UNIVERISIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO FES ZARAGOZA MEDICO CIRUJANO.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

IDENTIFICACION DE BACTERIAS POR PRUEBAS BIOQUIMICAS

CABALLERO GONZALEZ ANDREA ALEJANDRA CALDERON RAMIREZ MARIANA ITZEL CASTILLO JAIMES ELSA ATENAS CASTILLO MEJIA VALERY LARETH DE LA PEA GUTIERREZ VALERIA MIGUEL SANTIAGO EDGAR estilo de 6/5/12 Haga clic para modificar el OCHOA CONTRERAS ERICK CESAR subttulo del patrn

OBJETIVO

Identificar los microorganismos que crecieron el los agares mediante pruebas bioqumicas toando en cuenta sus caractersticas

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Pruebas Bioqumicas

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Introduccin
A partir de los medios selectivos de la practica anterior se deben realizar pruebas bioqumicas para la identificacin de los gneros y especies aisladas

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Introduccin caractersticas Las

morfolgicas de las colonias en los medios de cultivo selectivos, la tincin de Gram aplicada a los microorganismos inicia la diferenciacin de 6/5/12 gnero y especie

Introduccin

Las pruebas bioqumicas son de vital importancia para diferenciar entre una especie y gnero patgeno, de los no patgenos, por medio de reacciones

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Pruebas bioquimicas
Agar TSI Agar LIA Citrato de Simmons Prueba catalasa Caldo urea Medio mio 6/5/12 Prueba de catalasa

AGAR TSI

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Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico. 6/5/12

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FUNDAMENTO En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos 6/5/12

El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y 6/5/12

El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance

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Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio 6/5/12 cido.

El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.
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Formula en gramos por litro

Extracto de carne Pluripeptona Cloruro de Sodio Lactosa Sacarosa Glucosa Sulfato de hierro y amonio Tiosulfato de sodio Rojo de fenol Agar 3.0 20.0 5.0 10.0 10.0 1.0 0.2 0.2 0.025 13.0

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Siembra

A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio.

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Incubacin

A 35-37C durante 24 horas, en aerobiosis.

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Resultados

1-Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa.
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3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azcares. 4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo 6/5/12

5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido sulfhdrico.

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MicroorganisPico /fondo Produccin Produccin mo de gas de acido Sulfihidrico E.coli A/A + K. A/A + pneumoniae P. mirabilis K/A S.typhimuriuK/A m S. enteritidis K/A S. flexneri K/A P. K/K aeruginosa + + + + + 6/5/12

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Agar LIA

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Agar Agar Lisina Hierro)

En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para 6/5/12 detectar la presencia de las

Agar LIA

El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico.

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El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Es muy
6/5/12 utilizado

par

PROCEDIMIENTO
Inocular la cepa haciendo una puncin central hasta el fondo del tubo y estra en superficie. Se deja incubar a una temperatura de 37c por 24 6/5/12

Resultados: produccin de H2S

prueba positiva : ennegrecimiento del medio Prueba negativa: no hay formacin de precipitado negro 6/5/12

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Desaminacion de la lisina
Prueba positiva: pico rojizo Prueba purpura negativa: pico

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Descarboxilacion de la lisina

Reaccion positiva: Fondo y superficie del medio de color purpura Reaccion negativa : fondo amarillo
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microorga Color en el nismo pico de la flauta Salmonell Purpura a typhimuriu m Salmonell Purpura a enteriditis Providenci Rojo a spp. Klebsiella Purpura pnemonia

Color en base del tubo Purpura

Ennegrecimi ento del medio Positivo

Purpura

Positivo

Amarillo Purpura

Negativo Negativo
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CITRATO DE SIMMONS
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CITRATO DE SIMMONS
FUNDAMENTO El citrato de sodio es una sal acido ctrico, compuesto orgnico simple que se encuentra como uno de los metabolitos del ciclo de los cidos tricarboxilicos6/5/12 (ciclo de

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Algunas bacterias pueden obtener energa de fuentes distintas de la fermentacin de los hidratos de carbono, con el citrato como nica fuente de carbono.
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La medicin de esta caracterstica es importante para identificar muchos miembros de la familia enterobacteriaceae.
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Cualquier medio usado para detectar la utilizacin del citrato por las bacterias que se van a probar, debe carecer de protenas e hidratos de carbono como fuente de carbono.
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La utilizacin del citrato por la bacteria que se va a probar se detecta en el medio de citrato por la produccin de subproducto alcalinos..

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El medio contiene citrato de sodio, que es un anin como nica fuente de carbono, y fosfato de amonio como nica fuente de nitrgeno
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Las bacterias que pueden utilizar el citrato tambin pueden extraer nitrgeno de la sal de amonio, con produccin de amoniaco (NH+) lo que produce la alcalinizacin del medio por conversin del NH +, a hidrxido de amonio 6/5/12

.El

indicador es el azul bromotimol que amarillo por debajo de 6 y azul por encima de 7.6
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de es pH pH

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Fosfato de amonio dihidrgenado Fosfato dipotasico Cloruro de sodio Citrato de sodio Sulfato de magnesio Agar Azul de bromotimol

1g

1g 5g 2g 0.20 g 15 g 0.08 g
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RESULTADOS

La prueba positiva esta representada por la produccin de color azul oscuro en el termino de 24 a 48 hrs, que indica que el organismo en prueba ha sido capaz de utilizar el citrato en 6/5/12 el medio, con formacin de

La prueba tambien debe considerarse positiva sin que

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microorganis citrato mo Klebsiella pneumoniae Positovo

Color del medio Azul

S. typhimurium Escherichia colli s. Flexneri

Positivo Negativo Negativo

Azul Verde Verde

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CALDO UREA
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CALDO UREA
Es un medio de cultivo en tubos se utiliza para detectar la actividad de la ureasa, enzima bacteriana que hidroliza a la urea convirtindola en dos molculas de amonaco que finalmente forman carbonato de amonio.
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Los microorganismos que tiene la enzima ureasa hidrolizan la urea, liberando amoniaco y produciendo un cambio de color de rojo rosado en el medio.
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Extracto de Levadura..................................0.1 Fosfato de Potasio, Monobsico.................9.1 Fosfato de Potasio, Dibsico.......................9.5 Urea, Difco............................................... 6/5/12

Frmula Ingredientes por litro.

rea positiva

Rpida Ejm.: Proteus mirabilis

Retarda da Ejm.: Klebsiella pneumon iae 6/5/12

rea negativa Ej.: Escherich ia coli

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Bacterias urea + rpida: Proteus y Providencia

Bacterias urea + retardada: Klebsiella, Citrobacter y Enterobacter.

Bacterias urea negativa: Escherichia coli, Salmonella, Shigella

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PRUEBA DE CATALASA

La catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrogeno en agua y oxigeno . Qumicamente es una hemoproteina de estructura similar a la hemoglobina, salvo por que los cuatro tomos de hierro de su molcula estn en estado oxidado en lugar de estado reducido. 6/5/12

Excepto los estreptococos, la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas tienen actividad catalasa.

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El perxido de hidrogeno se forma como uno de los productos finales de oxidacin del metabolismo aerobio de los hidratos de carbono.
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Si se permite que se acumule, resulta letal para la clula bacteriana. La catalasa convierte el perxido de hidrogeno en agua y oxigeno segn la siguiente reaccin.

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Reaccin
2H2O2 2H2O + O2 ( BURBUJAS DE GAS) La prueba de la catalasa se usa con mucha frecuencia para diferenciar los miembros de la familia Micrococos de los miembros de la familia estreptococos

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Reactivos

Perxido de hidrogeno al 3% almacenado en frascos color caramelo en frio. Un cultivo de 18 a 24 hrs del microrganismo por probar

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Procedimiento
perxido de hidrgeno al 3% en un tubo de ensayo previamente esterilizado tomamos una asada de la muestra de la cepa del microrganismo a estudiar Introducir al tubo de ensayo, la muestra solamente debe acercarse a la muestra de la solucin liquida de perxido de hidrogeno y debemos observar la reaccin de esta.
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Resultados

La aparicin rpida y sostenida de burbujas o de efervescencia constituye una reaccin positiva. Como algunas bacterias tienen enzimas distintas de la catalasa que pueden descomponer el perxido de hidrogeno la formacin de unas pocas burbujas pequeas despus e 20 segundos no se considera un resultado positivo.
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La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxgeno.

Resultados:

(+) Staphylococcus aureus ( - ) Streptococcus spp.

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MEDIO MIO
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MOVILIDAD INDOL ORNITINA Haga clic para modificar el estilo de

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MEDIO MIO (MOVILIDAD INDOL ORNITINA) El medio MIO se utiliza para a identificacin de enterobacterias sobre la base de movilidad, la produccin de ornitina descarboxilasa y de indol
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FUNDAMENTO
En este medio las peptonas proporcionan la fuente de carbono y nitrgeno. El extracto de levadura provee las vitaminas y cofactores requeridos para el desarrollo. La dextrosa proporciona la fuente de energa. El agar es adicionado para demostrar la movilidad. El prpura de bromocresol acta como indicador de cambios de pH facilitando la deteccin de la descarboxilacin de la lisina
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FORMULA EN GRAMOS POR Extracto de levadura 2.0g LITRO

10.0g 10.0g 5.0g 1.0g 2.0g 0.02g

Peptona de gelatina Peptona de casena L-ornitina Dextrosa Agar Purpura de Bromocresol

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Este medio se inocula por picadura y se incuba de 18 a 24 horas a una temperatura de 35 grados

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RESULTADOS
Primero se leen las reacciones de movilidad y de ornitina descarboxilasa antes de agregar el reactivo de Kovacs para la prueba de indol La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas all de la lnea de inoculacin

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La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio. La ornitina negativa produce un color amarillo en el fondo que puede ser purpura al final

Para la prueba de indol se aaden de 3 a 4 gotas de reactivo de Kovacs y se agita suavemente el tubo. La aparicin del color del color rosa o rojo se interpreta como prueba positiva a indol

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Prueba catalasa en tubo plasma citratado

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Fundamento

Staphylococcus aureus posee dos tipos de coagulasa: * Una endocoagulasa o coagulasa ligada o cuando se mezcla una suspensin bacteriana con plasma citratado u oxalatado.
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Constitucin

Coagulasa en tubo:

Colocar volmenes iguales de plasma citratado y de cultivo de caldo de Staphylococcus mezclar suavemente e incubar durante 4hs a 37C controlando cada 30min, si se produce la coagulacin.

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Resultados

Positivo: coagulo total, parcial: cualquier grado de coagulacin Negativo: suspensin homognea (Staphylococcus epidermidis u otro organismo
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MATERIAL

1 tubo con agar TSI 1 tubo con agar LIA 1 tubo con Citrato de Simmons 1 tubo plasma citratado 1 tubo con caldo urea
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1 tubo con Peroxido de Hidrogeno Microscopio Reactivos para la tincion de Gram Mechero 6/5/12 Asa Bacteriologica

PROCEDIMIENTO
1.-tomar colonias aisladas de las placas de agar sangre y agar chocolate. Observar si hay hemolisis; reportar la presencia de estreptococos y confirmar con H2O2 para descartar estafilococos. Hacer frotis y teir por tcnica de Gram

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2.- si hay desarrollo en agar EMB; sembrar en los tubos de pruebas bioquimicas siguiendo el procedimiento de su practica exudado faringeo

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3.-

los tubos de LIA y TSI se siembran por estria simple y picadura

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4. si se obtiene desarrollo en

las cajas de agar S-110 efectuar la prueba de coagulasa (plasma citratado)

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5.- de un Diagnostico con discusin de los resultados obtenidos.

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BIBLIOGRAFIA

Koneman Elmer W. DIAGNSTICO MICROBIOLGICO Editorial Mdica Panamericana, 2004 - 1432 pginas Matthew J. Lynch, Mtodos 6/5/12 de laboratorio, 2 edicin,