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1.4.4.2 Antikrper - Bildung und Struktur Antikrper dienen als Bestandteil des Immunsystems zur Erkennung krperfremder Substanzen.

Sie binden an diese, um sie dadurch zu markieren und zu greren Einheiten zu vernetzen. Die so markierten Substanzen werden von anderen Zellen des Immunsystems, den Phagozyten, erkannt und vernichtet. Antikrper werden vom Immunsystem als Immunantwort auf die Gegenwart eines Fremdkrpers (Antigens) gebildet. Als Antigen versteht man Substanzen, an die Antikrper binden knnen. Ein Immunogen ist dagegen eine Substanz, die eine Immunantwort, d.h. die Bildung von Antikrpern auslsen kann. Ein Hapten ist eine Substanz, an die Antikrper binden knnen, das jedoch keine Immunantwort auslst. Ein Hapten ist daher ein Antigen, nicht jedoch ein Immunogen [57]. Immunogene mssen fr den Wirtsorganismus als krperfremd erkannt werden, um den Abwehrmechanismus auszulsen. Die Immunogenitt wird nicht durch das Molekl als Ganzes, sondern nur von Teilbereichen, den sog. Epitopen oder antigenen Determinanten hervorgerufen. Diese Bereiche werden von den Antikrpern erkannt. Ein Immunogen kann mehrere Epitope enthalten, die mit verschiedenen Antikrpern reagieren. Die phylogenetische Verwandtschaft des Immunogens zum Wirtsorganismus hat entscheidenden Einflu auf dessen Wirkung. Eine nahe Verwandtschaft hat eine geringe, aber spezifische Immunantwort zur Folge [57]. Antikrper befinden sich in der gamma-Globulinfraktion des Blutserums von Sugern und Vgeln. Sie werden daher Immunglobuline genannt [58]. Alle Immunglobuline (Ig) haben die gleiche Grundstruktur, bestehend aus 4 Polypeptidketten, die durch Disulfidbrcken kovalent verbunden sind. Fr die Antigen-Antikrper-Reaktion ist die Tertirstruktur und damit die Primrstruktur des Antikrpers entscheidend. Es gibt zwei Arten von Ketten, sogenannte schwere und leichte. Beide besitzen bezglich ihrer Primrstruktur sowohl konstante als auch variable Regionen. Jedes Immunglobulinmolekl ist symmetrisch aufgebaut und besteht aus zwei identischen schweren und zwei identischen leichten Ketten (Abb. 1-4). Schwere Ketten besitzen 3 konstante (cH1 - cH3) und eine variable (vH) Region, leichte Ketten besitzen je eine konstante (cL) und eine variable (vL) Domne. Die variablen Domnen bilden die Antigenbindungsstellen. Die vier Ketten bilden eine Y- bzw. Tartige Struktur.

Die Immunglobuline werden in Klassen eingeteilt. Bei Human-Immunglobulinen z.B. kennt man die 5 Klassen IgG, IgM, IgA, IgD und IgE. Sie unterscheiden sich durch die konstanten Regionen der schweren Kette sowie durch ihr Vorkommen als Mono- oder Polymere. So kommt IgA sowohl als Mono- als auch als Dimer vor, whrend IgM grundstzlich als Pentamer vorliegt. Die unterschiedlichen Ketten werden entsprechend mit den griechischen Buchstaben gamma, , alpha, delta und epsilon bezeichnet. Bei der gamma-Kette sind 4, bei der alpha-Kette 2 Variationen bekannt: gamma1 - gamma4 sowie alpha1 und alpha2. Sie bestimmen die Unterklasse (Isotyp) der Immunglobuline (IgG1 - IgG4; IgA1, IgA2). Beim Kaninchen dagegen sind keine IgG-Unterklassen bekannt [57]. Jede Ig-Klasse hat ihren charakteristischen Kohlenhydratgehalt, IgG z.B. enthlt 3 % Kohlenhydrate. Polymere Immunglobuline besitzen eine zustzliche J-Kette. IgA wird teilweise in Krperflssigkeiten, z.B. Speichel sekretiert. Fr den Vorgang der Sekretion bentigt es eine Sekretionskomponente (SC) [57]. Bei den leichten Ketten sind kappa- und lamda-Ketten bekannt. Im Folgenden wird nur noch das wichtigste Immunglobulin, das IgG behandelt. Das im Laufe dieser Arbeit ebenfalls verwendete IgY aus Eidottern wird in Kapitel 1.5.3.2 beschrieben. Im Humanserum findet man 1000 mg IgG/100 ml Serum [57], Harlow und Lane [59] geben 800 - 1600 mg/100 ml an. Sie machen 80 % der Globulinfraktion aus [57]. Die schwere Kette des IgG hat ein Molekulargewicht von 50.000 Da [57] bis 55.000 Da [62], die leichte Kette von 25.000 Da. Ein Immunglobulinmolekl hat damit eine molare Masse von 150 - 160.000 Da. Behandelt man Immunglobuline unter geeigneten Bedingungen mit Papain, so erhlt man 2 antigenbindende Fragmente (Fab; Fragment, antigenbindend) und ein Fragment, das nicht an der Antigenbindung beteiligt ist. Dieses Fragment konnte in kristalliner Form dargestellt werden

und wird daher als Fc (Fragment, kristallisierbar) bezeichnet. Es ist fr verschiedene Funktionen, u.a. den placentalen Transfer von IgG verantwortlich [57]. Die flexible, enzymsensitive Region wird Scharnier-Region (hinge region) genannt. Bei Behandlung mit Pepsin entsteht ein bivalentes antigenbindendes Fragment und ein nicht antigenbindendes Fragment, das etwas kleiner ist als jenes, das bei Papainbehandlung entsteht. Diese Fragmente werden als F (ab')2 und Fc' bezeichnet. Das F(ab')2-Fragment kann durch Cystein in 2 Fab' gespalten werden, ohne die antigenbindenden Fragmente zu beschdigen [57, 59, 60]. 1.4.4.3 Anforderungen an das Trgermaterial Ein idealer Trger fr die Immunaffinittschromatographie sollte eine porse Struktur und damit eine groe Oberflche haben, leicht zu derivatisieren sein, eine hydrophile, aber ungeladene und inerte Oberflche besitzen, keine unspezifische Adsorption zeigen sowie mechanisch, mikrobiologisch und chemisch stabil sein. Die Poren mssen so gro sein, da sowohl Antikrper als auch Antigen in sie eindringen knnen [48, 50, 61, 62]. Diese Anforderungen sind gleichzeitig nicht optimal zu erfllen, so da ein geeigneter Kompromi gefunden werden mu. Als Trger werden verschiedene Materialien verwendet. Dazu gehren:

Agarose wird am hufigsten eingesetzt. Quervernetzung fhrt zu einer hheren mechanischen Stabilitt, die jedoch fr die Hochdruck-IAC nicht ausreichend ist [48, 63]. Polyacrylamid hat besonders gute chemische Eigenschaften: Es ist zwischen pH 2 und pH 10 stabil und tolerant gegen verdnnte organische Suren. Die Poren von Polyacrylamid sind jedoch bei gengend hoher Quervernetzung, ber die die Stabilitt des Gels zu steuern ist, zu klein, um ein Eindringen von Antikrpern zu ermglichen [48]. Silica ist sehr druckstabil, eignet sich daher auch zu Hochdruckanwendungen. Problematisch ist jedoch, da Silica zu irreversibler Adsorption und Denaturierung von Proteinen neigt, wenn es nicht durch Derivatisierung mit einer hydrophilen Oberflche ausgestattet ist. Auerdem ist Silica empfindlich gegen hohe pH-Werte [48, 63]. Auch Cellulose wird als Trgermaterial verwendet. Sie ist jedoch nicht pors und nicht einheitlich [48].

1.4.4.4 Aktivierung des Trgermaterials Zur Immobilisierung von Antikrpern sind mehrere Verfahren mglich und blich. Wichtig ist bei allen Methoden, da der fr das jeweilige Immobilisierungsverfahren optimale Puffer und pH-Wert verwendet wird. Dabei ist auch zu bercksichtigen, da die Reaktionsbedingungen nicht die Antikrper schdigen. Von der Kopplungsmethode hngt auch die Stabilitt der resultierenden Bindung ab. Die ideale Kopplungs- und Aktivierungsreaktion erfllt die folgenden Bedingungen [50]:

Sie luft schnell ab. Sie ermglicht die Bildung einer stabilen, ungeladenen, kovalenten Bindung unter milden Reaktionsbedingungen. Verbleibende aktive Gruppen knnen durch hydrophile, ungeladene Gruppen einfach blockiert werden. Es werden billige, nicht toxische Reagenzien bentigt. Der Arbeitsaufwand ist gering.

Der Aktivierungsgrad des Trgers spielt in diesem Zusammenhang ebenfalls eine groe Rolle. Ist die Anzahl der aktiven Gruppen an der Matrix zu hoch (dieses ist bei den meisten kommerziell erhltlichen Materialien der Fall [64]), werden zu viele Antikrper gebunden. Die Antigenbindungsstellen sind so durch die rumliche Nhe untereinander sterisch gehindert [51, 65, 66]. Auerdem werden die Antikrper an mehreren Stellen gleichzeitig gebunden ("multi-site attachment" oder "multi-point attachment"), so da die Quartrstruktur verzerrt wird und die Aktivitt der Antikrper sinkt [62, 64]. Die spezifische Aktivitt der immobilisierten Antikrper sinkt also bei Erhhung der Antikrperdichte und bei Erhhung der Trgeraktivierung [50, 61, 62]. Dieses gilt allerdings nicht, wenn die Antikrperdichte unterhalb von 1 mg/ml Gel liegt [63, 65]. In diesem Fall ist die sterische Hinderung der Antigenbindungsstellen untereinander bedeutungslos. Die Bindung der Antikrper an mehreren Stellen kann durch Verringerung der aktiven Gruppen des Trgers und durch die richtige Wahl von pH-Wert und Reaktionszeit verhindert werden [65]. Ein wesentlicher Parameter zur Beurteilung der Antikrperdichte ist nicht die durchschnittliche Antikrperdichte, sondern die lokale Antikrperdichte. Findet die Kopplungsreaktion zu schnell im Verhltnis zur Diffusionsgeschwindigkeit der Antikrper in das Gel statt, so ist die Antikrperdichte an den Auenseiten der Gelpartikel hoch, whrend im Innern nur wenige Antikrper immobilisiert werden. Die lokale Antikrperdichte ist so stellenweise hoch, die durchschnittliche Dichte jedoch niedriger. Die Bindungskapazitt des Gels liegt aber aufgrund der sterischen Hinderung an den Orten hoher Antikrperdichten niedriger, als aufgrund der durchschnittlichen Antikrperdichte zu erwarten wre [66]. 1.4.4.5 Ungerichtete Immobilisierung Als aktive Gruppen des Antikrpers dienen Amino-, Sulfhydryl- oder Hydroxyfunktionen. Meistens werden die Antikrper ber Aminofunktionen an einen Cyanbromid-, NHydroxysuccinimid (NHS)-, Carbonyldiimidazol (CDI)-, Toluolsulfonylchlorid- (Tresyl-) oder Oxiran-aktivierten Trger gebunden [62]. Die aktive Gruppe sollte in jedem Fall ber einen Spacer an den Trger gebunden werden, um den daran zu koppelnden Antikrper auf Abstand zum Trger zu halten. Dadurch werden sterische Effekte vermindert [65]. Folgende Aktivierungsmechanismen werden eingesetzt:

Die Cyanbromid-Aktivierung ist die mit Abstand am hufigsten eingesetzte Methode (Abb. 1-5). Sie hat jedoch den Nachteil, da die entstehende Isoharnstoff-Bindung bei neutralem pH eine positive Ladung trgt und dadurch Ionenaustauscheffekte erzeugt, und da sie relativ unstabil besonders gegenber Nucleophilen ist. Dieses fhrt zum Verlust von Antikrpern bei mehrfachem Gebrauch des Materials ("ligand-leakage")

[48, 62, 63, 67, 68].

Die Aktivierung mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) ergibt eine stabile Amidbindung, die jedoch empfindlich gegenber Alkali ist. Bei neutralem und saurem pH ist jedoch kein Ligandenverlust zu beobachten [48, 62, 67]. Die Reaktion der NHS-Gruppe mit der Aminofunktion luft quantitativ ab [67]. Aus der Aktivierung mit Cabodiimid (CDI) resultiert eine stabile, ungeladene UrethanBindung ohne Ligandenverlust [48, 62, 68]. Die Tresylgruppe reagiert mit primren Aminen und Sulfhydrylgruppen und fhrt zu einer stabilen, sekundren Amin- oder Thioether-Bindung, jedoch ist auch hier wie bei der Cyanbromidaktivierung der Verlust von Antikrpern bei mehrfachem Gebrauch festzustellen [48, 62, 67]. Die Reaktionsausbeute bei der Immobilisierung ist nahezu quantitativ [67]. Ein oxiranaktivierter Trger bindet an primre Amino-, Sulfhydryl- und Hydroxylgruppen. Es entstehen stabile sekundre Amine, Thioether und Ether. Aktivierung mit Azlacton (Abb. 1-6). Die aktive Gruppe reagiert vorwiegend mit primren Aminen, so da eine Amidbindung entsteht. Auerdem ist die Reaktion mit Hydroxyl- und Sulfhydrylgruppen mglich.

Diese Kopplungsmethoden haben zur Folge, da die Antikrper in unterschiedlicher Orientierung zum Trger gebunden werden [62] ("statistische" oder "ungerichtete Kopplung") und die meisten Antikrper ihre Fhigkeit zur Bindung des Antigens verlieren (Abb. 1-7 a). Ursache dafr kann sein [51, 62, 64, 65, 69]:

Die Immobilisierung erfolgte an der Antigenbindungsstelle, die immer an den Nterminalen Enden des Proteins liegt. Da die terminalen Aminogruppen der

Antigenbindungsstelle einen geringeren pK-Wert haben und daher reaktiver sind, ist eine Kopplung an dieser Stelle wahrscheinlicher als an anderen Aminogruppen [62]. Eine Antigenbindungsstelle ist zur Matrix orientiert, so da sie sterisch gehindert ist.

Durch die genannten Effekte knnen nur 1 - 30 % der theoretischen Antikrperaktivitt nach der statistischen Kopplung genutzt werden [62, 64].

Tabelle 1-3 gibt eine bersicht ber die in der Literatur beschriebenen Anwendung der ungerichteten Immobilisierung von Antikrpern. Tab. 1-3: Exemplarische bersicht ber die ungerichtete Immobilisierung von Antikrpern in der Literatur (nicht vollstndig) Aktivierung Matrix Analyt Antikrper Quelle CNBr Agarose Lysozym Fragmente [70] Lysozym Fragmente [71] Lysozym monoklonal [51] Cytokinine polyklonal [72] humane Plasmaproteine monoklonal [65] Diethylstilbestrol polyklonal [73] Aflatoxin M1 polyklonal [74] strogene polyklonal [75] Tresyl Agarose Clenbuterol polyklonal [76] 19-Nortestosteron polyklonal [77] 19-Nortestosteron monoklonal [78] 19-Nortestosteron polyklonal [78] Virusproteine monoklonal [97] Penicillin G polyklonal [79] Tresyl Silica Lysozym Fragmente [80] Lysozym monoklonal [80] Tresyl synthetisches Polymer Prostaglandin F2a polyklonal [81] NHS Agarose Cytokinine polyklonal [72, 82] Virusproteine monoklonal [67] CDI Agarose [82]

CDI CDI Oxiran Oxiran Oxiran Aldehyd Aldehyd -

Silica synthetisches Polymer Agarose Silica synthetisches Polymer Agarose Silica -

Lysozym Cytokinine Lysozym Chloramphenicol Penicillin G Albumin Transferrin Carboxypeptidase A Meerrettichperoxidase Penicillin G Cytokinine Humanserumalbumin Cytokinine Cortisol

monoklonal polyklonal monoklonal monoklonal polyklonal polyklonal polyklonal monoklonal monoklonal polyklonal polyklonal polyklonal polyklonal polyklonal

[51] [72] [83] [51] [68] [79] [82] [83] [56] [52, 56] [63] [52, 63] [83] [72] [84] [72, 85] [86]

1.4.4.6 Gerichtete Immobilisierung Um die Nachteile der genannten Kopplungsmethoden zu umgehen, besteht die Mglichkeit, eine gerichtete Immobilisierung durchzufhren. Dabei werden die Antikrper mit ihrem Fc-Teil, der nicht an der Antigenbindung beteiligt ist, an den Trger gebunden (Abb. 1-7 b). Bei polyklonalen Antikrpern kann so die dreifache Kapazitt gegenber der statistischen Immobilisierung erreicht werden [64]. Auch fr die gerichtete Kopplung gibt es verschiedene Methoden:

Der Fc-Teil vieler IgG-Unterklassen bindet an Protein A. Immobilisiert man Protein A an einen unlslichen Trger, kann man daran die Antikrper binden. Durch Quervernetzung wird die Bindung stabilisiert [48, 87 - 89]. Durch Spaltung mit den proteolytischen Enzymen Pepsin oder Papain kann man den FcTeil der Immunglobuline abspalten. Die brigbleibenden Fab- bzw. F(ab)'2-Fragmente behalten ihre volle Antigenbindekapazitt. An der Stelle, an der der Fc-Teil abgespalten wurde, sind Sulfhydrylgruppen oder Disulfidbrcken lokalisiert, an denen man die FabTeile immobilisieren kann [69, 84]. Der gebruchlichste Weg fr die gerichtete Immobilisierung von Antikrpern fhrt ber den im Fc-Teil lokalisierten Kohlenhydratanteil der Immunglobuline an einen Aminooder Hydrazid-aktivierten Trger. Der Fc-Teil ist nicht an der Antigenbindung beteiligt. Durch enzymatische Oxidation oder die Oxidation mit Natriummetaperiodat kann an dieser Stelle eine Aldehydgruppe generiert werden. Unter milden Reaktionsbedingungen wurde kein Aktivittsverlust der Immunglobuline durch Oxidation von Aminosuren beobachtet [90, 91]. Die Aldehydgruppe reagiert mit dem Trger (Abb. 1-8).

Ein Hydrazid-aktivierter Trger ist gegenber einem mit Aminogruppen aktivierten Trger zu bevorzugen, da bei der Kopplung an ein primres Amin eine unstabile Schiffsche Base entsteht, die zur Stabilisierung reduziert werden mu. Die Reduktion kann zum Aktivittsverlust der Antikrper fhren. Auerdem kommt es zu Konkurrenzreaktionen zwischen den Aminofunktionen der Matrix und denen der Antikrper selbst, so da mit inter- und intramolekularer Vernetzung der Antikrper gerechnet werden mu. Auch dieses fhrt zum Aktivittsverlust. Immobilisiert man die oxidierten Antikrper an einen Hydrazid-aktivierten Trger, so kann man den pH-Wert des Kopplungspuffers senken, da der pK-Wert des Hydrazids bei 3 liegt (prim. Amin: 9 - 10). Um die Hydrazidgruppe in der reaktiven unprotonierten Form vorliegen zu haben, reicht daher ein pH-Wert von 4,5 - 5,5. Die primren Aminofunktionen sind unter diesen Bedingungen noch protoniert und damit nicht reaktiv. Das entstehende Hydrazon ist stabil und bedarf keiner Reduktion [48, 62]. Die Reaktionsausbeute zwischen Hydrazid und Aldehyd betrgt ca. 80 % [67]. Die Vorteile der gerichteten Immobilisierung ber den Kohlenhydratrest der Immunglobuline kommen nicht zum Tragen, wenn auch der Fab-Teil Kohlenhydrate enthlt. Dieses ist bei einigen monoklonalen Antikrpern beobachtet worden [65]. Tabelle 1-4 gibt eine bersicht ber die Anwendungen fr die gerichtete Immobilisierung von Antikrpern in der Literatur. Tab. 1-4:Exemplarische bersicht ber die gerichtete Immobilisierung von Antikrpern in der Literatur (nicht vollstndig) Aktivierung Matrix Analyt Antikrper Quelle Protein A Controlled Pore Glass Human-IgG polyklonal [88] Protein A Agarose Adenosindeaminase monoklonal [87] Membranproteine monoklonal [89] Malein Agarose Maus-IgG Fragmente [69] sureimid [84] Hydrazid synthetisches Polymer Human-IgG polyklonal [62] Maus-IgG polyklonal [62] Hydrazid Agarose Humanplasmaproteine monoklonal [65] BSA polyklonal [84] Humanserumalbumin polyklonal [84] Virusproteine monoklonal [67] Human-IgG polyklonal [92]

Hydrazid

Cellulose

BSA BSA Human-IgG Maus-IgG Penicillin G Ovalbumin

polyklonal polyklonal polyklonal polyklonal polyklonal polyklonal

[64] [93] [94] [69] [79] [95]

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