Lehrstuhl für Siedlungswasserwirtschaft

Ingenieurfakultät Bau Geo Umwelt

Technische Universität München

Normal and Reversed Phase Chromatography

PD Dr. J. Graßmann; PD Dr. T. Letzel

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Normal and Reversed Phase Chromatography

• Adsorption Chromatography (Normal Phase and Reversed Phase)

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Normal and Reversed Phase Chromatography

Stationary Phase

Normal Phase Reversed Phase

Silica Si-OH Silica bonded phases

Silica bonded phases (-NH2; -CN) Octadecyl
Aluminiumoxide (Al-OH) Octyl
Phenyl
Cyanopropyl

Mobile Phase

Unpolar Solvents Polar Solvents

Heptane, Hexane, Dichlormethane, Buffer, methanol, acetonitrile

t-Butylmethylether, Cyclohexane,
Ethylacetate
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Normal and Reversed Phase Chromatography

Normal Phase
The mostly used solid phases are silica gels (normal phase HPLC)

HO
OH O
Si
O Si OH O
O
O O Si
HO Si
O
HO OH Si O O
O O
Si O Si
Si
HO Si
O O
O

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Normal and Reversed Phase Chromatography

Normal Phase
The mostly used solid phases are silica gels (normal phase HPLC)

HO CH2 N
NH2 CH C
OH
(CH 2)n CH2 (CH 2)n
H 3C H3C H 3C
Si Si Si
O CH3 O CH3 O CH3
OH

Si Si Si Si
R R R R R R R R
R R R R
Silica Amino Diol Cyano

Column Retentivity: Silica >> Amino > Diol ~ Cyano

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Normal and Reversed Phase Chromatography
Normal Phase
Normal Phase Advantages
 Separation selectivity can be greatly
influenced by altering mobile phase
constituents and ratio of solvents
 Organic compounds are highly
soluble in the solvents  advantage
for preparative chromatography
 Solvent viscosity is lower  higher
flow rates and therewith higher
sample thoughput can be achieved
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Normal Phase Disadvantages
 Amendable to low and mid polarity
samples
 Controlling solvent strength can be
unpredictabal
 Solvents are more prone to air
bubble formation giving raise to
instrument problems and noisy
baselines
 Gradient elution is often not feasible
 Solvents used have higher cpst of
disposal and environmental impact
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Normal and Reversed Phase Chromatography

Reversed Phase
In case of modified silca gels, e.g. with alkyl groups: Reversed phase HPLC

HO H37 C18 O
OH O OC18 H37 O
Si Si
O Si OH O O Si OH O
O O
O O Si O O Si
HO Si H37 C18 O Si
O
HO OH Si O O
O H37 C18 O OC18 H37 Si O O
O O O
O Si Si O Si
Si O Si Si
H37 C18 O Si
HO Si O O
O O
O
O
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Normal and Reversed Phase Chromatography

Reversed Phase

Example for transformation of a normal phase to a reversed phase:

Si OH Si OSi(CH 2)2R
Si OH Si OH
Si OH
Cl-Si(CH2)2R
Si OSi(CH 2)2R
Si OH Si OH
Si OH Si OH
Si OH Si OSi(CH 2)2R

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Normal and Reversed Phase Chromatography

Reversed Phase - Characteristics of different stationary phases
Si OSi(CH 2)2R
Si OH
H2)2R
Si OSi(CH 2)2R
Si OH
Si OH
Si OSi(CH 2)2R

R= Name
-(CH2)17-CH3 Octadecyl (C18) Decreasing
Hydrophobicity /
-(CH2)7-CH3 Octyl
Increasing Polarity
-CN Cyano
-(CH2)3-CN Cyanopropyl Increasing
-Phenyl Phenyl retention
of non-polar
-NH2 Amino analytes
-(CH2)3-NH2 Aminopropyl
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Normal and Reversed Phase Chromatography

HILIC

HILIC = Hydrophilic Interaction Liquid – Chromatography

HILIC ia a variation of Normal Phase Liqiud Chromatography

The stationary phase is polar

The mobile phase has high organic content and is miscible with water

HILIC is suitable for separation of polar compounds

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Normal and Reversed Phase Chromatography

HILIC - Classification of HILIC stationary phases

Greco and Letzel. Sep. Sci. 2013, HILIC Solutions No.3

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Normal and Reversed Phase Chromatography

Selection of a stationary phase

Types of Compounds Mode Stationary Phase Mobile Phase

Neutrals, Weak Acids, Reversed C18, C8, C4 Water/Organic

Weak Bases Phase cyano, amino Modifiers
Ionics, Bases, Acids Ion Pair C18,C8 Water/Organic
Ion-Pair Reagent
Compounds not soluble Normal Phase Silica, Amino, Organics
in water Cyano, Diol
Ionics / Inorganic Ions Ion Exchange Anion or Cation Aqueous/Buffer
Exchange Resin Counter Ion
High Molecular Weight Size Exclusion Polystyrene Gel Filtration -
Compounds Silica Aqueous
Polymers Gel Permeation-
Organic

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Normal and Reversed Phase Chromatography

Selection of stationary and mobile phase

Analyte examples (Log P gives the polarity)

OH
H3C CH3 H3C
OH O O HO
O
OH

Log P = -3.2 -1.8 -0.2 0.5 1.5 2.7 4.8

Analyte -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
Log p
Normal Phase Separation Reversed Phase Separation
Column with hydrophilic surface Column with hydrophobic surface
Typical MeCN/H2O Hexane/EtOH H2O/MeCN
mobile (HILIC) CO2/MeOH H2O/MeOH
phases

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