Universidade Federal de Santa Catarina Ps-Graduao em Engenharia de Alimentos

w Effect of preservatives for food grade C-PC from w Spirulina platensis w

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Sanjiv K. Mishra, Anupama Shrivastav, Sandhya Mishra w

Discipline of Marine Biotechnology and Ecology, Central Salt and Marine Chemicals Research Institute, G.B. Marg, Bhavnagar 364002, India w w Received 4 June 2007; received in revised form 20 November 2007; accepted 19 December 2007

Process Biochemistry 43 (2008) 339345

Doutorandas: Cntia Carla Penso Darlene Cavalheiro

Spirulina platensis
 A Spirulina platensis tem sido utilizada a mais de 100 anos como um excelente suplemento nutritivo para seres humanos e animais devido ao seu perfil nutricional, alto contedo proteico e pela composio equilibrada de todos os aminocidos essenciais.  A Spirulina contm vitamina A, C, E, beta-caroteno, xantofila, clorofila, mega-3, minerais e ficobiliprotenas, entre elas, em quantidade relativamente alta, a C-ficocianina (C-PC).  As ficobiliprotenas so os maiores pigmentos fotossintetizantes, de cor brilhante, aquossolveis e representam cerca de 20-28% do peso seco das cianobactrias.

C-Ficocianina (C-PC)
 A ficocianina um complexo proteico azul encontrado em vrias espcies de cianobactrias, como por exemplo, na S. platensis no txica, podendo ser empregado em alimentos.  Estruturalmente, a ficocianina uma biliprotena oligomrica com o cromforo tetrapirrlico linear, conhecido como bilins, e este covalentemente ligado a apoprotena por uma ligao tioter.

Aplicao da (C-PC)
 A C-PC pode ser utilizada como ingrediente nutricional e corante natural para alimentos e cosmticos, alm de ser um potencial agente teraputico em doenas oxidativas induzidas pelo estresse, como marcador fluorescente em pesquisas biomdicas e recentemente usado como um corante alimentcio natural na China.  Para ser utilizada na indstria de alimentos, a C-PC deve ser de grau alimentcio e estar na forma estabilizada, ou seja, no pode sofrer degradao de suas propriedades.  O uso de conservantes alimentcios tem a finalidade de conferir estabilidade para a C-PC para que a mesma possa ser obtida e armazenada com suas propriedades no degradadas para posterior aplicao em alimentos.

Do que trata o artigo?

 Estudo do efeito de conservantes comestveis na estabilidade da C-PC obtida de Spirulina platensis em soluo aquosa e em diferentes temperaturas.  A ao dos agentes estabilizantes sobre a desnaturao e o desdobramento trmico da protena C-PC foi analisada pelo mtodo DSC (Calorimetria Exploratria Diferencial).  Os agentes estabilizantes devem agir sobre as interaes hidrofbicas da protena, as quais desempenham importante papel na estabilidade da protena.

Objetivos do estudo
 Selecionar e estudar o efeito que conservantes alimentcios tem sobre a estabilidade da C-ficocianina.  Obter a C-PC de grau alimentcio e garantir sua estabilidade no processo de extrao e purificao, definindo:  o conservante e concentrao mais adequados  condies de pH e temperatura ideais

Justificativa para o estudo

 Importncia que a obteno da C-ficocianina de grau alimentcio tem para uso na rea de alimentos e mdica.  Possibilitar obteno da C-PC de grau alimentcio estabilizada atravs de um mtodo simples e eficiente que utilize conservantes alimentcios, uma vez que os mtodos comumente empregados com finalidade de obter esta protena para fins analticos utilizam compostos txicos para sua estabilizao.

Hipteses
 A hiptese central dos autores embasada no fato de que as fortes interaes hidrofbicas na parte apoproteica da C-PC desempenham uma importante funo na sua estabilidade estrutural.  Portanto, a adio de um conservante alimentcio, o qual poderia estabilizar a estrutura da C-PC na forma aquosa atravs de interaes hidrofbicas, promoveria sua estabilidade, possibilitando assim a obteno de um produto de grau alimentcio com suas propriedades de interesse preservadas durante a vida-de-prateleira.

Estratgia
 Extrao e purificao da C-PC a partir de Spirulina platensis  Realizao de experimentos para avaliar o efeito dos conservantes alimentcios selecionados (cido ctrico, sacarose e cloreto de clcio)  Estimao do contedo de C-PC em mg/ml por absorbncia  Espectrofotometria de absoro visvel da C-PC desnaturada variando a concentrao de uria  Determinao do desdobramento trmico da C-PC por Calorimetria Exploratria Diferencial (DSC)

Materiais e Mtodos
 Extrao e purificao da C-PC a partir de Spirulina platensis

Materiais e Mtodos
 Todos os materiais e reagentes utilizados nos experimentos foram de grau analtico e a Spirulina em p foi de grau alimentcio.  Realizao de experimentos para avaliar o efeito dos conservantes alimentcios selecionados (cido ctrico, sacarose e cloreto de clcio) Soluo de C-PC com 10mg de C-PC liofilizada dissolvida em 25ml de tampo fosfato de sdio. A esta soluo foram adicionados os conservantes nas seguintes concentraes e combinaes:
sacarose 0.1g cloreto de clcio 0.1g cido ctrico 0.1g sacarose 0.05g + cloreto de clcio 0.05g sacarose 0.1g + cloreto de clcio 0.1g

Tambm foi preparada uma soluo controle (sem conservante).

Materiais e Mtodos
 Estimao do contedo de C-PC em mg/ml por absorbncia A absorbncia dos conservantes contendo C-PC foi medida em dias alternados durante 15 dias em espectrofotmetro, em comprimento de onda entre 250 e 700nm. Para calcular a concentrao de C-PC foi utilizada a seguinte equao:

Anlise de pureza: a absorbncia foi determinada atravs do espectrofotmetro e a pureza foi tomada com a razo da absorbncia em 620nm e 280nm.

Materiais e Mtodos
 Espectrofotometria de absoro visvel da C-PC desnaturada variando a concentrao de uria O espectro de absoro da C-PC foi medido na escala 450-700nm usando um espectrofotmetro a temperatura ambiente como funo da concentrao de uria (0-10M). Para a medida do espectral da C-PC, amostras foram preparadas em soluo tampo de fosfato de sdio 0,1M (pH 6) com adio da concentrao de uria apropriada na faixa de 010M.  Determinao do desdobramento trmico da C-PC por Calorimetria Exploratria Diferencial (DSC) O desdobramento trmico da C-PC foi determinado usando um instrumento de DSC. Amostras de C-PC na ausncia e na presena de uma concentrao apropriada de uria (0-4M) foi escaneada de 20oC a 80oC com uma taxa de aquecimento de 40oC/h. Para as medidas de controle, soluo tampo com e sem uria foi usada.

Resultados e Discusso
 Os resultados obtidos pelos autores no estudo do efeito dos conservantes demonstram que a perda do contedo da C-PC em soluo aquosa (tampo a pH 7,0) a 0 oC menor do que a 35 oC, conforme apresentado nas Figuras 3 e 4 do artigo.

Resultados e Discusso

Resultados e Discusso
 A perda do contedo da C-PC observada depois da adio de diferentes conservadores a 0 oC muito menor, variando de 6% para 15%, enquanto que a 35 oC a perda do contedo de C-PC de 16 a 95% depois de 15 dias como mostrado na Tabela 1 e Figuras 5 e 6 do artigo.

Resultados e Discusso

Resultados e Discusso
 A ficocianina na fase aquosa foi mais estvel com o cido ctrico (4g/ml) como conservante a 35oC, como observado atravs da anlise espectrofotomtrica.

 A descolorao da ficocianina observada depois de 15 dias, tanto para 0oC como para 35oC, foi mnima.  Constatou-se somente 15% de perda do contedo de C-PC a 35oC depois de 15 dias, enquanto somente 9% de perda de C-PC foi observada a 0oC depois de 15 dias. Mesmo depois de 45 dias a C-PC em soluo aquosa com cido ctrico a 35oC apresentou-se relativamente menos descolorida, conforme Figura 7 do artigo.

Resultados e Discusso

Resultados e Discusso
 A estabilidade da ficocianina de grau alimentcio com a cido ctrico como conservante foi melhor do que em cloreto de clcio mais sacarose a 35oC. A faixa de pH 5-6 foi a mais adequada para manter as suas propriedades particulares. O cido ctrico age como um quelante e abaixa o pH prevenindo a degradao da C-ficocianina. Logo, depois da extrao e purificao da protena a adio imediata de conservante crucial antes da liofilizao e sua posterior embalagem em frascos escuros ou mbar para proteo da ao da luz.

Resultados e Discusso

O desdobramento da C-PC na presena de uria foi medido usando dados de absoro visvel em 620 nm. Na presena de 1 - 10M de uria, a absorbncia a 620nm diminuiu enquanto a concentrao de uria na soluo de protena aumentou. Estima-se que na concentrao de 6,6M de uria a desnaturao da protena C-PC est pela metade.

Resultados e Discusso
 A uria interrompe as interaes hidrofbicas, as quais tornam a desestabilizar o estado natural da protena. Conforme os autores discutem no artigo, esperado que as fortes interaes hidrofbicas na parte apoproteica da C-PC desempenhem uma importante funo na sua estabilidade estrutural. Neste ponto do estudo os autores ressaltam o importante papel do conservante adicionado, o qual tem a funo de estabilizar a estrutura da C-PC na forma aquosa, atravs de interaes hidrofbicas. O nion citrato altera a estabilidade da protena atravs da modificao da estrutura da gua, por este motivo o cido ctrico mostrou-se to eficiente na estabilizao da C-PC.

Resultados e Discusso
 Ainda, pesquisas envolvendo as sries de Hofmeister indicam que os nions citrato so cosmtropos com capacidade mxima de estabilizao.

 Estes ons aumentam a estabilidade da estrutura da protena, rompem a estrutura da gua e aumentam a solubilidade mais do que os ons cloreto, os quais so aproximadamente neutros com relao aos seus efeitos sobre a estabilidade da protena e estrutura da gua.

Concluses


O presente trabalho leva a concluso que dos trs conservantes testados (cido ctrico, sacarose e cloreto de clcio), o cido ctrico (4mg/ml) um dos mais efetivos conservantes para manter a estabilidade da C-PC na fase aquosa a 35oC por 45 dias, com perdas mnimas, portanto melhorando vida-deprateleira desta protena.

Consideraes Finais


Considerando o objetivo do trabalho proposto, hipteses e estratgia para atingir os objetivos e resultados apresentados e fundamentados na discusso pelos autores, conclumos:

Que os autores obtiveram resultados positivos e os mesmos quando aplicados ao processo de extrao e purificao da CPC, obtida a partir de Spirulina platensis, realmente contribuem para a sua estabilidade, proporcionando assim a manuteno de suas propriedades de interesse durante a vida-de-prateleira. Sendo assim, o estudo permitiu a possibilidade de obter a C-PC de grau alimentcio estabilizada para aplicao da indstria de alimentos e na rea biomdica.

Aplicaes Futuras

Como sugesto para trabalhos futuros os autores citam a possibilidade do cido ctrico poder tambm melhorar a estabilidade de outras ficobiliprotenas, mas estudos detalhados necessitam ser feitos para estabelecer sua eficcia nas mesmas.

Anlise Crtica
 O ttulo do artigo est adequado a pesquisa realizada e diretamente relacionado aos objetivos propostos.

 Os objetivos do trabalho so bem claros e a estratgia para alcanar os objetivos est bem descrita e fundamentada.  Os materiais e mtodos descrevem os materiais e reagentes, procedimentos e condies de realizao dos experimentos.  Os resultados esto bem apresentados e a discusso sobre os mesmos explora bem os dados obtidos, justificando-os e levando s concluses necessrias.  Todas as bibliografias citadas no artigo, encontram-se nas referncias bibliogrficas.

Anlise Crtica - Pontos Fracos

 Os autores citam na descrio do experimento para avaliar a eficincia dos conservantes, que os mesmos seriam combinados entre si. No entanto, apenas dois, dos trs conservantes utilizados, foram combinados e no foi apresentada justificativa para a falta de combinao do cido ctrico com a sacarose e com o cloreto de clcio.

 Os autores no comentam sobre a realizao de um planejamento experimental e no apresentam anlise estatstica.  Na apresentao dos resultados, os autores citam que os valores de k (constante de equilbrio) e de (Gapp (energia livre aparente de desnaturao) esto demonstrados na Figura 8, no entanto a figura citada no apresenta estes dados, os mesmos tm que ser calculados a partir das equaes apresentadas no decorrer do texto.

Anlise Crtica - Pontos Fracos

 Ao referenciar os dados apresentados no texto para as energias livres os autores citam que os mesmos esto apresentados na Tabela 2, no entanto a referida tabela contm dados para se chegar aos valores das mesmos. Neste caso, a referncia foi errada ou teria que ter uma terceira tabela com a apresentao destes dados. As equaes apresentadas ao longo do texto no esto numeradas, isso dificulta a identificao das mesmas ao longo da leitura.

 As temperaturas adotadas nos experimentos para anlise do efeitos dos conservantes no esto justificadas.