicapas de fosfolpidos.

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Influencia de la composicin de la membrana en la resistencia al etanol.

Por otro lado, se requiere de una pequea cantidad de oxgeno para la tolerancia al etanol. Debido a que las levaduras producen cidos grasos insaturados utilizando oxgeno y NADH, las clulas no pueden crecer en ambientes completamente anaerbicos en la presencia de etanol. El oxgeno se requiere tambin para la produccin de ergosterol, un esterol de la membrana citoplsmica que contribuye a la estabilidad de la membrana. El crecimiento microaeroflico en la presencia de etanol conlleva al incremento del contenido de ergosterol en la membrana.

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Proceso de produccin de etanol

Tericamente, por un gramo de glucosa, se producen 0.511 g de etanol, debido a la ecuacin establecida por Gay-Lussac en 1810 para la fermentacin de glucosa en etanol por levaduras:

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2.

Cuando se utilizan sustratos puros el rendimiento es de 95% y se reduce a 91% cuando se usan sustratos grado industrial.

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Proceso de produccin de etanol

Como ya se mencion, el etanol es producido en tres etapas generales: 1) preparacin de la solucin de nutrientes, 2) fermentacin y 3) destilacin de la solucin. La figura siguiente muestra las etapas de produccin de etanol a partir de harina de maz:
Etapas de produccin etanol a partir de un sustrato que contiene almidn

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En este caso, debido a que S. cerevisiae no contiene amilasas, el almidn debe ser hidrolizado. Los sustratos, que contienen 25-30% de azcares y 1-2% de protena son molidos, exprimidos y secados, y posteriormente, hidrolizados enzimticamente. Se aade un poco de aamilasa para disminuir la viscosidad que se desarrolla despus del pretratamiento.
Etapas de produccin etanol a partir de un sustrato que contiene almidn

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Para la produccin de glucosa, se aaden glucoamilasa y a-amilasa despus de los procesos de calentamiento y enfriamiento. Aprox. 1 L de a-amilasa y 3.5 L de glucoamilasa por tonelada de almidn. Tambin existen procesos continuos de produccin de etanol, siendo uno de ellos la fermentacin de sustratos de almidn por Zymomonas mobilis.
Etapas de produccin etanol a partir de un sustrato que contiene almidn

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La fermentacin tipo batch es ms comnmente empleada para la produccin de etanol, utilizando almidn o melazas, con un 3% de inoculo. Dentro de 12 h, Saccharomyces produce 10% v/v de etanol con 10-20 g de peso seco de biomasa/L, cuando el proceso se lleva a cabo entre 35-38 C y pH 4-4.5.

Etapas de produccin etanol a partir de un sustrato que contiene almidn

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Produccin de etanol mediante Zymomonas mobilis

La bacteria Zymomonas mobilis, es estudiada actualmente como agente de la fermentacin alcohlica gracias a las ventajas que presenta en relacin con las levaduras , tales como su alto factor de conversin sustrato a producto y la baja produccin de clulas, entre otras. La inmovilizacin de microorganismos es una tcnica que permite altas productividades y menores tiempos de fermentacin.

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Produccin de etanol mediante Zymomonas mobilis

Zymomonas mobilis tiene:

Tiempos de fermentacin mas cortos (300-400% mas rpido que la levadura) Mas produccin de etanol (92%-94% en contra de 88-90% de la levadura). La conversin de mezclas de azucares es 90-95% de eficiencia. Las Zimomonas mobilis, una bacteria gram negativa, se consideran como organismo alternativo en la produccin en grande del etanol del combustible. Estan reagrupadas todas las cepas de Zymomonas en una especie (Zymomonas mobilis) y dos subespecies : Zymomonas mobilis mobilis y Zymomonas mobilis pomaceae. La mayor parte de las cepas pertenece a la subespecie mobilis.

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Produccin de etanol mediante Zymomonas mobilis

Adems del etanol, las Z. mobilis tambin se han dirigido metablicamente para producir el L-alanina y el cido L-lctico. Es una de las pocas bacterias anaerobias facultativas que metaboliza la glucosa y la fructosa va de Embden-Meyerhoff-Parnas, que est generalmente presente en los microorganismos aerobios. Bajo condiciones anaerobias, las Z. mobilis producen subproductos tales como glicerol, acetato y lactato, que dan lugar a la produccin reducida del etanol de la glucosa.