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Protokoll zur Übung PCR

im Rahmen des Praktikums


Instrumentelles und Bioanalytisches Labor an der TU Wien

Durchgeführt bei
Ao.Univ.Prof. Mag. Dr.rer.nat. Robert Mach

Verfasser des Protokolls: Gwendolin Korinek 0625083 & Daniel Bomze 0726183

Versuche durchgeführt am 25.01.2010


PCR

Inhaltsverzeichnis

1 Theoretischer Hintergrund 3
1.1 Aufgabenstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2 PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.3 Steriles und sauberes Arbeiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2 Praktische Durchführung 6
2.1 Vorbereitung der PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.2 PCR-Programm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.3 Behandlung mit Restriktionsenzym . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.4 Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

3 Auswertung u. Ergebnis 8
3.1 Scan des Agarosegels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

4 Anhang 10
4.1 Tabellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

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PCR

1 Theoretischer Hintergrund

1.1 Aufgabenstellung
Aufgabe war es das Prinzip der Polymerase Chain Reaction (PCR) an Hand der Ampli-
fikation eines DNA-Fragmentes zu verstehen und die PCR durchzuführen. Weiters sollte
die Analyse der amplifizierten DNA mit Hilfe des Restriktionsenzyms Hpa II durch-
geführt werden.

1.2 PCR
PCR steht für Polymerase Chain Reaction. Darunter versteht man den Vorgang mittels
Nukleotiden, einer Templat-DNA sowie einer Polymerase bestimmte DNA-Sequenzen
zu amplifizieren. Dabei wird im ersten Schritt die Templat-DNA mittels Hitze aufge-

schmolzen“ (darunter versteht man die Trennung der 2 verbunden DNA-Stränge in zwei
einzelne Stränge). Als nächstes kann sich der Primer, das ist ein Oligo-Nukleotid mit
einer bestimmten Basen-Sequenz, an die einzelnen DNA-Stränge anlagern (Annealing).
Die Anlagerung erfolgt typischerweise nur an einer bestimmten Stelle. Am 3’-Ende des
Primers beginnt die Polymerase, die neue DNA-Sequenz zu synthetisieren. Dafür sind
Nukleotide notwendig, die durch die Polymerase zu dem DNA-Strang verbunden werden.
Als Koenzym benötigt die Polymerase Magnesium-Ionen. Daher finden PCR-Reaktionen
stets in wässriger Lösung von Magnesiumsalzen (meist M gCl2 ) statt. Da gewöhnliche
Polymerasen bei Temperaturen von über 75 ◦ C längst denaturieren würden, ist es für
die PCR notwendig, spezielle Hochtemperatur-Polymerasen einzusetzen. Diese wurden
aus Mikroorganismen gewonnen, die man gewöhnlich in Geysiren oder in unmittelbarer
Nähe von Vulkanen findet. Ein Beispiel dafür ist die sogenannte Taq-Polymerase. Sie
wurde aus dem Bakterium Thermus aquaticus gewonnen, welches in Geysiren bei rund
70 ◦ C lebt.

Die einzelnen Schritte wie Primeranlagerung, Strangsynthese und Denaturierung sind


temperaturabhängig. Daher wird ein Temperaturprogramm gefahren, sodass die jewei-
lige Temperatur für den jeweiligen Schritt ideal ist. Weiters ist es günstig, wenn der
Deckel des Eppendorfgefäßes, in dem die PCR durchgeführt wird, beheizt wird. Die Be-
heizung soll dabei eine höhere Temperatur erzielen als die höchste im PCR-Programm
verwendete Temperatur, um ein Kondensieren der Lösung am Deckel zu verhindern.
Die so gewonnene DNA kann anschließend noch charakterisiert werden. Dazu benutzt

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man Restriktionsenzyme, die die DNA an bestimmten Stellen schneiden und somit DNA-
Fragmente mit charakteristischer Größe entstehen lassen. Somit kann überprüft werden,
ob wirklich die Teile der DNA-Sequenz amplifiziert worden sind, die erwünscht waren.
Da die Größe der DNA-Fragmente natürlich mit freiem Auge nicht sichtbar ist, bedarf
es einer Technik, die Fragmente ihrer Größe nach zu ordnen und anschließend sicht-
bar zu machen. Dazu bedient man sich der Gelelektrophorese und Anfärbung der DNA
mittels Ethidiumbromid. Die Gelelektrophorese nutzt die Tatsache, dass beim Anlegen
einer Spannung an ein Agarosegel Teilchen in Abhängigkeit ihrer Größe unterschiedlich
schnell im Gel wandern. Der Vernetzungsgrad lässt sich über die Konzentration des Gels
steuern. Je stärker das Gel vernetzt ist, desto langsamer können große Moleküle in ihm
wandern. Der Vernetzungsgrad muss daher auf die erwartete Molekülgröße angepasst
werden.
Durch die Zugabe von Ethidiumbromid in das Elektrophoresegel ist eine Sichtbarma-
chung der aufgetrennten DNA-Fragmente möglich. Dabei wird das Ethidiumbromid zwi-
schen die Basen der DNA eingebaut und dabei die Fluoreszenzausbeute von Ethidium-
bromid um den Faktor 50-100 erhöht. Wird nun das Gel mittels UV-Licht bestrahlt,
so erscheint das Gel dunkel und die mit Ethidiumbromid behandelten DNA-Fragmente
erscheinen rosa. Die Intensität der Fluoreszenzstrahlung hängt primär von der Menge
an DNA in der jeweiligen Bande ab (bei gleicher Wellenlänge des UV-Lichts).

1.3 Steriles und sauberes Arbeiten


Beim Arbeiten mit DNA ist größtes Augenmerk auf sterile und saubere Arbeitsweise zu
legen. Da auf der menschlichen Haut sehr viele Nukleasen vorhanden sind (als Schutzme-
chanismus für den Körper), ist ein direkter Hautkontakt mit den Geräten und Lösungen
auf jeden Fall zu verhindern, da die Nukleasen sonst in die Reaktion eingebracht werden
könnten. Dies würde dazu führen, dass die frisch gebildete DNA sofort wieder abgebaut
wird. Weiters muss bedacht werden, dass durch das Einbringen von Hautschuppen o. Ä.
auch DNA in die Lösung gelangen kann, die dann eventuell anstelle der gewünschten
DNA amplifiziert wird. Eine Fremd-DNA Quelle können auch Mikroorganismen sein,
die quasi ubiquitär sind. Es muss daher darauf geachtet werden z.B. mit Pipettenspitzen
möglichst nirgends anzukommen, außer an den Lösungen und Gefäßen die unbedingt
notwendig sind. Außerdem müssen die Pipettenspitzen und Eppendorfgefäße sterilisiert
sein.
Ein anderer Grund für besonders sauberes Arbeiten ist die Mutagenität von Ethidium-
bromid. Ethidiumbromid interkaliert in die DNA und sorgt so für deren Anfärbung am
Agarosegel nach der Elektrophorese. Da die Interkalierung jedoch die DNA verändert,
führt das zu Mutation und kann somit zu bösartigen Tumoren führen. Es ist daher stets
darauf zu achten, dass Geräte die mit Ethidiumbromid in Berührung kommen speziell
gekennzeichnet und gereinigt werden. Das Arbeiten ist nur mit Nitrilhandschuhen zu

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empfehlen, da die Durchbruchszeit von Ethidiumbromid bei Latex-Handschuhen zwi-


schen 30 und 60 Sekunden liegt. Weiters dürfen Lösungen, die mit Ethidiumbromid
verunreinigt sind nicht direkt ins Abwasser eingebracht werden. Diese müssen erst mit
Aktivkohle behandelt werden, da diese das Ethidiumbromid adsorbiert und es somit aus
der Lösung abgeschieden wird. Die kontaminierte Aktivkohle kann anschließend durch
Thermobehandlung (Pyrolyse) unschädlich gemacht werden.

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2 Praktische Durchführung

2.1 Vorbereitung der PCR


In einem 500 µL Eppendorfgefäß wurden der so genannte Master Mix für die PCR in
fünffacher Menge zusammen pipettiert. Dabei wurde darauf geachtet, dass die Polymera-
se als letztes zugegeben wurde, da das Enzym sehr temperaturempfindlich ist und daher
alle folgenden Schritte auf Eis durchgeführt werden mussten. Obwohl die Taq-Polymerase
sehr temperaturbeständig ist, nimmt ihre Aktivität bei zunehmender Temperatur stark
ab, daher wird die Lösung so lange wie möglich bei niedrigen Temperaturen gehandhabt
und gelagert.
Als Primer wurden LR1 sowie SRCR eingesetzt. Der Name der Probe lautete ITS 117.
Die restliche Zusammensetzung des Probenansatzes ist in Tabelle 4.1 zusammengefasst.
Nachdem der Master Mix fertig gestellt wurde, wurden jeweils 45 µL Master Mix mit
5 µL Proben-DNA in einem kleinen Eppendorfgefäß gemischt. Außer den Gefäßen mit
den DNA-Templaten wurde auch noch eine sog. Blank-Probe hergstellt. Diese enthielt
alle Bestandteile des Master Mixes, allerdings ohne DNA-Template. Würden sich also
nach der PCR bei der Gelelektrophorese hier DNA Fragmente zeigen, so ließe das auf
eine Kontamination der Reagenzien schließen.

2.2 PCR-Programm
Der Deckel des PCR-Gerätes wurde während der PCR auf 104 ◦ C geheizt, um ein Kon-
densieren des PCR-Gemisches am Deckel der Eppendorfgefäße zu verhindern. Das Tem-
peraturprogramm startete mit einem initialen Denaturierungsschritt bei 94 ◦ C für 60
Sekunden. Bei diesem Schritt sollte die Templat-DNA in ihre zwei Einzelstränge zerlegt
werden, sodass es den Primern anschließend möglich ist, sich auf den entsprechenden
Stellen anzulagern. Erst nach diesem Denaturierungsschritt startete der eigentliche zy-
klische Reaktionsschritt:
Denaturierungsschritt 94 ◦ C 45 s
Primer Anlagerung 54 ◦ C 60 s
Primerverlängerung (Synthese) 74 ◦ C 90 s
Diese Schritte wurden 30 mal wiederholt und anschließend wurde in einem letzten Schritt
die Temperatur von 74 ◦ C für 7 Minuten gehalten. Nach dieser Zeit wurde die Reaktion
auf 16 ◦ C abgekühlt.

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2.3 Behandlung mit Restriktionsenzym


Um charakteristische DNA-Fragmente aus der amplifizierten DNA herzustellen, wurde
ein Aliquot von 10 µL des PCR-Ansatzes mit 10 µL des Restriktionsmixes versetzt.
Dieser Restriktionsmix bestand aus 1 µL des Restriktionsenzyms Hpa II , dem 10 fach
verdünnten Restriktionspuffer A sowie destilliertem, sterilen Wasser. Die genaue Zu-
sammensetzung ist Tabelle 4.2 zu entnehmen. Das Enzym schneidet selektiv an der
Basen-Sequenz CCGG, wobei zwischen den beiden Cytosinbasen geschnitten wird. Das
Reaktionsgemisch wurde für eine Stunde bei 37 ◦ C inkubiert.

2.4 Gelelektrophorese
Die Gelelektrophorese wurde auf einem Agarosegel durchgeführt. Zur Herstellung des
Agarosegels wurden 2,25 g Agarose in 150 mL TAE-Puffer aufgeschlämmt (entspricht
einem 1,5 %igem Gel) und diese Mischung anschließend in der Mikrowelle so lange er-
hitzt, bis eine klare Lösung entstanden war. Nachdem diese Lösung auf 50 ◦ C temperiert
worden war, konnten noch 5 µL Ethidiumbromid Lösung hinzugefügt werden. Anschlie-
ßend wurde das Gel in den Gelgießstand gegossen und mit einem Kamm versehen, der
die Taschen für die Probenaufgabe erzeugen sollte. Das Gel wurde bei Raumtemperatur
aushärten gelassen und bis zum nächsten Tag im Kühlschrank gelagert, um ein Aus-
trocknen zu verhindern.
Der Kamm wurde aus dem Gel entfernt und das Gel wurde in die Elektrophoresekammer
gelegt. Anschließend wurde der TEA-Puffer als Laufpuffer in die Kammer gefüllt. Eine
Mischung aus Xylencyanol, Bromphenolblau und Glycerin wurden als Loading Dye den
Proben zugesetzt. Das Glycerin diente dabei dazu, die Dichte der Lösung zu erhöhen,
sodass beim Pipettieren der Lösungen in die Elektrophoresetaschen keine Mischung der
Lösung statt findet, sondern sie direkt in die Taschen absinkt. Es wurden jeweils 40
µL PCR-Produkt mit 8 µL Loading Dye und 20 µL der Lösung mit den geschnitte-
nen DNA-Fragmenten mit 4 µL Loading Dye versetzt. Von diesen Mischungen wurden
jeweils 10 µL der PCR-Produkt-Lösung und 20 µL der Lösung mit den geschnittenen
DNA-Fragmenten in die Taschen pipettiert.
Außerdem wurden noch 2 Kammern mit einem DNA-Längen-Standard (GeneRuler 50bp
DNA Ladder) gefüllt, um anschließend die Größe der DNA-Fragmente bestimmen zu
können. Die Elektrophorese wurde bei 80 V und unlimitierten Strom für rund 1 Stunde
10 Minuten laufen gelassen.
Anschließend wurde das Gel aus der Elektrophoresekammer genommen und nach dem
Abtropfen des Laufpuffers mittels UV-Licht bestrahlt. Durch die Bestrahlung wurde
das interkalierte Ethidiumbromid zur Fluoreszenz angeregt und die dadurch sichtbaren
DNA-Banden konnten mit einer Kamera fotografiert werden.

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3 Auswertung u. Ergebnis

3.1 Scan des Agarosegels

Abbildung 3.1: Scan der mit Ethidiumbromid gefärbten DNA im Agarosegel nach der
Elektrophorese

Abbildung 3.1 zeigt das fotografierte Agarosegel unter UV-Licht nach der Elektrophorese.
Das Bild wurde in Schwarz/Weiß aufgenommen, um einen möglichst guten Kontrast
zwischen DNA-Banden und Agarosegel herzustellen.

Marker B1 P1 R1 P2 R2 P3 R3 B2 P4 R4 P5 R5 P6 R6 Marker

Tabelle 3.1: Aufgabeschema der Elektrophorese

Tabelle 3.1 gibt das Aufgabeschema der Proben an. Marker steht für die DNA-Längen-
Standards, B1 und B2 sind die beiden Blank-Proben. R steht jeweils für die mit Restrik-

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tionsenzym behandelten Proben und P schließlich steht für die PCR-Produkte.


Sofort erkennt man, dass die beiden Blank-Proben keinerlei sichtbare DNA-Banden ent-
halten. Es lässt sich daher auf die Sauberkeit der Chemikalien schließen sowie auf die
saubere und korrekte Arbeitsweise der durchführenden Personen. Weiters erkennt man
die DNA-Längen-Standards, welche sich jeweils auf den äußersten Positionen des Gels
befinden. Man erkennt, dass die DNA-Fragmente aufgetrennt wurden, jedoch der Ab-
stand zwischen den jeweiligen Banden sehr gering ist. Hätte man das Gel länger laufen
gelassen, wäre die Auftrennung vermutlich besser geworden. Die Proben 1-3 lassen kaum
DNA erkennen. Dies lässt auf eine ungenügende PCR zurück schließen. Gründe dafür
könnten zu wenige Primer oder zu wenig Nukleotide in der Lösung sein. Eventuell wur-
de beim Herstellen des Master-Mix für die ersten 3 Gruppen ein Fehler gemacht und zu
wenig oder gar keine Primer bzw. Nukleotide zugegeben.
Der Kontrast wurde soweit wie möglich mit Hilfe der Software Gimp verbessert. Es
war jedoch nicht möglich, weitere Banden bei den Proben 1-3 sichtbar zu machen. Die
Größenbestimmung der DNA-Fragmente wurde daher an Probe 4 durchgeführt. Bei P4
sind 2 Banden erkennbar. Die erste Bande besteht aus amplifizierter DNA-Sequenz und
hat eine Größe von rund 700 bp. Weiters ist eine Bande direkt an der Front erkennbar.
Diese besteht aus Primer-Dimeren mit einer ungefähren Größe von 50 bp. Bei der Probe
4, die mit dem Restriktionsenzym versetzt wurde (R4), sind drei Banden erkennbar. Die
erste Bande entspricht einer Größe von rund 300 bp, die zweite Bande entspricht einer
Größe von rund 120 bp. Bei der letzten Bande dürfte es sich wieder um Primer-Dimere
mit einer ungefähren Größe von 50 bp handeln. Hier fällt auf, dass die Summe der ge-
schnittenen Fragmente nur in etwa 420 bp anstatt der erwarteten zirka 700 bp ergibt.
Diese Abweichung ist so groß, dass sie nicht durch Abschätzfehler allein erklärbar wäre.
Es wäre denkbar, dass die Probe aus je zwei Fragmenten mit 300 bp sowie einem Frag-
ment à 120 bp besteht. Damit würde die Summe der Fragmente 720 bp ergeben, was
innerhalb des Fehlerbereiches des Schätzfehlers liegt. Da jedoch beide Probenbanden in
etwa gleich intensiv sind, erscheint dies nicht allzu plausibel. Es ist aber erkennbar, dass
der Bereich, in dem die Primer-Dimere zu sehen sind, recht stark verbreitert ist. Mögli-
cherweise haben die Restriktionsenzyme Teile des DNA-Fragmentes so gut geschnitten,
dass nur noch sehr kleine Fragmente < 120 bp über geblieben sind, welche den feh-
lenden Anteil an Basenpaaren in Vergleich mit dem Wert des nicht behandelten DNA
Fragmentes erklären könnten.

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4 Anhang

4.1 Tabellen

Volumen [µL] Stoff


5 Proben-DNA
5 Taq-Polymerase-Puffer (MgCl2-Frei, 10 fach)
5 MgCl2 (25 mM)
2 LR1 (20 ng/µL) Primer
2 SRCR (20 ng/µL) Primer
1 dNTPs (2mM von jedem Nukleotid)
29,8 steriles Wasser
0,2 Taq DNA Polymerase

Tabelle 4.1: Zusammensetzung des PCR-Mixes

Volumen [µL] Stoff


10 PCR-Produkt
2 Restriktions Puffer A (10 fach)
7,5 steriles Wasser
1 Restiktionsenzym Hpa II

Tabelle 4.2: Zusammensetzung des Restriktions-Master-Mixes

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Tabellenverzeichnis

3.1 Aufgabeschema der Elektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

4.1 Zusammensetzung des PCR-Mixes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10


4.2 Zusammensetzung des Restriktions-Master-Mixes . . . . . . . . . . . . . . 10

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