MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA

INTRODUCCION

Descubierto en 1908 por Khler y Siedentopf, y se basa en que una sustancia natural en las clulas o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energa absorbida como rayos luminosos. Siendo escasas las molculas autofluorecentes, su aplicacin ms difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la deteccin de antgenos o anticuerpos. Tambin se puede inyectar molculas fluorescentes especficas en un animal o directamente en clulas y usarlas como marcadores.

FLUOROCROMOS
Pueden usarse directamente, aprovechando la propiedad de unirse a determinadas molculas u orgnulos. Pero lo ms habitual es que estos colorantes se empleen conjugados a otras molculas, como anticuerpos, que son capaces de unirse de modo especfico a estructuras concretas de la clula. Algunos colorantes denominados fluorocromos tienen la propiedad de ser excitados (pasar a un nivel superior de energa) cuando absorben luz ultravioleta (luz de longitud de onda corta). Problema: La utilizacin de fluorocromos pierde grandes intensidades de luz empleadas, entonces no pueden observadas durante largos periodos de tiempo debido a la desaparicin de la fluorescencia

FLUORFOROS
Son molculas utilizadas por sus propiedades fluorescentes. Ejemplos: FITC, PE, Cy,

Alexa, protenas fluorescentes (GFP, CFP, YFP, etc).

DAPI

GFP

FLUORESCENCIA
A medida que las molculas excitadas regresan a su estado normal liberan el exceso de energa en forma de luz visible de mayor longitud de onda que la radiacin excitante. Los objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados contra un fondo oscuro, segn el color del colorante usado.

CONSTITUCION FUNDAMENTAL
Fuente luminosa (lmpara de mercurio o halgena): Debe emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta en el lmite del espectro visible, que atraviesan el material de la preparacin de la misma forma en que lo hace un microscopio ptico comn Objetivos: Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiacin ultra-violeta. Filtros: Retienen la radiacin ultra-violeta, peligrosa para el ojo humano, dejando pasar solamente la radiacin visible, que no es peligrosa. Existen un gran nmero de juegos de filtros de excitacin y de emisin para los diferentes fluorocromos: *El de excitacin: Ubicada entre la fuente de luz y el preparado. Permite el paso de ondas de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisin de luz fluorescente. *El de barrera: Ubicada antes del ocular para prevenir daos retinianos que podran ser causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrmico. Corta completamente la luz de excitacin no deseada, es decir selecciona la longitud de onda de emisin del fluorocromo.

 *Espejo Dicroico: Permite la separacin de la luz de excitacin y la fluorescencia. Posicionado en 45 respecto al eje ptico, la longitud de onda ms corta es reflejada y la longitud de onda ms larga lo atraviesa.

COMPARACION CON MICROSCOPIO CONVENCIONAL

Este microscopio es similar al microscopio convencional, a excepcin de que la luz incidente que procede de una potente fuente atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo. Otra diferencia radica en que la luz de iluminacin (excitacin) no est involucrada en la formacin de la imagen. En este sentido la microscopa de fluorescencia difiere de la microscopa normal en la cual la imagen es formada por la luz de iluminacin .

FUNDAMENTO FISICO
La luz de una fuente de longitud de onda mltiple se mueve a travs de un filtro excitador que solo permite que pase la radiacin excitada de la longitud de onda deseada. Esta radiacin es reflejada por el filtro dicromtico y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra, las molculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda especfica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a travs del filtro dicromtico y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiacin de excitacin. Ejemplo: 1. Primer filtro de excitacin: selecciona la luz de la longitud de onda incidente. En el esquema est seleccionando luz de longitud de onda entre 450 y 490 nm (azul) 2. Espejo dicroico: Refleja la luz de ciertas longitudes de onda y de dejar pasar otras. En este caso refleja luz de longitud de onda menos de 510 nm (por ello refleja la luz incidente azul) y deja pasar la luz de longitud de onda superior a 510 nm, dejando pasar la luz verde emitida por el fluorocromo.

 3. Segundo filtro de barrera: Es el filtro que selecciona la luz de longitud de onda fluorescente. En este caso deja pasar la luz de longitud de onda 520 a 560 nm. Entre otros aspectos o fundamentos, importantes a considerar tenemos: *El largo de onda de la fluorescencia (emisin) es generalmente ms largo que el largo de onda de la luz excitadora *Mientras ms larga sea la longitud de onda, ms baja es la energa de la luz. Por lo tanto la energa de la fluorescencia es mas baja que la luz absorbida. *La intensidad de la fluorescencia es generalmente mucho ms baja que la de la luz de excitacin

*La fluorescencia se desvanece.

*Cada substancia posee un espectro de fluorescencia caracterstico.

TECNICAS DE TINCION FLUORESCENTE 1.DAPI: TIE EL DNA DE COLOR AZUL BRILLANTE

Permite enumerar microorganismos.

Desventaja: No discrimina entre clulas vivas y muertas.

2. TINCION DE VIABILIDAD
Permite discriminar entre clulas vivas y muertas

Desventaja: solo apropiado para cultivos puros, tintes se pueden pegar a otras cosas que no son clulas en muestras ambientales o complejas.

3. GREEN FLUORESCENT PROTEIN

Deteccin y rastreo de organismos introducidos en ambientes naturales.

4. AUTOFLUORESCENCIA
Ej:emplo: Clorofila de cianobacterias.

5. FLUORESCENCIA INDUCIDA

FLUORESCENCIA MULTIPLE
Es posible combinar, sobre una misma muestra, dos o ms colorantes siempre que emitan en diferente longitud de onda y nuestro sistema sea capaz de excitar a todos a la vez y discriminar los fotones emitidos por ellos.

COMPARACION DE IMGENES CON DIFERENTES FILTROS