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http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/chromintro.html http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/gc/
http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/LC/
Cromatografia
Definio
Histrico Michael Tseewt - botnico russo 1906 Dcada de 30 Dcada de 40 - pratos tericos/impulso CG Dcada de 60 CLAE
Parmetros em cromatografia:
Tempo de reteno (distncia, volume, tempo de reteno corrigido) Resoluo Pratos tericos Altura equivalente a um prato terico (HETP)
Cromatografia: Classificao
1. Forma fsica do suporte
Cromatografia planar: CP e CCD Cromatografia em coluna CG e CL -dimetro interno do tubo(preparativa/ analtica) -estado fsico da F.M.(gas/lquido/supercrtico) -tipo de coluna (aberta/fechada) -fase estacionria (lquido/slido) 2.Mecanismo de separao (processos fsico-qumicos ou mecnico) 3.Polaridade das fases utilizadas
Mecanismos de separao
http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/be_types.htm
Cromatografia em papel
Compostos hidrossolveis, cidos orgnicos e ions metlicos Princpio: partio (solubilidade) Quantidade de amostra necessria 10-3 a 10-6 g Tipos: ascendente, descendente, bidimensional, circular F.M. - Sistema de solventes F.E. - gua retida na celulose (papel Whatman) Mtodos de deteco: fsico-qumicos
Anlise qualitativa: Rf (fator de reteno) - problema : reprodutibilidade Anlise quantitativa: densitmetro, extrao dos solutos
Mtodo rpido (20-40 min.) Uso de diversos agentes cromognicos Maior sensibilidade que C.P. (10-9 g) Grande gama de compostos pode ser analisada Mtodo simples e barato F.M. - sistema de solventes F.E - Adsorventes (slica, alumna, celite, amido) Mtodos de deteco: fsico-qumicos Princpio: Adsoro (polaridade)
Adsoro depende: natureza qumica do adsorvente rea de superfcie/ tamanho da partcula porosidade da partcula -atividade --> stios ativos
Tipos de adsorventes:
G- aglutinantes (gesso amido ou talco) H- sem aglutinante (p/ CL) P-camada preparativa F- contm fluorescncia
CCD - exemplos
Requerimento da amostra::
detectvel no cromatograma solvel na FM estvel luz, oxignio, solvente, no ser voltil
Comparao
CP Vantagens: tcnica simples no requer instrumentao sofisticada baixo custo Desvantagens: uso limitado alargamento de banda-difusopouca alternativa de reveladores CCD Vantagens: maior sensibilidade mais rpido > repetibilidade < difuso > faixa de aplicao reveladores reativos permite aquecimento Desvantagens degradao de compostoslbeis devido grande superfciede exposio dificuldades na quantificao
Cromatografia Gasosa
Rapidez
Alto poder de separao Separao de vrias classes de compostos em uma anlise Sensibilidade (ppm - ppb) Facilidade de registrar dados Variedade de detetor (especificidade) Amostras volteis Compostos termicamente estveis Tcnicas auxiliares p/ identificao
Cromatografia Gasosa: aplicaes Anlise de cidos graxos e triglicerdeos Anlise de micotoxinas Anlise de compostos volteis responsveis pelo aroma caracterstico de alimentos Anlise de aucares Anlise de amino cidos Anlise de pesticidas Anlise de frmacos etc etc
Gs de arraste (FM) H2, N2, He, Ar Funo: transporte da amostra Propriedades: inerte, compatvel com o detetor, puro
Espessura F.E.(m)
Vazo gs (ml/min)
Vol. amostra (l)
20 - 60
02 - 20
1- 5
0,001- 0,5
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Cromatografia gasosa: Instrumentao Colunas - fase estacionria (FE) Abreviao de algumas fases estacionrias DEGA - adipato de dietileno glicol DEGS - succinato de dietileno glicol SE-30 - metil silicone OV -11 - 35% fenil- metilsilicone
Carbowax 20 M - polietilnoglicol
Programao de temperatura
Alta sensibilidade
Baixo nvel de rudo Faixa linear ampla p/ a resposta Resposta p/ os compostos de interesse (universais, seletivos, especficos) Insensvel a pequenas mudanas de fluxo e temperatura Destrutivos/ no destrutivos
Formao de ons pela combusto da amostra na presena de H2 e O2. Origina corrente eltrica no coletor gerando um sinal do qual a combusto do gs de arraste descontada
O bombardeamento do gs de arraste com as particulas B geram eltrons lentos que migram para o nodo gerando corrente constante que ser registrada como linha de base. Qdo a substncia que entra no detector capaz de capturar eltrons, h diminuio da corrente gerando um sinal negativo proporcional concentrao do composto.
Tempo de reteno Tempo de reteno relativo Co-cromatografia com padres (spiking) Grficos p/ sries homlogas ndices de reteno (Kovats, ECL) Tcnicas auxiliares (EM, IR, RMN)
Tr= tempo de reteno Tm = tempo morto- tempo que a FM leva para percorrer a coluna Tr = tempo de reteno corrigido = Tr-Tm
Padro externo
Fator de resposta
Normalizao: Todo componente produz um pico (f) A resposta do detector dependente apenas da concentrao (f)
Calibrao externa
Soluo contendo padres de todas as substncias a serem analisadas Padres em concentraes prximas amostra Condies analticas devem ser as mesmas, inclusive o volume de injeo
Fator de resposta do detector: determina a real resposta para uma determinada classe de substncias Fator de resposta= concentrao/rea
Para um padro contendo a mesma concentrao de trs substncias diferentes com reas A1, A2 e A3
Ento, para uma amostra com estas trs substncias, a concentrao de cada uma calculada utilizando estes fatores:
Z a referncia
Fx =1190/238 = 5,8 Fy = 1190/660 = 1,8
Multiplica-se cada pico por seu fator: X= 90 x 5,8 Y = 265 x 1,8 e Z = 460 x 1
Padronizao interna Uma substncia conhecida adicionada em concentrao definida em todos os padres e nas amostras; No co-elui com a amostra estvel e detectado na concentrao em que se encontra
Etapas: Faz-se uma curva de calibrao baseada na relao entre as reas e concentraes do PI e da substncia de interesse Contamina-se a amostra com um volume conhecido da soluo estoque do padro interno (PI)
Adsoro:
Alumina, Silica, magnso, carbonato de clcio, amido
Natureza da amostra x Comportamento cromatogrfico
COOH > -OH > -NH3 > -SH > -CHO > C=O > CO2R > OCH3 > CH=CH e 3. Impedimento estrico
0----15%)
Colunas de guarda
Colunas: recheios materiais porosos com partculas de dimetros o mais homogneo possvel e de dimetro igual ou menor a 10 um (em geral) Silica e Alumina. Colunas com fase ligada silica como suporte A) formao do ster silicato (Si-O-R) B)formao da ligao siloxano (Si-O-SiR) C)Ligao Si-C
Detector: Alta sensibilidade Resposta rpida para todos os compostos da amostra Insensvel mudanas na Fase mvel
Detector Uv-Vis Detector de Fluorescncia Detector de arranjo de diodos Detector de ndice de Refrao
Detectores eletroqumicos
Quantificao: Calibrao Externa Calibrao Interna