La hormona estimulante de la toroide (THS) influyen en un aumento de las patologas cardiovasculares ya que afectan en las funciones diastlica, sistlica

y el tono vascular perifrico. Una baja de esta hormona nos puede llevar a lo que es llamado hipotiroidismo (baja de la hormona THS) lo que conlleva a una disfuncin ventricular izquierda severa, dilatacin de la cmara al deterioro del flujo sanguneo coronario, reduciendo la densidad de las pequeas arteriolas y una eventual insuficiencia cardiaca. Los estudios de Hunt revelaron que no solo los pacientes con insuficiencia cardiaca tienen una mayor incidencia de la funcin TH baja sino que tambin demostr que los niveles mas altos de la hormona estimulante que se encuentra dentro de los rangos normales lo que lleva un aumento de la mortalidad por enfermedad coronaria arterial en las mujeres y las desfavorables de lipidos sericos en todos los pacientes. La baja funcin tiroidea en la insuficiencia cardiaca y los beneficios potenciales del tratamiento fue examinado recientemente por Gerdes y Levarsi

Estudios en animales demuestran efectos beneficiosos de la THS en la remodelacin y la funcin cardiaca en la miocardiopatia dilatada , la hipertensin y el infarto de miocardio sin aumentar la frecuencia cardaca por encima de los valores normales, en el estudio se a determinado que el flujo de alteracin glucemia en reposo y al mximo en hamsters BIO-TO2 el hipotiroidismo subclnico, y la normalizacin del flujo de sangre despus de recibir un tratamiento con TH , dio como resultado varios beneficios en la patologa cardaca subyacente. El siguiente estudio revelo que despus de un tratamiento con T3 en una rata que padeca hipotiroidismo se determino una rpida remodelacin vascular coronaria, si bien los efectos son vasomotores de la THS son reconocidos, este resultado siguiere que la THS puede trabajar de otra manera como de remodelacin vascular

Animales modelo y estudios de diseo Los animales utilizados en este estudio estaban bajo los estndares y conforme ala gua de servicios de salud publica para el cuidado y use de animales de laboratorio, los experimentos fueron revisados y aprobados por la investigacin Sanford / Universidad del Sur de Dakota, el servicio quirrgico fue facilitado por Charles River Laboratorios, Las ratas hembras Sprague-Dawley tenan TX a la edad de 10 semanas. Estas ratas con TX tienen un mnimo de 8 semanas para padecer hipotiroidismo. se dividieron aleatoriamente en tres grupos experimentales (12 ratas / grupo). Para as asegurar una adecuada operacin de TX y as establecer el hipotiroidismo las ratas con signos vitales normales las excluyeron del estudio. Dos grupos fueron tratados con T3, les administraron 14 mg / kg / da, cada 24 horas para 36 y 72 horas respectivamente. El otro grupo se trato con una solucin salina como placebo . Con doce semanas de edad y emparejados por sexo las ratas Sprague-Dawley sin ciruga sirvieron como controles. Todas las ratas fueron expuestas a un ciclo de doce horas de luz y oscuridad teniendo en cuenta estndares de comida de rata y agua ad libitum.

La concentracin srica de THS se determino utilizando un kit Elisa TSH el suero de T3 Y T4 fue determinado utilizando los kit totales de T3 Y T4 DE ELISA. El peso, el peso del corazn y la frecuencia cardiaca se registraron durante los experimentos terminales despus de recolectar los ecocardiogramas a cada animal se le anestesio con isofluorano al 5% , y se abri la cavidad torcica. Detuvieron su corazn en distole y la vasodilatacin se consigue inyectando 0,2% 2,3butanodiona monoxima recin preparada y 0,1% de solucin de adenosina en el ventrculo izquierdo, los corazones fueron removidos y lavados con buffer fosfato salino helado se transfirieron y se pesaron. Los VIs fueron disecados y pesados. Se cortaron apical y basalmente de Vis, y luego los almacenaron congelndolos para un anlisis de ARN y de protenas. El resto fue cortado transversalmente, e incorporado en el complejo y congelados, o guardados por inmersin fija en formol al 10% para anlisis morfomtricos.

Con la camara olympus 1000 fluoview laser con focal de microscopio se tomaron todas las imgenes de fluorescencia. Los cambios en la densidad arteriola miocardio se cuantificaron segn su forma como se informo anterior mente, tambin se modifico el protocolo anterior para una mayor eficacia en el reconocimiento de las arteriolas mas pequeas. La combinacin Isolectina y -actina de msculo liso fueron utilizados en lugar de un SMA-solamente. Esto permite la identificacin de arteriolas mas pequeas, q muy amenudo tenan una baja cobertura de clulas musculares lisas. Con esto hubo una reconstruccin en 3D de los pequeos vasos que se identifican claramente como arteriolas , en estudios anteriores estos vasos no eran cuantificables De paraffinized-, re-hidratadas secciones de tejido se calentaron a 95 C en 10 mM citrato de Na, pH 5,0 que contiene 0,05% de Tween-20 durante 20 minutos, se enfriaron a temperatura ambiente, y se incubaron con solucin de bloqueo durante 30 minutos. El bloqueo y la solucion diluyente para anticuerpos fueron 2% de albmina srica bovina en Tris-buffer salina que contiene 0,05% de Tween-20 y 1 mM de CaCl2 Las secciones fueron teidas con fluorescena isothiocyanateconjugated IB4 y SMA- anticuerpo marcado con Cy3 tinte fluorescente durante una hora, se lavaron en una solucion de anticuerpo diluyente cubreobjetos con Fluoromount G .

ASI LAS ARTERIOLAS DEL MIOCARDIO SE VISUALIZARON POR MICROSCOPIA. La densidad de las arteriolas se calculo en base de las siguiente formula : DL (DL duracin media de las arteriolas / por volumen de mitosis) (mm / mm3) = (a / b) / M donde a y b son las arteriolas externas de dimetros mximo y mnimo, respectivamente, y M es el rea de tejido. La DL arteriolar se convirti en la longitud total de arteriolas multiplicando DL (mm/mm3) por peso del VI expresado en mm3 (~1 mg de tejido cardaco es equivalente a 1 mm3). La densidad capilar se determino por microscopia de criosecciones de metanol fijo de OCT en tejidos embebidos de VI de reas que contengan slo crculos , cortes transversales de perfiles de capilares teidos con IB4-FITC y -SMA-Cy3 . El nmero de IB4 positivo (-SMA-negativo) de capilares se normaliz al rea de tejido y se convirti en longitud del capilar total multiplicando la densidad numrica capilar (number/mm2) por peso del VI expresado en mm3. Hay anticuerpos especficos Ki67 y 4,6-diamidino-2-phenylindole se utiliza para detectar la proliferacin de ncleos en criosecciones de 5 mm. Los anticuerpos secundarios conjugados con Alexa-Flour-488 o 568-AlexaFlour se diluyeron 1:1000. El IB4-FITC se utiliz para detectar CE. Las CMLV se detectaron con -SMA-Cy3. Los pericitos se detectaron con un anticuerpo especfico NG2 o PDGFR- . Colocalizacin de etiquetado se determin mediante microscopa confocal. 100 campos microscpicos por muestra (40X) fueron examinados.

La frecuencia cardaca se determin mediante una ecocardiografa VisualSonics Vevo660 de alta resolucin de imgenes. Los animales estuvieron sedados ligeramente con un 1,5% isofluorano y en modo M se obtuvieron imgenes de eje corto del VI en el nivel de los msculos papilares.

PCR cuantitativa en serie Ubo un aislamiento de ARN del tejido cardaco entre 50-100 mg utilizando el reactivo TRIzol seguido por la purificacin del RNA con el kit de PureLink RNA Mini y la digestin del ADN con el PureLink DNasa kit . Se agruparon igual cantidad de ARN de alta calidad de cada muestra dentro de un grupo experimental particular. cDNA fue sintetizado utilizando RT2 kit Primera Strand. La expresin de 84 inhibidores de la angiognesis y agonistas se analiz por PCR cuantitativa utilizando el RT2 Profiler de matriz qPCR por las instrucciones del fabricante. El ABI 7500 PCR en tiempo real, instrumento operado por la versin del software 1.3.0 se utiliz para todos los experimentos (Life Technologies, Carlsbad, California). Los datos de expresin se analizaron mediante anlisis de expresin SABiosciences plantilla en Excel.

Todos los datos se presentan como media sem de solo un sentido los modelos ANOVA se utilizo para todas las respuestas. Utilizaron El test post hoc de Dunnett para comparar los grupos de tratamiento con el grupo control y con grupo TX, los analisis estadisticos se hicieron con un programa llamado SIGMASTAT en su versin 3.5

Datos fisicos Las ratas con hipotiroidismo se le administraron inyecciones intraperiotoneales de T3 (14 mg / kg cada 24 horas). Un grupo de ratas con TX fue inyectado con TX recibiendo un total de 2 inyecciones en un lapso de 36 horas que duro el tratamiento y otro grupo recibi 3 inyecciones fue tratado por 72 horas.se selecciono la dosis de 14 mg / kg / da,para producir un efecto pronunciado farmacolgico de la T3 en el corazn.

El tratamiento T3 result en niveles elevados de circulacin T3(Figura 1A). La frecuencia cardaca fue menor en las ratas TX en comparacin con ratas control y se normaliz al controlar los niveles despus de 36 horas de tratamiento T3. 72 horas de tratamiento T3 aumenta la frecuencia cardiaca por encima de los niveles de control (Figura 1B). La TSH srica fue mayor en las ratas TX, en comparacin con el control y se redujo a un nivel normal despus de 36 horas de tratamiento T3 (fig. 1C). Las circulantes de concentracin de T4 en los animales con TX fue anormalmente baja y no se vio afectada por el tratamiento T3 (Figura 1D). Las ratas TX mostraron una reduccin significativa del peso corporal, peso del corazn, y muestra atrofia cardiaca (el peso del corazn reducido a peso del cuerpo, PCo / PCu) en comparacin con los controles (Figura 1E-G). El tratamiento T3 durante 72 horas es restaurada PCo / PCu para controlar los niveles (Figura 1G).

La DL de las arteriolas se redujo en un 23% en un rango de 5 a 30 mm de tamao de las ratas con TX. Esto no alcanz significacin estadstica como se inform en los dos estudios anteriores de ratas hipotiroideas.

En comparacin con las ratas con TX, la DL de 5 a 30 mm de las arteriolas aumentaron en un 61% a las 36 horas y 91% a las 72 horas.
La rpida accin de T3 inducida por aumento de las pequeas arteriolas podra ser debido a la divisin de vasos (intususcepcin). Se hizo un examen exhaustivo de los vasos en la imagen confocal. No hay evidencia de divisin arteriolar observada alguna vez.

Se ha demostrado que las arteriolas recin formadas se reactivan con anticuerpo -SMA, pero no con el msculo liso de la cadena pesada de miosina (ML-CPM) de anticuerpos. A medida que estas arteriolas maduran, comienzan expresar ML-CPM. En consecuencia, el potencial de T3 relacionados con las diferencias en el patrn de expresin de -SMA y ML- CPM fueron examinados en un esfuerzo por detectar brotes arteriolares. La mayor de las arteriolas claramente etiquetados con ambos marcadores (Figura 4A). A pesar de la drstica reduccin en la intensidad etiqueta de ML-CHM de las arteriolas ms pequeas que fue observada, no hubo diferencias entre los grupos.

Observaciones confocal de cortes de tejido co-marcados con IB4 y -SMA revel que muchas de las arteriolas ms pequeas con un estrato discontinuo de msculo liso eran excluidas con el mecanismo de etiquetado nico debido a la clasificacin incierta. La longitud de las arteriolas se volvi a evaluar usando este mtodo de doble etiquetado. Este nuevo enfoque dirigido a la mejora en la objetividad y reproducibilidad en la medicin de las pequeas arteriolas. En la Figura 4B se muestra la facilidad con que las arteriolas pequeas con una capa discontinua o continua de clulas musculares lisas pueden ser identificadas utilizando doble etiquetado.

Se observ en las ratas con TX tratadas con T3 durante 72 horas, un incremento en las arteriolas pequeas (10-18 mm de dimetro) (Figura 4C).

El tratamiento T3 tambin condujo a una: Reduccin de la longitud total de las arteriolas ms pequeas (5-9 rango mm), que inclua arteriolas con una capa de msculo liso discontinua (Figura 4C).

LA INDUCCIN DE LA PROLIFERACIN CELULAR T3 La proliferacin de las clulas fueron detectadas por la presencia de antgeno Ki67 en los ncleos, un marcador de proliferacin celular expresadas durante todas las fases activas del ciclo celular (G1, S, G2 y mitosis). No hubo cambios en la proliferacin celular 36 horas despus de la inyeccin T3 (Figura 5). El tratamiento T3 durante 72 horas, sin embargo, condujo a un aumento significativo en el nmero de Ki67 positivos CE, CMLV y pericitos. c-Kit etiquetado fue examinado para estudiar el posible papel de las clulas madre en este proceso. La frecuencia de etiquetado era extremadamente baja (5-9 clulas positivas por parte transversal del ventrculo izquierdo y del tabique del corazn de rata, datos no mostrados) y no hubo diferencias entre los grupos que indican que las clulas madre no pueden jugar un papel en la etapa inicial de las arteriolas mediadas por T3 en la remodelacin inducida en animales hipotiroideos.

El potencial de T3 relacionados con las diferencias en el patrn de expresin de -SMA y MLCPM fueron examinados en un esfuerzo por detectar brotes arteriolares. Se ha demostrado que las arteriolas recin formadas se reactivan con anticuerpo -SMA, pero no con el msculo liso de la cadena pesada de miosina (ML-CPM) de anticuerpos. A medida que estas arteriolas maduran, comienzan a expresar ML-CPM. En consecuencia, el potencial de T3 relacionados con las diferencias en el patrn de expresin de -SMA y ML-CPM fueron examinados en un esfuerzo por detectar brotes arteriolares. La mayor de las arteriolas claramente etiquetados con ambos marcadores (Figura 4A). Extensas observaciones confocal de cortes de tejido co-marcados con IB4 y -SMA revel que muchas de las arteriolas ms pequeas con un estrato discontinuo de msculo liso eran excluidas con el mecanismo de etiquetado nico debido a la clasificacin incierta. En consecuencia, la longitud de las arteriolas se volvi a evaluar usando este mtodo de doble etiquetado. Cabe sealar que este es un nuevo enfoque dirigido a la mejora en la objetividad y reproducibilidad en la medicin de las pequeas arteriolas.

En la Figura 4B se muestra la facilidad con que las arteriolas pequeas con una capa discontinua o continua de clulas musculares lisas pueden ser identificadas utilizando doble etiquetado.
Se observ en las ratas con TX tratadas con T3 durante 72 horas, un incremento en las arteriolas pequeas (10-18 mm de dimetro) (Figura 4C). Cabe destacar que el tratamiento T3 tambin condujo a una reduccin de la longitud total de las arteriolas ms pequeas (59 rango mm), que inclua arteriolas con una capa de msculo liso discontinua (Figura 4C).

A) Pila de proyeccin de imgenes Confocal del punto representante de la sucursal en las arteriolas de espesor (30 mm) en crio secciones. B. Protocolo modificado morfo mtrico aumenta la sensibilidad de la medicin de las pequeas arteriolas con una cobertura incompleta CMLV, ejemplos de pequeos (paneles superiores) y los vasos ms grandes (paneles inferiores) C. Los cambios de la distribucin del tamao de las arteriolas 72 h despus del inicio del tratamiento T3 en comparacin con la distribucin del tamao de las arteriolas en ratas con TX, -SMA actina alfa de msculo liso, IB4 - isolectina B4, ML-CPM - la cadena de miosina del msculo liso pesado. Los valores son medias SEM. La induccin de la proliferacin celular T3: La proliferacin de las clulas fueron detectadas por la presencia de antgeno Ki67 en los ncleos, un marcador de proliferacin celular expresadas durante todas las fases activas del ciclo celular (G1, S, G2 y mitosis).

No hubo cambios en la proliferacin celular 36 horas despus de la inyeccin T3 (Figura 5). El tratamiento T3 durante 72 horas, sin embargo, condujo a un aumento significativo en el nmero de Ki67 positivos CE, CMLV y pericitos. c-Kit etiquetado fue examinado para estudiar el posible papel de las clulas madre en este proceso. La frecuencia de etiquetado era extremadamente baja (5-9 clulas positivas por parte transversal del ventrculo izquierdo y del tabique del corazn de rata, datos no mostrados) y no hubo diferencias entre los grupos que indican que las clulas madre no pueden jugar un papel en la etapa inicial de las arteriolas mediadas por T3 en la remodelacin inducida en animales hipotiroideos.