DEUTSCHE NORM August 2000

Nachweis von Salmonellen in Lebensmitteln

mittels enzymgebundenen {
Fluoreszenzimmunoassay 10121
ICS 07.100.30

Detection of Salmonella in foodstuffs with enzyme linked fluorescent

immuno-assay

Recherche de Salmonella dans les produits alimentaires par un test

immuno-enzymatique fluorescent

Vorwort
Diese Norm wurde vom Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte, Arbeitsausschuss
"Mikrobiologische Lebensmitteluntersuchung einschließlich Schnellverfahren" erarbeitet.

1 Anwendungsbereich
Diese Norm legt ein Routineverfahren zum Nachweis von Salmonellen mittels eines enzymgebundenen
Fluoreszenzimmunoassay (ELFA) fest.
ANMERKUNG Auf die Vorschriften des Bundesseuchengesetzes wird verwiesen.

2 Normative Verweisungen
Diese Norm enthält durch datierte oder undatierte Verweisungen Festlegungen aus anderen Publikationen. Diese
normativen Verweisungen sind an den jeweiligen Stellen im Text zitiert, und die Publikationen sind nachstehend
aufgeführt. Bei datierten Verweisungen gehören spätere Änderungen oder Überarbeitungen dieser Publikationen
nur zu dieser Norm, falls sie durch Änderung oder Überarbeitung eingearbeitet sind. Bei undatierten
Verweisungen gilt die letzte Ausgabe der in Bezug genommenen Publikation.
DIN EN 12824:1998-02, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln — Horizontales Verfahren zum
Nachweis von Salmonellen (ISO 6579:1993, modifiziert); Deutsche Fassung EN 12824:1997.
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General rules for microbiological examinations.

3 Begriffe
Für die Anwendung dieser Norm gelten die folgenden Begriffe:
3.1
Salmonellen
Mikroorganismen, die durch monoklonale Salmonella-Antikörper gebunden und durch eine Fluoreszenzreaktion
erkannt werden. Salmonellen bilden typische Kolonien auf festen Selektivmedien und besitzen bei der
Untersuchung nach dem in DIN EN 12824 festgelegten Verfahren die beschriebenen biochemischen und
serologischen Eigenschaften.
3.2
Nachweis von Salmonellen
Feststellung der Anwesenheit dieser Mikroorganismen in einer vorgegebenen Produktmenge nach dem in dieser
Norm vorgegebenen Verfahren.

Fortsetzung Seite 2 bis 5

Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN Deutsches Institut für Normung e.V.
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DIN 10121:2000-08

4 Prinzip
4.1 Allgemeines
Der Nachweis von Salmonellen erfordert mehrere aufeinanderfolgende Schritte.
Bei Verwendung von kommerziell erhältlichen immunologischen Nachweisverfahren (ELFA-/ELISA-Testsysteme), die
mit dieser Norm vergleichbare Ergebnisse erzielen, ist der Nachweis von Salmonellen grundsätzlich nach den
Angaben des Herstellers zu führen. Das hier beschriebene Verfahren ist beispielhaft.
ANMERKUNG Salmonellen können im Probenmaterial in geringer Anzahl, subletal geschädigt oder gemeinsam mit einer größeren
Anzahl anderer Mikroorganismen vorkommen. Daher sind eine Voranreicherung und eine selektive Anreicherung notwendig.

4.2 Voranreicherung in einem nicht selektiven, flüssigen Nährmedium

Gepuffertes Peptonwasser wird mit der Probe beimpft und 16 h bis 20 h bei 37 °C inkubiert.

4.3 Anreicherung in selektiven, flüssigen Medien

Ein Magnesiumchlorid-Malachitgrün-Medium (RV-Medium) und ein Selenit-Cystin-Medium werden mit der nach 4.2
erhaltenen Kultur beimpft und bei 42 °C bzw. 37 °C für 6 h bis 8 h inkubiert.

4.4 Inkubation nach der Anreicherung in einem nicht selektiven, flüssigen Medium
Mannose-(M-)Bouillon wird mit den nach 4.3 erhaltenen Kulturen beimpft und 18 h bei 42 °C inkubiert.
Nach der Inkubation werden 1 ml jeder M-Bouillon für 15 min im Wasserbad bei 100 °C erhitzt.

4.5 Nachweis von Salmonellen

Die nach 4.4 erhaltenen Suspensionen werden in einen Antikörperträger mit Salmonella-Antikörpern verbracht.
Durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion werden vorhandene Salmonellen gebunden und mit einer Fluoreszenz-
reaktion angezeigt.

4.6 Bestätigung und Identifizierung

Bei positivem Ausfall des Nachweises nach 4.5 werden der Teil der M-Bouillon, der nach 4.4 nicht erhitzt wurde,
sowie das Magnesiumchlorid-Malachitgrün-Medium und das Selenit-Cystin-Medium nach 4.3 zur Bestätigung heran-
gezogen. Zwei selektive feste Nährmedien werden mit diesen Kulturen beimpft.
Weiteres Vorgehen nach DIN EN 12824:1998-02, 4.3 und 4.4.

5 Nährmedien, Chemikalien und Seren

5.1 Allgemeines
Zur üblichen Laboratoriumspraxis siehe ISO 7218.

5.2 Nährmedien und Chemikalien

5.2.1 Allgemeines
Es werden alle Nährmedien und Chemikalien nach DIN EN 12824:1998-02, B.1 bis B.13 benötigt.
5.2.2 Flüssiges Medium nach der Anreicherung (M-Bouillon)
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DIN 10121:2000-08

5.2.2.1 Zusammensetzung
– Hefeextrakt 5,0 g
– Pepton aus Casein (pankreatisch verdaut) 12,5 g
– D-Mannose 2,0 g
– Natriumcitrat 5,0 g
– Natriumchlorid 5,0 g
– Dikaliumphosphat 5,0 g
– Magnesiumsulfat 0,8 g
– Manganchlorid 0,14 g
– Eisen(III)-sulfat 0,04 g
– Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (z. B. Tween 80®)1) 0,75 g
– Wasser 1 000 ml

5.2.2.2 Herstellung
Die Bestandteile werden in Wasser gelöst und bei 100 °C 1 min bis 2 min zum Sieden gebracht. Nach dem
Einstellen des pH-Wertes auf pH = 7, 0 ± 0,2 bei 25 °C wird das Medium in 10 ml Portionen in Kulturröhrchen
überführt und bei 121 °C ± 1 °C für 15 min autoklaviert.

5.3 Seren
Nach DIN EN 12824:1998-02, 5.3.

5.4 Reagenzien und Materialien für den enzymgebundenen Fluoreszenzimmunoassay

5.4.1 Antikörperträger2)
Antikörperträger, beschichtet mit monoklonalen Salmonella-Oberflächenantigen-spezifischen Antikörpern.

5.4.2 Küvetten
5.4.2.1 Probenküvette
Probenküvette für 500 µl Anreicherungsnährmedium nach 4.4.

5.4.2.2 Vorwaschpuffer und Waschpuffer:

400 µl Vorwaschpuffer und 600 µl Waschpuffer werden wie folgt hergestellt:
– Tris-NaCl-Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (z. B. Tween 80®)1) (150 mmol/l) 18,15 g/l
– Natriumazid 1 g/l

5.4.2.3 Konjugat
Zur Herstellung von 400 µl Konjugat werden mit alkalischer Phosphatase markierte polyklonale Salmonella-
Antikörper (Hammel, Ziege) mit 1 g/l Natriumazid zusammengegeben.

5.4.2.4 Substrat
In eine Küvette werden 300 µl von 4-Methyl-Umbelliferyl-Phosphat und 1 g/l Natriumazid gegeben.

5.4.2.5 Positiv-Kontrolle
Gereinigtes und inaktiviertes Salmonella-Antigen mit 1 g/l Natriumazid.

5.4.2.6 Negativ-Kontrolle
Tris-NaCl-Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (z. B. Tween 80®)1) mit 1 g/l Natriumazid.

1)
Tween 80® ist der Handelsname des Produktes, geliefert von der ICI-America Inc. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung
der Anwender dieser Norm und bedeutet keine Anerkennung des genannten Produktes durch das DIN. Gleichwertige Produkte
dürfen verwendet werden, wenn sie nachweisbar zu den gleichen Ergebnissen führen.
2)
Auskunft über mögliche Bezugsquellen erteilt der Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im
DIN, Burggrafenstr. 6, 10787 Berlin.
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5.4.2.7 Antigen-Standard-Lösung
Gereinigtes und inaktiviertes Salmonella-Antigen mit 1 g/l Natriumazid in bekannter Konzentration.

6 Geräte und Glasgeräte

Übliche Ausstattung eines mikrobiologischen Labors, die Geräte nach DIN EN 12824:1998-02, Abschnitt 6 und die
folgenden:
6.1 Wasserbad, auf (100 ± 1) °C einstellbar.
6.2 Photozelle, Fluoreszenzmessung im Bereich von 450 nm.
6.3 Pipetten, Pipettenspitzen (Volumen 100 µl bis 1000 µl)

7 Probenahme
Nach DIN EN 12824:1998-02, Abschnitt 7.

8 Probenvorbereitung
Nach DIN EN 12824:1998-02, Abschnitt 8.

9 Durchführung
9.1 Einwaage und Erstverdünnung
Nach DIN EN 12824:1998-02, 9.1.

9.2 Nicht selektive Voranreicherung

Nach DIN EN 12824:1998-02, 9.2.

9.3 Selektive Anreicherung

Nach DIN EN 12824:1998-02, 9.3, mit folgender Abänderung:
10 ml eines Magnesiumchlorid-Malachitgrün-Mediums (RV-Medium) werden mit 0,1 ml der nach 9.2 erhaltenen
Kultur beimpft und bei 42 °C für 6 h bis 8 h inkubiert. 10 ml eines Selenit-Cystin-Mediums werden mit 1 ml der nach
9.2 erhaltenen Kultur beimpft und bei 37 °C für 6 h bis 8 h inkubiert.

9.4 Inkubation nach der Anreicherung in einem nicht selektiven, flüssigen Medium
Je 1 ml der nach 9.3 erhaltenen Kulturen in Magnesiumchlorid-Malachitgrün-Medium und in Selenit-Cystin-Medium
werden in je ein Röhrchen mit M-Bouillon (nach 5.2.2) verbracht und für 18 h bei 42 °C bzw. 37 °C inkubiert. Nach
der Inkubation wird je 1 ml der in den beiden M-Bouillons erhaltenen Kulturen zusammen in ein Röhrchen gegeben
und gemischt. Die Suspension wird 15 min im Wasserbad bei 100 °C erhitzt. Der Rest des Nährmediums und der
selektiven Medien nach 9.3 wird zur Bestätigung positiver Ergebnisse bei 4 °C aufbewahrt.
Wenn die bebrütete M-Bouillon nicht sofort weiterverarbeitet werden kann, darf diese 48 h bei 4 °C gelagert werden,
bei längerer Lagerung ist Einfrieren erforderlich. Die Erhitzung auf 100 °C muss nach der Lagerung durchgeführt
werden.

9.5 Nachweis von Salmonellen mittels enzymgebundenem Fluoreszenzimmunoassay

Alle Reagenzien und Materialien müssen vor ihrem Gebrauch mindestens 30 min auf Raumtemperatur erwärmt
worden sein. Reagenzien verschiedener Chargen dürfen nicht vermischt werden. Alle Reagenzien und Lösungen
müssen vor Gebrauch gut gemischt werden.
Von der nach 9.4 gewonnenen erhitzten Kultur werden 500 µl in eine Küvette gegeben.
In diese Küvette wird der Antikörperträger mit Salmonella-Antigen-Antikörper nach 5.4.1 eingetaucht. Gleichzeitig
werden, falls eine Kalibrierung nach Abschnitt 12 durchgeführt werden soll, je ein Antikörperträger nach 5.4.1 in die
Küvetten mit den Positiv- und Negativ-Antigen-Kontrollen nach 5.4.2.5 und 5.4.2.6 eingelegt sowie zweimal mit der
Antigen-Standard-Lösung nach 5.4.2.7 gemessen.
Nach diesem Schritt erfolgen sieben Waschschritte, in denen der jeweilige Antikörperträger einmal in Vorwaschpuffer
nach 5.4.2.2 und sechsmal in Waschpuffer nach 5.4.2.2 eingetaucht wird. Anschließend werden die jeweiligen
Antikörperträger in die Küvette mit dem Konjugat nach 5.4.2.3 eingetaucht und im letzten Schritt in die Küvette mit
dem Substrat nach 5.4.2.4 eingetaucht.
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Die entstandene Farbreaktion wird fluorometrisch gemessen. Es erfolgt jeweils eine doppelte Messung. Die erste
Messung dient der Erfassung des Hintergrundwertes durch Messung einer Küvette mit Substrat nach 5.4.2.4 ohne
weitere Zugaben. Die zweite Messung erfolgt nach Eintauchen des Antikörperträgers in die Küvette mit dem
Substrat. Aus der Differenz beider Werte ergibt sich ein Relativer Fluoreszenzwert (RFW). Der zur Bewertung
herangezogene Prüfwert ergibt sich aus dem RFW der Probe geteilt durch den RFW des Standards nach 5.4.2.7.

9.6 Bestätigung und Isolierung

Ein Prüfwert (RFW Probe/RFW Standard) von kleiner 0,23 wird als negativ angesehen, d. h., dass es sich um eine
Probe mit nicht nachweisbaren Salmonella-Antigenen handelt. Ein Prüfwert von größer bzw. gleich 0,23 wird als
positiv angesehen, d. h. es wurden Salmonella-Antigene nachgewiesen. Zur Isolierung der Salmonellen aus der
Probe werden die zuvor aufbewahrte M-Bouillon und die inkubierten Selektivmedien nach 9.3 verwendet.
Die weitere Subkultivierung auf festen Nährböden und die Bestätigungsreaktionen erfolgen wie in
DIN EN 12824:1998-02, 9.4 bis 9.5, beschrieben.

10 Auswertung
Wie in DIN EN 12824:1998-02, Abschnitt 10, festgelegt.

11 Untersuchungsbericht
Wie in DIN EN 12824:1998-02, Abschnitt 11, festgelegt.
Falls ein automatisiertes Verfahren benutzt wird, ist eine Angabe des Systems und der vom Hersteller angegebenen
Chargenbezeichnungen der Reagenzien erforderlich. Nach der automatisierten Auswertung im System werden
Chargennummer und Fluoreszenzwerte von Standard und Proben ausgedruckt.

12 Qualitätssicherung
Wie in DIN EN 12824:1998-02, Abschnitt 12, festgelegt.
Zusätzlich: Bei jedem Einsatz neuer Reagenzienchargen muss, wie in dieser Norm beschrieben, eine Positiv- und
eine Negativ-Kontrolle mitgeführt werden. Zusätzlich muss vor Einsatz einer neuen Reagenziencharge nach 5.4,
spätestens nach 14 Tagen, eine Kalibrierung mit der Standardlösung durchgeführt werden. Hierzu muss die erforder-
liche Menge des Standards von 500 µl ± 5 µl präzise pipettiert werden. Liegt der ermittelte Wert der Positiv-Kontrolle
und des Standards nicht innerhalb eines vorher festgelegten Bereiches, können die Probenergebnisse nicht
verwertet werden, und der Versuch muss mit neuen Kontroll-Lösungen wiederholt werden.
Liegt der Hintergrundwert der Substratprobe über einem festgelegten Wert (Kontamination der Lösung), muss die
Prüfung mit einer frischen Lösung wiederholt werden.