Produo de Protenas Recombinantes

O que so protenas recombinantes?

So protenas produzidas artificialmente a partir de genes clonados. Isto , advm da tcnica de DNA recombinante.

Para que servem?

A produo de protenas recombinantes permite obter benefcios em vrias reas: - sade; - biologia; - bioqumica; - microbiologia; - gentica; - biotecnologia; - agricultura; - etc.

Algumas aplicaes


Terapia gnica

Possibilidade de introduo de um gene num organismo e consequente correo de doenas genticas.

Melhoramento animal e vegetal

Plantas resistentes a pragas e a diferentes meios nutritivos. Animais de maiores dimenses, mais frteis e carne com maior qualidade.

Criao de modelos animais

www.dqb.fc.ul.pt

Ideais para o estudo da estrutura, funo e regulao de um gene, alm de facilitar a compreenso da fisiopatologia da doena.

Tcnica de produo de protenas recombinantes

Isolar e preparar o DNA; Escolher o vetor apropriado; O fragmento de DNA a clonar introduzido em vectores de clonagem, formando-se o DNA recombinante. O DNA recombinante inserido na clula hospedeira transformao, que possui mecanismos enzimticos para a replicao do DNA e para a sntese protica; Seleco e identificao de clulas que incorporam o DNA recombinante; Verificar se a protena foi expressa; Remoo e purificao das protenas.
The Cell- A Molecular Approach;Cooper, Geoffrey M..

Algumas enzimas envolvidas no processo

Enzimas
Tipo II (endonuclease de restrio) DNA ligase Taq DNA polimerase Transcriptase reversa

Funo
Cortam os DNAs em sequncias de bases especficas. Juntam duas molculas de DNA ou fragmentos. Adiciona os nucleotdeos na extremidade 3 da cadeia de DNA. Produz uma molcula de DNA atravs de uma molcula de RNA.

Enzimas de restrio- Endonucleases restrioOs fragmentos de DNA usados para criar molculas recombinantes so normalmente gerados por digesto atravs de endonucleases de restrio ou PCR . Conhecem pequenas sequncias especficas com 4 a 6 pares de bases. . So designadas por trs letras: EcoRI, HindIII.

Vetores de clonagem


   

Capaz de transportar uma seqncia de DNA estranha dando origem a um DNA hbrido ou recombinante. Capacidade de se auto-replicar. Conter pelo menos um gene que confira resistncia a antibiticos. Possuir locais de restrio nicos, polylinker. Fcil de purificar.

Tipos de vectores de clonagem Plasmdeos (pBR322) Fasmdeos ou fagemdeos Cosmdeos Bacterifagos YACs, BACs e PACs
www.biologianaweb.com/ Livro2/C11/pbr322.html

Vetores de expresso
  

Promotor Cdon de iniciao seguido de polylinker Local de ligao ao ribossoma

Promotor
Local de ligao ao ribossoma
Stio de clonagem e sequncia codificante de 6 histidinas

www.icampus.ucl.ac.be/. ../expression.html

www.icampus.ucl.ac.be/. ../expression.html

Vetores para clonagem gnica

O que precisa um vetor para servir de molcula carreadora?



A escolha de um vetor depende do design do experimento e de como o gene/protena clonados sero pesquisados posteriormente Alguns vetores contm uma origem procaritica de replicao o qual permite sua manuteno em bactrias.

Alguns vetores contm uma origem eucaritica de replicao permitindo replicao autnoma e epissomal em clulas eucariticas. Stios de clonagem mltiplos so geralmente includos para versatilidade e construo de bibliotecas genmicas.

Genes de resistncia a antibiticos e/ou marcadores selecionados permitem a identificao de clulas que adquiriram o vetor. Alguns vetores possuem promotores induveis ou tecido-especficos que permitem a expresso controlada dos genes introduzidos em clulas transfectadas ou animais transgnicos.

Vetores mais modernos possuem elementos multi-funcionais que permitem uma combinao de clonagem, seqenciamento de DNA transcrio e replicao epissomal.

Muitos tipos de vetores



Plasmdeos, bacterifagos, cosmdeos, cromossomo artificial bacteriano (BAC), cromossomo artificial de fungos (YAC), retrovrus, vetor de baculovrus...

Escolha do vetor


Depende da natureza e do protocolo de experimento Tipo de clula que vai receber o vetor
 

Procaritica Eucaritica

Vetor de Plasmdeo
  

Fechado, circular, DNA dupla fita, ocorre naturalmente em bactrias e replica extracromossomalmente Muitos conferem resistncia a drogas para cepas bacterianas Origem de replicao presente (ORI)

Examplos


pBR322  Um dos primeiros plasmdeos utilizados  Dois marcadores (resistncia a Amp and Tet)  Vrios stios de restrio espalhados atravs do plasmdeo  ColE1 ORI

pUC18
 

Derivado do pBR322 Vantagens sobre pBR322:

  

Pode acomodar fragmentos de DNA maiores durante a clonagem (5-10kbp) MAior nmero de cpias por clula (500 per cell = 5-10x mais que pBR322) Mltiplos stios de clonagem = polylinker

Esquema geral de clonagem



O vetor e o gene a ser clonado so purificados separadamente e depois ligados entre si Produtos ligados so introduzidos em clulas competentes por tcnicas de transformao. As colnias so analizadas individualmente.

Os vetores que vm de bactrias que sobreviveram seleo por antibiticos so amplificados em outras bactrias O plasmdeo contendo DNA purificado em larga escala

F. Vetores cosmdeos


Molculas hbridas contendo DNA de plasmdeos e de bacterifagos lambaLambda components: COS sequences (required for in vitro packaging into phage coats)
 

Componentes do plasmdeo: ORI + Gene de resistncia aos antibiticos Os stios de clonagem vm do lambda

F. Vetores cosmdeos

Aps a transformao da bactria, o rDNA replica como plasmdeo. Insertos bem grandes podem ser acomodados por cosmdeos (mais de 35-45 kbp)

Bacterial artificial chromosomes (BACs)

   

Pode acomodar mais de 1 Mb de DNA (= 1000kbp) Vrios componentes de replicao e de controle de nmero de cpias esto presentes Marcadores e stios de clonagem em diferentes lugares Outras caractersticas:


Prmotores SP6 and T7

 

Sntese de RNA mais eficiente Sondas de RNA para hibridizao

Bacterial artificial chromosomes (BACs)

I. Yeast artificial chromosomes (YACs)

 

Molcula hbrida contendo componentes de fungos, protozorios e bactrias (plasmdeos) ORI = ARS (autonomously replicating sequence)  MArcadores (TRP1 and URA3)  Centrmero de fungos Protozoa= Tetrahymena  Sequncias de telmeros



Plasmdeos bacterianos

 

Polylinker

Pode acomodar >1Mb (1000kbp = 106 bp)

I. Yeast artificial chromosomes (YACs)

I. Yeast artificial chromosomes (YACs)

Human artificial chromosomes

   

Devenvolvidos em 1997 sintticos, autoreplicantes 1/10 do tamanho de um cromossomo normal Microcromossomo que passa para as clulas durante a mitose Contm:
    

ORI Centrmero Telmero Cap protetor de DNA repetitivo no fim do cromossomo Histonas dadas pela clula hospedeira

J. Human artificial chromosomes

Transformao


Ocorre quando uma clula incorpora e exprime um fragmento de material gentico. Para a introduo do DNA recombinante podem ser utilizados vrios mtodos:

Clulas competentes; Eletroporao; Bombardeamento de DNA revestido de Tungstnio; Microinjeo; Transfeco.

Modern Genetic Analysis.

Extraco e purificao de protenas

Extrao lise celular

Purificao
Cromatografia de afinidade

Lehningher Principles of Biochemistry

Tags moleculares de fuso

Fusion Tag Glutathione (Stransferase(GS T) Immobilized Ligand Reduced glutathione Binding Conditions Neutral (physiologic) pH, and non-denaturing; glutathione must be reduced and GST must be active Neutral (physiologic) pH without reducing or oxidizing agents; small tag must be accessible in fusion protein structure; high ionic strength and denaturants (chaotropes such as 8 M urea) compatible. Neutral (physiologic) pH and non-denaturing; NaCl added to reduce nonspecific binding Neutral (physiologic) pH and non-denaturing Elution Conditions Free reduced glutathione at neutral pH (competitor) Available Formats Prepacked column kits, spin cup column kits, SwellGel Discs, coated microplates Prepacked column kits, spin cup column kits, SwellGel Discs, Swell- Gel Discs in 96-well filter plates, coated microplates

Histidine-tagged

Chelated Nickel or Cobalt

>200 mM Imidazole, low pH, or strong chelators

Maltose Binding Protein (MBP) Green Fluorescent Protein (GFP)

Dextrin

Maltose at neutral pH (competitor)

Gel slurry, coated microplates

Anti-GFP antibody

Usual antibody/antigen elution buffers (e.g., low pH or chaotropic salts)

Coated microplates

Exemplos de Protenas Recombinantes



Hormnio de crescimento humano a administrao deste hormnio durante a infncia permite a correo dos casos de nanismo. Anticoagulantes ativadores de plasminognio tecidual que por sua vez ativam a plasmina, enzima que dissolve os trombos (evita ataques cardacos). Dismatase do superxido previne danificao de tecidos quando este exposto falta de oxignio. Anticorpos monoclonais so usados em testes diagnsticos; transporte direccionado (drogas, toxinas, componentes radioactivos utilizados na terapia cancergena), assim como outras aplicaes.
ioh.medstudents.com.br/ humoral.htm

Insulina
Referncia cronolgica


1922 - Frederick Grant Banting descobre a insulina. 1978 - produzida insulina humana recombinante. 1982 - Esta insulina disponibilizada no mercado.

Insulina
-

Duas cadeias peptdicas- cadeia A e cadeia B. Duas pontes dissulfeto entre as cadeias A e B e outra na prpria cadeia A.

Insulina recombinante
Monmeros- Insulina ativa na forma de monmeros. Dmeros pontes de hidrognio entre as extremidades C da cadeia B.
http:\\bio.chm.nu.edu\resources\webproject\rasHol\tutorial\isulina4.htm

Zn 2+

http:\\bio.chm.nu.edu\resources\webproject\rasHol\tutorial\isulina4.htm

Produo de insulina
 

Insulina proveniente de sunos e bovinos Insulina humana biossinttica

Introduction to Genetic Analysis.

Purify -gal- insulin fusion proteins -gal

SAG

Seqncia

Referncia

SAG1 SAG2 SAG3

Forward: CGGAATTCATGTCGGTTTCGCTGCACCAC Reverse: CCCAAGCTTCACTCACGCGACACAAGCTG Forward: GCGGATCCATGAGTTTCTCAAAGACCACG Reverse: GGGAATTCTTACACAAACGTGATCAACAA Forward: GAGGATCCATGCAGCTGTGGCGGCGCAG Reverse: GGGAATTCTTAGGCAGCCACATGCACAA

Burg et al, 1988 Parmley et al, 1992 Cebron-Delauw, 1994

Padro

SAG2

SAG1

SAG3

1500pb 900pb

500pb 400pb 300pb 200pb

100pb

A- SAG1 CEPA RH 5`ATGTCGGTTTCGCTGCACCACTTCATTATTTCTTCTGGTTTTTTGACGAGTATGTTTCCGAAGGCAGTGAGACGCGCCGTCACGGCAG GGGTGTTTGCCGCGCCCACACTGATGTCGTTCTTGCGATGTGGCGTTATGGCATCGGATCCCCCTCTTGTTGCCAATCAAGTTGTCACC TGCCCAGATAAAAAATCGACAGCCGCGGTCATTCTCACACCGACGGAGAACCACTTCACTCTCAAGTGCCCTAAAACAGCGCTCACA GAGCCTCCCACTCTTGCGTACTCACCCAACAGGCAAATCTGCCCAGCGGGTACTACAAGTAGCTGTACATCAACGGCTGTAACATTGA GCTCCTTGATTCCTGAAGCAGAAGATAGCTGGTGGACGGGGGATTCTGCTAGTCTCGACACGGCAGGCATCAAACTCACAGTTCCAA TCGAGAAGTTCCCCGTGACAACGCAGACGTTTGTGGTCGGTTGCATCAAGGGAGACGACGCACAGAGTTGTATGGTCACGGTGACAG TACAAGCCAGAGCCTCATCGGTCGTCAATAATGTCGCAAGGTGCTCCTACGGTGCAGACAGCACTCTTGGTCCTGTCAAGTTGTCTGC GGAAGGACCCACTACAATGACCCTCGTGTGCGGGAAAGATGGAGTCAAAGTTCCTCAAGACAACAATCAGTACTGTTCCGGGACGAC GCTGACTGGTTGCAACGAGAAATCGTTCAAAGATATTTTGCCAAAATTAACTGAGAACCCGTGGCAGGGTAACGCTTCGAGTGATAAG GGTGCCACGCTAATGATCAAGAAGGAAGCATTTCCAGCCGAGTCAAAAAGCGTCATTATTGGATGCACAGGGGGATCGCCTGAGAAG CATCACTGTACCGTGAAACTGGAGTTTGCCGGGGCTGCAGGGTCAGCAAAATCGGCTGCGGGAACAGCCAGTCACGTTTCCATTTTT GCCATGGTGATCGGACTTATTGGCTCTATCGCAGCTTGTGTCGCGTGA 3` B- SAG2 CEPA RH 5ATGAGTTTCTCAAAGACCACGAGCCTAGCGTCGCTAGCGCTCACGGGCTTGTTTGTTGTGTTCAAGTTCGCTCTTGCGTCCACCACC GAGACGCCAGCACCCATTGAGTGCACTGCCGGCGCAACGAAGACTGTTGATGCACCCTCCAGTGGTTCCGTTGTCTTCCGATGTGGG GATAAACTAACCATCAGTCCCAGTGGCGAAGGTGATGTCTTTTATGGCAAGGAATGCACAGACTCGAGGAAGTTGACGACTGTCCTTC CAGGTGCGGTCTTGGCAGCTAAGGTCGAGCAGCCCCCGAAAGGTCCTGCTACCTACACACTGTCTTACGACGGTACTCCCGAGAAAC CTCAGGTTCTCTGTTACAAGTGCGTTGCCGAAGCAGGTGCTCCCGCTGGTCGAAATAATGATGGTGGTTCTAGCGCTCCGACGCCTAA AGACTGCAAACTCATTGTTCGCGTTCCGGGTGCCGATGGCCGTGTCACATCTGGGTTTGACCCTGTGTCTCTCACGGGCAAGGTTCTT GCTCCCGGTCTCGCAGGTTTGTTGATCACGTTTGTGTAA 3` C- SAG3 cepa rh 5ATGCAGCTGTGGCGGCGCAGAGCAGCAGGTCCCGCGAGCCTGGGGAGGCAGTCTTTGCCGCTCGGGTGTTTTTTCGCGGCTTTTGG TTTGTGCGTGTTGTCTGCGATCTTGGGAACCGGAGAGCACGGACTGTTCGTCGCCGCAGGGAAATCGAGAAGTAAGATAACCTATTTT GGCACGCTCCTCAAGAAGGCTCCGAACTGGTACCGCTGCTCTTCAACGAGGGCGAATGAAGAGGTCGTAGGACATGTGACGCTGAA CAAAGAGCACCCTGATATGACAATTGAATGCGTCGACGACGGCTTGGGCGGAGAGTTTTTGCCGCTCGAAGGCGGCACGTCGTCGTA CCCGCGAGTATGTCACATTGATGCCAAGGACAAGGGCGACTGCGAGCGCAACAAGGGCTTTCTGACCGACTACATACCGGGCGCGA ACAGGTACTGGTACAAGATAGAAAAGGTGGAGAACAACGGCGAGCAATCCGTTCTGTACAAATTCACAGTTCCTTGGATATTCCTTCC GCCCGCCAAGCAGCGATACAAGGTTGGATGCCGATACCCGAACCACGAGTATTGCTTTGTTGAGGTCACCGTCGAACCCACGCCGCC AATGGTCGAAGGCAAGAGAGTGACCTGCGGGTATCCCGAGTCCGGCCCCGTGAATCTCGAGGTGGACTTGTCAAAGGACGCGAACT TTATCGAGATTCGGTGCGGCGAACAGCACCACCCGCAGCCGTCGACCTACACGCTGCAGTACTGCTCAGGTGACTCGGTGGACCCGC AGAAGTGTTCGCCGCAGTCCCTGACGAACATTTTTTATGACTACAGCTCTTCGTGGTGGAAGGGGAAACTGAACGGGCCTGACGGGG CAACTCTCACCATTCCACCCGGCGGGTTCCCCGAAGAAGACAAATCTTTTCTTGTCGGGTGTTCACTCACTGTGGACGGGCCGCCCTT CTGCAACGTCAAAGTGAGAGTTGCCGGGAACCCCAGAAAGTGGGGGAGAGGCGGAGGCGGCCATCCAGGAAGCGGAGGATTGCAG CCGGGAACTGAAGGGGAAAGTCAAGCTGGAACAGAAAGTTCAGCCGGCGCGAGTTCGCGAATGGCTTCCGTTGCCCTGGCGTTCCTT CTCGGTCTCCTTGTGCATGTGGCTGCCTAA 3

A - SAG1 M S V S L H H F I I S S G F L T S M F P KAV R RAV TAG V FAAP T L M S F L RC G V MAS D PPLVAN Q V V TC PD K K S TAAV I LTPTE N H FTLK C PK TALT E PPT LAYS PN R Q I C PAGT T S S C T S KAV T LS S LI PEA EDSWWTGDSASLDTAGIKLTVPIEKFPVTTQTFVVGCIKGD DAQSCMVTVTVQARASSVVNNVARCSYGADSTLGPVKLSA EGPTTMTLVCGKDGVKVPQDNNQYCSGTTLTGCNEKSFKD ILPKLTENPWQGNASSDKGATLTIKKEAFPAESKSVIIGCTG G S P E K H H C T V K L E FAGAAG SAK SAAG TAS H V S I FAM V I G L I GSIAAC VA B - SAG2 MS F S K T T S LAS LALT G LF V V F K FALAS T T E T PAPI E C TAGAT KTVDAPSSGSVVFRCGDKLTISPSGEGDVFYGKECTDSRK LTTV LPGAV LAAK V E QPPK G PATYTLSYD G TPE K PQV LCYK CVAEAGAPAG RNND GG S SAPTPKD CKLIV RV PGAD GRV TS G F D PV S LT G K V LAPG LAG LLI T F V C - SAG3 M Q L W R R RAAG PAS L G R Q S L PL G C F FAAF G L C V L SAI L G T G E H G L F VAAG K S R S K I T Y F G T L L K KAP N W Y R C S S T RAN E E V V GHVTLNKEHPDMTIECVDDGLGGEFLPLEGGTSSYPRVCHI DAKDKGDCERNKGFLTDYIPGANRYWYKIEKVENNGEQSV LYKFTV PW IFLPPAK QRYKV G CRYPNHEYCFV E V TV E PTPP MVEGKRVTCGYPESGPVNLEVDLSKDANFIEIRCGEQHHP QPSTYTLQYCSGDSVDPQKCSPQSLTNIFYDYSSSWWKGK LNGPDGATLTIPPGGFPEEDKSFLVGCSLTVDGPPFCNVKV RVAGNPRKWGRGGGGHPGSGGLQPGTEGESQAGTESSAG AS S R MAS VALAFLLG LLV H VAA

SAG3

Plasm

SAG1

SAG2

Padro

45 Kda 35 Kda 24Kda

Positivo SAG1

Negativo

SAG2

SAG3

IgGTotal Neg
25000 20000

IgG1 Neg Pos

76%

IgG3 Neg Pos

40%

Pos
86%

SAG1

RLU

15000 10000 5000 0 25000 68% 20000 62% 14% 24% 60%

28%

SAG2

RLU

15000 10000 5000 0 25000 20000 71% 32% 38% 72%

62%

27%

SAG3

RLU

15000 10000 5000 0 25000 29% 38% 63%

76%

GIPLs
RLU

20000 15000 10000 5000 0 32% 24%

68%

32%

68%