PROTECCIN SINRGICA DEL ZINC Y EL SELENIO ANTE LOS EFECTOS LETALES PRODUCIDOS POR LA RADIACIN UV-B EN EMBRIONES DE Bufo

arenarum.
Jos L. DEramo, Osvaldo Fridman & Jorge Herkovits Instituto de Ciencias Ambientales y Salud, Fundacin PROSAMA Paysand 752. Buenos Aires. fridman@conicet.gov.ar
RESUMEN Los embriones de anfibio, por su alta sensibilidad a agentes fsico qumicos, son utilizados en forma cada vez mas frecuente para estudios ecotoxicolgicos. En trabajos previos, comprobamos que la letalidad producida por irradiacin UV-B sobre estos organismos, puede ser mitigada mediante pre-tratamientos con iones zinc o selenito. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la posibilidad de acrecentar el efecto protector de estos metales mediante la administracin simultanea de ambos iones. Los experimentos de proteccin se realizaron manteniendo 10 embriones de Bufo arenarum por triplicado en estadio de oprculo completo (estadio 25) en soluciones con Zn2+ (como ZnSO4) y Selenio (como Se03Na2) en concentraciones continua de 1 mg/L cada uno o ambos iones administrados en forma simultanea en la misma concentracin durante 72 horas. Los animales controles fueron mantenidos en solucin fisiolgica AMPHITOX. Tanto los embriones controles como los pretratados fueron irradiados con luz UV-B de 302 nm (irradiancia de 4,56 watts/m2) durante 10 minutos. Un grupo adicional de controles se mantuvieron en AMPHITOX sin irradiar. Luego de irradiados, los embriones continuaron en las respectivas soluciones de pretratamiento observndose ya a las 17 horas post irradiacin una mortalidad del 90% en los controles que a las 24 alcanz el 96.67%. En cambio, con Se la mortalidad a los 24 horas post irradiacin fue del 90%, y con Zn de 76,7%. Los tratados con ambos iones en forma simultanea presentaron una mortalidad del 53,3%. Los resultados confirman la capacidad protectora de cada uno de los metales estudiados frente a los efectos adversos de la irradiacin UV-B e indican que el tratamiento combinado de zinc y selenio presenta un efecto beneficioso sinrgico con una sobrevida a las 24 hs de 46.7% de los embriones irradiados. Si bien en todos los casos la proteccin es transitoria ya que a las 48 horas todos los embriones irradiados con UV-B se encontraron muertos, consideramos de inters el resultado por los efectos beneficiosos que ambos metales pueden ejercer en organismos expuestos a irradiacin subletal. RESULTADOS

Figura 1. Efecto de diferentes tiempos de irradiacin UV-B sobre embriones de Bufo arenarum

100 80 Porciento de sobrevida 60 40 20 0 0 3 5 7 9 10 13 15 Tiempo de irradiacin (minutos) 96 192 240 0 48 Tiempo post irradiacin (horas)

Toxicidad de la radiacin UV-B y curvas TOP. La Figura 1 muestra que hasta 3 minutos de exposicin a 4,56 watt/m2 de radiacin UV-B de 302 nm no produjeron letalidad en embriones de Bufo arenarum hasta los 10 das post irradiacin, mientras que 7 minutos result ser el mayor tiempo de exposicin que no caus letalidad 24 horas post irradiacin. Todas las exposiciones mayores de 5 minutos produjeron un aumento progresivo de la mortandad, alcanzando el 100% 24 horas despus de 15 minutos de radiacin. Los valores de (Tiempo Letal de Exposicin) TL10, TL50 y TL90 correspondientes a la toxicidad de la UV-B sobre los embriones de Bufo arenarum entre las 24 y 240 hs post irradiacin, estn graficados en la Figura 2. En ese perodo los valores de TL50 disminuyeron desde 10.59 hasta 8.09 minutos. Un comportamiento similar ocurri con los valores correspondientes a TL10 (de 8.88 a 5.60 minutos) y TL90 (de 12.62 a 11.69 minutos). Por lo tanto, la toxicidad aguda de la UV-B aumenta levemente a medida que el tiempo post irradiacin avanza entre las 24 y las 240 hs. La Tabla 1 muestra que los intervalos de confianza de TL50 no se solapan con los de TL10 y TL90. El valor NOEC (mayor tiempo de exposicin que no caus letalidad) para todo el perodo post irradiacin fue de aproximadamente 3 minutos, mientras que TL100 fue de aproximadamente 15 minutos. Proteccin del Zinc y el Selenio: En la Figura 3 se observa que el pretratamiento con Zn confiri una neta proteccin a los embriones frente a 10 minutos de radiacin UV-B, ya que mientras que en los controles se registro el 10% de sobrevida a las 17 horas, 3,3% a las 21 y 24 hs y 0% a las 27 hs, los embriones pretratados sobrevivieron el 66,7%, el 50%, el 23,33% y el 20% en esos mismos tiempos respectivamente. La proteccin del Selenio por su parte, fue significativamente menor que la del Zinc, ya que monitoreados siempre a los mismos tiempos post-irradiacin, las sobrevidas fueron del 20%, 13,3%, 10% y 0% respectivamente. El mayor efecto protector se consigui cuando el pretratamiento fue realizado con ambos metales a la vez, alcanzndose niveles de sobrevida del 80%, 73,3% , 46,7% y 43,3% de los embriones observados 17, 21, 24 y 27 hs despus de la irradiacin, respectivamente.

INTRODUCCION La disminucin de los niveles de ozono debida a la eliminacin de compuestos fluorocarbono clorados, han producido un peligroso aumento de la radiacin ultravioleta (UV-B, 280-315 nm), representando serias consecuencias para los organismos vivos. Las poblaciones de muchas especies de anfibios, en una gran cantidad de habitats, se encuentran en un severo proceso de declinacin. No existe una nica causa que explique esta declinacin, pero su amplia distribucin sugiere la participacin de agentes globales tales como el incremento de la radiacin UV. Los huevos y las formas juveniles son los ms susceptibles a la radiacin UV-B, observndose efectos sobre la metamorfosis, anormalidades en el desarrollo y altas tasas de mortalidad Los productos primarios generados por la absorcin UV son las especies de oxgeno reactivas (ROS) que a su vez atacan a las distintas macromolculas celulares, promoviendo un escenario conocido como estrs oxidativo. Los organismos vivos poseen una amplia gama de mecanismos de defensa antioxidante que les permite protegerse de los daos ocasionados por los ROS. Sin embargo, si por incremento en la exposicin UV-B la produccin de ROS excede la capacidad antioxidante de estos sistemas, el estrs oxidativo puede alcanzar niveles capaces de producir dao. Una estrategia que permitira proveer una mayor fotoproteccin es mediante el apoyo o la estimulacin de uno o ms de estos sistemas endgenos antioxidativos. A tal fin, en el presente trabajo se evaluaron en embriones de Bufo arenarum por separado y en forma conjunta, los efectos protectores del zinc (Zn) y el selenio (Se), dos oligoelementos que juegan papeles importantes en la defensa celular contra el dao oxidativo ocasionado por la exposicion a radiacion UV-B.
13
Tiempo de exposicin (min)

Figura 2. Curvas TOP para UV-B en embriones de Bufo arenarum

DISCUSIN: Los efectos adversos de la radiacin UV-B sobre los embriones de Bufo arenarum se produjeron con apenas unos minutos de exposicin. Por debajo de los 5 minutos de radiacin no se registraron efectos letales mientras que a partir de ese tiempo se verific una relacin dosis-respuesta tpica (Figura 1). Apenas unos minutos de diferencia (de 5 a 7 minutos) en la iradiacin UV-B de los embriones de Bufo arenarum, produce mortalidad en 48 y 24 horas respectivamente. Para evaluar los eventuales efectos protectores de dos oligoelementos, Se y Zn, en el medio de mantenimiento de embriones expuestos a radiacin UV-B, fueron seleccionadas aquellas dosis que nos permitieron obtener resultados comparables dentro de los tres primeros das post exposicion. Para eso, la distancia a la fuente de emisin y el tiempo de exposicin utilizado, determin una dosis de radiacin de 2736 Joule/m2 (10 minutos a 10 cm de distancia). Como se observa en la Figura 3, los tratamientos previos tanto con Zn como con Se les permiti a los embriones de Bufo arenarum presentar una mayor sobrevida frente a la iradiacin UVB respecto de los embriones que no han sido tratados con estos oligoelementos (p < 0,001), mientras que el tratamiento combinado con Zn y Se, ejerci un efecto beneficioso sinrgico. Es importante hacer notar que aunque indudablemente las presencias de estos metales tanto separadamente como en forma conjunta, arrojaron valores de sobrevida significativamente superiores que en los controles, estas protecciones, bajo nuestras condiciones experimentales (estadio maduracional de los embriones, dosis de radiacin, concentracin de los oligoelementos), resultaron ser transitorias, ya que a las 48 horas todos los embriones irradiados se encontraban muertos. Consideramos de inters estos resultados por los efectos beneficiosos que ambos metales pueden ejercer en organismos expuestos a irradiacin subletal. Ya que el estrs oxidativo es uno de los mecanismos por los cuales la radiacin UV-B produce efectos adversos sobre los embriones irradiados, vemos que tanto el Zn como el Se separadamente, pero especialmente cuando se encuentran ambos en el medio de mantenimiento, pudieron reducir los efectos adversos debidos a ROS. En efecto, el sistema de defensa contra los radicales endgenos se lleva a cabo mediante metaloenzimas entre las que se encuentra la Glutatin Peroxidasa Se-dependiente y la CuZn Superxido Dismutasa. El Zn y el Se produciran un incremento en la actividad detoxificante de la glutatin peroxidasa y de la superxido dismutasa, lo cual explicara el aumento significativo en la sobrevida de los embriones irradiados. Nuestros resultados refuerzan el inters de investigar el fenmeno de la fotoproteccin basada en los sistemas antioxidantes endgenos. En futuros estudios investigaremos si las propiedades antioxidantes del Zn y del Se en el medio de mantenimiento, dependen o no de su accin sobre las actividades de la Glutatin Peroxidasa y de la Superxido Dismutasa.

12 11 10 9 8 7 6 5 24 48 72 96 168 192 216 240 Tiempo post exposicin (hs) TL10 TL50 TL90

Figura 3. Efecto protector del Zinc y el Selenio sobre embriones de Bufo arenarum irradiados con UV-B
MATERIALES Y MTODOS Materiales: Caractersticas de la lmpara: UVB Longitud de onda 302 nm. Irradiancia: 4,56 watt/m2. Todas las drogas fueron de grado analtico. Animales: Se indujo la ovulacin de hembras de Bufo arenarum maduras de entre 200 y 280 g de peso corporal mediante una inyeccin i.p. de un macerado de hipfisis homloga. Los ovocitos fueron fertilizados in vitro con una suspensin de espermatozoides en Solucin ANFITOX (SA). Los embriones fueron mantenidos en SA a 20 2C hasta alcanzar el estadio 25 del desarrollo embrionario (oprculo abierto). La irradiacin de los embriones se llev a cabo exponiendo a luz UV-B las cpsulas de Petri de 10 cm de dimetro en las que se encontraban sumergidos en 40 ml de SA. Toxicidad de las distintas condiciones de exposicin a la irradiacin UVB: Para determinar la toxicidad de la irradiacin, 10 embriones por triplicado fueron irradiados entre 1 y 15 minutos. La supervivencia fue determinada hasta diez das post exposicion.. Efectos del Zn y el Se: Los experimentos de proteccin se realizaron por triplicado manteniendo 10 embriones en soluciones con Zn2+ (como ZnSO4) y Selenio (como Se03Na2) en concentraciones de 1 mg/L cada uno o ambos iones administrados en forma simultanea en la misma concentracin durante 72 horas. Los animales controles fueron mantenidos en solucin fisiolgica AMPHITOX. Tanto los embriones controles como los pretratados fueron irradiados durante 10 minutos. Anlisis de los datos: La mortalidad en los embriones experimentales fue analizada en forma estadstica usando el programa PROBIT. Las medias, los lmites de confianza y el test-t de significancia de Students fueron obtenidos con el programa ESTADISTICA.

100 80 Porciento de sobrevida 60 40 20 0

Co Co nt ro nt lI rra rol di ad o Zi nc Zi nc I rr ad ia do Se Se le nio le nio I rr ad ia Zn do Zn + Se + Se I rr ad ia do s
0 17 21 24 27

Tiempo post irradiacin (horas)

Tabla 1. Tiempo Letal de Exposicin e Intervalos de Confianza de UV-B en embriones de Bufo arenarum Tiempo post TL10 (min) exposicin (hs) 24 8,88 (8,22 - 9,35) 48 7,25 (6,45 - 7,78) 72 6,93 (5,07 - 7,88) 96 6,53 (5,71 - 7,13) 168 6,33 (5,51 - 6,92) 192 5,97 (5,13 - 6,58) 216 5,90 (5,07 - 6,51) 240 5,60 (4,76 - 6,23) TL50 (min) 10,59 (10,14 - 11,10) 9,12 (8,64 - 9,60) 9,05 (8,00 - 10,07) 8,78 (8,24 - 9,32) 8,55 (8,00 - 9,08) 8,37 (7,79 - 8,93) 8,26 (7,68 - 8,81) 8,09 (7,49 - 8,66) TL90 (min) 12,68 (11,90 - 13,84) 11,48 (10,75 - 12,74) 11,82 (10,53 - 15,42) 11,81 (10,95 - 13,22) 11,55 (10,71 - 12,93) 11,74 (10,82 - 13,24) 11,56 (10,66 - 13,08) 11,69 (10,72 - 13,25)