Universidad de Concepcin

FACULTAD DE MEDICINA

CARRERA DE TECNOLOGIA MEDICA

Histoqumica de cidos Nucleicos

T.M. Andrea Dibarrart Vera 2008

DISTRIBUCIN DE LOS AN

ARN

Surcos y Fuerzas de estabilizacin en el ADN.

ESTABILIZACIN DE CIDOS NUCLEICOS.

Nucleoprotenas se estabilizan bien; como la mayora de las protenas. Poseen alto peso molecular (insolubilizacin).

cidos Nucleicos unidos a protenas (ADN y ARN unido a poliribosomas) se conservan, no as los AN libres (ARNm, ARNt) Si el mtodo de tincin requiere de una hidrlisis previa, NO SE DEBE UTILIZAR FIJADORES ACIDOS.
Si vamos a identificar ARNr hay que tratar de no destruir membranas (evitar fijadores a base de solventes orgnicos) y de eleccin, clulas con alta sntesis de protenas. CH3COOH, buen precipitador de nucleoprotenas.

HISTOQUIMICA DE ACIDOS NUCLEICOS

Base Nitrogenada Pentosa Radical Fosfato

HQ DE AN: IDENTIFICACION POR BASE NITROGENADA

ABSORCIN EN EL ULTRAVIOLETA DE BASES NITROGENADAS.

El no apilamiento de bases, producto de la desnaturalizacin determina que stas absorvan radiacin UV. Los AN presentan una mayor absorcin de luz UV a 254260 nm debido a la interaccin entre la luz UV y los sistemas de anillos de las purinas y pirimidinas. Cualquier molcula que contenga bases nitrogenadas (nuclesidos; nucletidos y polinucletidos) pueden analizarse utilizando luz UV.
Importancia: Localizacin; separacin y caracterizacin de AN (aislamiento luego de separarlos por electroforesis, por ejemplo).

HQ DE AN: IDENTIFICACION POR SU PENTOSA

Reaccin de Feulgen Hidrlisis cida dbil que puede ser realizada a 60C (HCl 1M) T A. (HCl 5 M). La hidrlisis es capaz de provocar la formacin de grupos aldehdos que Son detectados con el reactivo de Schiff.

REACCIN DE FEULGEN

La hidrlisis cida rompe aquellos enlaces de hidrgeno que une a la doble hlice (desnaturalizacin), lo que provoca la liberacin de bases pricas (A y G) con la formacin de un cido apurnico y la generacin de grupos CHOs en el C1 de la pentosa, donde se hallaba la base nitrogenada.

Mtodo de Feulgen consiste en una depurinizacin por hidrlisis cida del ADN, y la posterior utilizacin del reactivo de Schiff (leucobase).

Para obtener el mayor nmero de grupos CHO reactivos, debemos realizar una hidrlisis que libere la mayor cantidad de bases pricas, sin producir despolimerizacin del ADN, ni romper las uniones tipo ster con los fosfatos en los C3 y C5.

HIDROLISIS ACIDA DEL ADN

Variables a considerar:
Tiempo de hidrlisis; pH Temperatura Fijador Grado de compactacin de la cromatina.

Cromatina Laxa

Cromatina Compacta

Sin Depolimerizar

10

15

20

25

30

35

TIEMPO (HCl 1N/60C)

Reactivos Seudo-Schiff

Distintos colorantes y fluorocromos que en presencia de H2SO3 tambin se decoloran como lo hace la pararosanilina, los que en presencia de grupos CHO del tejido forman compuestos coloreados. Son colorantes bsicos que presentan a lo menos un amino primario y no presentan grupos cidos. Estos compuestos son altamente sensibles y se pueden cuantificar. Los colorantes fluorescentes (fluorocromos) saturados con SO3 emiten una fluorescencia particular en presencia de grupos CHO Ejps: Acridina; Acriflavina; Auramina 0.

FEULGEN

HQ DE AN: IDENTIFICACION DEL RADICAL FOSFATO

Utilizacin de colorantes bsicos a pH cido

Pironina Y ; PM= 302.812 C.I. 45005 Verde de Metilo; PM= 458.488 C.I. 42585

VERDE DE METILO/PIRONINA Y Selectividad en la Tincin

1.- El Verde de Metilo sera ms catinico y, por lo tanto presentara una > afinidad por molculas ms polimerizadas (ADN).
La Pironina tiene afinidad por molculas menos polimerizadas (ARN). 2.- Basado en un fundamento Estereomtrico: disposicin de la molcula en el espacio. Existira un alineamiento espacial de los grupos aminos (+) del colorante a los radicales fosfato(-) en la doble hlice de ADN.

Nota: Si cambio el pH de la solucin, cambia la afinidad diferencial. El pH en que hay selectividad se encuentra entre 4-5. Por otro lado, la [ ] de ambos colorantes en solucin es crtica: ambos compiten.

VERDE DE METILO/PIRONINA Y

GALOCIANINA CROMOALUMBRE

El carcter de la Galocianina no es ni bsico ni cido. Al asociarse al Alumbre de Cromo forma una LACA CATIONICA. Este mtodo trabaja a pH = 1,5-1,75. La Galocianina Cromo-alumbre dura slo 4 semanas. Conservar a 4C; frasco oscuro. Color en los tejidos: Azul-pizarra.

 A pH bajo (<1,5), la Galocianina cromoalumbre reacciona casi especficamente con AN . Aparentemente a pH bajo los grupos fosfricos en el tejido permanecen disociados y pueden formar una sal con la laca de cromo.

Oxazina anfotrica.

Galocianina-Cr-Al

MTODOS DE EXTRACCIN DE CIDOS NUCLEICOS

1.- ENZIMTICA: RNasa y DNasa. 2.- QUMICA: ATC (4%/90C/15 min: ARN y ADN) ; HClO3 (10%/4C toda la noche: - ARN; 5%/60C/30 min : ARN y ADN); HCl 1 M /60C: -ARN en tiempo ptimo.Econmica pero
variable.

Nota: La extraccin de ARN con cido perclrico tambin extrae bases pricas y pirimdicas del ADN, el que puede ser detectado

con el reactivo de Schiff.

FLUOROCROMOS
Internalares No intercalares Mixtos

IDENTIFICACIN DE ADN POR MEDIO DE FLUOROCROMOS.

Los fluorocromos que se utilizan para el estudio de ADN son generalmente catinicos, con anillos aromticos y planares. Al unirse al ADN pueden actuar como:

A.- INTERCALARES: Fenantrinas y Acridinas

B.- NO INTERCALARES (MinorGroove binders) Indoles e Imidazoles C. MIXTOS: Derivados de las Cianinas
DAPI

INTERCALARES
Fenantrinas y Acridinas

Forman complejos estables con el ADN:

ANARANJADO DE ACRIDINA. Presenta a lo menos un grupo polar (atraccin electrosttica) y adems se intercala entre las bases . Se unen al polianin por atraccin electrosttica.
QUINACRINA (regiones A-T, brillantes y G_C, oscuras). BROMURO DE ETIDIO PROPIDIUM YODADO (PI): No presentan selectividad por pb y su unin es estequiomtrica (1: 4-5 pb).

Acridine Orange

Ethidium Bromide

Propidium Iodide

NO INTERCALARES
Indoles e Imidazoles
Va dominios hidrfobos. Se unen externamente y no se intercalan: DAPI (A-T selectivo) Hoechst 33342 (A-T); Hoechst 33342 Actinomicina O (G-C);

DAPI

SURCO MENOR

MIXTO
Derivados de las Cianinas

Se pueden unir externamente al ADN (alta proporcin colorante:pb) y por intercalacin (baja relacin colorante:pb)
Son extremadamente sensibles y presentan una fluorescencia ms estable (alto costo). Fluorescen slo cuando se unen al ADN.

Ejm: TOTO-1; YOYO-1

TOTO-1

HIBRIDACIN DE ADN y ARN

Desnaturalizacin del ADN blanco: Hibridizacin de los AN en presencia de una sonda marcada Marcadores:
1.- Radioactivos (isotopicos): 3H; 125I; 35S. 2.- No radioactivos (no isotopicos): digoxigenina, biotina, fluorescencia Hibridacin In Situ: Cromognica (CISH) Fluorescente (FISH)

ESTUDIO DE APOPTOSIS

Tincin nuclear simple I.S.E.L. (IN SITU END LABELLING )

1.- TUNEL 2.- In Situ Nick Traslation

I.S.O.L. Anexina V IHQ (Bax, Caspasas, Fas)

TUNEL
Terminal Uridine Nick End Labelling

Enzima: La Tranferasa terminal (tdT)

Sustrato: Deoxiuridina trifosfato marcado (dUTP)+ Co+2.

In Situ Nick Traslation Se

diferencia del TUNEL en la enzima: Polimerasa I

ISOL
In situ Oligo Ligation
Enzima: Ligasa

ANEXINA V

La anexina-V es una protena que se une especficamente al fosfolpido: fosfatidilserina, el cual se encuentra en la cara interna de la membrana plasmtica y es expuesto en la cara externa de dicha membrana cuando comienza el proceso de apoptosis. Para la unin de la protena con el fosfolpido es requerida la presencia de calcio, por lo que ser necesario la preparacin de un binding buffer donde se mantendr la suspensin celular

ESTUDIOS DE PROLIFERACION

MTODOS MORFOLGICOS (figuras mitticas, utilizacin de precursores del ADN marcados) MTODOS INMUNOLGICOS (Ki-67, PCNA, alfa-DNA polimerasa, etc)

ESTUDIO DEL CONTENIDO DE ADN

CITOMETRIA DENSITOMTRICA: Esttica y de Imagen CITOMETRIA DE FLUJO