Cell Cycle Regulation

Hui Zhang, Ph. D.
Department of Genetics
Yale University School of Medicine
New Haven, CT 06520, USA
Telephone: (203)737­1922
Fax: (203)785­7023
E­mail: hui.zhang@yale.edu
http://info.med.yale.edu/genetics/fac/HuiZhang.php

   
 Cell Cycle Regulation: 
the mechanisms controlling cell growth, cell duplication, 
cell division, and their roles in development and diseases

cell proliferation development cancer

  differentiation  aging
 All Organisms are Composed of 
Cells­the Cell Theory
•Microorganisms  preliminary observations on
unicell vs. multicell (Anton van Leeuwenhook, 1632-1723)

•Cork shreds  box-like units (cells) (Robert Hooke, 1665)

•Animal and plant tissues  fluid + nucleus (Mathios Schleiden

& Theodore 
Theodore Schwann, 1838-39)

•Cells dividing into cells (Rudolf 

(Rudolf Virchow, 1858)
   
 Unicellular Organisms: bacteria, blue algae, 
single cell fungi (yeast), etc.

   
 Multicellular organisms
cells in an onion root

QuickTimeª and a
GIF decompressor
are needed to see this picture.

Involving complex programs to coordinate proliferation, differentiation,
 and functional specialization of various cells in an organism
   
 Cell cycle under microscope

telophase
interphase metaphase
prophase anaphase
   
 Life Cycles
Mitosis

Reproduction
systems

   
   
Somatic cell cycle can be divided 
into G1, S, G2, M phases
Mitosis (M): chromosome condensation

Gap1 Gap2
 (G1)  (G2)

  DNA synthesis (S): 
  3
H­thymidine incorporation
 Embryonic cell division
­Many embryonic cell divisions are rapid (10­15 min)
Fertilized eggs from Xenopus, Drosophila, sea urchin, clam, etc.

­Alternating S phase (S) and mitosis (M).

­Uses maternally stored proteins for mitotic divisions.

   
Growth factor 
signaling

 
Cell Cycle Regulation/Differentiation
 
 Developmental cell divisions
­cells divide asymmetrically­
Zygote (fertilized egg)

Mitosis

Continued cell divisions with different cell fate

Nerve, muscle, blood, endocrine, epithelial, stem cells, etc.
   
 How cell cycle regulation 
can be studied?

   
 Different systems offer various ways to 
identify and isolate cell cycle regulators
­Cultured mammalian cells (Rao and Johnson)

­Budding yeast (Saccharomyces cerevisiae­Leland Hartwell)

­Fission yeast (Schizosaccharomyces pombe­Paul Nurse) 

­Frog Oocytes (Xenopus laevis, Rana pipiens­Yoshio Matsui)

­Sea urchin/clam eggs (Joan Ruderman and Tim Hunt)
   
   
Xenopus Oocyte Maturation and Activation

Maturation Activation
(Meiosis) (Mitosis)
   
 Assay for MPF (Yoshio Masui)

   
 Maturation Promoting (MPF) Factor is 
Transferable and Autocatalytically propagated

   
 MPF is an universal regulator of 
mitosis and meiosis

MPF from mitotic embryonic or somatic cells
 
and mature eggs behave the same.
 
Properties of MPF:

­ promotes oocyte maturation

­ common in all mitotic or meiotic cells from 
different sources

­ activity oscillates in the cell cycle, low in 
interphase and high in mitotic/meiotic cells

   
 Nobel Prize Winners 
for Cell Cycle Regulation
in Physiology or Medicine, 2001

Leland Paul Tim

Hartwell Nurse Hunt
   
 Lee Hartwell: isolated a collection of cell­division cycle
(cdc) mutants using yeast Saccharomyces cerevisiae

Isolated various conditional 
budding yeast mutants, mostly 
temperature sensitive (ts) mutants that 
arrest the cell cycle with growth or 
morphological defects 
   
 Isolate yeast conditional mutants
High temperature mutants: Grow at 25 oC but not at 37 oC

Cultured yeast cells
Mutagenize with EMS or other chemicals
Classify
mutant 
Replica plating
terminal
phenotypes:
small bud,
dumbbell,
Grow at permissive  non­growing mutants at no DNA 
25 oC 37 oC. synthesis, 
(permissive temperature)
  (non­permissive temperature)
  etc.
 Isolation of cdc mutants

cdc mutants arrest with a single cell morphology
 
at a defined cell cycle stage
 
 Cdc mutants in budding yeast
G1 (Start) mutants: cdc28, cdc4, cdc6, cdc7, etc.

S phase mutants: cdc21, cdc46, etc.

Mitosis: cdc5, cdc14, cdc15, etc.

   
 Isolate the genes encoding 
yeast cdc mutants
Yeast genomic DNA in a plasmid library (yeast selection and E. coli
drug resistant markers)
Transfromation (Li acetate, etc)
Introduce into interested cdc mutant yeast cells
37 oC
Isolate 
plasmids

Grow at permissive temperature
(25 
  oC) and yeast selection media 
25 oC
 Paul Nurse: isolate cdc mutants from distant fission yeast
Schizosaccharomyces pombe.

S. pombe has 
a short G1 but a long G2

Cdc mutants arrest in 
G2/M were isolated:
cdc2, cdc25, cdc13, etc. 

   
 The S. pombe cdc2 mutant
G2 cells Mitosis Cell division

G1 cells S phase G2 cells

Cdc2 mutant is defective in both G1 (start) and G2 phases
   
 cdc2ts
cdc2ts CDC2 plasmid

   
Wild­Type cdc2ts Cells
Cells cdc2ts Cells + Human CDC2 plasmid

   
S. Pombe CDC2 encodes an evolutionarily 
conserved serine/threonin kinase
­the fission yeast CDC2 gene by recovering the gene 
that rescues the cdc2 G2/M arrest phenotypes.

­S. pombe cdc2 mutant can be rescued by introducing 
budding yeast cdc28 (S. cerevisiae) which is primarily 
defective in G1 (Start) in budding yeast.

­human CDC2 was isolated using the same rescue strategy.

CDC2=CDC28 and regulates both G1 and G2/M.
   
 CDC2 is part of MPF activity
Xenopus MPF  Inject Oocyte Oocyte matuation
(meiosis)

Xenopus MPF Inject Oocyte Oocyte matuation

(meiosis)

Absorb by p13SUC1 beads

Bound p34 = CDC2; another protein ~ 50­60 kDa?
   
(yeast p13SUC1
 binds yeast and human CDC2)
 Discovery of cyclins (Tim Hunt)
sperm

Sea urchin fertilization   1st  1st  2nd  2nd 

egg S­phase Mitosis S­phase Mitosis
Protein synthesized:
A
B
C
A= cyclin A
   
B= cyclin B
 Cyclins behave the same as MPF

­MPF activity fluctuates; cyclin proteins fluctuate

­MPF has a kinase activity

­MPF contains CDC2 and another component

MPF= cyclin B (cyclin A) + CDC2

   
 Cyclin dependent kinases
(CDKs)
Replication
Cyclin A/B Chromatin condensation
Nuclear envelop breakdown
CDC2
Mitotic spindle formation 

Active CDC2 Kinase Activation of Anaphase Promoting 
Complex/Cyclosome (APC/C)
Chromosome cohesion, etc.

Proteolysis of cyclin A and cyclin B in late mitosis
   
inactivates CDC2 and causes the exit of mitosis.
 Wee1 and CDC25
Cell size 
A. wildtype S. pombe 

B. cdc25, cdc13, cdc2 loss of function mutants

C. wee1 and certain gain of function cdc2 mutants

CDC13
CDC25
Inactive CDC2 Active CDC2/CDC13
WEE1
   
CDC13=cyclin B
  Y=tyrosine; T=threonine
 
 CDC25 and WEE1 couples CDC2 
activation to S phase in S. pombe
WEE1 kinase
Y15­PO4  Y15 
CDC25 pptase Cells divide only 
WT CDC2 CDC2 in mitosis

Inactive CDC2 Active CDC2
S phase cells G2 and mitotic cells

Y15  F15  Insensitive

Y15F  to WEE1 Cells divide in 
CDC2 CDC2
mutant S phase
   
F=phenylalanine Active CDC2
 Regulation of CDC2 (cyclin­
dependent kinase 1, CDK1)

CDC25 is regulated by phosphorylation and protein degradation
   
 Budding yeast S. cerevisiae
CDC28 regulates G1 and G2 
but most mutants arrest before G1 start

CDC28
G1 G2/M
S

How?

   
 Budding yeast S. cerevisiae
CDC28 regulates G1, S, and G2/M by synthesize 
distinct cyclins in each phase of the cell cycle

CDC28
G1 G2/M
S
Cln1 Clb5  Clb1
Cln2 Clb6 Clb2
Cln3 Clb3
G1 progression S phase progression Clb4
Nutrient & cell  S phase checkpoint G2 and mitosis
size
   
a/α factor
 Yeast G1 cell cycle regulation
α/a mating factors
Cln1 Nutrients (carbon, nitrogen, lipid, etc.)
Cln2 Expression:

G1 G1/S S G2/M

Cln3 constant
Clb5­6

Cln1­3 accumulation leads to the progression of G1 phase
Over­expression of Cln3 promotes S phase entry at smaller size
Clb5­6 starts to synthesize at late G1
   
 How S­phase starts in yeast
α/a mating factors
Cln1 Nutrients (carbon, nitrogen, lipid, etc.)
Cln2 Expression:

G1 G1/S S

Cln3 constant
Clb5­6
p40Sic1 cdc28
Clb5­6
p40Sic1 is a CDK inhibitor
Inactive Clb5­6/CDC28 kinase
   
 How S­phase starts in yeast
α/a mating factors
Cln1
Cln2 Expression:

G1 G1/S S

Cln3 constant
Clb5­6
p40Sic1 cdc28
PO4­ p40Sic1
Clb5­6 PO4­

    SCFCDC4
 SCF Ubiquitin E3 Ligase 
(SKP1, CUL1/CDC53, F­box proteins)
ub ub
E1 & E2 enzymes ub ub
Ubiquitin(ub) ub ub
ub

26S proteosome

Substrate 
proteolysis
> 10 F­box proteins found in yeast
   
 26S proteasome proteolyzes 
polyubiquitinated proteins

   
 Clb5­6/CDC28 in S phase
Cdc28

For G1 Clb5­6 For G2/M

For S
Phosphorylate Cln1/Cln2 Clb1­4 expression 
Regulate replication  Other events for G2/M
SCF binding initiation at origins

Degradation of Cln1/Cln2

Turn­off G1 events