El ADN y la Ingeniera gentica

Tema 16

Biotecnologa

Utilizacin de los seres vivos para obtener productos tiles al ser humano

Produccin de alimentos y bebidas Obtencin de medicamentos

La ingeniera gentica puede definirse como un conjunto de tcnicas, nacidas de la Biologa molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo.
Clonacin, mapas genticos, Organismos transgnicos, terapia gnica

Biotecnologa

Utilizacin de los seres vivos para obtener productos tiles al ser humano

Tecnologa del ADN recombinante (dcada 70)

Alimentos Medicamentos Bebidas

Ingeniera gentica
No hay modificacin de genes

Animales y plantas transgenicas

Si hay modificacin de genes

Tcnicas utilizadas en Ingeniera gentica

Obtencin de ADN recombinante

Clonacin de ADN

PCR

Secuenciacin de ADN

Aplicaciones de la ingeniera gentica

Medicina
Diagnstico de enfermedades Medicina forense Produccin de medicamentos

Agricultura
Plantas resistentes Fbricas de medicamentos

Ganadera
Mejora del rendimiento Obtencin de rganos Obtencin de medicamentos

Medio ambiente
Biorremediacin Biolixiviacin

Nuevas disciplinas surgidas de la ingeniera gentica

Genmica
Estudio genoma

Protemica Estudio de las protenas de un organismo

Farmacogentica Fabricacin de medicamentos personalizados

Estructural Funcional

Tecnologa del ADN recombinante

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Fragmentar y aislar el ADN Unin a vectores. Introduccin en las clulas. Clonacin Bsqueda del clon idneo. Anlisis del ADN clonado: transferencia Southern, Secuenciacin. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Enzimas de restriccin
1. Endonucleasas que cortan el ADN por una secuencia (siempre la misma) corta y conocida. 2. Las secuencias de corte son palindrmicas 3. El corte puede ser: o Liso o Escalonado (extremos cohesivos o pegajosos)

Posteriormente, los fragmentos de distintos ADN cortados con la misma enzima se podrn unir mediante otro enzima, una ADN ligasa

ADN recombinante

Formacin de ADN complementario por hibridacin

Tenemos dos tipos distintos de ADN Se separan las cadenas de ADN (desnaturalizacin). Se devuelven las condiciones adecuadas y se produce la renaturalizacin. Se pueden obtener molculas hbridas de los dos tipos de ADN

El porcentaje de hibridacin est relacionado con el parentesco evolutivo

Estas tcnicas permiten localizar enfermedades genticas

Sntesis de ADNc usando ARNm como molde

Se utiliza el enzima transcriptasa inversa para sintetizar un ADNc partiendo de un ARNm maduro (sin intrones) para que pueda ser utilizado luego en bacterias (los procariotas no realizan un proceso postranscripcional de eliminacin de intrones 1. Una clula eucariota transcribe el ADN a ARNm. 2. La misma clula procesa la nueva cadena de ARNm eliminando los intrones, y aadiendo una cola poli-A y un terminal GTP. 3. Esta cadena de ARNm maduro se extrae de la clula. 4. Se hibrida un oligoncletido poli-T sobre la cola poli-A del molde de ARNm maduro, ya que la retrotranscriptasa necesita un cebador de doble cadena para comenzar a trabajar. 5. Se aade la retrotranscriptasa, junto con las bases A, T, C y G. 6. La retrotranscriptasa va recorriendo la cadena de ARNm y sintetizando la cadena de ADN complementaria del molde de ARNm (ADNc). 7. Se sintetiza la doble cadena

AAAAAA 3
TTTTTT 5

5
Transcriptasa inversa

AAAAAA 3 3 TTTTTT 5
ADNc Degradacin del ARN

TTTTTT 5
Sntesis de la otra cadena de ADN ADN polimerasa I

Nucleasa S1 elimina el bucle

ADN de doble cadena

Clonacin de ADN
En ingeniera gentica se entiende por clonacin la obtencin de mltiples copias de un gen especfico o de un fragmento de ADN en el interior de un organismo hospedador.
Estos organismos deben cumplir las siguientes caractersticas: 1. 2. 3. 4. 5. Crecimiento rpido No debe ser patgeno Debe favorecer la entrada del transgn Debe ser muy bien conocido Debe ser fcilmente manipulable

Escherichia coli

Vectores de clonacin
Son molculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados. Debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. Tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la insercin del fragmento de ADN a clonar.

Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restriccin, y se mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.

Tipos de vectores de clonacin Plsmidos Virus bacterifagos Csmidos YACs (cromosomas artificiales de levadura) Cromosomas artificiales de bacterias (BACs) Cromosomas artificiales humanos

Plsmidos
Son molculas de ADN bicatenario circular. Se localizan en las bacterias. Tienen replicacin independiente. Genes propios (resistencias a antibiticos) que permiten seleccionarlos posteriormente Facilidad para la manipulacin. Puntos de corte especficos para enzimas de restriccin

Bacterifagos
Virus que infectan bacterias Incorporan material gentico mediante el proceso de transduccin. Al infectar otra clula (bacteria) introduce el material del antiguo husped.

Csmidos
Consiste en un plsmido al cual se le han adicionado unos segmentos del genoma de un bacterifago. Son fragmentos de ADN que llevan un ADN no propio y la porcin COS (fragmento de fagos necesario para empaquetar el material gentico) Lleva varios genes de plsmidos Incorpora marcadores (resistencia a antibiticos) Tiene varios sitios de restriccin Permite transportar grandes cantidades de ADN.

Cromosoma artificial de levadura

Son vectores de clonacin de alta capacidad.

Esto permite clonar en levaduras (microorganismos eucariotas) secuencias de ADN de hasta un milln de pares de bases o ms, al comportarse como un cromosoma propio de la levadura.

Clonacin de los fragmentos de ADN

1. Insercin de genes marcadores en el vector (plsmido o lo que sea). Generalmente de resistencia a antibiticos 2. Se cortan el ADN humano y el vector con el mismo plsmido. 3. Se mezclan los fragmentos. 4. Obtencin de plsmidos recombinantes. 5. Se juntan los plsmidos con bacterias. 6. Incorporacin de los plsmidos por transformacin bacteriana. 7. Cultivo de bacterias en presencia de un antibitico. 8. Las bacterias que no han incorporado el plsmido mueren (no son resistentes).

Almacenamiento de genes clonados

Una genoteca es una coleccin de clones cada uno de los cuales contiene un vector al que se le ha insertado un fragmento de ADN derivado del ADN o el ARN totales de la clula o tejido. La coleccin de clones debera contener, tericamente, todas las secuencias existentes en la fuente original de ADN, es decir, debera contener muestras de todo el ADN del organismo.

Para encontrar el gen de inters hay que utilizar sondas de cidos nucleicos.
Estas genotecas pueden ser de plsmidos, fagos o de ADNc

Identificacin de clones

Una genoteca contiene muchos clones

Hay que identificar el que nos interesa

Sondas de ADN

Sondas de ADN Oligonucletidos de cadena sencilla Se pueden sintetizar a partir de la secuencia de bases del gen o de la secuencia de aminocidos de la protena Estn marcadas (radiactividad o fluorescencia) para poder ser identificadas

Una vez localizadas, las colonias que contienen el gen de inters se cultivan en grandes cantidades

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Es una tcnica que permite duplicar un nmero ilimitado de veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta tcnica pueden generarse millones de molculas idnticas, a partir de una molcula de ADN y adems en muy poco tiempo. La reaccin es un proceso cclico: 1. La molcula de ADN que va a copiarse se calienta para que se desnaturalice y se separe las dos hebras. 2. Cada una de las hebras es copiada por la ADNpolimerasa. (Se utiliza la ADN-polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales, Thermus aquaticus, as la enzima puede trabajar a altas temperaturas). 3. Las cadenas recin formadas son separadas de nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de copias.

Aplicaciones de la PCR

Amplificacin de:
ADN antiguos (mamuts, momias, fsiles ADN obtenidos de la escena de un crimen (medicina forense). ADN de clulas embrionarias (diagnostico prenatal de trastornos genticos) ADN de genes virales (en clulas infectadas por virus difciles de detectar, como el VIH)

Animacin de la PCR: http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf

Secuenciacin del ADN

* Mtodo del didesoxi de Sanger mtodo de la interrupcin controlada de la replicacin enzimtica (de la polimerizacin de DNA). * Elementos necesarios: - DNA polimerasa - Oligonucletido (primer o cebador), de 18-30 nucletidos y complementario al extremo 3 del fragmento de DNA que queremos secuenciar - Mezcla de los 4 desoxinuclesidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) - Una pequea cantidad de cada uno de los 4 didesoxinuclesidos trifosfato (ddATP* o ddCCTP* o ddGTP* o ddTTP*) marcados (*florescencia especfica para cada uno de ellos)

Desoxi nucletido

OH

Didesoxi nucletido (bloqueo de la sntesis de DNA)

Pasos de la secuenciacin
1. Primero es necesario obtener una gran cantidad de fragmentos de ADN (clonacin) 2. Desnaturalizacin del ADN (obtencin de cadenas simples) 3. Mezcla de todos los componentes de la reaccin 4. Comienza la sntesis de ADN, que termina cuando la ADN polimerasa incorpora un ddNTP marcado 5. Se obtienen fragmentos de distinta longitud, todos ellos acabados en un ddNTP* 6. Se separan las molculas marcadas mediante un gel de poliacrilamida. 7. Un detector identifica cada uno de los ddNTP* finales gracias al color. 8. El espectrograma resultante nos indica la secuencia de bases.

Materiales necesarios para la secuenciacin

Obtencin de cadenas de distinto tamao acabadas en un ddNTP* Separacin de fragmentos por tamaos e identificacin por color

Genmica

objetivo

El estudio de la genmica es el conocimiento del genoma completo y de las interacciones entre los genes que lo forman.

Identificacin de genes codificadores de protenas

Genes que interactan entre s

Comparacin de genomas de distintas especies

Genmica Conocimiento del genoma completo

Identificacin de genes

Rastreo de secuencias de inicio de transcripcin

Comparacin con genes conocidos

Genmica

Interacciones entre los genes del genoma

Genes que interactan entre s La expresin de un gen afecta a otros y vara en funcin de las condiciones

La expresin del genoma se evala con chips de ADN

Ensayo de micromatrices de ADN

Sirve para saber si un tejido normal presenta genes alterados que podran provocar una enfermedad

http://www.bio.davidson.edu/courses/genomi cs/chip/chip.html http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/m icroarray/

Animacin secuenciacin genoma humano http://www.pbs.org/wgbh/nova/genome/sequencer.html#

Proteoma
Conjunto de protenas de una clula, tejido o genoma completo

PROTEMICA

Protemica
Estudios sistemticos de las protenas codificadas por el genoma de un organismo.

El conjunto de protenas supera con mucho al de los genes. Su importancia radica en que son ellas las que desempean las actividades celulares

Ingeniera gentica y medicina

Obtencin de productos farmacuticos Diagnostico de enfermedades

Medicina forense

Terapia gnica

Insulina

Huella gentica

Clonacin de genes Identificacin en el enfermo Identificacin en portadores

Ex vivo

Hormona de crecimiento

Marcadores genticos

In vivo

Factor VIII de coagulacin

In situ

Obtencin de productos farmacuticos

Insulina

1. 2. 3.

Hormona de crecimiento Factor VIII de coagulacin

4. 5. 6.

Secuencia de la protena (insulina) Sntesis de los ADN Obtencin de plsmidos recombinantes con los genes para formar las dos cadenas de la insulina. Expresin en E. coli Purificacin y procesado qumico Obtencin de insulina activa

Medicina forense
Huella gentica

1.

2.
3. 4.

Marcadores genticos

5.

Los seres humanos difieren en un 0.1% del genoma. Estas diferencias estn localizadas en regiones cromosmicas concretas. Estas zonas se usan como marcadores genticos Con la identificacin de los marcadores se hace la huella gentica (mtodo de Southern blot) La comparacin de huellas genticas permite resolver casos policiales.

MTODO DE SOUTHERN BLOT

Ingeniera gentica y medicina

Terapia gnica
Ex vivo

In vivo

In situ

Ingeniera gentica y agricultura

Obtencin de plantas transgnicas

Resistencia a herbicidas Se introduce un gen de E. coli que permite usar mayores concentraciones de herbicidas sin daar a la planta de inters, y eliminando malas hierbas.

Mejora del producto Se mejora el valor nutricional del producto, por ejemplo aadiendo betacaroteno al arroz

Plantas farmacuticas Las plantas producen sustancias medicinales, vacunas o anticuerpos (planticuerpos).

Ingeniera gentica y medio ambiente

Biorremediacin
Uso de bacterias modificadas para degradar materia orgnica (petrleo)

Bioadsorcin
Fijacin de metales pesados a la superficie de la clula para limpieza de suelos

Biolixiviacin
Obtencin de metales a partir de minerales de baja ley

Ingeniera gentica y ganadera

MEJORA DE RAZAS
Obtener razas mas resistentes, mas productivas, con mayor desarrollo, resistentes a condiciones ms difciles

PRODUCCIN DE MEDICAMENTOS
Se usan animales transgnicos. Se pueden obtener sustancias de inters como protenas humanas para combatir enfermedades: Enfisema hereditario Factores de coagulacin

ESTUDIO DE ENFERMEDADES HUMANAS

Se estudia la expresin de genes humanos en organismos transgnicos