FUNDAO UNIVERSIDADE REGIONAL DE BLUMENAU FURB CENTRO DE CINCIAS TECNOLGICAS CCT DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA - DEQ

RECUPERAO E PURIFICAO DE ENZIMA OBTIDA POR FERMENTAO

Engenharia Bioqumica II
Acadmicos: Anna Karolyn Androczeczem Netto Caciane de Oliveira Franco Camilla Benvervano Veiga Giovane Furtado Tuanne Gomes Porto

INTRODUO
Em processos industriais a invertase usada para obteno do xarope de acar de acar invertido. O uso da invertase est principalmente relacionado indstria alimentcia, tanto na fabricao do xarope de glicose e frutose (acar invertido) quanto com a formao dos frutooligossacardeos.

Um mtodo de obteno atravs da Fermentao em Estado Slido (FES).

A gerao de resduos e subprodutos inerente a qualquer setor produtivo. Portanto estes resduos e subprodutos gerados pela agroindstria podem ser reaproveitados para obteno de novos produtos.

INTRODUO
Aps a fermentao e extrao, as enzimas podem ser separadas e purificadas do meio por centrifugao, filtrao, precipitao fracionada, separao cromatogrfica, separao por membranas, liofilizao ou pela combinao desses e de outros mtodos. O grau de pureza necessrio da enzima depende de sua aplicao final e ser determinado pelas caractersticas fsico-qumicas, propriedades biolgicas, fonte da qual a enzima est sendo purificada e tecnologia de purificao. Este trabalho apresentar um estudo de caso onde h a produo, recuperao e purificao da invertase obtida por fermentao em estado slido de farelo de soja a partir do fungo Aspergillus casiellus.

FLUXOGRAMA
OBTENO DO MICROORGANISMO:
Aspergillus casiellus

OBTENO E PREPARO DO SUBSTRATO: FARELO DE SOJA

FERMENTAO EM ESTADO SLIDO

EXTRAO DE ENZIMAS DO MEIO SLIDO

RECUPERAO DA ENZIMA DO EXTRATO BRUTO POR PRECIPITAO

PURIFICAO DA INVERTASE POR CROMATOGRAFIA DE TROCA INICA

CARACTERIZAO FSICO-QUMICA

TRATAMENTOS FINAIS

OBTENO DO MICROORGANISMO

Figura 1: Cama de frango

Figura 2: Fotomicrografia do fungo Aspergillus casiellus.

OBTENO E PREPARO DO SUBSTRATO

Figura 3: Plantao de Soja

Figura 4: Gro de Soja

Figura 4: Produtos resultantes do esmagamento do gro de soja

FERMENTAO
Mtodo: Estado slido (Batelada)

O termo fermentao em estado slido, ou

fermentao semi-slida, ou fermentao em meio semi-slido aplica-se ao processo de crescimento de microrganismos sobre substratos slidos sem a presena de gua livre.

FERMENTAO NO ESTADO SLIDO

CARACTERSTICAS

Papel da gua;

Vantagens x Desvantagens;
Bioreatores;

Aplicao;

FERMENTAO NO ESTADO SLIDO

EQUIPAMENTOS

FERMENTAO NO ESTADO SLIDO

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RECUPERAO DA ENZIMA
Aps a fermentao, a enzima segue para a recuperao e purificao.

Preparo do inoculo e do mostro

Recuperao e Purifica

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RECUPERAO DA ENZIMA
MTODO: SEPARAO POR EXTRAO

Meio lquido
Meio slido

RECUPERAO DE ENZIMAS
CENTRIFUGAO Centrfugas tubulares e centrfugas de disco

Centrfuga de discos

Centrfuga tubular

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RECUPERAO DA ENZIMA
ESTUDO DE CASO Mtodo de extrao slido-lquido por filtrao: 50 ml gua destilada; Agitados em shakers a 120 rpm, durante 60 min a 4C; Filtros Whatman n 1; Bomba a vcuo; Filtrado mantido em banho de gelo para a determinao da atividade da invertase.

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RECUPERAO DA ENZIMA
MTODO: PRECIPITAO Recuperao da enzima do extrato bruto Definio do mtodo; Principais mtodos de precipitao de protenas; Vantagens e desvantagens.

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RECUPERAO DA ENZIMA
A solubilidade de uma protena o resultado de: Interaes polares com o solvente aquoso, Interaes inicas com os sais presentes, Foras eletrostticas de atrao e repulso. O desempenho do processo de precipitao depende tambm da composio da soluo, incluindo as propriedades das demais protenas presentes (coprecipitao). Outros fatores determinantes na solubilidade das protenas: pH, temperatura e fora inica.

RECUPERAO DA ENZIMA
PRECIPITAO POR SOLVENTES ORGNICOS E SULFATO DE AMNIO. - mecanismo da precipitao com solventes orgnicos; - tipos de solventes utilizados; - variveis que afetam o processo de precipitao por solventes.

RECUPERAO DA ENZIMA

Os solventes devem ser usados somente a baixas temperaturas (< 0 oC); O uso de solventes tem diminudo nos ltimos anos; Mais usados: metanol, etanol e acetona inflamveis; Vantagem: recuperao do solvente para reutilizao. Precipitaes com etanol e acetona tambm foram realizadas usando uma

proporo de 2:1 (solvente:extrato bruto).

Os resultados obtidos so relatados na tabela abaixo.

RECUPERAO DA ENZIMA

RECUPERAO DA ENZIMA
PRECIPITAO PELA TEMPERATURA

RECUPERAO DA ENZIMA
PRECIPITAO POR POLMEROS

Polietilenimidas e polietilenoglicis de diferentes pesos moleculares. Mecanismo de precipitao: similar ao existente com solventes orgnicos e resulta da mudana na solvatao das molculas proticas pela gua. Acredita-se que as molculas de polmero ocupem o lugar das molculas proticas na solvatao. Muitas enzimas precipitam com concentraes de polmero variando entre 15 e 20%.

RECUPERAO DA ENZIMA
OUTRAS FORMAS DE PRECIPITAO: PRECIPITAO FRACIONADA; PRECIPITAO POR AFINIDADE; PRECIPITAO POR ONS METLICOS; - crescimento do precipitado; - quebra do precipitado por cisalhamento. MECANISMO FSICO-QUMICO DA PRECIPITAO:
- envelhecimento do precipitado;

RECUPERAO DA ENZIMA
PRECIPITAO ISOELTRICA:

PRECIPITAO COM SAIS INORGNICOS:

RECUPERAO DA ENZIMA

OBS: a adio do sal deve ser lenta e sob agitao para favorecer a homogeneizao

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PURIFICAO
As caractersticas das etapas de um processo de purificao so, em grande parte, determinadas pela natureza do produto final e pela sua aplicao.
Existe necessidade para a purificao completa da enzima?

Maioria das aplicaes: suficiente um menor grau de purificao ainda que existam algumas atividades contaminantes desde que no afetem substrato, produto ou enzima envolvidos em um processo especfico. Existem algumas aplicaes (na medicina clnica, rea farmacutica, anlises especficas, projeto de biosensores, engenharia gentica) onde essencial que protenas contaminantes sejam reduzidas ou completamente eliminadas.

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PURIFICAO
Cromatografia de Troca-inica
Fracionamento de substncias biolgicas que apresentam semelhanas em suas propriedades qumica e fsico qumicas. Mtodo de fracionamento baseado na fixao de substncias carregadas a um suporte que contm uma carga oposta. A separao ocorre porque as interaes eletrostticas entre os grupos so reversveis e dependentes das afinidade de cada substncia pelo trocador. Esta afinidade funo do pH do meio, da temperatura, da fora inica, do tampo, etc.

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PURIFICAO
Cromatografia de Troca-inica
Suportes: trocadores inicos ou resinas, sendo normalmente aplicados em colunas. As resinas so obtidas pela introduo de grupamentos polares em matrizes insolveis em gua. Exemplo: celulose, poliacrilamida, gis de dextrana e copolmeros de estireno e divinilbenzeno.

Classificao: Permutadores de ctions: grupamentos cidos (ativos em pH>pK) Permutadores de nions: grupamentos bsicos (ativos em pH<pK)

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PURIFICAO
Cromatografia de Troca-inica
Ativao do trocador aninico:
Trata-se com uma base forte (acetato de sdio)
Lava-se com gua deionizada

Trata-se a resina com um cido forte (NaCl)

Lava-se com gua deionizada

Tratamento com tampo cujo pH deve ser inferior ao pK do grupamento trocado

Os trocadores aninicos assim tratados so considerados ativos na sua forma cloreto, ou seja:

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PURIFICAO
Cromatografia de Troca-inica
Capacidade total de troca: funo do tipo de trocador. Importncia deste parmetro: se excedido, os ons no sero totalmente retidos. Capacidade disponvel ou real de troca: capacidade de cada trocador em uma determinada condio experimental (pH, natureza do tampo, fora inica, etc.).

Escolha do tipo de resina: Protenas com cargas positivas e negativas: - carga funo do pH do meio, Fator principal: estabilidade da molcula nos diferentes pHs Protenas lbeis: trocadores fracos.

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PURIFICAO
A purificao da invertase foi conduzida por cromatografia de troca aninica em DEAE-celulose com fator de purificao de 30,30 vezes e rendimento de 42,07%.
O extrato enzimtico foi dialisado contra gua destilada a 4C por 18h, substituindo-se a gua de dilise a cada 6h. Este extrato foi levado ao banho-maria a 60C por 20 min (choque trmico. Centrifugado a 4000 rpm por 10 min, A soluo sobrenadante foi aplicada em uma coluna de troca inica DEAE-celulose equilibrada e eluda com tampo acetato de sdios 0,02 M e pH 5,5. A amostra foi lavada com 5 volumes do mesmo tampo e em seguida foi aplicado o gradiente de NaCl de 0,05 a 1 M em tampo acetato de sdio 0,02M e pH 5,5.

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PURIFICAO
A cromatografia foi desenvolvida sob fluxo de 3 ml/min e fraes de aproximadamente 3 ml foram coletadas para a leitura de protenas em absorvncia de 280 nm.
Feita a determinao da atividade da invertase.

As fraes contendo alta atividade invertsica foram reunidas, dialisadas contra gua destilada a 4C por 18 h, substituindo-se a gua de dilise a cada 6 h e guardadas em freezer a -20C para etapas posteriores.

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CARACTERIZAO FSICO-QUMICA
Influncia do enzimtica; pH e temperatura na atividade

Determinao da termoestabilidade e estabilidade ao pH; Determinao de carboidratos neutros; Efeito de solventes orgnicos, ons, agentes redutores e detergente sobre a atividade enzimtica;

Determinao da especificidade ao substrato.

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TRATAMENTOS FINAIS
O grau de pureza de um produto biotecnolgico depende

de sua aplicao final. (SCHMIDELL et al., 2001)

Liofilizao

secagem por sublimao;

na sublimao o soluto concentrado; Alto grau de pureza;

materiais liofilizados em forma de p;

atividades biolgicas se tornam mais estveis.

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TRATAMENTOS FINAIS
Cristalizao permite estocagem estvel de bioprodutos pois as

molculas so imobilizadas; aps a purificao o produto biotecnolgico deve estar em alto grau de pureza;

Produto pode ser recuperado por filtrao ou centrifugao

seguido de secagem; Prpriedades do produto tecnolgico so diretamente afetadas pelas caractersticas do cristal formado.

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ROTINAS ANALTICAS
A porcentagem de recuperao e o grau de purificao da molcula alvo devem ser monitorados em cada etapa do processo de purificao (SCHMIDELL et al., 2001)

eletroforese para determinao da massa molecular

determinao da atividade enzimtica

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IMPORTNCIA
A produo de enzimas induzida por resduos agroindustriais destaca-se como uma ferramenta para o desenvolvimento de tecnologias limpas.
Tanto por dar destino a compostos orgnicos que se acumularia no meio ambiente; Quanto por gerar produtos aplicveis industrialmente que dispensam os solventes e reagentes txicos atualmente utilizados que provocam poluio do meio ambiente. Nesse contexto, a FES desempenha um papel de destaque no aproveitamento de resduos slidos, pois, em virtude do crescimento microbiano, ocorre a sntese de diversos compostos, dos quais muitos apresentam interesse para diversos segmentos industriais, alm de valor agregado.

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CONCLUSO
O resduo de farelo de soja demonstrou ser um bom substrato para utilizao em fermentaao em estado slido por Aspergillus casiellus para produo de invertase.
Os mtodos de purificao tornaram o processo vivel e pouco tempo foi despendido em relao a outros processos. Os valores de pH e temperatura da invertase purificada foram timos, 4,0 e 70C. A enzima demonstrou termoresistncia em altas temperaturas de 60 a 70C no atingindo o tempo de meia vida em 240 minutos. Nas temperaturas de 75 a 80C foram mantidas aproximadamente 40% da atividade residual aps 4 horas de incubao.

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REFERNCIAS
1. 2. GOMIDE, R. Operaes Unitrias. 3 ed. So Paulo: Gomide, 1980. 4 v. :il. KILIKIAN, B. V.; PESSOA, A. Purificao de produtos biotecnolgicos. - Barueri : Manole, 2005. - 444 p. :il. NOVAKI, L. Produo, Purificao e Caracterizao Parcial da Invertase obtida por Fermentao em Estado Slido de Soja com Aspergillus casiellus. Toledo: Novaki, 2009. SCHMIDELL, W., et al. Biotecnologia industrial: engenharia bioqumica. So Paulo: Edgard Blcher, 2001. 541 p.

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