CINVESTAV Unidad Irapuato

Rocio Medina Chvez ASESOR TECNICO: Dra. June Simpson DIRECTOR: Dr. Alejandro Tllez

Importancia del frijol como fuente alimenticia Problemas agronmicos; estrs causado por factores Biticos. Antracnosis (C. Lindemuthianum) Identificacin de los genes candidatos o marcadores asociados a stos. Desarrollo de nuevos materiales de Phaseolus as como la naturaleza de su control gentico . Empleo de las nuevas herramientas moleculares disponibles

 FRIJOL

COMUN (Phaseolus vulgaris)

Originario de Amrica Antigedad del Cultivo:10,000aos Especies de Phaseolus: P. vulgaris, P. coccineus, P. lunatus, P. acutifolius.

ETAPAS DE LA PLANTA

Emergencia Inicio de floracin

Plena Floracion

Fin de floracin Periodo de floracin Madurez Fisiolgica

Contenido Nutricional promedio por 100g de alimento crudo

PROPIEDADES
kcal 332 fibra 4,3 g humedad 7,9 g grasas 1,8 g protenas 19,2 g carbohidratos 61 g

LIPIDOS
grasas totales 1,8 g colesterol 0,0 mg saturados totales 0,12 g monoinsaturados 0,06 g poliinsaturados 0,18g

MINERALES
calcio 228 mg hierro 5,5 mg magnesio 140 mg sodio 24 mg potasio 1406 mg zinc 2,79 mg fluor

VITAMINAS
retinol 1,0 g tiamina 0,62 mg riboflavina 0,14 mg niacina 1,7 mg piridoxina 0,4 mg cido flico 394 g cobalamina 0,0 g

AMINOACIDOS
isoleucina 927 mg leucina 1685 mg lisina 1593 mg metionina 234 mg fenilalanina 1154 mg treonina 878 mg triptofano 223 mg valina 1016 mg arginina 1257 mg histidina 627 mg

fsforo 407 mg cido ascrbico 0mg

INTERES SOCIOECONOMICO
Perspectiva Nacional Produccin total: 1.7 millones de Toneladas (2008) Contexto Internacional Produccin total: 23 millones de Toneladas

INTERES CIENTIFICO: Fijacin de Nitrgeno (Rhizobium etli)

PRINCIPALES ENFERMEDADES: Hongos, Bacterias, Virus, Nmatodos.

Fuente: Organizacin de las Naciones Unidas para la agricultura y la alimentacin

Agente causal de la Antracnosis del frijol

Variedades Diferenciales de frijol (Pastor-Corrales, 1991)

VARIEDAD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

NOMBRE
Michelite M.D.R.K Perry Marrow Cornell Widusa Kaboon Mex 222 Pi 207262 To Tu AB 136 G2333

No. De CLASIFICACION
1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048

Fase Biotrfica Fase Necrotrfica

Enfermedad del frijol comn de mayor importancia econmica a nivel mundial Prdidas en el rendimiento entre 38 y 95%. Factores ambientales: climas frescos a fros, alta humedad relativa mayor de 92%. Temperatura optima entre 17-18C

cDNA

ESTs

TRANSCRIPTOMA

OBJETIVO GENERAL DEL PROYECTO Estandarizar el sistema de Interaccin patgeno-planta (Colletotrichum lindemuthianum- Phaseolus vulgaris ) para obtener RNAs en diferentes estadios de infeccin.

Seleccionar cepas de C. lindemuthianum, patognicas, y no patognicas al cultivar BAT93 del frijol comn P. vulgaris. Inocular plantas de frijol de los cultivares BAT93 y Victoria en diferentes estados de infeccin. Estandarizar el mtodo de obtencin de RNA en plantas de frijol BAT93 expuestas a dos razas diferentes (patognica y no patognica) para su posterior secuenciacin y obtencin de transcritos EST.

Estandarizacin del mtodo de cultivo de las cepas de C. Lindemuthianum. Nivel de esporulacin optimo y recoleccin de conidias. Cultivo y crecimiento de las variedades de frijol BAT 93 y Victoria. Ensayos de infeccin para la estandarizacin y caracterizacin de la Antracnosis en las variedades de frijol BAT 93 y Victoria. Estandarizacin del mtodo de extraccin.

Obtencin de material vegetal

Estandarizacin de las Condiciones ptimas de Crecimiento, Reactivacin y Esporulacin de las Cepas de C. lindemuthianum
Medio M3S
Componentes MgSO4 KH2PO4 Ext. Leva dura Bacto Peptona Sucrosa Agar Composicin (100ml) 0.25 g 0.27 g 0.1 g 0.1 g 1.0 g 1.5 g

INOCULACION EN PLANTULA

INOCULACION EN HIPOCOTILO

ESCALA PARA LA EVALUACION DE ANTRACNOSIS

VALOR 0

SINTOMATOLOGIA
Sin infeccin; no hay presencia de sntomas visibles en el envs ni en el haz de la hoja. Las plantas se consideran inmunes. Infeccin leve. Se observan algunas lesiones pequeas de color caf rojizo, sobre las principales nervaduras de la hoja, en su mayora visibles solo por el envs. Las manchas miden de 1 a 2 mm de ancho por 2 5 mm de largo.

Infeccin Moderada. Se observan manchas necrticas de color caf en las nervaduras tanto principales como secundarias, rodeadas de reas necrticas del tejido adyacente. Este sntoma se aprecia tanto por el haz como por el envs; esporulacin nula.
Infeccin Severa. Se observan decoloraciones de color caf oscuro en todas las nervaduras de la hoja, tanto por el haz como por el envs. En ocasiones el tejido presenta necrosis; se puede identificar esporulacin en las lesiones. Infeccin muy Severa. Decoloracin completa de la nervadura y necrosis del tejido, cada de hojas o rotura del tallo. Abundante esporulacin en las lesiones.

EXPERIMENTO DE TRANSCRIPTOMA INTERACCIN P. vulgaris C. lindemuthianum.

Cepas C. Lindemuthianum: A4 R1088/A6R256 3 Plantas por muestra de RNA 6 Plantas control: Victoria

EXTRACCION DE RNA
TRIZOL Reagent (Cat: No. 15596-018, Invitrogen, California, USA). Nucleo Spin RNA Plant (Cat: No. 740949.10, MachereyNagel, Germany). ZR RNA Micro Prep (Cat: No. R1060, Zymo Research, USA). Pure Link Micro-to-Midi Total Rna Purification System (Cat: No. 12183, 018).

PURIFICACION DE RNA MENSAJERO PURIFICACION DE mRNA; PRUEBA DE SINTESIS DE Cdna

Clone Miner cDNA Library Construction Kit (Cat: No. 18249029, Invitrogen, California, USA).

SIEMBRA Y DESARROLLO DE SEMILLAS

NIVEL DE ESPORULACION Y PATOGENICIDAD DE LAS CEPAS DE Colletotrichum lindemuthianum.

INFECCION EN HIPOCOTILO BAT 93 y VICTORIA

1 SEMANA DE INFECCION

EVALUACION: INFECCION EN HIPOCOTILOS

CEPA A4 R1088 CULTIVAR VICTORIA BAT 93 REACCION compatible compatible REACCION 4 4

A19 R1280

VICTORIA
BAT 93

compatible
Incompatible

4
0

Comparacin de los resultados entre ambas cepas y cultivares

EVALUACION: SINTOMAS DE INFECCION Cultivar: BAT 93

CEPA A4 R1088 REACCION Compatible REACCION 4 CEPA A4 R1088

Cultivar: VICTORIA
REACCION Compatible REACCION 4

A6 R256
A12 R384 A16 R292 A17 R2 A19 R1280

Incompatible
Compatible Compatible Incompatible Compatible

0
2 1 0 1

A6 R256
A12 R384 A16 R292 A17 R2 A19 R1280

Compatible
Compatible Compatible Compatible Compatible

4
4 3 2 4

CEPA A2 R448 A4 R1088

A6 R255

A12 R384

A16 R292

A17 R2

A19 R1280

EVALUACION DE SINTOMAS " ANTRACNOSIS" INOCULACION EN PLANTULA CULTIVAR Reaccin Mex 222 Compatible Pi Compatible Cornell Incompatible Mex 222 Incompatible BAT 93 Compatible To Compatible BAT 93 Incompatible Cornell Incompatible Perry Compatible BAT 93 Compatible Pi Compatible Michigan Incompatible Perry Compatible To Compatible Michigan Incompatible Mex 222 Compatible Perry Incompatible Michigan Incompatible BAT 93 Incompatible To Compatible

de Reaccin 2 3 0 4 4 4 0 0 1 3 4 0 3 4 0 4 0 0 0 4

INOCULACION EN PLANTULAS
CEPA A4 R1088 CULTIVAR Mex 222 FMB To BAT 93 Mex 222 FMB To BAT 93 EVALUACION DE LA SINTOMATOLOGIA 1 da 3 da 1 semana 2 4 4 2 4 4 3 2 4 2 4 1

A19 R1280

EVALUACION DE LA INFECCION EN PLANTULAS

INOCULACION

INFECCION DE PRUEBA:

Gel del RNA extrado de BAT 93 de plantas infectadas por C. Lindemuthianum muestra extrada 96 h. posteriores a la infeccin.

Muestra: BAT 93 infectado de C. lindemuthianum. Extraccin de mRNA y Sntesis de cDNA

Se lograron reactivar todas las cepas de C. lindemuthianum y obtener esporulacin con el medio M3S. Todas las razas se mantuvieron uniformes cuando fueron inoculadas con las doce variedades diferenciales. Se seleccionaron para el proceso de interaccin Phaseolus vulgaris Vs Colletotrichum lindemuthianum, las razas 1088 (patognica) y 256 (no patognica), por mantenerse constantes en el ensayo por hipocotilos y plntulas; as como para el control positivo (cultivar Victoria). Se logr obtener muy buena calidad del RNA del BAT 93 y Victoria cuando fueron colectado el tejido a las 96 horas posteriores a la inoculacin de las razas 1080 y 256. Se obtuvieron cantidades de fragmentos transcritos, cuando se aisl el RNA mensajero y se hizo una sntesis de cDNA de prueba, obteniendo sntesis entre los rangos de 750 a 1500pb.

Dilucidar la secuencia del genoma completo de Phaseolus vulgaris, establecer y diseminar las herramientas necesarias para dirigir e incrementar el mejoramiento gentico del cultivo. Obtener la secuencia genmica completa de Phaseolus vulgaris. Procesamiento y ensamblaje de los datos de secuenciacin (Obtencin de bancos de BACs y secuenciacin de sus extremos [BES] para la generacin del mapa fsico.. Integrar mapas genticos con mapas fsicos. Determinacin de todas las unidades transcripcionalmente activas del frijol. Anotacin del genoma de Phaseolus vulgaris. Secuenciacin de regiones genmicas asociadas a caracteres de importancia agronmica y de calidad nutricional y sensorial, as como resistencia y/o tolerancia a estreses biticos y abiticos. Desarrollo de marcadores asociados con caractersticas de inters, para seleccin asistida mediante la utilizacin de genes y otros marcadores moleculares derivados de la secuenciacin del genoma.

Dra. June Simpson Laboratorio de Gentica y Biologa Molecular del CINVESTAV Irapuato Bilogo Fernando Hernndez Dr. Alejandro Tllez

GRACIAS!!