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Durchgeführt bei
Ao.Univ.Prof. Mag. Dr.rer.nat. Robert Mach
Verfasser des Protokolls: Gwendolin Korinek 0625083 & Daniel Bomze 0726183
Inhaltsverzeichnis
1 Theoretischer Hintergrund 3
1.1 Aufgabenstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2 PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.3 Steriles und sauberes Arbeiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2 Praktische Durchführung 6
2.1 Vorbereitung der PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.2 PCR-Programm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.3 Behandlung mit Restriktionsenzym . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.4 Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
3 Auswertung u. Ergebnis 8
3.1 Scan des Agarosegels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
4 Anhang 10
4.1 Tabellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1 Theoretischer Hintergrund
1.1 Aufgabenstellung
Aufgabe war es das Prinzip der Polymerase Chain Reaction (PCR) an Hand der Ampli-
fikation eines DNA-Fragmentes zu verstehen und die PCR durchzuführen. Weiters sollte
die Analyse der amplifizierten DNA mit Hilfe des Restriktionsenzyms Hpa II durch-
geführt werden.
1.2 PCR
PCR steht für Polymerase Chain Reaction. Darunter versteht man den Vorgang mittels
Nukleotiden, einer Templat-DNA sowie einer Polymerase bestimmte DNA-Sequenzen
zu amplifizieren. Dabei wird im ersten Schritt die Templat-DNA mittels Hitze aufge-
”
schmolzen“ (darunter versteht man die Trennung der 2 verbunden DNA-Stränge in zwei
einzelne Stränge). Als nächstes kann sich der Primer, das ist ein Oligo-Nukleotid mit
einer bestimmten Basen-Sequenz, an die einzelnen DNA-Stränge anlagern (Annealing).
Die Anlagerung erfolgt typischerweise nur an einer bestimmten Stelle. Am 3’-Ende des
Primers beginnt die Polymerase, die neue DNA-Sequenz zu synthetisieren. Dafür sind
Nukleotide notwendig, die durch die Polymerase zu dem DNA-Strang verbunden werden.
Als Koenzym benötigt die Polymerase Magnesium-Ionen. Daher finden PCR-Reaktionen
stets in wässriger Lösung von Magnesiumsalzen (meist M gCl2 ) statt. Da gewöhnliche
Polymerasen bei Temperaturen von über 75 ◦ C längst denaturieren würden, ist es für
die PCR notwendig, spezielle Hochtemperatur-Polymerasen einzusetzen. Diese wurden
aus Mikroorganismen gewonnen, die man gewöhnlich in Geysiren oder in unmittelbarer
Nähe von Vulkanen findet. Ein Beispiel dafür ist die sogenannte Taq-Polymerase. Sie
wurde aus dem Bakterium Thermus aquaticus gewonnen, welches in Geysiren bei rund
70 ◦ C lebt.
man Restriktionsenzyme, die die DNA an bestimmten Stellen schneiden und somit DNA-
Fragmente mit charakteristischer Größe entstehen lassen. Somit kann überprüft werden,
ob wirklich die Teile der DNA-Sequenz amplifiziert worden sind, die erwünscht waren.
Da die Größe der DNA-Fragmente natürlich mit freiem Auge nicht sichtbar ist, bedarf
es einer Technik, die Fragmente ihrer Größe nach zu ordnen und anschließend sicht-
bar zu machen. Dazu bedient man sich der Gelelektrophorese und Anfärbung der DNA
mittels Ethidiumbromid. Die Gelelektrophorese nutzt die Tatsache, dass beim Anlegen
einer Spannung an ein Agarosegel Teilchen in Abhängigkeit ihrer Größe unterschiedlich
schnell im Gel wandern. Der Vernetzungsgrad lässt sich über die Konzentration des Gels
steuern. Je stärker das Gel vernetzt ist, desto langsamer können große Moleküle in ihm
wandern. Der Vernetzungsgrad muss daher auf die erwartete Molekülgröße angepasst
werden.
Durch die Zugabe von Ethidiumbromid in das Elektrophoresegel ist eine Sichtbarma-
chung der aufgetrennten DNA-Fragmente möglich. Dabei wird das Ethidiumbromid zwi-
schen die Basen der DNA eingebaut und dabei die Fluoreszenzausbeute von Ethidium-
bromid um den Faktor 50-100 erhöht. Wird nun das Gel mittels UV-Licht bestrahlt,
so erscheint das Gel dunkel und die mit Ethidiumbromid behandelten DNA-Fragmente
erscheinen rosa. Die Intensität der Fluoreszenzstrahlung hängt primär von der Menge
an DNA in der jeweiligen Bande ab (bei gleicher Wellenlänge des UV-Lichts).
2 Praktische Durchführung
2.2 PCR-Programm
Der Deckel des PCR-Gerätes wurde während der PCR auf 104 ◦ C geheizt, um ein Kon-
densieren des PCR-Gemisches am Deckel der Eppendorfgefäße zu verhindern. Das Tem-
peraturprogramm startete mit einem initialen Denaturierungsschritt bei 94 ◦ C für 60
Sekunden. Bei diesem Schritt sollte die Templat-DNA in ihre zwei Einzelstränge zerlegt
werden, sodass es den Primern anschließend möglich ist, sich auf den entsprechenden
Stellen anzulagern. Erst nach diesem Denaturierungsschritt startete der eigentliche zy-
klische Reaktionsschritt:
Denaturierungsschritt 94 ◦ C 45 s
Primer Anlagerung 54 ◦ C 60 s
Primerverlängerung (Synthese) 74 ◦ C 90 s
Diese Schritte wurden 30 mal wiederholt und anschließend wurde in einem letzten Schritt
die Temperatur von 74 ◦ C für 7 Minuten gehalten. Nach dieser Zeit wurde die Reaktion
auf 16 ◦ C abgekühlt.
2.4 Gelelektrophorese
Die Gelelektrophorese wurde auf einem Agarosegel durchgeführt. Zur Herstellung des
Agarosegels wurden 2,25 g Agarose in 150 mL TAE-Puffer aufgeschlämmt (entspricht
einem 1,5 %igem Gel) und diese Mischung anschließend in der Mikrowelle so lange er-
hitzt, bis eine klare Lösung entstanden war. Nachdem diese Lösung auf 50 ◦ C temperiert
worden war, konnten noch 5 µL Ethidiumbromid Lösung hinzugefügt werden. Anschlie-
ßend wurde das Gel in den Gelgießstand gegossen und mit einem Kamm versehen, der
die Taschen für die Probenaufgabe erzeugen sollte. Das Gel wurde bei Raumtemperatur
aushärten gelassen und bis zum nächsten Tag im Kühlschrank gelagert, um ein Aus-
trocknen zu verhindern.
Der Kamm wurde aus dem Gel entfernt und das Gel wurde in die Elektrophoresekammer
gelegt. Anschließend wurde der TEA-Puffer als Laufpuffer in die Kammer gefüllt. Eine
Mischung aus Xylencyanol, Bromphenolblau und Glycerin wurden als Loading Dye den
Proben zugesetzt. Das Glycerin diente dabei dazu, die Dichte der Lösung zu erhöhen,
sodass beim Pipettieren der Lösungen in die Elektrophoresetaschen keine Mischung der
Lösung statt findet, sondern sie direkt in die Taschen absinkt. Es wurden jeweils 40
µL PCR-Produkt mit 8 µL Loading Dye und 20 µL der Lösung mit den geschnitte-
nen DNA-Fragmenten mit 4 µL Loading Dye versetzt. Von diesen Mischungen wurden
jeweils 10 µL der PCR-Produkt-Lösung und 20 µL der Lösung mit den geschnittenen
DNA-Fragmenten in die Taschen pipettiert.
Außerdem wurden noch 2 Kammern mit einem DNA-Längen-Standard (GeneRuler 50bp
DNA Ladder) gefüllt, um anschließend die Größe der DNA-Fragmente bestimmen zu
können. Die Elektrophorese wurde bei 80 V und unlimitierten Strom für rund 1 Stunde
10 Minuten laufen gelassen.
Anschließend wurde das Gel aus der Elektrophoresekammer genommen und nach dem
Abtropfen des Laufpuffers mittels UV-Licht bestrahlt. Durch die Bestrahlung wurde
das interkalierte Ethidiumbromid zur Fluoreszenz angeregt und die dadurch sichtbaren
DNA-Banden konnten mit einer Kamera fotografiert werden.
3 Auswertung u. Ergebnis
Abbildung 3.1: Scan der mit Ethidiumbromid gefärbten DNA im Agarosegel nach der
Elektrophorese
Abbildung 3.1 zeigt das fotografierte Agarosegel unter UV-Licht nach der Elektrophorese.
Das Bild wurde in Schwarz/Weiß aufgenommen, um einen möglichst guten Kontrast
zwischen DNA-Banden und Agarosegel herzustellen.
Marker B1 P1 R1 P2 R2 P3 R3 B2 P4 R4 P5 R5 P6 R6 Marker
Tabelle 3.1 gibt das Aufgabeschema der Proben an. Marker steht für die DNA-Längen-
Standards, B1 und B2 sind die beiden Blank-Proben. R steht jeweils für die mit Restrik-
4 Anhang
4.1 Tabellen
Tabellenverzeichnis