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Klinische Chemie u.

Pathobiochemie
fr Studenten der Biochemie


Stoffwechselprodukte und Substrate


Markus Thaler/Peter B. Luppa



Die Metabolit-Kenngren, die klinisch
relevant sind, haben eine relativ hohe
Serumkonzentration und knnen daher
mittels spektralphotometrischer Verfahren
quantifiziert werden.
Der optische Test (Spektralphotometrie)
E = Extinktion
e = Extinktionskoeff.
c = Konzentration
d = Schichtdicke
e = charakteristische
Stoffkonstante
abhngig von:
Wellenlnge
Temperatur
pH-Wert
Lambert-Beer'sches Gesetz: E = e

x
c
x
d
Eichkurve
(mind. 2 bekannte
Substratkonz.)
Standard
Extinktionskoeff.
l
l
l
Auswertung:
Streinflsse in der Spektralphotometrie
Definition
Der optisch-enzymatische Test ist
ein photometrisches Messverfahren,
das der Aktivittsbestimmung von
Enzymen oder der Bestimmung von
Substratkonzentrationen unter
Zuhilfenahme von Enzymen dient.

Voraussetzungen
Um die Aktivitt eines Enzyms zu
messen, mssen alle an der Reaktion
beteiligten Stoffe im berschuss vor-
liegen, die Messung im pH-Optimum
erfolgen sowie auf eine standardisierte
Temperatur geachtet werden.

Man unterscheidet den einfachen optisch-enzymatischen Test
und den zusammengesetzten optisch-enzymatischen Test.
Einfach optisch-enzymatischer Test
Die Aktivitt von Enzymen, die NAD+ oder NADP+ als Kofaktor bentigen, wird mittels des
einfach optisch-enzymatischen Tests gemessen. Solche Tests sind auf NAD- bzw. NADP
abhngige Dehydrogenasen beschrnkt, z. B. Lactat-Dehydrogenase, Malat-
Dehydrogenase, Glucose-6P-Dehydrogenase.
Grundlage ist dabei die nderung des Absorptionsmaximums des Cofaktors. In der
reduzier-ten Form als NADH bzw. NADPH liegt das Absorptionsmaximum der
Cofaktoren bei 340 nm; kommt es zur Oxidation liegt es bei 260 nm. Diese nderung
wird mittels eines Photometers gemessen und anschlieend mittels des Lambert-
Beerschen Gesetzes die Konzentration des Substrates berechnet, die in einer
bestimmten Zeit umgesetzt wurde.

Zusammengesetzter optisch-enzymatischer Test
Zusammengesetzte optische Tests mssen stets dann angewandt werden, wenn die
Test-reaktion selbst nicht von einer NAD- bzw. NADP-abhngigen Dehydrogenase
katalysiert wird. In diesem Fall muss der Testreaktion eine Indikatorreaktion nach-
geschaltet werden, in der ein Produkt der Testreaktion in einer NAD- bzw. NADP-ab-
hngigen Reaktion oder einer anderen photometrisch quantifizierbaren (Farb-)Reaktion
weiter umgesetzt wird.



Beispiel: Triglyceridbestimmung im Serum (GPO-PAP-Methode)

Methode nach Wahlefeld: Lipoproteinlipase hydrolysiert TG zu Glycerin + freien
FS. Das Glycerin wird durch die Glycerokinase zu Glycerin-3-phosphat
umgesetzt, welches dann mittels der Glycerin-Phosphat-Oxidase zu Dihydroxy-
acetonphosphat und H
2
O
2
oxidiert wird. H
2
O
2
wird in einer Endpunktsreaktion
unter der Katalyse einer Peroxidase mit 4-Aminophenazon zu einem roten
Farbstoff umgesetzt.
Klinisch-chemisch relevante
Stoffwechselprodukte
und Substrate

1. Bilirubin
Portalfeld mit Glisson-Trias
Zentralvene
Gallengang
Leberarterien-
Kapillare
Ast A. hepatica
Zentralvene
Lobulus
Gallengang
Pfortaderast
Schema des Leber-Lobulus
Pfortaderast
Bilirubin ist ein gelbbrauner Gallenfarbstoff, der dem Serum die
gelbe Farbe verleiht.


Der Metabolit wird zu etwa

90%
als albumingebundenes Bilirubin bei dem im retikulohistiozytren System (Milz,
Leber) erfolgenden oxidativen Abbau des Hb`s ber seine Vorstufe Biliverdin
gebildet, sowie bei der Hmoglobin-Synthese aus Protoporphyrin IX freigesetzt,

10%
katabolisch aus anderen Hmoproteinen (Myoglobin, Cytochrome u.a.) gebildet.

Bilirubin IXa wird durch Oxidation von Hm und Reduktion des
resultierenden Biliverdin IXa produziert
Bilirubinstoffwechsel in der Leber
Gallengang Hepatozyt
Bestimmungsmethode fr Gesamt-Bilirubin im Serum:
Kupplung mit Diazoniumsalzen
mittlere Methylengruppe
des unkonjugierten
Bilirubins reagiert bei
Azokupplung erst in
Anwesenheit sog.
Akzeleratoren (Coffein,
Methanol o..)
indirektes Bilirubin
B
t
= B
u
+ B
c
+ B
d

Konjugiertes Bilirubin: reagiert sofort bei Azokupplung direktes
Bilirubin
Unkonjugiertes Bilirubin: intramolekulare Wasserstoffbrcken
Die verschiedenen Methoden zur Best. der Bilirubins (z.B. Jendras-
sik-Grof, DPD-Methode, DCA-Methode) unterscheiden sich nur in der
Art des Diazoniumsalzes und in den verwendeten Akzeleratoren.

Bilirubin-Bestimmung: Endpunktmessung mit Probenleerwert

Extinktion x 10000
Bichromatische Messung:
Durch Messen bei zwei
Wellenlngen werden
strende Einflsse wie
Partikel oder Luftblasen
im Strahlengang eliminiert.







Prhepatischer Ikterus:

Hmolyse, ineffektive Hmatopoese
hoher Hb-Abbau Bilirubin indirektes
Bilirubin erhht:

korpuskulre hmolytische Anmie
extrakorpuskulre hmolytische Anmie
(Transfusionsreaktion, Medikamente)
Icterus neonatorum / Morbus hmolyticus
neonatorum
groe Hmatome
primre Shunt-Hyperbilirubinmie (selten)
Rhabdomyolyse
Verbrennungen

Posthepatischer Ikterus:

extrahepatische Cholestase
direktes Bilirubin erhht


Choledocholithiasis
Gallengangskarzinom
Pankreas(kopf-)karzinom
Gallengangsatresie
Abstoungsreaktion nach Leber-
transplantation
Ascaris-Infektion

Intrahepatischer Ikterus (I):

gestrter Bilirubin-Stoffwechsel der Leber (Aufnahme, Konjugation, Sekretion) oder gestrter Galle-
abfluss in der Leber (intrahepatische Cholestase) je nachdem ob Strung vor oder nach der
Konjugation liegt, ist indirekets oder direktes Bilirubin erhht:

primre Strungen des Bilirubinstoffwechsels:
Morbus Gilbert = Morbus Meulengracht (hufig!):
autosomal-dominant vererbt
Strung der Aufnahme unkonjugierten Bilirubins, Verminderung der UDP-Glukuronyltransferase
Manifestation zw. 20. und 40. Lj.
intermittierender Ikterus
indirektes Bilirubin erhht
gute Prognose
Criggler-Najjar-Syndrom:
Typ I: aut.-rez. vererbt, fehlende UDP-Glukuronyltransferase, Prognose schlecht
Typ II: aut.-dom. vererbt, Aktivittsminderung der UDP-Glucoronyl-Transferase, Prognose gut
indirektes Bilirubin erhht

Intrahepatischer Ikterus (II)

primre Strungen des Bilirubinstoffwechsels (Fortsetzung):


Dubin-Johnson-Syndrom:
autosomal-rezessiv
Exkretionsstrung von Bili in den Gallengngen
direktes Bilirubin erhht
Prognose gut
Rotor-Syndrom:
autosomal-rezessiv
gestrte Aufnahme und Ausscheidung des Bilirubins in die Leberzelle
chronischer Ikterus
direktes Bilirubin erhht
Prognose gut
Intrahepatischer Ikterus (III)

Sekundre Strungen des Bilirubinstoffwechsels (Leberparenchym-Schden):

intrahepatische Cholestase
(Virus-)Hepatitis
Leberzirrhose
Fettleber
Leberzellkarzinom, -metastasen
Intoxikationen, z.B.:
Alkohol
Drogen
Pilzvergiftungen
Lsungsmittel
Sepsis (Endotoxine)
Cholangitis
Salmonellen
Leptospirose
Icterus neonatorum (u.a.)
Klinisch-chemisch relevante
Stoffwechselprodukte
und Substrate

2. Creatinin
Creatinin ist ein Ausscheidungsprodukt, das durch spontane Dehydratation des
krpereigenen Creatins gebildet wird.
Creatin ist vor allem im Muskelgewebe vorhanden, und zwar als Creatin-P, wo
es als wichtiger Energiespeicher fr die Bildung von ATP dient.
Die Creatininbildungsrate ist annhernd konstant: innerhalb von 24 Stunden
werden 1 bis 2 % des krpereigenen Creatins in Creatinin umgewandelt.
spontan
- H
2
0
NH
CH
3
CH
2
COOH
NH
N H
2
NH
CH
3
CH
2
COOH
NH
O
4
P-NH
N
N
H
NH
O
CH
3
+ ATP/
-ADP
CK
Creatin
Creatinphosphat Creatinin
-PO4
Als Bestimmungsmethoden fr das Creatinin im Serum
stehen die Jaffe-Methode, verschiedene enzymatische
Methoden und die Hochdruckflssigkeitschromatogra-
phie (HPLC) zur Verfgung. In der Routine wird hufig
die relativ unspezifische, aber kostengnstige Jaffe-
Methode eingesetzt, aber auch enzymatische Methoden
wie der Creatinin-PAP-Farbtest (mit Creatininase +
Creatinase + Sarkosinoxidase) werden angewandt.

Richtwerte im Serum:
Mnner: 0,6 1,2 mg/dl (53 - 106 mol/l)
Frauen: 0,5 1,0 mg/dl (44 - 89 mol/l)

Enzymatische Creatininbestimmung
Creatinin ist zur Abschtzung der glomerulren Filtra-
tionsrate (GFR) geeignet, da:

Es frei glomerulr filtriert und
Konstant tubulr rckresorbiert wird.
Es wird tubulr nicht sezerniert!

Es sind also Bildungs- und Eliminationsraten gleich!
Ein Anstieg des Creatinin-Spiegels im Blut spricht fr eine
Verschlechterung der Nierenfunktion!
Problem: Creatinin-blinder Bereich
Creatinin-Konz. im Serum steigt erst an, wenn die
GFR auf 50% oder weniger reduziert ist!
obere Referenzbereichsgrenze
fr Serum-Creatinin
Die Creatinin-Clearance bezeichnet das pro Zeiteinheit durch die Niere von
Creatinin (theoretisch) befreite Plasmavolumen.

Sie wird herangezogen zur Abklrung
eines grenzwertigen oder pathologischen Creatininwertes im Serum
bei pathol. Harnwerten, z. B. pos. Urinsediment bei normalem Creatinin
Erfassung einer mglichen Nierenfunktionsstrung

Diese erlaubt nicht die direkte Messung der GFR, sondern nur eine
Abschtzung deren Grenordnung. Zur klinischen Klrung der folgenden
Fragestellungen ist dies jedoch zumeist ausreichend:

Feststellung einer reduzierten Creatinin-Clearance im sog. Creatinin-
blinden Bereich (60 < GFR < 150 ml/min)
Verlaufsberwachung einer Therapie mit potentiell nephrotoxischen
Medikamenten
Festlegung des Zeitpunktes einer Dialyse (als Grenzwert gilt eine
Creatinin-Clearance von 5 ml/min/1.73 m)
Die Creatinin-Clearance lsst sich folgendermaen bestimmen:
Beginn der 24-h-Urin Sammlung mit dem zweiten Morgenurin.
Mit Sammlung des ersten Morgenurins am zweiten Tag Beendigung der
Urinsammlung. Abnahme einer Serumprobe.
Bestimmung des Urin-Creatinins im 24-h-Sammelurin und des Serum-Creatinins.
Berechnung der Creatinin-Clearance C (ml/min/1.73 m): Dazu mssen neben den
Werten des Creatinins im Serum und im 24-h-Sammelurin auch die Krpergre
und das Krpergewicht des Patienten bekannt sein:


U x U
vol


x 1.73
C (ml/min/1.73 m) =
S x t x KO

U Uvol = S Svol
C Creatinin-Clearance
U Creatininkonzentration im Urin (mg/dl)
Uvol Urinsammelmenge (ml)
S Creatininkonzentration im Serum (mg/dl)
Svol theoretisch von Creatinin gereinigtes
Plasmavolumen
t Sammelzeit (min)
KO Krperoberflche des Patienten
(aus Nomogramm ersichtlich)
1.73 Krperoberflche eines 75 kg schweren
Erwachsenen (m), auf diesen Wert
werden die Referenzwerte bezogen
Adjustierung auf
Sammelzeit
KO Standardmensch
n (Urin) = n (Serum)
Klinisch-chemisch relevante
Stoffwechselprodukte
und Substrate

3. Harnstoff
Harnstoff

Die Begriffe Harnstoff und Harnstoff-N (engl. BUN) werden in der
medizinischen Diagnostik nebeneinander benutzt. Der Harnstoff-N-Gehalt
wird aus dem Harnstoff durch Multiplikation mit dem Faktor 0,46 berechnet.

Harnstoff ist das wichtigste Endprodukt des Protein-Stickstoff-Stoffwechsels.
Die Synthese erfolgt ber den Harnstoffzyklus in der Leber via Ammoniak,
das durch Desaminierung von Aminosuren gebildet wird. Harnstoff wird
hauptschlich ber die Nieren, in geringen Mengen auch ber den Schwei
ausgeschieden und im Darm durch Bakterien abgebaut.
Hhe des Harnstoffspiegels hngt ab von:
Proteinzufuhr
Proteinkatabolismus
Nierenfunktion

Fr die Azotmie (= Harnstofferhhung im Blut) lassen sich drei
grundstzliche Ursachen unterscheiden:
prrenal: verminderte Durchblutung der Niere, z. B. Herzinsuffizienz
Schock, vermindertes Blutvolumen
renal: GFR mind. 50% eingeschrnkt, z. B. chronische Nephritis,
Nephrosklerose, Tubulusnekrose, Glomerulonephritis
postrenal: Harnwegsobstruktion, z. B. Steine, Tumore
Bei starker Proteinaufnahme knnen vorbergehende Erhhungen
auftreten. Bei Lebererkrankungen kommt es zu nicht vorhersagbaren
Konzentrationen.

Referenzbereiche fr Harnstoff im Serum:
Mnner: 23 - 44 mg/dl; Frauen: 10 40 mg/dl; Kinder: bis 45 mg/dl;
Funktionsparameter der Niere, dem Creatinin jedoch
deutlich unterlegen!
Klinisch-chemisch relevante
Stoffwechselprodukte
und Substrate

4. Harnsure
Harnsure

Harnsure ist das wichtigste Endprodukt des Purinstoffwechsels und
einer der Bestandteile der nichtproteinhaltigen Stickstoff-Fraktion im
Plasma.

Der Groteil der Harnsure wird in der Leber aus endogenen oder mit der
Nahrung aufgenommenen Nucleoproteinen gebildet.

Etwa die Hlfte der im Organismus vorhandenen Gesamtharnsure wird
tglich ber den Urin (2/3) ausgeschieden oder im Darmtrakt (1/3)
abgebaut.
Der Harnsurespiegel im Blut wird enzymatisch bestimmt.

Harnsure wird mittels der Uricase oxidativ zu Allantoin und H
2
O
2
umgesetzt.
Diese Reaktion kann bei 293 nm direkt photometrisch verfolgt werden.
Alternativ kann das entstehende H
2
O
2
mit verschiedenen Techniken
(amperometrisch, photometrisch via Farbstoff) erfasst werden.

Uricase
Uricase
Katalase
Aldehyd-DH
Ein erniedrigter Harnsurespiegel wird beobachtet bei
Nierentubulusresorptionsstrungen
Hodgkin-Krankheit
Bronchialkarzinom
schweren Leberzellerkrankungen und
Xanthinurie

Erhhte Harnsurespiegel (Hyperurikmie) sind mit der Gicht
assoziiert:
Gelenkentzndung (v.a. Grozehengrundgelenk) durch
Ausfallen von Harnsurekristallen in der Gelenkflssigkeit.
Referenzwerte Harnsure im Serum:

Mnner: 3,0 7,0 mg/dl
Frauen: 2,5 5,5 mg/dl
Hyperurikmie = Harnsure im Serum > 7,0 mg/dl
Fr die Behandlung der Gicht kommen
neben ditetischen Manahmen
vor allem Medikamente wie
Probenecid in Frage, die die renale
Harnsureausscheidung beschleunigen oder
Substanzen wie Allopurinol, die durch die
Hemmung der Xanthinoxidase die
Harnsuresynthese bremsen.
N
N
N
H
N
O H
OH
OH
N
N
N
H
N
OH
N
N
N
H
N
O H
OH
N
N
OH
N
H
N
N
N
OH
N
H
N
O H
Hypoxanthin
Xanthin
Harnsure
Xanthinoxidase
Xanthinoxidase
Xanthinoxidase
Allopurinol
Oxipurinol
Hemmung der Xanthinoxidase durch das Gichttherapeutikum
Allopurinol fhrt zu einer Erniedrigung der
Harnsurespiegel im Blut