Skript Mikrobiologie 2017

Labor: Mikrobiologie
SS 2017
Dennis Voigt, M.Sc.
Thomas Jäschke, M.Sc.
Wissen durch Praxis stärkt

Labor: Mikrobiologie SS 2017
Inhaltsübersicht
Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................... III
Abbildungsverzeichnis ........................................................................................................ IX
Tabellenverzeichnis ............................................................................................................ XI
Abkürzungs- und Symbolverzeichnis ................................................................................. XII
Vorwort ............................................................................................................................... 1
1 Theoretische Grundlagen zum Praktikum ................................................................... 2
2 Grundlagen des mikrobiologischen Arbeitens .......................................................... 13
3 Versuch 1: Volumenmessung und Aufnahme von Mikroorganismen ...................... 15
4 Versuch 2: Mikroskopie und Darstellung von morphologischen Merkmalen........... 18
5 Versuch 3: Bestimmung der Zellzahl in Populationen einzelliger

Mikroorganismen ...................................................................................................... 21
6 Versuch 4: Morphologische/cytologische Beschreibung und biochemische

Leistungsprüfung von unbekannten Mikroorganismen ............................................ 26
7 Versuch 5: Direktisolierung von fluoreszierenden Pseudomonaden aus

Erdproben .................................................................................................................. 34
8 Versuch 6: Hitzeinaktivierung von Mikroorganismen ............................................... 36
9 Versuch 7: Gravimetrische Bestimmung der Zellmasse ............................................ 39
10 Versuch 8: Aufnahme einer Wachstumskurve von Vibrio natriegens ...................... 44
11 Versuch 9: Bestimmung des Gesamtausbeutekoeffizienten des von

Janthinobacterium lividum produzierten Violaceins ................................................. 50
12 Versuch 10: Agardiffusionstest ................................................................................. 57
Literatur- und Quellenverzeichnis .................................................................................... XIII
Anhang ............................................................................................................................. XIV
Notizen
II
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................... III
Abbildungsverzeichnis ........................................................................................................ IX
Tabellenverzeichnis ............................................................................................................ XI
Abkürzungs- und Symbolverzeichnis ................................................................................. XII
Vorwort ............................................................................................................................... 1
1 Theoretische Grundlagen zum Praktikum ................................................................... 2
1.1 Überblick über die Mikroorganismen..................................................................... 2
1.1.1 Zellstrukturen von pro- und eukaryotischer Zellen ........................................ 2
1.2 Nährmedien ............................................................................................................ 5
1.2.1 Definierte Medien........................................................................................... 7
1.2.2 Komplexe Nährmedien ................................................................................... 7
1.2.3 Universal-, Selektiv- und Differenzierungsnährböden.................................... 7
1.3 Sterilisation ............................................................................................................. 7
1.3.1 Sterilisation durch Hitze.................................................................................. 7
1.3.2 Autoklav .......................................................................................................... 8
1.3.3 Hitzeschrank ................................................................................................... 8
1.3.4 Sterilfiltration .................................................................................................. 8
1.4 Mikroskopie ............................................................................................................ 9
1.5 Parameter zur Fehlerrechnung............................................................................. 11
1.5.1 Mittelwert und Streumaße ........................................................................... 11
1.5.1.1 Fehlerart: Systematischer Fehler .......................................................... 11
1.5.1.1 Fehlerart: Zufallsfehler .......................................................................... 11
2 Grundlagen des mikrobiologischen Arbeitens .......................................................... 13
2.1 Volumenmessgeräte............................................................................................. 13
2.1.1 Mess- und Volumenpipetten ........................................................................ 13
2.1.2 Kolbenhubpipetten ....................................................................................... 14
III
2.1.3 Messzylinder ................................................................................................. 14
2.2 Waagen................................................................................................................. 14
3 Versuch 1: Volumenmessung und Aufnahme von Mikroorganismen ...................... 15
3.1 Teilversuch: Volumenmessung mit Pipetten........................................................ 15
3.1.1 Durchführung ................................................................................................ 15
3.1.2 Auswertung ................................................................................................... 15
3.2 Teilversuch: Volumenmessung mit Bechergläsern und Messzylinder ................. 15
3.2.1 Durchführung ................................................................................................ 15
3.2.2 Auswertung ................................................................................................... 15
3.3 Teilversuch: Isolierung von Keimen aus der Luft.................................................. 16
3.3.1 Durchführung ................................................................................................ 16
3.3.2 Auswertung ................................................................................................... 16
3.4 Teilversuch: Abklatschversuche ........................................................................... 16
3.4.1 Durchführung ................................................................................................ 16
3.4.2 Auswertung ................................................................................................... 16
4 Versuch 2: Mikroskopie und Darstellung von morphologischen Merkmalen........... 18
4.1 Vorbereitung der Zellen ....................................................................................... 18
4.1.1 Native Präparate ........................................................................................... 18
4.1.2 Vorbereitende Hitzefixierung für Färbungen ............................................... 18
4.2 Teilversuch: Einfachfärbung ................................................................................. 18
4.3 Teilversuch: Gramfärbung .................................................................................... 19
4.3.1 Chemikalien .................................................................................................. 19
4.3.2 Durchführung ................................................................................................ 19
4.3.3 Auswertung ................................................................................................... 19
4.4 Teilversuch: Endosporenfärbung.......................................................................... 19
4.4.1 Einführung .................................................................................................... 19
4.4.2 Chemikalien .................................................................................................. 19
IV
4.4.3 Durchführung ................................................................................................ 20
4.4.4 Auswertung ................................................................................................... 20

Mikroorganismen ...................................................................................................... 21
5.1 Einführung ............................................................................................................ 21
5.2 Teilversuche.......................................................................................................... 21
5.2.1 Anlegen einer Verdünnungsreihe ................................................................. 21
5.2.2 Anlegen einer Plattenkultur zur Lebendzellzahlbestimmung....................... 23
5.2.2.1 Auswertung ........................................................................................... 23
5.2.3 Mikroskopische Zellzählung in einer Thoma-Zählkammer ........................... 23
5.3 Auswertung .......................................................................................................... 25
6 Versuch 4: Morphologische/cytologische Beschreibung und biochemische

Leistungsprüfung von unbekannten Mikroorganismen ............................................ 26
6.1 Einführung ............................................................................................................ 26
6.2 Durchführung ....................................................................................................... 27
6.2.1 Morphologische Beschreibung eines Mikroorganismus............................... 27
6.2.2 Cytologische Beschreibung von Mikroorganismen ...................................... 27
6.2.3 Biochemische Leistungsprüfung von Mikroorganismen............................... 28
6.2.3.1 Verwertbarkeit der Kohlenhydrate Glucose, Lactose und

Saccharose ............................................................................................ 28
6.2.3.2 Katalasetest ........................................................................................... 28
6.2.3.3 Citratverwertung ................................................................................... 29
6.2.3.4 Denitrifikation........................................................................................ 30
6.2.3.5 Indolproduktion..................................................................................... 30
6.2.3.6 Oxidasetest ............................................................................................ 31
6.2.3.7 Oxidation-Fermentation-Test ................................................................ 32
V
7 Versuch 5: Direktisolierung von fluoreszierenden Pseudomonaden aus

Erdproben .................................................................................................................. 34
7.1 Einführung ............................................................................................................ 34
7.2 Durchführung ....................................................................................................... 34
7.3 Auswertung .......................................................................................................... 35
8 Versuch 6: Hitzeinaktivierung von Mikroorganismen ............................................... 36
8.1 Einführung ............................................................................................................ 36
8.2 Durchführung ....................................................................................................... 37
8.3 Auswertung .......................................................................................................... 38
9 Versuch 7: Gravimetrische Bestimmung der Zellmasse ............................................ 39
9.1 Einführung ............................................................................................................ 39
9.1.1 Methode: Zentrifugation .............................................................................. 40
9.1.2 Methode: Membranfiltration ....................................................................... 41
9.1.3 Fehlerquellen ................................................................................................ 41
9.2 Durchführung ....................................................................................................... 42
9.2.1 Teilversuch 1: Bestimmung der Biofeuchtmasse mittels Zentrifu-

gation ............................................................................................................ 42
9.2.2 Teilversuch 2: Bestimmung der Biotrockenmasse durch Zentrifu-

gation ............................................................................................................ 43
9.2.3 Teilversuch 3: Bestimmung der Biotrockenmasse durch Membran-

filtration ........................................................................................................ 43
9.3 Auswertung .......................................................................................................... 43
10 Versuch 8: Aufnahme einer Wachstumskurve von Vibrio natriegens ...................... 44
10.1 Einführung ............................................................................................................ 44
10.2 Durchführung ....................................................................................................... 47
10.2.1 Kalibrierung................................................................................................... 47
10.2.2 Aufnahme der Wachstumskurve .................................................................. 48
VI
10.3 Auswertung .......................................................................................................... 48
10.3.1 Erstellung der Kalibrierkurve ........................................................................ 48
10.3.2 Berechnung ................................................................................................... 49
11 Versuch 9: Bestimmung des Gesamtausbeutekoeffizienten des von

Janthinobacterium lividum produzierten Violaceins ................................................. 50
11.1 Einführung ............................................................................................................ 50
11.1.1 Quorum Sensum............................................................................................ 51
11.1.2 Stöchiometrische und Ausbeutekoeffizienten ............................................. 51
11.2 Durchführung ....................................................................................................... 53
11.2.1 Aufarbeitung ................................................................................................. 53
11.2.1.1 Bestimmung der Biotrockenmasse mit 15 ml Falcon-Tubes ................. 53
11.2.1.2 Bestimmung des Extinktionsmaximums................................................ 54
11.3 Auswertung .......................................................................................................... 54
12 Versuch 10: Agardiffusionstest ................................................................................. 57
12.1 Einleitung .............................................................................................................. 57
12.1.1 Antibiotika..................................................................................................... 59
12.1.1.1 ß-Lactam-Antibiotika ............................................................................. 60
12.1.1.1.1 Amoxicillin ...................................................................................... 60
12.2 Durchführung ....................................................................................................... 61
12.2.1 Herstellung des Inokulums ........................................................................... 61
12.2.2 Herstellung des Agars ................................................................................... 61
12.2.3 Beimpfen der Agarplatten ............................................................................ 61
12.2.4 Inkubation ..................................................................................................... 62
12.3 Auswertung .......................................................................................................... 62
Literatur- und Quellenverzeichnis .................................................................................... XIII
Anhang ............................................................................................................................. XIV
UV/VIS-Spektroskopie................................................................................................... XIV
VII
Grundregeln guter mikrobiologischer Technik ............................................................. XVI
Notizen
VIII
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Vergleich pro- und eukaryotische Zelle .................................................. 2
Abbildung 2: Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen ............................. 3
Abbildung 3: Grundformen bakterieller Zellen........................................................... 3
Abbildung 4: Mikroskopische Aufnahme von Stäbchen .............................................. 4
Abbildung 5: Zellverbände von Bakterien.................................................................. 4
Abbildung 6: Formen des Wachstums und der Sporenbildung bei Pilzen ...................... 5
Abbildung 7: Kreislauf des Autoklavenzyklus ............................................................. 8
Abbildung 8: Durchlicht-Hellfeldmikroskop ............................................................... 9
Abbildung 9: Revolver eines Mikroskopes ............................................................... 10
Abbildung 10: Hellfeldmikroskopische und Durchlicht-Hellfeldmikros-
kopische Aufnahmen ....................................................................... 10
Abbildung 11: Schema zum Anlegen einer Verdünnungslösung ................................. 22
Abbildung 12: Thomazählkammer.......................................................................... 24
Abbildung 13: Zählnetz der Thomazählkammer ....................................................... 24
Abbildung 14: Kolonie von Streptomyces spp. ......................................................... 26
Abbildung 15: Kolonien von E. coli auf Blut-Agar...................................................... 26
Abbildung 16: Schwärmverhalten von Proteus spp. auf Blut-Agar .............................. 26
Abbildung 17: Drei Kulturen von Aspergillus fumigatus ............................................ 26
Abbildung 18: Zellformen bei Prokaryoten .............................................................. 27
Abbildung 21: Simmons-Citrat-Agar mit Escherichia coli und Enterobacter
aerogenes ...................................................................................... 29
Abbildung 22: Mögliche Ergebnisse für die Denitrifikation ........................................ 30
Abbildung 23: Mögliche Ergebnisse für die Indolbildung ........................................... 31
Abbildung 24: Mögliche Ergebnisse für den Oxidasenachweis ................................... 32
Abbildung 25: Mögliche Ergebnisse für den OF-Test mit Glucose als Kohlen-
hydrat ............................................................................................ 33
Abbildung 26: Zentrifugieren................................................................................. 40
Abbildung 27: Teilung eines stäbchenförmigen Prokaryoten in zwei
gleiche Tochterzellen ....................................................................... 44
Abbildung 28: Reinkultur von Chromobacterium violaceum ...................................... 51
Abbildung 30: MIK-Bestimmung mittels der Verdünnungs-
methode bzw. des Röhrchenverdünnungstests ................................... 58
IX
Abbildung 31: Prüfung der Wirksamkeit von acht verschiedenen Anti-

biotika gegenüber Bacillus cereus ...................................................... 59
Abbildung 32: Selektivmedium für Streptomyces spp. zur Iden-
tifizierung von Antibiotikabildnern .................................................... 60
Abbildung 33: Strukturformel von Amoxicillin ......................................................... 61
Abbildung 34: Trübungsmessung des mikrobiellen Wachstums .................................XV
X
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Unterschied Pro- und Eukaryoten ...................................................................... 2
Tabelle 2: Gesetze von Liebig (1840) und Shelford (1913) ................................................. 5
Tabelle 3: Makro- und Spurenelemente ............................................................................. 6
Tabelle 4: Daten zur Thomazählkammer .......................................................................... 24
Tabelle 5: D10-Werte von Sporensuspensionen für drei Bacillusarten.............................. 37
Tabelle 6: Inkubationsansatz für die Hitzeinaktivierung von E. coli ................................. 37
Tabelle 7: Größen und Verhältnisse für die Zellzahl- und Zellwachstums-
bestimmung..................................................................................................... 44
Tabelle 8: Schema für die zu beimpfenden Petrischalen .................................................. 61
XI
Abkürzungs- und Symbolverzeichnis

Abkürzung Erklärung
AS Aminosäure
µl Mikroliter
µm Mikrometer
UpM Umdrehungen pro Minute
UV Ultraviolett
UV/VIS Ultraviolett/Visuell
VE-Wasser Vollentsalztes Wasser
XII
Vorwort
Zu dem aktuellen Skript Mikrobiologie SS 2017 gehört eine sogenannte Laborrichtlinie

(Stand: SS 2017), in der Sie alles zu den Themen Organisatorisches, die Bewertung der
erbrachten Leistung oder die Erstellung von Laborprotokollen nachlesen können. Diese
Richtlinie wird vor jedem Semester überprüft und ggf. angepasst.
Das vorliegende Skript soll Ihnen als Hilfestellung dienen und zwar nicht nur um die Ver-
suche bearbeiten zu können, sondern auch um Ihnen einen Teil der Theorie zu vermit-
teln. Oft ist es ratsam, neben dem Skript auch andere Literatur zu verwenden, beson-
ders im Hinblick auf die Protokollerstellung.
Bei Fragen stehen wir Ihnen gerne zur Verfügung.
Wir wünschen Ihnen neben der Arbeit im Labor natürlich auch viel Spaß!
1
1 Theoretische Grundlagen zum Praktikum
1.1 Überblick über die Mikroorganismen
1.1.1 Zellstrukturen von pro- und eukaryotischer Zellen

Aufgrund ihres feinstrukturellen Aufbaus lassen sich zwei Zelltypen unterscheiden: Pro-
karyoten und Eukaryoten. Prokaryotische Zellen sind zunächst kleiner als Eukaryoten,
nämlich 0,2 - 0,5 µm. Hingegen liegt die Größe der eukaryotischen Zellen zwischen 3 - 50
µm. Einige weitere Merkmale bzw. Unterschiede sind in der folgenden Tabelle aufge-
führt (vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006, S. 8):
Tabelle 1: Unterschied Pro- und Eukaryoten: Auflistung einiger Merkmale zur Unterscheidung zwischen Pro-
und Eukaryoten (vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006, S. 8).
Prokaryoten Eukaryoten
Zellkern Nein ja, membranumschlossen
DNA frei im Cytoplasma (Nucleoid) im Zellkern
Mitochondrien, Endoplasmti-
Organellen (Auszug) nur: Ribosomen sches Retikulum, Ribosomen
Golgi-Apparat
Weitere Zellstrukturen, die an dieser Stelle aber nicht weiter behandelt werden sollen
sind die Phagen und Viren.
Abbildung 1: Vergleich pro- und eukaryotische Zelle: Die prokaryotische Zelle (a) ist kleiner und es fehlen die
Kernmembran sowie weitere Organellen der eukaryotischen Zelle (b) (vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006, S. 8).
2
Abbildung 2: Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen: Links: Aufnahme einer grampositiven

Bakterienzelle, ohne äußere Membran, in der sich die Strukturen aus Abb. 1.13 wiedererkennen lassen (x
10.000). Rechts: Aufnahme eines weißen Blutkörperchens als Vergleich zur schematischen Darstellung in
Abb. 1.13. Der tierischen Zelle fehlen die Zellwand pflanzlicher und pilzlicher Zellen sowie die Chloroplasten
der Pflanzen (vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006, S. 8).
Mikroorganismen können mikroskopisch betrachtet sehr unterschiedliche Zellformen

aufweisen. Auch hier gibt es grundsätzlich zwei unterscheidbare Gruppen, nämlich die
Kokken und Stäbchen. Zwischen diesen beiden Großgruppen gibt es weitere Abwand-
lungen, wie zum Beispiel die kurzen Stäbchen, die mit Kokken verwechselt werden kön-
nen, oder die gebogenen oder gewundenen Stäbchen. Einige weitere Formen zeigt die
folgende Abbildung (vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006, S. 15):
Abbildung 3: Grundformen bakterieller Zellen. Die nicht maßstabsgerechten Zeichnungen sollen hier aus-
schließlich die unterschiedlichen Formen aufzeigen (vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006, S. 15).
Die Abbildung 4 zeigt wie Stäbchen im mikroskopischen Bild aussehen können.
3
Abbildung 4: Mikroskopische Aufnahme von Stäbchen: Links: Escherichia coli hat die Form eines kurzen
Stäbchens (x 2.500). Rechts: Bacillus cereus bildet ebenfalls stäbchenförmige Zellen, die aber länger sind als
jene von E. coli (x 2.500) (vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006, S. 15).
Neben den einzelnen vorliegenden Zellformen sind ebenfalls die sogenannten Zellver-
bände von Bedeutung. Zellverbände entstehen durch die bekannte Zellteilung, die hier
nicht weiter erklärt werden soll. Wie bei den Zellformen können auch die Zellverbände
sehr unterschiedlich auftreten, was die Abbildung 5 verdeutlichen soll (vgl. ALEXANDER u.
STRETE, 2006, S. 17).
Abbildung 5: Zellverbände von Bakterien, die sich nach der Teilung nicht sofort und vollständig voneinander
lösen (vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006, S. 17).
Eine weitere große Gruppe von Mikroorganismen wird von den Pilzen eingenommen.
Hier können Unterschiede bezüglich der Wuchsform und des Sporentypen gemacht
werden (vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006, S. 22).
4
Abbildung 6: Formen des Wachstums und der Sporenbildung bei Pilzen (vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006, S. 22).
1.2 Nährmedien
Die Kultivierung von Mikroorganismen kann nur dann gelingen, wenn die Rahmenbedin-
gungen stimmen. Daher müssen für jeden Mikroorganismus bestimmte chemische und
physikalische Voraussetzungen beachtet werden. Von besonderer Bedeutung sind dabei
die Nährstoffansprüche, weil von ihnen abhängig ist, ob der Mikroorganismus Zellsub-
stanz aufbauen und genügend Energie bereitstellen kann. Allerdings gibt es in diesem
Zusammenhang ein bestimmtes Konzentrationsfenster, in dem sich die einzelnen Nähr-
stoffbestandteile bewegen sollten, was die Gesetzmäßigkeiten nach Liebig (1840) und
Shelford (1913) hinreichend beschreiben (vgl. STEINBÜCHEL u. OPPERMANN-SANIO, 2003, S.
6):
Tabelle 2: Gesetze von Liebig (1840) und Shelford (1913) (vgl. STEINBÜCHEL u. OPPERMANN-SANIO, 2003, S. 6).
Gesetz des Minimums nach Liebig (1840) Gesetz der Toleranz nach Shelford (1913)
„Der Gehalt der Biomasse eines jeden Or- „Jeder Organismus benötigt in einem ge-
ganismus wird begrenzt durch denjenigen gebenen Ökosystem einen kompletten
Nährstoff, der im Vergleich zu den Nähr- Satz von Bedingungen zum Überleben und
stoffansprüchen am Standort in der nied- zum Wachstum. Jede Bedingung muss im
rigsten Konzentration vorhanden ist.“ (vgl. Toleranzbereich des jeweiligen Organis-
STEINBÜCHEL u. OPPERMANN-SANIO, 2003, S. mus liegen.“ (vgl. STEINBÜCHEL u. OPPER-
6). MANN-SANIO, 2003, S. 6).
Weiter muss nach Makro- und Spurenelementen unterschieden werden. Einige wichtige
Makroelemente sind Kohlenstoff (C), Wasserstoff (H), Magnesium (Mg), Sauerstoff (O)
oder Stickstoff (N). Spurenelemente sind z. B. Chlor (Cl), Kupfer (Cu) oder Selen (Se). Die
5
folgende Tabelle zeigt alle Makroelemente, die von allen Mikroorganismen benötigt
werden. Die genannten Spurenelemente werden nicht von allen Organismen benötigt
und sind oftmals Bestandteile von Coenzymen und/oder Enzymen (vgl. STEINBÜCHEL u.
OPPERMANN-SANIO, 2003, S. 7):
Tabelle 3: Makro- und Spurenelemente (vgl. STEINBÜCHEL u. OPPERMANN-SANIO, 2003, S. 7).

Makroelemente Spurenelemente
Element Zeichen Element Zeichen
Kohlenstoff C Silber Ag
Calcium Ca Bor B
Eisen Fe Cadmium Cd
Wasserstoff H Chlor Cl
Kalium K Kobalt Co
Magnesium Mg Chrom Cr
Stickstoff N Kupfer Cu
Natrium Na Quecksilber Hg
Sauerstoff O Mangan Mn
Phosphor P Molybdän Mo
Schwefel S Nickel Ni
Selen Se
Vanadium V
Wolfram W
Zink Zn
Grundsätzlich ist immer der Stoffwechsel bzw. der Stoffwechseltyp des Mikroorganis-
mus zu betrachten, damit entschieden werden kann, ob und welche Spurenelemente
dem Medium zugesetzt werden müssen. Dies gilt sowohl für die Kultivierung im Labor
wie auch für die Anreicherung von Mikroorganismen aus der Natur (vgl. STEINBÜCHEL u.
OPPERMANN-SANIO, 2003, S. 7). Für die Kultivierung von Mikroorganismen können grund-
sätzlich zwei Formen von Nährmedien eingesetzt werden: feste und flüssige Medien. Die
festen Medien unterscheiden sich von den flüssigen Medien durch die Zugabe eines
Verfestigungsstoffes. Hierfür können entweder Agar-Agar oder Gelatine eingesetzt wer-
den. Von Vorteil ist hier Agar-Agar, da dieser Stoff im Gegensatz zur Gelatine nicht wie-
der so leicht flüssig wird. Für die Gelatine genügen bereits 28 °C, um diese wieder zu
verflüssigen.
Für die Kultivierung von Mikroorganismen werden also entsprechende Nährmedien

benötigt, die alle für den Mikroorganismus notwendigen Substanzen enthalten müssen.
Wie Sie wissen, können diese Nährmedien fest (Agarplatten) oder flüssig sein. Außer-
dem gibt es Unterschiede bezüglich ihrer Zusammensetzung, wodurch sie in zwei Arten
von Nährmedien unterschieden werden.
6
1.2.1 Definierte Medien

Hierfür werden genaue Mengen hochreiner anorganischer oder organischer Substanzen
zu destilliertem Wasser hinzugegeben. Die genaue chemische Zusammensetzung dieser
Medien ist somit bekannt. Besonders die Kohlenstoffquelle ist von Bedeutung, da Mik-
roorganismen diese benötigen, um Zellmasse aufbauen zu können. Aber auch andere
chemische Elemente sind wichtig und müssen vor der Kultivierung bekannt sein (vgl.
MADIGAN, MARTINKO, STAHL u. CLARK, 2013, S. 121f.).
1.2.2 Komplexe Nährmedien

Bezüglich der bekannten Zusammensetzung sind die komplexen Medien genau das Ge-
genteil. Hier sind auch Abbauprodukte von tierischen und pflanzlichen Produkten, wie
Casein (Milcheiweiß), Rindfleisch (Rindfleischextrakt), Hefezellen (Hefeextrakt) etc. ent-
halten. Der Nachteil dieser Medienart ist also deren nicht bekannte chemische Zusam-
mensetzung. Die komplexen Medien bilden oftmals die Basis für die sogenannten ange-
reicherten Medien, die für die Anzüchtung schwer zu kultivierender Mikroorganismen
verwendet werden (vgl. MADIGAN, MARTINKO, STAHL u. CLARK, 2013, S. 123).
1.2.3 Universal-, Selektiv- und Differenzierungsnährböden

Die Universalnährböden sind für eine Vielzahl von Mikroorganismen geeignet und sind
den komplexen Nährmedien zuzuordnen. Das Gegenstück zu den Universalnährböden
sind die Selektivnährböden, die nur für einen bestimmten Mikroorganismus geeignet
sind und letztlich alle anderen Mikroorganismen unterdrücken bzw. am Wachstum hin-
dern. Die Differenzierungsnährböden machen durch die Zugabe eines bestimmten Indi-
kators, wie z. B. Bromthymolblau, eine bestimmte Stoffwechselleistung (z. B. Abbau von
Kohlenhydrate) sichtbar.
1.3 Sterilisation
Die Sterilisation spielt in der Mikrobiologie eine essentielle Rolle. Sterilisationsmethoden
gewährleisten sterile Nährmedien zur Anzüchtung reiner mikrobiologischer Kulturen
oder deaktivieren mikrobiologische Abfälle. Für die Sterilisation stehen verschiedene
Methoden zur Verfügung, die sich in ihrem Ablauf oder dem apparativen Aufwand z. T.
stark unterscheiden können. Die wichtigsten Methoden sollen hier kurz vorgestellt wer-
den.
1.3.1 Sterilisation durch Hitze

Die Sterilisation über Hitze ist die häufigste Methode zur Kontrolle des mikrobiellen
Wachstums. Hierfür gibt es zwei bestimmende Faktoren, die sich auf die Empfindlichkeit
der Mikroorganismen auswirken. Zum einen ist das die Temperatur zum anderen die
Dauer. Aber auch die Art der Hitze (feuchte oder trockene Hitze) bestimmt die Sterilisa-
tion (vgl. MADIGAN, MARTINKO, STAHL u. CLARK, 2013, S. 1108).
7
1.3.2 Autoklav
Der Autoklav ist ein Gerät, mit dem Dampf unter Druck gesetzt wird. Grundsätzlich muss
beachtet werden, was behandelt werden soll. So ist z. B. eine andere Einstellung zu wäh-
len, wenn Endosporen abgetötet werden sollen. Diese bedürfen eine längere Dauer
sowie eine höhere Temperatur. Die Temperatur zur Zeit der Sterilisation, also nach dem
Aufheizen und vor dem Abkühlen beträgt für normale Anwendungen bei 1 bar 121 °C
und wird für einen Zeitraum von 10 - 15 min konstant gehalten. Je nachdem was für ein
Objekt autoklaviert werden soll, muss dementsprechend die Einstellung angepasst wer-
den, damit die Hitze bis zum Kern des Objektes vordringen kann. Dies gilt auch, wenn
Flüssigkeiten autoklaviert werden sollen (vgl. MADIGAN, MARTINKO, STAHL u. CLARK, 2013, S.
1110). Das Prinzip des Autoklavierens zeigt die folgende Abbildung:
Abbildung 7: Kreislauf des Autoklavenzyklus (vgl. MADIGAN, MARTINKO, STAHL u. CLARK, 2013, S. 1111).
1.3.3 Hitzeschrank
Ein Hitzeschrank arbeitet mit trockener Hitze und eignet sich für Geräte aus Glas wie
Pipetten, Kulturkolben, Messzylinder, Trichter etc.. Außerdem können hier auch Geräte
aus Metall oder Porzellan sterilisiert werden. Grundsätzlich muss darauf geachtet wer-
den, wofür die Geräte verwendet werden sollen. Trichter oder Porzellanschalen müssen
evtl. mit Alufolie eingepackt werden. Messzylinder oder Kulturkolben müssen ebenfalls
abgedichtet oder verschlossen werden.
1.3.4 Sterilfiltration
Die Sterilfiltration ist vermutlich die einfachste Form der Sterilisation. Hierfür werden
bestimmt Filter (Membranfilter oder Spritzenfilter) verwendet, mit deren Hilfe empfind-
liche Lösungen oder Zusätze wie Vitaminlösungen sterilisiert werden können. Zunächst
wird die zu sterilisierende Lösung mit einer Spritze aufgezogen. Anschließend wird der
Spritzenfilter aufgesteckt und die Lösung vorsichtig hindurchgedrückt.
8
1.4 Mikroskopie
Für die Sichtbarmachung von Mikroorganismen ist aufgrund der Größe ein Mikroskop
notwendig. Neben der hier behandelten Durchlicht-Hellfeldmikroskopie gibt es noch
spezielle Verfahren, wie die Fluoreszenzmikroskopie oder die Raster- und Transmissi-
onselektronenmikroskopie. In diesem Praktikum wollen wir das Augenmerk auf die
Durchlicht-Hellfeldmikroskopie legen. Mit Hilfe der Mikroskopie können Merkmale wie
Größe, Form und Beweglichkeit von Mikroorganismen untersucht werden. Außerdem
können spezielle Merkmale wie z. B. Sporen oder Geißeln untersucht werden. Stan-
dardmäßig stehen dafür drei Vergrößerungen zur Verfügung (vgl. ALEXANDER u. STRETE,
2006, S. 2):
Okular 10-fach ∙ Objektiv 4-fach 40-fache Vergrößerung

Den Aufbau eines Mikroskopes und im Speziellen des sogenannte Revolvers zeigen die
Abbildungen 8 und 9. Denkbar sind neben dem gezeigten Aufbau noch spezielle Anbau-
teile, wie z. B. eine Kamera oder ein Touchscreen zwecks Dokumentation.
Abbildung 8: Durchlicht-Hellfeldmikroskop (vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006, S. 3).
9
Abbildung 9: Revolver eines Mikroskopes: Einsatz des 100fachen Ölimmersionsobjektivs bei der Untersu-
chung von Bakterien, Hefen und kleinen Protozoen. Das Objektiv wird in den Öltropfen getaucht, der zuvor
auf das Deckglas getropft wurde (vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006, S. 3).
Für die Mikroskopie sollten einige Hinweise berücksichtigt werden:
• Zunächst sollte immer erst mit der kleinsten Vergrößerung begonnen werden, um
die Schärfeebene einstellen zu können.
• Wichtig ist die Berücksichtigung des zu untersuchenden Objektes:
o Für filamentöse Pilze oder Protozoen wird maximal die 40-fache Vergröße-
rung empfohlen.
o Für Bakterien, Hefen oder kleinere Protozoen ist die 100-fache Vergröße-
rung geeignet.
o Es sollte bei der Anfertigung des Objektes darauf geachtet werden, dass
dieses nicht zu dick ist, da sich sonst die Zellmerkmale nicht optimal unter-
suchen lassen. Ratsam ist es immer an den Stellen zu mikroskopieren, an
denen die Zellen möglichst vereinzelt vorliegen. Dies ist meistens an den
Rändern der Fall.
Abbildung 10: Hellfeldmikroskopische und Durchlicht-Hellfeldmikroskopische Aufnahmen: Links: Hellfeld-

mikroskopische Aufnahme von angefärbten Bacillus-Zellen als Beispiel für Bakterien. Die einzelnen Zellen
sind so klein, dass für die Untersuchung ein 100-faches Ölimmersionsobjektiv benötigt wird. Rechts: Durch-
licht-Hellfeldmikroskop-Aufnahme von Hefezellen als Beispiel für pilzliche Zellen. Für die Untersuchung wird
ein 100faches Ölimmersionsobjektiv benötigt (x 2.400) (vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006, S. 4).
10
1.5 Parameter zur Fehlerrechnung
1.5.1 Mittelwert und Streumaße

Das Messen einer Größe, wie z. B. einer Masse, eines Volumens oder einer Extinktion,
liefert zunächst eine Vielzahl von Werten, je nachdem, wie oft gemessen wird. Oftmals
wird dann ein Mittelwert gebildet, um einen besseren Eindruck zu bekommen. Dieser
Wert ist jedoch niemals ein exakter wahrer Wert, da hier zwei Fehlerarten zum Tragen
kommen können:
1.5.1.1 Fehlerart: Systematischer Fehler

Die systematischen Fehler bleiben während einer Messung immer gleich. Als Beispiel sei
hier das wiederholte falsche Ablesen einer Pipette zu nennen. Dadurch wird die Richtig-
keit der Messung beeinflusst. Diese Fehler können aber durch eine richtige Versuchspla-
nung und –durchführung vermieden werden. Die Kenntnis dieser Fehler macht deren
Vermeidung einfach. So kann z. B. durch eine Eichung ein systematischer Fehler vermie-
den werden.
1.5.1.1 Fehlerart: Zufallsfehler

Die sogenannten Zufallsfehler lassen sich nicht vollständig vermeiden und treten statis-
tisch verteilt auf. Häufig folgt die Verteilung dieser Fehler einer Gauß’schen Fehlervertei-
lung, was deren mathematische Erfassung erfordert. Letztlich verändern die Zufallsfeh-
ler die Präzision einer Messreihe.
Damit Zufallsfehler einen weniger starken Einfluss auf die Messung haben, wird die An-
zahl der Messdurchgänge entsprechend erhöht. Daher wird für die Näherung an den
wahren Wert x der arithmetische Mittelwert gebildet:
1
̅
x = wahrer Wert
̅ = Mittelwert der Messwerte
N = Anzahl der gemittelten Messwerte
xi = einzelner Messwert der in den Mittelwert eingeht
In diesem Beispiel wurden die SI-Einheiten der Messwert, des Mittelwertes und des
wahren Wertes in g für die Masse oder in ml für das Volumen angegeben. Natürlich
können auch andere SI-Einheiten vorkommen.
Die zufallsbedingte Streuung der Messwerte wird mit der sogenannten empirischen Va-
rianz berechnet:
1
̅
1
11
= empirische Varianz
N = Anzahl der gemittelten Messwerte
xi = einzelner Messwert der in den Mittelwert eingeht
Das Maß für die Streuung der Werte xi um den Wert x ergibt sich aus der empirischen
Standardabweichung sx:
sx = Standardabweichung
= empirische Varianz
Die Ergebnisse aus der Messung werden dann in der Form ̅ angegeben. Außer-
dem sollte auch immer die Anzahl der Messungen (N) mit angegeben werden. Einzelne
Extremwerte (sog. Ausreißer) beeinflussen stark den Mittelwert sowie die Standardab-
weichung. Die Berechnung der Messergebnisse erfordert immer alle Dezimalstellen,
sollte allerdings im Anschluss immer auf eine sinnvolle Stelle gerundet werden.
Manchmal kann es sinnvoll sein, den Fehler relativ zum Messergebnis und in Prozent
anzugeben. Der sogenannte relative Fehler, der auch als relative Standardabweichung
bezeichnet werden kann, ist wie folgt definiert:
, ! 100 % ∙
̅
sx = Standardabweichung
12
2 Grundlagen des mikrobiologischen Arbeitens

Für das Arbeiten in einem Labor, gleich ob es sich um ein Mikrobiologielabor oder um
ein Chemielabor handelt, gelten einige Grundlagen im Hinblick auf den richtigen Um-
gang mit den Laborgeräten. Daher lernen Sie zunächst den richtigen Umgang mit fol-
genden Laborgeräten:
• Mess- und Vollpipetten (Glaspipetten)

• Kolbenhubpipetten (z. B. Eppendorfpipetten)
• Messzylinder und Bechergläser
• Waagen
Anmerkung: Berücksichtigen Sie bitte das Erlernte auch für die nachfolgenden Labore
des Studiums!
Außerdem lernen Sie im ersten Versuch feste Nährböden und eine bestimmte Anwen-
dung kennen.
2.1 Volumenmessgeräte
2.1.1 Mess- und Volumenpipetten

Mess- und Volumenpipetten sind in einem Mikrobiologielabor ein grundlegendes Werk-
zeug, da mit ihnen Lösungen entnommen oder zugegeben werden. In diesem Labor
kommt der Faktor Sterilität hinzu. Da sie mit Mikroorganismen arbeiten und Ziel das
Erhalten bzw. Erreichen einer Reinkultur ist, müssen natürlich nicht nur die Medien steril
sein sondern auch die verwendeten Pipetten. Je nachdem mit welcher Pipette gearbei-
tet wird, werden sterile Glaspipetten oder sterile Kunststoffspitzen benötigt. Entschei-
dend ist zudem, welches Volumen übertragen werden soll. Messpipetten eignen sich für
die Übertragung von 1 ml, 2 ml, 5 ml und 10 ml. Vollpipetten sind nur für ein bestimmtes
Volumen geeignet, da sie im Gegensatz zu den Messpipetten keine Skalierung haben.
Der Vorteil einer Vollpipette ist die höhere Genauigkeit ab einem Volumen von 5 ml.
Wenn Sie sich die Pipetten einmal genauer ansehen, erkennen Sie den Schriftzug Ex + 15
s. Das bedeutet, dass die Pipetten auf das Auslaufen geeicht sind. Nach dem Auslaufen
muss also eine Wartezeit von 15 s eingehalten werden, damit das vollständige Auslaufen
gewährleistet ist. Der Teil der dann noch in der Pipette verbleibt, gehört nicht zum
Messvolumen!
Weiter zu beachten sind die Toleranzgrenzen die abhängig von der Einord-
nung/Einteilung nach ISO, DIN und der Eichordnung sind. Auch die entsprechenden War-
tezeiten unterscheiden sich je nachdem welche Einordnung vorgenommen wurde.
13
2.1.2 Kolbenhubpipetten
Kolbenhubpipetten, im Laborjargon auch als Eppendorfpipetten bezeichnet, eigenen
sich ebenfalls um Lösungen abzunehmen oder zu übertragen. Hierfür gibt es im Labor
drei Pipetten, die bestimmte Volumina aufnehmen können:
• grau (1 - 10 µl)
• gelb (10 - 100 µl)
• blau (100 - 1000 µl)
Vor der Verwendung der Pipetten sollte überlegt werden, welches Volumen aufgenom-
men werden soll. Prinzipiell können die gelbe und die blaue Pipette 100 µl aufnehmen,
jedoch ist dafür die gelbe Pipette geeigneter, weil sich das Volumen an der oberen
Grenze des einstellbaren Volumens befindet. Die Genauigkeit ist daher höher als bei der
blauen Pipette, denn die 100 µl liegen an der unteren Einstellgrenze.
Anmerkung: Achten Sie bitte darauf, dass die (Eppendorf-)Pipetten nicht überdreht
werden! Es gibt für jeden Pipettentypen einen Minimal- und einen Maximalwert!
Auch die Eppendorfpipetten haben bestimmte Toleranzgrenzen. Bei Volumen ≤ 0,1 ml

sollten Kolbenhubpipetten verwendet werden, da sie an dieser Stelle genauer sind (To-
leranz ± 0,8 - 0,5 % bei einem Nennvolumen von ≥ 20 µl).
2.1.3 Messzylinder
Messzylinder sind zum Abmessen von Proben- oder Verdünnungslösungen und in sehr
unterschiedlichen Größen verfügbar. Für Volumen < 10 ml werden normalerweise
Messpipetten verwendet. Wie bei den Pipetten gibt es auch hier unterschiedliche Klas-
sen und Genauigkeiten.
Anmerkung: Im Übrigen sind Bechergläser, auch wenn sie eine Skala haben, nicht genau
und daher für das Abmessen eines definierten Volumens nicht geeignet!
2.2 Waagen
Im Labor lernen Sie zwei unterschiedliche Waagen kennen, nämlich die Oberschalen-
waage und die Analysenwaage. Die Oberschalen- oder Präzisionswaage eignet sich für
das Abwiegen größerer Massen und Mengen von Chemikalien und ist nicht so genau wie
die Analysenwaage. Die Analysewaage sollte nur für sehr kleine Einwaagen verwendet
werden. Grundsätzlich können die Wägegenauigkeiten von Waagen sehr variieren.
14
3 Versuch 1: Volumenmessung und Aufnahme von Mikroorganis-

men
3.1 Teilversuch: Volumenmessung mit Pipetten

Der Versuch wird mit den folgenden Pipetten durchgeführt:
1 ml Messpipette Analysenwaage
10 ml Messpipette Präzisionswaage
10 ml Vollpipette Präzisionswaage
0,1 ml Kolbenhubpipette Analysenwaage
1,0 ml Kolbenhubpipette Analysenwaage
3.1.1 Durchführung
• 50 ml Becherglas auf die Waage stellen und die Tarataste drücken.
• Mit der Pipette das maximale Volumen VE-Wasser aufziehen und in das Becher-
glas pipettieren.
• Nach dem Stilstand der Anzeige das Gewicht notieren.
• Die Messung fünfmal wiederholen.
3.1.2 Auswertung
Berechnen Sie für jede Messreihe den Mittelwert und die Standardabweichung sowie
den relativen Fehler. Die Ergebnisse werden anschließend bezüglich der Genauigkeit der
einzelnen Pipetten diskutiert. Bewerten Sie außerdem Ihre Arbeitsweise.
3.2 Teilversuch: Volumenmessung mit Bechergläsern und Messzylinder

Die Genauigkeit eines Becherglases wird mit einem Messzylinder überprüft.
3.2.1 Durchführung
• Ein 150 ml Becherglas wird mit VE-Wasser bis zur Marke:
20 ml
40 ml
60 ml
80 ml
100 ml befüllt
• Der Inhalt wird in den Messzylinder überführt und das Volumen abgelesen.
3.2.2 Auswertung
Tragen Sie die Sollwerte (x-Achse) und Istwerte (y-Achse) in einem Diagramm auf und
bestimmen Sie mit EXCEL eine Ausgleichsgerade (Trendlinie linear). Bewerten Sie die
Ergebnisse bezüglich der Genauigkeit des Becherglases.
15
3.3 Teilversuch: Isolierung von Keimen aus der Luft

Das Spektrum von Mikroorganismen soll mit Hilfe von Nähr- und Malzextraktagarplatten
abgebildet werden.
Anmerkung: Beschriftung von verwendeten Agarplatten: Beschriften Sie alle verwende-

ten Agarplatten mit der Gruppennummer, Datum, Name des Mikro-organismus (wenn
bekannt), Nährbodentyp (NA = Nähragar, MA = Malzextraktagar). Die Platten werden
immer entlang des Plattenrandes beschriftet.
Anmerkung: Beachten Sie bitte, dass alle nicht oder unzureichend beschrifteten Platten,
Gefäße etc. vom Laborpersonal entsorgt werden!
3.3.1 Durchführung
• Die bereitgestellten Nährböden öffnen
• Nach Ablauf der Versuchsdauer von 10 min, 30 min und 60 min werden die Plat-
ten wieder bedeckt und beschriftet.
• Die Agarplatten werden zunächst bei Ihnen gesammelt und nach Beendigung des
Versuches für drei Tage bei 30 °C im Brutschrank inkubiert.
3.3.2 Auswertung
Die Kolonien werden ausgezählt und kurz beschrieben.
3.4 Teilversuch: Abklatschversuche

Mit Hilfe von drei Nähragarplatten wird der Einfluss von Handwaschseife und Händedes-
infektionsmittel (Sterilium) auf die Hautflora abgebildet.
3.4.1 Durchführung
• Legen Sie die ungewaschenen drei Finger Ihrer Hand leicht auf die Nähragarplatte.
• Verschließen Sie die Platte wieder und beschriften Sie diese deutlich.
• Waschen Sie sich die Hände und lassen Sie diese lufttrocknen.
• Wiederholen Sie die Schritte von oben mit einer frischen Nähragarplatte.
• Desinfizieren Sie die Hände und wiederholen Sie die Schritte.
• Inkubieren Sie die Platten für 3 Tage bei 30 °C.
3.4.2 Auswertung
Zählen Sie die Kolonien auf den Platten aus und beurteilen Sie ihre Ergebnisse.
Anmerkung: Bei der Prüfung der Agarplatten kann es auffallen, dass Kolonien ineinan-
der wachsen und sich dadurch ein sogenannter Koinzidenzfehler ausbildet. Dem kann
aber entgegengewirkt werden, wenn die Agarplatten während der Inkubationsphase
16
kontrolliert werden. Selbst wenn die Kolonien noch sehr klein sein sollten, können diese
mit Hilfe einer Lupe oder eines Stereomikroskopes ausgezählt werden. Die optimale
Anzahl an Kolonien liegt zwischen 100 – 200 pro Agarplatte. Durchsichtige Kolonien kann
man gut durch eine Kontrastierung sichtbar machen. Dazu wird die Agarplatte auf eine
dunkle Oberfläche gelegt. Die ausgezählten Kolonien können mit einem Stift markiert
werden.
17
4 Versuch 2: Mikroskopie und Darstellung von morphologischen

Merkmalen
4.1 Vorbereitung der Zellen

Bevor Sie mit den Versuchen beginnen können, müssen Sie sich ein Objekt herstellen.
Sie sollten berücksichtigen, was Sie mikroskopieren wollen: native Präparate oder Fär-
bungen. Hierfür unterscheiden sich die Präparate bzw. deren Herstellung.
4.1.1 Native Präparate

• Geben Sie auf den Objektträger einen kleinen Tropfen Wasser.
• Entnehmen Sie von der Agarplatte ein wenig Bakterienmaterial (es genügt dafür
mit der Impföse einmal kurz in die Kolonie zu gehen, nicht abkratzen!).
• Verreiben Sie vorsichtig den Tropfen mit der Bakterienmasse bis sich eine gleich-
mäßige Suspension eingestellt hat.
• Legen Sie ein Deckgläschen auf den Objektträger und mikroskopieren Sie diesen.
4.1.2 Vorbereitende Hitzefixierung für Färbungen

• Gehen Sie zunächst wie oben vor (Schritt 1 - 3).
• Lassen Sie die Suspension zunächst lufttrocknen.
• Ziehen Sie den Objektträger anschließend dreimal durch die Bunsenbrennerflam-
me.
• Danach den Objektträger drehen und nochmals durch die Flamme ziehen.
Anmerkung: Die Mikroorganismen sollen nur fixiert und nicht verbrannt werden!
• Anschließend können Sie das hitzefixierte Präparat färben.
4.2 Teilversuch: Einfachfärbung

• Stellen Sie sich ein hitzefixiertes Objekt her und tropfen Sie anschließend einen
Tropfen Kristallviolett auf die Zellen.
• Lassen Sie den Farbstoff etwa 5 s einwirken und spülen ihn anschließend wieder
mit Wasser ab.
• Nach dem Trocknen kann der Objektträger mikroskopiert werden. Zeichnen Sie
bitte, was Sie unter dem Mikroskop erkennen.
18
4.3 Teilversuch: Gramfärbung

Anmerkung: Für das Gelingen der Gramfärbung wird die genaue Einhaltung der Ver-
suchsvorschrift empfohlen. Insbesondere die Differenzierung ist ein kritischer Arbeits-
schritt!
4.3.1 Chemikalien
Lösung A: Karbol-Gentianaviolett-Lösung
Lösung B: Lugolsche Lösung [Jod-Kaliumjodid-Lösung]
Lösung C: 96 % Ethanol
Lösung D: Safranin-Lösung
4.3.2 Durchführung
• Stellen Sie sich ein hitzefixiertes Objekt her.
• Bedecken Sie das Präparat komplett mit der Lösung A (Einwirkzeit: 3 min).
• Gießen Sie die Lösung A ab und bedecken Sie die Zellen mit Lösung B (Einwirkzeit:
sofort wieder abgießen).
• Erneut mit Lösung B bedecken (Einwirkzeit: 1 min).
• Anschließend langsam die Lösung C mittels einer 10 ml Pipette über den Objekt-
träger laufen lassen (Einwirkzeit: < 1 min). Die Differenzierung muss sofort durch
gründliches Spülen mit Wasser beendet werden.
• Nach der Differenzierung erfolgt die Gegenfärbung mit der Lösung D (Einwirkzeit:
30 - 60 s).
• Das Präparat wird mit Wasser gespült und luftgetrocknet. Wischen Sie die Unter-
seite des Objekträgers mit Zellstoff sauber.
4.3.3 Auswertung
Mikroskopieren Sie das Präparat ohne Deckgläschen mit einem Tropfen Immersionsöl.
Beurteilen Sie die Färbung und entscheiden Sie ob die Zellen gram positiv oder gram
negativ sind.
4.4 Teilversuch: Endosporenfärbung
4.4.1 Einführung
4.4.2 Chemikalien
Lösung E: Malachitgrün-Lösung
Lösung D: Safranin-Lösung
19
4.4.3 Durchführung
• Stellen Sie sich ein hitzefixiertes Objekt her.
• Vorbereiten der Färbelösung: Bereiten Sie sich die Lösung E wie folgt vor:
o Eine Färbeküvette wird auf Glasperlen in einem Becherglas gestellt.
o Die Küvette wird mit der Lösung E bis ca. 2 cm unter den Rand befüllt.
o Legen Sie einen Deckel auf.
o Das Becherglas wird mit VE-Wasser gefüllt, die Küvette soll zu ¾ im Wasser
stehen.
o Das Wasser wird auf einem Dreibein zum Kochen gebracht.
• Markieren Sie die Seite, auf der der Ausstrich ist.
• Färbung: Stellen Sie den Ausstrich in die kochend heiße Lösung E (Einwirkzeit: 10 -
15 min).
• Nehmen Sie mit einer Pinzette den Objektträger aus der Küvette und spülen Sie
solange, bis keine grünen Farbwolken mehr zu sehen sind.
• Gegenfärbung: Überschichten Sie anschließend mit Lösung D den Objektträger
(Einwirkzeit: 1 - 2 min).
• Gießen Sie die Färbelösung ab und spülen Sie kurz mit VE-Wasser.
• Lassen Sie das Präparat lufttrocknen.
4.4.4 Auswertung
Mikroskopieren Sie das Präparat ohne Deckgläschen mit einem Tropfen Immersionsöl.
Öffnen Sie die Kondensorblende weit. Die Endosporen erscheinen hell bis kräftig bläu-
lich-grün. Die vegetativen Zellen erscheinen rot.
20

Mikroorganismen
5.1 Einführung
Die Bestimmung der Lebendzellzahl ist ein wichtiger Wert für die Beurteilung der Zell-
dichte, z. B. für eine Fermentation oder um Veränderungen in einer Zellpopulation er-
fassen zu können. Je nach Fragestellung wird also die Zellzahl bzw. Zellkonzentration
%& &
oder die Zellmasse (Biomasse) bestimmt. Die Biomasse wird üblicherweise in oder ! ,
%!
die Zellkonzentration in Zellzahl/ml angegeben. Die Zellzahl kann über zwei Methoden
ermittelt werden:
• Die Bestimmung der Lebendzellzahl über eine Plattenkultur

• Die Bestimmung der Lebendzellzahl mittels einer Zählkammer
Für beide Methoden ist ein Vorbereitungsschritt notwendig. Es muss vorher eine Ver-
dünnungsreihe angelegt werden. Dieser Schritt gilt nicht als Versuch im eigentlichen
Sinne, da er nicht ausgewertet wird, sondern dient lediglich der Vorbereitung.
Anmerkung: Hier ist sehr sorgfältiges und sauberes Arbeiten die Voraussetzung für ein
gut auszuwertendes Plattenmaterial!
5.2 Teilversuche
5.2.1 Anlegen einer Verdünnungsreihe

Die Anfangskonzentration einer unbestimmten Probe liegt etwa zwischen 108 -1010 Zel-
len/ml. Diese Konzentration ist für eine Zellzahlbestimmung deutlich zu hoch; es ließen
sich so keine Zellen auszählen, da ein Bakterienrasen, also keine vereinzelten Zellen,
vorliegen würde. Aus diesem Grund muss vorher eine Verdünnungsreihe angelegt wer-
den. Wie eine Verdünnungsreihe angelegt werden könnte zeigt die Abbildung 11.
Anmerkung: Das Anlegen einer Verdünnungsreihe ist kein Versuch im klassischen Sinne,
sondern dient hier der Vorbereitung. Es muss daher für die Verdünnungsreihe auch kei-
ne Auswertung gemacht werden.
21
Abbildung 11: Schema zum Anlegen einer Verdünnungslösung (eigene Darstellung).
• Vorlegen der Verdünnungslösung (Saline, steril):

o Kulturkolben: 99 ml
o Reagenzglas: 9 ml
• Probensuspension vor jeder Verwendung gut mischen!
• Aus der Probensuspension 1 ml entnehmen und in einen Kulturkolben überführen
(mit der Verdünnungsstufe beschriften)
Anmerkung: Anhaltspunkte für die Berechnung von Verdünnungsstufen: Vorgelegtes
Volumen (z. B. 99 ml) und zugegebenes Volumen (z. B. 1 ml). Die Verdünnungsstufe wird
in der Form 10-xy angegeben!
• Den Kulturkolben anschließend wieder gut durchmischen und 1 ml entnehmen.

• Das entnommene Volumen in den zweiten Kulturkolben pipettieren.
• Gut durchmischen und weiter fortfahren.
Anmerkung: Zum Mischen der Reagenzgläser können diese zwischen den Handflächen
etwa 20 s lang gerollt werden. Alternativ können die Reagenzgläser auch vorsichtig ge-
vortext werden.
22
5.2.2 Anlegen einer Plattenkultur zur Lebendzellzahlbestimmung (Koch’sches

Plattengussverfahren)
Anmerkung: Für das Anlegen der Plattenkultur wird ein vorbereiteter flüssiger Nährbo-
den, der in Reagenzgläsern (RG) abgefüllt ist, verwendet. Die flüssigen Nährböden be-
finden sich im Wasserbad bei 90 °C.
• Drei leere, sterile(!) Petrischalen werden mit den bereits bekannten Angaben plus
der Verdünnungsstufe beschriftet.
• Es wird ein RG entnommen und zunächst abgekühlt auf etwa 45 °C.
Anmerkung: Der flüssige Nährboden darf nicht zu heiß und nicht zu kalt sein. Zum einen
dürfen die Mikroorganismen aufgrund der zu hohen Temperatur nicht absterben, zum
anderen muss der Nährboden noch fließen können. Ist der Nährboden also zu kalt, bil-
den sich Klumpen, die unbedingt zu vermeiden sind.
• Aus der vorbereiten Verdünnungsstufe werden 100 µl entnommen und in das RG

mit dem flüssigen Nährboden pipettiert.
• Das RG wird sofort zügig gemischt und in die Petrischale ausgegossen.
• Zur besseren Verteilung in der Petrischale wird diese vorsichtig auf der Oberfläche
kreisend bewegt.
• Die Petrischale wird anschließend bis zur vollständigen Erstarrung des Nährbo-
dens am Platz stehen gelassen.
• Mit den übrigen zwei Verdünnungsstufen wird analog verfahren.
• Die Nährböden werden anschließend für 3 Tage bei 30 °C inkubiert.
5.2.2.1 Auswertung
Nach 3 Tagen werden die Kolonien ausgezählt.
5.2.3 Mikroskopische Zellzählung in einer Thoma-Zählkammer

Zellen (Bakterien, Bakterien, Erythrozyten u. a.) können mit Hilfe von Zählkammern aus-
gezählt werden. Zählkammer gibt es in verschiedenen Ausführungen und müssen je
nach Zellenart ausgewählt werden. Für Bakterien/Hefen wird die Thomazählkammer, für
z. B. Erythrozyten1 die Neubauerkammer verwendet.
Die Zellzählung ist meanderförmig wobei darauf geachtet werden muss, wo die Zellen
im Zählnetz verteilt sind. Diejenigen Zellen, die sich am Rand befinden, werden z. B.
nicht mitgezählt.
1
Erythrozyten = Die roten Blutkörperchen werden als Erythrozyten bezeichnet.
23
Abbildung 12: Thomazählkammer (vgl. HECHT-ASSISTENT).
Abbildung 13: Zählnetz der Thomazählkammer (vgl. LO LABOROPTIK).
Tabelle 4: Daten zur Thomazählkammer (eigene Darstellung).

Zählnetz Anzahl Fläche [mm2]
Großquadrat 1 mitte 1
Gruppenquadrat 16 0,2 x 0,2 0,04
Kleinquadrat 256 0,05 x 0,05 0,0025
Die Zählkammer weißt ein bestimmtes Volumen auf, da zwischen dem Deckglas und
dem Zählnetz ein Abstand von 0,1 mm liegt ergibt sich ein Kammervolumen von 0,00025
mm3. Weil die ausgezählten Zellen auf 1 ml bezogen werden, muss mit einem sogenann-
ten Kammerfaktor gerechnet werden. Dieser beträgt für die Thomazählkammer 4 ∙ 10(
und wird schließlich mit dem Ergebnis multipliziert.
• Die Kammer wird mit Ethanol (unverdünnt) gereinigt.

• Anschließend werden die Glasstege am Rand mit VE-Wasser benetzt.
• Ein Deckglas wird auf die Stege gelegt und vorsichtig durch hin- und herschieben
befestigt.
Anmerkung: Es sollte auf dem Deckglas ein Regenbogen (Newton’schen Ringe) zu

erkennen sein.
24
• Entnehmen Sie aus der vorbereiteten Verdünnungsreihe (10-2) 100 µl und setzen
Sie einen kleinen Tropfen am oberen und unteren Rand des Deckglases an.
Anmerkung: Durch die Kapillarkraft werden die Tropfen unter das Deckglas gezogen.
• Anschließend werden beide Netze vollständig ausgezählt.
5.3 Auswertung
Bilden Sie den Mittelwert und berechnen die Zellzahl nach der folgenden Formel:
̅
) *+, /
0,25 ∙ 10/(
̅ = Mittelwert der ausgezählten Zellen in den beiden Zählnetzen
Anmerkung:
Kleinquadrat = 0,0025 mm2 * 0,1 mm (Kammertiefe) = 0,00025 mm3
= 0,00025 mm3 = 0,00025 µl = 0,25 * 10-6 ml-1
25
6 Versuch 4: Morphologische/cytologische Beschreibung und bio-

chemische Leistungsprüfung von unbekannten Mikroorganismen
6.1 Einführung
Die Morphologie/Cytologie und die biochemische Leistungsprüfung dienen u. a. der
Identifizierung von unbekannten Mikroorganismen. Dabei ist bereits die morphologische
und cytologische Beschreibung einer Kultur entscheidend, weil darüber bereits ein Ver-
dacht geäußert werden kann. Mikroorganismen und insbesondere die Pilze haben ein
charakteristisches Wachstum auf Nährmedien. Das Wachstum auf Nährmedien kann
also ganz unterschiedlich sein. Näheres dazu kann beispielhaft den Abbildungen 14 - 17
entnommen werden.
Abbildung 14: Kolonie von Streptomyces spp. (vgl. GOODMAN).

Abbildung 15: Kolonien von E. coli auf Blut-Agar (vgl. BACTERIA IN PHOTOS).
Abbildung 16: Schwärmverhalten von Proteus spp. auf Blut-Agar (vgl.: RESEARCHGATE).
Abbildung 17: Drei Kulturen von Aspergillus fumigatus (vgl. MIDGLEY).
Neben der Wachstums- bzw. Koloniebeschreibung ist auch das Merkmal Geruch (bitte
nur bei Bakterien, nicht bei Pilzen (Sporen!) prüfen) ist ein wichtiger Anhaltspunkt. Wäh-
rend E. coli eher einen moderigen bis fäkalen Duft verströmt, erinnert der Geruch von z.
B. Streptomyces spp. an einen feuchten Wald.
Nicht nur die Morphologie oder der Geruch, sondern auch das mikroskopische Bild gibt
einen wichtigen Hinweis. Bei der mikroskopischen Betrachtung verschiedener Kulturen
zeigt sich, wie unterschiedlich Zellformen aussehen können, was die Abbildung 18 an-
hand einiger Zellenformen zeigt.
26
Abbildung 18: Zellformen bei Prokaryoten (vgl. MADIGAN, MARTINKO, STAHL u. CLARK, 2013, S. 67).
Der Vollständigkeit halber sei hier auch auf die Pilze (Eukaryoten) verwiesen, die aller-
dings aufgrund ihrer Sporenbildung in diesem Versuch nicht behandelt werden.
6.2 Durchführung
Anmerkung: Sie bekommen pro Zweiergruppe einen unbekannten Mikroorganismus
(mit arabischer Ziffer gekennzeichnet). Für diesen Mikroorganismus werden die nachfol-
genden Teilversuche durchgeführt. Am Schluss dieses Versuches soll die Bestimmung
des unbekannten Mikroorganismus erfolgen. Stellen Sie dazu eigene Recherchen an.
6.2.1 Morphologische Beschreibung eines Mikroorganismus

• Beschreiben Sie Ihre Kultur anhand der genannten Kriterien: Kolonieform und –
farbe, Rand der Kolonie, Geruch (nicht bei Pilzen!), Konsistenz, Unterseite (nur bei
Pilzen!).
6.2.2 Cytologische Beschreibung von Mikroorganismen
Stellen Sie sich als erstes ein natives Präparat her:
• Geben Sie auf den Objektträger einen kleinen Tropfen Wasser.

• Entnehmen Sie von der Agarplatte ein wenig Bakterienmaterial (es genügt dafür
mit der Impföse einmal kurz in die Kolonie zu gehen, nicht abkratzen!).
• Verreiben Sie vorsichtig den Tropfen mit der Bakterienmasse bis sich eine gleich-
mäßige Suspension eingestellt hat.
• Legen Sie ein Deckgläschen auf den Objektträger und mikroskopieren Sie diesen.
27
• Mikroskopieren Sie das Präparat und dokumentieren Sie, was Sie sehen. Unter-
stützend können Sie auch ein Foto oder eine Zeichnung anfertigen.
6.2.3 Biochemische Leistungsprüfung von Mikroorganismen
6.2.3.1 Verwertbarkeit der Kohlenhydrate Glucose, Lactose und Saccharose

Der Abbau von Kohlenhydraten führt gleichzeitig zur Säurebildung. Die eingesetzten
Medien enthalten den Farbindikator Bromkresolpurpur, der sich im Zuge der Säurebil-
dung verändert. Im alkalischen Bereich ist der Indikator Purpurrot, im sauren pH-Wert-
Bereich hingegen gelb. Gleichzeitig kann mittels eines Durham-Gärröhrchens überprüft
werden, ob Gas gebildet wird, was an einem Luftbläschen im Röhrchen zu erkennen ist.
• Beimpfen Sie die Röhrchen mit der Impföse, in dem die Öse mit der Bakterien-
masse (wenig!) im Flüssigmedium ausgeschüttelt wird. Die Bakterienmasse kann
auch vorsichtig am Glasrand in das Medium gerieben werden.
• Inkubation bei 35 °C für 24 - 48 h.
• Ergebnisse:
Abbildung 19: Mögliche Ergebnisse für den Kohlenhydrattest: I (= inert, keine Säure- und Gasbil-
dung); S (= Säurebildung); SG (= Säure- und Gasbildung); UK (= unbeimpfte Kontrolle) (vgl. ALEXANDER
u. STRETE, 2006, S. 77).
6.2.3.2 Katalasetest
Die aerobe Atmung führt zur Bildung von Wasserstoffperoxid (H2O2). Diese Substanz ist
toxisch und muss daher über das Enzym Katalase zersetzt werden. Dieses Enzym kann
bei den meisten aeroben und fakultativ anaeroben Organismen gefunden werden.
2343!35
Reaktion: 0 1 6777778 0 1 9 1
• Tropfen Sie einen Tropfen Wasserstoffperoxid (3 %) auf die Kultur (max. 24 h alt).
• Ergebnisse:
Katalase positiv: Bläschenbildung
Katalase negativ: Keine Bläschenbildung
28
Abbildung 20: Bläschenbildung beim Katalasetest (hier: in einem Röhrchen) (vgl. ALEXANDER u. STRETE,
2006, S. 78).
6.2.3.3 Citratverwertung
Mittels der Citratverwertung können Enterobakterien unterschieden werden. Entero-
bakterien besitzen das Enzym Citratlyase und können somit die Carbonsäure Citrat als
Kohlenstoffquelle verwenden. Es gibt allerdings auch Enterobakterien wie z. B. Escher-
ichia coli, die dieses Enzym nicht bilden (vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006 S. 79).
? 4 34!@35
Reaktion: :;< +<& ü> 677777778 1 + +A <+< 9 BA <+<
1 + +A <+< → DE FG+< 9 :1
:1 9 +H → + :1I ,ö, K0 L <
• Beimpfen Sie die Schrägagar-Röhrchen mit etwas Bakterienmaterial.

• Führen Sie zu dem angeimpften Röhrchen eine unbeimpfte Kontrolle mit.
• Inkubation bei 35 °C für 24 - 48 h.
• Ergebnisse:
Citrat positiv: Wachstum, blauer Farbumschlag
Citrat negativ: kein Wachstum, grüner Agar
Abbildung 19: Simmons-Citrat-Agar mit Escherichia coli (links) und Enterobacter aerogenes (rechts)
(vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006, S. 79).
29
6.2.3.4 Denitrifikation
Als Denitrifikation wird die Reduktion2 von Nitrat zu Stickstoff bezeichnet. Damit dies
möglich ist, benötigen Bakterien das Enzym Nitratreduktase. Dieses Enzym ermöglicht
den Bakterien Nitrat unter anaeroben Bedingungen als Elektronenakzeptor zu verwen-
den und es über die Bildung zu Nitrat zum gasförmigen Stickstoff zu reduzieren. Als Nit-
ratquelle dient KNO3, das Durham-Gärröhrchen zeigt auch hier die Gasbildung an.
4 34 MNO435
Reaktion: 1I 67777777777778 P+
• Beimpfen Sie die Röhrchen mit der Impföse, in dem die Öse mit der Bakterien-
masse (wenig!) im Flüssigmedium ausgeschüttelt wird. Die Bakterienmasse kann
auch vorsichtig am Glasrand in das Medium gerieben werden.
• Inkubieren Sie die Proben für 24 - 48 h bei 35 °C.
• Ergebnisse:
Positiv: Gasbildung
Negativ: Keine Gasbildung
Abbildung 20: Mögliche Ergebnisse für die Denitrifikation: Links: Unbeimpfte Kontrolle; mitte: beide
Röhrchen sind bewachsen, zeigen aber keine Gasbildung; rechts: Wachstum und Gasbildung (Bläs-
chen an der Oberfläche und im Durham-Gärröhrchen) (vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006, S. 81).
6.2.3.5 Indolproduktion
Das Enzym Tryptophanase dient einigen Bakterien, insbesondere den Enterobakterien
wie z. B. Escherichia coli, dazu, die Aminosäure Tryptophan zu Indol3, Pyruvat4 und Am-
2
Reduktion: Die Elektronenaufnahme durch ein Atom, Ion oder Molekül mit gleichzeitiger Erniedrigung der
Oxidationszahl.
3
Indol: Eine chemische Substanz (im speziellen ein aromatischer Heterocyclus), die in vielen Naturstoffen
enthalten ist. In niedrigen Konzentrationen erinnert Indol an Blütenduft, weshalb es u. a. in Parfüms einge-
setzt wird.
4
Pyruvat: Salze und Ester der Ketocarbonsäure (Carbonsäuren, die zusätzlich eine Ketogruppe [C=O] enthal-
ten).
30
moniak5 abzubauen. Im sogenannten SIM-Agar ist u. a. Pepton als Tryptophanquelle

enthalten.
S @T4UTV3>35
Reaktion: Q EK< K,+R 6777777777778 0I 9 DE FG+< 9 WR
• Beimpfen Sie die Röhrchen mit einer Stichimpfung (Impfnadel!).

• Inkubieren Sie die Röhrchen für 24 - 48 h bei 35 °C.
• Nach der Inkubation werden die Kulturen mit fünf Tropfen Kovacs-Reagenz über-
schichtet.
• Ergebnisse:
Positiv: Rote Verfärbung
Negativ: Keine rote Verfärbung
Abbildung 21: Mögliche Ergebnisse für die Indolbildung: Links: Escherichia coli (positiver Indolnach-
weis); mitte: Enterobacter aerogenes (negativer Indolnachweis); rechts: unbeimpfte Kontrolle (vgl.
ALEXANDER u. STRETE, 2006 S. 84).
6.2.3.6 Oxidasetest
Der Oxidasetest ist ein Kurztest, der das Enzym Cytochrom-Oxidase nachweist. Die Oxi-
dase ist ein Enzym der Atmungskette in deren Verlauf u. a. das Elektronentransportmo-
lekül Cytochrom c oxidiert und O2 zu H2O reduziert wird. Cytochrom-Oxidase positiv sind
z. B. Pseudomonas spp., negativ sind Enterobakterien, z. B. E. coli.
?@4UYV U%/Z M35
Reaktion: :E< A, A M. 9 1 67777777777777778 :E< A, A U . 90 1
:E< A, A U . 9[ + R* M. → :E< A, A M. 9[ + R* U .
• Verreiben Sie ein wenig Bakterienmaterial auf die die Indikatorplättchen und war-
ten Sie einige Sekunden.
• Alternativ können Sie ein wenig Bakterienmasse auf einen Objektträger verreiben
und anschließend ein bis zwei Tropfen Oxidase-Reagenz dazutropfen.
5
Ammoniak: Die chemische Verbindung aus Stickstoff und Wasserstoff [NH3] ist ein stark riechendes und
giftiges Gas.
31
• Ergebnisse:
Oxidase positiv: blauer-violetter Farbumschlag
Oxidase negativ: farblos
Abbildung 22: Mögliche Ergebnisse für den Oxidasenachweis: Links: Oxidase-Nachweis auf einer Agarplatte
(links: Escherichia coli, rechts: Pseudomonas aeruginosa). Rechts: Kommerzieller Oxidase-Test (PA = Pseu-
domonas aeruginosa, EC = Escherichia coli) (vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006, S. 90).
6.2.3.7 Oxidation-Fermentation-Test (OF-Test)

Der OF-Test ist ein wichtiger Test für die Identifizierung von Bakterien, da er zeigt, auf
welche Weise Kohlenhydrate abgebaut werden: oxidativ (mit Sauerstoff) oder fermenta-
tiv (ohne Sauerstoff). Bei aeroben Arten kann Säurebildung beobachtet werden, wenn
Sauerstoff zur Verfügung steht bzw. der Sauerstoffzutritt erlaubt wird. Fakultativ anae-
robe Bakterien sind dagegen in der Lage Säure zu bilden wenn Sauerstoff vorliegt bzw.
kein Sauerstoff zur Verfügung steht. Der Test erlaubt also die Differenzierung zwischen
gramnegativen Stäbchen: Pseudomonas aeruginosa ist ein gramnegatives aber aerobes
Stäbchen, E. coli hingegen ebenfalls gramnegativ aber fakultativ anaerob. Der OF-Test
funktioniert aber nicht nur bei Stäbchen, sondern auch bei Kokken: z. B. Micrococcus
spp. (grampositiv, aerob) versus Staphylococcus spp..
Der Nährboden nach Hugh und Leifson enthält wie auch die vorherigen Testnährböden
Pepton, allerdings in niedrigeren Konzentrationen. Der Grund ist, da bei höherkon-
zentrierten Peptonzugaben alkalische Abbauprodukte entstehen würden, die die gebil-
deten Säuren neutralisieren würden. Als Kohlenhydrat können verschiedene Zucker
eingesetzt werden: Glucose, Lactose, Saccharose aber auch Maltose, Mannitol oder Xy-
lose. Als Indikator wird hier Bromthymolblau eingesetzt, der im sauren pH-Wertbereich
von grün nach gelb umschlägt.
• Beimpfen Sie zwei Röhrchen mittels Stichimpfung.

• Ein Röhrchen wird mit Paraffinöl (steril!) ca. 1 cm überschichtet.
• Inkubieren Sie die Röhrchen für 48 h bei 35 °C.
32
• Ergebnisse:
Abbildung 23: Mögliche Ergebnisse für den OF-Test mit Glucose als Kohlenhydrat: I (= inert, Alcaligenes
faecalis); FA (= fakultativ anaerob, Escherichia coli); A (= aerob, Pseudomonas aeruginosa); UK (= unbeimpfte
Kontrolle) (vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006, 91).
33
7 Versuch 5: Direktisolierung von fluoreszierenden Pseudomona-

den aus Erdproben
7.1 Einführung
Die Spezies der Gattung Pseudomonas kommen in der Natur häufig vor. Insbesondere
sind sie im Boden, im Wasser oder auch auf Pflanzen zu finden. Die Zellform ist stäb-
chenförmig, sie sind polar begeißelt (eine/mehrere) und sind gram negativ. Ihr Sauer-
stoffbedarf ist obligat aerob. Darüber hinaus besitzen sie die Fähigkeit Verbindungen
abbauen zu können, die als schwer abbaubar einzustufen sind. wie z. B. Xenobiotika6.
Auch sind Pseudomonaden in der Lage Speicherstoffe, sogenannte Polyhydroxyalkanoa-
te7 einzulagern. Bezüglich der Pathogenität können Pseudomonaden tier- und humanpa-
thogen sein.
Einige Pseudomonas spp. scheiden Pigmente ins Medium aus, die mitunter fluoreszieren
können. Als Anzuchtmedium dienen oftmals feste Medien, in denen ein Eisenmangel
herrscht. Pseudomonaden, die fluoreszierende Pigmente auf dem genannten Medium
ausscheiden, werden als Eisenchelatbildner8 bezeichnet. Die Affinität zu Fe3+-Ionen, die
für die Eisenaufnahme zuständig sind, ist in diesem Fall sehr hoch. Diese Pigmente wer-
den als Pyoverdine bezeichnet und gehören zur Gruppe der Siderophoren. Siderophore
enthalten eine fluoreszierende Struktur, das sogenannte Chinolin ein Chromophor9, das
an eine Peptidkette (11 AS) gebunden ist.
Eisen ist ein essentielles Makroelement (s. Tabelle 3), dass sich bei Nichtvorhandensein
in einem limitierten Wachstum zeigt. Das Element Eisen gilt unter physiologischen Be-
dingungen als sehr schlecht löslich. Daher gibt es im Organismus z. T. hoch komplexe
Mechanismen, dies es dem Organismus ermöglichen, Eisen aufzunehmen und in ihren
Stoffwechsel einzubauen. Hier kommen die oben genannten Siderophore zum Einsatz,
deren hohe Affinität zu Eisenionen und somit zur Komplexbildung führen. Diese ent-
standenen Komplexe werden schließlich in die Zelle transportiert und dort wieder ge-
löst. Das im Komplex gebundene Eisen wird wieder frei.
7.2 Durchführung
Anmerkung: Die Durchführung erstreckt sich über mehrere Tage. Daher ist eine eigene
Versuchsplanung notwendig!
• Tag 1: Probenansatz
6
Xenobiotika: (1) Körperfremde Substanzen, die eine Immunantwort hervorrufen können oder (2) Anthro-
pogene Substanzen, die für Mikroorganismen u. a. giftig sein können und gezielt oder diffus in der Umwelt
verteilt werden.
7
Polyhydroxyalkanoate: In der Natur vorkommende Polyester, die von vielen Bakterien als Reservestoffe
gebildet werden und bei Bedarf in Energie umgewandelt werden können.
8
Eisenchelatbildner: Chelate sind sogenannte Komplexbildner, die z. B. mit Eisen- oder anderen Metallionen
Komplexe bilden können.
9
Chromophor: Ist der Anteil in einem Farbstoff, der dessen Farbigkeit erst sichtbar macht.
34
o Entnehmen Sie eine Spatelspitze Gartenerde und lösen sie diese in 5 ml Lei-
tungswasser.
o Entnehmen Sie einen kleinen Tropfen und plattieren Sie diesen auf eine
King-Agar-Platte mittels eines Drigalskispatels aus.
o Inkubieren Sie die Platte bei 30 °C für einen Tag.
Anmerkung: Aufgrund der Erdprobe besteht die Gefahr, dass die Platte sehr schnell sehr
stark bewachsen ist. Lassen Sie die Platten daher nicht zu lange im Brutschrank.
• Tag 3: Vorbereitung
o Die inkubierte Platte wird mit einer UV-Licht (366 nm) beleuchtet.
o Fluoreszierende Kolonien werden entnommen und auf einer neuen King-
Agar-Platte ausgestrichen.
• Tag 5: Erster Reinigungsausstrich
o Die Platte wird erneut auf fluoreszierende Kolonien geprüft.
o Fluoreszierende Kolonien werden auf eine frische King-Agar-Platte ausge-
strichen
• Tag 7: Zweiter Reinigungsausstrich
o Siehe Tag 5
• Tag 9: Prüfung auf Pseudomonaden
o Fertigen Sie ein mikroskopisches Präparat an und beschreiben Sie die Zell-
form.
o Bestimmen Sie den Gram-Typen über die Gram-Färbung und den KOH-
Schnelltest.
7.3 Auswertung
Diskutieren Sie die Ergebnisse im Hinblick auf die Frage, ob der gesuchte Mikroorganis-
mus isoliert werden konnte.
Anmerkung: Stimmt das mikroskopische Bilde mit der Literatur überein. Passen die Er-
gebnisse Gram-Färbung und KOH-Test zueinander. Bedenken Sie Gram pos. bedeutet
KOH neg. und umgekehrt.
35
8 Versuch 6: Hitzeinaktivierung von Mikroorganismen
8.1 Einführung
In diesem Versuch geht es um die Aufnahme der Absterberate von Mikroorganismen,
die sogenannte Dezimale Reduktionszeit. Hierbei ist der enzscheidende Faktor die Tem-
peratur. Als Versuchsorganismus steht Escherichia coli K12 zur Verfügung. Der Einfluss
der Temperatur bewirkt führt letztlich zum Zelltod, d. h. zum irreversiblen Verlust der
Wachstumsfähigkeit. Allerdings gibt es auch Zellschädigungen, die zwar zum Zelltod
führen, aber dennoch reparabel sind. Derartige Zellschädigungen können durch UV-
Strahlen oder Hitzeeinwirkungen auftreten. Die dezimale Reduktionszeit lässt nur Aus-
sagen für eine Zellpopulation zu. Einzelne Zellen werden nicht betrachtet. Die Abnahme-
rate der Lebendzellzahl ist zu jedem Zeitpunkt zur Zahl der lebenden Zellen proportional,
was der Kinetik einer Reaktion 1. Ordnung entspricht:
\ ∙ /O∙4
N = Zellzahl zur Zeit t

N0 = Zellzahl zum Beginn der Sterilisation
k = exponentielle Absterberate
t = Zeit der Sterilisation
Die Art und Weise der Hitzeeinwirkung auf Mikroorganismen ist von verschiedenen Fak-
toren abhängig, wie z. B. Art der Mikroorganismen, Abhängigkeiten bezüglich des Was-
sergehaltes und des pH-Wertes im Milieu, das Zell- oder Sporenalter.
Der Parameter, der angewendet wird, um den Erfolg der Abtötung anzugeben, ist der
sogenannte D-Wert (dezimale Reduktionszeit = D10). Er besagt, nach welcher Zeit 90 %
der Zellen abgetötet worden sind. Der D-Wert lässt sich über die oben genannte Formel
ableiten:
\
\ ∙ /O ∙]
10
1 /O ∙]
10
2,303
^
`
Bakterien- und Pilzzellen werden bei Temperaturen um die 60 °C innerhalb von 5 - 10

min abgetötet. Hefezellen und Pilzsporen benötigen bereits Temperaturen > 80 °C und
Sporen von Bakterien werden erst bei Temperaturen oberhalb von 120 °C (15 min) ab-
getötet. Sporen einiger Bacillusarten (B. cereus, B. subtilis und B. stearothermophilus)
sind äußerst hitzeresistent und bedürfen für deren Abtötung feuchte Hitze und entspre-
36
chend lange Einwirkzeiten. Wie sich die Temperatur auf die genannten Bacillusarten
auswirkt können Sie der Tabelle 5 entnehmen:
Tabelle 5: D10-Werte von Sporensuspensionen für drei Bacillusarten (eigene Darstellung).

Dezimale Reduktionszeit in Sekunden bei T =
Sporen von
105 °C 120 °C 130 °C 140 °C 150 °C 160 °C
B. cereus 12,1 4,2 2,6 1,3 1,0 0,7
B. subtilis 27,8 4,5 3,1 2,1 1,1 0,5
B. stearothermophilus 2857,0 38,6 8,8 3,9 2,4 1,4
8.2 Durchführung
• Die Bakteriensuspension von E. coli K12 steht bereit.
• Stellen Sie sich 13 Reagenzgläser bereit.
• Alle Reagenzgläser werden mit 9,0 ml Saline befüllt.
• Beschriften Sie die Reagenzgläser nach folgendem Schema:
Tabelle 6: Inkubationsansatz für die Hitzeinaktivierung von E. coli (eigene Darstellung).
Inkubationsansatz (IA)
-1
0 - 10 15 - 10-1 30 - 10-1 45 - 10-1
0 - 10-2 15 - 10-2 30 - 10-2 45 - 10-2
0 - 10-3 15 - 10-3 30 - 10-3 45 - 10-3
• Das Röhrchen mit der Beschriftung IA wird für 5 min im Thermoblock bei 55 °C
inkubiert.
• Anschließend entnehmen Sie 1 ml aus der Bakteriensuspension und pipettieren
Sie diesen in das IA-Reagenzglas. Mischen Sie das Röhrchen zwischen den Hand-
flächen.
• Der IA-Ansatz verbleibt für den ganzen Versuch im Thermoblock.
• Entnehmen Sie 1 ml aus dem IA und pipettieren Sie diesen in 0 - 10-1 und mischen
Sie.
• Entnehmen Sie aus der 0 - 10-1 1 ml und pipettieren Sie diesen in die 0 - 10-2 und
mischen Sie.
• Entnehmen Sie aus der 0 - 10-2 1 ml und pipettieren Sie diesen in die 0 - 10-3 und
mischen Sie.
• Entnehmen Sie schließlich aus jedem Röhrchen 100 µl und plattieren Sie dieses
Volumen auf einer Nähragarplatte aus.
• Die Nähragarplatten werden zunächst am Platz gesammelt und später bei 30 °C
für 1 - 3 Tage inkubiert.
37
• Verfahren Sie für die übrigen Röhrchen nach dem oben beschriebenen Schema.
8.3 Auswertung
Tragen Sie in einem Diagramm die ausgezählte Zellzahl/ml halblogarithmisch gegen die
Inkubations-dauer auf. Dabei ist die ausgezählte Anfangszellzahl/ml = 100 %. Legen Sie
anschließend eine Trendlinie (linear) durch die aufgetragenen Punkte. Ermitteln Sie
dann entweder grafisch oder durch Berechnung die dezimale Reduktionszeit D10.
38
9 Versuch 7: Gravimetrische Bestimmung der Zellmasse
9.1 Einführung
Eine wichtige Methode für die Untersuchung von mikrobiologischen Kulturen in Flüssig-
keiten ist die sogenannte Biomassebestimmung. Anwendungen dieser Methode sind die
Verfolgung des Wachstums in statischen Kulturen oder die Bestimmung des Zellertrages.
Die Biomasse kann aber auch als Bezugsgröße für den Stoffwechsel oder die Enzymakti-
vitäten herangezogen werden. Allerdings sind diese Methoden nicht geeignet, wenn es
um ökologische Fragestellungen geht. Gründe sind das Auftreten von Mischpopulatio-
nen, das Vorhandensein von organischen Bestandteilen oder anorganische Partikeln.
Die Bestimmung der Zellmasse bezieht sich immer auf das gesamte Volumen der Kultur
und wird in der Einheit mg/ml oder g/l angegeben. Es kann angenommen werden, dass
Mikroorganismen, die sich in der exponentiellen Phase befinden, ausgeglichen wachsen.
Gemeint ist, dass sich sowohl die Zellmasse bzw. Zellzahl, wie auch die makromolekula-
ren Bestandteile (Proteine, DNA, RNA) mit derselben Rate zunehmen. Das bedeutet,
dass es nur möglich und auch sinnvoll ist das Wachstum zu verfolgen, wenn die Größe
(Masse) und die chemische Zusammensetzung der Zellen konstant bleiben. Oft ist es
allerdings so, dass sowohl die Größe der Einzelzellen wie auch deren chemische Zusam-
mensetzung variabel sind. Daher ist die Zunahme der Zellmasse nicht gleichzusetzen mit
dem Wachstum der Population.
Grundsätzlich gibt es mehrere Methoden, mit denen die Zellmasse bestimmt werden
kann. Ein Problem, das bei den meisten Verfahren auftritt, ist die fehlende Differenzie-
rung zwischen lebenden und abgestorbenen Zellen oder lebenden Zellen und anorgani-
schen Bestandteilen. Eine sinnvolle Unterscheidung der Methoden kann bezüglich des
zu untersuchenden Parameters getroffen werden:
• Direkte Methoden:
Hierbei wird die gesamte Biomasse oder ein anderer für die Zellmasse repräsentativer
chemischer Stoff Trockenmasse- oder Proteinbestimmung.
• Indirekte Methoden:
Die indirekten Methoden beziehen sich auf einen bestimmten Effekt, der von den Mik-
roorganismen hervorgerufen wird. Ein Beispiel für einen solchen Effekt ist die Trübung
des Mediums, die durch das Wachstum hervorgerufen wird. Andere Parameter können
die Sauerstoffaufnahme oder –bildung, die Kohlendioxidabgabe oder die Säurebildung
sein.
Ein Vorteil der indirekten Methoden ist deren Sensitivität und das sie relativ zügig
durchzuführen sind.
39
9.1.1 Methode: Zentrifugation

Die sogenannte gravimetrische Bestimmung der Feuchtmasse10 nach der Zentrifugation
der Zellsuspension kann zügig ein Ergebnis liefern. Zu beachten ist aber, dass es sich um
ein relativ unzuverlässiges Ergebnis handelt, da der Wassergehalt variabel ist.
Bei der Abtrennung der Zellen von dem flüssigen Kulturmedium wird die Zentrifugalkraft
genutzt. Auf die Zellen wirkt die Beschleunigung a die nach außen wirkt und durch eine
Rotorachse aufgebaut wird:
Abbildung 24: Zentrifugieren (vgl. SEILNACHT).
Eine wichtige Größe ist die sogenannte Winkelgeschwindigkeit ω, die sich auf den Rotor
bezieht. Mit ihr kann der Betrag der Beschleunigung, letztlich also die Sedimentations-
geschwindigkeit, bestimmt werden. Weiter geht der Abstand r in die Berechnung ein,
also der Abstand zwischen den Zellen und der Rotorachse:
+ a ∙
+= Beschleunigung ∙ /
a= Winkelgeschwindigkeit /
= Abstand der Zellen zur Rotorachse (ausmessen!)
Die Anzahl der Umdrehungen n des Rotors steht mit der Winkelgeschwindigkeit ω in
folgender Beziehung:
a 2∙b∙R
R = Drehzahl /
Weiter gilt:
+ 4∙b ∙R ∙
Die Beschleunigung wird als ein vielfaches der Erdbeschleunigung formuliert und
schließlich als relative Zentrifugalbeschleunigung (RZB) bezeichnet.
10
Feuchtmasse: Die Zellen enthalten noch das Cytoplasma.
40
4∙b ∙R ∙
[)c
= Erdbeschleunigung 9,81 ∙ /
Zu beachten ist, dass die RZB nicht überall im Zentrifugengefäß gleich ist; sie nimmt mit
zunehmenden Rotorachsenabstand zu. Daher ist es üblich, die mittlere RZB anzugeben.
Diese gilt dann für die Mitte der Flüssigkeitssäule. Berechnet wird sie indem man die RZB
jeweils mit rmin und rmax berechnet.
9.1.2 Methode: Membranfiltration

Eine alternative zur Zentrifugation ist die Membranfiltration, ein Trennprozess, in deren
Verlauf die Flüssigkeit durch eine Membran geleitet wird. Dabei halten die Membranen
aufgrund ihrer Porengröße und ihres Aufbaus die Partikel einer bestimmten Größe zu-
rück.
Membranfiltrationen sind besonders für die Abtrennung von Pilzmyzelien geeignet, weil
meistens die Zelldichte im Vergleich zu Bakterien- oder Hefesuspensionen gering ist.
Dennoch können auch diese Suspensionen damit abgetrennt werden, vorausgesetzt,
dass die Dichte dies zulässt. Auch sollte das Flüssigkeitsvolumen dann ausreichend groß
sein.
Da dieses Verfahren relativ schonend ist, ist es besonders für empfindliche Zellen geeig-
net. Ein weiterer Vorteil ist die Genauigkeit, weil die Membranfilter ein relativ niedriges
Gewicht haben, ist die Genauigkeit bei der Wägung höher. Damit die Genauigkeit gege-
ben ist, müssen die Filter vorher getrocknet werden, damit sie tatsächlich gewichtskon-
stant sind.
9.1.3 Fehlerquellen
Ein wichtiger Fehler, der sich auch durch die penibelste Arbeitsweise nicht verhindern
lässt, ist der systematische Fehler; diese Fehler entstehen durch die Art und Durchfüh-
rung einer Analysemethode. Damit also entschieden werden kann, welche Vor- und
Nachteile oder anders gesagt, welche Stärken und Schwächen eine Methode hat, sollte
bekannt sein, wie diese Fehler in Erscheinung treten können:
• Ein Aufwirbeln der Zellen bewirkt, dass die Abtrennung bei der Zentrifugation
unvollständig ist und im Überstand verbleiben.
• Eine unvollständige Übertragung in das Wägegefäß.
• Das Waschen mit destilliertem Wasser führt zur Lyse und in der Folge zu einer
Unterbewertung der Zellmasse.
• Beim Trocknen der Zellmasse können u. U. flüchtige Zellbestandteile zu einem
Abbau der Zellmasse führen.
41
• Eine zunehmende Zelltrockenmasse ist nicht immer auf das Wachstum zurückzu-
führen, sondern kann auch durch die Einlagerung von intrazellulären Speicherstof-
fen bedingt sein.
9.2 Durchführung
Anmerkung: Mikroorganismus: Saccharomyces cerevisiae
Anmerkung: Verwendung einer Kühlzentrifuge (4 °C) um ein weiteres Wachstum zu

vermeiden!
Anmerkung: Vor der Verwendung der Probensuspension muss der Kolben gut gemischt
werden, da die Zellen rasch zu Boden sinken!
9.2.1 Teilversuch 1: Bestimmung der Biofeuchtmasse mittels Zentrifugation
• Die Zentrifugengefäße (15 ml Falcon-Tubes) bei 105 °C für ca. 1 h trocken und
anschließend im Exsikkator abkühlen lassen (ca. 30 min).
• Zwei Falcon-Tubes mit einer Tiegelzange herausnehmen und auf der Analysen-
waage auswiegen (Gewichte notieren!)
Anmerkung: Nach dem Auswiegen können die Falcon-Tubes mit der Hand angefasst
werden.
• Die Zentrifugengefäße werden jeweils mit 10 ml der Probensuspension (Glaspi-

pette!) befüllt.
• Die Falcon-Tubes auf der Oberschalenwaage auf Gewichtsgleichheit prüfen und
anschließend gegenüberliegend in die Zentrifuge stellen.
Anmerkung: Warten Sie auf die anderen Gruppenmitglieder, um Wartezeiten zu ver-
meiden.
• Zentrifugieren bei 2000 – 3000 x g für 15 min.

• Die Röhrchen werden vorsichtig herausgenommen ohne die Zellen aufzuwirbeln.
Anschließend den Überstand dekantieren.
• Zellmasse mit 10 ml Saline waschen (Pellet vorsichtig aufschütteln)
• Erneut zentrifugieren.
• Das Waschen 1 - 3 mal wiederholen.
• Zuletzt werden die Falcon-Tubes zurückgewogen (es befindet sich nur die Zell-
masse im Röhrchen).
42
Anmerkung: Die Röhrchen werden für den 2. Teilversuch weiterverwendet!
9.2.2 Teilversuch 2: Bestimmung der Biotrockenmasse durch Zentrifugation
• Das Zellmaterial wird über Nacht bei 105 °C getrocknet.

• Die Röhrchen erneut im Exsikkator abkühlen lassen und anschließend auf der Ana-
lysenwaage auswiegen.
9.2.3 Teilversuch 3: Bestimmung der Biotrockenmasse durch Membranfiltrati-
on
• Die Membranfilter für 1 h trocknen bei 45 °C.

• Nach dem Trocknen werden die Membranfilter zur Abkühlung in den Exsikkator
gelegt.
Anmerkung: Achtung! Es liegt ein Vakuum vor! Schutzbrille!
• Aufsatz fest auf die Saugflasche aufsetzen.

• Hülse abnehmen und den Membranfilter zentrisch auf die Oberfläche legen.
• Hülse wieder aufsetzen.
• Den Filter mit VE-Wasser anfeuchten und die Pumpe anschalten.
• 10 ml der Kultur auf den Filter geben und absaugen.
• Mit VE-Wasser 1 - 3 mal kurz spülen.
• Anschließend den Filter vorsichtig mit einer Pinzette abziehen und auf ein Uhren-
glas legen.
Anmerkung: Es empfiehlt sich auf das Uhrenglas ein kleines Stück Aluminiumfolie aufzu-
legen, um ein festkleben des Filters am Uhrenglas zu vermeiden. Beschriften nicht ver-
gessen!
• Die Filter werden über Nacht bei 105 °C getrocknet. Es wird weiter wie oben be-
schrieben verfahren.
9.3 Auswertung
Führen Sie die Ergebnisse in einer Tabelle zusammen. Geben Sie die RZB an und disku-
tieren Sie die Ergebnisse bezüglich der Vor- und Nachteile der entsprechenden Metho-
den.
43
10 Versuch 8: Aufnahme einer Wachstumskurve von Vibrio natrie-

gens
10.1 Einführung
Für die Aufnahme der Wachstumskurve verwenden Sie den Mikroorganismus Vibrio
natriegens. Dieser Mikroorganismus hat eine vergleichsweise kurze Verdopplungszeit
und eignet sich daher gut für die Ermittlung einer Wachstumskurve innerhalb einer kur-
zen Zeitspanne. Die Teilung einer prokaryotischen Zelle ist in Abbildung 20 dargestellt.
Abbildung 25: Teilung eines stäbchenförmigen Prokaryoten in zwei gleiche Tochterzellen (vgl. MADIGAN,
MARTINKO, STAHL u. CLARK 2013, S. 162).
Was die Abbildung 20 nicht zeigt, ist die Vermehrung der Zellbestandteile. Jede Tochter-
zelle enthält das vollständige Genom der Mutterzelle sowie alle Makromoleküle, anor-
ganische Ionen etc. um als eigenständige Zelle überleben zu können. Die Generationszeit
von Mikroorganismen kann höchst unterschiedlich lang sein. Beeinflussende Faktoren
sind z. B. die Ernährungssituation im Milieu. Fehlen essentielle Nährbestandteile wird
das Wachstum auch weniger schnell voranschreiten als wenn alle Moleküle in ausrei-
chender Konzentration verfügbar sind.
Bezüglich der Messung von Zellzahl und Zellwachstum können unterschiedliche Größen
berücksichtigt und miteinander in Beziehung gesetzt werden:
Tabelle 7: Größen und Verhältnisse für die Zellzahl- und Zellwachstumsbestimmung (eigene Darstellung).
Zellzahl Zellmasse
Zellkonzentration Zelldichte
Pro Volumeneinheit
(Zellzahl pro ml) (Trockenmasse pro ml)
Verdopplung pro Zeitein-
Teilungsrate ν pro h Wachstumsrate µ pro h
heit
Zeitintervall der Verdopp-
Generationszeit g in h Verdopplungszeit td in h
lung
44
Mit zunehmender Zellzahl nimmt die Trübung der Suspension zu. Erkennbar wird dies ab
einer Zellzahl von 107 Zellen/ml. Diesen Effekt macht man sich bei der Messung der Ex-
tinktion zunutze. Nimmt die Trübung zu, nimmt die Intensität der gerichteten Lichtein-
strahlung beim Durchgang durch die Suspension ab. Dieser Effekt kann mit der soge-
nannten Turbidimetrie oder Trübungsmessung gemessen werden. Die Trübungsmessung
kann für Bakterien-, Pilz oder Sporensuspension angewendet werden. Von Vorteil ist
dabei, dass die Methode schnell durchzuführen ist und die Zellen nicht abgetötet wer-
den müssen. In der Praxis wird diese Methode für die Kontrolle des kontinuierlichen
Wachstums angewendet. Ausgeschlossen sind Suspensionen, die neben den Zellen noch
andere Partikel enthalten oder myzelbildende Mikroorganismen überwacht werden
sollen.
Um die gemessenen Werte auswerten zu können, sollen an dieser Stelle noch einmal
grundlegende Ansätze wiederholt werden. Das Wachstum folgt im Prinzip einer geomet-
rischen Reihe, also der Form: 20 21 22 … 2n. Daraus resultiert eine Zellzahl N
nach n Teilungen:
\ ∙ 2>
Durch Logarithmieren und entsprechendem Umstellen erhält man die Anzahl der Zelltei-
lungen:
lg lg \
R
lg 2
Die Teilungsrate η ergibt sich aus der folgenden Gleichung:
R lg lg \
h
< lg 2 ∙ < <\
Der Kehrwert der oben genannten Beziehung entspricht der Generationszeit g:
< 1
R h
Für eine nutzbare Darstellung von hohen Zellzahlen muss eine halblogarithmische Dar-
stellung gewählte werden, d. h. das die Zellzahl logarithmisch und die Zeit arithmetisch
aufgetragen wird. Sie erhalten dann eine Gerade die Ihnen über die Steigung die Tei-
lungsrate η angibt. In der Praxis geben Sie immer die Biomassekonzentration X für die
gesamte Zellpopulation an. Das Maß für die Biomassezunahme innerhalb eines be-
stimmten Zeitintervalls geben Sie in Form der spezifischen Wachstumsrate µ an. Dabei
müssen Sie beachten, dass für die Auswertung die logarithmische Phase entscheidend
ist. Weder die Lag-Phase (Eingewöhnungsphase) noch die Absterbephase spielen im
Vorliegenden Versuch eine Rolle.
45
Für die Berechnung der spezifischen Wachstumsrate µ verwenden Sie die folgende Glei-
chung:
log k log k\ ln k R k\
i
log ∙ < <\ < <\
Wenn Sie nun entsprechend integrieren, bekommen Sie die folgende Beziehung:
k k\ ∙ m∙4
Für die Verdopplungszeit td gilt dann:
ln 2
<M
i
Bei Vorliegen eines einzigen Substrates, wie z. B. Glucose, kann das Wachstum von Mik-
roorganismen über die Monod-Kinetik beschrieben werden. Die Parameter µmax und Ks
sind in diesem Fall für die logarithmische Wachstumsphase konstant. Es lässt sich also
darüber die Abhängigkeit des Wachstums vom Substrat beschreiben. Neben der Monod-
Kinetik gibt es weitere Modelle (z. B. Contois, Moser oder Tessier), die unter Bestimm-
ten Voraussetzungen bessere Ergebnisse liefern können als das Monod-Modell. Ein wei-
terer Aspekt ist das Substrat- oder Produkthemmungen vorliegen können, was mehrere
Messreihen nötig machen kann.
Wie bereits angesprochen sind die Parameter µmax und KS entscheidend. Die maximale
spezifische Wachstumsrate µmax gibt immer das Maximum an, weil selbst eine Substra-
terhöhungen nicht zu einer höheren Wachstumsrate führen würde. Analog zum KM der
Michaelis-Menten-Kinetik (Enzymkinetik) steht auch bei der Monodkinetik das KS für die
Substratkonzentration, bei der die halbe maximale spezifische Wachstumsrate erreicht
wird.
n
i i%3 ∙
op 9 n
-1
µ = spezifische Wachstumsrate [h ]
-1
µmax = maximale spezifische Wachstumsrate [h ]
& %U!
S = Substratkonzentration q r q r
! !
&
KS = Substratsättigungskonstante q r
!
Ein anderer Weg für die Ermittlung von µmax ist Berechnung des Ertragskoeffizienten st
u
und der spezifischen Substratverbrauchsrate q:
k
sv
p n
46
sv
p n
i ∙ ≅ sv ∙ x
k < p
& y U%355
st = Ertragskoeffizient q r
u
& pNz54 34
-1
q = spezifische Substratverbrauchsrate [h ]
x%3 ∙ n
x
op 9 n
Durch Einsetzen und entsprechender Umformung erhält man:
1 k
i ∙
k <
Analog erhält man für die spezifische Wachstumsrate folgende Gleichung:
1 n
x ∙
k <
Schlussfolgernd gilt also, dass für kleine Zeiträume (dt) die Zunahme der Biomasse (dX)
proportional zur vorhandenen Biomasse (X) ist.
Aus der Integration mit den Anfangsbedingungen t = 0 und X = X0 resultiert die folgende
Gleichung:
v 4
k k
{ i{ <→ R i∙< →k k\ ∙ m∙4
k k\
v| 4|
10.2 Durchführung
Anmerkung: Sie erhalten das unbeimpfte Medium (300 ml Kulturkolben) und eine be-
wachsene Kultur mit Vibrio natriegens (300 ml Kulturkolben). Es genügt, wenn eine
Zweiergruppe die Kalibrierung des Versuches übernimmt. Klären Sie dies vor dem Ver-
suchsbeginn!
10.2.1 Kalibrierung
• Legen Sie sich drei Membranfilter auf Uhrengläser und trocknen Sie diese für 45
min im Trockenschrank bei 110 °C.
• Legen Sie anschließend die Membranfilter zur Abkühlung in den Exsikkator und
belassen Sie diese dort bis zur Verwendung.
• Vor der Verwendung wiegen Sie die Filter auf der Analysenwaage aus und notie-
ren sich die Gewichte (bis auf vier Stellen!). Die Filter sollen ca. 0,08 g wiegen.
47
• Die Kalibrierung erfolgt zu den folgenden Zeiten: t = 60 min, t = 105 min und t =
150 min.
• Zu den gegeben Zeiten entnehmen Sie aus ihrer Kultur 20 ml und geben diese auf
die mit VE-Wasser angefeuchteten Membranfilter.
• Schalten Sie die Vakuumfiltration an und warten Sie, bis die Flüssigkeit abgezogen
ist.
• Anschließend waschen Sie den Filter, indem Sie 1 - 3 mal VE-Wasser auf den Filter
geben.
• Legen Sie sich etwas Alufolie auf das Uhrenglas.
• Wenn auf dem Filter keine Flüssigkeit mehr steht, können Sie den Filter entneh-
men und auf das Uhrenglas legen.
• Der Filter wird dann für 1 h im Trockenschrank bei 110 °C getrocknet.
• Anschließend wird der Filter für 45 min im Exsikkator abgekühlt und ausgewogen.
10.2.2 Aufnahme der Wachstumskurve
• Entnehmen Sie vor dem Animpfen zwei Milliliter für den Nullabgleich (Blindwert)
und pipettieren Sie diese in zwei Messküvetten.
Anmerkung: Das Photometer hat zwei Strahlengänge zwei Küvetten für den Nullab-
gleich!
• Impfen Sie das Nährmedium mit 10 ml der bereitgestellten Kultur an.
• Schwenken Sie den Kolben kurz und pipettieren Sie sofort 1 ml in eine Messküvet-
te.
• Messen Sie diese bei 580 nm (ins Photometer stellen und ablesen).
• Stellen Sie den Kolben möglichst zügig in den Schüttelinkubator (bei 100 UpM,
Inkubation: 15 min).
• Anschließend entnehmen Sie wieder einen Milliliter, den Sie sofort messen.
• Gehen Sie für die verbleibende Versuchsdauer nach dem obigen Schema vor.
10.3 Auswertung
10.3.1 Erstellung der Kalibrierkurve

Anmerkung: Die Gruppe, die die Biomasse für die Kalibrierkurve aufgenommen hat, gibt
die Werte der Auswaagen sowie die dazugehörigen Extinktionen (t = 60, 105 und 150
min) an die übrigen Gruppen weiter. Jede Gruppe erstellt also ein eigenes Kalibrierdia-
gramm.
48
Tragen Sie die Extinktionen gegen die Biomassekonzentrationen (g/l) in einem x-y-
Diagramm auf. Legen Sie eine Trendlinie (linear) durch die Punkte und dem Nullpunkt
des Koordinatensystems (die Punkte werden übrigens nicht verbunden). Lassen Sie sich
sowohl die Geradengleichung wie auch das Bestimmtheitsmaß anzeigen (Optionen der
Trendlinie).
Die Geradengleichung: E ∙ ≅} ∙k
E = Extinktion zum jeweiligen Zeitpunkt

&
X = Biomassekonzentration q r
!
10.3.2 Berechnung
Berechnen Sie zunächst für jeden Zeitpunkt die Biomassekonzentration X(t). Über die
Berechnung von X(t) kann für jedes Messintervall der Wert dX und der dazugehörige
Wert dt ermittelt werden. Berechnen Sie die spezifische Wachstumsrate µ sowie die
Verdopplungszeit.
Tragen Sie als nächstes die logarithmierte Biomassekonzentration log(X) über die ent-
sprechende Zeit auf. Das Diagramm sollte für die log-Phase eine Gerade zeigen. Das
untere Ende markiert die lag-Phase, das obere Ende die stationäre Phase.
Die berechneten X-Werte tragen Sie in das Exceldatenblatt (im Labor) ein. Sie erhalten
dann die berechneten Glucosekonzentrationen S für die entsprechenden Messzeiten.
Führen Sie eine Linearisierung durch, in dem Sie die Werte ~
über
p
berechnen. Legen
Sie eine Trendlinie durch die Punkte. Mit Hilfe dieser Auftragung wird die Geleichung
p
i i%3 ∙ linearisiert. Die Geradengleichung ermöglicht die Bestimmung von µmax
2u Hp
und KS.
Berechnen Sie außerdem st und q für jeden Messwert. Tragen Sie in einem weiteren
u
Diagramm die Werte X und S gegen die Zeit auf.
Diskutieren Sie die ermittelten Werte für td, µmax und KS und vergleichen Sie diese mit
Literaturwerten.
49
11 Versuch 9: Bestimmung des Gesamtausbeutekoeffizienten des

von Janthinobacterium lividum produzierten Violaceins
11.1 Einführung
Die Produktbildung, die durch Mikroorganismen durchgeführt wird, sind selbst kompli-
zierte Stoffwechselprozesse und unterliegen einer bestimmten Regulierung. Die Zellbil-
dung ist daher nicht als Produkt zu verstehen, sondern nur der bzw. die Stoffe, die erst
nach der Zellvermehrung gebildet werden. Unter den verschiedenen Produkten sind die
Farbstoffe für die Mikrobiologie oder die Chemie von besonderem Interesse. Die Fähig-
keit zur Pigmentbildung ist genetisch festgeschrieben und oft auch ein erster Hinweis
auf die Bildung antibiotischer Wirkstoffe. Mikrobiell synthetisierte Pigmente sind struk-
turell vielfältig und können Derivate aus den Stoffklassen der Carotinoide11, Phenazin-
farbstoffe12 oder der Pyrrolfarbstoffe13 sein.
Ein Beispiel für ein mikrobiell gebildetes Pigment ist das blau-schwarze Violacein, das
erstmals 1882 beschrieben wurde. Der Mikroorganismus, aus dem damals der Farbstoff
isoliert worden war, ist heute unter der Bezeichnung Chromobacterium violaceum be-
kannt. Violacein kann aber auch aus den Bakteriumstämmen Janthinobacterium lividum,
Chromobacterium lividum und Alteromonas luteoviolacea isoliert werden.
Violacein hat die Summenformel C20H13N3O3 und ein Molekulargewicht von 343,33
g/mol. Das Absorptionsmaximum liegt in methanolischer Lösung bei 570 nm. In Wasser
ist Violacein praktisch unlöslich. Geeignete Lösemittel sind Aceton, Ethanol und Dio-
xan14. Der Mikroorganismus Chromobacterium violaceum kann aus Erde und Gewässer
isoliert werden und bildet neben dem Violacein das sogenannte Desoxyviolacein, das
eine identische Struktur aber ein Sauerstoffatom weniger aufweist. Die Funktion des
Violaceins ist der Schutz vor UV-Strahlen zum einen und zum anderen die Regulierung
der Tryptophankonzentration15. Weitere Eigenschaften dieses Pigmentes sind antibioti-
sche, antivirale und antitumorale Wirkungen. Wobei eine zytotoxische oder gar patho-
gene Wirkung nicht gezeigt werden kann. Industriell kann es für Färbungen von natürli-
chen und synthetischen Textilien (Seide, Wolle, Baumwolle oder Nylon) eingesetzt wer-
den. Eine wichtige Voraussetzung für die Violacein-Synthese ist der relativ hohe Sauer-
stoffbedarf. Dies wird deutlich, wenn man sich den Trypophanabbau einmal genauer
ansieht:
11
Carotinoide: Ein natürliches, fettlösliches Pigment, das u. a. in Möhren, Bananen oder Tomaten vor-
kommt. Flamingos fressen bestimmte (rötliche) Schalentiere, wodurch die Vögel das Pigment aufnehmen
und somit selbst ein rosafarbenes Gefieder bekommen.
12
Phenazinfarbstoffe: Eine Gruppe synthetischer Farbstoffe, die als gemeinsames Chromophor den Phe-
nazinring haben.
13
Pyrollfarbstoffe: Pyroll ist eine organische (Ring-)Verbindung und gehört in die Gruppe der Heteroaroma-
ten. Pyrollringe kommen u. a. im Häm (Blutfarbstoff), Chlorophyll oder Vitamin B12 vor. Die Farbstoffe des
Pyrolls sind biochemisch wichtige Substanzen und absorbieren das Licht besonders stark, was als stark farbig
wahrgenommen wird.
14
Dioxan: In der anorganischen Nomenklatur der systemische Name für Wasserstoffperoxid.
15
Tryptophan: Eine proteinogene Aminosäure, die mit Phenylalanin, Tyrosin und Histidin zu den sogenann-
ten aromatischen Aminosäuren gehört.
50
Abbildung 26: Reinkultur von Chromobacterium violaceum (Synonym von Janthinobacterium lividum) auf
einem Nährboden (vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006, S. 70).
11.1.1 Quorum Sensum

Die Ausbildung wichtiger physiologischer Leistungen wie z. B. das Schwarmverhalten, die
Biofilmbildung oder auch die Synthese antibiotischer Substanzen sind Fähigkeiten der
Mikroorganismen, die ab einer bestimmten Populationsdichte in Erscheinung treten.
Diese Fähigkeiten können koordiniert werden. Als Ausgangsbasis dienen die Ausschei-
dung niedrigmolekularer Substanzen und das Erkennen dieser Konzentrationen mittels
spezifischer Rezeptorsysteme. Auch die Erkennung von Signalmolekülen anderer Popula-
tionen ist möglich. In diesem Zusammenhang ist die Struktur N-Acylhomoserinlactone
(AHL’s) von Bedeutung, da sie bei einer Vielzahl von Bakterien das Grundgerüst darstellt
und als Signalmolekül fungiert. Varianten der AHL’s existieren bezüglich der Moleküllän-
ge oder der Art der Kohlenstoffseitenketten.
Gram-negative Bakterien steuern über AHL-Moleküle die Produktion abbauender Enzy-

me, wie z. B. Proteasen, oder die Aktivierung der Violaceinproduktion bei Janthinobac-
terium lividum (J. lividum). Unter physiologischen Bedingungen beginnt die Ausschüt-
tung des AHL bei J. lividum nach etwa 1 bis 2 Tagen unter der Voraussetzung einer ent-
sprechend hohen Populationsdichte. Die Aktivierung der Farbstoffproduktion lässt sich
aber auch auf externen Weg induzieren. Dafür kann sowohl reines AHL verwendet wer-
den oder auch AHL-produzierende Mikroorganismen wie Escherichia coli oder Micrococ-
cus luteus.
11.1.2 Stöchiometrische und Ausbeutekoeffizienten

Eine Möglichkeit zur Beschreibung der mikrobiellen Aktivität ist die stöchiometrische
Berechnung, vorausgesetzt, dass die Edukte und Produkte bekannt sind. Dies soll an
dem folgenden Beispiel gezeigt werden. Das Edukt ist in diesem Fall ein Kohlenhydrat
(C6H12O6 = Glucose). Die Glucose wird aerob durch ein heterotrophes16 Bakterium (ele-
16
Heterotrophie: Der für den Aufbau von Zellsubstanz nötige Kohlenstoff wird aus organischen Verbindun-
gen bezogen. Das Gegenteil der Heterotrophie ist die Autotrophie, bei der der nötige Kohlenstoff aus anor-
ganischen Quellen (CO2) verwendet wird.
51
mentare Zusammensetzung der Biomasse C5H7NO2) abgebaut. Die folgende stöchiomet-

rische Gleichung stellt den Vorgang in einer Näherung dar:
+ :( 0 1( 9 • 1 9 A 0I :€ 0• 1 9 :1 9 ‚ 0 1
Die Effizienz des Umsatzes eines Eduktes j zu einem Produkt i wird durch den sogenann-
ten Yield- bzw. Ausbeutekoeffizienten sƒ , der auch als Ertragskoeffizient bezeichnet
„
wird, beschrieben. Dieser Koeffizient gibt also lediglich an, wieviel Stoff j verbraucht
wurde damit Stoff i produziert werden konnte. Der Gesamtausbeutekoeffizient …† kann
‡
experimentell ermittelt werden. Die Variante spezifischer Ausbeutekoeffizient …∗† ist

‡
meistens nur mittels mathematischer Modelle zu ermitteln.
Für die Aufstellung und Berechnung der stöchiometrischen Gleichung sind sogenannte
stöchiometrische Koeffizienten nötig, damit die theoretische Bestimmung des Ausbeu-
tekoeffizienten möglich wird. Anzumerken ist, dass die Umwandlung von Substrat zum
Produkt/Biomasse sehr selten stöchiometrisch genau ist. Die stöchiometrischen Koeffi-
zienten werden daher über integrale Massenbilanzen der Elemente ermittelt. Es werden
also nicht die Änderungsraten bilanziert, sondern die Massen, wobei natürlich die Erhal-
tungssätze für die totale Masse und die Elemente gilt.
Das folgende Beispiel zeigt die Berechnung eines theoretischen Ausbeutekoeffizienten.

Vorher sollen noch einige Angaben gemacht werden:
• Anaerobes Zellwachstum
• :0 1 = Kohlenhydrat (= Substrat)
• 0‰H
= Stickstoffsubstrat
• :0 ,Š 1\,€ \, = angenäherte Formel für Zellen
:0 1 9 0,2 0‰H 9 /
:0 ,Š 1\,€ \, 9 0,5 0 1
Das Ergebnis dieser Berechnung ist, dass aus 1 kg Substrat 0,82 kg Zellen gebildet wer-
den und 8,8 kg Zellen pro kg Stickstoff. Daraus folgen die Beziehungen:
v v
pv
0,82 sv
p
und
v v
v
8,8 sv
pv = Geschwindigkeit des Kohlenhydratverbrauchs

v = Geschwindigkeit des Stickstoffverbrauchs
v = Zellwachstumsrate
52
st = Ausbeutekoeffizient für Zellen bezogen auf das Substrat

u
st = Ausbeutekoeffizient für Zellen bezogen auf den Stickstoff

‹
Hier werden die Geschwindigkeiten durch die Massen ersetzt, weil die Zeit des Umsatzes
in allen Fällen gleich ist und hier herausgekürzt werden kann. Der Faktor der notwendi-
gen Energie ist in diesem Ansatz nicht enthalten. Bei einem anaeroben Zellaufbau kann
die Energie aus der Ethanolproduktion bezogen werden, wodurch die reale Zellausbeute
deutlich niedriger ist als der oben berechnete Ausbeutekoeffizient.
11.2 Durchführung
Anmerkung: Die Inkubationszeiten belaufen sich auf 3 – 6 Tage. Organisieren Sie den
Versuch sorgfältig. Da die Inkubationszeiten relativ lang sind ist ein steriles und sorgfälti-
ges Arbeiten erforderlich! Sie erhalten alle notwendigen Medien sowie den Mikroorga-
nismus.
• Bereiten Sie sich die Laminar-Flow-Bank vor (Bakterium, Medium: Glucose-

Nährboullion [GNB] und Arbeitsutensilien etc.).
• Pipettieren Sie 10 ml Inokulum in das frische Medium [GNB].
• Durchmischen Sie den Inhalt durch vorsichtiges Schwenken
• Der Kolben wird mit Vorkultur und den bekannten Daten beschriftet und für 24 -
48 h im Schüttelinkubator bei 25 °C und 100 U/min inkubiert.
• Bevor die Hauptkultur beimpft wird, muss eine Reinheitskontrolle am Mikroskop
durchgeführt werden!
• Für die Hauptkultur entnehmen Sie 10 ml aus der Vorkultur und überführen das
Volumen in einen neuen Kulturkolben mit frischem GNB-Medium.
• Der Kolben wird beschriftet und für 48 - 96 h bei den oben genannten Bedingun-
gen inkubiert.
11.2.1 Aufarbeitung
Für die Aufarbeitung des Kolbens werden zwei Methoden angewendet:
• Biotrockenmassebestimmung (mit 15 ml Falcon-Tubes)
• Bestimmung des Absorptionsmaximums (UV/VIS-Photometer)
11.2.1.1 Bestimmung der Biotrockenmasse mit 15 ml Falcon-Tubes

Anmerkung: Die Falcon-Tubes werden vor der Bestimmung des Taragewichtes und vor
dem Auswiegen der Zellmasse ausschließlich mit einer Tiegelzange entnommen.
53
• Entnehmen Sie zwei Falcon-Tubes aus dem Wärmeschrank und lassen Sie diese im
Exsikkator (ca. 30 min) abkühlen. Notieren Sie anschließend die Taragewichte.
• Entnehmen Sie aus der Hauptkultur 20 ml und verteilen diese gleichmäßig auf die
zwei 15 ml Falcon-Tubes.
• Zentrifugieren Sie diese bei 4000 U/min für 10 min.
• Dekantieren Sie den Überstand.
• Die verbleibende Zellmasse wird über Nacht im Wärmeschrank bei 110 °C ge-
trocknet.
• Lassen Sie die Falcon-Tubes erneut abkühlen und wiegen Sie die Röhrchen an-
schließend aus.
11.2.1.2 Bestimmung des Extinktionsmaximums
• Das verbliebene Volumen aus der Hauptkultur wird gleichmäßig auf zwei 50 ml
Falcon-Tubes aufgeteilt und bei 4000 U/min für 10 min zentrifugiert.
• Der Überstand wird dekantiert.
• Die Zellmasse wird mit jeweils 25 ml Ethanol versetzt und selbige resuspendiert.
Anschließend wird der Inhalt in einen Jodzahlkolben (Kolben mit einem Schraub-
deckel) überführt.
• Den Jodzahlkolben entweder für mindestens 1 h oder über Nacht bei 100 U/min
schütteln lassen.
• Anschließend zwei Eppendorf-Tubes mit jeweils 1 ml füllen und diese bei 10.000
U/min für 5 min zentrifugieren.
• Das Photometer auf null stellen: Zwei Küvetten mit Ethanol autozero drücken
• Der Überstand (nicht in die Zellmasse kommen) wird vorsichtig in eine Messküvet-
te überführt und gegen Ethanol gemessen.
• Wenn die Extinktion den Wert von 1 übersteigt, muss die Probe mit Ethanol ver-
dünnt werden.
Anmerkung: Die Messung erfolgt im Programm Lambda 25 (Scan-Modus). Das Absorpti-
onsmaximum sowie die dazugehörige Extinktion werden abgelesen und in die entspre-
chende Gleichung eingesetzt.
11.3 Auswertung
Die Konzentration an Violacein wird über die folgende Gleichung mittels des molaren
Extinktionskoeffizienten bestimmt:
54
}
AŒ ∙ ŽŒ
•∙
%U!
AŒ = Konzentration des Farbstoffes q r
!
} = Extinktion
= Schichtdicke der Küvette (1 cm) A
• !
• q r
4
= molarer Extinktionskoeffizient 1,7 ∙10
•‘•∙’• %U!∙Y%
ŽŒ = Verdünnungsfaktor der Probe
Die Glucosekonzentration im Medium am Anfang der Fermentation berechnet sich wie

folgt:
“
A“
”“ ∙ •
%U!
A“ = Konzentration der Glucose q r
!
“ = eingewogene Masse an Glucose (10 g)
– &
”“ = Molmasse der Glucose (180,15 ) q r
•‘• %U!
• = Volumen der Fermentationslösung (100 ml)
Der Gesamtausbeutekoeffizient der gebildeten Biomasse in Bezug auf die im Nährmedi-

um enthaltene Glucose berechnet sich wie folgt:
k
sv
p A“
&
st = Gesamtausbeutekoeffizient (Biomasse bezogen auf die Glucose) q r
u
%U!
&
k = Biomassekonzentration q r
!
%U!
A“ = Konzentration der eingesetzten Glucose q r
!
Der Gesamtausbeutekoeffizient des gebildeten Produktes in Bezug auf die im Nährme-

dium enthaltene Glucose berechnet sich nach der folgenden Formel:
AŒ
s—
p A“
s˜ = Gesamtausbeutekoeffizient (Produkt bezogen auf die Glucose) ™– ›

u
%U!
AŒ = Konzentration an erhaltenen Violacein q r
!
%U!
A“ = Konzentration an eingesetzter Glucose q r
!
55
Der Gesamtausbeutekoeffizient des gebildeten Produktes in Bezug auf die Biomasse

berechnet sich nach der folgenden Formel:
AŒ
s—
v k
%U!∙!
s˜ = Gesamtausbeutekoeffizient (Produkt bezogen auf die Biomasse) q r
t
&
%U!
AŒ = Konzentration an erhaltenen Violacein q r
!
&
k = Biomassekonzentration q r
!
56
12 Versuch 10: Agardiffusionstest (Änderungen vorbehalten)
12.1 Einleitung
Das mikrobiologische Wachstum kann mit verschiedenen Methoden kontrolliert wer-
den. Routinemäßig werden dafür Substanzen auf chemischer Basis eingesetzt. Diese als
sogenannte Agentien bezeichneten Substanzen sind natürlichen oder synthetischen
Ursprungs und können Mikroorganismen hemmen oder gar abtöten. Diese Substanzen
sind an der Endung -zid zu erkennen und können über die Vorsilbe einem Organismus
zugeordnet werden, z. B. für Bakterien Bakterizid oder für Pilze Fungizid.
Antimikrobielle Agenzien unterscheiden sich durch ihre selektive Toxizität. Von nicht
selektiven Agenzien wird gesprochen, wenn sich die Wirkung auf unterschiedliche le-
bende Zellen nicht unterscheidet. Selektive Agenzien wiederum wirken nur auf Mikroor-
ganismen, nicht aber auf z. B. humane Zellen und werden verabreicht, wenn eine Infek-
tion bekämpft werden soll. Die Wirkung kann dabei durchaus unterschiedlich sein. So
können Bakterien entweder gehemmt (bakteriostatische Agenzien) oder abgetötet (bak-
teriolytische Agenzien) werden. In die Gruppe der bakteriolytischen Agenzien gehören
auch die Antibiotika, deren Wirkung meistens eine Störung der Zellwandsynthese ist
(vgl. MADIGAN, MARTINKO, STAHL UND CLARK, 2013, S. 1117). Wie sich Agentien auswirken
können, fasst die folgende Grafik zusammen:
Abbildung 29: Bakteriostatische, bakteriozide und bakteriolytische Wirkstoffe im Vergleich. Der Pfeil mar-
kiert den Zeitpunkt, an dem ein entsprechender Wirkstoff hinzugegeben wurde (vgl. MADIGAN, MARTINKO,
STAHL u. CLARK, 2013, S. 1117).
Die antimikrobielle Aktivität wird gemessen, indem die kleinste Menge des Agens ermit-
telt wird, die gerade noch eine Hemmwirkung auf die Mikroorganismen ausübt. Dieser
Wert wird als minimale inhibitorische Konzentration (MIK) bezeichnet. Ein weit verbrei-
tetes Verfahren zur Ermittlung dieses Wertes ist der Röhrchenverdünnungstest. Dieser
Test besteht aus Kulturproben, von denen jede das gleiche Volumen, aber eine unter-
schiedliche Konzentration des Agens hat. Nach der Inkubation wird durch Augenschein
die Trübung untersucht und diejenige Konzentration als MIK bezeichnet, die das Bakte-
rienwachstum vollständig unterbunden hat. Damit die Vergleichbarkeit gegeben ist,
muss der Test standardisiert werden. Es müssen also alle Bedingungen (Inkubationszeit,
pH-Wert, Belüftung und Temperatur) stets gleich sein. Das Gleiche gilt für die Zusam-
mensetzung des Inokulums17 sowie für die Testorganismen (vgl. MADIGAN, MARTINKO,
17
Inokulum: In der Biotechnologie wird darunter eine bestimmte Zellmenge verstanden, mit der z. B. ein
Fermenter angeimpft werden kann.
57
STAHL u. CLARK, 2013, S. 1117f.). Wie solch ein Test aussehen kann, zeigt die folgende
Abbildung:
Abbildung 27: MIK-Bestimmung mittels der Verdünnungsmethode bzw. des Röhrchenverdünnungstests. Die
Trübung nimmt von links nach rechts ab (vgl. MADIGAN, MARTINKO, STAHL u. CLARK, 2013, S. 1118).
Eine ebenfalls weit verbreitete Methode ist der Agardiffusionstest. Dafür wird zunächst
ein Agarmedium mit einer Bakterienkultur überschichtet. Die Testsubstanz wird dann
mittels getränkter Filterplättchen auf den Agar aufgebracht. Die antimikrobielle Sub-
stanz dringt während der Inkubation durch Diffusion in das Testmedium ein und entfal-
tet seine Wirkung. Reagiert ein Mikroorganismus sensibel auf das Antibiotikum, hat das
eine Hemmung des Wachstums zur Folge. Zu erkennen ist dieser Effekt daran, dass sich
um die Auftragsstelle ein sogenannter Hemmhof bildet. Der Mikroorganismus wächst
also nur bis zu einem bestimmten Bereich. Die Hemmzone ist dann also frei von Kolo-
nien. Der Durchmesser dieser im besten Fall kreisrunden Zone wird ausgemessen und
mit dem Wachstum des Mikroorganismus in Korrelation gesetzt. Dieses Verfahren wird
in der Routine oft verwendet, weil die Auftragung der Agenzien mittels eines Stempels
zeitsparend von statten geht und über kommerziell erworbene Agarplatten auch eine
empfindliche Fehlerquelle, nämlich die Schichtdicke der Platte, weitestgehend ausge-
schlossen werden kann (vgl. MADIGAN, MARTINKO, STAHL u. CLARK, 2013, S. 1118f.).
58
Abbildung 28: Prüfung der Wirksamkeit von acht verschiedenen Antibiotika gegenüber Bacillus cereus (gram
+, Stäbchen) (vgl. ALEXANDER u. STRETE, 2006, S. 121).
12.1.1 Antibiotika
Unter der Bezeichnung Antibiotikum werden natürlich vorkommende Substanzen zu-
sammengefasst, die eine antimikrobielle Wirkung haben. Als Produzenten sind eine Viel-
zahl von Pilzen und Bakterien bekannt. Das vermutlich bekannteste Antibiotikum ist
Penicillin, das von einem Schimmelpilz der Gattung Penicillium synthetisiert wird. Seine
Entdeckung geht auf Sir Alexander Flemming zurück, der im Jahr 1921 mit der Isolierung
des Enzyms Lysozym18 beschäftigt war. Im Jahr 1928, Flemming war weiter mit der Un-
tersuchung von Lysozym beschäftigt, bemerkte er einen Schimmelpilz in seinen Bakteri-
enkulturen, dessen Wachstum zu einer Keimreduktion geführt hatte. Aufgrund dieser
zufälligen Beobachtung und weiterer Untersuchungen konnte schließlich das uns be-
kannte Antibiotikum Penicillin entwickelt werden. In der Behandlung von Infektions-
krankheiten sind Antibiotika nicht mehr wegzudenken. Die natürlich vorkommenden
Antibiotika wurden im Laufe der Zeit im Labor strukturell verändert, mit dem Ziel die
Wirksamkeit zu erhöhen. Die Herstellung dieser halbsynthetischen Antibiotika erfolgt
heute überwiegend großindustriell. Wichtige Angriffspunkte der heutigen Antibiotika
sind die Ribosomen, die Zellwand, die Cytoplasmamembran oder die DNA-Synthese.
18
Lysozym: Ein Enzym, dass die Bakterienzellwand von Bakterien zerstören (lysieren) kann und u. a. im
Hühnerei vorkommt.
59
Abbildung 29: Selektivmedium für Streptomyces spp. zur Identifizierung von Antibiotikabildnern. Zu sehen
sind verschiedene Streptomyceten, von denen einige ein Antibiotikum bilden (Hemmhöfe) (vgl. MADIGAN,
MARTINKO, STAHL u. CLARK, 2013, S. 606).
12.1.1.1 ß-Lactam-Antibiotika
Die Gruppe der ß-Lactam-Antibiotika wird charakterisiert durch den ß-Lactam-Ring und
wird von einer Vielzahl von Pilzen der Gattung Penicillium (z. B. Penicillium chrysogen-
um) und Aspergillus synthetisiert. Auch bestimmte Prokaryoten sind in der Lage, diese
Antibiotikaklasse zu bilden. Wichtige Vertreter dieser Gruppe sind neben den Penicilli-
nen die Cephalosporine (Cephalosporium acremonium) (vgl. MADIGAN, MARTINKO, STAHL u.
CLARK, 2013, S. 607).
Die Wirkung dieser Antibiotika beruht, dass der ß-Lactam-Ring aufgespalten wird und
die Komponenten an Enzyme binden. Diese Enzyme synthetisieren das Murein, ein für
die Prokaryoten charakteristischer Zellwandbestandteil. Unter physiologischen Bedin-
gungen herrscht ein Gleichgewicht zwischen den Enzymen, die das Mureinnetz spalten
und den Enzymen, die die entstandenen Lücken wieder schließen. Dadurch, dass die ß-
Lactam-Antibiotika die mureinaufbauenden Enzyme binden, verschiebt sich das Gleich-
gewicht auf die Seite der abbauenden Enzyme. Die Folge ist die Zelllyse. Das bedeutet
für den Einsatz dieser Antibiotika, dass er nur bei wachsenden Bakterien sinnvoll ist (vgl.
SPEKTRUM.DE, 1999).
12.1.1.1.1 Amoxicillin
Amoxicillin ist ein sogenanntes Breitbandantibiotikum, d. h. es wirkt auf ein weites Bak-
terienspektrum. Einzuordnen ist es in die Gruppe der Aminopenicilline und ist somit ein
beta-Lactam-Antibiotikum. Eine entsprechende Wirkung (Störung der Zellwandsynthese)
zeigt sich sowohl bei gram negativen wie auch bei gram positiven Bakterien. Amoxycillin
wie auch Ampicillin sind beta-lactamseempfindlich, wodurch es zu einer Unwirksamkeit
kommen kann, wenn bestimmte Erreger dieses Enzym bilden (vgl. SIGMA ALDRICH, 2016
und FILLE, HAUSDORFER, DIETRICH und MIKSITIS, 2009, S. 720).
60
Abbildung 30: Strukturformel von Amoxicillin (vgl. SIGMA-ALDRICH, 2016).
12.2 Durchführung
12.2.1 Herstellung des Inokulums (wird gestellt)

• 0,2 g Nährbouillon werden in 25 ml VE-Wasser gelöst
• Die Suspension wird auf fünf Reagenzgläser verteilt
• Die Reagenzgläser werden mit Kapsenbergkappen (Aluminiumkappen) verschlos-
sen und autoklaviert (121 °C, 15 min)
• Nach dem Autoklavieren werden die sterilen Bouillons mit E. coli K12/Probe be-
impft und anschließend über Nacht bei 37 °C inkubiert.
12.2.2 Herstellung des Agars (Agarplatten werden gestellt)

Anmerkung: Die Petrischalen a - c dienen der Erstellung einer Kalibrierkurve, die Pet-
rischalen d und e sind für die unbekannten Proben. Es werden jeweils Dreifachbestim-
mungen durchgeführt.
• 5,75 g Nähragar in 250 ml VE-Wasser lösen (ein Ansatz reicht für zwei Gruppen)
• Der pH-Wert wird überprüft und bei Bedarf auf pH 7,2 eingestellt.
• Der Nähragar wird autoklaviert.
• Nach dem Autoklavieren wird der Agar auf ca. 40 °C abgekühlt und unter sterilen
Bedingungen zu je 20 ml in Petrischalen pipettiert.
• Die Platten werden zum Erstarren zur Seite gestellt.
12.2.3 Beimpfen der Agarplatten

Bereiten Sie sich bitte insgesamt fünf Petrischalen nach dem folgenden Schema vor:
Tabelle 8: Schema für die zu beimpfenden Petrischalen (eigene Darstellung).

Amoxicillinkonzentrationen
Petrischalen Beimpft mit:
[µg/ml]
A -C E. coli K12 2, 10, 25, ?
D Probe 1 2, 10, 25, ?
E Probe 2 2, 10, 25, ?
61
• Von dem Inokulum werden jeweils 3 ml E. coli K12 mit einer sterilen Pipettenspit-
ze entnommen und auf die Agarplatten gegeben.
• Die Agarplatten kurz auf der Tischfläche kreisen und anschließend trocknen las-
sen.
• Vom Laborpersonal erhalten Sie zwei unbekannte Proben, die Sie wie zuvor be-
schrieben behandeln
• Wenn die Agarplatten getrocknet sind, wird der Stempel mit den Antibiotikakon-
zentrationen (2, 10 und 25 µg/ml) auf die Platten gesetzt und einmal gestempelt.
12.2.4 Inkubation
Die Agarplatten werden für 24 h bei 37 °C bebrütet.
12.3 Auswertung
Erstellen Sie sich zunächst die Kalibrierkurve, in dem Sie die entstandenen Hemmhöfe in
mm messen. Bilden Sie den Mittelwert und tragen Sie diesen gegen die Amoxicillinkon-
zentration auf.
Legen Sie anschließend eine Trendlinie (linear) durch die Punkte und ermitteln Sie die
Geradengleichung.
Erstellen Sie eine Tabelle und beurteilen Sie die Wirksamkeit des Antibiotikums. Wenn
kein sichtbarer Hemmhof zu sehen ist, wird das Ergebnis mit ≤ 6 mm bezeichnet. Ermit-
teln Sie außerdem die unbekannte Amoxicillinkonzentration.
Anmerkung: y-Achse: Mittelwert der Hemmhöfe; x-Achse: Amoxicillinkonzentration. Im

Kalibrierdiagramm werden nur die Punkte eingetragen (keine Punkt-zu-Punkt-Verbind-
ung). Legen Sie durch die Punkte eine lineare Trendlinie. Lassen Sie sich die Geradenglei-
chung sowie das Bestimmtheitsmaß angeben. Klicken Sie dazu auf die Trendlinie und
setzen Sie an den entsprechenden Stellen die Häkchen.
Diskutieren Sie die Ergebnisse sowie evtl. auftretende Fehler. Abweichungen vom Skript
sollten notiert werden.
62
Literatur- und Quellenverzeichnis

ALEXANDER, S. und STRETE, D., 2006: Mikrobiologisches Grundpraktikum. Ein Farbatlas.
Pearson: München.
BACTERIA IN PHOTOS: E. coli auf Blut-Agar,

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GOODMAN, 2009: Colony of Streptomyces,

http://www.microbeworld.org/component/jlibrary/?view=article&id=1926
(aufgerufen am 20.01.2016).
HECHT ASSISTENT, o. J.: Thomazählkammer, http://www.hecht-assistent.de/183/ (aufgeru-

fen am 15.03.17).
LO LABOROPTIK, o. J.: Zählkammer Thoma,

http://images.google.de/imgres?imgurl=http%3A%2F%2Fwww.zaehlkammer.de%2Fgfx
%2Fbuerker.jpg&imgrefurl=http%3A%2F%2Fwww.zaehlkammer.de%2Fdetsch%2Fbuerk
er.html&h=380&w=350&tbnid=Ebd9pf8g1KBGkM%3A&docid=3cSeBKtO9fkcdM&ei=Kha
eVs6aGsGDO7rhgJAJ&tbm=isch&iact=rc&uact=3&dur=1315&page=1&start=0&ndsp=20
&ved=0ahUKEwjO1-Ot27XKAhXBwQ4KHbowAJIQrQMIOzAK (aufgerufen am
19.01.2016).
MADIGAN, M. T., MARTINKO, J. M., STAHL, D. A. und CLARK, D. P., 2013: Brock Mikrobiologie,
Pearson: München.
MIDGLEY, D., 2006: Aspergillus fumigatus from soil in culture.
RESEARCHGATE, 2014: How to identify Salmonella from Proteus in normal Salmonella se-
lective media?,
https://www.researchgate.net/post/How_to_identify_Salmonella_from_Proteus_in_nor
mal_Salmonella_selective_media (aufgerufen am 20.01.2016).
SEILNACHT, T. o. J.: Zentrifugieren, http://www.seilnacht.com/versuche/zentrif.html (auf-

gerufen am 15.03.17).
SIGMA-ALDRICH, 2016:
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/amoxicillin365402678778011?lang=d
e&region=DE (aufgerufen am 15.03.17).
STEINBÜCHEL, A. u. OPPERMANN-SANIO, F. B., 2003: Mikrobiologisches Praktikum. Versuche

und Theorie, Springer: Berlin Heidelberg.
XIII
Anhang
UV/VIS-Spektroskopie
Für das Labor erfolgt an dieser Stelle zum besseren Verständnis eine kurze Einführung in
die analytische UV-VIS-Spektroskopie.
Wenn man einen Lichtstrahl gleicher Wellenlänge λ (monochromatisches Licht), dessen

Intensität I (Energie pro Sekunde bezogen auf einen Querschnitt von 1 A ) betragen
soll, durch eine dünne Schicht mit der Dicke dx leitet, wird ein Bruchteil absorbiert. Die
Intensität W ist um die Größe dI kleiner geworden, die wiederum proportional der
Schichtdicke dx ist.
W œ∙W∙
W = Änderung der Intensität

œ = Absorptionskoeffizient
W = Intensität
= Schichtdicke
Durch Integration
• M
W
{ {œ ∙
W
•| \
und umformen erhält man:
W W\ ∙ /ž∙M
Wobei W\ die ursprüngliche Intensität darstellt. Bei Erfüllung des dekadischen Logarith-
mus erhält man:
W
0,4343 ∙ œ ∙ }
W\
} wird als Extinktion bezeichnet und das Produkt 0,4343 œ als Extinktionskoeffizient.
Dieses Gesetz wurde von J. H. Lambert (1760) formuliert. Das Verhältnis der Lichtintensi-
•
täten Ÿ •|
wird als Durchlässigkeit bezeichnet. A. Beer (1862) fand nun, dass der Ex-
tinktionskoeffizient proportional der Konzentration c des absorbierenden Stoffes ist. Die
Erkenntnisse der beiden Entdecker werden heute als Lambert-Beer-Gesetz zusammen-
gefasst:
} •∙A∙
XIV
• ist der molare dekadische Extinktionskoeffizient. Er entspricht dem reziproken Wert

der Schichtdicke, die bei einer 1 molaren Lösung die Intensität auf 10 % ihres ursprüngli-
chen Wertes herabsetzt. Mit Hilfe des Lambert-Beer’schen-Gesetzes kann man die Kon-
zentration eines farbigen Stoffes bestimmen. Allerdings ist dieses Gesetz nur für sehr
verdünnte Lösungen gültig. Aus diesem Grund werden Eichkurven erstellt, mit denen
sich die Konzentrationen berechnen lassen.
Diese Methode wird auch zur Bestimmung des Biomassegehaltes in Fermentationsme-

dien verwendet. Dabei wird die durch Lichtstreuung hervorgerufene scheinbare Extink-
tion einer keimhaltigen Lösung bei 600 nm (ein Wellenlängenbereich zwischen 500 bis
600 nm ist für die Messung geeignet) gegen steriles Nährmedium als Referenz gemes-
sen. Für E. coli gilt näherungsweise E600 ~ 8 ∙ 108 Zellen/ml. Bei dieser Bestimmung ist
vorher auszutesten bis zu welchen Bereich die Extinktion noch linear mit der Keimzahl
verläuft.
In der Literatur gibt es dazu unterschiedliche Angaben die zwischen einer Extinktion von
0,3 und 1,0 variieren. Grund dafür ist die Tatsache, dass Licht, das an einer Zelle gestreut
wurde, bei hohen Keimzahlen erneut an einer anderen Zelle zurück in den Lichtweg des
Photometers gestreut werden kann. Unter solchen Bedingungen werden dann zu niedri-
ge Extinktionen gemessen. Außerdem ist zu berücksichtigen, dass es während der Fer-
mentation zu einer Ver- oder Entfärbung des Nährmediums kommen kann was in der
Folge zu einer Verfälschung des Messergebnisses führt. Außerdem sollte man bei den
Messungen berücksichtigen, dass die Standardabweichungen bei Messungen unterhalb
einer Extinktion von 0,150 relativ groß sind und damit die Messungen ungenau werden.
Abbildung 31: Trübungsmessung des mikrobiellen Wachstums: a) Das Bild zeigt das grundlegende Prinzip
der Spektroskopie anhand der eingesetzten Bauteile. Am Ende steht die Photozelle, die das nicht gestreute
Licht misst und es als sogenannte optische Dichte wiedergibt; b) Die Abbildung zeigt das Wachstum zweier
Mikroorganismen mit unterschiedlichen Wachstumsgeschwindigkeiten; c) Das Verhältnis zwischen der
Zellzahl bzw. dem Trockengewicht und den Trübungsmesswerten. Weiter ist hier ein nahezu 1:1-Verhältnis
zu erkennen, dass allerdings bei hohen Trübungen nicht mehr gilt (vgl. MADIGAN, MARTINKO, STAHL und CLARK,
2013, S. 182).
XV
Grundregeln guter mikrobiologischer Technik (GMT)

Anmerkung: Die hier genannten Regeln können auch als allgemein gültig bezeichnet
werden und können somit auch für die anderen Labore angewendet werden.
Quelle: G Chemie, Merkblatt B003 1/92 - Sichere Biotechnologie Anhang 1
Allgemeine Regeln:
• Während der Arbeitsvorgänge sollen die Fenster und Türen geschlossen sein.
• Das Trinken, Essen und Rauchen ist in den Arbeitsräumen untersagt. Lebensmittel
dürfen nicht in den Arbeitsräumen aufbewahrt werden.
• Es ist ein Laborkittel und eine Schutzbrille zu tragen.
• Das Pipettieren mit dem Mund ist untersagt. Es sind Pipettierhilfen zu benutzen.
• Spritzen und Kanülen sollen nur dann benutzt werden, wenn es absolut nötig ist.
Anmerkung: Die gebrauchten Kanülen sind ausschließlich in den entsprechenden Ab-

wurfboxen zu entsorgen.
• Aerosolbildungen sollten vermieden werden.

• Nach Beendigung der Arbeit sowie vor dem Verlassen des Arbeitsbereiches sind
die Hände sorgfältig mit Seife zu waschen. Gegebenenfalls sollte ein Händedesin-
fektionsmittel verwendet werden. Zur Pflege der Hände kann eine Handcreme zur
Rückfettung verwendet werden.
• Die Arbeitsplätze sind sauber und aufgeräumt zu halten. Es befinden sich nur die
tatsächlich verwendeten Geräte und Werkzeuge am Arbeitsplatz.
• Vorräte sind nur in den bereitgestellten Schränken zu verwahren.
• Die biologischen Agenzien sind auf ihre Identität hin zu überprüfen, vor allem im
Hinblick auf die Erstellung von Gefährdungspotentialen.
• Die Beschäftigten sind vor der Aufnahme der Tätigkeit und danach mindestens
einmal jährlich mündlich und arbeitsplatzbezogen zu unterweisen.
• Unerfahrene Mitarbeiter/Beschäftigte (insbesondere auf den Gebieten der Mik-
robiologie, Virologie und Zellbiologie) sind besonders sorgsam zu unterweisen,
anzuleiten und zu überwachen.
• Ungeziefer muss wenn nötig regelmäßig entfernt werden.
Anmerkung: Je nach Gefährdungspotential19 müssen die Regeln bzw. Arbeitsweisen

angepasst werden.
19
Änderungen müssen vorgenommen werden, wenn z. B. mit humanpathogenen Mikroorganismen gearbei-
tet wird.
XVI
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Labor: Mikrobiologie

Wissen durch Praxis stärkt

Abkürzungs- und Symbolverzeichnis ................................................................................. XII

1 Theoretische Grundlagen zum Praktikum ................................................................... 2

2 Grundlagen des mikrobiologischen Arbeitens .......................................................... 13

3 Versuch 1: Volumenmessung und Aufnahme von Mikroorganismen ...................... 15

4 Versuch 2: Mikroskopie und Darstellung von morphologischen Merkmalen........... 18

5 Versuch 3: Bestimmung der Zellzahl in Populationen einzelliger

6 Versuch 4: Morphologische/cytologische Beschreibung und biochemische

7 Versuch 5: Direktisolierung von fluoreszierenden Pseudomonaden aus

8 Versuch 6: Hitzeinaktivierung von Mikroorganismen ............................................... 36

9 Versuch 7: Gravimetrische Bestimmung der Zellmasse ............................................ 39

10 Versuch 8: Aufnahme einer Wachstumskurve von Vibrio natriegens ...................... 44

11 Versuch 9: Bestimmung des Gesamtausbeutekoeffizienten des von

12 Versuch 10: Agardiffusionstest ................................................................................. 57

Literatur- und Quellenverzeichnis .................................................................................... XIII

Anhang ............................................................................................................................. XIV

Abkürzungs- und Symbolverzeichnis ................................................................................. XII

1 Theoretische Grundlagen zum Praktikum ................................................................... 2

1.1 Überblick über die Mikroorganismen..................................................................... 2

1.1.1 Zellstrukturen von pro- und eukaryotischer Zellen ........................................ 2

1.2 Nährmedien ............................................................................................................ 5

1.2.1 Definierte Medien........................................................................................... 7

1.2.2 Komplexe Nährmedien ................................................................................... 7

1.2.3 Universal-, Selektiv- und Differenzierungsnährböden.................................... 7

1.3 Sterilisation ............................................................................................................. 7

1.3.1 Sterilisation durch Hitze.................................................................................. 7

1.3.2 Autoklav .......................................................................................................... 8

1.3.3 Hitzeschrank ................................................................................................... 8

1.3.4 Sterilfiltration .................................................................................................. 8

1.4 Mikroskopie ............................................................................................................ 9

1.5 Parameter zur Fehlerrechnung............................................................................. 11

1.5.1 Mittelwert und Streumaße ........................................................................... 11

1.5.1.1 Fehlerart: Systematischer Fehler .......................................................... 11

1.5.1.1 Fehlerart: Zufallsfehler .......................................................................... 11

2 Grundlagen des mikrobiologischen Arbeitens .......................................................... 13

2.1.1 Mess- und Volumenpipetten ........................................................................ 13

2.1.2 Kolbenhubpipetten ....................................................................................... 14

2.1.3 Messzylinder ................................................................................................. 14

3 Versuch 1: Volumenmessung und Aufnahme von Mikroorganismen ...................... 15

3.1 Teilversuch: Volumenmessung mit Pipetten........................................................ 15

3.1.1 Durchführung ................................................................................................ 15

3.1.2 Auswertung ................................................................................................... 15

3.2 Teilversuch: Volumenmessung mit Bechergläsern und Messzylinder ................. 15

3.2.1 Durchführung ................................................................................................ 15

3.2.2 Auswertung ................................................................................................... 15

3.3 Teilversuch: Isolierung von Keimen aus der Luft.................................................. 16

3.3.1 Durchführung ................................................................................................ 16

3.3.2 Auswertung ................................................................................................... 16

3.4 Teilversuch: Abklatschversuche ........................................................................... 16

3.4.1 Durchführung ................................................................................................ 16

3.4.2 Auswertung ................................................................................................... 16

4 Versuch 2: Mikroskopie und Darstellung von morphologischen Merkmalen........... 18

4.1 Vorbereitung der Zellen ....................................................................................... 18

4.1.1 Native Präparate ........................................................................................... 18

4.1.2 Vorbereitende Hitzefixierung für Färbungen ............................................... 18

4.2 Teilversuch: Einfachfärbung ................................................................................. 18

4.3 Teilversuch: Gramfärbung .................................................................................... 19

4.3.1 Chemikalien .................................................................................................. 19

4.3.2 Durchführung ................................................................................................ 19

4.3.3 Auswertung ................................................................................................... 19

4.4 Teilversuch: Endosporenfärbung.......................................................................... 19

4.4.1 Einführung .................................................................................................... 19