Bioprozesstechnik

Horst Chmiel
Ralf Takors
Dirk Weuster-Botz
Hrsg.

Bioprozesstechnik
4. Auflage
Herausgeber
Horst Chmiel Dirk Weuster-Botz
München Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik
Deutschland Technische Universität München
Garching
Ralf Takors Deutschland
Institut für Bioverfahrenstechnik
Universität Stuttgart
Stuttgart
Deutschland

Die Darstellung von manchen Formeln und Strukturelementen war in einigen elektronischen
Ausgaben nicht korrekt, dies ist nun korrigiert. Wir bitten damit verbundene Unannehmlich-
keiten zu entschuldigen und danken den Lesern für Hinweise.
ISBN 978-3-662-54041-1    ISBN 978-3-662-54042-8 (eBook)
https://doi.org/10.1007/978-3-662-54042-8

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 V

Vorwort zur 4. Auflage „Bioprozesstechnik“

Die „Weiße Biotechnologie“ nutzt Mikroorganismen oder Enzyme für die industrielle Stoff-
produktion. Zu den Produkten gehören Spezial- und Feinchemikalien, Agrar- und Pharma-
vorprodukte, Lebensmittel, Hilfsstoffe für die verarbeitende Industrie, zunehmend aber auch
großvolumige Chemieprodukte und Treibstoffe. Für 2017 wird weltweit ein Umsatz in der
Größenordnung von 340 Milliarden € erwartet (Festel, Ind. Biotechnol., 2010). Die „Rote Bio-
technologie“ (Produktion pharmazeutischer Wirkstoffe beispielsweise mittels tierischer Zellkul-
turen) erreichte mit rund 140 Milliarden US$ globalen Umsatz in 2013 (Walsh, Nat. Biotechnol.,
2014) ebenfalls eine große wirtschaftliche Bedeutung. Beide Werte spiegeln die steten jähr-
lichen Wachstumsraten von etwa 8–10 % in den jeweiligen Segmenten wider. Getrieben wird
die Entwicklung durch die Megatrends einer ständig wachsenden Bevölkerung, die zudem in
den westlichen Ländern altert. Diesen stehen eine sich abzeichnenden Ressourcenknappheit
und der Klimawandel gegenüber. Im biopharmazeutischen Bereich beflügelt der auslaufende
Patentschutz einer Reihe von blockbustern zusätzlich die Entwicklung.

In der überarbeiteten und aktualisierten 4. Auflage wird allen genannten Gebieten entspre-
chend Raum gegeben. Durch die Auslagerung der ersten beiden Kapitel vorheriger Auflagen
(„Zellbiologie“ und „Biochemie“) als elektronische Beiträge (abrufbar unter http://www.springer.
com/de/book/9783540411), konnte in der vorliegenden Druckausgabe mehr Platz für die bio-
verfahrenstechnischen Kernthemen geschaffen werden. Diese Neujustierung wird auch in der
Zusammensetzung des Herausgeber-Teams sowie durch die Berücksichtigung neuer Autoren
deutlich. Nach wie vor profitiert das Buch ebenfalls von Kurzbeiträgen namhafter Wissen-
schaftlern aus Hochschule und Industrie, was dessen Aktualität erhöht.

In den ersten beiden Kapiteln sind die Grundlagen zur Kinetik enzymatischer und mikrobieller
Umsetzungen und des zellulären Wachstums zusammengestellt. Das nachfolgende 7 Kap. 3
verdeutlicht, wie derartige kinetische Modelle zur Modellierung von biotechnischen Stoff-
wandlungsprozessen integriert werden. Verglichen mit den vorherigen Bucheditionen, sind
diese drei ersten Kapitel vollkommen neu konzipiert und von einem neuen Autorenteam erstellt.

7 Kap. 4 beschäftigt sich ausführlich mit den Fließeigenschaften von Biosuspensionen auf den
Impuls-, Wärme- und Stoffaustausch.

Der Einfluss von Biosuspensionen auf Transportvorgänge im Bioreaktor behandelt 7 Kap. 5.

Dieses beginnt wegen der besonderen Bedeutung für die Maßstabsübertragung mit einer Ein-
führung in dimensionslose Kennzahlen.

Mit diesem Rüstzeug folgen in dem ebenfalls neu konzipierten und gegenüber der vorherigen
Ausgabe stark erweiterten 7 Kap. 6 die systematische Beschreibung der Eigenschaften der wich-
tigsten in der Biotechnologie eingesetzten Bioreaktoren (Rührkesselreaktoren, Blasensäulen-
reaktoren, Bioreaktoren mit Leistungseintrag über einen Kreislauf mit Pumpe einschließlich
Fotobioreaktoren und bewegte Bioreaktoren).

Die Bedeutung der Sterilisation für die Bioproduktion wird häufig unterschätzt (7 Kap. 7 „Ste-
rilisation und Sterildesign“).
VI Vorwort zur 4. Auflage „Bioprozesstechnik“

Das komplexe Mehrphasensystem in einem Bioprozess stellt höchste Anforderungen an die

Mess- und Regeltechnik (7 Kap. 8 „Bioprozessanalytik und -steuerung“).

Mehr als die Hälfte der Kosten eines Bioproduktes entfallen auf die Aufarbeitung. Den Einzel-
schritten Zellernte, Zellaufschluss, Produktisolation und Produktreinigung werden in 7 Kap. 9
deshalb besondere Beachtung geschenkt.

Die nachfolgenden 7 Kap. 10–12 stellen die technischen Anwendungen von Enzymen, mikrobi-
ellen Produzenten und Säugerzellen zur Produktion in den Vordergrund. Insbesondere 7 Kap. 10
und 11 wurden für diesen Zweck neu konzipiert und aktualisiert. Da neben der Produktion
auch die Entsorgung von Abfallströmen betrachtet werden sollte, enthält 7 Kap. 11 ebenfalls eine
Übersicht über die biologische Abwasserreinigung („Graue Biotechnologie“).

Das Buch schließt mit einem Beitrag zur „Systembiologie in der Bioverfahrenstechnik“ in
7 Kap. 13. Darin wird die quantitative, ingenieurwissenschaftliche Sichtweise zur Optimierung
der zellulären Produzenten in Kooperation mit der Stammkonstruktion in den Mittelpunkt
gestellt.

Das Herausgeber-Team, bestehend aus dem Gründervater Horst Chmiel und den neuen Mit-
herausgebern Ralf Takors und Dirk Weuster-Botz, möchte sich herzlich bei allen Autoren be-
danken, die durch sorgfältige Überarbeitung oder Neuschreiben ihrer Kapitel oder Beiträge zur
Aktualität dieses Lehrbuches beigetragen haben. Unser ganz besonderer Dank gilt Frau Sabine
Bartels vom SpringerSpektrum-Verlag für Ihren unermüdlichen Einsatz.

Horst Chmiel
München

Ralf Takors
Stuttgart

Dirk Weuster-Botz
Garching
Februar 2018
 VII

Herausgeber

Horst Chmiel
1963–1967 Studium des Maschinenbaus mit Schwerpunkt Verfahrenstechnik
an der RWTH Aachen. 1967–1971 Wissenschaftlicher Mitarbeiter/Assistent
mit Promotion am Institut für Verfahrenstechnik der RWTH Aachen. 1971–
1975 wissenschaftlicher Mitarbeiter am Helmholtz-Institut für Biomedizini-
sche Technik an der RWTH Aachen; dort 1973 Habilitation. 1976–1992 Leiter
des Fraunhofer-Instituts für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik Stutt-
gart. 1986–1992 Ordinarius für Bioprozesstechnik der Universität Stuttgart.
1992–2005 Inhaber des Lehrstuhls für Prozesstechnik der Universität des
Saarlandes und geschäftsführender wissenschaftlicher Direktor der Gesell-
schaft für umweltkompatible Prozesstechnik mbH, Saarbrücken und von
2005–2016 Geschäftsführer der audita Unternehmensberatung GmbH in
München.

Ralf Takors
1987–1993 Studium des Maschinenbaus mit Schwerpunkt Verfahrenstechnik
an der RWTH Aachen. 1993–1997 Doktorand am Institut für Biotechnologie
(IBT) der Forschungszentrum Jülich GmbH, Promotion an der RWTH Aachen.
Bis 2004 Leitung der Arbeitsgruppe ‚Fermentationstechnik‘ am IBT, Habili-
tation an der RWTH Aachen in 2004. Von 2004–2009 verantwortlich für den
Bereich Bioprozessentwicklung inkl. systems metabolic engineering bei Evonik
Degussa GmbH. Seit Juli 2009 Professor und Leiter des Instituts für Bioverfah-
renstechnik der Universität Stuttgart. Seit 2014 Vorsitz der Fachgruppe ‚Bio-
prozesstechnik‘ der DECHEMA e.V.

Dirk Weuster-Botz
1979–1986 Studium des Chemie-Ingenieurwesen an der Universität Karls-
ruhe. 1987–1991 Doktorand am Institut für Biotechnologie des Forschungs-
zentrums Jülich, Promotion an der Universität Karlsruhe. 1992–1999 Leitung
des Biotechnikums am Forschungszentrum Jülich, Habilitation an der RWTH
Aachen. Seit 2000 Universitätsprofessor und Ordinarius am Lehrstuhl für Bio-
verfahrenstechnik der TU München. Seit 2005 Herausgeber der Fachzeitschrift
Bioprocess and Biosystems Engineering. Seit 2012 Mitglied der Deutschen
Akademie der Technikwissenschaften (acatech). Seit 2014 Direktor am TUM-
Forschungszentrum für Weiße Biotechnologie.
 IX

Inhaltsverzeichnis

1 Enzymkinetik. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Kathrin Castiglione
1.1 Nomenklatur und Klassifizierung von Enzymen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2 Reaktionsordnungen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3 Ligandenbindung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.4 Kinetik von Einsubstratreaktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.5 Identifikation von kinetischen Parametern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.6 Modulatoren enzymatischer Aktivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.7 Enzymstabilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
1.8 Empirische, semi-mechanistische und mechanistische Modelle. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
1.9 Regulatorische Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
1.10 Kinetik von Mehrsubstratreaktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
Literatur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2 Wachstumskinetik. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Dirk Weuster-Botz und Ralf Takors
2.1 Wachstumsmodelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.2 Wachstumskurve. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
2.3 Nicht-strukturierte Wachstumsmodelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.4 Wachstumskinetik von Mycelbildnern. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
2.5 Weitere Einflussgrößen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
Literatur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

3 Prozessmodelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
Ralf Takors und Dirk Weuster-Botz
3.1 Einleitung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
3.2 Bilanzierung idealisierter homogen durchmischter Reaktoren (Rührreaktoren). . . . . . . . . 73
3.3 Besondere Betriebsweisen von homogen durchmischten Bioreaktoren. . . . . . . . . . . . . . . . . 81
3.4 Sauerstoffeintrag . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
3.5 Rohrreaktor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
3.6 Blasensäule und Airlift Reaktor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
3.7 Diffusion in Zell- und Enzymschichten. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
3.8 Nicht-Ideale Bioreaktoren. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
3.9 Parameteridentifizierung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
3.10 Beispiele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
Literatur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

4 Rheologie von Biosuspensionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

Horst Chmiel und Eckehard Walitza
4.1 Die parallele Schichtenströmung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
4.2 Viskosimeterströmungen inkompressibler Flüssigkeiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
4.3 Mathematische Modellierung der stationär ermittelten Fließkurve. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
4.4 Repräsentative Viskosität. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
4.5 Das Rührer-Rheometer. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
X Inhaltsverzeichnis

4.6 Die instationäre Scherströmung viskoelastischer Fluide. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

4.7 Dehnströmungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
4.8 Das Fließverhalten von Fermentationsbrühen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
Literatur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129

5 Transportvorgänge in Biosuspensionen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131

Horst Chmiel und Eckehard Walitza
5.1 Maßstabsübertragung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
5.2 Leistungseintrag beim Rühren von Flüssigkeiten. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
5.3 Stofftransport in Biosuspensionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
5.4 Wärmeübergang im Bioreaktor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151
Literatur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156

6 Bioreaktoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
Horst Chmiel und Dirk Weuster-Botz
6.1 Bioreaktoren mit Leistungseintrag über mechanisch bewegte Einbauten
(Rührkesselreaktoren). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160
6.2 Bioreaktoren mit Leistungseintrag über Gasexpansion (Blasensäulenreaktoren) . . . . . 175
6.3 Bioreaktoren mit Leistungseintrag über Kreislauf mit Pumpe. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
6.4 Bewegte Bioreaktoren. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196
6.5 Parallelbioreaktorsysteme für die Bioprozessentwicklung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
6.6 Spezielle Bioreaktoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217
Literatur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223

7 Sterilisation und Sterildesign. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231

Jörg Hinrichs, Heinrich Buck und Gerhard Hauser
7.1 Thermische Stabilität von Mikroorganismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232
7.2 Kinetik der thermisch induzierter Veränderungen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233
7.3 Vergleich und Optimierung des Behandlungseffekts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 236
7.4 Sicherheitsniveau für Sterilisationsprozesse. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238
7.5 Kontinuierliche Verfahren zur thermischen Mediumsterilisation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238
7.6 Sterilfiltration. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
7.7 Funktion von Dampfsterilisatoren (Autoklaven) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244
7.8 Sterilisierbare Bioreaktoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245
7.9 Sterildesign . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 246
Literatur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 258

8 Bioprozessanalytik und -steuerung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261

Bernd Hitzmann und Thomas Scheper
8.1 Charakteristische Parameter für das Bioprozessmonitoring. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263
8.2 Messtechnik. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265
8.3 Softwaresensoren. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 284
8.4 Automatisierung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290
Literatur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 297

9 Aufarbeitung (Downstream Processing). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 299

Horst Chmiel
9.1 Zellernte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301
 XI
Inhaltsverzeichnis

9.2 Zellaufschluss. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 309

9.3 Produktisolation, -konzentrierung und -reinigung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 317
9.4 Trocknungsverfahren in der Bioprozesstechnik. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 392
Literatur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 397

10 Enzymatische Prozesse. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 403

Kathrin Castiglione und Dirk Weuster-Botz
10.1 Quervernetzte Enzymaggregate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 409
10.2 Trägerfixierte Enzyme. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 414
10.3 Enzymeinschluss. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 421
10.4 Ganze Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 425
10.5 Mehrphasensysteme. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 435
Literatur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 445

11 Mikrobielle Prozesse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 449

Christoph Syldatk, Rudolf Hausmann und Horst Chmiel
11.1 Mikrobielle Produktionsprozesse. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 450
11.2 Mikrobielle Stoffproduktion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453
11.3 Mikrobielle Abwasserreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 478
Literatur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 487

12 Kultivierung von Säugetierzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 489

Ralph Kempken, Franz Walz und Michael Howaldt
12.1 Eigenschaften von Tierzellen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 491
12.2 Zellcharakterisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 499
12.3 Die Umgebung von Zellen in Kultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 506
12.4 Zellkultivierungsmethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 510
12.5 Prozessführung bei Säugerzellkulturen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 515
12.6 Prozessentwicklung und Scale-up . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 520
12.7 Großtechnische biopharmazeutische Produktion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 529
Literatur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 540

13 Systembiologie in der Bioverfahrenstechnik. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 545

Ralf Takors
13.1 Einführung in die Systembiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 546
13.2 Aufgaben der Systembiologie für die Bioprozessentwicklung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 548
13.3 Metabolische Ebene. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 551
13.4 Zelluläre Regulation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 563
13.5 Subpopulationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 564
13.6 Scale-up. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 565
Literatur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 566

Serviceteil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 571
Symbolverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 572
Indizierung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 578
Stichwortverzeichnis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 579
Verzeichnis der Autoren

Verzeichnis der Kapitelautoren Jörg Hinrichs, Prof. Dr.-Ing. habil.

Universität Hohenheim
Institut für Lebensmittelwissenschaft und
Heinrich Buck, Dipl.-Ing. Biotechnologie
Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Garbenstraße 21
Birkendorfer Str. 65 70599 Stuttgart
88397 Biberach Deutschland
Deutschland e-mail: jh-lth@uni-hohenheim.de
e-mail: heinrich.buck@t-online.de
Bernd Hitzmann, Prof. Dr.
Kathrin Castiglione, Prof. Dr. Universität Hohenheim
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Institut für Lebensmittelwissenschaft und
Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik Biotechnologie, Fachgebiet Prozessanalytik und
Paul-Gordan-Straße 3 Getreidetechnologie
91052 Erlangen Garbenstraße 23
Deutschland 70599 Stuttgart
e-mail: kathrin.castiglione@fau.de Deutschland

Horst Chmiel, Prof. Dr.-Ing. habil. Michael Howaldt, Dr.-Ing.

Haslangstraße 28 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG
80689 München Birkendorfer Str. 65
Deutschland 88397 Biberach
e-mail: auditaUB@aol.com Deutschland
e-mail: michael.howaldt@boehringer-ingelheim.com
Gerhard Hauser, Dr.-Ing.
Goethestraße 43 Ralph Kempken, Dr.
85386 Eching Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG
Deutschland Birkendorfer Str. 65
e-mail: gerhardwrhauser@yahoo.de 88397 Biberach
Deutschland
Rudolf Hausmann, Prof. Dr.-Ing. e-mail: ralph.kempken@boehringer-ingelheim.com
Universität Hohenheim
Fg. Bioverfahrenstechnik Thomas Scheper, Prof. Dr. rer. nat.
Fruwirthstr.12 Gottfried-Wilhelm-Leibniz Universität Hannover
70599 Stuttgart Institut für Technische Chemie
Deutschland Callinstraße 5
e-mail: jan.hansmann@igb.fraunhofer.de 30167 Hannover
Deutschland
e-mail: scheper@iftc.uni-hannover.de
 XIII
Verzeichnis der Autoren

Christoph Syldatk, Prof. Dr. Bernd Bauer, Dr.

Karlsruher Institut für Technologie (KIT)
Institut für Bio- und Lebensmitteltechnologie
Kaiserstraße 12
76131 Karlsruhe
Deutschland
e-mail: christoph.syldatk@kit.edu
FuMa-Tech Gesellschaft für funktionelle
Membranen und Anlagetechnologie mbH
Carl-Benz-Str. 4
74321 Bietigheim-Bissingen
Deutschland
e-mail: bernd.bauer@fumatech.com

Ralf Takors, Prof. Dr.-Ing. Christoph Brandenbusch

Universität Stuttgart Technische Universität Dortmund
Institut für Bioverfahrenstechnik Departement of Biochemical and Chemical
Allmandring 31 Engineering
70569 Stuttgart Emil-Figge-Straße 70
Deutschland 44227 Dortmund
Deutschland
Eckehard Walitza, Dr.-Ing. e-mail: Christoph.Brandenbusch@bci.
Ludwigstraße 32 tu-dortmund.de
73430 Aalen
Deutschland André Braun, Dr.
e-mail: ewalitza@t-online.de Meisenweg 7
73773 Aichwald
Franz Walz, Dr. Deutschland
Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG e-mail: sismondi@gmx.ch
Birkendorfer Str. 65
88397 Biberach Jochen Büchs, Prof. Dr.-Ing.
Deutschland RWTH Aachen
e-mail: franz.walz@boehringer-ingelheim.com Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik
Forckenbeckstraße 51
Dirk Weuster-Botz, Prof. Dr.-Ing. 52074 Aachen
Technische Universität München Deutschland
Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik e-mail: jochen.buechs@avt.rwth-aachen.de
Boltzmannstr. 15
85748 Garching Verena Charwat, Dr.
Deutschland Universität für Bodenkultur Wien BOKU
e-mail: d.weuster-botz@lrz.tum.de Departement für Biotechnologie,
Zellkulturtechnik und Tissue Engineering
Muthgasse 18
Verzeichnis der Beitragsautoren 1190 Wien
Österreich
e-mail: verena.charwat@boku.ac.at
Anne Baier, Dr.-Ing.
Technische Universität Berlin Michèle Delbé, Dr.
Königin-Luise-Straße 22 Corden BioChem GmbH
14195 Berlin Industriepark Hoechst Geb. D770 / R2.31
Deutschland Brüningstraße 50
e-mail: anne.k.baier@tu-berlin.de 65929 Frankfurt am Main
Deutschland
e-mail: Michele.Delbe@cordenbiochem.com
XIV Verzeichnis der Autoren

Martin Denecke, Prof. Dr. Christoph Kiziak

Universität Duisburg-Essen Lonza Ltd. Pharma and Biotech Research &
Fakultät Ingenieurwissenschaften Abt. Technology
Bauwissenschaften Siedlungswasserwirtschaft Rottenstraße 6
Universitätsstr. 15 3930 Visp
45141 Essen Schweiz
Deutschland e-mail: christoph.kiziak@lonza.com
e-mail: martin.denecke@uni-due.de
Dirk Kreyenschulte
Lothar Eggeling, Dr. RWTH Aachen
IBG-1, Biotechnologie Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik
Forschungszentrum Jülich Forckenbeckstraße 51
52428 Jülich 52074 Aachen
Deutschland Deutschland
e-mail: l.eggeling@fz-juelich.de e-mail: Dirk.Kreyenschulte@avt.rwth-aachen.de

Jan Hansmann, Dr.-Ing. Tobias Ladner, Dipl.-Ing.

Universitätsklinik Würzburg RWTH Aachen
Lehrstuhl Tissue Engineering und Regenerative Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik
Medizin Forckenbeckstraße 51
Röntgenring 11 52074 Aachen
97070 Würzburg Deutschland
Deutschland e-mail: tobias.ladner@avt.rwth-aachen.de
e-mail: jan.hansmann@igb.fraunhofer.de
Karl-Heinz Maurer, Dr.
Dariusch Hekmat, PD Dr.-Ing. Global Marketing Director
Technische Universität München AB Enzymes GmbH
Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik Feldbergstraße 78
Boltzmann-Str. 15 64293 Darmstadt
85748 Garching Deutschland
Deutschland e-mail: Karl-heinz.maurer@abenzymes.com
e-mail: Hekmat@lrz.tu-muenchen.de
Guido Melzer, Dr.-Ing.
Jens-Michael Hilmer, Dr. Betriebsleiter Biotech Operations Corden
Symrise AG BioChem GmbH
Mühlenfeldstraße 1 Industriepark Hoechst
37603 Holzminden 65929 Frankfurt am Main
Deutschland Deutschland
e-mail: jens-michael.hilmer@symrise.com e-mail: guido.melzer@cordenbiochem.com

Werner Himmelsbach Hans-Jörg Menger, Dr.

EKATO Forschung und Entwicklung Hauptstraße 40
Postfach 1110/20 68799 Reilingen
79641 Schopfheim Deutschland
Deutschland e-mail: menger@naturin.viscofan.com
e-mail: Werner.Himmelsbach@ekato.com
 XV
Verzeichnis der Autoren

Marco Antonio Mirata, Dr. Ralf Takors, Prof. Dr.-Ing.

R&T Speciality Ingredients Universität Stuttgart
Lonza Ltd. Institut für Bioverfahrenstechnik
Rottenstraße 6 Allmandring 31
3930 Visp 70569 Stuttgart
Schweiz Deutschland
e-mail: marco.mirata@lonza.com e-mail: takors@ibvt.uni-stuttgart.de

Clemens Posten, Prof. Dr.-Ing. Moniec Van-Logchem

Karlsruher Institut für Technologie (KIT) Evonik Nutrition & Care GmbH
Institut für Bio- und Lebensmitteltechnik, Goldschmidtstraße 100
Bereich III Bioverfahrenstechnik 45127 Essen
Fritz-Haber-Weg 2 Deutschland
76131 Karlsruhe e-mail: moniec.van-logchem@evonik.com
Deutschland
e-mail: clemens.posten@kit.edu Franz Walz, Dr.
Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG
Cornelia Rauh, Prof. Dr.-Ing. habil. Birkendorfer Str. 65
Technische Universität Berlin 88397 Biberach
Fakultät Prozesswissenschaften Deutschland
Königin-Luise-Str. 22 e-mail: franz.walz@boehringer-ingelheim.com
14195 Berlin
Deutschland Hans Henning Wenk, Dr.
e-mail: cornelia.rauh@tu-berlin.de Evonik Nutrition & Care GmbH
Goldschmidtstraße 100
Martin Schilling, Dr. 45127 Essen
Evonik Nutrition & Care GmbH Deutschland
Kirschenallee e-mail: henning.wenk@evonik.com
64293 Darmstadt
Deutschland Tim Zeiner, Dr.-Ing.
e-mail: martin.schilling@evonik.com Technische Universität Dortmund
Department of Biochemical and Chemical
Diego Schmidhalter, Dr. Engineering
Lonza Ltd. R&T Custom Manufacturing Emil-Figge-Straße 70
Pharma&Biotech 44227 Dortmund
Rottenstraße 6 Deutschland
3930 Visp e-mail: Tim.Zeiner@bci.tu-dortmund.de
Schweiz
e-mail: diego.schmidhalter@lonza.com

Leon Steuernagel
Universität Duisburg-Essen
Fakultät Ingenieurwissenschaften Abt.
Bauwissenschaften Siedlungswasserwirtschaft
Universitätsstr. 15
45141 Essen
Deutschland
e-mail: leon.steuernagel@uni-due.de
 1 1

Enzymkinetik
Kathrin Castiglione

1.1 Nomenklatur und Klassifizierung von Enzymen – 3

1.2 Reaktionsordnungen – 4
1.2.1 Reaktionen erster Ordnung – 4
1.2.2 Reaktionen zweiter und höherer Ordnung – 4
1.2.3 Reaktionen nullter Ordnung – 5

1.3 Ligandenbindung – 5

1.4 Kinetik von Einsubstratreaktionen – 6

1.4.1 Die Michaelis-Menten-Gleichung – 6
1.4.2 Die kinetischen Parameter Km und kcat – 8
1.4.3 Reversible Einsubstratreaktionen – 10

1.5 Identifikation von kinetischen Parametern – 11

1.5.1 Messung von Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten – 11
1.5.2 Verlaufskurvenanalyse – 16

1.6 Modulatoren enzymatischer Aktivität – 17

1.6.1 Temperatur – 17
1.6.2 pH und Puffersystem – 18
1.6.3 Inhibitoren – 19
1.6.4 Aktivatoren – 24

1.7 Enzymstabilität – 25

1.8 Empirische, semi-mechanistische und mechanistische

Modelle – 26

1.9 Regulatorische Enzyme – 27

1.9.1 Kooperativität und Allosterie – 28
1.9.2 Die Hill-Gleichung – 28

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2018

H. Chmiel, R. Takors, D. Weuster-Botz (Hrsg.), Bioprozesstechnik,
https://doi.org/10.1007/978-3-662-54042-8_1
1.9.3 Das Symmetrie-Modell von Monod, Wyman und Changeoux – 29
1.9.4 Das Sequenz-Modell von Koshland, Némethy und Filmer – 31
1.9.5 Andere Regulationsmechanismen – 32

1.10 Kinetik von Mehrsubstratreaktionen – 33

1.10.1 Stöchiometrie – 33
1.10.2 Reihenfolge der Substratbindung – 33
1.10.3 Geschwindigkeitslimitierender Schritt – 34
1.10.4 Irreversible Reaktionen oder Inhibierungen – 34
1.10.5 Cleland-Diagramme – 34
1.10.6 Unterscheidung von Enzymmechanismen – 35
1.10.7 Herleitung von Geschwindigkeitsgleichungen – 38

Literatur – 43
Kapitel 1 · Enzymkinetik
Die Enzymkinetik beschäftigt sich mit der Unter-
suchung der Geschwindigkeit enzymkatalysier-
ter Reaktionen. Durch die quantitative Analyse des
Effekts verschiedener chemischer und physikalischer
Parameter, wie beispielsweise Substrat- und Produkt-
konzentration oder Temperatur, auf die Umsetzungs-
geschwindigkeit, können wichtige Informationen
bezüglich des zugrundeliegenden Reaktionsmecha-
nismus und der physikalischen Eigenschaften des
biologischen Katalysators gewonnen werden. Die
Geschwindigkeitsgleichungen, die aus den kineti-
schen Studien hervorgehen, können dazu verwen-
det werden, optimale Betriebspunkte für einen Bio-
prozess zu identifizieren.
1.1 Nomenklatur und Klassifizierung
von Enzymen
In den Anfängen der Enzymologie war die Namens-
gebung von Enzymen unsystematisch. In vielen
Fällen hat ein Enzym mehrere Namen zugewie-
sen bekommen, während im Gegenzug auch der
gleiche Name für unterschiedliche Enzyme ver-
wendet wurde. Häufig wurden auch Trivialnamen
wie Trypsin oder Lysozym vergeben, die zum einen
nicht erkennen lassen, dass es sich bei der Substanz
überhaupt um ein Enzym handelt und zum anderen
keinen Rückschluss auf die katalysierte Reaktion
erlauben. In anderen, systematischeren Ansätzen
wurde das Suffix „ase“ an den Substratnamen ange-
hängt oder an einen Terminus, der die Enzymakti-
vität beschreibt. So spaltet beispielsweise das Enzym
Urease Harnstoff, während DNS-Ligasen DNS-
Stränge verknüpfen [33].
Die rapide zunehmende Zahl an entdeckten
Enzymen machte die Entwicklung einer einheitli-
chen Namensgebung unumgänglich. Daher richtete
die Internationale Union für Biochemie ein Komitee
ein, die sogenannte Enzyme Commission (EC), das
mit der Standardisierung der Nomenklatur und Klas-
sifizierung von Enzymen betraut wurde und im Jahr
1961 die Grundlagen für das heute gültige System
veröffentliche [16]. Hierbei bekommt jede enzymati-
sche Reaktion eine eindeutige vierstellige Codenum-
mer zugewiesen, die sogenannte EC-Nummer. Die
erste Ziffer steht für eine der sechs Hauptklassen, in
3 1
die jedes Enzym nach der jeweils katalysierten Reak-
tion eingeteilt wird, wie . Tab. 1.1 zeigt. Die zweite
Ziffer steht für die Unterklasse, die in der Regel Infor-
mationen über an der Reaktion beteiligte Gruppen
oder Verbindungen enthält. Beispielsweise wird
die Hauptklasse der Hydrolasen weiter unterteilt
in Enzyme, die Esterbindungen (EC 3.1), Glykosyl-
bindungen (EC 3.2), Etherbindungen (EC 3.3) etc.
spalten. Die dritte Ziffer spezifiziert die Reaktion
noch genauer: Während die Unter-Unterklasse EC
3.1.1 Enzyme umfasst, die Carbonsäureester hydro-
lysieren, sind die Substrate der in EC 3.1.2 eingeteil-
ten Enzyme Thioester. Die letzte Ziffer wird fortlau-
fend vergeben und identifiziert das jeweilige Enzym
in eindeutiger Weise.
Zusätzlich zur EC-Nummer bekommt jedes
Enzym auch einen systematischen Namen, der
die katalytische Aktivität so genau wie möglich
beschreibt. Im Alltag haben sich die systemati-
schen Namen jedoch nicht durchgesetzt, da sie
zum Teil sehr lang und kompliziert sind. Der sys-
tematische Name der Riboflavinsynthase (EC
2.5.1.9) ist beispielsweise 6,7-Dimethyl-8-(1-D-ri-
bityl)lumazin:6,7-dimethyl-8-(1-D-ribityl)luma-
zin-2,3-butandiyltransferase. Daher wird neben dem
systematischen Namen zusätzlich ein empfohlener
Name vergeben, der einfach leserlich sein soll wie
„Alkoholdehydrogenase“, aber auch ein gebräuchli-
cher Trivialname sein kann wie „Pepsin“. Zur eindeu-
tigen Identifizierung eines Enzyms sollte daher stets
die EC-Nummer in Kombination mit dem empfoh-
lenen Namen verwendet werden [9, 28].
Da die EC-Nummern genau genommen nicht
Enzyme, sondern enzymatische Reaktionen kate-
gorisieren, kann es mitunter vorkommen, dass
einem Protein mehr als nur eine EC-Nummer
zugewiesen wird. Diese Enzyme, die häufig sehr
unterschiedliche chemische Reaktionen kataly-
sieren können, werden als promiskuitiv bezeich-
net. Bislang wurde diese Eigenschaft bei ungefähr
zwei Prozent der bekannten Enzyme nachgewiesen
[3]. Darüber hinaus sind nicht alle Enzyme Pro-
teine. Es gibt auch katalytisch aktive Ribonuklein-
säure (RNS)-Moleküle, die als Ribozyme bezeich-
net werden und ebenfalls EC-Nummern tragen. Ein
Beispiel hierfür ist die RNS-spaltende Ribonuklease
P (EC 3.1.26.5).
 4 K. Castiglione

1 . Tab. 1.1  Klassifizierung von Enzymen [16]

EC-Nummer Hauptklasse Katalysierte Reaktion

EC 1 Oxidoreduktasen Redoxreaktionen
AH2 + B ⇌ A + BH2 oder AH2 + B+ ⇌ A + BH + H+
EC 2 Transferasen Transfer einer spezifischen Gruppe, wie beispielsweise Methyl, Acyl oder
Phosphat, von einer Verbindung auf eine andere
AX + B ⇌ A + BX
EC 3 Hydrolasen Hydrolytische Spaltung von Bindungen
A–B + H2O ⇌ AH + BOH
EC 4 Lyasen Nichthydrolytische Spaltung von Bindungen
A–B ⇌ A + B
EC 5 Isomerasen Geometrische oder strukturelle Neuordnungen innerhalb eines Moleküls
A ⇌ A′
EC 6 Ligasen Schaffung einer kovalenten Bindung gekoppelt an die Hydrolyse eines
Nukleosidtriphosphats (NTP)
A + B + NTP ⇌ A–B + NMP + PP oder
A + B + NTP ⇌ A–B + NDP + P

1.2 Reaktionsordnungen Die Geschwindigkeit v ist direkt proportional zu

der Konzentration des Stoffes A und man spricht
Die Reaktionsordnung charakterisiert die Abhän- von einer Reaktion erster Ordnung. Der Propor-
gigkeit der Geschwindigkeit einer (bio)chemischen tionalitätsfaktor k wird als Geschwindigkeitskons-
Reaktion von den Konzentrationen der Reaktions- tante bezeichnet, deren Dimension abhängig von der
teilnehmer. Die Ordnung einer Reaktion entspricht Reaktionsordnung n ist:
der Summe der Potenzen, mit denen die Konzent-
rationen der Reaktionsteilnehmer in das Geschwin- 1
dim k = n −1
 Gl. 1.3
digkeitsgesetz eingehen. Sehr vielen Reaktionen
kann man eine Ordnung von Null, Eins oder Zwei
( −1
molL ) ⋅s

zuweisen, jedoch können Reaktionsordnungen auch

gebrochen sein. Aus Gl. 1.3 folgt, dass Geschwindigkeitskonstanten
von Reaktionen erster Ordnung die Einheit s–1 tragen.

1.2.1 Reaktionen erster Ordnung

1.2.2 Reaktionen zweiter und höherer
Betrachtet man die einfache Reaktion eines radioak- Ordnung
tiven Zerfalls, bei dem ein Stoff A zum Stoff P umge-
wandelt wird, Bilden die beiden Edukte A und B in einer Reaktion
k das Produkt P,
A→P  Gl. 1.1
k
A + B→ P  Gl. 1.4
ist die Reaktionsgeschwindigkeit durch folgendes
Geschwindigkeitsgesetz gegeben:
so erhöht sich die Reaktionsgeschwindigkeit, wenn
dcA dcP
v =− = = k ⋅ cA  Gl. 1.2 die Konzentrationen von A und B erhöht werden. Für
dt dt die Reaktionsgeschwindigkeit folgt daraus:
Kapitel 1 · Enzymkinetik
5 1

dcA dc dc 1.3 Ligandenbindung

v =− = − B = P = k ⋅ cA ⋅ cB  Gl. 1.5
dt dt dt
Die Bindung zwischen Enzym und Substrat ist der
Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt somit von den erste Schritt jeder enzymatischen Reaktion. Allge-
Konzentrationen der Reaktanten A und B ab und meiner formuliert bindet dabei ein Ligand L an ein
es liegt eine Reaktion zweiter Ordnung vor. Wenn Protein Pr und bildet den Protein-Ligandenkom-
einer der Reaktanten jedoch in einem sehr hohen plex PrL:
Überschuss vorhanden ist, sodass seine Konzentra-
k1
tionsänderung über die Zeit der Reaktion vernach- →
Pr + L ← PrL  Gl. 1.10
lässigbar ist, folgt die Reaktionsgeschwindigkeit den k−1

mathematischen Gesetzmäßigkeiten einer Reaktion

erster Ordnung. In diesem Fall spricht man von einer In der Gleichgewichtssituation ist die Geschwindig-
Reaktion pseudo-erster Ordnung. keit der Bildung des Protein-Ligandenkomplexes PrL
Eine Reaktion zweiter Ordnung liegt ebenfalls identisch mit der Geschwindigkeit seines Zerfalls:
vor, wenn zwei Moleküle A zu einem Molekül P
reagieren: dcPrL dc
= − PrL  Gl. 1.11
dt dt
k
A + A→ P  Gl. 1.6
Nach dem Massenwirkungsgesetz können die
Geschwindigkeiten als Funktion der Konzentration
Bei dieser Reaktion geht die Konzentration des der Reaktanten wie folgt formuliert werden:
Stoffes A in ihrer zweiten Potenz in das Geschwin-
digkeitsgesetz ein: k1 ⋅ cPr ⋅ cL = k−1 ⋅ cPrL  Gl. 1.12

1 dcA dcP Das Verhältnis der beiden Geschwindigkeitskons-

v= − = = k ⋅ cA2  Gl. 1.7 tanten für die Bildung (k1) und den Zerfall von PrL
2 dt dt
(k–1) kann zu einer neuen Konstante zusammenge-
Die Geschwindigkeitskonstanten von Reaktionen fasst werden, die als Bindungskonstante oder auch
zweiter Ordnung haben die Einheit L mol–1 s–1. Assoziationskonstante Ka bezeichnet wird:

k1 c
1.2.3 Reaktionen nullter Ordnung Ka = = PrL  Gl. 1.13
k−1 cPr ⋅ cL

Eine Reaktion nullter Ordnung liegt vor, wenn die Der Begriff der Affinität wird in biochemischen
Reaktionsgeschwindigkeit unabhängig von der Kon- Reaktionen benutzt, um die Bindungsstärke zwi-
zentration der Reaktanten ist. Hierbei ist die Reak- schen einem Protein und seinem Liganden zu cha-
tionsgeschwindigkeit v konstant und die Produkt- rakterisieren. Je höher die Affinität eines Proteins zu
konzentration nimmt linear über die Zeit zu: seinem Liganden ist, desto größer ist die Assozia-
tionskonstante Ka. Gängiger als die Assoziationskon-
k stante Ka ist jedoch der Gebrauch ihres Kehrwertes,
A→ P Gl. 1.8 der Dissoziationskonstante Kd:

dcA dcP k−1 cPr ⋅ cL

v= − = =k  Gl. 1.9 K d = K a−1 = =  Gl. 1.14
dt dt k1 cPrL

Hierbei gilt, dass die Affinität eines Proteins zu

Die Dimension der Geschwindigkeitskonstante k ist seinem Liganden umso höher ist, je niedriger die
in diesem Fall mol L–1 s–1. Dissoziationskonstante Kd ist.
 6 K. Castiglione
1.4 Kinetik von
1 Einsubstratreaktionen
1.4.1 Die Michaelis-Menten-Gleichung
Im einfachsten Fall handelt es sich bei einer
enzymkatalysierten Reaktion um eine irreversible
Ein-Substrat-Ein-Produkt-Reaktion:
k1 k2
→ Anschließend beginnt der Bereich der steady state-
E +S← ES→ E + P  Gl. 1.15
k−1
Das Enzym (E) reagiert mit dem Substrat (S) unter
Bildung eines Enzym-Substrat-Komplexes (ES), der
in freies Enzym und unverändertes Substrat dissozi-
ieren kann oder in freies Enzym und Produkt (P). Die
Konstanten ki sind die Geschwindigkeitskonstanten
der Teilreaktionen, die in Abhängigkeit der Reaktions-
richtung einen positiven oder negativen Index tragen.
G.E. Briggs und J.B.S. Haldane entwickelten im
Jahre 1925 ein kinetisches Modell zur Beschreibung
dieses Reaktionsmechanismus, das auf folgenden
grundlegenden Annahmen basiert [2]:
55 Jeweils ein Enzym- und ein Substratmolekül
bilden einen aktivierten Enzym-Substrat-
Komplex (ES).
55 Der aktivierte ES-Komplex befindet sich im
Fließgleichgewicht der Gesamtreaktion, d. h.
seine Konzentration ist konstant:
dcES
= 0 Gl. 1.16
dt
55 Diese Annahme wird auch als Fließgleichge-
wichts- oder steady state-Annahme bezeichnet.
55 Die Reaktion verläuft weit entfernt vom
thermodynamischen Gleichgewicht, sodass
eine mögliche Rückreaktion im letzten
Reaktionsschritt vernachlässigbar ist. Dies
ist bei der Messung von Anfangsreaktions-
geschwindigkeiten der Fall, da die Produktkon-
zentration in der Anfangsphase der Reaktion
vernachlässigt werden kann ( cP ≅ 0 ).
55 Die Substratkonzentration cS ist viel höher als
die Gesamtkonzentration des in katalytischen
Mengen eingesetzten Enzyms cE0, sodass
die Menge an enzymgebundenem Substrat
vernachlässigbar ist.
. Abb. 1.1 zeigt beispielhaft den zeitlichen Verlauf
der Reaktantenkonzentrationen bei einer enzyma-
tisch katalysierten Reaktion. In der Anfangsphase,
die auch als pre-steady state-Phase bezeichnet wird,
nehmen die Konzentrationen des Substrats und des
freien Enzyms leicht ab, da sich der Enzym-Substrat-
Komplex ES bildet. Diese Phase ist sehr kurz, typi-
scherweise im Bereich von Millisekunden bis Sekun-
den, sodass oft spezielle Messmethoden nötig sind,
um die Veränderungen experimentell zu erfassen.
Phase, in der sich der ES-Komplex im Fließgleich-
gewicht befindet und sich seine Konzentration nicht
ändert, während die Substratkonzentration linear
ab- und die Produktkonzentration in gleicher Weise
zunimmt. In der dritten Phase ist die Substratkonzen-
tration so weit gesunken, dass die Konzentration des
ES-Komplexes abnimmt und die Reaktion verlang-
samt sich. Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit ent-
spricht der Geschwindigkeit in der steady state-Phase.
Die relative Dauer der einzelnen Phasen ist von den
Relationen der Geschwindigkeitskonstanten abhän-
gig. Darüber hinaus ist der lineare Bereich umso
länger, je besser die Bedingung cS ≫ cE0 erfüllt ist.
Die Reaktionsgeschwindigkeit in der steady
state -Phase entspricht der Geschwindigkeit der Pro-
duktzunahme und ist proportional zur Konzentra-
tion des Enzym-Substrat-Komplexes ES:
dcP
v= = k2 ⋅ cES  Gl. 1.17
dt
Da die Konzentration von ES jedoch messtechnisch
sehr schwer zugänglich ist, muss ein alternativer
Ausdruck dafür gefunden werden. Betrachtet man
zunächst die gesamte Enzymkonzentration cE0, so
entspricht sie der Summe der Konzentrationen an
freiem Enzym E und substratgebundenem Enzym ES:
cE 0 = cE + cES  Gl. 1.18
Mit Hilfe dieses Zusammenhangs kann man nun die
Geschwindigkeiten für die Bildung und den Zerfall
wie folgt ausdrücken:
vES−Bildung = k1 ⋅ (cE 0 − cES ) ⋅ cS  Gl. 1.19
vES−Zerfall = k−1 ⋅ cES + k2 ⋅ cES  Gl. 1.20
 Kapitel 1 · Enzymkinetik
7 1

  
 
Y GFSGW
 

F(F(6P0
F6F3P0

 

 

 

 
     
WV

. Abb. 1.1  Zeitliche Änderung der Reaktantenkonzentrationen einer enzymkatalysierten Reaktion. 1 pre-steady state-
Phase, 2 steady state-Phase, 3 post-steady state-Phase. Rot: cE, Schwarz: cES, Rot gestrichelt: cP, Schwarz gestrichelt: cS. Die
Reaktionsgeschwindigkeit in der steady state-Phase entspricht der Steigung der gepunkteten Gerade

Berücksichtigt man nun die oben getroffene Dadurch vereinfacht sich Gl. 1.23 zu:
Annahme, dass sich der ES-Komplex im Fließgleich-
gewicht der Gesamtreaktion befindet und seine Kon- cE 0 . cS
zentration konstant ist, muss die Geschwindigkeit cES =  Gl. 1.25
der ES-Bildung gleich der Geschwindigkeit des ES- cS + K m
Zerfalls sein:
Setzt man nun Gl. 1.25 in Gleichung Gl. 1.17 ein, erhält
vES−Bildung =vES−Zerfall  Gl. 1.21 man:

k2 ⋅ cE 0 ⋅ cS
v=  Gl. 1.26
k1.(cE 0 − cES )⋅ cS = k−1 ⋅ cES + k2 ⋅ cES  Gl. 1.22 cS + K m

Da die maximale Reaktionsgeschwindigkeit v max

Löst man Gl. 1.22 nach cES auf und fasst die Geschwin- erreicht ist, wenn alle Enzyme mit Substrat gesättigt
digkeitskonstanten zusammen, erhält man: sind und demnach die Konzentration des Enzym-
Substrat-Komplexes cES gleich der gesamten Enzym-
konzentration cE0 ist, gilt:
cE 0 ⋅ cS
cES =  Gl. 1.23
 k + k 

cS +  − 1 2 
 k  vmax = k2 ⋅ cE 0  Gl. 1.27
1 

Die Geschwindigkeitskonstanten lassen sich durch Mit diesem Zusammenhang vereinfacht sich Gl. 1.26
die Michaeliskonstante Km ersetzen, die wie folgt noch weiter zu:
definiert ist:
vmax ⋅ cS
k−1 + k2 v=  Gl. 1.28
Km =  Gl. 1.24 cS + K m
k1
 8 K. Castiglione
Diese von Briggs und Haldane entwickelte Bezie-
1 hung wird auch als Michaelis-Menten-Gleichung
bezeichnet. Leonor Michaelis und Maud Menten
haben sich 1913 ebenfalls mit der kinetischen
Beschreibung von Enzymreaktionen beschäftigt
[22]. Die beiden Wissenschaftler trafen bei der Her-
leitung der Gleichung jedoch nicht die Annahme,
dass sich der ES-Komplex im Fließgleichgewicht der
Gesamtreaktion befindet (steady state-Annahme).
Michaelis und Menten gingen davon aus, dass die
Umsetzung des Enzym-Substrat-Komplexes zu
freiem Enzym und Produkt (k2) der geschwindig-
keitsbestimmende Schritt der Gesamtreaktion ist.
Die Geschwindigkeit der Gleichgewichtseinstel-
lung zwischen freiem Enzym, Substrat und Enzym-
Substrat-Komplex ist vergleichsweise schnell und die
zugehörigen Geschwindigkeitskonstanten k1 und
k–1 sind wesentlich größer als k2. Durch diese soge-
nannte rapid equilibrium-Annahme vereinfacht sich
die Michaeliskonstante zu:
k Km + Km 2
K m = −1  Gl. 1.29
k1
Die Form der Geschwindigkeitsgleichung Gl. 1.28
ist unabhängig davon, ob man von der steady state-
Annahme (Briggs-Haldane-Gleichung) oder der
rapid equilibrium-Annahme (Michaelis-Menten-
Gleichung) ausgeht.
In . Abb. 1.2 ist die Abhängigkeit der Geschwin-
digkeit der enzymatischen Reaktion von der Subst-
ratkonzentration gezeigt. Der typische hyperbolische
Verlauf der Kurve, die sich asymptotisch an vmax annä-
hert, ergibt sich aus folgenden Gesetzmäßigkeiten:
55 cS ≤ 0,01 Km: Bei sehr niedrigen Substratkon-
zentrationen ist die Substratkonzentration im
Nenner von Gl. 1.28 vernachlässigbar und die
Formel vereinfach sich zu:
vmax ⋅cS
v=  Gl. 1.30
Km
Die Reaktionsgeschwindigkeit ist in diesem
Bereich linear abhängig von der Substrat-
konzentration und es liegt eine Reaktion erster
Ordnung vor.
55 cS = Km: Wenn die Substratkonzentration
gleich der Michaeliskonstante ist, entspricht
die Reaktionsgeschwindigkeit der halben
Y YPD[
YPD[


F6 .P F6

. Abb. 1.2  Abhängigkeit der Geschwindigkeit einer
enzymkatalysierten Reaktion von der Substratkonzentration
nach Gl. 1.28
Maximalgeschwindigkeit vmax, was sich durch
Einsetzen der Substratkonzentration cS = Km in
Gl. 1.28 überprüfen lässt:
vmax ⋅K m 1
v= = vmax  Gl. 1.31
55 cS > 100 Km: Bei sehr hohen Substratkonzent-
rationen ist die Michaeliskonstante im Nenner
von Gl. 1.28 vernachlässigbar und die Gleichung
vereinfacht sich zu v = vmax. Unter diesen
Bedingungen ist die Reaktionsgeschwindigkeit
unabhängig von der Substratkonzentration
und es liegt eine Reaktion nullter Ordnung vor.
Eine Erhöhung der Substratkonzentration hat
in diesem Bereich keine Geschwindigkeitsstei-
gerung zur Folge, da alle aktiven Zentren der
Enzyme besetzt sind.
1.4.2 Die kinetischen Parameter Km
und kcat
Für jedes Enzym, dessen Kinetik sich mit der Michae-
lis-Menten-Gleichung Gl. 1.28 beschreiben lässt, gilt
die Beziehung, dass die halbmaximale Reaktions-
geschwindigkeit des Enzyms erreicht ist, wenn die
Substratkonzentration gleich der Michaeliskonstante
Km ist. Aus diesem Grund wird die Michaeliskons-
tante auch als Halbsättigungskonstante bezeichnet.
Die tatsächliche Bedeutung der Michaeliskonstante
Km ist jedoch von Enzym zu Enzym unterschiedlich,
da hier der genaue Reaktionsmechanismus sowie die
Kapitel 1 · Enzymkinetik
relative Geschwindigkeit der einzelnen Reaktions-
schritte zu berücksichtigen sind.
Gelegentlich wird die Michaeliskonstante Km
benutzt, um die Affinität eines Enzyms zu einem
Substrat zu charakterisieren. In diesem Fall wird die
Michaeliskonstante mit der Dissoziationskonstante
Kd (7 Abschn. 1.3) des Enzym-Substrat-Komple-
xes gleichgesetzt. Dies ist jedoch nur dann korrekt,
wenn die rapid equilibrium-Annahme zutrifft und
die Geschwindigkeitskonstante k2 viel kleiner ist als
k1 und k–1. In diesem Fall gilt:
k−1 cS ⋅ cE
Km = = = Kd  Gl. 1.32
k1 cES
Dieser Zusammenhang gilt jedoch nicht für jedes
Enzym. Wenn k2 wesentlich größer ist als k–1, entspricht
Km dem Verhältnis von k2 zu k1. Sind alle drei Werte in
der gleichen Größenordnung, ist Km eine Funktion aller
drei Geschwindigkeitskonstanten nach Gl. 1.24.
Neben der Michaeliskonstante ist die Wechsel-
zahl kcat (engl. turnover number) ein weiterer wich-
tiger kinetischer Parameter. Sie gibt an, wie viele
Substratmoleküle von einem aktiven Zentrum eines
Enzyms pro Sekunde umgesetzt werden, wenn das
Enzym mit Substrat gesättigt ist. Lässt sich eine enzy-
matische Reaktion mit Hilfe der Michaelis-Menten-
Kinetik beschreiben, entspricht kcat der Geschwin-
digkeitskonstante k2 und es gilt:
vmax = kcat ⋅ cE 0  Gl. 1.33
Die Wechselzahl ist somit eine Geschwindigkeitskons-
tante erster Ordnung und hat die Einheit s–1. Ist neben
der Wechselzahl auch die molekulare Masse eines
Enzyms (ME) bekannt, kann die spezifische Aktivi-
tät eines Enzyms berechnet werden (Gl. 1.34). Sie wird
üblicherweise in der Einheit Units (U) pro Milligramm
Enzym angegeben. Eine Unit ist dabei definiert als
diejenige Enzymmenge, die unter den angegebenen
Bedingungen 1 µmol Substrat pro Minute umsetzt.
( )
kcat s−1 ⋅ 60.000
(
vmax U mg−1 = ) M E (g mol−1 )
 Gl. 1.34
Die eigentliche SI-Einheit der Enzymaktivität ist
Katal (1 kat = 1 mol s–1). Da die Zahlenwerte typi-
scher Enzymaktivitäten bei Verwendung dieser
9 1
Einheit jedoch unzweckmäßig klein sind (1 U =
16,7 nkat), hat sich Katal gegenüber der Einheit Unit
bislang nicht durchgesetzt. Bei der Berechnung der
spezifischen Aktivität von Enzymen mit mehreren
Untereinheiten muss beachtet werden, dass sich die
Wechselzahl auf ein aktives Zentrum bezieht. Daher
muss bei der Umrechnung von kcat in die spezifi-
sche Aktivität im Falle eines oligomeren Enzyms die
molekulare Masse des Monomers verwendet werden.
Die molekulare Masse von Enzymen wird häufig in
der Einheit Dalton (Da) angegeben, wobei der Zah-
lenwert zur Angabe in g mol–1 identisch ist.
Das Verhältnis von kcat zu Km wird als katalytische
Effizienz bezeichnet und wird häufig dazu verwen-
det, Enzyme zu vergleichen, welche die gleiche Reak-
tion katalysieren, oder Aussagen darüber zu treffen,
welches Substrat von einem Enzym besser umge-
setzt wird. Gerade beim Vergleich von verschiedenen
Enzymen muss jedoch auch die Substratkonzentration
berücksichtigt werden, bei der eine enzymatische Reak-
tion ablaufen soll. Nicht immer ist das Enzym mit der
höheren katalytischen Effizienz auch der bessere Kata-
lysator unter einer vorgegebenen Bedingung. Trägt man
die Reaktionsgeschwindigkeiten von zwei Enzymen A
und B in Abhängigkeit der Substratkonzentration in
ein gemeinsames Diagramm ein, so gibt es je nach Ver-
hältnis der kinetischen Parameter einen Schnittpunkt
der beiden hyperbolischen Kurven (. Abb. 1.3a) oder
die Kurven schneiden sich nicht (. Abb. 1.3b). Einen
Schnittpunkt gibt es immer dann, wenn die Bedingung
B
kcat
K mB > ⋅ K mA  Gl. 1.35
A
kcat
erfüllt ist. Der Schnittpunkt entspricht einer kriti-
schen Substratkonzentration c S,kritisch, bei der die
Geschwindigkeiten beider Enzyme bei gleicher
Enzymkonzentration identisch sind:
A
kcat ⋅ K mB − kcat
B
⋅ K mA
cS,kritisch = B A
 Gl. 1.36
kcat − kcat
Unabhängig von der katalytischen Effizienz der
beiden Enzyme A und B zeigt ober- und unterhalb
von cS,kritisch jeweils ein anderes Enzym eine höhere
Reaktionsgeschwindigkeit. Ist Gl. 1.35 nicht erfüllt, ist
stets das Enzym mit der höheren katalytischen Effi-
zienz unabhängig von der vorliegenden Substratkon-
zentration der bessere Katalysator [11].
 10 K. Castiglione

Die Reaktionsgeschwindigkeit, d. h. die Veränderung

1 D  der Produktkonzentration über die Zeit, lässt sich
bei einer reversiblen Reaktion wie folgt formulieren:

YP06

dcP
v= = k2 ⋅ cES − k−2 ⋅ cE ⋅ cP  Gl. 1.38
 dt

 Analog zur Herleitung der Michaelis-Menten-Glei-

chung (7 Abschn. 1.4.1) gelten im Fließgleichgewicht
 folgende Zusammenhänge:
     
FVP0 dcES
FVNULWLVFK = 0 Gl. 1.39
dt

E
 cE 0 = cE + cES Gl. 1.40

 vES−Bildung = k1 ⋅ cE ⋅ cS + k−2 ⋅ cE ⋅ cP  Gl. 1.41

YP06

 vES−Zerfall = k−1 ⋅ cES + k2 ⋅ cES  Gl. 1.42


k1 ⋅ cE ⋅ cS + k−2 ⋅ cE ⋅ cP = k−1 ⋅ cES + k2 ⋅ cES  Gl. 1.43

      k1 ⋅ cS + k−2 ⋅ cP
cES = ⋅ cE  Gl. 1.44
FVP0 k−1 + k2

Teilt man die Geschwindigkeitsgleichung Gl. 1.38

. Abb. 1.3  Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit
durch Gl. 1.40
von der Substratkonzentration für zwei verschiedene Enzyme
A und B mit unterschiedlichen katalytischen Effizienzen.
In beiden Fällen hat Enzym A eine vierfach höhere v k ⋅ c − k−2 ⋅ cE ⋅ cP
= 2 ES  Gl. 1.45
A = 5 s–1, A
katalytische Effizienz als Enzym B. a) rot: kcat
cE 0 cE + cES
Km
= 0,25 mM, kcat B = 10 s–1,
A
/ K mA = 20 s−1 mM−1 , schwarz: kcat und substituiert cES durch den Ausdruck in Gl. 1.44
B = 2 mM, B B = 5 s−1mM−1; b) rot: k A = 10 s–1, K A
Km kcat / K m cat m erhält man:
A / K A = 5 s−1mM−1 , schwarz: k B = 5 s–1, K B
= 2 mM, kcat m cat m

B / K B = 1, 25 s−1mM−1
= 4 mM, kcat k1 ⋅ k2 ⋅ cS ⋅ cE 0 k−1 ⋅ k−2 ⋅ cP ⋅ cE 0
m −
k−1 + k2 k−1 + k2
v=  Gl. 1.46
1.4.3 Reversible k1 ⋅ cS k−2 ⋅ cP
1+ +
Einsubstratreaktionen k−1 + k2 k−1 + k2

Die klassische Michaelis-Menten-Gleichung Gl. 1.28 Da die Geschwindigkeitskonstanten der Teilreaktio-

beschreibt den Verlauf von irreversiblen Ein-Subs- nen ki nur schwer direkt bestimmbar sind, werden
trat-Ein-Produkt-Reaktionen. In vielen Fällen ist sie durch einfach experimentell zugängliche kineti-
jedoch die Rückreaktion nicht vernachlässigbar: sche Konstanten ersetzt. Die Michaeliskonstanten für
Substrat und Produkt, KmS und KmP , sowie die maxi-
k1 k2
→ malen Geschwindigkeiten der Hin- und Rückreak-
E +S← ES →
← E+P  Gl. 1.37
k−1 k−2 tion, vmax,f und vmax,r , sind dabei wie folgt definiert:
Kapitel 1 · Enzymkinetik
11 1

k−1 + k2 k + k2
K mS = ; K mP = −1 ;vmax ,f = k2 ⋅ cE 0 ;vmax , r = k−1 ⋅ cE 0  Gl. 1.47
k1 k−2

Hierdurch kommt man zur allgemeinen Gleichung
für reversible Ein-Substrat-Ein-Produkt-Reaktionen:
cS c bezeichnet. Sie verdeutlicht, dass die maximalen
vmax ,f ⋅ −vmax ,r ⋅ P
K mS K mP
v=  Gl. 1.48
c c
1+ S + P
K mS K mP
Unter Anfangsreaktionsbedingungen, wenn je nach
betrachteter Reaktionsrichtung die Substrat- oder
die Produktkonzentration gleich Null ist, vereinfacht
sich Gl. 1.48 zur Michaelis-Menten-Gleichung 1.28 für
die Hin- bzw. Rückreaktion.
Eine wichtige Größe bei der Beschreibung rever-
sibler Reaktionen ist die Gleichgewichtskonstante
Keq, die durch das Verhältnis der Substrat- und Pro-
duktkonzentrationen im thermodynamischen
Gleichgewicht definiert ist. Die Gleichgewichts-
konstante der Gesamtreaktion kann jedoch auch als
Produkt der Gleichgewichtskonstanten der Teilreak-
tionen ausgedrückt werden. Für eine reversible Ein-
Substrat-Ein-Produkt-Reaktion gilt daher:
Diese Beziehung zwischen der thermodynamischen
Gleichgewichtskonstante einer Reaktion und den
kinetischen Parametern wird als Haldane-Beziehung
Reaktionsgeschwindigkeiten und die Michaeliskon-
stanten von Substrat und Produkt nicht unabhängig
voneinander sind. Ändert man beispielsweise durch
Mutagenese das Bindeverhalten zwischen Substrat
und Enzym und demnach die Michaeliskonstante
KmS, nimmt zwangsläufig mindestens ein anderer
kinetischer Parameter ebenfalls einen anderen Wert
an, da Keq unveränderlich ist.
1.5 Identifikation von kinetischen
Parametern
Gängige Methoden zur experimentellen Identifika-
tion kinetischer Parameter von Enzymen sind die
Messung von Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten
sowie die Analyse von Verlaufskurven. Im Folgenden
werden beide Methoden näher dargestellt.

cP,eq k1 ⋅ k2
K eq = = K1 ⋅ K 2 =  Gl. 1.49 1.5.1 Messung von Anfangsreaktions­
cS,eq k−1 ⋅ k−2
geschwindigkeiten
Die Gleichgewichtskonstante kann somit mit Hilfe
der gleichen Geschwindigkeitskonstanten ausge- Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit lässt sich
drückt werden, die auch in die kinetischen Kons- durch die Auswertung von Zeit-Umsatz-Kurven
tanten Km und v max eingehen. Aus diesem Grund einfach ermitteln. Hierfür wird die Geschwindig-
ist es auch möglich, die Gleichgewichtskonstante keit der Produktzunahme oder der Substratab-
direkt durch K m und v max auszudrücken. Wenn nahme in der steady state-Phase (7 Abschn. 1.4.1)
eine Reaktion im thermodynamischen Gleichge- der Reaktion gemessen, in der sich die Konzen-
wicht ist, kompensieren sich die Hin- und die Rück- tration des Enzym-Substrat-Komplexes nicht
reaktion und die Nettogeschwindigkeit v ist Null. ändert. Die Anlaufphase der Reaktion, die direkt
Durch Einsetzen dieser Beziehung in Gl. 1.48 und nach dem schnellen Vermischen von Enzym und
Auflösen folgt: Substrat(en) auftritt und als pre-steady state-
Phase bezeichnet wird, ist in der Regel ohne spe-
vmax ,f ⋅K mP ⋅ cS,eq = vmax ,r ⋅K mS ⋅ cP,eq  Gl. 1.50 zielle Messmethoden experimentell nicht zugäng-
lich. Innerhalb von Millisekunden bis Sekunden
stellt sich das Fließgleichgewicht der Reaktion
cP,eq vmax ,f ⋅ K mP k1 ⋅ k2 ein, sodass diese Phase bei der Bestimmung der
= = = K eq  Gl. 1.51
cS,eq vmax , r ⋅ K mS k−1 ⋅ k−2 Anfangsreaktionsgeschwindigkeit meist vernach-
lässigt werden kann.
 12 K. Castiglione

Teil der Zeit-Umsatz-Kurven. Die Linearität ist in

1 
GFSGW Y
der Regel bis zu einem Umsatz von 10 % gewähr-
 leistet. Für die genaue Schätzung kinetischer Para-
meter sollten mindestens zehn Anfangsreaktionsge-

GFSGW Y schwindigkeiten in einem Bereich von 0,1 bis 10 Km
FSP0

 gemessen werden.
 GFSGW Y
Für die Aufnahme von Zeit-Umsatz-Kurven
sind kontinuierliche Messmethoden, wie beispiels-
 weise photometrische Messungen, ideal geeignet, da
 hierbei der Verlauf der Reaktion unmittelbar verfolgt
      werden kann. Vor allem bei der kinetischen Untersu-
WPLQ chung von Enzymen aus der Klasse der Oxidoreduk-
tasen, die oxidiertes oder reduziertes Nikotinamid-
Adenin-Dinucleotid-(Phosphat) (NAD(P)(H)) als
. Abb. 1.4  Ermittlung von Anfangsreaktionsgeschwindig-
Cofaktor benötigen, kann die Konzentrationsände-
keiten bei drei verschiedenen Substratkonzentrationen (cS1
(durchgezogene Linie) < cS2 (gestrichelte Linie) < cS3 (gepunk- rung der reduzierten Formen sehr einfach bei 340 nm
tete Linie). Die Ausgleichsgeraden im linearen Bereich der photometrisch verfolgt werden. Während NAD(P)H
Zeit-Umsatz-Kurven sind in Rot dargestellt bei dieser Wellenlänge absorbiert, zeigen die oxidier-
ten Formen keine Absorption. Die Konzentrations-
Für die Erstellung eines typischen Michaelis- änderung der Cofaktoren ist dabei stöchiometrisch
Menten-Diagramms und für die Identifikation der zur Konzentrationsänderung des Produkts.
zugehörigen kinetischen Parameter Km und v max Wenn weder Substrat noch Produkt einer Reak-
muss die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit der enzy- tion für eine kontinuierliche Messung geeignet sind,
matischen Reaktion für eine Reihe definierter Subs- kann man die zu verfolgende Reaktion mit einer
tratkonzentrationen gemessen werden. . Abb. 1.4 oder mehreren weiteren Reaktionen koppeln, die
zeigt beispielhaft die Ermittlung von Anfangsre- ein online messbares Signal ergeben. Beispielsweise
aktionsgeschwindigkeiten bei drei verschiedenen kann mit Hilfe eines gekoppelten Assays die Reak-
Substratkonzentrationen. Die Anfangsreaktionsge- tionsgeschwindigkeit der Hexokinase gemessen
schwindigkeit entspricht der Steigung im linearen werden (. Abb. 1.5). Dieses Enzym setzt Glucose zu

2
2+
2+ 3
2 +H[RNLQDVH +2
+2 2
+2 2
2+ 2+ +2
$73 $'3 +2
2+ 2+

2 2 2
2+ 2+ 2+
3 *OXFRVHSKRVSKDW 3 3
+2 GHK\GURJHQDVH +2 + 2 +2
2 2 2
2 2 2+
+2 +2 +2
+2 +2 +2 2+
2+ 2+ 1$'3 1$'3++
2+ 2 2+ 2
SKRWRPHWULVFKH
'HWHNWLRQEHL
QP

. Abb. 1.5  Reaktionsschema zur Messung der Geschwindigkeit der Hexokinase-Reaktion durch einen gekoppelten Assay
Kapitel 1 · Enzymkinetik
Glucose-6-phosphat unter ATP-Verbrauch um. Da
keines der Substrate oder Produkte der Reaktion ein-
zigartige spektrale Eigenschaften aufweist, die eine
direkte Verfolgung der Reaktion ermöglichen, wird
ein zweites Enzym zugegeben. Die Glucose-6-phos-
phatdehydrogenase oxidiert Glucose-6-phosphat
zu 6-Phosphogluconolacton, während gleichzeitig
NADP+ zu NADPH reduziert wird, das photomet-
risch detektierbar ist. Bei der Anwendung gekoppel-
ter Assays ist es sehr wichtig, dass die zweite Reaktion
nicht limitierend ist, da sonst die Geschwindigkeit
des Detektionsenzyms und nicht des Zielenzyms
gemessen werden würde. Daher werden Detek-
tionsenzym(e) und zusätzlich benötigte Substrate
stets im Überschuss zugegeben. Zudem sollte das
Gleichgewicht der Detektionsreaktion weit auf der
Produktseite liegen. Im Falle der Glucose-6-phos-
phatdehydrogenase hydrolysiert das gebildete Glu-
conolacton spontan zur Gluconsäure und wird somit
dem Gleichgewicht entzogen.
Ist eine kontinuierliche Messung nicht möglich,
kann die Reaktionsgeschwindigkeit auch aus einer
diskontinuierlichen Zeit-Umsatz-Kurve ermittelt
werden. Hierbei werden nach dem Start der Reak-
tion in definierten Zeitabständen Proben genom-
men, bei denen die enzymatische Reaktion bei-
spielsweise durch Zugabe von Säure gestoppt wird.
Die Prozedur, die zum Abstoppen der Reaktion ver-
wendet wird, ist spezifisch für das jeweilige Enzym
und muss auch die Stabilität der Reaktionsprodukte
und die gewählte Analysenmethode berücksichtigen.
Im Anschluss kann der Umsatz in jeder Probe durch
geeignete Messmethoden, wie beispielsweise Hoch-
leistungsflüssigkeitschromatographie (High Perfor-
mance Liquid Chromatography, HPLC), bestimmt
werden.
Lineare und nichtlineare Regression
Die Identifikation der enzymkinetischen Parame-
ter kann durch lineare oder nichtlineare Regression
erfolgen. Konzeptionell beruhen beide Methoden auf
der gleichen Vorgehensweise, da jeweils die Unter-
schiede zwischen experimentellen (yi,experimentell)
und berechneten Werten (y i,berechnet) minimiert
werden. Während bei der linearen Regression stets
eine Geradengleichung y = mx + b zugrunde gelegt
wird, kann bei der nichtlinearen Regression jede
13 1
Gleichung der Form y = f(x) verwendet werden, die
einen oder mehrere zu schätzende Parameter enthält.
In beiden Fällen werden die Parameter identifiziert,
bei denen die Fehlerquadratsumme zwischen den
experimentellen Daten und den berechneten Werten
minimal ist:
2
( yi,berechnet − yi,experimentell )
∑
N
χ2 =  Gl. 1.52
i =1 σi2
Dabei entspricht N der Anzahl der Messwerte. In
Gl. 1.52 wird die Varianz jedes individuellen Daten-
punktes σi2 berücksichtigt. Werte mit großer Mess-
unsicherheit und folglich mit einer großen Stan-
dardabweichung werden weniger stark gewichtet
als akkurate Messergebnisse mit geringer Standard-
abweichung. Hierbei müssen jedoch auch die Grund-
annahmen erfüllt sein, dass keine systematischen
Fehler vorliegen und die Fehler normalverteilt sind.
Linearisierungsverfahren wurden in der Ver-
gangenheit häufig für die grafische Bestimmung
der Parameter Km und v max eingesetzt. Diese Ver-
fahren sind zwar anschaulich, jedoch führen sie zu
einer teils erheblichen Verfälschung der Ergebnisse,
da die Umformung einer nichtlinearen Gleichung
in eine lineare Form auch Verzerrungen des Koor-
dinatenraums und der Fehlerverteilung nach sich
zieht. Bei der nichtlinearen Regression kommt es zu
keiner Verzerrung der ursprünglichen Fehlervertei-
lung, da die Originaldaten ohne weitere Transfor-
mation ausgewertet werden können [20]. Da Com-
puterprogramme zur Durchführung nichtlinearer
Regressionen mittlerweile zur Standardausstattung
biotechnologischer Labore gehören, ist die deut-
lich präzisere Schätzung kinetischer Parameter mit
Hilfe von nichtlinearer Regression heute Stand der
Technik. Da sich Linearisierungen jedoch zur Dar-
stellung der Ergebnisse enzymkinetischer Versuche
sehr gut eignen, weil Zusammenhänge gut visuali-
sierbar sind, sollen die verschiedenen Linearisie-
rungsverfahren dennoch kurz vorgestellt werden.
Linearisierungsverfahren
Die Michaelis-Menten-Gleichung Gl. 1.28 kann durch
drei verschiedene Linearisierungsverfahren sehr
einfach in Geradengleichungen umgeformt werden.
 14 K. Castiglione

Das am häufigsten verwendete Linearisierungs-

1 verfahren ist die doppelt-reziproke Darstellung nach
D

Lineweaver-Burk. Stellt man die reziproke Michaelis- Y

Menten-Gleichung so um, dass sie der allgemeinen
Geradengleichung y = mx + b entspricht, ergibt sich
folgender Zusammenhang:

1 K 1 1 .PYPD[
= m ⋅ +  Gl. 1.53 YPD[
v vmax cS vmax

Die Auftragung der reziproken Reaktionsgeschwin-

digkeit gegen den Kehrwert der Substratkonzentration 
 FV
ergibt eine Gerade mit der Steigung Km/vmax, welche die
x-Achse bei –1/Km, und die y-Achse bei 1/vmax, schnei- .P
det (. Abb. 1.6a). Der grundlegende Nachteil der rezi- E
proken Darstellung ist die Stauchung der Messwerte in
Y
Richtung des Koordinatenkreuzes, wie . Abb. 1.7 zeigt. YPD[
Die Messwerte bei kleineren Substratkonzentrationen,
die beispielsweise aufgrund geringerer Signal-Rausch-
Verhältnisse meist zudem schlechter bestimmbar sind,
bekommen dadurch ein überproportionales Gewicht
bei der linearen Regression. Darüber hinaus wirkt sich
die doppelt-reziproke Darstellung auch negativ auf die .P YPD[.P
Fehlergrenzen der abhängigen Variable v aus. Nimmt
man einen konstanten absoluten Fehler bei allen Subs- 
tratkonzentrationen an, vergrößern sich die Fehler-  YFV
grenzen mit zunehmendem Abstand von der Ordinate
deutlich. Bei einem einfachen linearen Regressionsver-
F
fahren werden jedoch alle Messwerte gleichermaßen
FV9
gewichtet, sodass kleine Messunsicherheiten bei nied-
rigen Substratkonzentrationen die Lage der Regres-
sionsgeraden in beträchtlichem Maß beeinflussen. Die
Nutzung von Gewichtungsfaktoren kann diesem Effekt
entgegenwirken, findet jedoch selten Anwendung.
Zur Erstellung des sogenannten Eadie-Hofstee-
Diagramms wird die reziproke Michaelis-Menten-
Gleichung Gl. 1.53 mit vmax v multipliziert und nach .PYPD[
v aufgelöst:

 FV
v
v = −K m ⋅ +vmax  Gl. 1.54
.P
cS

Bei der Auftragung von v gegen v/c S entspricht . Abb. 1.6  Lineare Darstellungen der Michaelis-
der Ordinatenschnittpunkt der Geraden v max Menten-Gleichung. a) Lineweaver-Burk-Darstellung,
und die Steigung –Km (. Abb. 1.6b). Ebenso wie b) Eadie-Hofstee-Darstellung, c) Hanes-Woolf-Darstellung
bei der Lineweaver-Burk-Darstellung weist die
Kapitel 1 · Enzymkinetik
15 1

Y Y

 
 F6  F6

Y FVY

 
 YF6  F6

. Abb. 1.7  Fehlergrenzen in verschiedenen Darstellungsarten der Michaelis-Menten-Gleichung unter Annahme eines
konstanten absoluten Fehlers. a) Direkte Auftragung, b) Lineweaver-Burk-Darstellung, c) Eadie-Hofstee-Darstellung, d) Hanes-
Woolf-Darstellung

Eadie-Hofstee-Darstellung eine deutliche Verzer-
rung der Fehlergrenzen auf ( . Abb. 1.7c) und es
kommt der Nachteil der fehlenden Trennung von
abhängigen und unabhängigen Variablen hinzu.
Die Ungenauigkeiten bei der Bestimmung der
Reaktionsgeschwindigkeiten gehen somit in beide
Achsen ein und die Fehlerbalken konvergieren zum
Ursprung.
Die Multiplikation von Gleichung Gl. 1.53 mit der
Substratkonzentration cS ergibt eine weitere Gera-
dengleichung, welche dem sogenannten Hanes-
Woolf-Diagramm zugrunde liegt:
cS 1 K
= ⋅ cS + m  Gl. 1.55
v vmax vmax
Die Auftragung von cS/v gegen cS ergibt eine Gerade
mit der Steigung 1/vmax und dem y-Achsenabschnitt
Km/vmax (. Abb. 1.6c). Die Fehlergrenzen der Mess-
werte werden von dieser Darstellung nur in gerin-
gem Maße beeinflusst (. Abb. 1.7d). Ein wesentli-
cher Nachteil dieses Linearisierungsverfahrens ist
jedoch, dass auch hier abhängige und unabhängige
Variablen nicht getrennt sind, da cS in den x- und
y-Wert eingeht.
 16 K. Castiglione

1.5.2 Verlaufskurvenanalyse da mehr Informationen aus einem einzelnen Expe-

1 riment gewonnen werden können. Darüber hinaus
Eine Alternative zur Messung von Anfangsreaktions-
geschwindigkeiten ist die Analyse von Verlaufskur-
ven. Hierbei wird die enzymatische Reaktion nicht
nur in der Anfangsphase der Reaktion verfolgt,
sondern weit über die steady state-Phase hinaus. Die
kompletten Umsatzkurven werden dann unmit-
telbar für die Ermittlung der kinetischen Konstan-
ten mittels nichtlinearer Regression herangezogen.
Hierbei steht man jedoch zunächst vor dem Problem,
dass Enzymaktivitäten durch Geschwindigkeiten aus-
gedrückt werden, während die experimentellen Daten
in Form von Konzentrationen erhoben werden. Für
eine Parameterschätzung werden daher die gemes-
senen Konzentrationen entweder differenziert oder
das Geschwindigkeitsgesetz wird integriert. Das ein-
fachste integrierte Geschwindigkeitsgesetz ist die inte-
grierte Michaelis-Menten-Gleichung. Die Reaktions-
geschwindigkeit entspricht der Geschwindigkeit der
Produktzunahme beziehungsweise Substratabnahme:
dc dc v ⋅c
v = P = − S = max S 
dt dt cS + K m
Durch Umstellen und Invertieren folgt:
cS + K m
vmax dt = − ⋅ dcS
cS
können Aspekte wie Rückreaktion, Produktinhi-
bierung, Produktzerfall und Enzyminaktivierung
ebenfalls betrachtet werden, die bei der Messung
von Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten entweder
implizit ausgeschlossen oder aufgrund der Kürze der
Messzeit nicht erfasst werden. Hierbei muss jedoch
das verwendete Geschwindigkeitsgesetz ebenfalls
angepasst werden. In . Abb. 1.8 ist eine enzymati-
sche Reaktion zu sehen, bei der das Produkt während
der Reaktion zerfällt. Die Änderung der Produkt-
konzentration über die Zeit entspricht daher der Dif-
ferenz zwischen der Produktbildung über die enzy-
matische Reaktion und dem Produktzerfall, der eine
klassische Reaktion erster Ordnung (7 Abschn. 1.2.1)
darstellt:
dcP
=v−kZerfall ⋅ cP  Gl. 1.62
dt
Da bei industriellen enzymatischen Prozessen ein
hoher Umsatz angestrebt wird und auch Langzeit-
Gl. 1.56
phänomene wie Enzyminaktivierung und Pro-
duktzerfall von besonderer Bedeutung sind, ist die
Analyse von Verlaufskurven vor allem im Hinblick
auf den höheren Informationsgehalt im Vergleich zur
Messung von Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten
Gl. 1.57
interessant.

Durch Integration ergibt sich:

t cS
cS + K m
vmax
∫ t0
∫
dt = −
cS0 cS
⋅ dcS  Gl. 1.58 


t cS cS

dcS
FSP0

vmax
∫ t0
dt = −K m ⋅
∫ cS 0 cS
−
∫
cS 0
dcS  Gl. 1.59 

c 
vmax ⋅t = −K m ⋅ ln S − (cS − cS0 )  Gl. 1.60
cS0


cS0       
vmax ⋅t = K m ⋅ ln + (cS0 − cS )  Gl. 1.61 WK
cS

. Abb. 1.8  Verlaufskurven einer enzymatischen

Im Vergleich zur Messung von Anfangsreaktions- Reaktion mit Produktzerfall bei drei verschiedenen
geschwindigkeiten, reduziert sich bei der Verlaufs- Substratkonzentrationen (cS1 (durchgezogene Linie) < cS2
kurvenanalyse die Anzahl der nötigen Experimente, (gestrichelte Linie) < cS3 (gepunktete Linie))
Kapitel 1 · Enzymkinetik
1.6 Modulatoren enzymatischer
Aktivität
Die Aktivität von Enzymen wird in entscheidendem
Maße von den Umgebungsbedingungen wie Tempe-
ratur, pH, Ionenstärke und Anwesenheit von Aktiva-
toren oder Inhibitoren beeinflusst.
1.6.1 Temperatur
Wie bei allen chemischen Reaktionen ist die
Geschwindigkeit enzymatisch katalysierter Reak-
tionen von der Temperatur abhängig. Mit steigen-
der Temperatur erhöht sich die Reaktionsgeschwin-
digkeitskonstante k gemäß der Arrhenius-Gleichung:
k = a ⋅ e−EA / RT 
EA ist die Aktivierungsenergie der Reaktion, R die
allgemeine Gaskonstante, T die absolute Temperatur
und a der Arrhenius-Faktor, der auch als Stoß- oder
Häufigkeitsfaktor bezeichnet wird und für jede Reak-
tion charakteristisch ist. Aus den temperaturabhän-
gigen Geschwindigkeitskonstanten wird die Akti-
vierungsenergie durch Auftragen von lnk gegen den
reziproken Wert der absoluten Temperatur ermittelt:
D E

17 1
EA 1
ln k = ln a − ⋅  Gl. 1.64
R T
Diese liegt üblicherweise in einem Bereich zwischen
10 und 100 kJ mol–1.
Betrachtet man die Abhängigkeit der Geschwin-
digkeit enzymatischer Reaktionen über einen weiten
Temperaturbereich, ergibt sich bei hohen Tempera-
turen jedoch eine deutliche Abweichung von der
Arrhenius-Beziehung. Die Reaktionsgeschwindig-
keit durchläuft ein Maximum, das als Temperatur-
optimum bezeichnet wird, und fällt dann relativ
steil ab (. Abb. 1.9a). Die Temperaturänderung
beeinflusst nicht nur die Reaktionsgeschwindigkeit,
sondern zugleich die Konformation des Enzyms
und es kommt zur Hitzedenaturierung. Ursache für
den damit einhergehenden irreversiblen Verlust der
Gl. 1.63 Enzymaktivität ist die Zerstörung der Tertiär- und
Quartärstruktur der Proteine, die vor allem durch
schwache Bindungen wie Wasserstoffbrücken oder
Van-der-Waals-Kräfte aufrechterhalten wird. Die
Aktivierungsenergie der Proteindenaturierung
kann ebenfalls mit Hilfe des Arrhenius-Diagramms
bestimmt werden (. Abb. 1.9b).
Der Begriff des Temperaturoptimums muss diffe-
renziert betrachtet werden. Zwar wird unter gegebe-
nen Reaktionsbedingungen am Temperaturoptimum

,QVSH]$NWLYLW¦Wದ

ದ
VSH]$NWLYLW¦W8PJ


ದ

ದ

ದ
 ದ

 ದ
                
7HPSHUDWXUr& 7.

      
7HPSHUDWXUr&

. Abb. 1.9  a) Abhängigkeit der Enzymaktivität einer Oxidoreduktase von der Reaktionstemperatur, b) Arrhenius-
Darstellung für die Bestimmung der Aktivierungsenergien der enzymatischen Reaktion (rote Gerade, EA = 49 kJ mol–1) und der
Enzyminaktivierung (schwarze Gerade, EA = 192 kJ mol–1)
 18 K. Castiglione

die höchste Reaktionsgeschwindigkeit erzielt, es
1 findet jedoch oft auch schon eine merkliche Inakti-
vierung statt. Die Lage des Temperaturoptimums ist
daher eine Funktion der Reaktionsdauer. Je kürzer
die Messzeit ist, desto höher ist das apparente Tempe-
raturoptimum. Daraus folgt, dass die optimale Tem-
peratur für einen enzymatischen Prozess wesentlich
von der Einsatzdauer des Enzyms und damit von der
Enzymstabilität bestimmt wird.
Bei der experimentellen Untersuchung von Tem-
peraturoptima darf man nicht außer Acht lassen, dass
sich der pH vieler Puffersysteme mit der Tempera-
tur deutlich ändert. Der Temperaturkoeffizient des
Puffers gibt Auskunft darüber, wie sich der negative
dekadische Logarithmus der Säuredissoziationskon-
stante (pKa) mit der Temperatur ändert (. Tab. 1.2).
Beispielsweise fällt der pH eines Tris-HCl-Puffers bei
einer Temperaturerhöhung von 20 °C auf 37 °C um
0,48 pH-Einheiten. Um die Überlagerung von pH-
und Temperatureffekten auszuschließen, muss der
pH des Puffers entsprechend seines Temperaturko-
effizienten korrigiert werden.
1.6.2 pH und Puffersystem
Der Ladungszustand saurer und basischer Ami-
nosäureseitenketten hat einen unmittelbaren Ein-
fluss auf die Aktivität eines Enzyms sowie auf die
Bindung von Substraten und Produkten. Trägt man
die Enzymaktivität gegen den pH auf, ergibt sich
häufig eine mehr oder weniger symmetrische Glo-
ckenkurve. Diese Form rührt häufig daher, dass der
steigende Kurventeil die zunehmende Deprotonie-
rung eines ionisierbaren Aminosäurerests im aktiven
Zentrum des Enzyms anzeigt, während der fallende
Kurventeil mit dem Protonierungszustand einer
zweiten Aminosäure verknüpft ist. Die Glocken-
form ist demnach das Ergebnis der Überlagerung
von zwei Titrationskurven. Liegt nur ein ionisierba-
rer Rest vor, erhält man folglich eine sigmoide Kurve,
während mehr als zwei ionisierbare Reste zu komple-
xeren Kurvenverläufen führen können.
Die Lage und Breite des pH-Optimums sind
enzymspezifisch (. Abb. 1.10). Das Verdauungsen-
zym Pepsin, das in Wirbeltieren für den Abbau von
Nahrungsproteinen im Magen verantwortlich ist, hat
ein Optimum bei pH 2 und ist somit ideal an das
saure Milieu im Magen angepasst. Trypsin ist eben-
falls ein Verdauungsenzym, das jedoch im Bereich
des Dünndarms Proteine spaltet. Hier liegt ein leicht
basisches Milieu vor, was dem pH-Optimum von
Trypsin bei pH 7,8 entspricht.
Untersucht man den Aktivitätseinfluss des pH
über einen weiten pH-Bereich, kann dies meist nicht
mit einem einzigen Puffersystem erfolgen, da eine
ausreichende Pufferkapazität in der Regel nur in
einem engen Bereich um den pKa der Puffersubstanz
gewährleistet ist (. Tab. 1.2). Da die Puffersubstanzen
ihrerseits Interaktionen mit dem Enzym, den Subs-
traten oder den Cofaktoren eingehen können, emp-
fiehlt es sich, beim Wechsel von einem Puffersystem

. Tab. 1.2  pKa, Pufferbereich und Temperaturkoeffizienten für ausgewählte Puffersubstanzen [10, 30]

Puffersubstanz pKa (25 °C) Pufferbereich Temperaturkoeffizient

(25 °C, 0,1 M) ΔpKa/ΔT

Acetat 4,76 3,6–5,6 0,0002

MES (4-Morpholino-ethansulfonsäure) 6,10 5,5–6,7 –0,011
Citrat (pK3) 6,40 5,5–7,2 0,0
MOPS (4-Morpholino-propansulfonsäure) 7,20 6,5–7,9 –0,011
Phosphat (pK2) 7,20 5,8–8,0 –0,0028
HEPES (2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl] 7,48 6,8–8,2 –0,014
ethansulfonsäure)
Tricin (N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycin) 8,05 7,4–8,8 –0,021
Tris-HCl (Tris(hydroxymethyl) aminomethan 8,06 7,0–9,0 –0,028
Borat 9,23 8,5–10,2 –0,0082
Kapitel 1 · Enzymkinetik


UHODWLYH$NWLYLW¦W




 torische Zentren eines Proteins hervorgerufen wird.
      
S+
. Abb. 1.10  pH-Abhängigkeit der enzymatischen Aktivität
von Pepsin (schwarz) und Trypsin (rot)
in das nächste stets überlappende Werte beim glei-
chen pH zu messen, da sich die Aktivitätswerte zum
Teil erheblich unterscheiden. Für viele Enzymklassen
ist bereits bekannt, dass spezifische Puffersubstan-
zen zu unerwünschten Effekten führen können. Bei
Enzymen, die zweiwertige Metallionen als Cofakto-
ren besitzen, sollten beispielsweise Phosphatpuffer
vermieden werden, da es hier zur Bildung unlösli-
cher Salze kommen kann. Puffer mit einem Pipera-
zin-Ring, wie unter anderem HEPES, können Radi-
kale in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid bilden,
weshalb sie für die Untersuchung von Peroxidasen
nicht geeignet sind [14].
Neben pH und verwendeter Puffersubstanz hat
auch die Ionenstärke einen Einfluss auf die Enzym-
aktivität. Die Ionenstärke I ist wie folgt definiert:
1 Bei der kompetitiven Hemmung, die durch
I= ∑ ci zi2 
2 i
wobei ci die Molaritäten der Ionen und zi deren
Ladungszahlen sind. Die optimale Ionenstärke muss
experimentell bestimmt werden, jedoch sind für
viele Enzyme sehr niedrige (<10 mM) und sehr hohe
Ionenstärken (>500 mM) ungünstig. Ausnahmen sind
beispielsweise Enzyme aus halophilen Organismen,
die in Gegenwart hoher Salzkonzentrationen leben
und deren zelleigene Proteine auch entsprechend tole-
rant gegenüber hohen Ionenstärken sind [32].
Da die Kombination aus pH, Puffersubstanz
und Ionenstärke, die für die Aktivität eines Enzyms
optimal ist, keineswegs auch für dessen Stabilität
(7 Abschn. 1.7) optimal sein muss, sollten stets beide
19 1
Aspekte bei der Charakterisierung eines Enzyms
berücksichtigt werden.
1.6.3 Inhibitoren
Die Enzyminhibierung beschreibt den negati-
ven Effekt auf die Enzymaktivität, der durch die
Bindung von Liganden an katalytische oder regula-
   
Je nachdem, ob der Inhibitor reversibel oder irre-
versibel an das Enzym bindet, unterscheidet man
reversible und irreversible Hemmungen. Im Fol-
genden werden grundlegende Hemmtypen vor-
gestellt, bei denen jeweils nur ein Inhibitor an der
Hemmung einer Einsubstratreaktion beteiligt ist. Die
Gleichungen zur Beschreibung der Enzymkinetik in
Anwesenheit von Inhibitoren sind von der einfachen
Michaelis-Menten-Gleichung Gl. 1.28 abgeleitet und
basieren demnach auf denselben vereinfachenden
Annahmen (7 Abschn. 1.4.1).
Reversible Hemmung
Die reversible Hemmung eines Enzyms kann kom-
petitiv, unkompetitiv oder nichtkompetitiv erfol-
gen. .  Abb. 1.11 gibt eine Übersicht über die ver-
schiedenen Hemmtypen und ihr Erscheinungsbild
in der Lineweaver-Burk-Darstellung. Die dop-
pelt-reziproke Auftragung, die nicht zur Bestim-
mung kinetischer Konstanten genutzt werden sollte
(7 Abschn. 1.5), eignet sich sehr gut zur Unterschei-
dung der verschiedenen Inhibitionsarten.
Gl. 1.65
Gl. 1.66 beschrieben wird, ist die gleichzeitige
Bindung von Substrat und Inhibitor an das Enzym
ausgeschlossen:
vmax ⋅cS
v=  Gl. 1.66
 cI 

K m ⋅ 1 +  + cS
 3 K 
mit
k−3 cE ⋅ cI
K3 = =  Gl. 1.67
k3 cEI
Im klassischen Fall konkurriert der Inhibitor mit dem
Substrat um die Bindungsstelle im aktiven Zentrum.
Häufig hat der Inhibitor dabei strukturelle Ähnlichkeit
 20 K. Castiglione

. Abb. 1.11  Varianten der reversiblen Enzyminhibierung und das dazugehörige Muster in der Lineweaver-Burk-Darstellung.
a) Kompetitive Hemmung, b) unkompetitive Hemmung, c) nichtkompetitive Hemmung

mit dem Substrat. Jedoch kann eine kompetitive Inhibi- Darstellung erscheint dieser Hemmtyp als Schar par-
tion beispielsweise auch durch Verbindungen hervor- alleler Geraden (. Abb. 1.11b). Durch den Inhibitor
gerufen werden, die nicht direkt im aktiven Zentrum wird sowohl die maximale Reaktionsgeschwindig-
binden, aber durch sterische Hinderung die Subst- keit als auch die Halbsättigungskonzentration verän-
ratbindung stören. Die Halbsättigungskonzentration dert. Gl. 1.68 gibt den Einfluss eines unkompetitiven
des Enzyms wird in Gegenwart des Inhibitors erhöht, Inhibitors auf die enzymatische Umsetzung wieder:
während die maximale Reaktionsgeschwindigkeit
unverändert bleibt, da der reversibel gebundene Inhi- vmax ⋅cS
v=  Gl. 1.68
bitor durch die Zugabe von hohen Substratkonzent-  c 
rationen verdrängt werden kann. Die kompetitive K m + cS ⋅ 1 + I 
 K 5

Hemmung führt daher in der doppelt-reziproken Dar-
stellung zu einer Schar von Geraden, die sich auf der mit
y-Achse schneiden (. Abb. 1.11a). Da der wahre Wert
der Michaeliskonstante nur augenscheinlich durch den k−5 cES ⋅ cI
K5 = =  Gl. 1.69
Inhibitor erhöht wird, spricht man in diesem Zusam- k5 cEIS
menhang auch von einem apparenten Km. Der Wert der
Dissoziationskonstante des Enzym-Inhibitor-Komple- Die Substratüberschussinhibierung ist eine spezielle
xes K3 gibt Aufschluss über die Stärke der Inhibition. Je Form der unkompetitiven Hemmung, bei der das
kleiner K3 ist, desto größer ist die Affinität des Enzyms Substrat der unkompetitive Inhibitor ist. Hierdurch
zum Inhibitor und desto stärker ist die inhibierende verändert sich Gl. 1.68 zu:
Wirkung bei einer gegebenen Inhibitorkonzentration.
vmax ⋅cS
Im Fall der unkompetitiven Hemmung bindet v=  Gl. 1.70
der Inhibitor an den Enzym-Substrat-Komplex, nicht c2
K m + cS + S
jedoch an das freie Enzym. In der doppelt reziproken K5
Kapitel 1 · Enzymkinetik
21 1
Eine nichtkompetitive Hemmung liegt vor, wenn
der Hemmstoff sowohl an das freie Enzym als auch
an den Enzym-Substrat-Komplex bindet. Weil sich
der Inhibitor an einer Stelle des Enzyms anlagert, die
nicht mit der Substratbindungsstelle identisch ist,
und die Substratbindung auch nicht sterisch behin-
dert, können Inhibitor- und Substratbindung unab-
hängig voneinander erfolgen. Während die maxi-
male Reaktionsgeschwindigkeit herabgesetzt wird,
hat die Inhibitorbindung keinen Effekt auf die Halb-
. Abb. 1.12  Schematische Darstellung der reversiblen,
sättigungskonzentration und die Geraden schnei-
partiellen Enzymhemmung. Bei der partiell kompetitiven
den sich auf der x-Achse beim Km des Enzyms, wie Hemmung gilt k6 = k2, bei der partiell nichtkompetitiven
. Abb. 1.11c zeigt. Gl. 1.71 beschreibt die Reaktions- Hemmung k6 < k2. Im Falle einer partiell unkompetitiven
geschwindigkeit in Anwesenheit eines nichtkompe- Hemmung finden die rot markierten Reaktionen
titiven Inhibitors: nicht statt

vmax ⋅cS
v=  Gl. 1.71 die gleichen Mechanismen zu Grunde wie den kor-
 c   c
K m ⋅ 1 + I  + cS ⋅ 1 + I  respondierenden vollständigen Hemmtypen. Der
 K 
3
 
 K5

Unterschied liegt nur darin begründet, dass der EIS-
Komplex nicht unproduktiv ist, sondern lediglich
In der Praxis entspricht die reine nichtkompetitive eine niedrigere Aktivität als der ES-Komplex zeigt.
Hemmung der Ausnahme. Meist liegt eine soge- Die Reaktionsgeschwindigkeit v setzt sich demnach
nannte „gemischte Hemmung“ vor, bei der auch wie folgt zusammen:
ein Einfluss auf die apparente Halbsättigungs-
konzentration beobachtet wird. Die gemischte dcP
v= =v1+v2  Gl. 1.72
Hemmung führt in der doppelt-reziproken Auf- dt
tragung ebenfalls zu einer Schar von Geraden
mit gemeinsamem Schnittpunkt links von der y- mit
Achse. Im Gegensatz zur reinen nichtkompetitiven
Hemmung, bei der K5 gleich K3 ist, schneiden sich v1= k2 ⋅ cES und v2 = k6 ⋅ cEIS  Gl. 1.73
die Geraden jedoch nicht auf der Abszisse. Ist K5
größer als K3, liegt der Schnittpunkt über der x- Die Geschwindigkeitsgleichung der partiell unkom-
Achse, während er im umgekehrten Fall unter der petitiven Hemmung lautet wie folgt:
x-Achse lokalisiert ist.
Die bislang betrachteten Hemmtypen basierten  v ⋅c 
alle auf der Annahme, dass die Aktivität des Enzyms
v + max ,2 I  ⋅ cS
 max ,1 K 5

in Anwesenheit des Inhibitors vollständig gehemmt v=  Gl. 1.74
 c 
und der EIS-Komplex, soweit vorhanden, unproduk- K m + cS ⋅ 1 + I 
tiv ist. Wenn der EIS-Komplex jedoch zur Produkt-  K 5

bildung fähig ist, liegt nur eine partielle Hemmung
vor, die schematisch in . Abb. 1.12 dargestellt ist. wobei gilt
Wie bei der vollständigen Hemmung, die wesent-
lich häufiger vorkommt, unterteilt man die partielle vmax,1= k2 ⋅ cE0 und vmax, 2 = k6 ⋅ cE0  Gl. 1.75
Hemmung in partiell kompetitiv, partiell nichtkom-
petitiv und partiell unkompetitiv.
Der partiell unkompetitiven Hemmung sowie Die partiell nichtkompetitive Hemmung wird durch
der partiell nichtkompetitiven Hemmung liegen folgende Gleichung beschrieben:
 22 K. Castiglione

 vmax ,2 ⋅cI 
1 v
 max ,1 +
K
 ⋅ cS

D

v= 5  Gl. 1.76
 Y
c   c 
K m ⋅ 1 + I  + cS ⋅ 1 + I  F,
 K3   K5 

Eine partiell kompetitive Hemmung sollte es theo-

retisch nicht geben, da die gleichzeitige Bindung
von Substrat und Inhibitor bei der kompetitiven
Hemmung ausgeschlossen ist. Im Gegensatz zu den
anderen beiden partiellen Hemmtypen rührt der F, 

Name der partiell kompetitiven Hemmung auch
 F6
nicht von dem molekularen Mechanismus der Inhi-
bition her, sondern von deren Erscheinungsbild in E
der doppelt-reziproken Auftragung des Linewea-
ver-Burk-Diagramms (. Abb. 1.13). Das Geraden- Y
F6
muster gleicht dem der kompetitiven Hemmung, bei
der es ebenfalls einen gemeinsamen Schnittpunkt
auf der y-Achse gibt. Um eine partielle Hemmung
von einer vollständigen Hemmung zu unterschei-
den, kann man das Dixon-Diagramm verwen-
den, bei dem die reziproke Reaktionsgeschwindig-
keit gegen die Inhibitorkonzentration aufgetragen
wird. Bei allen vollständigen Hemmungen ergeben 
sich im Dixon-Diagramm Geraden, während die  F,
partiellen Hemmtypen zu Hyperbeln führen. Aus
F
diesem Grund werden die vollständigen Hemmun-
gen auch als linear und die partiellen als hyperbolisch
6WHLJXQJ

bezeichnet. Alternativ kann man auch ein sogenann-

tes Sekundärdiagramm zur Unterscheidung heran-
ziehen. Hierbei werden die Geradensteigungen aus
dem Lineweaver-Burk-Diagramm gegen die Inhi-
bitorkonzentration aufgetragen. Ebenso wie beim
Dixon-Diagramm ergeben sich bei den vollständigen
Hemmtypen Geraden und bei den partiellen Hem-
mungen Hyperbeln.
Die partiell kompetitive Hemmung ist als Son- 
 F,
derfall der partiell nichtkompetitiven Hemmung
zu betrachten, bei der der Inhibitor die maximale
Reaktionsgeschwindigkeit nicht beeinträchtigt und . Abb. 1.13  Partiell kompetitive Inhibierung im
k2 gleich k6 ist. Gl. 1.76 vereinfacht sich somit zu: Lineweaver-Burk-Diagramm (a), im Dixon-Diagramm (b) und
im Sekundärdiagramm (c), bei dem die Geradensteigungen
aus (a) gegen die Inhibitorkonzentration aufgetragen sind
 c 
vmax ⋅cS ⋅ 1 + I 
 K5 
v=  Gl. 1.77 Die Hemmung kommt in diesem Fall dadurch
 c   c 
K m ⋅ 1 + I  + cS ⋅ 1 + I  zustande, dass das freie Enzym eine höhere Affinität
 K 3
 
 K 5
 zum Substrat hat als der Enzym-Inhibitor-Komplex
EI. Folglich erhöht sich der apparente Km des Enzyms
Kapitel 1 · Enzymkinetik
mit steigender Inhibitorkonzentration, jedoch nur
unter der Bedingung K3 < K5. Wenn K3 gleich K5 ist,
kürzen sich die Inhibierungsterme in Gl. 1.77 und die
Reaktionsgeschwindigkeit kann mit einer einfachen
Michaelis-Menten-Kinetik nach Gl. 1.28 beschrie-
ben werden. Für den Fall, dass K3 > K5 ist, hat der
Enzym-Inhibitor-Komplex eine höhere Affinität für
das Substrat als das freie Enzym und es kommt zu
einer Aktivierung bei niedrigen Substratkonzentra-
tionen, die sich in einem niedrigeren apparenten Km
widerspiegelt [1, 29].
Irreversible Hemmung
Wenn Substanzen an Enzyme irreversibel binden,
beispielsweise durch kovalente Bindung, kann es
zu einem dauerhaften Verlust enzymatischer Akti-
vität kommen. Die Unterscheidung zwischen einer
reversiblen oder irreversiblen Hemmung ist meist
sehr einfach. Wird eine Enzymlösung, in der sich
der Inhibitor befindet, verdünnt, erhöht sich im Falle
einer reversiblen Hemmung die spezifische Aktivi-
tät, da es zu einer Dissoziation des Inhibitors vom
Protein kommt. Bleibt die spezifische Aktivität hin-
gegen konstant, liegt eine irreversible Hemmung vor.
Darüber hinaus ist die irreversible Hemmung zeit-
abhängig, da eine Reaktion zweiter Ordnung zwi-
schen Enzym und Inhibitor stattfindet, während die
reversible Hemmung auf einer Gleichgewichtsein-
stellung basiert, die so schnell erfolgt, dass sie unmit-
telbar nach Zugabe des Inhibitors abgeschlossen ist
(. Abb. 1.14). Ein klassisches Beispiel für einen irre-
versiblen Inhibitor ist der Proteasehemmer Phe-
nylmethylsulfonylfluorid (PMSF), der irreversibel

RKQH,QKLELWRU

UHODWLYH$NWLYLWlW
 UHYHUVLEOHU,QKLELWRU


LUUHYHUVLEOHU,QKLELWRU


W
. Abb. 1.14  Zeitliche Verläufe der irreversiblen und
reversiblen Enzymhemmung
23 1
an das Serin im aktiven Zentrum von Serinprotea-
sen bindet. Mitunter sind irreversible Inhibitoren so
effektiv, dass eine stöchiometrische Menge an Inhibi-
tor ausreicht, um eine Enzympräparation vollständig
zu inaktivieren [1, 13].
Ist die initiale Inhibitorkonzentration cI0 viel
höher als die gesamte Enzymkonzentration c E0,
kann die Inaktivierung als Reaktion pseudo-ers-
ter Ordnung (7 Abschn. 1.2.2) betrachtet und die
Abnahme der Enzymaktivität A wie folgt formuliert
werden:
dA
− = ki ⋅ cI0 ⋅ A = ki′ ⋅ A  Gl. 1.78
dt
Durch Integration erhält man
′
A = A0 ⋅ e−ki ⋅t  Gl. 1.79
wobei A und A0 den Enzymaktivitäten zum Zeit-
punkt t beziehungsweise t = 0 entsprechen. Die
Geschwindigkeitskonstante der Inaktivierung bei
einer bestimmten Inhibitorkonzentration k′ kann
durch Auftragen des natürlichen Logarithmus der
Aktivität gegen die Zeit bestimmt werden. Die Inak-
tivierungskonstante k′ entspricht der Steigung der
resultierenden Gerade.
Abweichungen von einem linearen Zusammen-
hang können sehr unterschiedliche Gründe haben
und müssen individuell untersucht werden. Sie
können beispielsweise darauf hinweisen, dass das
Enzym in verschiedenen Konformationen vorliegt,
wobei die Konformationsisomere unterschiedliche
Reaktivität gegenüber der inaktivierenden Substanz
aufweisen. Darüber hinaus kann eine zweiphasige
(oder mehrphasige) Inaktivierung auf die Existenz
von zwei (oder mehr) modifizierbaren Gruppen
im Proteinmolekül hinweisen, die essentiell für die
enzymatische Katalyse sind. Bei einer zweiphasi-
gen Inaktivierung reagiert eine der beiden Gruppen
schnell und die andere langsam mit dem irreversib-
len Inhibitor [26]. Der Verlauf dieser Reaktion kann
mit Hilfe der Summe von zwei Exponentialfunktio-
nen beschrieben werden:
A s l
= Fs ⋅ e−ki ⋅ t + Fl ⋅ e−ki ⋅ t  Gl. 1.80
A0
 24 K. Castiglione
In dieser Gleichung entsprechenkis undkil der Inak-
1 tivierungskonstanten der schnellen beziehungsweise
langsamen Inaktivierung. Die Faktoren Fs und Fl
geben an, welcher Anteil der Gesamtaktivität jeweils
durch die schnelle und langsame Inaktivierung ver-
lorengeht. Dabei gilt:
Fs = 100 % − Fl 
Die Parameterschätzung sollte durch nichtlineare
Regression erfolgen. Durch die Subtraktion der
langsamen Komponente der Inaktivierung von den
Messdaten können jedoch die schnelle und die lang-
same Reaktion auf einfache Weise visualisiert werden
(. Abb. 1.15) [4].
1.6.4 Aktivatoren
Aktivatoren sind Substanzen, die die Geschwindig-
keit einer enzymatischen Reaktion erhöhen. Generell
unterscheidet man essentielle und nichtessentielle
Aktivatoren.

Essentielle Aktivatoren
Benötigt ein Enzym einen essentiellen Aktiva-
tor, kann die Reaktion in Abwesenheit der Subs-
tanz nicht ablaufen. Häufig sind es Metallionen, die
einen Komplex mit dem Substrat eingehen. Der ent-
stehende Substrat-Aktivator-Komplex ist dann das
eigentliche Substrat für das Enzym. Hexokinasen (EC
Gl. 1.81 2.7.1.1) können beispielsweise Adenosintriphosphat
(ATP) nur in Verbindung mit Mg2+ als Substrat für
die Phosphorylierung von Zuckern verwenden. Die
kinetische Analyse von enzymatischen Reaktionen
mit einem essentiellen Aktivator kann aufwendig
sein, da das zusätzliche Gleichgewicht zwischen Subs-
trat und Aktivator berücksichtigt werden muss. Um
dies zu vermeiden, kann der Aktivator im Überschuss
zugegeben werden, um sicherzustellen, dass jegliches
Substrat als Substrat-Aktivator-Komplex vorliegt.
Dies ist jedoch nur dann sinnvoll, wenn nicht eine
hohe Konzentration an freiem Aktivator einen zusätz-
lichen inhibierenden Effekt auf das Enzym ausübt.
Nichtessentielle Aktivatoren
Bei der nichtessentiellen Aktivierung kann die Reak-
tion auch in Abwesenheit des Aktivators ablaufen.
. Abb. 1.16a zeigt ein generelles Schema der nicht-
,QUHODWLYH$NWLYLWlW±

 essentiellen Aktivierung.
Da sowohl der Enzym-Substrat-Komplex ES als
ODQJVDPH5HDNWLRQ
 auch der Enzym-Substrat-Aktivator-Komplex ESA

katalytisch aktiv ist, gilt für die Reaktionsgeschwin-
VFKQHOOH5HDNWLRQ
digkeit:

dcP
v= = v1+ v2  Gl. 1.82
 dt
     
WK
mit

v1= k2 ⋅ cES und v2 = k6 ⋅ cESA  Gl. 1.83

. Abb. 1.15  Zweiphasige Inaktivierung eines Enzyms
durch einen irreversiblen Inhibitor. Die geschlossenen
Insgesamt müssen vier verschiedene Dissozia-
Symbole sind die Messdaten, die in der semi-logarithmischen
Darstellung die zweiphasige Inaktivierung zeigen. Die tionskonstanten der auftretenden Enzymkomplexe
offenen Symbole erhält man durch Subtraktion der berücksichtigt werden:
langsamen Komponente der Inaktivierung von den
Messdaten. Die Steigungen der roten und schwarzen Geraden k−1 k k k
s l
entsprechen den Inaktivierungskonstanten ki und ki . Den
K1 = ; K3 = −3 ; K 4 = −4 ; K5 = −5  Gl. 1.84
k1 k3 k4 k5
korrespondierenden y-Achsenabschnitten können die Werte
von Fs und Fl entnommen werden. Im gezeigten Beispiel
gehen jeweils 50 % der Gesamtaktivität durch die schnelle Diese sind jedoch nicht unabhängig voneinander,
und die langsame Reaktion verloren da gilt:
Kapitel 1 · Enzymkinetik
25 1
. Abb. 1.16  Generelles
Schema der nichtessentiellen
Aktivierung. a) Reaktionsschema
mit Geschwindigkeitskonstanten,
b) Reaktionsschema mit Dissoziations-
und Geschwindigkeitskonstanten

K 4 K5 Komplexbildner wie Ethylendiamintetraessigsäure

= = α Gl. 1.85
K1 K3 (EDTA) destabilisierend wirken. Letztere komple-
xieren Kationen, die essentiell für die Enzymstruktur
In einem modifizierten Reaktionsschema, in dem die und -funktion sein können [17]. Auch an Grenzflä-
Geschwindigkeitskonstanten soweit möglich zu Dis- chen zwischen Gas- und Flüssigphase können Enzyme
soziationskonstanten zusammengefasst sind, ist die denaturiert werden, was vor allem während der
Abhängigkeit der einzelnen Konstanten untereinan- Enzymherstellung berücksichtigt werden muss [34].
der sehr gut zu erkennen (. Abb. 1.16b). Mit diesen Da die Stabilität eines Enzyms unter verschie-
Zusammenhängen kann die Geschwindigkeitsglei- denen Bedingungen sehr von dessen Herkunft und
chung für die nichtessentielle Aktivierung wie folgt Funktion abhängt, muss sie stets individuell unter-
formuliert werden: sucht werden. Enzyme aus hyperthermophilen
Organismen, die Wachstumsoptima bei Tempe-
 v ⋅c  raturen zwischen 80 °C und 110 °C haben, zeigen
v + max ,2 A  ⋅ cS sehr hohe Temperaturstabilitäten [12], während
 max ,1 α ⋅ K 
3
v=  Gl. 1.86 Proteine aus halophilen Organismen, die bei-
 c   c 
K1 ⋅ 1 + A  + cS ⋅ 1 + A  spielsweise aus den Tiefsee-Solebecken des Roten
 K 
3
 
 α⋅K 3
 Meeres stammen, extreme Salzkonzentrationen
(>2 M NaCl) tolerieren können [32]. Enzyme aus
Hierbei entsprechen v max.1 und v max.2 den maxi- der Klasse der Lipasen sind häufig auch in organi-
malen Reaktionsgeschwindigkeiten ohne Aktiva- schen Lösemitteln mit extrem niedrigem Wasserge-
tor beziehungsweise bei vollständiger Sättigung mit halt stabil, was eng mit ihrer natürlichen Funktion
Aktivator. In vielen Fällen gilt bei der nichtessentiel- der Hydrolyse und Synthese von Fettsäureestern
len Aktivierung: α < 1 und vmax,2 > vmax,1. Das heißt, verbunden ist [27].
der Aktivator erhöht zum einen die Affinität des In sehr vielen Fällen kann eine Enzyminaktivie-
Enzyms zu seinem Substrat, was sich in einer nied- rung als Reaktion erster Ordnung (7 Abschn. 1.2.1)
rigeren Dissoziationskonstante K4 im Vergleich zu beschrieben werden, bei der die Konzentration an
K1 äußert, und zum anderen die Geschwindigkeit aktivem Enzym cE durch Denaturierung nach fol-
der Produktbildung. gendem Geschwindigkeitsgesetz abnimmt:

dcE
1.7 Enzymstabilität − = ki ⋅ cE  Gl. 1.87
dt

Die Stabilität eines Enzyms kann von einer Vielzahl Die Geschwindigkeitskonstante k i wird auch als
unterschiedlicher Faktoren beeinflusst werden. Neben Inaktivierungskonstante bezeichnet. Durch Integ-
Temperatur und pH zählen hierzu Salze, Lösemittel, ration ergibt sich:
Detergenzien, Radikale, Strahlung und Oxidantien.
Je nach Protein können auch Schwermetalle oder cE = cE 0 ⋅ e−ki ⋅t  Gl. 1.88
 26 K. Castiglione
Beim Vergleich der Stabilität verschiedener Enzyme
1 bedient man sich häufig der Halbwertszeit t1/2. Sie
gibt an, in welchem Zeitraum die Hälfte der Enzym-
moleküle denaturiert und somit inaktiviert wird.
Durch Auftragen des natürlichen Logarithmus der
Konzentration an aktivem Enzym gegen die Zeit
erhält man die Inaktivierungskonstante ki als Stei-
gung. Die Halbwertszeit wird nach Gl. 1.89 berechnet:
ln (2)
t1/ 2 =  Gl. 1.89
ki
Es gibt verschiedene Methoden, um die Stabilität eines
Enzyms zu erhöhen. Die größte Bedeutung kommt
dabei der Immobilisierung zu (7Kap.10). Vielfach
kann auch durch Protein Engineering oder die Zugabe
verschiedener Additive eine Erhöhung der Enzym-
stabilität bewirkt werden. Natürliche Liganden eines
Enzyms, wie Substrate oder Cofaktoren, wirken in der
Regel stabilisierend, ebenso verschiedene Zucker oder
Polyole, wie Trehalose, Glycerin und Sorbitol. Auch
Polyethylenglykole mit unterschiedlichen molekula-
ren Massen (400–600.000 Da) tragen häufig zur Sta-
bilisierung von Enzymen bei [17].
1.8 Empirische, semi-mechanistische
und mechanistische Modelle
Alle bislang betrachteten kinetischen Modelle für
enzymatische Reaktionen sind sogenannte mecha-
nistische Modelle. Sie basieren auf der genauen
. Tab. 1.3  Vergleich zwischen empirischen und mechanistischen Modellen
Empirisches Modell
Grundlage: Beobachtete Beziehungen zwischen
experimentellen Daten
Detaillierte Kenntnis der zugrundeliegenden
Mechanismen nicht nötig
Modellparameter ohne physikalische Bedeutung
Gleichungen meist einfacher als bei mechanistischen
Modellen
Meist nur in den Grenzen der experimentell
untersuchten Bedingungen anwendbar
Kein zusätzlicher Erkenntnisgewinn
Kenntnis der zugrundeliegenden physikalischen,
chemischen und/oder biologischen Vorgänge und
die zugehörigen Modellparameter haben eine direkte
physikalische Bedeutung. Ein Beispiel ist die Michae-
liskonstante Km, welche die Substratkonzentration
anzeigt, bei der die halbmaximale Reaktionsge-
schwindigkeit eines Enzyms erreicht ist.
Steht bei der Entwicklung eines Modells nicht
der Erkenntnisgewinn im Vordergrund, der durch
ein genaueres Verständnis der zugrundeliegenden
Mechanismen generiert wird, kann ein empirisches
Modell eine sehr gute Alternative darstellen. Hierbei
wird die Wirkungsweise des betrachteten Systems
nicht berücksichtigt, sondern versucht, beobachtete
Beziehungen zwischen experimentellen Daten durch
eine Gleichung abzubilden. Die wesentlichen Unter-
schiede zwischen empirischen und mechanistischen
Modellen sind in . Tab. 1.3 gegenübergestellt. Modelle,
die sowohl empirische als auch mechanistische Anteile
haben, werden als semi-mechanistisch bezeichnet.
Ein Beispiel für ein semi-mechanistisches Modell
ist das Lin-log-Modell, bei dem die Geschwindig-
keit einer enzymkatalysierten Reaktion als lineare
Summe nichtlinearer logarithmischer Konzentra-
tionsterme ausgedrückt wird:
a + b1 ⋅ ln cX1 + b2 ⋅ ln cX 2 +
v= cE 0 ⋅  
b3 ⋅ ln cX 3 +…+ bn ⋅ ln cXn   Gl. 1.90
Hierbei haben die Parameter b1 bis bn positive Vor-
zeichen, wenn es sich um Substrate oder Aktivatoren
Mechanistisches Modell
Grundlage: Tiefgreifendes Verständnis von physikalischen,
chemischen und/oder biologischen Vorgängen
Detailliertes Vorwissen nötig
Modellparameter mit unmittelbarer physikalischer
Bedeutung
Häufig komplexe Gleichungen
Meist höhere Extrapolationsfähigkeit als bei empirischen
Modellen (für Simulationen wichtig)
Zusätzlicher Erkenntnisgewinn möglich
Kapitel 1 · Enzymkinetik
handelt, und negative Vorzeichen, wenn sie Produk-
ten oder Inhibitoren zuzuordnen sind. Die Parame-
ter besitzen keinerlei Abhängigkeiten voneinander,
da beispielsweise die Stöchiometrie einer Reak-
tion nicht berücksichtigt wird. Die mechanistische
Grundlage des Modells bilden die Prinzipien der
Nichtgleichgewichtsthermodynamik. In Systemen,
die sich nicht im thermodynamischen Gleichgewicht
befinden, ist die Reaktionsgeschwindigkeit propor-
tional zur thermodynamischen Triebkraft ΔG, die
in logarithmischer Weise von den Konzentrationen
der Reaktanten abhängt. Obwohl dieser Zusammen-
hang eigentlich nur für Systeme gilt, die sich nah
am thermodynamischen Gleichgewicht befinden,
konnten Lin-log-Modelle dennoch sehr erfolgreich
zur Beschreibung von biologischen Reaktionen ver-
wendet werden, die typischerweise weit entfernt vom
Gleichgewicht ablaufen [35].
Das einfachste Lin-log-Modell für eine irrever-
sible Einsubstratreaktion lautet:
v= cE 0 ⋅ (a + b ⋅ ln cS )  Gl. 1.91
Gl. 1.91 stellt somit eine Alternative zur Michaelis-
Menten-Gleichung Gl. 1.28 dar. Im Gegensatz zu
den Modellparametern der Michaelis-Menten-Ki-
netik Km und kcat (vmax) haben die Modellparame-
ter des Lin-log-Modells a und b jedoch keine phy-
sikalische Bedeutung und sind als empirisch zu
betrachten. .  Abb. 1.17 zeigt einen Vergleich der
cS-v-Kurve, die auf der Basis des Lin-log-Modells
generiert wurde, mit der klassischen hyperbolischen
. Abb. 1.17  Lin-log-Modell (rote Kurve) und Michaelis-
Menten-Modell (schwarze Kurve) im Vergleich für ein Enzym
mit vmax = 10 U mg–1 und Km = 2 mM. Die Messwerte (0,1–10
Km) sind als schwarze Punkte markiert. Der Gültigkeitsbereich
des Lin-log-Modells ist rot hinterlegt
27 1
Michaelis-Menten-Kurve. Innerhalb des experi-
mentell abgedeckten Konzentrationsbereichs geben
beide Modelle die gemessenen Werte gut wieder.
Der Vergleich macht jedoch auch die Nachteile des
semi-mechanistischen Modells an den Grenzen des
Messbereichs deutlich. Das Lin-log-Modell kann die
Reaktionsgeschwindigkeit in Abwesenheit des Subs-
trats nicht abbilden, da der Logarithmus von Null
nicht definiert ist. Zudem kann das Lin-log-Modell
die vollständige Sättigung des Enzyms mit Substrat
nicht darstellen, wodurch die extrapolierten Werte
bei hohen Substratkonzentrationen deutlich von den
Werten des mechanistischen Modells und somit von
den realen Werten abweichen.
Wesentliche Vorteile der Lin-log-Modelle gegen-
über mechanistischen Modellen sind die sehr einfa-
che Erweiterbarkeit und die minimale Parameter-
zahl. Gl. 1.92 gibt die Geschwindigkeitsgleichung für
eine reversible Ein-Substrat-Ein-Produkt-Reaktion
nach dem Lin-log-Modell wieder:
v= cE 0 ⋅ (a + b1 ⋅ ln cS + b2 ⋅ ln cP )  Gl. 1.92
Im Vergleich zu Gl. 1.48, die auf einem mechanis-
tischen Modell der reversiblen Ein-Substrat-Ein-
Produkt-Reaktionen basiert, hat das korrespondie-
rende Lin-log-Modell nur drei (a; b1; b2) statt vier
(vmax,f; vmax,r; KmS; KmP) Modellparameter. Die Dif-
ferenz zwischen der Anzahl der zu bestimmenden
Parameter bei einem mechanistischen Modell und
dem korrespondierenden Lin-log-Modell nimmt vor
allem mit steigender Anzahl an zu berücksichtigen-
den Substraten und Produkten zu (7 Abschn. 1.10).
Bei Verwendung eines Lin-log-Modells müssen
zwar meist sehr viel weniger kinetische Parameter
bestimmt werden, jedoch kann im Gegenzug nur in
einem engen Bereich um einen Arbeitspunkt inter-
poliert werden. Die Wahl eines geeigneten Modells
kann daher nur unter Berücksichtigung mehrerer
Entscheidungskriterien getroffen werden (. Tab. 1.3).
1.9 Regulatorische Enzyme
Zelluläre Stoffwechselwege umfassen eine Vielzahl
verschiedener Enzyme, die am Auf- oder Abbau
von Metaboliten beteiligt sind. Die Aktivität der
meisten Enzyme in einem metabolischen Netzwerk
kann mit den in den vorangegangenen Abschnitten
 28 K. Castiglione
dargestellten kinetischen Modellen beschrieben
1 werden. Regulatorische Enzyme hingegen stellen in
vielerlei Hinsicht eine Ausnahme dar und müssen
daher gesondert betrachtet werden.
Regulatorische Enzyme werden auch als Schlüs-
selenzyme oder Schrittmacherenzyme bezeichnet
und finden sich häufig am Anfang von Stoffwechsel-
wegen oder an zentralen Knotenpunkten in einem
metabolischen Netzwerk. Durch die Regulation der
katalytischen Aktivität dieser Schlüsselenzyme, die
meist irreversible Reaktionen katalysieren, können
die Flussraten durch die einzelnen Stoffwechselwege
kontrolliert werden, wodurch eine Zelle beispiels-
weise sehr effizient auf eine Änderung der Umwelt-
bedingungen reagieren kann.
1.9.1 Kooperativität und Allosterie
Regulatorische Enzyme reagieren häufig auf eine
geringe Änderung der Substratkonzentration mit
einer großen Änderung der Enzymaktivität. Oft
wird dieses Verhalten dadurch ermöglicht, dass die
aktiven Zentren von Enzymen, die aus mehreren
Untereinheiten bestehen, eine kooperative Bindung
zeigen. Hiermit ist gemeint, dass die Bindung eines
Substrats an eine Untereinheit zu einer strukturellen
Änderung des oligomeren Enzyms führt, wodurch
die Affinität der noch freien Bindeplätze moduliert
wird. Der Effekt auf die Enzymaktivität kann positiv
(stimulatorisch) oder negativ (inhibitorisch) sein.
Allosterische Enzyme stellen einen weiteren
Typ regulatorischer Enzyme dar, die ebenfalls eine
Konformationsänderung infolge der Bindung eines
Liganden eingehen. Bei allosterischen Enzymen
erfolgt die Regulation jedoch durch Effektoren, die
nicht im aktiven Zentrum binden, sondern an spezi-
fischen Bindestellen der Proteine, die als allosterische
Zentren bezeichnet werden. Häufig sind die Effekto-
ren kleine Metabolite oder Cofaktoren. Ein Enzym
kann auch durch zwei oder mehr Effektoren reguliert
werden. Ein typisches Beispiel für ein allosterisches
Enzym ist die 6-Phosphofructokinase (EC 2.7.1.11),
die den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der
Glykolyse katalysiert: die Umwandlung von Fructo-
se-6-phosphat zu Fructose-1,6-bisphosphat. Liegt
Adenosintriphosphat (ATP), die Energiewährung der
Zelle, in einer hohen Konzentration in der Zelle vor,
bindet ATP an ein allosterisches Zentrum des Enzyms
und hemmt dessen Aktivität, wodurch die weitere
ATP-Produktion über die Glykolyse gedrosselt wird.
Eine derartige Kontrolle von Enzymen durch Inter-
mediate oder Endprodukte ihres Stoffwechselwegs
wird als Rückkopplungshemmung (feedback inhibi-
tion) bezeichnet. Hohe Konzentrationen von Adeno-
sinmonophosphat (AMP) und Adenosindiphosphat
(ADP) hingegen, die eine Unterversorgung der Zelle
mit Energie anzeigen, führen zu einer allosterischen
Aktivierung der 6-Phosphofructokinase.
Kooperativität und Allosterie treten bei regulato-
rischen Enzymen sehr häufig zusammen auf, jedoch
sind es getrennt zu betrachtende Phänomene. Ein
gemeinsames Merkmal beider Regulationsmecha-
nismen ist, dass die Kurve, die beim Auftragen der
Reaktionsgeschwindigkeit gegen die Substratkon-
zentration entsteht, in der Regel eine sigmoide Form
hat. Die Kinetik von allosterischen und kooperati-
ven Enzymen kann daher nicht mit einem einfachen
Michaelis-Menten-Modell beschrieben werden, das
stets zu hyperbolischen cS-v-Kurven führt [8].
1.9.2 Die Hill-Gleichung
Für die Beschreibung des kooperativen Verhaltens
eines oligomeren Enzyms, das eine irreversible Reak-
tion katalysiert, liefert die Hill-Gleichung häufig eine
gute Annäherung:
vmax ⋅cSh
v=  Gl. 1.93
K 0h,5 + cSh
Die Parameter vmax und K0,5 entsprechen der maxi-
malen Reaktionsgeschwindigkeit beziehungsweise der
Substratkonzentration, bei der die halbmaximale Reak-
tionsgeschwindigkeit erreicht wird. Der Hill-Koeffizi-
ent h zeigt die Stärke der Kooperativität zwischen den
Untereinheiten an (. Abb. 1.18). Für ein Enzym, das
keine kooperative Bindung aufweist und der Michae-
lis-Menten-Kinetik (7 Abschn. 1.4.1) folgt, ist h = 1.
In diesem Fall entspricht K0,5 auch einer klassischen
Michaeliskonstante Km (Gl. 1.24). Eine positive Koope-
rativität liegt vor, wenn h > 1 ist. Negative Kooperativi-
täten (h < 1) treten vergleichsweise selten auf.
Eine Gleichung ähnlicher Form wurde von A.V.
Hill im Jahr 1910 ursprünglich für die Beschrei-
bung der positiv kooperativen Bindung von Sauer-
stoff an Hämoglobin entwickelt [15] und nachträglich
Kapitel 1 · Enzymkinetik
Y 
YPD[ K  K 

K 

K 



    FV
.
. Abb. 1.18  Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit
von der Substratkonzentration für Enzyme mit
unterschiedlichen Hill-Koeffizienten
auf enzymatische Reaktionen übertragen. Hill selbst
betrachtete seine Gleichung als empirisch [7]. Die
Grundannahme, die bei einer mechanistischen Her-
leitung der Hill-Gleichung getroffen werden muss,
ist, dass entweder alle Bindestellen eines Proteins mit
Liganden besetzt sind oder keine. Demnach müssten
die Interaktionen zwischen den Untereinheiten so aus-
geprägt sein, dass die Bindung eines Liganden die Affi-
nität der weiteren Untereinheiten so stark erhöht, dass
alle Bindeplätze simultan besetzt werden. Wenn dieses
Alles-oder-nichts-Prinzip zutreffen würde, wäre der
Hill-Koeffizient stets ganzzahlig und würde die Anzahl
der Substratbindestellen an einem Enzym angeben. Da
diese vollständige Kooperativität in der Praxis jedoch
nie vorkommt, ist der Hill-Koeffizient stets niedriger als
die tatsächliche Anzahl an Bindeplätzen eines Enzyms.
In vielen Fällen kann die Hill-Gleichung das Ver-
halten von kooperativen Enzymen im Bereich von
10–90 % der Substratsättigung sehr gut wiedergeben.
Die tatsächliche Reaktionsgeschwindigkeit weicht
jedoch vor allem bei sehr hohen und sehr niedri-
gen Substratkonzentrationen deutlich vom Modell
ab. Daher wurden realistischere Modelle entwickelt,
die gleichzeitig aber auch wesentlich komplexer sind.
1.9.3 Das Symmetrie-Modell von
Monod, Wyman und Changeoux
Kooperative und allosterische Effekte haben gemein-
sam, dass sie in der Regel auf Interaktionen zwischen
Proteinregionen basieren, die räumlich entfernt sind.
29 1
Wissenschaftler um Jacques Monod führten beide
Effekte auf die konformationelle Flexibilität von
Proteinen zurück und entwickelten ein gemeinsa-
mes Modell für beide Phänomene, das auf folgen-
den Annahmen basiert [23]:
1. Das Protein besteht aus n Untereinheiten, die
funktionell identisch sind.
2. Jede Untereinheit kann in zwei verschiedenen
Konformationen vorliegen, die als R (relaxed)
und T (tense) bezeichnet werden.

3. Alle Untereinheiten eines Proteinmoleküls sind
zu einem gegebenen Zeitpunkt in der gleichen
Konformation. Bei einem dimeren Protein gibt
es demnach nur R2- und T2-Zustände, während
die gemischte Konformation RT nicht auftreten
kann.
4. Die R- und T-Konformationen des Proteins
befinden sich im Gleichgewicht. L ist die
Gleichgewichtskonstante für den Übergang der
R- in die T-Konformation in Abwesenheit eines
Liganden (Aktivator, Inhibitor, Substrat).
5. Liganden können an beide Konformationen
binden, jedoch mit unterschiedlicher Affinität,
was in zwei verschiedenen Dissoziations-
konstanten KR und KT für die Bindung eines
Liganden A an eine R- beziehungsweise
T-Untereinheit resultiert:
cR ⋅ cA c ⋅c
KR = und KT = T A  Gl. 1.94
cRA cTA
Im Folgenden wird das Symmetrie-Modell beispiel-
haft an einem Protein mit zwei Untereinheiten (n = 2)
erläutert. Das Protein kann nach dem Symmetrie-
Modell in sechs verschiedenen Formen vorliegen:
zwei Konformationen mit je drei Beladungszustän-
den (. Abb. 1.19).
Die Gleichgewichtskonstante für den Konforma-
tionsübergang zwischen R- und T-Form lautet für ein
dimeres Protein wie folgt:
cT2
L=  Gl. 1.95
cR 2
Die fraktionelle Sättigung y gibt den Anteil der Bin-
deplätze, die mit einem Liganden besetzt sind, an der
Gesamtzahl verfügbarer Bindeplätz wieder. Die frak-
tionelle Sättigung eines dimeren Proteins kann wie
folgt beschrieben werden:
 30 K. Castiglione

  c  c  c
1 + cA
1  K
 ⋅ A + L ⋅ 1 + A  ⋅ A
  K T  K T
R  KR
y=  Gl. 1.102
 2  2
1 + cA  + L ⋅ 1 + cA 
   
K R  K T 

Für Proteine mit n Untereinheiten lautet die gene-

relle Gleichung:
. Abb. 1.19  Schematische Darstellung des Symmetrie-
Modells für ein dimeres Protein. Freie Liganden A werden aus
Gründen der Übersichtlichkeit nicht dargestellt  n−1 c  n−1
1 + cA ⋅ A + L ⋅ 1 + cA  ⋅ cA
 K  KR  K T  KT
R Gl. 1.103
y=
cR 2A + cT2A + 2 ⋅ cR 2A 2 + 2 ⋅ cT2A 2  n  n
y= 1 + cA  + L ⋅ 1 + cA 
(
2 ⋅ cR 2 + cT2 + cR 2A + cT2A + cR 2A 2 + cT2A 2 )  K R 

 K T 

 Gl.1.96
Gl. 1.103 beschreibt die fraktionelle Sättigung eines
Proteins mit einem Liganden A auf der Basis von
Im Zähler von Gl. 1.96 finden sich nur die Protein- Dissoziationskonstanten. Häufig wird diese Glei-
formen, die einen Liganden gebunden haben. Wenn chung noch augenscheinlich vereinfacht, indem
beide Untereinheiten einer Proteinform besetzt sind, weitere Quotienten zusammengefasst werden, z. B.
wird die Konzentration mit dem Faktor 2 multipli- cA/KR = α. Da dies jedoch dem Verständnis der bio-
ziert. Der Nenner repräsentiert die Gesamtkonzen- logischen Zusammenhänge nicht zuträglich ist, wird
tration des Proteins als Summe der Einzelkonzentra- an dieser Stelle darauf verzichtet. Soll Gl. 1.103 nun auf
tionen multipliziert mit der Anzahl der Bindestellen ein Enzym angewendet werden, das eine Einsubstrat-
pro Proteinmolekül. Unter Berücksichtigung von reaktion katalysiert, muss die in 7 Abschn. 1.4.1 einge-
Gl. 1.94 und 1.95 kann die Konzentration jeder Pro- führte rapid equilibrium-Annahme zutreffen. Hierbei
teinform in Abhängigkeit von cR2, KR, KT und L aus- führt ein geschwindigkeitslimitierender Schritt bei
gedrückt werden: der Umwandlung des Enzymsubstratkomplexes ES in
freies Enzym E und Produkt P dazu, dass alle anderen
cT2 = L ⋅ cR 2  Gl. 1.97 Komplexbildungen im Gleichgewicht sind und
durch Dissoziationskonstanten beschrieben werden
2 ⋅ cR 2 ⋅ cA können. In diesem Fall gilt für ein Enzym mit n Unter-
cR 2 A =  Gl. 1.98 einheiten und kooperativer Bindung des Substrates S:
KR
 n−1 c  c 
n−1
2 ⋅ cT2 ⋅ cA 2 ⋅ L ⋅ cR 2 ⋅ cA 1 + cS  ⋅ S + L ⋅ 1 + S  ⋅ S
c
cT2 A = =  Gl. 1.99 v  KR  KR  K T  KT
KT KT y= =
vmax  n  c 
n
1 + cS  + L ⋅ 1 + S 
0, 5 ⋅ cR 2 A ⋅ cA cR 2 ⋅ c2A  K   K T 
R
cR 2 A 2 = =  Gl. 1.100
KR K R2
 Gl. 1.104

0, 5 ⋅ cT2 A ⋅ cA L ⋅ cR 2 ⋅ cA2
cT2 A 2 = =  Gl. 1.101
KT K T2 Die Kooperativität der Untereinheiten hängt zum
einen vom Verhältnis von KR zu KT und zum anderen
von der Gleichgewichtskonstante L ab. Wenn KR
Durch Einsetzen von Gl. 1.97 bis Gl. 1.101 in Gl. 1.96 kleiner als KT ist, hat das Substrat eine höhere Affini-
und Umformen erhält man folgenden Ausdruck für tät zur R- als zur T-Konformation und die cS-v-Kurve
die fraktionelle Sättigung eines dimeren Proteins: nimmt eine stärker sigmoide Form mit zunehmender
Kapitel 1 · Enzymkinetik
Y 
YPD[



/


F6
. Abb. 1.20  Geschwindigkeitskurven für die kooperative
Substratbindung eines tetrameren Enzyms nach dem
K
Symmetrie-Modell. R = 0, 01 ; L = 0 (keine Kooperativität),
KT
5, 15, 50
Gleichgewichtskonstante für den Konformations-
übergang L an, da sich in Abwesenheit des Liganden
anteilig mehr Enzym in der wenig affinen T-Konfor-
mation befindet. Ist L = 0 existiert die T-Form des
Enzyms unter keiner Bedingung und es zeigt sich eine
klassische hyperbolische Bindekurve (. Abb. 1.20).
Ein sehr praktischer Aspekt des Symmetrie-
Modells ist die vergleichsweise einfache Modifizier-
barkeit von Gl. 1.103. Dies ist beispielsweise nötig,
wenn die T- und die R-Konformation eines Enzyms
nicht nur unterschiedliche Affinitäten zum Substrat,
sondern auch unterschiedliche Reaktionsgeschwin-
digkeiten aufweisen. Darüber hinaus kann auch die
Geschwindigkeitsgleichung von allosterisch akti-
vierten Enzymen auf die oben beschriebene Weise
hergeleitet werden. Da Substrat und Aktivator in
diesem Fall unabhängig voneinander an das Enzym
binden, müssen entsprechend mehr unterschiedli-
che Enzymformen bei der Herleitung berücksich-
tigt werden. Details hierzu sind nachzulesen in Segel
[29]. Ein wesentlicher Nachteil des Symmetrie-Mo-
dells hingegen ist, dass keine negative Kooperativität
abgebildet werden kann.
1.9.4 Das Sequenz-Modell von
Koshland, Némethy und Filmer
Das Sequenz-Modell ist neben dem Symmetrie-Mo-
dell der zweite gebräuchliche Ansatz zur Beschrei-
bung von Kooperativität. Auch dieses Modell geht
31 1
von einem Enzym mit mehreren Untereinheiten aus,
die in zwei verschiedenen Konformationen vorlie-
gen können. Während das Symmetrie-Modell jedoch
postuliert, dass die Konformation eines Proteins
unabhängig von der Ligandenbindung ist, ist eine
Grundannahme von Daniel Koshland und seinen
Kollegen (1966), dass die Konformationsänderung
durch die Ligandenbindung hervorgerufen wird
[19]. Diese induced fit-Hypothese hat das Schlüssel-
Schloss-Prinzip von Emil Fischer (1894), das von der
exakten Passgenauigkeit der Strukturen von Ligand
und Bindestelle ausgegangen war, um den Aspekt
der räumlichen Flexibilität erweitert. Nach dem
Sequenz-Modell entsteht Kooperativität dadurch,
dass die Konformationsänderung einer Untereinheit
die Dissoziationskonstanten der anderen Unterein-
heiten beeinflusst. Mit diesem Modell kann sowohl
positive als auch negative Kooperativität eines oligo-
meren Enzyms beschrieben werden.
Im Folgenden wird das Sequenz-Modell beispiel-
haft an einem dimeren Protein erläutert. Hierbei
kann das Protein in drei verschiedenen Zuständen
vorliegen wie . Abb. 1.21 zeigt. Während das Symme-
trie-Modell auf der Annahme basiert, dass gemischte
Konformationen wie RT nicht auftreten, ist der RTA-
Komplex eine zwingende Folge der induced fit-
Hypothese des Sequenz-Modells, wonach nur die
R-Konformation mit Substrat beladen sein kann.
Die Konzentrationen des RTA-Komplexes kann
wie folgt beschrieben werden:
2 ⋅ cT2 ⋅ cA ⋅ K R:T
cRTA =  Gl. 1.105
Kt ⋅ KR
Neben den Konzentrationen des Proteins ohne
gebundenem Liganden cT2 und des freien Ligan-
den cA, berücksichtigt Gl. 1.105 drei Konstanten, die
für die Komplexbildung relevant sind: Die Dissozia-
tionskonstante KR (Gl. 1.94), welche die Bindung des
Liganden A an die Untereinheit R charakterisiert, die
. Abb. 1.21  Schematische Darstellung des Sequenz-
Modells für ein dimeres Protein. Freie Liganden A werden aus
Gründen der Übersichtlichkeit nicht dargestellt
 32 K. Castiglione

Gleichgewichtskonstante Kt, die den Konformations-

1 übergang der T- in die R-Form beschreibt, und die Y
YPD[

sogenannte Interaktionskonstante KR:T. Interaktions-  F 
konstanten geben an, inwiefern die neu entstandenen F 
Schnittstellen gegenüber der ursprünglichen T:T- 
F 
Schnittstelle stabilisiert sind. Der statistische Faktor

2 trägt der Tatsache Rechnung, dass für die Liganden-
bindung zwei äquivalente Untereinheiten zur Verfü- 
gung stehen. Da bei der Bildung des R2A2-Komplexes

jeweils zwei Konformationsübergänge und Ligan- F6
denbindungen erfolgen müssen, gilt hierfür:

. Abb. 1.22  Geschwindigkeitskurven für die kooperative

cT2 ⋅ cA2 ⋅ K R:R
cR 2A 2 =  Gl. 1.106 Substratbindung eines dimeren Enzyms nach dem Sequenz-
K t2 ⋅ K R2 Modell

Analog zum Symmetrie-Modell kann die fraktionelle

Sättigung eines Proteins beziehungsweise Reaktions- den Proteinuntereinheiten abhängt. . Abb. 1.23 illus-
geschwindigkeit eines Enzyms nach der rapid equilib- triert diesen Zusammenhang am Beispiel der unter-
rium-Annahme unter Berücksichtigung von Gl. 1.105 schiedlichen geometrischen Arrangements eines tet-
und Gl. 1.106 wie folgt formuliert werden: rameren Proteins.

v cRTA + 2 ⋅ cR 2 A2
y= = 1.9.5 Andere
vmax 2 ⋅ (cT2 + cRTA + cR 2 A2 )
Regulationsmechanismen
cA ⋅ K R :T cA2 ⋅ K R :R
+ 2 2
Kt ⋅ KR Kt ⋅ KR Neben Allosterie und Kooperativität gibt es noch
=  Gl. 1.107
cA ⋅ K R :T cA2 ⋅ K R :R weitere Möglichkeiten, die Aktivität von regula-
1+ + 2 2
Kt ⋅ KR Kt ⋅ KR torischen Enzymen zu modulieren. Viele Enzyme
werden auch durch mehr als einen Regulationsme-
Bei einen Enzym nimmt dabei das Substrat S die Stelle chanismus kontrolliert.
des Liganden A ein. . Abb. 1.22 zeigt die Geschwin- Ein sehr häufig auftretender Regulationsmecha-
digkeitskurven für die kooperative Substratbindung nismus ist die reversible kovalente Modifikation, bei
eines dimeren Enzyms nach dem Sequenz-Modell. der eine modifizierende Gruppe an eine oder mehrere
Die Form der Kurven wird dabei durch den Faktor c Aminosäuren eines Enzymmoleküls bindet und so
bestimmt, der folgendermaßen definiert ist: dessen Aktivität verändert. Insgesamt gibt es mehr als
500 unterschiedliche Arten der kovalenten Modifika-
K R:T tion, wie beispielsweise Methylierung, Acetylierung
c=  Gl. 1.108
K R:R

Wenn c > 1 ist, liegt eine negative Kooperativität vor,

während Werte <1 eine positive Kooperativität anzei-
gen. Ist c = 1 weist das Enzym eine hyperbolische Sät-
tigungskurve auf.
Die Herleitung der Geschwindigkeitsgleichung
für Enzyme mit mehr als zwei Untereinheiten kann
prinzipiell wie oben beschrieben erfolgen. Jedoch
muss die Geometrie des betrachteten Enzyms
bekannt sein, da hiervon die Anzahl und Qualität . Abb. 1.23  Mögliche räumliche Anordnungen der
der zu berücksichtigenden Schnittstellen zwischen Untereinheiten eines tetrameren Proteins
Kapitel 1 · Enzymkinetik
33 1
und Ubiquitinierung. Die bedeutendste kovalente
. Tab. 1.4  Typische Stöchiometrien der Reaktionen,
Modifikation ist die Phosphorylierung, die durch Pro- die von Enzymen verschiedener Hauptklassen nach
teinkinasen katalysiert wird. Schätzungsweise weist der EC-Nomenklatur katalysiert werden [31]
ein Drittel aller Proteine einer eukaryotischen Zelle
unterschiedliche Phosphorylierungszustände auf [24]. EC-Nummer Hauptklasse Typische
Stöchiometrie
Manche Enzyme werden aktiviert oder
gehemmt, indem sie an weitere regulatorische Pro- EC 1 Oxidoreduktasen Bi-Bi oder Ter-Bi
teine binden oder werden durch proteolytische
EC 2 Transferasen Bi-Bi
Spaltung irreversibel aktiviert. Ein sehr bekanntes
EC 3 Hydrolasen Bi-Bi
Beispiel für die Aktivierung von Enzymen durch
Entfernung von Proteinsegmenten ist die Blutgerin- EC 4 Lyasen Bi-Uni oder
Uni-Bi
nung. Unter anderem wird dabei die Serinprotease
Thrombin, das zentrale Enzym der Blutgerinnung EC 5 Isomerasen Uni-Uni
in Wirbeltieren, aus ihrem inaktiven Proenzym Pro- EC 6 Ligasen Ter-Ter
thrombin freigesetzt.

1.10 Kinetik von
Mehrsubstratreaktionen
Bei der Erstellung eines mechanistischen Modells für
Reaktionen, an denen mehr als ein Substrat und/oder
mehr als ein Produkt beteiligt ist, müssen zunächst
folgende grundlegenden Fragen beantwortet werden,
bevor mit der Aufstellung der Geschwindigkeitsglei-
chung begonnen werden kann:
55 Welche Stöchiometrie liegt vor?
55 In welcher Reihenfolge binden die Substrate?
55 Ist der geschwindigkeitslimitierende Schritt
bekannt?
55 Gibt es irreversible Reaktionsschritte oder
Inhibierungen?
mit drei Substraten treten bei Oxidoreduktasen und
Ligasen auf. Ligasen sind zwar essentiell für zelluläre
Prozesse wie DNA-Replikation und -Reparatur, finden
jedoch bislang keine gezielte Anwendung in biotech-
nologischen Produktionsprozessen. Oxidoreduktasen
hingegen werden häufig eingesetzt. Reaktionssysteme
mit drei Substraten können jedoch vereinfachend wie
ein Zweisubstratsystem analysiert werden, wenn jeweils
eines der Substrate im Überschuss zugegeben wird. Aus
diesen Gründen repräsentieren Bi-Bi-Reaktionen die
bedeutendste Gruppe der Mehrsubstratreaktionen.
1.10.2 Reihenfolge der
Substratbindung

Die Reaktionsmechanismen von Enzymen können

1.10.1 Stöchiometrie
Die Zugehörigkeit eines Enzyms zu einer der Haupt-
klassen nach der EC-Nomenklatur ist ein sehr guter
Indikator für die Stöchiometrie der katalysier-
ten Reaktion. Wie . Tab. 1.4 zeigt, katalysieren die
meisten Enzyme Reaktionen, an denen mehr als
ein Substrat und/oder Produkt beteiligt ist. Hierbei
stehen die Präfixe Uni, Bi und Ter für ein, zwei bezie-
hungsweise drei Substrate oder Produkte.
Ein-Substrat-Ein-Produktreaktionen (Uni-Uni-
Reaktionen), die mit der Michaelis-Menten-Kinetik
beschrieben werden können, sind vergleichsweise
selten. Am häufigsten sind Reaktionsmechanismen,
bei denen zwei Substrate involviert sind. Reaktionen
in sequentielle Mechanismen und Ping-Pong-Me-
chanismen unterteilt werden.
Bei einem sequentiellen Mechanismus können
alle Substrate gleichzeitig im aktiven Zentrum
gebunden werden. Die Anlagerung der Subst-
rate kann prinzipiell in einer definierten Reihen-
folge („ordered“) oder in beliebiger Reihenfolge
(„random“) erfolgen.
Bei einem Ping-Pong-Mechanismus kommt es
zur Produktfreisetzung, bevor alle Substrate an das
aktive Zentrum gebunden haben. Das Enzym exis-
tiert in zwei (oder mehr) Formen – jeweils modifi-
ziert durch Gruppen der Substrate. Ping-Pong-Me-
chanismen sind typisch für Transferasen, kommen
jedoch auch in anderen Enzymklassen vor.
 34 K. Castiglione
1.10.3 Geschwindigkeitslimitierender
1 Schritt
Wie bei der Herleitung der Michaelis-Menten-Kinetik
bereits erläutert wurde (7 Abschn. 1.4.1), gibt es prinzi-
piell zwei Möglichkeiten, Geschwindigkeitsgleichun-
gen für enzymkatalysierte Reaktionen aufzustellen:
den rapid equilibrium- und den steady state-Ansatz.
Beim rapid equilibrium-Ansatz geht man davon
aus, dass der katalytische Schritt, also das Aufbre-
chen und die Neubildung von kovalenten Bindungen,
geschwindigkeitslimitierend ist. Alle Bindungs- und
Dissoziationsschritte sind vergleichsweise schnell und
im Gleichgewicht. Diese Annahme führt in der Regel
zu relativ einfachen Geschwindigkeitsgleichungen, in
denen drei Arten von Parametern auftreten: die kata-
lytische Konstante (kcat), die Gleichgewichtskonstante
(Keq), und Dissoziationskonstanten (KA, KB, KC, …).
Für die meisten Enzyme ist die rapid equilibrium-
Annahme nicht zutreffend, da der katalytische Schritt
so schnell ist, dass die auftretenden Enzym-Substrat-
und Enzym-Produktkomplexe nicht im Gleichgewicht
sind und ihre Konzentrationen daher nicht durch Dis-
soziationskonstanten beschrieben werden können. Bei
steady state-Mechanismen ist die Verteilung der auf-
tretenden Enzymformen von den Geschwindigkeits-
konstanten aller Teilschritte abhängig und ihre Kon-
zentrationen sind im Fließgleichgewicht:
dcEX
= 0 Gl. 1.109
dt
Die resultierenden Geschwindigkeitsgleichungen
sind meist komplex und es müssen vier Arten von
Parametern berücksichtigt werden. Neben kcat und
Keq treten Michaeliskonstanten (KmA, KmB, KmC, …)
und Inhibitionskonstanten (KiA, KiB, KiC, …) auf.
1.10.4 Irreversible Reaktionen oder
Inhibierungen
Wenn eine enzymkatalysierte Reaktion irreversi-
bel ist, ist das auf einen oder mehrere irreversible
Teilschritte des Reaktionsmechanismus zurück-
zuführen. Die resultierende Geschwindigkeits-
gleichung ist davon abhängig, welche Teilschritte
genau irreversibel sind. Beispielsweise katalysieren
Formiatdehydrogenasen (EC 1.2.1.2) die Oxidation
von Formiat zu Kohlendioxid unter gleichzeitiger
Reduktion des Cofaktors NAD+ zu NADH:
HCOO– + NAD+ → CO2 + NADH
Die Reaktion ist unter normalen Bedingungen irre-
versibel, da das gasförmige Kohlendioxid aus dem
Reaktionsansatz entweicht. Beim Aufstellen einer
Geschwindigkeitsgleichung für die Reaktion muss
jedoch die Produktinhibition von NADH berück-
sichtigt werden, da der reduzierte Cofaktor im Reak-
tionsansatz verbleibt und an das Enzym binden kann,
auch wenn die Rückreaktion nicht stattfindet.
Weitere kinetische Phänomene, wie beispiels-
weise eine Substratüberschussinhibierung, müssen
ebenfalls in der Geschwindigkeitsgleichung berück-
sichtigt werden.
1.10.5 Cleland-Diagramme
Die gebräuchliche Nomenklatur für enzymkataly-
sierte Reaktionen mit zwei oder mehr Substraten
wurde von W. Cleland entwickelt [5]. Laut dieser
Notation werden die Substrate als A, B, C … und die
Produkte als P, Q, R … bezeichnet, in der Reihen-
folge, in der sie an das Enzym binden beziehungs-
weise das Enzym verlassen. Der Buchstabe E steht
für das Enzym in seiner Ursprungsform. Wird das
Enzym in einem Ping-Pong-Mechanismus durch
übertragene Gruppen der Substrate modifiziert,
werden die entstehenden Formen durch F, G, H …
repräsentiert. In der Cleland-Nomenklatur werden
Übergangskomplexe und Zentralkomplexe unter-
schieden. Übergangskomplexe sind die Enzymkom-
plexe, die bimolekulare Reaktionen mit anderen
Liganden eingehen können und beispielsweise ein
weiteres Substrat binden können. In den Zentral-
komplexen findet die katalytische Reaktion statt. Alle
Bindungsstellen sind besetzt und nur unimolekulare
Reaktionen, wie Isomerisierungen oder die Freiset-
zung von Substraten oder Produkten, sind möglich.
Bei der schematischen Darstellung von Reak-
tionsmechanismen nach Cleland werden die auftre-
tenden Enzymformen unterhalb einer horizontalen
Linie aufgelistet und vertikale Reaktionspfeile zeigen
den Eintritt von Substraten und die Freisetzung
Kapitel 1 · Enzymkinetik
von Produkten an. Die Geschwindigkeitskonstan-
ten der Teilreaktionen, die auch als Mikrokonstan-
ten bezeichnet werden, können neben die Pfeile
geschrieben werden. Dabei stehen die Mikrokons-
tanten links neben dem Pfeil für die Hin- und rechts
für die Rückreaktion. Die Zentralkomplexe werden
dadurch gekennzeichnet, dass sie in Klammern
gesetzt werden. . Abb. 1.24 zeigt verschiedene Bei-
spiele für Cleland-Diagramme.
Rapid equilibrium- und steady state-Mechanis-
men unterscheiden sich in Cleland-Diagrammen
meist in der Darstellung der Zentralkomplexe. Bei
rapid equilibrium-Mechanismen ist die Umwandlung
der Zentralkomplexe der geschwindigkeitslimitie-
rende Schritt, weshalb die zugehörigen Geschwin-
digkeitskonstanten in der schematischen Darstellung
aufgeführt sind. Bei steady state-Mechanismen wird
die Umwandlung der Zentralkomplexe ineinander
. Abb. 1.24  Cleland-Diagramme für verschiedene Bi-Bi-
Reaktionsmechanismen
35 1
nicht aufgelöst, da es sich formal um eine Isomeri-
sierung handelt, die keinen Einfluss auf die resultie-
rende Geschwindigkeitsgleichung hat. In . Abb. 1.24
sind daher die Zentralkomplexe der beiden steady
state-Mechanismen jeweils zusammengefasst.
1.10.6 Unterscheidung von
Enzymmechanismen
Die Unterscheidung zwischen verschiedenen
Enzymmechanismen wird nachfolgend am Bei-
spiel der Bi-Bi-Reaktionen erläutert, da diese die
wichtigste Gruppe der Mehrsubstratreaktionen
darstellen.
Anfangsreaktionsge­
schwindigkeitsmuster
Anfangsreaktionsgeschwindigkeitsmuster können
dazu benutzt werden, sequentielle Mechanismen
von Ping-Pong-Mechanismen zu unterscheiden.
Bei einer Bi-Bi-Reaktion wird hierzu die Konzent-
ration eines der beiden Substrate konstant gehalten,
während die Konzentration des anderen Substrats
variiert wird. Wenn A das variable und B das kons-
tante Substrat ist, gibt die Auftragung der Anfangs-
reaktionsgeschwindigkeit gegen die Konzentration
von A eine hyperbolische „Michaelis-Menten-
Kurve“ und vice versa. Trägt man die Reaktionsge-
schwindigkeiten, die bei unterschiedlichen Konzent-
rationen des konstanten Substrats bestimmt worden
sind, in ein gemeinsames Diagramm ein, so ergibt
sich in der doppelt-reziproken Lineweaver-Burk-
Darstellung eine Geradenschar (. Abb. 1.25). Liegt
ein sequentieller Mechanismus vor, bei dem beide
Substrate gleichzeitig an das Enzym gebunden sind
und ein sogenannter ternärer Enzym-Substrat-Kom-
plex entsteht, haben die Geraden einen gemeinsamen
Schnittpunkt. Dieser Schnittpunkt kann zwar über,
auf oder unter der x-Achse liegen, jedoch befindet
er sich bei Bi-Bi-Mechanismen stets links von der y-
Achse. Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeitsmus-
ter von Ping-Pong-Mechanismen hingegen zeigen
parallele Linien.
Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeitsmuster
zeigen, dass sowohl bei sequentiellen Mechanismen
als auch bei Ping-Pong-Mechanismen eine höhere
 36 K. Castiglione
. Abb. 1.25  Anfangsreaktionsgeschwindigkeitsmuster von sequentiellen (a) und Ping-Pong-Mechanismen (b). Die Muster
sind in beiden Fällen qualitativ identisch, wenn B das variable und A das konstante Substrat ist
Konzentration des konstanten Substrats B zu einer
höheren apparenten maximalen Reaktionsgeschwin-
digkeit führt. Dies kann man an dem kleiner werden-
den Betrag des y-Achsenabschnitts erkennen, der im
Lineweaver-Burk-Diagramm 1/vmax entspricht. Bei
sequentiellen Mechanismen ist auch die Steigung der
Geraden abhängig von der Konzentration des variab-
len Substrats. Die inverse Steigung der Geraden in
der Lineweaver-Burk-Auftragung entspricht der
Geschwindigkeitskonstante bei sehr niedrigen Subs-
tratkonzentrationen (cA ≤ 0,01 Km) (7 Abschn. 1.4.1
und Gl. 1.30):
vmax
v= ⋅ cA  Gl. 1.110
Km
Bei sehr niedrigen Konzentrationen von A ist die
Bindung des Substrats an das freie Enzym geschwin-
digkeitslimitierend. Die Erhöhung von cB redu-
ziert die Konzentration des EA-Komplexes, da
sie zur verstärkten Bildung des EAB-Komplexes
führt. Die Reaktion EA + B → EAB zieht folglich
die Reaktion E + A → EA auf die rechte Seite. Auf
diese Weise erhöht eine steigende Konzentration
von B die Reaktionsgeschwindigkeit bei sehr nied-
rigen Konzentrationen an A, woraus eine Änderung
der Geradensteigung resultiert. Im Ping-Pong-Bi-
Bi-Mechanismus hingegen ist die Umsetzung von
A von der Umsetzung von B kinetisch isoliert, da
beide Substrate an unterschiedliche Enzymformen
(E beziehungsweise F) binden (. Abb. 1.24). Unter
Anfangsreaktionsgeschwindigkeitsbedingungen
gibt es keine reversible Verbindung zwischen E und
F, da keine Rückreaktion stattfindet. Daher ist die
Geradensteigung bei einem Ping-Pong-Mechanis-
mus unabhängig von der Konzentration des kons-
tanten Substrats und es kommt zu parallelen Linien
in der Lineweaver-Burk-Auftragung.
Anhand von Anfangsreaktionsgeschwindigkeits-
mustern ist es nicht möglich, Aussagen darüber zu
treffen, ob die Substrate bei einem sequentiellen
Mechanismus in zufälliger Reihenfolge (random)
oder geordnet (ordered) binden. Diese Unterschei-
dung kann mit Hilfe von Produktinhibitionsmustern
gemacht werden.
Produktinhibitionsmuster
Produktinhibitionsexperimente können ein detail-
liertes Bild vom Mechanismus einer Zweisubstrat-
reaktion liefern. Hierbei wird die Art der Hemmung
eines Enzyms durch die Produkte der Reak-
tion untersucht. Wie bei Einsubstratreaktionen
(7 Abschn. 1.6.3) werden kompetitive, unkompetitive
und nichtkompetitive beziehungsweise gemischte
Hemmungen unterschieden.
Im Verlauf einer Zweisubstratreaktion werden die
Substrate A und B durch das Enzym zu den Produk-
ten P und Q umgesetzt. Laut der Cleland-Nomenk-
latur (7 Abschn. 1.10.2) ist P das Produkt, welches
das Enzym zuerst verlässt. Bei einem sequentiellen,
geordneten Mechanismus können die beiden Subst-
rate nicht gleichzeitig ihren Bindeplatz erreichen. Es
muss zunächst das Substrat A binden, bevor B binden
kann. Folglich muss das Produkt, das aus B entsteht,
das Enzym zuerst verlassen, bevor das Produkt, das
aus A entsteht, freigesetzt werden kann. Somit wird
A zu Q und B zu P umgesetzt, wie . Abb. 1.26a zeigt.
Kapitel 1 · Enzymkinetik
. Abb. 1.26  Schematische Darstellung der aktiven
Zentren von Enzymen, die einen sequentiellen
Reaktionsmechanismus aufweisen, bei dem die Substrate
in geordneter (a) oder in beliebiger Reihenfolge (b) binden
können
Bei einem random-Mechanismus erfolgen die Subs-
tratbindung und die Produktfreisetzung unabhängig
voneinander und die Zuordnung ist willkürlich. Aus
Gründen der Konsistenz wird hier jedoch auch das
Produkt Q dem Substrat A und das Produkt P dem
Substrat B zugeordnet (. Abb. 1.26b).
. Tab. 1.5 gibt eine Übersicht über mögliche Inhi-
bitionsmuster, die aus der Zugabe der Produkte P
und Q zu der Enzymreaktion resultieren, wenn die
37 1
Konzentrationen der Substrate A und B im nicht-
gesättigten Bereich gehalten werden und eines der
beiden Substrate variiert wird.
Die Entstehung der unterschiedlichen Muster
wird nachfolgend am Beispiel des rapid equilibrium
random Bi-Bi-Mechanismus erläutert. In diesem Fall
können die Substrate in beliebiger Reihenfolge an das
Enzym binden. Es treten daher folgende Enzymkom-
plexe auf: EA, EB, EAB, EPQ, EP und EQ. Mischfor-
men, in denen jeweils ein Substrat und ein Produkt
vereinigt wären, wie EAP und EBQ, können nicht
gebildet werden. Wenn A das variable Substrat ist
und Q das inhibierende Produkt, so konkurrieren
beide um den gleichen Bindeplatz. Eine steigende
Konzentration an A kann Q aus diesem Bindeplatz
verdrängen und es liegt eine kompetitive Hemmung
vor. Wenn P das inhibierende Produkt ist, kommt
es hingegen zu keiner direkten Konkurrenz um den
gleichen Bindeplatz. Dennoch kann eine steigende
Konzentration an A das Produkt P aus dem Nach-
barbindungsplatz verdrängen, da der Komplex EAP
nicht existieren kann. Somit kommt es hier auch zu
einer kompetitiven Hemmung. Die anderen Subs-
trat-Produkt-Paarungen ergeben aus den gleichen
Gründen identische Muster.
Anhand der Produktinhibitionsmuster kann
nicht nur der jeweilige Mechanismus identifiziert
werden. Beispielsweise kann bei einem ordered

. Tab. 1.5  Produktinhibitionsmuster häufig vorkommender Bi-Bi-Mechanismen [29]

Mechanismus Inhibieren- Variables Substrat

des Produkt
A (B konstant, nicht gesättigt) B (A konstant, nicht gesättigt)

Ordered Bi-Bi P Nichtkompetitiv Nichtkompetitiv

Q Kompetitiv Nichtkompetitiv
Theorell-Chance P Nichtkompetitiv Kompetitiv
Q Kompetitiv Nichtkompetitiv
Rapid equilibrium random P Kompetitiv Kompetitiv
Bi-Bi
Q Kompetitiv Kompetitiv
Ping-Pong Bi-Bi P Nichtkompetitiv Kompetitiv
Q Kompetitiv Nichtkompetitiv

Statt einer nichtkompetitiven Hemmung kann stets auch eine gemischte Hemmung vorliegen. Falls nicht näher
spezifiziert, handelt es sich um steady state-Mechanismen.
 38 K. Castiglione

Bi-Bi-Mechanismus auch bestimmt werden, welches 1.10.7 Herleitung von

1 der beiden Substrate zuerst an das Enzym bindet.
Dies ist möglich, da eine kompetitive Hemmung nur
dann auftritt, wenn das zuerst bindende Substrat A
variiert wird und das Produkt Q, welches das Enzym
zuletzt verlässt, als Inhibitor fungiert. Die beispiel-
haft aufgeführten Produktinhibitionsmuster zeigen
jedoch auch, dass die Unterscheidung zwischen
verschiedenen Mechanismen häufig noch weitere
Daten erfordert. Der Theorell-Chance-Mechanis-
mus ist eine Sonderform des ordered Bi-Bi-Mecha-
nismus, bei dem der Zentralkomplex so schnell zer-
fällt, dass seine Konzentration im Fließgleichgewicht
und folglich auch für die Erstellung der Geschwin-
digkeitsgleichung vernachlässigbar ist. Anhand
der Produktinhibitionsmuster lässt sich der Theo-
rell-Chance-Mechanismus jedoch nicht von einem
Ping-Pong Bi-Bi-Mechanismus unterscheiden. Hier
können zusätzliche Anfangsreaktionsgeschwindig-
keitsmuster helfen.
Geschwindigkeitsgleichungen
Rapid equilibrium-Mechanismen
Die Herleitung der Geschwindigkeitsgleichungen für
rapid equilibrium-Mechanismen ist vergleichsweise
einfach und erfolgt für jeden Mechanismus nach dem
gleichen Schema in sieben Schritten. Als Beispiel soll
hier der rapid equilibrium ordered Bi-Uni-Mechanis-
mus dienen, bei dem die Desorption des Produktes
irreversibel ist und folglich keine Rückreaktion statt-
findet (. Abb. 1.27).
1. Formulierung des geschwindigkeitslimitie-
renden Schrittes:
In einem rapid equilibrium-Mechanismus
wird die Reaktionsgeschwindigkeit nur durch
den geschwindigkeitslimitierenden Schritt
bestimmt. Für den rapid equilibrium ordered
Bi-Uni-Mechanismus gilt daher:

v= k3 ⋅ cEAB = kcat ⋅ cEAB  Gl. 1.111

Nutzung von Isotopen
Kann ein Enzymmechanismus nicht allein auf- 2. Erstellung der Massenbilanz der auftretenden
grund von Anfangsreaktionsgeschwindigkeits- Enzymformen:
mustern und Produktinhibitionsstudien iden-
tifiziert werden, können Isotope zur weiteren cE 0 = cE + cEA + cEAB  Gl. 1.112
Aufklärung beitragen. Die Anwendungen von
Isotopen zur genauen Untersuchung kinetischer 3. Teilen von Gl. 1.111 durch Gl. 1.112:
Mechanismen sind vielfältig [8] und daher soll
ihr Potential nur am Beispiel des primären kine- v kcat ⋅ cEAB
=  Gl. 1.113
tischen Isotopeneffekts herausgestellt werden. cE 0 cE + cEA + cEAB
Dieser Effekt tritt auf, wenn ein Atom in einer
reagierenden Gruppe durch ein schwereres Isotop 4. Zusammenfassung der übrigen Geschwindig-
ersetzt wird. Ist beispielsweise in einer Reaktion keitskonstanten zu Dissoziationskonstanten:
die Übertragung eines Wasserstoffatoms geschwin-
digkeitsbestimmend, führt der Austausch gegen k−1 cE ⋅ cA
KA = =  Gl. 1.114
Deuterium zu einer deutlich verminderten Reak- k1 cEA
tionsgeschwindigkeit. Typischerweise sind die
Reaktionsraten mit Wasserstoff siebenfach höher k−2 cEA ⋅ cB cE ⋅ cA ⋅ cB
KB = = =  Gl. 1.115
als mit Deuterium [8]. Folglich ist das Ausblei- k2 cEAB K A ⋅ cEAB
ben eines primären Isotopeneffektes ein Hinweis
darauf, dass der katalytische Schritt, also das Auf- 5. Darstellung der Konzentrationen aller Enzym-
brechen und die Neubildung kovalenter Bindun- formen in Abhängigkeit von cE:
gen, nicht geschwindigkeitslimitierend ist und es
cA
sich um keinen rapid equilibrium-Mechanismus cEA = ⋅ cE  Gl. 1.116
handelt. KA
Kapitel 1 · Enzymkinetik
39 1
. Abb. 1.27  Cleland-Diagramm
des rapid-equilibrium ordered Bi-
Uni-Mechanismus mit irreversibler
Desorption des Produkts

cA ⋅ cB dann beispielsweise mit Hilfe eines Computerpro-

cEAB = ⋅ cE  Gl. 1.117
KA ⋅ KB
6. Einsetzen der Ausdrücke für die Enzymformen
in Gl. 1.113:
c ⋅c
kcat ⋅ A B ⋅ cE
v KA ⋅ KB
=  Gl. 1.118
cE 0 c + cA ⋅ c + cA ⋅ cB ⋅ c
E E E
KA KA ⋅ KB
7. Kürzen von cE und Einsetzen der Beziehung
vmax = kcatcE0, da die maximale Reaktions-
geschwindigkeit erreicht ist, wenn die Konzen-
tration des EAB-Komplexes der gesamten
Enzymkonzentration cE0 entspricht:
cA ⋅ cB
KA ⋅ KB
v =vmax ⋅  Gl. 1.119
c c ⋅c
1+ A + A B
KA KA ⋅ KB
Steady state-Mechanismen
Die Erstellung von Geschwindigkeitsgleichun-
gen für steady state-Mechanismen kann prinzipiell
analog zur Herleitung der Michaelis-Menten-Kine-
tik (7 Abschn. 1.4.1) durch die Aufstellung von Dif-
ferentialgleichungen erfolgen, die die Geschwindig-
keiten der Konzentrationsänderungen der einzelnen
Komponenten beschreiben. Durch die Annahme,
dass sich die auftretenden Enzymkomplexe im
Fließgleichgewicht der Gesamtreaktion befinden,
können ihre Konzentrationsänderungen gleich
Null gesetzt werden. Das Gleichungssystem kann
gramms gelöst werden. Wenn Gleichungen für sehr
komplexe Mechanismen mit mehreren Substraten,
Produkten und Inhibitoren aufgestellt werden sollen,
ist eine korrekte Formulierung der Differentialglei-
chungen jedoch mühsam und fehleranfällig. Daher
wurden eine Reihe von schematischen Ansätzen und
Computerprogrammen entwickelt, die hierbei assis-
tieren können [25]. Der bedeutendste schematische
Ansatz, der auch die Basis für viele der Algorithmen
darstellt, die in den entsprechenden Computerpro-
grammen eingesetzt werden, ist das King-Altman-
Verfahren [18].
Bei der schematischen Methode nach King und
Altman (1956) erfolgt die Aufstellung von steady
state-Geschwindigkeitsgleichungen in fünf Schritten.
1. Schritt: Konstruktion eines Polygons
Zunächst werden die verschiedenen Enzymformen,
die in einem Reaktionsmechanismus auftreten, in
einer geometrischen Figur arrangiert, wobei jede
Ecke von einer Enzymform besetzt wird. Die Reak-
tionspfeile verbinden die Enzymformen und werden
mit den entsprechenden Geschwindigkeitskonstanten
beschriftet, die mit der Konzentration der eingehen-
den Liganden multipliziert werden. Die Freisetzung
von Liganden wird nicht angezeigt. Das konstruierte
Polygon hat somit n Ecken, die den jeweiligen Enzym-
formen entsprechen, und m Verbindungen zwischen
den Enzymformen. . Abb. 1.28 zeigt Beispiele für die
Polygone verschiedener Reaktionsmechanismen.
Wie bei den Cleland-Diagrammen (7 Abschn. 1.10.2)
können die Zentralkomplexe zusammengefasst
werden, da die formale Isomerisierung keinen Ein-
fluss auf die Geschwindigkeitsgleichung hat. Beim
steady state Uni-Uni Mechanismus (. Abb. 1.28a) sind
 40 K. Castiglione
. Abb. 1.28  Polygone für verschiedene steady state-
Reaktionsmechanismen nach dem King-Altman-Verfahren.
a) Uni-Uni-Mechanismus (n = 3, m = 3), b) ordered Bi-Bi-
Mechanismus (n = 4, m = 4), c) random Bi-Uni-Mechanismus
(n = 4, m = 5)
beide Zentralkomplexe getrennt aufgeführt, da sonst
kein Polygon konstruiert werden kann.
2. Schritt: Ableitung der relevanten Muster
Ausgehend vom Polygon werden im nächsten Schritt
alle möglichen Muster aufgezeichnet, die aus n − 1
Linien bestehen. Hierbei werden alle Muster, die
geschlossene Figuren aufweisen, nicht berücksich-
tigt. . Abb. 1.29 zeigt die relevanten Muster für die
in . Abb. 1.28 dargestellten Polygone.
. Abb. 1.29  Relevante Muster mit n − 1 Linien für die
in . Abb. 1.28 dargestellten Polygone verschiedener steady
state-Reaktionsmechanismen. a) Uni-Uni-Mechanismus,
b) ordered Bi-Bi-Mechanismus, c) random Bi-Uni-Mechanismus.
Nur im Fall des random Bi-Uni-Mechanismus (rot hinterlegt)
treten geschlossene Figuren auf, die eliminiert werden müssen
Die Anzahl aller möglichen Muster x aus n − 1
Linien kann mit Hilfe folgender Gleichung berech-
net werden:
m!
x=  Gl. 1.120
(n −1)!⋅(m − n + 1)!
Die Anzahl der unzulässigen Muster y aus n − 1
Linien mit einer geschlossenen Figur mit r Seiten
kann ebenfalls berechnet werden, wobei gilt r ≤ n − 1:
(m − r )!
y=  Gl. 1.121
(n −1 − r )!⋅(m − n + 1)!
Die Zahl der unzulässigen Muster muss für jede auf-
tretende geschlossene Figur separat berechnet werden.
Die Summe aller unzulässigen Muster wird abschlie-
ßend von der Zahl der möglichen Muster x abgezogen,
um die Zahl der relevanten Muster z zu bestimmen.
z = x − ∑ i yi  Gl. 1.122
Eine Beispielrechnung für den steady state random
Bi-Uni-Mechanismus (n = 4, m = 5) ergibt:
Kapitel 1 · Enzymkinetik
5!
x= = 10 
(4 −1)!⋅(5 − 4 + 1)!
Wie aus . Abb. 1.28c ersichtlich wird, gibt es zwei
Dreiecke im zugehörigen Polygon, die an einer
gemeinsamen Basis gespiegelt sind. Für jedes dieser
Dreiecke gilt:
(5 − 3)!
y= =1 
(4 −1− 3)!⋅(5 − 4 + 1)!
Somit ergibt sich für die Anzahl der relevanten Muster:
z = 10 − (1 + 1) = 8
Die relevanten Muster sowie die beiden unzulässigen
Muster sind in . Abb. 1.29c zu sehen.
3. Schritt: Ableitung der mathematischen
Ausdrücke für alle Enzymformen
Die nachfolgenden Schritte werden aus Gründen der
Übersichtlichkeit nur am Beispiel des Uni-Uni-Mecha-
nismus erläutert. Zur Ableitung der mathematischen
Ausdrücke für die auftretenden Enzymformen wird
die jeweils betrachtete Enzymform in den in Schritt
2 identifizierten Mustern an der Stelle platziert, die
ihrer ursprünglichen Position im Polygon entspricht.
Anschließend wird ein Produkt aus den Geschwin-
digkeitskonstanten und zugehörigen Konzentrationen
eingehender Liganden gebildet, die im ursprünglichen
Polygon entlang der Reaktionspfeile stehen, die zu der
jeweiligen Enzymform führen. Die drei Produkte, die
aus den drei relevanten Mustern resultieren, werden
letztendlich summiert. . Abb. 1.30 illustriert dieses
Vorgehen am Beispiel des freien Enzyms E.
Der relative Anteil des freien Enzyms an der
Gesamtenzymkonzentration kann dann wie folgt
formuliert werden:
cE k ⋅ k + k−1 ⋅ k3 + k2 ⋅ k3
= −2 −1  Gl. 1.123
cE 0 Nenner
Analog ergibt sich für die anderen beiden Enzym-
formen EA und EP:
cEA k−2 ⋅ k1 ⋅ cA + k3 ⋅ k1 ⋅ cA + k−3 ⋅ cP ⋅ k−2
=
cE 0 Nenner
 Gl. 1.124
41 1
. Abb. 1.30  Ableitung des mathematischen Ausdrucks für
das freie Enzym E im Uni-Uni-Mechanismus
cEP k1 ⋅ cA ⋅ k2 + k−1 ⋅ k−3 ⋅ cP + k2 ⋅ k−3 ⋅ cP
=
cE 0 Nenner
 Gl. 1.125
Der Nenner entspricht der Summe aller Zählerterme:
Nenner = cE 0 = (k−2 ⋅ k−1 + k−1 ⋅ k3 + k2 ⋅ k3 )
+(k−2 + k2 + k3 )⋅ k1 ⋅ cA
+(k−1 + k−2 + k2 )⋅ k−3 ⋅ cP
 Gl. 1.126
4. Schritt: Aufstellung der
Geschwindigkeitsgleichung und
Transformation in die Koeffizienten-Form
Da nun alle mathematischen Ausdrücke für die ein-
zelnen Enzymformen vorliegen, kann die Geschwin-
digkeitsgleichung aufgestellt werden:
v= k2 ⋅ cEA − k−2 ⋅ cEP  Gl. 1.127
Nach Einsetzen der Gleichungen für die Enzymfor-
men und Zusammenfassen ergibt sich:
v k ⋅ k ⋅ k ⋅ c − k−1 ⋅ k−2 ⋅ k−3 ⋅ cP
= 1 2 3 A
cE 0 (k−2 ⋅ k−1 + k−1 ⋅ k3 + k2 ⋅ k3 )
+(k−2 + k2 + k3 ) ⋅ k1 ⋅ cA
+(k−1 + k−2 + k2 ) ⋅ k−3 ⋅ cP
 Gl. 1.128
Gl. 1.128 ist eine vollständige Geschwindigkeitsglei-
chung für den steady state ordered Uni-Uni-Me-
chanismus. Die Mikrokonstanten kn und k–n sind
jedoch experimentell nur schwer zugänglich. Um
Gl. 1.128 in eine leichter zu handhabende Form zu
überführen, werden die Mikrokonstanten zunächst
 42 K. Castiglione

zu Koeffizienten zusammengefasst. Die Koeffizien- Konstante

1 ten umfassen dabei immer die Mikrokonstanten,
K mA =
Koeffizient A
die dem jeweiligen Konzentrationsterm im Zähler Konstante
beziehungsweise im Nenner zugeordnet sind. Bei- K mP =
Koeffizient P
spielsweise gilt:
ZahlerA
K eq =
(k−2 + k2 + k3 )⋅ k1 ⋅ cA = Koeffizient A ⋅ cA  P
Zahler
 Gl. 1.132
 Gl. 1.129
Durch Erweiterung von Gl. 1.131 mit ZählerP/(Koeffi-
Die Koeffizienten im Zähler umfassen zusätzlich zientA · KoeffizientP) und zusätzlicher Multiplikation
noch die Enzymkonzentration: aller Terme, die cP umfassen, mit ZählerA/ZählerA
erhält man Gl. 1.133 (siehe unten).
k1 ⋅ k2 ⋅ k3 ⋅ cE 0 ⋅ cA = ZählerA ⋅ cA  Gl. 1.130 Durch Einsetzen der kinetischen Konstanten und
Umformen erhält man die Gleichung für den steady
Die Mikrokonstanten im Nenner, die keinem Kon- state Uni-Uni-Mechanismus in ihrer üblichen Form:
zentrationsterm zugeordnet sind, werden zu einer
Konstante vereinigt. Auf diese Weise wird Gl. 1.128 in  c 

die sogenannte Koeffizienten-Form überführt: vmax,f ⋅vmax,r ⋅ cA − P 
 K eq 
v=  Gl. 1.134
v ⋅c
ZählerA ⋅ cA − ZählerP ⋅ cP K mA ⋅vmax,r +vmax,r ⋅ cA + max,f P
v= K eq
Konstante+Koeffizient A ⋅ cA
 Gl. 1.131
+Koeffizient P ⋅cP
Gl. 1.134 ist nur eine andere Darstellung von Gl. 1.48,
da der betrachtete Uni-Uni-Mechanismus der
5. Schritt: Transformation der reversiblen Ein-Substrat-Ein-Produktreaktion ent-
Geschwindigkeitsgleichung in die Form der spricht. Für diesen Mechanismus ist die Herleitung
kinetischen Konstanten nach dem King-Altman-Verfahren im Vergleich zur
Im letzten Schritt werden die Koeffizienten aus in 7 Abschn. 1.4.3 dargestellten Herleitung aufwen-
Gl. 1.131 durch experimentell zugängliche kinetische dig. Dieses Verhältnis verschiebt sich jedoch bei der
Konstanten ersetzt. Dies geschieht nach den Defini- Betrachtung komplexer Reaktionsmechanismen
tionen von Cleland [6]: deutlich zu Gunsten des King-Altman-Verfahrens.
Ein Blick auf die Geschwindigkeitsgleichung für den
 A
Zahler steady state ordered Bi-Bi-Mechanismus veranschau-
vmax,f = kcat,f ⋅ cE0 =
Koeffizient A licht, wie komplex die resultierenden Gleichungen
Zahler
 P werden, obwohl „nur“ ein zweites Substrat bezie-
vmax, r = kcat, r ⋅ cE0 = hungsweise Produkt hinzukommt:
Koeffizient P

 A ⋅ Zahler
Zahler  P ⋅ cA  A ⋅ Zahler
Zahler  P ⋅ Zahler
 P ⋅ cP
−
 rA
Koeffizient A ⋅ Koeffizient P Koeffizient A ⋅ Koeffizient P ⋅ Zahle
v=
 P
Konstante ⋅ Zahler  P ⋅ Koeffizient A ⋅ cA
Zahler  A ⋅ Zahl
Zahler  erP ⋅ Koeffizient P ⋅ cP
+ +
 A
Koeffizient A ⋅ Koeffizient P Koeffizient A ⋅ Koeffizient P Koeffizient A ⋅ Koeffizient P ⋅ Zahler

 Gl. 1.133
Kapitel 1 · Enzymkinetik
vmax,f .vmax,r ⋅ (cA ⋅ cB −
v=
KiA ⋅ K mB ⋅vmax,r +K mB ⋅ vmax,r ⋅ cA +K mA ⋅vmax,r ⋅ cB +
vmax,f .vmax,r ⋅ (cA ⋅ cB −
)
K eq
K ⋅v ⋅c ⋅ c K ⋅v ⋅c ⋅c v ⋅c ⋅c v ⋅c ⋅c ⋅c v ⋅ c ⋅c ⋅ c
+ mQ max,f A P + mA max,r B Q + max,f P Q + max,r A B P + max,f B P Q
KiA K eq KiQ K eq KiP
 Gl. 1.135
Aus Gl.1.135 wird ersichtlich, dass neben den
Michaeliskonstanten (KmA, KmB, …) auch Inhibi-
tionskonstanten (KiA, KiB, …) in den Geschwindig-
keitsgleichungen von steady state-Mechanismen
auftreten. Die Schätzung der kinetischen Parameter
für solch komplexe Gleichungen kann zum einen
über Verlaufskurvenanalyse geschehen (7 Abschn.
1.5.2). Zum anderen können jeweils Teile der kineti-
schen Parameter durch die Messung von verschiede-
nen Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten bestimmt
werden (7 Abschn. 1.5.1). Da hierbei die Produktkon-
zentrationen vernachlässigt werden können, verein-
facht sich Gl.1.135 zu:
vmax ,f . cA . cB
v=
KiA . K mB + K mB . c A + K mA . c B + c A . c B
 Gl. 1.136
Eine analoge Vereinfachung kann für die Rückreak-
tion getroffen werden. Wird zusätzlich ein Substrat
im sättigenden Überschuss gehalten und das andere
variiert, kann die Enzymgeschwindigkeit in Abhän-
gigkeit des variablen Substrats mit der klassischen
Michaelis-Menten-Kinetik nach Gl. 1.28 beschrieben
werden. Auf diese Weise kann die zugehörige maxi-
male Reaktionsgeschwindigkeit vmax,f beziehungs-
weise v max,r sowie die Michaeliskonstante für das
variable Substrat bestimmt werden.
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cP ⋅ cQ
)
K eq
K mQ ⋅vmax,f ⋅ cP K mP ⋅vmax,f ⋅ cQ
+ +vmax,r ⋅ cA ⋅ cB
K eq K eq
cP ⋅ cQ
KiB ⋅ K eq
 
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 45 2

Wachstumskinetik
Dirk Weuster-Botz und Ralf Takors

2.1 Wachstumsmodelle – 46

2.2 Wachstumskurve – 47

2.3 Nicht-strukturierte Wachstumsmodelle – 49

2.3.1 Sättigungskinetik (Monod) – 50
2.3.2 Substratüberschussinhibierung – 50
2.3.3 Produktinhibierung – 52
2.3.4 Erhaltungsstoffwechsel – 53
2.3.5 Mehrere limitierende Substrate – 54
2.3.6 Produktbildung – 56
2.3.7 Reaktionsvektor – 57

2.4 Wachstumskinetik von Mycelbildnern – 58

2.5 Weitere Einflussgrößen – 60

2.5.1 Temperatur – 61
2.5.2 Wasserstoffionenaktivität (pH) – 62
2.5.3 Andere Medienbestandteile – 63
2.5.4 Methoden der Medienentwicklung – 66

Literatur – 69

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2018

H. Chmiel, R. Takors, D. Weuster-Botz (Hrsg.), Bioprozesstechnik,
https://doi.org/10.1007/978-3-662-54042-8_2
 46 D. Weuster-Botz und R. Takors
Mikroorganismen (Bakterien, Hefen, Pilze, Mikro-
algen) und Gewebezellen (tierische Zellen, pflanz-
liche Zellen) werden neben isolierten Enzymen als
2 Biokatalysatoren in vielfältiger Weise in der indus-
triellen Produktion eingesetzt. Im Vergleich zu
Katalysatoren, wie sie in der chemischen Produk-
tion zum Einsatz kommen, aber auch im Vergleich
zu Enzymen, zeichnen sich Mikroorganismen oder
Gewebezellen dadurch aus, dass sie sich im Bioreak-
tor selbst vermehren oder regenerieren können. Das
bedeutet, der Katalysator muss in der Regel nicht zu
Beginn der Reaktion vollständig vorgelegt werden,
sondern der Einsatz geringer Mengen an Mikro-
organismen oder Zellen ist ausreichend, und der
Biokatalysator bildet sich autokatalytisch im Laufe
des Produktionsprozesses. Oftmals korreliert dabei
die Zunahme der Zellzahl (Vermehrung) linear mit
der Zunahme der Zellmasse (Wachstum). Dies ist
beispielsweise der Fall, wenn Zellen sich stochas-
tisch – also nicht synchronisiert – teilen und damit
aus einer Zelle durch Teilung immer zwei identische
neue Zellen entstehen, wie es beispielsweise beim
nichtsynchronisierten Wachstum von Bakterien oder
Hefen der Fall ist (siehe . Abb. 2.1).
Im Zellzyklus einer mikrobiellen Zelle erfolgt
zunächst die Zunahme an Biomasse in der B-Phase,
bis eine kritische Masse erreicht ist. In der sich
anschließenden C-Phase wird das Bakterienchro-
mosom repliziert. Die beiden chromosomalen DNA-
Moleküle werden anschließend zu den entgegen-
gesetzten Zellpolen auseinandergezogen, und die
Zelle beginnt sich in der Mitte zu teilen (D-Phase).
Am Ende der Zellteilung (binary fission) liegen zwei
genetisch identische Zellen vor, und der Zyklus kann
erneut mit der B-Phase beginnen [1]. Hefen vermeh-
ren sich dagegen durch Zellsprossung. Das bedeutet,
eine Mutterzelle generiert nach Durchlaufen eines
Zellzyklus eine einzelne Tochterzelle, die sich von der
Mutterzelle ablöst. Die Tochterzelle nimmt danach
in der Masse zu, bevor diese selbst nach Durchlaufen
eines Zellzyklus eine eigene Tochterzelle abschnüren
kann. Jede Mutterzelle kann dabei nur eine begrenzte
Anzahl an einzelnen Tochterzellen bilden. Wachs-
tum und Vermehrung korrelieren hier ebenfalls nur
linear bei nicht synchronisierter Vermehrung von
Zellpopulationen. Das Wachstum von Pilzen durch
Hyphenbildung stellt ein Beispiel dar, bei dem Ver-
mehrung (Zunahme der Zellzahl) und Wachstum
(Zunahme der Zellmasse) häufig nicht linear kor-
reliert erfolgen. Die intrazelluläre Bildung von Koh-
lenstoffspeichern, wie beispielsweise bei der Lipid-
akkumulation in Mikroalgen, führt zu vollständiger
Entkopplung von Wachstum und Vermehrung in der
Lipidakkumulationsphase, da hier eine Massenzu-
nahme ohne Zunahme der Zellzahl erfolgt.
Damit überhaupt Wachstum erfolgen kann,
müssen im wässrigen Reaktionsmedium alle Subs-
trate verfügbar sein, die eine Zelle zum Wachstum
benötigt. Neben geeigneten Energie-, Kohlenstoff-
und Stickstoffquellen müssen alle Hauptelemente wie
Phosphor, Schwefel, Magnesium, Kalium, Calcium,
Natrium, Eisen und Spurenelemente wie Kupfer,
Mangan, Kobalt, Zink und andere in ausreichen-
der Menge vorhanden sein. Häufig müssen zusätz-
lich spezifische Aminosäuren und Vitamine oder
deren Vorläufermetabolite vorgelegt werden, wenn
die verwendeten Zellen diese nicht selbst syntheti-
sieren können. Individuelle Druck-, Temperatur-,
Ionenstärke- und pH-Bereiche müssen eingehalten
werden, um Wachstum zu ermöglichen. Es ist damit
eine große Anzahl an Einsatzstoffen (Substraten) und
Reaktionsbedingungen vorhanden, die Wachstums-
geschwindigkeiten und damit Substratverbrauchs-
und Produktbildungsraten von Mikroorganismen
oder Zellen beeinflussen können.
Die quantitative Kenntnis der Reaktionsge-
schwindigkeiten (Substratverbrauch, Wachstum
und Produktbildung) in Abhängigkeit der Reak-
tionsbedingungen ist jedoch von zentraler Bedeu-
tung für Auslegung und Betrieb von Bioreaktoren.
Die grundlegenden Konzepte zur Wachstumsmodel-
lierung von Mikroorganismen und Zellen werden in
diesem Kapitel beschrieben.
2.1 Wachstumsmodelle
In der Regel sind heute die Genome der in der indus-
triellen Produktion eingesetzten (genetisch opti-
mierten) Mikroorganismen oder Zellen sequen-
ziert, sodass stöchiometrische Netzwerkmodelle mit
mehreren hundert und teilweise bis über tausend int-
razellulären Stoffwechselreaktionen verfügbar sind.
Diese strukturierten stöchiometrischen Modelle ein-
zelner Zellen erlauben die Abschätzung von maxima-
len theoretischen Biomasse/Substrat- oder Produkt/
Kapitel 2 · Wachstumskinetik
47 2

=HOOWHLOXQJ Noch komplexer wird die kinetische Beschrei-

bung des Wachstums von Mikroorganismen und
Zellen, wenn nicht nur Einzelzellen, sondern Zell-
populationen betrachtet werden (segregierte
Modelle). Unterschiedliche Zellpopulationen können
prinzipiell immer in Bioreaktoren auftreten. Zelltei-
lungen sind nicht immer exakt symmetrisch, sodass
beispielsweise Plasmide ungleich verteilt werden.
%3KDVH&3KDVH'3KDVH Eukaryotische Zellen können sich in unterschiedli-
=HOOVSURVVXQJ gregaten (beispielsweise Pilzpellets) oder Inhomo-
+\SKHQELOGXQJ idealisierten Modellansätzen zur Beschreibung der
6SRUHQ+\SKHQ 
. Abb. 2.1  Vermehrung durch Zellteilung,
Sprossenbildung oder Hyphenbildung
Substratausbeuten oder die Abschätzung intrazel-
lulärer Stoffflussverteilungen, wenn übergeord-
nete Regulationsmechanismen auf zellulärer Ebene
bekannt sind (transkriptionale oder post-transkrip-
tionale Regulationen). Die kinetische Modellierung
dieser stöchiometrischen Stoffwechselnetzwerke
ermöglicht prinzipiell die Abschätzung von Subs­
trataufnahme-, Wachstums- und Produktbildungski-
netiken einzelner Zellen bei Kenntnis der übergeord-
neten Regulationsmechanismen. Allerdings stellt die
Identifikation der vielen tausend kinetischen Modell-
parameter im Gegensatz zur bekannten Stöchiome-
trie intrazellulärer Reaktionen eine große Heraus-
forderung dar.
chen Phasen des Zellzyklus befinden oder es ist keine
Knospung bei Hefen mehr möglich (altern). Auch
unterschiedliche Substratverfügbarkeiten in Zellag-
genitäten in Bioreaktoren können zur Ausbildung
unterschiedlicher Zellpopulationen führen.
Eine Möglichkeit zur Reduktion der Komplexi-
tät solcher segregierter (Populations-) und struk-
turierter (Stoffwechsel-)Modelle ist die Betrach-
tung der Einzelzellen als unstrukturierte black box
oder der Verzicht auf die Betrachtung verschiede-
ner Zellpopulationen (siehe . Abb. 2.2). Beide Vor-
gehensweisen führen zu stark vereinfachten und
Wachstumskinetik. Die unstrukturierte Beschrei-
bung einer Zelle mit mehreren hundert gleichzeitig
ablaufenden Stoffwechselreaktionen ist damit nur
noch rein empirisch möglich („formalkinetisch“).
Der Verzicht auf ein segregiertes Wachstumsmodell
setzt voraus, dass eine dominante homogene Zell-
population im betrachteten Reaktionsvolumen vor-
liegt und die minoren Zellpopulationen als vernach-
lässigbar betrachtet werden können.
Bei der Kombination beider Modellvereinfachun-
gen zu einem nicht strukturierten und nicht segre-
gierten Wachstumsmodell wird der Biokatalysator
ausschließlich als eine Menge homogener Durch-
schnittszellen im Reaktionsvolumen betrachtet, die alle
dieselben Eigenschaften haben. Zur Charakterisierung
des Biokatalysators ist in diesem Fall einzig und allein
die Bestimmung der Biotrockenmasse ausreichend.
2.2 Wachstumskurve
Wird ein steriles, ideal homogenisiertes Reaktions-
medium, das alle Substrate zum Wachstum enthält,
mit Zellen oder Mikroorganismen bei geeigne-
ten Reaktionsbedingungen (Temperatur, pH, …)
 48 D. Weuster-Botz und R. Takors
angeimpft, wird im Satzverfahren eine Zunahme
der Zellmasse als Funktion der Prozesszeit beob-
achtet. Dabei werden verschiedene Wachstumspha-
2 sen durchlaufen (siehe . Abb. 2.3). In der ersten Ver-
zögerungsphase (engl. lag-phase) passen die Zellen
ihren Stoffwechsel an die Reaktionsbedingungen
an. Hier wird kein Wachstum beobachtet. Sobald
die Zellen in der Lage sind, Substrate aus dem Reak-
tionsmedium umzusetzen, beginnen die Zellen mit
zunehmender Geschwindigkeit zu wachsen (erste
Übergangsphase) bis eine exponentielle Massen-
zunahme beobachtet wird (exponentielle Phase). In
EODFNER[=HOOPRGHOO
IU'XUFKVFKQLWWV]HOOHQ
8QVHJUHJLHUW
EODFNER[=HOOPRGHOOH
IUKHWHURJHQH=HOOSRSXODWLRQHQ
6HJUHJLHUW
8QVWUXNWXULHUW
. Abb. 2.2  Einteilung von Wachstumsmodellen
der exponentiellen Phase können die Zellen unli-
mitiert wachsen. Irgendwann nimmt nachfolgend
die Geschwindigkeit der Massenzunahme wieder ab
(zweite Übergangsphase), bis keine Massenzunahme
mehr erfolgt (stationäre Phase). Die Abnahme der
Wachstumsgeschwindigkeit in der zweiten Über-
gangsphase kann unterschiedliche Ursachen haben,
wie beispielsweise die Anhäufung inhibierender
Stoffwechselprodukte, die Veränderung der Reak-
tionsbedingungen durch Stoffwechselvorgänge (pH-
Veränderung) oder der Verbrauch eines oder meh-
rerer der vorgelegten Substrate. Wird die Reaktion
VW|FKLRPHWULVFKHV1HW]ZHUNPRGHOO
IU'XUFKVFKQLWWV]HOOHQ
VW|FKLRPHWULVFKHV1HW]ZHUNPRGHOOH
IUKHWHURJHQH=HOOSRSXODWLRQHQ
6WUXNWXULHUW
Kapitel 2 · Wachstumskinetik
49 2
nach Erreichen der stationären Phase nicht abge- cX0 ist die Biotrockenmassekonzentration nach dem
brochen, so reduziert sich irgendwann die Biomas- Animpfen und cXmax die maximale Biotrockenmas-
sekonzentration. Die Zellen beginnen abzusterben sekonzentration in der stationären Phase. Die Zeit
und lysieren (Absterbephase). t1 stellt den Schnittpunkt der Asymptote im Wen-
Die zellspezifische Wachstumsrate µ wird defi- depunkt der sigmoiden Funktion mit der Zeitachse
niert als dar (siehe . Abb. 2.3). Die Steigung der Asymptote
entspricht dabei der maximalen Wachstumsrate
1 dcX µmax.
µ≡ ⋅
cX dt  Gl. 2.1

2.3 Nicht-strukturierte
mit cX als Biotrockenmassekonzentration. Nur in Wachstumsmodelle
der exponentiellen Phase wachsen die Zellen mit
der maximalen zellspezifischen Wachstumsrate Nicht-strukturierte und nicht-segregierte Wachs-
µ max. Die Verdopplungszeit td der Zellmasse ist tumsmodelle werden am häufigsten zur kinetischen
in dieser Phase bei konstanter maximaler Wachs- Beschreibung der zellspezifischen Substratver-
tumsrate durch Integration von Gleichung Gl. 2.1 brauchs-, Wachstums- und Produktbildungsraten
bestimmbar: verwendet. Mikroorganismen oder Zellen werden
hierbei als suspendierte Einheitszellen im Reak-
td 2cX0 tionsvolumen mit identischen Eigenschaften abstra-
1 ln2
µmax ⋅ ∫ dt = ∫ dc ; t = hiert. Diese starke Vereinfachung hat zur Folge, dass
cX X d µmax  Gl. 2.2
0 cX0 nur maximal zwei Prozessphasen der Wachstums-
kurve kinetisch beschrieben werden können (siehe
Zur Identifikation der maximalen Wachstumsrate . Abb. 2.3, grau hervorgehoben): die exponentielle
µ max aus experimentell ermittelten Wachstums- Wachstumsphase und die zweite Übergangsphase,
kurven bis einschließlich der stationären Phase falls diese durch das Versiegen eines limitierenden
können sigmoide Funktionen genutzt werden [2] Substrats hervorgerufen wird. In diesem Fall wird die
wie beispielsweise: zweite Übergangsphase auch Substratlimitierungs-
phase genannt. Das Konzept des limitierenden Subs-
trats hat zur Folge, dass
 

 µ
 max ⋅e ⋅(t −t )+1
 55 alle zellspezifischen Reaktionsgeschwindigkeiten
 cXmax 1 
cX c  ln  nur von der Konzentration einer geschwindig-
ln = ln Xmax ⋅ e−e
 cX0 
 Gl. 2.3
cX0 cX0 keitsbestimmenden Prozessvariablen, dem
limitierenden Substrat, abhängig sind und

. Abb. 2.3  Wachstumskurve bei einer

Biotrockenmassekonzentration von cX0 am
Prozessanfang mit Verzögerungsphase (1),
erster Übergangsphase (2), exponentieller
Phase (3), zweiter Übergangsphase
(4), stationärer Phase (5), Absterbephase (6)
 50 D. Weuster-Botz und R. Takors
55 alle anderen Prozessvariablen, wie Temperatur,
pH und andere Substrat- und Produktkonzent-
rationen, als konstant und ohne Einfluss auf die
2 zellspezifischen Reaktionsgeschwindigkeiten
betrachtet werden müssen.
Weiterhin wird häufig angenommen, dass Wachs-
tum und Vermehrung linear korreliert sind, die
Mikroorganismen oder Zellen sich somit nicht syn-
chronisiert teilen und dabei immer zwei identische
neue Zellen entstehen. In diesem Fall kann aus der
Anzahl n der Zellteilungen (Generationszahl) einfach
die resultierende Biomassekonzentration ermittelt
werden:
cX = cX0 ⋅ 2n  Gl. 2.4
Zur empirischen Beschreibung der Abhängig-
keit der zellspezifischen Wachstumsrate von einer
limitierenden Substratkonzentration sind ver-
schiedene Ansätze bekannt (siehe . Abb. 2.4). Alle
kinetischen Ansätze beschreiben eine Abnahme
der zellspezifischen Wachstumsrate mit Verringe-
rung der limitierenden Substratkonzentration cS,
wobei die Wachstumsrate µ Null wird, sobald kein
limitierendes Substrat mehr vorliegt (cS = 0), und
die Annäherung an eine maximale Wachstumsrate
bei hohen limitierenden Substratkonzentrationen.
Unterschiede gibt es lediglich in der funktionalen
Darstellung des Übergangs zwischen diesen beiden
Randbedingungen und der Anzahl der kinetischen
Parameter [3].
2.3.1 Sättigungskinetik (Monod)
Zur Beschreibung der Wachstumsrate als Funktion
einer limitierenden Substratkonzentration wird am
häufigsten die von Monod [4] eingeführte Sätti-
gungskinetik verwendet.
cS
µ = µmax ⋅
KS + cS 
Gl. 2.5
Der kinetische Parameter KS stellt hierbei die Sätti-
gungskonzentration dar, bei der die halbmaximale
Wachstumsrate erreicht wird (siehe . Abb. 2.5). Diese
einfache Sättigungskinetik lässt sich bei niedrigen
oder hohen limitierenden Substratkonzentrationen
als eine Reaktion 1. Ordnung oder 0. Ordnung
darstellen:
cS << KS : µ≅
µmax 1
⋅c
KS S  Gl. 2.6
cS << KS : µ ≅ µmax ⋅ cS0 = µmax  Gl. 2.7
Der Approximationsfehler bei Verwendung der
Reaktion 1. Ordnung (Gl. 2.6) liegt unter 1 % bei cS <
0,01 · KS. Die Annäherung von µ durch die maximale
Wachstumsrate µmax (Reaktion 0. Ordnung, Gl. 2.7)
ergibt einen Approximationsfehler von weniger als
1% bei cS > 100 · KS.
Die Annahme einer konstanten Sättigungskon-
zentration KS setzt voraus, dass die Mikroorganismen
oder Zellen für das limitierende Substrat nur ein Auf-
nahmesystem besitzen. Unterschiedliche Aufnahme-
systeme besitzen meist unterschiedliche Affinitäten
zum Substrat. In diesem Fall wäre die Sättigungskon-
zentration nicht mehr konstant, sondern müsste von
der limitierenden Substratkonzentration abhängen.
2.3.2 Substratüberschussinhibierung
Es gibt eine ganze Reihe von limitierenden Subs­
traten, die in hohen Konzentrationen inhibierend
auf die Wachstumsrate von Mikroorganismen oder
Zellen wirken können, beispielsweise organische
Säuren oder Alkohole. In diesem Fall lässt sich die
zellspezifische Wachstumsrate mit einer einfachen
Inhibierungskinetik empirisch beschreiben [5]:
cS
µ = µmax ⋅
cS2  Gl. 2.8
KS + cS +
KI
wobei die Inhibierungskonstante KI die Substratkon-
zentration darstellt, bei der erneut näherungsweise
die halbmaximale Wachstumsrate erreicht wird,
wenn KI ≫ KS (siehe . Abb. 2.6):
KI µ
µ = µmax ⋅ ≅ max  Gl. 2.9
KS + 2 ⋅ K I 2
Bei Vorliegen einer Substratüberschussinhibierung
durchläuft die Wachstumsrate ein Maximum, da
Kapitel 2 · Wachstumskinetik
51 2
. Abb. 2.4  Formalkinetische
Ansätze zur Beschreibung der
Wachstumsrate als Funktion der
limitierenden Substratkonzentration

höchste Wachstumsrate µopt erreicht wird, ist damit

lediglich eine Funktion der beiden kinetischen Para-
meter KS und KI und. Die höchste Wachstumsrate
µopt, die bei Substratüberschussinhibierung zu errei-
chen ist, ergibt sich damit zu:

KS ⋅ K I
µopt = µmax ⋅
KS + KS ⋅ K I + KS
KI
KS  Gl. 2.11
= µmax ⋅
KI
2+
KS

Grundsätzlich kann damit die maximale Wachstums-

. Abb. 2.5  Sättigungskinetik zur Beschreibung
der Wachstumsrate als Funktion der limitierenden
Substratkonzentration (µmax = 1 h–1)
mit zunehmender Konzentration des limitieren-
den Substrats zunächst die Wachstumsrate ansteigt,
dann aber mit weiter steigender limitierender Sub
stratkonzentration die Substratüberschussinhibie-
rung wirksam wird.
Die optimale Wachstumsrate µopt wird erreicht,
wenn die Steigung der Wachstumsrate als Funktion
der limitierenden Substratkonzentration Null wird:
dµ
= 0 : cS,opt = KS ⋅ K I 
dcS
Die optimale Substratkonzentration, bei der bei
Vorliegen einer Substratüberschussinhibierung die
rate µmax bei Vorliegen einer Substratüberschussinhi-
bierung nur bei einem hohen Verhältnis von KI zu KS,
also bei einer gering ausgeprägten Substratüberschuss-
inhibierung angenähert werden (siehe . Abb. 2.7). Bei
einem Verhältnis von KI zu KS von 10 können bei-
spielsweise nur etwas mehr als 60 % und bei einem
Verhältnis von 100 dagegen über 80 % der maximalen
Wachstumsrate im Optimum erreicht werden.
In manchen Fällen ist es notwendig, die Substrat-
überschussinhibierung in noch allgemeinerer Form
zu formulieren:
cS
µ = µmax ⋅  Gl. 2.12
cSn
Gl. 2.10 KS + cS +
KI
Der Exponent n kann hierbei auch Zahlenwerte n > 2
annehmen. In diesen Fällen wirken sich ansteigende
 52 D. Weuster-Botz und R. Takors

. Abb. 2.7  Erreichbare maximale Wachstumsrate µopt bei

. Abb. 2.6  Sättigungskinetik mit
Substratüberschussinhibierung als Funktion des Verhältnisses
Substratüberschussinhibierung zur Beschreibung
von Inhibierungskonstante KI zur Sättigungskonzentration KS
der Wachstumsrate als Funktion der limitierenden
bei Vorliegen einer Substratüberschussinhibierung
Substratkonzentration (µmax = 1 h–1)

Substratkonzentrationen stärker inhibierend als im die Erreichung möglichst hoher Produktkonzen-

Standardfall bei n = 2 aus (siehe . Abb. 2.6, graue trationen ist, soll im Folgenden nur das gebildete
Linie). Produkt als Inhibitor betrachtet werden. Eine Über-
tragung auf andere Inhibitoren ist ohne Einschrän-
kungen möglich.
2.3.3 Produktinhibierung Der allgemeingültigste Ansatz zur formalkineti-
schen Beschreibung der Reduktion des Wachstums
Neben hohen Konzentrationen am limitierenden von Mikroorganismen oder Zellen mit zunehmen-
Substrat selbst kann das Wachstum von Mikroorga- der Inhibitorkonzentration ist ein einfacher Expo-
nismen oder Zellen durch unterschiedliche Subs- nentialansatz [6]:
tanzen inhibiert werden. Dies können zum einen n
Produkte oder Nebenprodukte sein, die während cS  c 
µ = µmax ⋅ ⋅ 1 − P   Gl. 2.13
des Wachstums gebildet werden, wie beispielsweise KS + cS  cPmax 
organische Säuren oder Alkohole. Zum anderen
können aber auch inhibierende Stoffe mit der Subs- Hierbei stellt cPmax die maximale Produktkonzen­
tratlösung zugeführt werden, wie es bei der Ver- tration dar, bei der die Wachstumsrate gerade Null
wendung von kostengünstigen Abfallsubstraten wird und der Exponent n gibt an, ob die steigende
oder Biomassehydrolysaten häufig der Fall sein Produktkonzentration die Wachstumsrate schon bei
kann. Auch die Zugabe von Chemikalien als Precur- niedrigen Produktkonzentrationen stark reduziert (n
sor zur Herstellung der gewünschten Bioprodukte > 1) oder erst bei relativ hohen Produktkonzentratio-
oder als Induktor zur Expression von Enzymen kann nen (n < 1, siehe . Abb. 2.8).
zur Verringerung der Wachstumsraten von Mikro- Die meisten alternativen Ansätze zur Beschrei-
organismen oder Zellen führen. In allen Fällen muss bung einer Produktinhibierung wie beispielsweise [7]
der Einfluss der in der Regel veränderlichen Inhi-
−1
bitorkonzentrationen auf die Wachstumsrate kine- cS  c 
tisch beschrieben werden. Da ein wichtiges Ziel der µ = µmax ⋅ ⋅ 1 + P   Gl. 2.14
KS + cS  K P 
meisten biotechnologischen Produktionsprozesse
Kapitel 2 · Wachstumskinetik
53 2
oder [8]

cP
cS −
µ = µmax ⋅ ⋅ e KP  Gl. 2.15
KS + cS

kommen zwar mit nur einem kinetischen Parameter

(Inhibierungskonstante KP) aus, können jedoch nur
Inhibierungskinetiken analog zu n ≥ 1 beschreiben
(grau hinterlegte Fläche in . Abb. 2.8).

2.3.4 Erhaltungsstoffwechsel

Bevor Mikroorganismen oder Zellen wachsen

können, müssen das limitierende Substrat (und
selbstverständlich auch alle anderen für Stoffwechsel
und Wachstum erforderlichen Substrate) zunächst
. Abb. 2.8  Inhibition des Wachstums mit zunehmender
aufgenommen werden. Die zellspezifische Substrat- Produktkonzentration (nach Levenspiel [6]) bei unlimitiertem
aufnahmerate qS wird in Analogie zur Wachstums- Wachstum (cS ≫ KS)
rate definiert als

1 dcS  dcX  Gl. 2.19

qS ≡ ⋅ Gl. 2.16 YXS,µ =
cX dt dcS

mit cS als die limitierende Substratkonzentration.
Prinzipiell kann das limitierende Substrat von der
Zelle für das Wachstum (qS, µ), für den Erhaltungs-
stoffwechsel (qS,m) und zur Produktbildung (qS,P))
genutzt werden.
qS = qS,µ + qS, m + qS, P  Gl. 2.17
Die Substrataufnahmerate für das Wachstum der
Zellen wird als proportional zur Wachstumsrate
angenommen. Schnelleres Wachstum ist nur bei
einer erhöhten Substrataufnahmerate möglich:
1 sels vorliegt [9].
qS,µ = ⋅µ  Gl. 2.18
YXS,µ
Zur Verknüpfung von Wachstumsrate und Substrat-
aufnahmerate muss der Ertragskoeffizient YXS,µ als
weiterer formalkinetischer Parameter bekannt sein.
Der Ertragskoeffizient YXS,µ (Y für engl. yield) ent-
spricht der gebildeten Masse an Zellen pro umgesetz-
ter Masse an limitierendem Substrat, das ausschließ-
lich für Wachstum verbraucht wird.
Bei der Substrataufnahme für den Erhaltungsstoff-
wechsel qS,m (m für engl. maintenance) erfolgt kein
Wachstum der Zellen. Das limitierende Substrat
wird lediglich zur Aufrechterhaltung essenzieller
Stoffwechselfunktionen verbraucht. Dazu zählen
beispielsweise der Aufbau von Ionengradienten
zwischen dem Zellinnern und der Umgebung, die
Reparatur von DNA, die Neusynthese von degra-
dierter mRNA sowie von degradierten Proteinen und
vieles mehr. Häufig wird in erster Näherung davon
ausgegangen, dass eine konstante zellspezifische Auf-
nahmegeschwindigkeit mS des limitierenden Subst-
rats zur Aufrechterhaltung des Erhaltungsstoffwech-
qS, m = mS  Gl. 2.20
Damit stellt mS einen weiteren formalkinetischen
Parameter dar. Die Annahme einer konstanten zell-
spezifischen Substrataufnahmegeschwindigkeit für
den Erhaltungsstoffwechsel mS ist insbesondere vor
dem Hintergrund der Annahme eines limitierenden
Substrats gerechtfertigt (7 Abschn. 2.3).
 54 D. Weuster-Botz und R. Takors

Für den Fall, dass das limitierende Substrat nicht

auch noch zur Produktbildung verbraucht wird, lässt
sich die Substrataufnahmerate von Mikroorganis-
2 men oder Zellen damit wie folgt darstellen:

1
qS = ⋅ µ + mS  Gl. 2.21
YXS,µ

Für den Fall der einfachen Sättigungskinetik für das

Wachstum würde sich damit formal für die zellspezi-
fische Substrataufnahmerate folgender Zusammen-
hang ergeben:

1 cS
qS = ⋅ µmax ⋅ + mS  Gl. 2.22
YXS,µ KS + cS

Für den Grenzfall cS → 0 würde sich ergeben:
qS = mS  Gl. 2.23
Dies kann jedoch nicht sein. Wenn kein limitierendes
Substrat mehr vorhanden ist, kann auch keine Subs­
trataufnahme mehr erfolgen, qS müsste Null werden.
Daher muss bei Berücksichtigung eines konstan-
ten Verbrauchs an limitierendem Substrat für den
Erhaltungsstoffwechsel mS neben dem Substratver-
brauch für das Zellwachstum der formalkinetische
Ansatz zur Beschreibung der zellspezifischen Wachs-
tumsrate µ erweitert werden:
cS
µ = µmax ⋅ − mS ⋅ YXS,µ  Gl. 2.24
KS + cS
Damit geht die zellspezifische Substrataufnahmerate
bei cS → 0 ebenfalls gegen Null.
Die zellspezifische Wachstumsrate dagegen wird
jetzt bei sehr niedrigen Substratkonzentrationen
negativ (siehe . Abb. 2.9), es tritt also ein Abster-
ben der Zellen auf. Die Grenzsubstratkonzentra-
tion cS,lim, bei der die Zellen gerade eben aufhören
zu wachsen und das limitierende Substrat alleine
zur Aufrechterhaltung des Erhaltungsstoffwechsels
benötigt wird, ist geringer als die Sättigungskonzen-
tration KS, da in der Regel gilt: µmax ≫ mS · YXS,µ.
KS
cS,lim =  cSi
µmax Gl. 2.25
−1
mS ⋅ YXS,µ
. Abb. 2.9  Sättigungskinetik zur Beschreibung
der Wachstumsrate als Funktion der limitierenden
Substratkonzentration bei konstanter Substrataufnahmerate
für den Erhaltungsstoffwechsel (rot) im Vergleich zur
Sättigungskinetik ohne Erhaltungsstoffwechsel (µmax = 1 h–1)
2.3.5 Mehrere limitierende Substrate
In vielen Fällen ist die Berücksichtigung von nur
einem limitierenden Substrat zur unstrukturierten
Beschreibung der Wachstumskinetik von Mikroorga-
nismen oder Zellen nicht ausreichend. Beispiele sind
bei heterotrophen Wachstum von atmenden Mikro-
organismen die Berücksichtigung der Kohlenstoff-
quelle und des im Reaktionsmedium gelösten Sauer-
stoffs als zwei limitierende Substrate, ebenso wie die
Berücksichtigung von zwei limitierenden Kohlenstoff-
quellen (Glucose und Glutamin) und der Sauerstoff-
konzentration im Reaktionsmedium als drei limitie-
rende Substrate zur formalkinetischen Beschreibung
des Wachstums von tierischen Zellen. Ein anderes Bei-
spiel für die Berücksichtigung von drei limitierenden
Substraten ist die Konzentrationen einer Kohlenstoff-
quelle, sowie die Sauerstoff- und Nitratkonzentratio-
nen im Reaktionsmedium, wenn sowohl Sauerstoff-
atmung als auch Nitratatmung möglich sind.
Häufig werden die limitierenden Substrate dabei
als interaktiv komplementäre Substrate betrachtet
(vereinfacht nach [10]):
µ = µmax ⋅ Πi
 Gl. 2.26
KSi + cSi
Kapitel 2 · Wachstumskinetik
55 2
Dabei beeinflussen alle limitierende Substratkon-
zentrationen gleichzeitig „interaktiv komplemen-
tär“ die zellspezifische Wachstumsrate. Grundsätz-
lich können dabei auch spezifische Eigenschaften
einzelner limitierender Substrate wie Substratüber-
schussinhibierungen individuell berücksichtigt
werden. Dies ist beispielsweise möglich bei Metha-
nol als limitierender Kohlenstoffquelle, das gleich-
zeitig bei höheren Konzentrationen eine Substrat-
überschussinhibierung hervorruft, und Sauerstoff als
zweitem limitierenden Substrat:

cS cO  Gl. 2.27
µ = µmax ⋅ ⋅ 2
cS2 K O + cO
KS + cS + 2 2
KI
. Abb. 2.10  Wachstumsrate als Funktion zweier
Bei interaktiv komplementären Substraten wird die interaktiv komplementärer, limitierender Substrate.
Wachstumsrate immer Null, wenn eines der beiden Beispiel: Methanol als limitierendes Substrat cS mit
limitierenden Substrate gegen Null geht (siehe Substratüberschussinhibierung und Sauerstoff cO
2
. Abb. 2.10). (µmax = 1 h–1)
In den Fällen, bei denen ein limitierendes Subs-
trat erst von den Zellen verwertet werden kann, mit dem anderen limitierenden Substrat (hier Nitrat)
wenn die Konzentration eines anderen limitieren- zusammensetzt.
den Substrats niedrig genug ist, kann häufig eine
Schaltfunktion verwendet werden, ohne einen wei- cS
teren formalkinetischen Parameter einführen zu µ = µNitrat + µO = µmax ⋅
2 KS + cS
müssen. Dies soll am Beispiel der Umschaltung
 cNitrat KO 
von Sauerstoff- auf Nitratatmung bei der heterotro-  ⋅ 2
⋅ η   Gl. 2.29
 K 
phen Kohlenstoffverwertung erläutert werden. Für  Nitrat + cNitrat K O2 + cO2 
die Beschreibung der Wachstumsrate bei Nitratat- ⋅ 
 cO 
mung µNitrat gilt dann: + 2 
 K + c 
 O2 O2 
cS cNitrat
µNitrat = µmax ⋅ ⋅
KS + cS K Nitrat + cNitrat  Da die maximale Wachstumsrate bei Nitratat-
 Gl. 2.28 mung geringer ist als bei Sauerstoffatmung, muss
KO
⋅ 2 in diesem Fall hier noch ein Wirkungsgrad η ein-
K O + cO gefügt werden (η < 1). Aufgrund der eingeführten
2 2
Schaltfunktion ist im Gegensatz zu rein interak-
Ist die Sauerstoff konzentration sehr hoch tiv komplementären Substraten (siehe . Abb. 2.10)
( cO2 >> K O2 ) wird die Wachstumsrate bei Nitratat- auch Wachstum möglich, wenn eines der beiden
mung µNitrat sehr gering. Im umgekehrten Fall hängt limitierenden Substrate erschöpft sein sollte.
die Wachstumsrate bei Nitratatmung nur von den Dabei erfolgt der Wechsel zwischen Sauerstoffat-
Konzentrationen der Kohlenstoffquelle cS und der mung und Nitratatmung ohne Unstetigkeit (siehe
Nitratkonzentration cNitrat im Reaktionsmedium ab. . Abb. 2.11).
Zu beachten ist, dass sich die Wachstumsrate bei Bestimmt dagegen entweder die Konzentration
Umschaltung zwischen zwei limitierenden Substra- des einen oder des anderen limitierenden Substrats
ten additiv aus einem Anteil mit dem einen limitie- die Wachstumsrate, handelt es sich um nicht inter-
renden Substrat (hier Sauerstoff) und einem Anteil aktiv komplementäre Substrate [11]:
 56 D. Weuster-Botz und R. Takors
2 Produktbildung unabhängig vom Wachstum zu
. Abb. 2.11  Wachstumsrate als Funktion zweier interaktiv
komplementärer, limitierender Substrate, wobei der
Verbrauch des einen limitierenden Substrats (hier Nitrat) erst
erfolgt, wenn die Konzentration des zweiten limitierenden
Substrats (hier Sauerstoff ) niedrig wird (unlimitierte
Konzentration der Kohlenstoffquelle, µmax = 1 h–1)
cSi  Gl. 2.30
µ = µmax ⋅ mini
KSi + cSi
Das bedeutet zum einen, dass jeweils ein limitieren-
des Substrat alleine die Wachstumsrate bestimmt und
zum anderen, dass die Wachstumsrate bei Wechsel
von einem limitierenden Substrat zum anderen nicht
mehr stetig ist.
2.3.6 Produktbildung
Die mikrobielle oder zelluläre Produktbildung kann
auf ganz unterschiedlichen Stoffwechselreaktionen
beruhen, die nicht immer mit dem Verbrauch eines
wachstumslimitierenden Substrats oder mit Zell-
wachstum in Zusammenhang stehen müssen. Die
Bildungsgeschwindigkeit von Endprodukten des
primären Energiestoffwechsels (organische Säuren,
Alkohole, Methan, …) ist in der Regel jedoch vom
limitierenden Substrat abhängig und zumindest
teilweise wachstumsassoziiert. In wie weit andere
mikrobielle oder zelluläre Produkte wachstumsasso-
ziiert gebildet werden (beispielsweise Aminosäuren,
Vitamine, Proteine, …) hängt vom jeweiligen meta-
bolic design des eingesetzten Produktionsorganis-
mus ab. Meist wird jedoch gezielt versucht, die
ermöglichen, um möglichst hohe Produktausbeu-
ten bezogen auf das eingesetzte Substrat erzielen
zu können. In diesen Fällen finden Wachstum und
Produktbildung in unterschiedlichen Prozesspha-
sen statt. Die Produktbildung wird in der Regel erst
in der stationären Wachstumsphase induziert (siehe
. Abb. 2.3). In manchen Fällen ist das wachstums-
limitierende Substrat auch das limitierende Subst-
rat für die Produktbildung. Auch bei der Herstel-
lung von Sekundärmetaboliten wie beispielsweise
Antibiotika erfolgt die Produktbildung in der Regel
wachstumsunabhängig.
Die zellspezifische Produktbildungsrate qP wird
in Analogie zur Wachstumsrate definiert als
1 dcP
qP ≡ ⋅
cX dt  Gl. 2.31
mit cP als die jeweilige Produktkonzentration. Für
den Fall, dass das wachstumslimitierende Substrat
auch zur Produktbildung benötigt wird, erfolgt die
Verknüpfung mit den anderen zellspezifischen Raten
über die Ausbeutekoeffizienten YPS und YXP,µ:
dcP 
YPS = Gl. 2.32
dcS
dcX  Gl. 2.33
YXP,µ =
dcP
Y PS ist die Produktselektivität (gebildete Menge
an Produkt pro umgesetzter Menge an limitieren-
dem Substrat), während Y XP,µ die Selektivität bei
der wachstumsgekoppelten Produktbildung dar-
stellt (gebildete Menge an Biomasse bezogen auf
die gebildete Menge an Produkt), wobei hier nur
die wachstumsassoziierte Produktbildung berück-
sichtigt wird.
Eine einfache Klassifizierung der verschiedenen
Produktbildungskinetiken kann nach folgendem
Schema erfolgen [12] (siehe . Abb. 2.12):
Streng wachstumsgekoppelte Produktbildungs-
kinetik (Typ I):
Kapitel 2 · Wachstumskinetik
57 2
µ  Gl. 2.34 Kinetikmodellierung schnell an ihre Grenzen stoßen
qP =
YXP,µ kann. Häufig müssen Produktbildungskinetiken
Teilweise wachstumsgekoppelte Produktbildungs- aufgrund der sehr unterschiedlichen genetischen
kinetik (Typ II): Konstrukte der Produktionsorganismen sehr indi-
viduell formuliert werden, sodass die oben genannte
µ Klassifizierung nur als ein erster Ausgangspunkt
qP = + kP  Gl. 2.35
YXP,µ zur Erarbeitung eines kinetischen Ansatzes zur
Beschreibung der zellspezifischen Produktbildungs-
Wachstumsunabhängige Produktbildungsgeschwin- geschwindigkeiten betrachtet werden kann.
digkeit (Typ III):

qP = kP  Gl. 2.36 2.3.7 Reaktionsvektor

Im einfachsten Fall wird die wachstumsunabhängige Sowohl zellspezifische Wachstumsrate, Substrat-

Produktbildungsrate kP als konstante zellspezifische
Produktbildungsgeschwindigkeit angenommen.
Für den Fall, dass es sich bei dem betrachte-
ten Produkt um ein Primärprodukt des Energie-
stoffwechsels handelt, wie beispielsweise bei der
mikrobiellen Ethanolherstellung, lässt sich die wachs-
tumsunabhängige Produktbildungsrate kP auch als
zellspezifische Produktbildungsrate aufgrund des
Erhaltungsstoffwechsels mP interpretieren, sodass
hierbei die teilweise wachstumsgekoppelte Produkt-
bildung wie folgt dargestellt werden kann:
µ Modell einer Durchschnittszelle allgemein als Reak-
qP = + mP  Gl. 2.37
YXP,µ
Zur Formulierung von Produktbildungskinetiken
ist in der Regel sehr viel spezifisches Prozesswissen
auf metabolischer Ebene erforderlich, sodass die
hier betrachtete unstrukturierte und unsegregierte
aufnahmeraten und oftmals Produktbildungsraten
werden bei nicht-strukturierten und nicht-segregier-
ten Wachstumsmodellen als Funktion der limitieren-
den Substrate und gegebenenfalls inhibierenden Pro-
dukte wiedergegeben. In der Regel müssen zunächst
die limitierenden Substrate durch Zellen oder Mikro-
organismen aufgenommen werden, bevor Wachstum
und häufig auch Produktbildung erfolgen können.
Die biomassespezifischen Raten sind also nicht
unabhängig voneinander, sondern müssen gleich-
zeitig betrachtet werden.
Es ist daher sinnvoll, das formalkinetische
tionsvektor f(x,θ) wiederzugeben, wobei x den Sys-
temzustandsvektor (Zustandsgrößen wie die limitie-
renden Substrat- oder die Produktkonzentrationen)
und θ den Parametervektor mit allen verwendeten
kinetischen Modellparametern (µmax, KSi, …) dar-
stellt [13]:

. Abb. 2.12  Klassifizierung von Produktbildungskinetiken: Typ I streng wachstumsgekoppelt, Typ II teilweise
wachstumsgekoppelt, Typ III wachstumsunabhängige Produktbildung (nach [12])
 58 D. Weuster-Botz und R. Takors

 µ ( x,θ ) Für den oben dargestellten Reaktionsvektor

 
f ( x,θ ) = −qSi ( x,θ )  enthält der Systemzustandsvektor x folglich drei
 Gl. 2.38
 Einträge:
 qPi ( x,θ )
2 T
x = (cX, cS, cP )  Gl. 2.40
Grundsätzlich werden im Reaktionsvektor bio-
massespezifische Substratverbrauchsgeschwindig- Der Parametervektor θ enthält alle kinetischen Para-
keiten mit negativem Vorzeichen eingetragen und meter, die im Reaktionsvektor auftreten. Für den
Bildungsgeschwindigkeiten (Wachstumsrate und oben dargestellten Reaktionsvektor sind dies:
Produktbildungsraten) mit positivem Vorzeichen.
Beispielsweise stellt sich der Reaktionsvek- T
θ = (µmax, KS, cP, max, n, mS,YXS,µ, mP,YXP,µ )
tor bei der mikrobiellen Vergärung von Glucose
zu Ethanol wie folgt dar, wenn eine einfache Sät-  Gl. 2.41
tigungskinetik mit Glucose als einzigem limitie-
renden Substrat, der Glucoseverbrauch für den Die in diesem Fall acht formalkinetischen Parame-
Erhaltungsstoffwechsel, die teilweise wachstums- ter müssen quantitativ bekannt sein, um sowohl bio-
gekoppelte Produktbildung mit Ethanol als ein- massespezifische Wachstums- und Glucoseaufnah-
zigem Zielprodukt und die Produktinhibierung meraten als auch die spezifische Ethanolbildungsrate
durch Ethanol berücksichtigt werden sollen (die als Funktion der Zustandsgrößen beschreiben zu
Kinetik der CO2 Bildung soll hier als Nebenpro- können.
dukt nicht mit aufgeführt werden): Die Identifikation des Parametervektors θ, also
die Ermittlung von Zahlenwerten für alle formalki-
 µ ( x, θ ) netischen Modellparameter, muss für jede Zelle und
 
f ( x, θ ) = −qSi ( x, θ ) jeden Mikroorganismus unter definierten Reaktions-
  bedingungen experimentell erfolgen und ist sehr
 qPi ( x, θ )
aufwendig. Daher muss bei der Formulierung des
  n 
 cS 1 cP   Reaktionsvektors versucht werden, die Anzahl der
µmax ⋅ ⋅ −  − mS ⋅ YXS,µ  Einträge im Parametervektor θ so gering wie möglich
 K + c S   cP, max  
  S
 zu halten. Wesentliche Kriterien zur Formulierung
 
   des Reaktionsvektors f(x,θ) sind damit:
=  −
 µ
+ mS  
 YXS,µ   55 biologische Signifikanz
 
 55 minimale Parameterzahl
 µ 
 + mP  55 Möglichkeit der Parameteridentifikation
 YXP,µ 
 
Der letzte Punkt soll verdeutlichen, dass es nicht
Gl. 2.39 sinnvoll ist, formalkinetische Ansätze in den Reak-
tionsvektor mit aufzunehmen, bei denen ein oder
Als Zustandsgrößen werden alle Prozessgrößen mehrere kinetische Parameter nicht identifizierbar,
bezeichnet, die variabel sind. Die Zustandsgrößen also nicht messbar sind.
sind bei diesem Reaktionsvektor also neben der Bio-
massekonzentration cX die Glucosekonzentration cS
als limitierendes Substrat und die Ethanolkonzen- 2.4 Wachstumskinetik von
tration cP als inhibierendes Produkt. Die Konzent- Mycelbildnern
ration des Nebenproduktes CO2 im Medium wird
dabei als konstant angenommen, da beim Konzept Bei filamentös wachsenden Mikroorganismen (Bak-
des limitierenden Substrats alle anderen Prozess- terien und Pilzen) lösen sich die Zellen nicht von-
variablen als konstant und ohne Einfluss auf Reak- einander, sondern bilden auch in Suspension ver-
tionsgeschwindigkeiten betrachtet werden müssen. netzte, dreidimensionale Strukturen (Hyphen) aus.
Kapitel 2 · Wachstumskinetik
Diese Strukturen können mehr oder weniger ver-
zweigt und dabei auch mehr oder weniger dicht
sein. Es wird zwischen fadenförmigen Wachstum
oder der Ausbildung dichter, meist kugelförmiger
Pellets unterschieden. Die Zellen in einer Hyphe
nehmen unterschiedliche Funktionen war. Wachs-
tum erfolgt nur an den freien Enden der Hyphen. Je
verzweigter eine Hyphe ist, desto schnelleres Wachs-
tum ist möglich. Die Anzahl der Enden in einem
Mycel stellt damit eine charakteristische morpho-
logische Größe dar.
Zur Massenzunahme des Mycels trägt aber nicht
nur eine Zelle an einem der freien Enden (Spitzen)
bei, sondern auch die dahinter angeordneten Zellen.
Diese Zellen sind nicht durch eine Zellmembran
voneinander getrennt, sondern teilen sich ihr Zyto-
plasma, in dem alle Zellkerne verteilt sind. Der Teil
zwischen dem wachsenden Ende (lat. apex) und
der ersten die Zellen abtrennenden Zellmembran
(Septum) wird als apikales Kompartiment bezeich-
net. Die direkt dem ersten Septum nachfolgenden
Zellen stellen das subapikale Kompartiment dar.
Auch diese Zellen können noch zum Wachstum am
freien Ende beitragen, da die trennenden Zellmem-
branen oftmals mit großen Poren ausgestattet sind.
Noch weiter von der wachsenden Mycelspitze ent-
fernt befinden sich Zellen mit großen Vakuolen. Sie
tragen nicht mehr zum Wachstum bei. Dieser Bereich
wird Hyphenkompartiment genannt (siehe . Abb.
2.13).
Die Größe der apikalen Kompartimente ist
begrenzt. Daher erfolgt bei konstantem Wachstum
in regelmäßigen Abständen die Ausbildung eines
Septums, sodass ein Teil des Zytosols abgetrennt und
der abgetrennte Teil zum subapikalen Kompartiment
wird. Durch Verzweigungen können neue apikale
Kompartimente gebildet werden. Meist erfolgt die
Verzweigung ausgehend von den subapikalen Kom-
partimenten in der Nähe der Stellen, an denen sich
die Septen zwischen apikalen und subapikalen Kom-
partiment befinden.
Selbst ein einfaches Wachstumsmodell zur
Beschreibung des Wachstums von Mycelbildnern
muss daher strukturiert sein und die verschiedenen
morphologisch unterschiedlichen Kompartimente
berücksichtigen [14].
Da nur die apikalen und subapikalen Kompar-
timente Substrate aufnehmen und zum Wachstum
59 2
beitragen können, und beide Kompartimente unter-
schiedlich zum Biomassewachstum beitragen,
müssen zwei Wachstumsraten berücksichtigt werden.
Dies ist zum einen die biomassespezifische Wachs-
tumsrate der Zellen im apikalen Kompartiment
µA mit dem Massenanteil zA und zum anderen die
Wachstumsrate der Zellen im subapikalen Komparti-
ment µS mit dem Massenanteil zS. Im einfachsten Fall
wird für beide Wachstumsraten eine einfache Sätti-
gungskinetik in Bezug auf das limitierende Substrat
angenommen:
µ = µA ⋅ zA + µS ⋅ zS
cS 
= (µmax, A ⋅ zA + µmax,S ⋅ zS ) ⋅ Gl. 2.42
KS + cS
Prinzipiell können hier aber statt der einfachen Sät-
tigungskinetik zusätzlich auch der Erhaltungsstoff-
wechsel, Mehrsubstratkinetiken oder Inhibierungen
berücksichtigt werden.
Die gesamte Biomasse besteht aus dem apikalen,
subapikalen und Hyphenkompartimenten (Massen-
anteil zH), sodass die Summe dieser variablen Mas-
senanteile 1 ergeben muss:
zA + zS + zH = 1 Gl. 2.43
Um die Wachstumskinetik von Mycelbildnern
beschreiben zu können, müssen weitere Gleichungen
hinzukommen, die die Kinetik der Morphogenese
beschreiben, also wie sich die Massenanteile inner-
halb des Mycels verändern. In der Regel wird ange-
nommen, dass die Biomasseumwandlungsgeschwin-
digkeiten bei der Morphogenese als Reaktionen
erster Ordnung mit den Geschwindigkeitskonstan-
ten ki in Bezug auf den Biomasseanteil beschrieben
werden können, der dabei umgewandelt wird:

dz A
 = k1 ⋅ zS − k2 ⋅ zA +(µA − µ) ⋅ zA Gl. 2.44
dt
dzS
= −k1 ⋅ zS + k2 ⋅ zA − k3 ⋅ zS + (µS − µ) ⋅ zs
dt
 Gl. 2.45
dzH
= k3 ⋅ zS − µ ⋅ zH  Gl. 2.46
dt
 60 D. Weuster-Botz und R. Takors
. Abb. 2.13  Prinzipskizze
zu den Elementen einer Hyphe
bei Mycelbildnern (apikales
Kompartiment: rot-grau;
2 subapikales Kompartiment: grau;
Hyphenkompartiment: weiß)
Oftmals wird darüber hinaus angenommen, dass
die Bildung der nicht zum Wachstum beitragenden
Hyphenkompartimente bei hohen Konzentratio-
nen des limitierenden Substrats reduziert wird. In
diesem Fall können die letzten beiden Gleichungen
mit einem Substratverstärkungsfaktor F wie folgt for-
muliert werden:
dzS k ⋅z
= −k1 ⋅ zS + k2 ⋅ zA − 3 S
dt F ⋅ cS + 1
 Gl. 2.47
+(µS − µ) ⋅ zS
dzH k ⋅z
= 3 S − µ ⋅ zH  Gl. 2.48
dt F ⋅ cS + 1
Die Beschreibung der Wachstumskinetik von Mycel-
bildnern und damit auch der Substrataufnahme- und
Produktbildungskinetiken wird selbst bei stark ver-
einfachender Betrachtung schnell komplex. Bei-
spielsweise wurden bisher weder Sporenbildung
noch hydrodynamische Effekte auf die dreidimen-
sionale Struktur des Mycels oder Stofftransportlimi-
tierungen im Mycelpellet berücksichtigt. Häufig wird
im Inneren von Mycelpellets sehr schnell die Sauer-
stoffkonzentration so niedrig, dass diese ortsaufge-
löst als zweites limitierendes Substrat berücksichtigt
werden muss.
Da die Produktbildung häufig von der Mor-
phologie abhängt, also die Produktbildungskinetik
unterschiedlich ist, je nachdem ob fadenförmiges
Mycelwachstum vorliegt oder dichte, meist kugel-
förmige Pellets ausgebildet werden, wird die kineti-
sche Beschreibung noch aufwendiger.
2.5 Weitere Einflussgrößen
Das Konzept des limitierenden Substrats hat zur
Folge, dass neben dem limitierenden Substrat
oder auch mehreren limitierenden Substraten alle
anderen Prozessvariablen wie Temperatur, pH und
andere Substrat- und Produktkonzentrationen als
konstant und ohne Einfluss auf die zellspezifischen
Reaktionsgeschwindigkeiten betrachtet werden
müssen. In manchen Bioprozessen werden Tempe-
ratur und pH jedoch nicht geregelt und damit kon-
stant gehalten.
Beispielsweise erfolgt bei biologischen Verfahren
zur Abwasserreinigung oder in offenen Fotobioreak-
toren zur Produktherstellung mit Mikroalgen keine
Temperaturkontrolle, sodass die Reaktionstempera-
tur als Funktion der Tages- oder Jahreszeiten großen
Änderungen unterworfen ist.
Auch bei vielen biotechnologischen Produk-
tionsverfahren wird der pH nicht geregelt. Dies ist
oft der Fall, wenn bei heterotrophen Bioprozes-
sen auch komplexe Kohlenstoff- und Stickstoff-
quellen verwendet werden. Bei der mikrobiellen
Umsetzung der Kohlenstoffquellen kommt es dabei
häufig aufgrund von Säurebildung zur Absenkung
des pH, während die mikrobielle Umsetzung von
Aminosäuren und Peptiden zur Freisetzung von
Kapitel 2 · Wachstumskinetik
61 2
Ammoniak und damit zum pH-Anstieg führt. Die A und B sind die entsprechenden präexponentiel-
Geschwindigkeiten der Verwertung verschiedener len Faktoren und R ist die allgemeine Gaskonstante
Kohlenstoff- und Stickstoffquellen ist selten iden- (8,314 J mol–1 K–1).
tisch, sodass teilweise mehrfach dynamische Ver- Typischerweise steigt die Wachstumsrate über
änderungen des pH im Reaktor auftreten können. einen relativ breiten Temperaturbereich an, sinkt
Bei anderen Bioprozessen, beispielsweise beim dann aber sehr schnell ab, wenn die Maximaltem-
Einsatz von Clostridien zur Herstellung von Löse- peratur überschritten ist (siehe . Abb. 2.14). Zur
mitteln (Aceton, Butanol, Ethanol) aus heterotro- Identifikation der vier Parameter des gekoppelten
phen Kohlenstoffquellen, erfolgt in einer ersten Pro- Arrheniusansatzes ist die experimentelle Bestim-
zessphase eine pH-Absenkung durch die Bildung von mung von vier maximalen Wachstumsraten prin-
organischen Säuren. Diese pH-Absenkung ist not- zipiell ausreichend. Diese sollten jedoch weit
wendig, damit nachfolgend in einer zweiten Prozess- genug vom Temperaturoptimum entfernt sein, da
phase die Bildung der gewünschten Produkte über- sich im Optimum die beiden Effekte überlagern
haupt induziert werden kann. In der eigentlichen (in . Abb. 2.14 in schwarz beziehungsweise grau
Produktionsphase werden darüber hinaus die zuvor dargestellt).
produzierten organischen Säuren wieder aufgenom- Die Lage des Temperaturoptimums ermöglicht
men, sodass der pH im Reaktor in der Folge ansteigt. eine einfache Klassifizierung von Mikroorganis-
men nach dem Temperaturbereich in dem optima-
les Wachstum stattfindet:
2.5.1 Temperatur 55 psychrophil: <20 °C
55 mesophil: 20–45 °C
Die Abhängigkeit der zellspezifischen Wachs- 55 thermophil: 45–75 °C
tums-, Substratverbrauchs- und Produktbildungs- 55 hyperthermophil: >75 °C
raten von der Temperatur muss experimentell
ermittelt werden. In der Regel ist es ausreichend,
die maximale Wachstumsrate µmax und gegebe-
nenfalls die Substrataufnahmerate für den Erhal-
tungsstoffwechsel mS sowie unter Umständen noch
die wachstumsunabhängige Produktbildungsge-
schwindigkeit kP als Funktion der Reaktionstem-
peratur zu ermitteln. Alle anderen kinetischen
Parameter können häufig als unabhängig von der
Temperatur angenommen werden. In vielen Fällen
lässt sich die Temperaturabhängigkeit der zell-
spezifischen Wachstumsrate mit einem gekoppel-
ten Arrhenius-Ansatz beschreiben, der sowohl
die Zunahme der maximalen Wachstumsrate mit
zunehmender Temperatur, als auch die in der Regel
schnelle Verringerung der maximalen Wachstums-
rate bei Überschreiten des Temperaturoptimums
beschreibt (siehe beispielsweise [15]):

E 1 E 1
− A⋅ − B⋅
µmax (T ) = A ⋅ e R T −B⋅e R T  Gl. 2.49 . Abb. 2.14  Temperaturabhängigkeit der maximalen
Wachstumsrate (Beispiel: Escherichia coli). Schwarze Linie:
T steht dabei für die absolute Temperatur in Kelvin, Zunahme der Wachstumsrate mit zunehmender Temperatur;
graue Linie: Abnahme der Wachstumsrate mit zunehmender
EA und EB für die Aktivierungsenergien von Wachs-
Temperatur; rote Linie: Gekoppelter Arrhenius-Ansatz
tum beziehungsweise thermische Denaturierung,
 62 D. Weuster-Botz und R. Takors

2.5.2 Wasserstoffionenaktivität (pH)

Auch die Abhängigkeit der zellspezifischen Wachs-

2 tums-, Substratverbrauchs- und Produktbildungsra-
ten vom pH im Medium muss experimentell ermit-
telt werden. Mikroorganismen und Zellen verfügen
über vielfältige Mechanismen, um den zellinternen
pH zu regeln. Die Differenzen zwischen dem pH im
Inneren von Zellen und dem außerhalb der Zellen
können daher sehr groß werden. Beispielsweise ist
Escherichia coli in der Lage, den zellinternen pH
zwischen 7 und 8 zu halten, auch wenn der pH im
Medium zwischen 5,5 und 9,0 variiert wird (siehe
. Abb. 2.15).
Je größer die pH-Differenz zwischen innen und
außen wird, desto größer wird der Aufwand für
. Abb. 2.16  Maximale Wachstumsrate von E. coli als
Mikroorganismen, den zellinternen pH zu kontrol- Funktion des pH im Medium (Messdaten interpoliert mit
lieren, was sich unmittelbar in erhöhtem Aufwand einem Polynom 2. Ordnung)
für den Erhaltungsstoffwechsel und in verringerten
Wachstumsraten zeigt (. Abb. 2.16). Die pH-Abhän-
gigkeit der maximalen Wachstumsrate wird in der Funktion der transmembranen pH-Differenz (ΔpH)
Regel durch empirische Interpolationsfunktionen und der transmembranen Ladungsdifferenz (Δψ) ist,
wiedergegeben. wirkt die protonenmotorische Kraft der Zelle (PMF)
Die zellinterne pH-Kontrolle wird über vielfäl- entgegen:
tige protonenpumpende Proteine in der Zellmemb-
ran erreicht, die die Translokation von Wasserstoff-
R ⋅T
ionen oftmals gekoppelt an den Transport anderer ∆µH+ = 2, 3 ⋅ ⋅ ∆pH + ∆ψ = PMF
F 
Ionen bewirken. Dem elektrochemischen Protonen-
 Gl. 2.50
gradienten über die Zellmembran ( ∆µ H + ), der eine

mit R als allgemeine Gaskonstante (8,314 J mol–1

. Abb. 2.15  Zellinterner pH von E. coli bei verschiedenen
pH im Medium (Daten aus unterschiedlichen Quellen [16–17])
K–1), F als Faradaykonstante (96.480 J V–1 mol–1)
und T als absoluter Temperatur. Physiologische
Werte für die transmembrane Ladungsdifferenz Δψ
liegen bei 140–170 mV [18]. Diese chemiosmoti-
sche Hypothese ist von universeller Bedeutung für
biologische Energietransformationsprozesse, da die
protonenmotorische Kraft zum Antrieb von Phos-
phorylierungsreaktionen und Ionentransportpro-
zessen dient und die Bewegung von einzelligen
Lebewesen direkt energetisch antreibt [19]. Die
transmembrane Ladungsdifferenz Δψ wird direkt
von der Ionenzusammensetzung des Mediums
beeinflusst. Um eine bestimmte Ladungsdifferenz
Δψ aufrecht zu erhalten, werden bestimmte Ionen
wie beispielsweise Kalium-Ionen aktiv gegen einen
Konzentrationsgradienten über die Zellmembran
transportiert.
Kapitel 2 · Wachstumskinetik
2.5.3 Andere Medienbestandteile
Das Konzept des limitierenden Substrats setzt bei
bekanntem pH und Temperatur voraus, das bis auf
limitierende Substrate und gegebenenfalls inhibie-
rende Produkte alle anderen Substrat- und Produkt-
konzentrationen als konstant und ohne Einfluss auf
die zellspezifischen Reaktionsgeschwindigkeiten
betrachtet werden müssen. Hierzu ist es notwen-
dig, dass im Reaktionsmedium zumindest alle Ele-
mente in ausreichender Menge vorliegen, die von
Mikroorganismen oder Zellen zum Aufbau neuer
Biomasse (Wachstum) und für die Produktbildung
benötigt werden. Mit Hilfe einer Elementanalyse der
Zellen oder Mikroorganismen kann unter Berück-
sichtigung der Elementzusammensetzung der gebil-
deten Produkte für die Vorlage oder gegebenenfalls
Nachdosierung von den entsprechenden Substraten,
wie beispielsweise verschiedene Salze, in ausreichen-
der Menge gesorgt werden. Falls keine Messdaten zur
elementaren Zusammensetzung der jeweiligen Zellen
oder Mikroorganismen vorliegen, kann zunächst
auf Literaturdaten zurückgegriffen werden (siehe
. Abb. 2.17). Hierüber kann zumindest die Größen-
ordnung zum Bedarf einzelner Elemente abgeschätzt
werden. Kalium und Phosphor sind die mengenmäßig
bedeutendsten Elemente in Mikroorganismen nach
Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Wasserstoff.
Kalium
Die Konzentration von Kalium-Ionen im Zytoplasma
von vielen Mikroorganismen kann bis zu 1000 mM
betragen. Kalium-Ionen können aktiv gegen einen
Konzentrationsgradienten über die Zellmembran
transportiert werden. Escherichia coli ist beispielsweise
in der Lage, Kalium-Ionen um mehr als den Faktor 100
im Zellinneren aufzukonzentrieren. Die zytoplasmati-
sche Kalium-Ionenkonzentration hängt stark von der
Ionenstärke des Mediums ab, da der transmembrane
Kalium-Ionengradient zur Kontrolle von Protonen-
flüssen und anderer Ionenflüsse genutzt wird.
Phosphor
Phosphor spielt in Form von Zuckerphosphaten eine
zentrale Rolle bei der Speicherung und Übertragung
von Energie im Stoffwechsel und bei der Synthese
63 2
. Abb. 2.17  Durchschnittliche elementare
Zusammensetzung von Bakterien (weiß) und Hefen (grau)
bezogen auf das Trockengewicht
von DNA und RNA. Eine herausragende Stellung
bei der Energieübertragung nehmen Adenosinnu-
cleotide ein. Adenosin-5′-triphosphat (ATP) ist das
chemische Bindeglied zwischen Anabolismus und
Katabolismus. Seine exergonische Umwandlung in
Adenosin-5′-diphosphat (ADP) und Phosphat bzw.
Adenosin-5′-monophosphat (AMP) und Pyrophos-
phat ist an eine Vielzahl von endergonischen Reak-
tionen gekoppelt. Durch enzymkatalysierte Übertra-
gung von Phosphat oder Adenylat von ATP auf ein
Substrat- oder Enzymmolekül wird die Energie des
ATP-Abbaus endergonischen Reaktionen zur Verfü-
gung gestellt. Typische zytosolische Konzentrationen
sind beispielsweise in E. coli: ATP 8 mM, ADP 1 mM,
AMP 0.8 mM, Phosphat 8 mM [20].
Darüber hinaus ist Phosphor essentiell zur Bio-
synthese von Phospholipiden, die in Form der Phos-
pholipiddoppelschichten das Grundgerüst aller Zell-
membranen bilden.
Da Phosphor in Form von Phosphat von so
grundlegender Bedeutung für Mikroorganismen
ist, besitzen diese in der Regel hochaffine Phosphat-
aufnahmesysteme. Für E. coli wurden beispielsweise
extrem affine Aufnahmesysteme mit Sättigungs-
konzentrationen bei rund 0,02 mg L–1 identifiziert.
Doch wurde ebenfalls eine starke Verringerung des
Wachstums schon bei einer externen Phosphatkon-
zentration von 0,2 g L–1 beobachtet [21]. Aber auch
 64 D. Weuster-Botz und R. Takors
wenn kein messbares Phosphat mehr im Medium
für Mikroorganismen oder Zellen verfügbar ist,
führt dies nicht zum sofortigen Absterben. Bei
2 Phosphatlimitierung kommt es zur Expression einer
großen Anzahl von Proteinen, die den Phosphat-
stoffwechsel komplett verändern. Viele Mikroorga-
nismen setzen bei Phosphatlimitierung zellinterne
Phosphat- und Energiespeicher, wie beispielsweise
Polyphosphate um.
Schwefel
Nach Kalium und Phosphor sind Schwefel, Natrium,
Calcium, Magnesium und Eisen die mengenmä-
ßig bedeutendsten Elemente in Mikroorganismen.
Schwefel wird in Form von Sulfaten und Sulfiden
aufgenommen, kann aber auch als schwefelhaltige
Aminosäure (Cystein, Methionin) zur Verfügung
gestellt werden. Sulfat-Ionen und/oder Sulfide sind
für Mikroorganismen sowohl zur Synthese dieser
Aminosäuren als auch für die Bereitstellung einiger
Vitamine und Coenzyme wie beispielsweise Biotin,
Thiamin, Coenzym A oder Ferredoxin essentiell [20].
Zur intrazellulären Reduktion von Sulfat werden
allerdings 2–3 ATP benötigt.
Natrium
Der elektrochemische Natrium-Ionengradient über
die Zytoplasmamembran von Mikroorganismen
stellt die Triebkraft für den Cotransport von vielen
Substraten und Metaboliten dar. Damit steht den
Mikroorganismen eine Alternative zum durch Was-
serstoff-Ionengradienten getriebenen Cotransport
zur Verfügung. Da Mikroorganismen in der Regel
gleichzeitig einen Na +/H +-Antiporter besitzen,
können diese sehr einfach die Energie des elektro-
chemischen Protonengradienten nutzen, um einen
Natrium-Ionengradienten aufzubauen.
Magnesium
Magnesium-Ionen und zu einem gewissen Grad
auch Mangan-Ionen spielen eine zentrale Rolle in
fast allen mikrobiellen Ribozymen [22]. Der größte
Teil der zellinternen Magnesium-Ionen ist fest mit
Ribozymen assoziiert. Magnesium-Ionen sind not-
wendig, um die dreidimensionale Struktur und die
katalytische Aktivität von Ribozymen aufrecht zu
erhalten. Ein geringerer Teil der Magnesium-Ionen
ist mit der Zellwand verbunden. Weniger als 10% der
zellinternen Magnesium-Ionen sind frei verfügbar.
Magnesium-Ionen werden zellintern benötigt, um
durch Bildung von Mg2+-Komplexen einen Teil der
negativen Ladungen der Phosphatgruppen in Nuc-
leotiden wie beispielsweise ATP abzuschirmen. Bei
fast allen enzymatischen Reaktionen, an denen ATP
als Phosphatgruppendonor beteiligt ist, ist daher
MgATP2- das eigentliche Substrat [20]. Der Bedarf
an Magnesium-Ionen für die Zelle ist absolut: kein
anderes Ion kann Magnesium ersetzen. Mikroorga-
nismen besitzen daher spezifische energieabhängige
Aufnahmesysteme für Magnesium-Ionen.
Calcium
Calcium-Ionen sind bei lebenden Mikroorganismen
fast ausschließlich mit Zellmembranen assoziiert.
Ihre Funktion ist die Stabilisierung von Membran-
und Zellwandstrukturen. Obwohl Calcium und
Magnesium bei der Elementaranalyse von Mikro-
organismen in derselben Größenordnung gemes-
sen werden, wird ein Konzentrationsunterschied
zwischen diesen beiden zweiwertigen Kationen bis
zum Faktor 1000 im Zytosol beobachtet. Alle Mik-
roorganismen halten ihre zytosolische Calcium-Io-
nenkonzentration mit Hilfe eines aktiven Calcium-
Ionen-Exportcarriers auf niedrigem Niveau.
Eisen
Eisen-Ionen (Fe 2+, Fe 3+) stellen aufgrund ihres
weiten Oxidations- und Reduktionspotentials von
+300 mV bis –500 mV das katalytische Zentrum von
vielen Enzymen dar, bei denen Elektronen übertra-
gen werden. Eisen-Ionen sind daher essentiell für
den mikrobiellen Metabolismus. Eisen(II)-Ionen
werden in Gegenwart von Wasserstoff-Ionen und
gelöstem Sauerstoff im Medium zu Eisen(III)-Ionen
oxidiert. Da die Löslichkeit von Fe3+ in Wasser bei
pH 7 sehr gering ist (10–12 µM), sekretieren einige
Mikroorganismen Komplexbildner (Siderophore),
wie beispielsweise Enterochelin oder Aerobactin.
Die freien Fe3+-Konzentrationen werden mit Hilfe
dieser Komplexbildner um mehrere Zehnerpoten-
zen gesenkt. Siderophore werden mit komplexierten
Kapitel 2 · Wachstumskinetik
Eisen(III)-Ionen aktiv über die Zellmembran aufge-
nommen. Hierzu sind spezifische Rezeptorproteine
in der äußeren Membran notwendig, da der diffu-
sive Transport der beladenen Siderophore durch die
Poren der äußeren Membran nicht möglich ist (das
maximale Molekulargewicht zum diffusiven Trans-
port beträgt etwa 600 g mol–1). Während außer-
halb der Zelle Eisen als Eisen(III)-Ion komplexiert
wird, ist innerhalb der Zelle Eisen überwiegend als
Eisen(II)-Ion mit Metalloenzymen assoziiert.
Spurenelemente
Neben Eisenionen sind viele Metall-Ionen („Spu-
renelemente“) wie beispielsweise Zink-, Kupfer-,
Mangan-, Molybdän- und Nickel-Ionen mit
Enzymen assoziiert. Obwohl Limitierungen ein-
zelner Metall-Ionen die Stoffwechseleigenschaften
von Mikroorganismen drastisch verändern können
(Wachstumsrate, Sekundärmetabolitbildung, DNA-
und RNA-Gehalte, Proteinzusammensetzung), sind
die Auswirkungen der Limitierung eines einzelnen
Metall-Ions nicht unabhängig von der Verfügbarkeit
anderer Metall-Ionen. Ursache hierfür ist die teil-
weise Austauschbarkeit von Metall-Ionen in Metal-
loenzymen. Eine solche Substitution ist oftmals nicht
„neutral“, es werden in der Regel Enzymaktivitäten
und -spezifitäten verändert.
Viele Mikroorganismen verfügen über spezi-
fische Mechanismen, um toxische intrazelluläre
Metall-Ionenkonzentrationen zu vermeiden. Für
Mikroorganismen toxische Ionen können neben den
Ionen der Elemente Silber, Arsen, Cadmium, Chrom,
Quecksilber, Strontium, Tellur und Blei auch (essen-
tielle) Ionen der Elemente Kobalt, Kupfer, Nickel,
Zink, Bor und Selen sein. Mit Hilfe von induzier-
baren spezifischen „Effluxcarriern“ können Mikro-
organismen toxische intrazelluläre Konzentrationen
dieser zum Teil über unspezifische Kationen- oder
Anionen-Transportenzyme in die Zelle gelangten
Metall-Ionen absenken [23].
Oftmals werden Komplexbildner in Reaktions-
medien eingesetzt, um Ausfällungen von Nähr-
salzen insbesondere als schwerlösliche Phosphate,
Hydrogenphosphate oder Ammoniumphosphate
zu verhindern. Übliche Komplexbildner sind Ethy-
len-Diamin-Tetra-Essigsäure (EDTA), Nitril-Tri-
Essigsäure (NTA) oder Zitronensäure. EDTA liefert
65 2
besonders beständige Metall-Ionenkomplexe, da hier
sechs Donorgruppen vorhanden sind. Der Logarith-
mus der Stabilitätskonstanten KC (Gleichgewichts-
konstante der Komplexbildungsreaktion) liegt mit
Mg2+ bei 8.7, mit Ca2+ bei 10.6, mit Fe2+ bei 14.3, mit
Zn2+ bei 16.5, mit Cu2+ bei 18.8 und mit Fe3+ sogar
bei 25.1 [24]. Generell besteht damit bei zu hohen
Zugaben an EDTA die Gefahr von Spurenelement-
limitierungen der Mikroorganismen, da die Konzen-
trationen der freien Metall-Ionen im Medium weit
unterhalb der Sättigungskonzentration KS der spe-
zifischen mikrobiellen Aufnahmesysteme sinken
können (. Abb. 2.18). Diese liegen in der Größen-
ordnung von 0.3 µM (beispielsweise Mn2+ bei E. coli)
bis 30 µM (beispielsweise Mg2+ bei E. coli) [25–26].
Bei starken Komplexbildnern wie EDTA ist die Ein-
stellung einer geeigneten Konzentration sehr schwie-
rig, da aufgrund der hohen Stabilitätskonstanten bei
Vorlage einer stöchiometrischen Menge Komplex-
bildner nur sehr geringe Gleichgewichtskonzen-
trationen an freien Metall-Ionen einstellbar sind
(. Abb. 2.18).
Generell sind schwächere Komplexbildner wie
Zitronensäure mit Stabilitätskonstanten log KC zwi-
schen 3–6 zur Komplexierung zweiwertiger Metall-
Ionen bedeutend günstiger, da sich auch bei stö-
chiometrischer Zugabe die Konzentration der
freien Metall-Ionen um 1–3 Zehnerpotenzen ver-
ringern lassen, ohne unterhalb der Sättigungskon-
zentrationen für die Aufnahme der Metall-Ionen zu
fallen (. Abb. 2.18). Allerdings wird Zitronensäure
von Mikroorganismen meist auch relativ schnell als
zusätzliche Kohlenstoffquelle verwertet.
Vitamine
Vitamine erfüllen als Coenzyme oder Teil eines
Coenzyms wichtige katalytische Funktionen in der
Zelle. Die wichtigsten Vitamine sind Thiamin, Biotin,
Riboflavin, Pyridoxin, Niacin, Pantothensäure, Cya-
nocobalamin und Folsäure.
Thiamin ist Bestandteil des Coenzyms Thiamin-
pyrophosphat, das in der Zelle für Decarboxylierun-
gen und Transketolase-Reaktionen benötigt wird.
Biotin spielt bei vielen Carboxylierungsreaktio-
nen eine Schlüsselrolle, da es die Übertragung von
C1-Gruppen in ihrer höchsten Oxidationsstufe –
CO2 – ermöglicht. Damit ist Biotin ein Cofaktor, der
 66 D. Weuster-Botz und R. Takors
2 Cyanocobalamin ist die isolierte Form von Vitamin
. Abb. 2.18  Freie Metall-Ionenkonzentrationen als
Funktion des Logarithmus der Stabilitätskonstante KC
(Gleichgewichtskonstante der Komplexbildungsreaktion)
unter Standardbedingungen bei Vorlage von 1 mM
Metall-Ionen im Medium. Grau hinterlegter Bereich:
typische Sättigungskonzentrationen für die Aufnahme
von Metall-Ionen bei E. coli. Typische Wertebereiche der
Stabilitätskonstanten (log KC) von Zitronensäure und EDTA für
zweiwertige Metall-Ionen sind markiert
sowohl im Zentralstoffwechsel als auch in der Fett-
säuresynthese und in der Pyridin- bzw. Pyrmidin-
synthese wichtig ist.
Riboflavin ist die nicht aktivierte Form von Fla-
vinmononucleotid (FMN) oder Flavinadenindi-
nucleotid (FAD). FMN oder FAD dienen der Elek-
tronenübertragung. Sie sind die Cofaktoren der
Flavoproteine, die Redoxreaktionen katalysieren
[20].
Pyridoxin ist die nicht aktivierte Form des Cofak-
tors Pyridoxal-5-phosphat, der als prosthetische
Gruppe bei vielen Enzym-Coenzymsystemen eine
Rolle spielt. Insgesamt sind etwa 60 Enzyme bekannt,
die Pyridoxal-5-phosphat benötigen [27].
Niacin (Nicotinsäure oder Nicotinamid) ist Teil
der wichtigen Cofaktoren NAD und NADP. NAD+/
NADH dient vorzugsweise bei oxidativen Prozes-
sen des Katabolismus der Elektronenübertragung,
während NADP+/NADPH bei reduktiven Prozessen
des Anabolismus diese Funktion übernimmt.
Pantothensäure ist Bestandteil von Coenzym
A. Coenzym A nimmt eine zentrale Stellung im
Stoffwechsel ein. Es verbindet den Kohlenstoff-, Fett-
säure- und Aminosäurestoffwechsel und ist essentiell
für alle Acetylierungen.
B12, da es bei der Aufreinigung eine Cyanogruppe
bindet, die über eine Koordinierungsstelle mit dem
Zentralatom Kobalt (als Co3+) verknüpft ist. Vitamin
B12 ist Bestandteil des Coenzym B12. Bei Coenzym B12-
abhängigen Reaktionen wird eine Alkyl- oder substi-
tuierte Alkylgruppe mit einem Wasserstoffatom am
benachbarten Kohlenstoff vertauscht. Vitamin B12 wird
nur von Mikroorganismen synthetisiert – weder Pflan-
zen noch Tiere sind dazu in der Lage [20].
Mikroorganismen sind bezüglich ihrer Fähig-
keit, Vitamine zu synthetisieren, sehr unterschied-
lich. Aber auch bei Mikroorganismen, die prinzipiell
die Fähigkeit zur Vitaminsynthese haben, lassen sich
durch gezielte Vitaminsupplementierung metaboli-
sche Eigenschaften verändern [28].
2.5.4 Methoden der
Medienentwicklung
Die vielfältigen kombinatorischen Wechselwirkun-
gen der Reaktionsbedingungen (pH, Temperatur,
Medienzusammensetzung) mit dem Metabolis-
mus von Mikroorganismen sowie die hohe Anzahl
an Medienkomponenten, die in definierten Wachs-
tumsmedien teilweise über 50 einzelne Substanzen
enthalten können, machen den Einsatz von expe-
rimentellen Suchverfahren erforderlich, um geeig-
nete Medienzusammensetzungen identifizieren zu
können. Ziele sind die Maximierung oder Minimie-
rung wichtiger Prozessgrößen (Produktkonzentra-
tion, Ausbeute, Rohstoffkosten, …) unter standar-
disierten Bedingungen.
Aufgrund der großen Anzahl an Medienkom-
ponenten werden hierzu sinnvollerweise Methoden
der statistischen Versuchsplanung oder stochastische
Suchverfahren eingesetzt.
Statistische Versuchsplanung
Generell lässt sich die Vorgehensweise bei der sta-
tistischen Versuchsplanung zur Optimierung von
Fermentationsmedien in vier Schritte einteilen
[29]:
Kapitel 2 · Wachstumskinetik
1. Auswahl der wichtigsten Medienkomponenten
(screening)
2. Eingrenzung der Konzentrationsbereiche
ausgewählter Medienkomponenten
3. Identifikation des Optimums (optimum search)
4. Experimentelle Validierung des Optimums
Zur Auswahl der wichtigsten Medienkomponen-
ten wird angenommen, dass ein linearer Ansatz für
das Aussiebungsproblem ausreichend ist, also keine
Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen
Medienkomponenten auftreten:
k zu höheren Schätzwerten der Zielfunktion Yˆ ( x,ϑ )
Yˆ ( x,ϑ) = ϑ0 + ∑i=1 (ϑi ⋅ xi )  Gl. 2.51
mit Ŷ ( x,ϑ ) als Schätzwert der Zielgröße (Produkt-
konzentration, …), xi als Konzentration der Medien-
komponenten und ϑi als Modellparameter.
Die zur Identifikation der Modellparameter
ϑ i eingesetzten Versuchspläne müssen mindes-
tens genauso viel Versuchspunkte N enthalten, wie
Modellparameter ϑi im Ansatz vorkommen, also
N = k + 1. In der Regel erfolgt die Aussiebungsent-
scheidung auf der Grundlage von Restquadratsum-
men. Damit sind, gesättigte Versuchspläne mit nur
jeweils einer Beobachtung in jedem Punkt ungeeig-
net, die Restquadratsumme für den Gesamtansatz
wäre dann stets gleich Null. Es muss durch Wieder-
holungsexperimente eine Schätzung der Beobach-
tungsvarianz ermöglicht werden, sodass die Zahl der
Versuche etwas größer wird, beispielsweise N = k + 4.
Aufgrund des linearen Ansatzes sind zwei Konzen-
trationen je Medienkomponente ausreichend. Für
die über Regressionsanalyse ermittelten Modellpara-
meter ϑi (Steigungen) werden die Signifikanzniveaus
ermittelt und nicht signifikante Medienkomponen-
ten ausgesiebt. In der Regel wird in diesem ersten
Schritt versucht, die ursprünglich große Anzahl an
Medienkomponenten auf 2–4 signifikante einzu-
grenzen, um den experimentellen Aufwand für die
folgenden Schritte zu reduzieren. Die Konzentratio-
nen der anderen Medienkomponenten werden nach
dem Aussieben konstant gehalten.
Zur Eingrenzung der Konzentrationsbereiche
der im ersten Schritt ausgewählten Medienkompo-
nenten werden oftmals faktorielle Versuchspläne ein-
gesetzt. Grundlage ist die Annahme, dass sich die
67 2
Wechselbeziehungen zwischen Medienkomponen-
ten und der Zielgröße durch einen unvollständigen
Ansatz 1. Ordnung darstellen lassen, wobei meist nur
Wechselwirkungen zwischen zwei Medienkompo-
nenten xi und xj zugelassen werden:
k
Yˆ ( x, ϑ) = ϑ0 + ∑i=1(ϑi ⋅ xi)
k −1 k  Gl. 2.52
∑i=1 ∑ j=2 (ϑij ⋅ xi ⋅ x j ) (i < j )
Die über Regressionsanalyse ermittelten Modellpara-
meter ϑi und ϑij werden benutzt, um den Konzent-
rationsbereich der einzelnen Medienkomponenten
zu verschieben. Üblicherweise werden hierzu Gra-
dientenverfahren eingesetzt. Die minimale Anzahl
der Versuche für jeden hierzu eingesetzten faktoriel-
len Versuchsplan entspricht der Anzahl der Koeffi-
zienten ϑi und ϑij.
Zur Identifikation der optimalen Medienzusam-
mensetzung innerhalb der jetzt gefundenen sinnvol-
len Konzentrationsbereiche für die ausgewählten
Medienkomponenten wird angenommen, dass sich
der Schätzwert der Zielgröße Yˆ ( x,ϑ ) mit Hilfe eines
Polynoms 2. Ordnung beschreiben lässt (oftmals
auch als Response-Surface Methode bezeichnet):
k k −1 k
Yˆ ( x, ϑ) = ϑ0 + ∑i =1(ϑi ⋅ xi ) + ∑ ∑
i =1 j =2
k
(ϑij ⋅ xi ⋅ x j )+ ∑i=1 (ϑii ⋅ xi2) (i < j )
 Gl. 2.53
Damit eine unvermengte Schätzung der Modellpara-
meter ϑij möglich ist, muss jetzt jede Medienkom-
ponente auf mindestens drei Konzentrationsniveaus
untersucht werden. Um die Modellparameter des
Polynoms 2. Ordnung mit möglichst wenigen Ver-
suchsansätzen und hoher Genauigkeit zu bestim-
men, werden unterschiedliche optimale Versuchs-
pläne vorgeschlagen, die sich in der Anzahl der
mindestnotwendigen Versuche und im Anwen-
dungsbereich unterscheiden.
Mithilfe der über Regressionsanalyse identifi-
zierten Modellparameter ϑi, ϑij und ϑii kann danach
die optimale Medienzusammensetzung abgeschätzt
werden, indem der stationäre Punkt x0 der geschätz-
ten Wirkungsfläche Yˆ ( x,ϑ ) berechnet wird [30]:
 68 D. Weuster-Botz und R. Takors
x0 = −0, 5 ⋅ ϑij−1 ⋅ ϑi  Gl. 2.54
2 mit ϑ−1
ij als die Inverse der symmetrischen k × k-
Matrix mit den geschätzten Modellparametern ϑij
und ϑii und ϑi als der k × 1-Vektor mit den geschätz-
ten Modellparametern ϑi.
Durch Berechnung der Eigenwerte λi und Eigen-
vektoren der Matrix ϑii können die Eigenschaften
des stationären Punktes bestimmt werden. Sind alle
Eigenwerte negativ, handelt es sich um ein Maximum
im stationären Punkt.
Als letzter Schritt erfolgt die Validierung der
geschätzten optimalen Medienzusammensetzung,
wobei das Minimum oder Maximum nur innerhalb
der zuvor festgelegten Konzentrationsbereiche für
die nach dem ersten Schritt ausgewählten Medien-
komponenten liegen darf. Ist dies nicht der Fall,
wurde Schritt 2 (Eingrenzung der Konzentrations-
bereiche ausgewählter Medienkomponenten) nicht
richtig oder vollständig durchgeführt.
Grundsätzlich ist der Erfolg der statistischen Ver-
suchsplanung zur Optimierung einer Medienzu-
sammensetzung von der zufällig richtigen Wahl der
Konzentrationsbereiche der eingesetzten Medien-
komponenten abhängig, insbesondere wenn die
Beobachtungsvarianz relativ hoch ist. Die zufäl-
lige Wahl der Konzentrationsbereiche bedingt eine
weitere Einschränkung der Anwendung der statisti-
schen Versuchsplanung: Die Zielgröße Y(x,ϑ) muss
unimodal sein, darf also nicht mehrere Maxima oder
Minima aufweisen, da sonst statt des globalen Opti-
mums ein lokales Optimum identifiziert werden
kann.
Stochastische Suchverfahren:
Genetische Algorithmen
Eine Alternative zum Einsatz der statistischen Ver-
suchsplanung bei der Medienentwicklung ist die
Anwendung stochastischer Suchstrategien, wobei
hier insbesondere die Anwendung von „global
random search methods of generations“ (genetische
Algorithmen) sinnvoll erscheinen. Diese Suchver-
fahren haben die prinzipielle Fähigkeit zur effizien-
ten Exploration großer Variablenräume, können also
viele Medienkomponenten über große Konzentra-
tionsbereiche gleichzeitig berücksichtigen. Daher
muss kein Aussieben von Medienkomponenten vor-
genommen werden. Genetische Algorithmen setzen
weder die Unimodalität der Zielgröße als Funktion
der Medienkomponenten voraus, noch werden über-
haupt Modellannahmen getroffen [29].
Genetische Algorithmen wurden im Rahmen
von Forschungsarbeiten zur Analyse der Prinzipien
der Evolution entwickelt [31]. Genetische Algo-
rithmen kodieren reale Variablen – hier Konzent-
rationen von Medienkomponenten – in Form von
Binärzeichenketten. Eine Binärzeichenkette reprä-
sentiert damit eine komplette Medienzusammen-
setzung. Eine festgelegte Anzahl an Binärzeichen-
ketten, also eine Versuchsgeneration, wird vom
genetischen Algorithmus direkt bearbeitet. Dabei
kommen die Operatoren der Evolution – Selek-
tion, Crossover und Mutation mit unterschiedli-
chen Wahrscheinlichkeiten – zum Einsatz, um neue
Binärzeichenketten zu erzeugen (Funktionsprin-
zip . Abb. 2.19). Die Binärzeichenketten werden
. Abb. 2.19  Funktionsprinzip beim Einsatz eines
genetischen Algorithmus zur Medienentwicklung:
Eine erste Generation von Binärzeichenketten, die für
Medienzusammensetzungen kodieren, werden zufällig
erzeugt (Startmedien), experimentell evaluiert und
die Zielgröße bestimmt (Fitness). Danach werden die
Binärzeichenketten durch Selektion, Crossover und Mutation
verändert, sodass ein Satz neuer Medienzusammensetzungen
entsteht (neue Medien). Die neue Generation wird erneut
experimentell evaluiert und der Zyklus wird solange
durchlaufen, bis keine Medienzusammensetzung mit
verbesserter Fitness mehr gefunden wird
Kapitel 2 · Wachstumskinetik
nach experimentellem Einsatz der verschiedenen
Medienzusammensetzungen und Messung der Ziel-
größe (Produktkonzentration, …) entsprechend
ihrer Güte bezogen auf die Zielfunktion (Fitness)
selektiert, wobei die beste Güte die höchste Selek-
tionswahrscheinlichkeit besitzt. Die ausgewählten
Binärzeichenketten werden danach paarweise ange-
ordnet und tauschen zufallsgesteuert Binärzeichen-
abschnitte untereinander aus (Crossover). Ist die
Abfolge von Binärzeichen in bestimmten Abschnitten
oder ist ein bestimmtes Schema in einem Binärzei-
chenkettenpaar identisch, so bleibt diese Information
nach dem Crossover in beiden neu generierten Binär-
zeichenabschnitten erhalten. Es werden also bei gene-
tischen Algorithmen nicht die einzelnen Variablen
direkt prozessiert‚ sondern übergreifende Schemata.
Nachfolgend erfolgt mit abgestufter Wahrscheinlich-
keit der zufällige Austausch von einzelnen Binärzei-
chen (Mutation), um ein frühzeitiges Konvergie-
ren auf ein lokales Optimum zu vermeiden. Damit
ist eine neue Generation von Medienzusammenset-
zungen erzeugt, die erneut experimentell evaluiert
werden, bevorzugt im Parallelansatz. Der Vorgang
wiederholt sich, bis keine Medienzusammensetzung
mit verbesserter Güte mehr gefunden wird.
Grundsätzlich können bei Einsatz eines geneti-
schen Algorithmus zur Entwicklung von Medienzu-
sammensetzungen mehrere Zielgrößen gleichzeitig
verfolgt werden, ohne den experimentellen Aufwand
signifikant erhöhen zu müssen [32].
So effizient genetische Algorithmen bei der
Exploration großer Variablenräume sein können,
so ineffizient können sie bei der exakten Identifizie-
rung des globalen Optimums werden. Die Ursache
hierfür ist die Binärcodedarstellung. Es kann der Fall
eintreten, dass eine zur Erreichung des Optimums
notwendige kleine Änderung in einer Variablen eine
gleichzeitige Invertierung eines ganzen Abschnitts
einer Binärzeichenkette erforderlich macht. Diese
Invertierung kann besonders aufwendig werden
(viele Versuchsgenerationen benötigen), wenn der
genetische Algorithmus in die Nähe eines Opti-
mums gelangt ist und die Binärzeichenketten sehr
ähnlich sind. Dann wird die Invertierung eines
ganzen Abschnitts der Binärzeichenkette durch ein-
maliges Crossover sehr unwahrscheinlich [33]. Bei
der Medienentwicklung steht man jedoch vielmehr
vor dem Problem, in einem hochdimensionalen
69 2
Variablenraum effizient in die Nähe eines globalen
Optimums zu gelangen. Stochastische Suchverfahren
garantieren also nicht das Auffinden einer optima-
len Lösung bei einer begrenzten Anzahl von expe-
rimentellen Untersuchungen. Sowohl Effizienz als
auch Erfolg der Suche hängen von der problem-
spezifischen Parametrisierung des stochastischen
Suchalgorithmus ab. Details zur Parametrisierung
von genetischen Algorithmen zur Optimierung von
Medienzusammensetzungen und Anwendungsbei-
spiele sind nachzulesen in [29–32].
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 71 3

Prozessmodelle
Ralf Takors und Dirk Weuster-Botz

3.1 Einleitung – 73

3.2 Bilanzierung idealisierter homogen durchmischter

Reaktoren (Rührreaktoren) – 73
3.2.1 Satzverfahren (batch) – 73
3.2.2 Zulaufverfahren (fed-batch) – 74
3.2.3 Kontinuierlich betriebener Prozess – 75

3.3 Besondere Betriebsweisen von homogen durchmischten

Bioreaktoren – 81
3.3.1 Hochzelldichte Fermentation – 81
3.3.2 Wiederholtes Zulaufverfahren (repetitive fed-batch) – 82
3.3.3 Kontinuierliche Fermentationen – 83

3.4 Sauerstoffeintrag – 87
3.4.1 Stofftransportmodelle –87
3.4.2 Bilanzierung von Zu- und Abluft – 88
3.4.3 CO2 Transfer – 89

3.5 Rohrreaktor – 90

3.6 Blasensäule und Airlift Reaktor – 91

3.7 Diffusion in Zell- und Enzymschichten – 92

3.8 Nicht-Ideale Bioreaktoren – 94

3.8.1 Charakterisierung der Nicht-Idealität von Bioreaktoren – 95
3.8.2 Modell der Rührkesselkaskade – 97
3.8.3 Dispersionsmodell – 98

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2018

H. Chmiel, R. Takors, D. Weuster-Botz (Hrsg.), Bioprozesstechnik,
https://doi.org/10.1007/978-3-662-54042-8_3
3.9 Parameteridentifizierung – 99

3.10 Beispiele – 101

3.10.1 Schüttelkolben – 102
3.10.2 Zulaufverfahren – 103

Literatur – 105
Kapitel 3 · Prozessmodelle
73 3
3.1 Einleitung

Ein Prozessmodell besteht im Kern aus Massen- und

Stoffbilanzen, die bei Bedarf durch Energie-und P LLQ P LRXW
UL UM
Impulsbilanzen erweitert werden [11]. Bilanziert P MLQ P MRXW
werden z. B. Massen- oder Molmengen einzelner
Spezies in einem Bilanzraum, für die jeweils die
Erhaltungssätze gültig sind. Der Wahl der Bilanz-
raumgrenze kommt zur Beschreibung eines Pro-
. Abb. 3.1  Beispiel einer Massenbilanz für die
zessmodells eine große Bedeutung zu. Sie sollte so
Komponenten i und j in einem Bilanzraum. ri und rj
gewählt werden, dass alle ein- und austretenden bezeichnen die jeweiligen Reaktionsraten
Stoffströme (analog Impuls- und Energieströme)
erfasst und die innerhalb des Systems ablaufenden
Reaktionen beschrieben werden können. ist die Besonderheit zu beachten, dass der Biokataly-
In den nachfolgend vorgestellten Prozessmo- sator „Zelle“ sich vermehrt, d. h. die Reaktionsraten
dellen steht die Modellbildung auf der Basis von sind von der Zellzahl und damit von der Prozesszeit
Massen- und Stoffbilanzen im Vordergrund. Für abhängig.
derartige Bilanzen gilt prinzipiell:

3.2 Bilanzierung idealisierter

Zeitliche = Zufluss – Austritt +/– Reak-
homogen durchmischter
Verän- der der tion der
derung Spe- Spezies Spezies Reaktoren (Rührreaktoren)
der zies i i über i im
Masse über die Bilanz- Alle in diesem Abschnitt aufgeführten Prozessmo-
von Spe- die Bilanz- raum
zies i Bilanz- raum-
delle zeichnen sich dadurch aus, dass das Reaktions-
raum- grenze volumen als einphasig und ideal homogen durch-
grenze mischt angenommen wird. Das heißt, es werden
keine Gradienten in den Konzentrationen aller Reak-
. Abb. 3.1 zeigt beispielhaft ein System bestehend aus tionskomponenten (beispielsweise für das Substrat
den Massen i und j. Für die Änderung der gesam- cS, die Biomasse cX oder das Produkt cP) und den phy-
ten Masse dm/dt bzw. der Masse der Spezies i dmi/ sikalischen Eigenschaften der Reaktionsmischung
dt innerhalb des Bilanzraums gilt: (beispielsweise Temperatur) berücksichtigt. Damit
sind auch alle Reaktionsgeschwindigkeiten unab-
dm d(mi + m j) hängig vom Ort. Diese vereinfachende Annahme
= = m in − m out
dt dt ist in der Regel hinreichend genau für Bioreaktoren
mit hohem Energieeintrag im Labormaßstab. Anzu-
( ) ( )
= m i,in + m j,in − m i,out + m j,out  Gl. 3.1
merken ist weiterhin, dass mit der Konzentration cX
generell der ‚Biokatalysator‘ gemeint ist, unabhängig
dmi davon, ob es sich um wachsende beziehungsweise
= m i,in − m i,out ± ri  Gl. 3.2
dt ruhende ganze Zellen oder isolierte Enzyme handelt.

Die Reaktionsrate ri beschreibt die Umwandlung

der Komponente i in eine andere Komponente j.
Bilanzierungstechnisch ist es unerheblich, ob die
Umwandlung chemisch oder biochemisch erfolgt,
ob chemische Katalysatoren, Enzyme oder ganze
Zellen eingesetzt werden. Die Spezifizierung erfolgt
über die Verwendung der passenden Reaktionskine-
tik (siehe 7 Kap. 1 2). Werden ganze Zellen eingesetzt
3.2.1 Satzverfahren (batch)
Wird ein Bioreaktor im Satzverfahren (engl. batch)
betrieben, sind alle Inhaltsstoffe für die Durchfüh-
rung einer biologischen Stoffwandlung von Beginn
an vorgelegt. Das Medium wurde in der Regel vor
der Umsetzung bereits sterilisiert, die gewünschten
 74 R. Takors und D. Weuster-Botz

Substratmengen (z. B. an Zucker) eingesetzt und Nach Vereinfachung ergibt sich:

der pH-Wert eingestellt. Schüttelkolbenansätze sind
meist ausreichend gepuffert, wogegen Umsetzungen dcS
= −qS ⋅ cX  Gl. 3.5
im Bioreaktor einer kontinuierlichen pH-Regelung dt
mit Laugen oder Säuren bedürfen. Aerobe Fermen-
tationen im Bioreaktor werden zudem aktiv belüftet, qS beschreibt die biomassespezifische Subtratauf-
3 da die Löslichkeit von Sauerstoff im wässrigen Reak- nahmerate der Zellen und ist eine kinetische Größe
tionsmedium gering ist. (7 Kap. 2). Die Bilanzierung der Massen für Zellen
Wird die in . Abb. 3.2 gezeigte Bilanzraumgrenze (Biomasse) und Produkt erfolgt auf analoge Art und
für die Bilanzierung der Substratmasse mS verwen- Weise und führt zu den Gleichungen:
det, kann deren zeitliche Änderung im Bilanzraum
beschrieben werden zu: dcX
= µ ⋅ cX  Gl. 3.6
dt
dmS d(cS ⋅VL ) Produktregel dVL
= = cS ⋅ + VL ⋅
dt dt dt dcP
Gl. 3.3 = qP ⋅ cX  Gl. 3.7
dcS batch dc dt
= VL ⋅ S 
dt dt
mit μ als biomassespezifischer Wachstumsrate und qp
Zu beachten ist, dass für dV L/dt = 0 gilt, da das als biomassespezifischer Produktbildungsrate.
Reaktionsvolumen VL unverändert bleibt. Über die
Bilanzgrenzen hinweg tritt Substrat weder ein noch
aus, daher gilt: 3.2.2 Zulaufverfahren (fed-batch)

dmS batch dc Das Zulaufverfahren (engl. fed-batch) unterschei-

= VL ⋅ S = −rS = −qS ⋅ cX ⋅ VL  Gl. 3.4
dt dt det sich vom Satzverfahren dadurch, dass nicht alle
Medienbestandteile (wie z. B. die Kohlenstoffquelle)
von Prozessbeginn an vorgelegt werden, sondern
0RWRU
über eine Zulauf Fin als Funktion der Zeit dem Bio-
reaktor steril zugeführt werden. Dadurch werden
6WHULOGLFKWXQJ 7LWUDWLRQ
$EOXIW unerwünschte Nebenproduktbildungen der Zellen
9/ bei zu hohen Substratkonzentrationen vermieden
und die Zellaktivität kann gezielt über die Substrat-
verfügbarkeit gesteuert werden.
5KURUJDQ Unter Beachtung der in . Abb. 3.3 verwendeten
6FKLNDQHQ Bilanzraumgrenze folgt für die Substratmasse mS im
.KOPDQWHO Bilanzraum:
0HVVVRQGHQ F6F;F3 .XOWXUPHGLXP
S+7S2
%HJDVXQJV dmS d(cS ⋅VL) Produktregel dVL dc
= = cS ⋅ + VL ⋅ S
RUJDQ dt dt dt dt
VWHULOH=XOXIW fed−batch dc
= cS ⋅ Fin + VL ⋅ S
dt
. Abb. 3.2  Satzreaktor mit dem Reaktionsvolumen  Gl. 3.8
VL, den Konzentrationen für Substrat cS, Biokatalysator
cX und Produkt cP (die gestrichelte Linie stellt die
Zu berücksichtigen ist, dass das Reaktionsvolumen
Bilanzraumgrenze dar)
VL durch den Zulauf zunimmt: dVL/dt = Fin Substrat
Kapitel 3 · Prozessmodelle
75 3

dmX d(cX ⋅VL) Produktregel dV dc

)LQF6) = = cX ⋅ L + VL ⋅ X
dt dt dt dt
fed−batch dcX
= cX ⋅ Fin + VL ⋅
dt
7LWUDWLRQ  Gl. 3.11
$EOXIW
9/
YDULDEHO
Allerdings muss berücksichtigt werden, dass der
Zulauf in der Regel keine Biomasse enthält, daher folgt:

fed−batch
dmX = cX ⋅ Fin + VL ⋅
dcX
= µ ⋅ cX ⋅ VL
dt dt
F6F;F3  Gl. 3.12

und schließlich nach Umstellung und Kürzen

dcX  F 
VWHULOH=XOXIW = cX ⋅ µ − in   Gl. 3.13
dt  VL 

. Abb. 3.3  Satzreaktor mit dem Zufluss (engl. feed) Analog kann das Produkt bilanziert werden, was zu
Fin, der Eintrittskonzentration des Substrates cSF, dem
folgender Gleichung führt:
Reaktionsvolumen VL, den Konzentrationen für Substrat cS,
Biomasse cX und Produkt cP (die gestrichelte Linie stellt die 
dcP F 
Bilanzraumgrenze dar) = cX ⋅ qP − in   Gl. 3.14
dt  VL 

tritt über die Bilanzgrenze in den Bioreaktor ein und

wird dort von den Zellen verstoffwechselt. Daher gilt: 3.2.3 Kontinuierlich betriebener
Prozess
dmS fed−batch dc
= cS ⋅ Fin + VL ⋅ S
dt dt Ein kontinuierlich betriebener Bioreaktor wird in der
= cSF ⋅ Fin − qS ⋅ cX ⋅VL  Gl. 3.9
Regel mit konstantem Reaktionsvolumen VL betrie-
ben, das heißt Zu- und Ablaufmengen entsprechen
Nach Umstellung und Kürzen folgt daraus: sich. Die Laufzeit eines solchen Prozesses liegt deut-
lich über der des Zulaufverfahrens, da hierbei keine
dcS Fin Begrenzung durch das endliche Reaktorvolumen
= ⋅ (c − c ) − qS ⋅ cX  Gl. 3.10
dt VL SF S besteht. Je nach Ausprägung wird unterschieden, ob
der Prozess mit oder ohne Zellrückhaltung durch-
geführt wird.
Gl. 3.10 verdeutlicht, dass die Substratkonzentration
cS durch den Zufluss Fin / VL ⋅ cSF zunimmt, gleich- z Ohne Zellrückhaltung
zeitig jedoch auch um den Beitrag Fin / VL ⋅ cS ver- Bei der Betriebsweise ohne Zellrückhaltung sind die
dünnt wird. Der Term −qS ⋅ c X beschreibt wiede- Verweilzeiten von Medienbestandteilen und Zellen
rum den Substratverbrauch durch die Zellen im im Bioreaktor gleich. . Abb. 3.4 veranschaulicht die
Reaktionsvolumen. Vorgehensweise.
Für die Bilanzierung der Biomasse gilt ebenso Für die Bilanzierung der Substratmasse ergibt
der Ansatz: sich für dVL/dt = 0
 76 R. Takors und D. Weuster-Botz

während Fin/VL · cS die Verdünnung der Substratkon-

)LQF6) )RXWF6F;F3 zentration aufgrund des Zulaufs wiedergibt.
Analog lassen sich die zeitlichen Verläufe für die
Konzentrationen an Biomasse und Produkt unter
7LWUDWLRQ der Annahme, dass weder Zellen noch Produkt dem
kontinuierlich betriebenen idealen Rührkesselreak-
3 9/
$EOXIW
tor zugeführt werden, bestimmen zu:
YDULDEHO
dc X
= D ⋅ (0 − cX) + µ ⋅ cX = (µ − D) ⋅ cX  Gl. 3.18
dt

dcP
= D ⋅ (0 − cP) + qP ⋅ c X = qP ⋅ cX − D ⋅ cP  Gl. 3.19
dt
F6F;F3
Für einen kontinuierlich betriebenen Bioreaktor
kann sich nach genügend langem Betrieb bei einer
konstanten Verdünnungsrate ein Fließgleichgewicht
VWHULOH=XOXIW einstellen, das heißt d/dt = 0. Aus den Bilanzglei-
chungen Gl. 3.18 und 3.19 folgt daraus unmittelbar:

. Abb. 3.4  Kontinuierlich betriebener Bioreaktor mit µ=D  Gl. 3.20

dem Zufluss Fin, dem Abfluss Fout, der Eintrittskonzentration
des Substrates cSF, dem Reaktionsvolumen VL, den
Anschaulich bedeutet dies, dass genauso viele Zellen
Konzentrationen für Substrat cS, Biomasse cX und Produkt cP.
Zu- und Abfluss sind mengenmäßig gleich sodass VL konstant im Bioreaktor pro Zeiteinheit neu gebildet wie durch
bleibt (die gestrichelte Linie stellt die Bilanzraumgrenze dar) die Verdünnungsrate D ausgewaschen werden. Die
maximale Verdünnungsrate Dmax, auch Auswasch-
punkt (engl. wash-out) genannt, ist dann erreicht,
dmS dV dc dc wenn keine Zellen mehr im Reaktor vorhanden sind,
= cS ⋅ L + VL ⋅ S = cS ⋅ 0 + VL ⋅ S
dt dt dt dt also das zugeführte Substrat nicht mehr umgesetzt
dcS wird. Bei Berücksichtigung des Substratbedarfs für
= VL ⋅ Gl. 3.15
dt den Erhaltungsstoffwechsel ergibt sich:

was unter Berücksichtigung von F = Fin = Fout zu cSF

dem Ansatz führt:
dc
VL ⋅ S = F ⋅ (cSF − cS) − qS ⋅ cX ⋅ VL Gl. 3.16
dt
Damit ergibt sich für die zeitliche Änderung der
Substratkonzentration:
dcS
= D ⋅ (cSF − cS) − qS ⋅ cX 
dt
Darin bezeichnet D die Durchflussrate oder auch
Verdünnungsrate (engl. dilution rate) D = F/VL.
Anzumerken ist, dass Gl. 3.17 der Bestimmungsglei-
chung Gl. 3.10 des Zulaufverfahrens für das Substrat
entspricht. Allerdings bezeichnet der Term D · cS in
Gl. 3.17 den Abfluss von Substrat aus dem Bioreaktor,
Dmax = µmax ⋅ − mS ⋅ YXS,µ;
KS + cSF
 Gl. 3.21
Dmax < µmax − mS ⋅ YXS,µ
Die Einstellung von Arbeitspunkten (stabilen
Betriebspunkten) mit Verdünnungsraten ober-
halb der maximalen Wachstumsrate μmax ist somit
niemals möglich, da die Verdünnungsrate die Neu-
Gl. 3.17
bildung übersteigt. Weiterhin bedeutet dies, dass sich
die Wachstumsrate im kontinuierlich betriebenen
Bioreaktor im Fließgleichgewicht durch Vorgabe
einer Verdünnungsrate für D < µmax – mS · YXS,µ
beliebig einstellen lässt.
Aus Gl. 3.17 folgt zudem für den Biomasseertrag
(gebildete Biomasse pro umgesetzter Substratmasse)
YXS
Kapitel 3 · Prozessmodelle
77 3

dcS ! µ=D
= D ⋅ (cSF − cS) − qS ⋅ cX = 0 ⇒
dt
cX
YXS =  Gl. 3.22
cSF − cS

Der Biomasseertrag kann somit durch Messung der

Konzentrationen an Biomasse und Substrat in einem
Arbeitspunkt berechnet werden.
Wird berücksichtigt, dass auch nichtwachsende
Zellen für die Aufrechterhaltung lebensnotwendiger
Funktionen eine Grundaufnahme für Substrat benö-
tigen (Erhaltungsstoffwechsel, engl. maintenance), so
gilt unter Verwendung der Pirt-Gleichung (7 Kap. 2):

dcS  
 µ
= D ⋅ (cSF − cS) −  + mS ⋅ cX
dt  YXS,µ  . Abb. 3.5  X/D-Diagramm – Auftragung der
Konzentrationen an Biotrockenmasse cX als Funktion

!
=0 ⇒
µ=D (cSF − cS) = 1
=
1 m
+ S
cX YXS YXS,µ D
 Gl. 3.23
Der kontinuierlich betriebene Bioreaktor eignet sich
somit gut, um kinetische Größen zur Beschreibung
des Zellwachstums zu bestimmen. Gl. 3.23 verdeut-
licht, dass die kinetischen Parameter der wahre Bio-
masseertrag YXS,µ und die konstante Substratauf-
nahme für den Erhaltungsstoffwechsel mS aus den
Fließgleichgewichten bei bekannter Verdünnungs-
rate D und beobachtetem Biomasseertrag YXS (siehe
Gl. 3.21) ermittelt werden können.1
. Abb. 3.5 gibt einen Überblick über die Bio-
masse-Konzentrationen, die bei unterschiedlichen
Wachstumsraten (= Verdünnungsraten) im Fließ-
gleichgewicht zu beobachten sind. Deutlich zu erken-
nen ist die starke Abnahme der Zellkonzentrationen
bei Annäherung an die maximale Wachstumsrate,
der wash-out Grenze. Darüber hinaus ist kein ope-
rativer Arbeitspunkt möglich. Nimmt ein Modell
Zellwachstum ohne Verbrauch des limitierenden
1 Der Biomasseertrag YXS wird in manchen Lehrbüchern
auch als scheinbarer Biomasseertrag oder scheinbare
Biomasse/Substrat-Ausbeute bezeichnet. Demgegen-
über steht der wahre Biomasseertrag bzw. die wahre Bio-
masse/Substrat-Ausbeute als kinetische Eigenschaft des
biologischen Systems.
der Verdünnungsrate D in Fließgleichgewichten eines
kontinuierlich betriebenen idealen Rührkesselreaktors (cSF
= 10 g L–1; µmax = 1 h–1; KS = 0,2 g L–1; YXS,µ = 0,5 g g–1; mS
= 0,02 g g-1 h–1). Die rote Linie gibt stabile Arbeitspunkte
unter Berücksichtigung des Erhaltungsstoffwechsels wieder.
Im anderen Fall wird angenommen, dass das limitierende
Substrat nicht für den Erhaltungsstoffwechsel benötigt wird
(schwarze Linie). Besonders bei geringen aber auch bei hohen
Durchflussraten (entspricht Wachstumsraten) führt dies zu
deutlichen Unterschieden+
Substrates für den Erhaltungsstoffwechsel an, zeigt
die schwarze Kurve höhere Zellkonzentrationen
besonders bei geringen aber auch bei hohen Wachs-
tumsraten. Wird das limitierende Substrat auch
zur Aufrechterhaltung des Erhaltungsstoffwechsels
benötigt, ist bei diesen Wachstumsraten eine starke
Reduktion der erreichbaren Biomassekonzentra-
tionen erkennbar (rote Linie in . Abb. 3.5). Es ist
daher unbedingt erforderlich den Substratverbrauch
für den Erhaltungsstoffwechsel zu berücksichtigen,
wenn das limitierende Substrat hierfür benötigt wird.
Sollen in einem kontinuierlich betriebenen
(idealen) Rührkesselreaktor möglichst viele Zellen
im Fließgleichgewicht produziert werden, so muss
ein optimaler Betriebspunkt gewählt werden, der
hohe volumetrische Produktivitäten (Raum-Zeit
Ausbeuten) für die Biomasseherstellung RZA X
ermöglicht (. Abb. 3.6).
RZAX = cX ⋅ D  Gl. 3.24
 78 R. Takors und D. Weuster-Botz
Die höchste Raum-Zeit Ausbeute für die Biomasse-
herstellung wird erreicht, wenn die Steigung d(cX ·
D)/dD = 0 wird. Für die einfache Sättigungskinetik
ergibt sich die optimale Verdünnungsrate Dopt damit
zu:
3  KS 
Dopt = µmax ⋅ 1 −  Gl. 3.25
 KS + cSF 
Da in der Regel mit hohen Substratkonzentratio-
nen gearbeitet wird (cSF ≫ KS), liegt der optimale
Betriebspunkt nahe am Auswaschpunkt. Auch wird
deutlich, dass die höchste Produktivität für die Bio-
masseherstellung nur bei unvollständigem Umsatz
erreichbar ist (. Abb. 3.6).
z Mit Zellrückhaltung
Die Herstellung von Zellen verlangt nach Subst-
rat, was somit für die eigentliche Produktion der
Zielkomponente nicht mehr zur Verfügung steht.
Die damit verbundenen zeitlichen und finanziel-
len Aufwendungen fallen insbesondere bei solchen
. Abb. 3.6  Auftragung der Raum-Zeit Ausbeute RZAX und
der Konzentrationen von Biotrockenmasse cX und Substrat cS
als Funktion der Verdünnungsrate D in Fließgleichgewichten
eines kontinuierlich betriebenen idealen Rührkesselreaktors
(cSF = 10 g L–1; µmax = 1 h–1; KS = 0,2 g L–1; YXS,µ = 0,5 g g–1; mS
= 0,02 g g–1 h–1). Die optimale Verdünnungsrate ergibt sich
damit aus Gl. 3.25 zu 0,86 h–1
Produktionsansätzen ins Gewicht, in denen die
Zellen entweder als reiner nichtwachsender Bioka-
talysator oder als nur geringfügig wachsende Pro-
duzenten eingesetzt werden. Für solche Produk-
tionsansätze ist es sinnvoll, die einmal hergestellten
Zellen möglichst lange im Bioreaktor bei ausrei-
chender Substratversorgung und niedrigen Wachs-
tumsraten zu halten. Dies setzt einerseits geeignete
Maßnahmen zur Zellrückhaltung voraus. Anderer-
seits sollte eine ausreichende Versorgung durch im
Medium gelöste Substrate, wie aber auch Sauerstoff
(in aeroben Ansätzen) gewährleistet sein. Es findet
demnach eine Entkopplung der Verweilzeiten von
Biomasse und Substraten im Bioreaktor statt.
Die Zellrückhaltung kann im Reaktor (intern)
oder außerhalb des Reaktors (extern) erfolgen.
Interne Maßnahmen umfassen die Ausprägung von
Biofilmen beispielsweise durch Immobilisierung
der Zellen oder Enzyme auf oder in Trägermateria-
lien, die suspendiert oder als Festbettschüttungen
vorliegen oder durch getauchte Mikrofiltrations-
membranen. Externe Maßnahmen zur Fest-Flüs-
sig-Trennung machen einen externen Umlauf (engl.
bypass) mit kontinuierlicher Sedimentation im Zen-
trifugalfeld oder Mikrofiltration und Rückführung
der aufkonzentrierten Zellen erforderlich. Scher-
kraftempfindliche Säugerzellen können auch über
Sedimentation im Schwerefeld im Umlauf oder
über Ultraschalltechnik am Auslass des Bioreak-
tors zurückgehalten werden. Im Zuge der anhalten-
den Bemühungen zur Prozessintensivierung erlan-
gen geeignete Zellrückhaltungsmaßnahmen immer
größere Bedeutung. . Abb. 3.7 fasst die beiden prin-
zipiellen Ansätze beispielhaft zusammen.
z z Interne Zellrückhaltung:
Zur Bilanzierung des Substrates wird der Bilanzraum
2 verwendet (. Abb. 3.7). Es gilt prinzipiell Gl. 3.16
unter Berücksichtigung von F = Fin = Fout:
dcS
VL ⋅ = F ⋅ (cSF − cS) − rS  Gl. 3.26
dt
Darin bezeichnet rS den volumetrischen Substrat-
verbrauch, der sich aus den Einzelverbräuchen der
Zellen in der Biosuspension wie auch der immo-
bilisierten Zellen zusammensetzt. Vereinfachend
wird nachfolgend davon ausgegangen, dass beide
Kapitel 3 · Prozessmodelle
79 3

%LODQ]

)LQF6) )LQF6)
)RXWF6F;F3

7LWUDWLRQ 7LWUDWLRQ
$EOXIW $EOXIW

%LODQ]
)RXW/F/6F;/F/3
F[
N )5F6F;F3
F6F;F3 F6F;F3 )RXW;F;;

VWHULOH=XOXIW VWHULOH
%LODQ] %LODQ] =XOXIW
);5 )LQF;;F;6F;3

D E

. Abb. 3.7  Interne (a) und externe (b) Maßnahmen zur Zellrückhaltung. Beide Ansätze werden kontinuierlich betrieben,
d. h. VL bleibt konstant. a Zellen werden auf Trägern immobilisiert, so dass sich dort die flächenspezifische Zelldichte cX
′′
einstellt. Gleichzeitig lösen sich Zellen mit der Rate k aus dem Biofilm heraus. b Bei externer Rückhaltung werden die Zellen
im Umlauf des Bioreaktors beispielsweise durch eine kontinuierliche Zentrifugation zurückgehalten. Da die Rückhaltung nicht
vollständig ist, wird zwischen gering konzentrierten (Index L) und hochkonzentrierten (Index X) Stoffströmen unterschieden.
Der hochkonzentrierte Teilstrom FXR wird zurückgeführt, was dem Anteil α Fin entspricht. Darüber hinaus bedeuten: Zufluss Fin,
Abfluss Fout, Eintrittskonzentration des Substrates cSF, Reaktionsvolumen VL, Konzentrationen für Substrat cS, Biomasse cX und
Produkt cP. Gestrichelte Linien stellen verschiedene Bilanzräume dar

Zellfraktionen die gleiche geringe Wachstumsrate
besitzen. Nichtimmobilisierte Zellen wurden aus
dem Biofilm losgelöst und werden kontinuierlich
aus dem Bioreaktor ausgewaschen. Einem einfachen
Ansatz folgend kann rS formuliert werden zu:
rS = qS ⋅ cX(1 + f ) ⋅ VL 
mit AT als Biofilmoberfläche im Bioreaktor. Hierbei
wird angenommen, dass sich eine konstante Bio-
filmdicke auf der (planaren) Trägeroberfläche aus-
bildet. Dies führt bei einer geringen Biofilmdicke zu
einer vernachlässigbaren Stofftransportlimitierung
im Biofilm.
Gl. 3.27 Die Substratbilanz lässt sich wie folgt darstellen:

mit f als dem Anteil der immobilisierten Zellen dcS

= D ⋅ (cSF − cS) − qS ⋅ cX(1 + f )  Gl. 3.29
bezogen auf das Flüssigkeitsvolumen im Reaktor. dt
In der Praxis wird häufig die Biofilmdichte als
Zellanzahl oder Biomasse pro besiedelter Fläche ( c′′X ) bzw.:
angegeben, was zu der folgenden Formulierung für den
Substratverbrauch im Bioreaktor führt: 
dcS A 
= D ⋅ (cSF − cS) − qS ⋅ cX + c′′X ⋅ T   Gl. 3.30
dt VL 
rS = qS ⋅ cX ⋅ VL + c′′X ⋅ AT   Gl. 3.28 
 80 R. Takors und D. Weuster-Botz
Die Biomasse im Bioreaktor kann durch Formulie-
rung der Massenbilanz im Bilanzraum 2 wie folgt
beschrieben werden:
dmX dc
= VL ⋅ X = k ⋅ c′′X ⋅ AT
dt dt
3 −F ⋅ cX + µ ⋅ cX ⋅VL 
Darin bezeichnet k ⋅ c′′X ⋅ AT die Ablösungsrate der
Zellen aus dem Biofilm in das umgebende Medium.
Die entsprechende Bilanz für die Biofilmmasse mX,T
(Bilanzraum 1) lautet:
dmX,T
= µ ⋅ c′′X ⋅ AT − k ⋅ c′′X ⋅ AT
dt
= c′′X ⋅ AT ⋅ (µ − k )  Gl. 3.32
Unter der Annahme eines stabilen Biofilms im Fließ-
gleichgewicht (eng. steady-state) muss µ = k sein.
Damit ergibt sich Gl. 3.31 zu:
dcX A Biomasse das Trennmodul verlassen. Dies ist bei-
= µ ⋅ c′′X ⋅ T + cX ⋅ (µ − D ) 
dt VL
Deutlich zu erkennen ist, dass die Konzentration der
Biomasse im Reaktor nicht allein von der Durchfluss-
rate D abhängt, sondern auch vom Wachstum des
Biofilms. Das Wachstum der Zellen ist somit von der
Durchflussrate D entkoppelt.
z z Externe Zellrückhaltung:
Externe Zellrückhaltungsansätze haben den Vorteil,
relativ flexibel an bestehende Bioreaktoren angebaut
werden zu können. Gleichzeitig sind entsprechende
Ansätze aufwendig zu realisieren. Zum einen muss
der Bioreaktor trotz des externen Umlaufs auch wei-
terhin monoseptisch betrieben werden können. Zum
anderen erfordert die Förderung durch den Umlauf
die Installation zusätzlicher Pumpen. Die derart ein-
gebrachte Pumpleistung sollte ausreichend groß sein,
um unerwünschte Gradienten entlang des Umlaufs
zu minimieren. Dennoch werden beispielsweise pH-,
Sauerstoff- oder Substratgradienten auf die Zellen
aufgeprägt, was neben der zusätzlichen Scherstress-
beanspruchung (insbesondere bei Säugerzellen eine
kritische Größe) zu nicht erwünschten Leistungs-
einbrüchen bei den Produzenten führen kann. Die
externe Zellrückhaltung verlangt somit nach beson-
ders robusten Zellen, die keine Leistungsminderung
trotz der auftretenden Gradienten und Scherbean-
spruchung zeigen.
Zur Auslegung eines externen Zellrückhaltungs-
systems wird zunächst der Bilanzraum 1 (. Abb. 3.7a)
Gl. 3.31
betrachtet. Aus der Massenbilanz folgt unmittelbar
dass
Fin = FL,out + FX,out  Gl. 3.34
was mit der Definition des Rücklaufverhältnisses
α = FX,R/Fin und der Massenbilanz für den Bilanz-
raum 2 in
FR = Fin ⋅ (1 + α )  Gl. 3.35
überführt werden kann.
. Abb. 3.7 berücksichtigt den allgemeinen Fall,
dass zwei austretende Ströme mit hoher (FX,out mit
cX,X) und geringer (FL,out mit cL,X) Konzentration an
Gl. 3.33
spielsweise für den Betrieb von kontinuierlichen
Zentrifugalseparatoren gegeben. Bei Verwendung
von Mikrofiltrationseinheiten, kann der Strom FL,out
in der Regel als zellfrei angesehen werden.
Die Biomassebilanz für den Bilanzraum 2 führt
zu der Gleichung:
dmX dc
= VL X = FX,R ⋅ cX,X − FR ⋅ cX
dt dt
+µ ⋅ cX ⋅VL  Gl. 3.36
was mit Gl. 3.35 und D = Fin/VL umformuliert werden
kann zu
dcX
= α ⋅ D ⋅ cX, X − D ⋅ (1 + α )⋅ cX + µ ⋅ cX  Gl. 3.37
dt
Die Substratbilanzierung kann in analoger Vor-
gehensweise erfolgen. Allerdings sollte beachtet
werden, dass die Konzentrationen cL,S = cX,S = cS sind,
d. h. der Einsatz einer kontinuierlichen Sedimenta-
tion im Zentrifugalfeld ändert die Konzentratio-
nen gelöster Substratkomponenten nicht, wenn die
Verweilzeiten der Biomasse im Umlauf gering sind.
Daher folgt für die Bilanzierung des Substrates:
Kapitel 3 · Prozessmodelle
81 3

dcS
= D ⋅ (cSF − cS) − qS ⋅ cX  Gl. 3.38 F[
dt

Gl. 3.38 ist identisch mit Gl. 3.17, was belegt, dass für QG
LJH
gelöste Komponenten (wie z. B. das Substrat) kein V WH
DQ
Unterschied im Vergleich zu einem Bioreaktor ohne Į
”Į
Zellrückhaltung zu erwarten ist. Sehr wohl existieren
jedoch Unterschiede zwischen Gl. 3.37 und 3.18. Die
Verweilzeiten zwischen Zellen und Kulturmedium
sind daher entkoppelt. Deutlich wird dies auch durch
eine Betrachtung von Gl. 3.37 im Fließgleichgewicht: '

dcX
= α ⋅ D ⋅ cX, X − D ⋅ (1 + α) ⋅ cX + µ ⋅ cX . Abb. 3.8  Abhängigkeit der Konzentration an Biomasse
dt cX von der Durchflussrate in einem Bioreaktor mit externer
!   cX, X  Zellrückhaltung (durchgezogene Linie) im Vergleich zu
= 0 ⇒ µ = D ⋅ 1 + α ⋅ 1 −  einem Ansatz ohne Zellrückhaltung (gestrichelt). Wird
 cX 
  die Zellrückhaltung aktiviert (α > 0), sind deutlich höhere
 Gl. 3.39 Konzentrationen an Biomasse im kontinuierlichen Betrieb
erzielbar

Berücksichtigt man, dass wegen der Aufkonzentrie-

rung cX,X/cX > 1 ist, folgt: 3.3 Besondere Betriebsweisen
von homogen durchmischten
µ<D  Gl. 3.40 Bioreaktoren

Die Wachstumsrate der Zellen im Bioreaktor mit 3.3.1 Hochzelldichte Fermentation

externer Zellrückhaltung ist demnach kleiner als die
eingestellte Verdünnungsrate D. Es wird somit ein
Betriebspunkt realisiert, der ohne Zellrückhaltung
nicht einstellbar wäre.
Ähnliches gilt für die Konzentration an Biomasse
im Reaktor. Unter Annahme eines Fließgleichge-
wichtes (engl. steady-state) und dem Zusammenhang
YXS = μ/qS gilt für die Konzentration der Biomasse:
dcS
= D ⋅ (cSF − cS) − qS ⋅ cX
dt
! cSF − cS
= 0 ⇒ cX = YXS  Gl. 3.41
  c 

1 + α 1 − XX 


 cX 
Da der Nenner von Gl. 3.41 größer 0 und kleiner 1
ist, ist die resultierende Konzentration cX bei Zell-
rückhaltung immer größer als die vergleichbare Kon-
zentration ohne Zellrückhaltung. Dieser Sachverhalt
wird auch in . Abb. 3.8 verdeutlicht.
Das Ziel von Zulaufverfahren kann es sein, möglichst
hohe Konzentrationen an Biomasse im Reaktor zu
erreichen. Beispielsweise könnte damit ein Biotrans-
formationsansatz realisiert werden oder die Produk-
tion eines Zielproteins erfolgen, das weitestgehend
wachstumsentkoppelt hergestellt würde. Gleichzei-
tig sind die Sauerstoffeintragsraten in Bioreaktoren
technisch meist bei 150–180 mmol L–1h–1 limitiert,
was die maximale Zelldichte begrenzt, die ausrei-
chend mit Sauerstoff versorgt werden kann. Gl. 3.42
verdeutlicht, dass die Sauerstoffaufnahmerate der
Zellen (OUR = oxygen uptake rate) dem Produkt aus
biomassespezifischer Sauerstoffaufnahme (qO2) und
Konzentration an Biomasse entspricht:
steady−state
OUR = qO2 ⋅ cX = OTR  Gl. 3.42
Da sich die Raten an Sauerstoffaufnahme (OUR) und
technischem Sauerstofftransfer (OTR = oxygen trans-
fer rate) im Fließgleichgewicht (engl. steady-state)
 82 R. Takors und D. Weuster-Botz
entsprechen müssen, ist das Produkt aus Gl. 3.42
durch die technischen Sauerstoffeintragsmöglich-
keiten begrenzt. Daraus folgt unmittelbar, dass hohe
Biomassekonzentrationen cX nur mit geringen zell-
spezifischen Aufnahmeraten qO2 technisch realisiert
werden können.
3 Die biomassespezifische Sauerstoffaufnahmerate
qO2 ist über die Ausbeute YO2X an die Wachstumsrate
der Zellen gekoppelt:
qO2 = YO2X ⋅ µ 
Wird die Wachstumsrate der Zellen reduziert, ver-
ringert sich proportional deren Sauerstoffaufnah-
merate.2 Es eröffnet sich somit die Möglichkeit, eine
limitierend geringe Substratkonzentration (7 Kap. 2)
so während des gesamten Zulaufverfahrens über eine
entsprechend gesteuerte Substratzufuhr einzustellen,
dass das Wachstum und damit die biomassespezi-
fische Sauerstoffaufnahmerate konstant auf einem
niedrigen Niveau bleiben. Damit können hohen
Konzentrationen an Biomasse cX bei gleichzeitiger
Beachtung der begrenzten Sauerstoffeintragsleistung
OTR des Bioreaktors erreicht werden.
Bezogen auf . Abb. 3.3 kann die Formulierung
für die Biomassebilanz erfolgen zu:
dmX d (VL ⋅ cX )
= = µ ⋅ cX ⋅ VL 
dt dt
Anders als in Gl. 3.11 erfolgt nun nicht die Anwen-
dung der Produktregel, sondern die Umstellung der
Gleichung durch Trennung der Variablen zu:
d (VL ⋅ cX )
= µ ⋅ dt 
VL ⋅ cX
Für die Integration von Gl. 3.45 für die Dauer t des
Zulaufverfahrens soll μ = µset = konstant sein, da dies
die Bedingung für den gesuchten Prozessansatz ist.
Daher folgt:
(V ⋅ c )
ln L X = µset ⋅ t 
(VL ⋅ cX )0
2 Der Bedarf der Zellen an Sauerstoff für den Erhaltungs-
stoffwechsel wird hier vereinfachend vernachlässigt.
Darin indiziert 0 den Start des Zulaufs zur Einstel-
lung von μset im substratgesteuerten Zulaufverfah-
ren. Für die Substratbilanz gilt Gl. 3.10 mit der zusätz-
lichen Bedingung, dass cS = konstant ist, da nur so
eine konstante niedrige Wachstumsrate μset einge-
stellt werden kann:
dcS Fin
= ⋅ (c − c ) − qS ⋅ cX
dt VL SF S
! qS
Gl. 3.43 = 0 ⇒ Fin = VL ⋅ cX  Gl. 3.47
( SF − cS)
c
Mit Gl. 3.46 und der Beziehung Y XS = µ/q S folgt
daraus:
µset
Fin (t) = (VL ⋅ cX ) exp (µset ⋅ t )
0Y ⋅
XS (cSF − cS)
 Gl. 3.48
Zu beachten ist, dass die gewünschte Wachstums-
rate μset bei bekannter Sättigungskinetik (7 Kap. 2)
für eine gewählte Substratkonzentration c S und
bekannten Parametern μmax, KS und YXS,µ sowie bei
Berücksichtigung des Erhaltungsstoffwechsels mS
abgeschätzt werden kann. Das so erhaltene Zulauf-
profil ist exponentiell und erlaubt das Erreichen
hoher Konzentrationen an Biomasse durch kons-
Gl. 3.44
tant langsam wachsende Zellen.
In der Praxis wird bei Hochzelldichteverfah-
ren häufig nach Erreichen von OTRmax die Wachs-
tumsrate umgekehrt proportional zur Zellmasse im
Reaktor weiter verringert, um noch weitaus höhere
Zelldichten erzielen zu können. Die Festlegung
einer ‚optimalen‘ Wachstumsrate im Hochzelldich-
Gl. 3.45
teverfahren erfolgt häufig so, dass gerade eben keine
Nebenproduktbildung auftritt. Die Festlegung einer
konstanten, niedrigen Wachstumsrate µset kann zu
unökonomisch langen Prozesszeiten führen.
3.3.2 Wiederholtes Zulaufverfahren
(repetitive fed-batch)
Gl. 3.46
Für die effiziente Nutzung von Zellen kann es sinnvoll
sein, den Reaktorinhalt am Ende eines Zulauf- (oder
auch Satz-) Prozesses nicht vollständig zu entneh-
men, sondern einen Restgehalt von beispielsweise
Kapitel 3 · Prozessmodelle
10–20 % im Bioreaktor zu lassen. Die derart zurück-
gehaltene Biomasse dient als Inokulum für den nach-
folgenden Prozess.
Um einen Folgeprozess erfolgreich zu starten,
wird der zurückbehaltene Anteil mit frischem, steri-
lem Satzmedium aufgefüllt. Anschließend erfolgt die
‚normale‘ Fahrweise des Satz- bzw. Zulaufverfahrens.
Soll eine solche Vorgehensweise in der Praxis eta-
bliert werden, müssen im Vorfeld die nachfolgenden
Punkte intensiv untersucht werden:
1. Stabilität der Produzenten: Zellen am
Ende eines industriellen Zulaufprozesses
haben häufig 20–30 Generationen seit dem
Überimpfen aus einer working cell bank
(WCB)3 des Labors durchlaufen. Durch die
Prozessführung am Ende eines Zulaufver-
fahrens ist ihr Stoffwechsel deutlich anders
reguliert als zu Beginn eines neuen Satzpro-
zesses, der durch exponentielles Wachstum
gekennzeichnet ist. Es muss daher im Vorfeld
untersucht werden, ob wiederverwendete
Zellen diesen Wechsel problemlos verkraften
können, also ob die gleichen Leistungsdaten für
den Gesamtprozess erreicht werden können.
2. Wirtschaftlichkeit: Den geringeren
Aufwendungen für die Biomassebildung
einerseits stehen geringere Produktmengen
im Vergleich zu einem vollständig geernteten
Ansatz gegenüber. Diese Einflüsse müssen
wirtschaftlich gegeneinander abgewogen
werden. Wirtschaftlich vorteilhaft ist ebenfalls,
dass die zeitlichen Aufwendungen für Ernte
und Vorbereitung des Bioreaktors in einem
wiederholten Zulaufverfahren niedriger sind
als bei Durchführung einer analogen Sequenz
mit dazwischen geschalteten Vorbereitungs-
intervallen. Das bedeutet, die volumetrische
Produktivität (Raum-Zeit Ausbeute) des
eingesetzten Bioreaktors nimmt zu.
3. Wechselwirkung mit der Aufarbeitung:
Durch das verringerte Erntevolumen einer-
seits sowie durch die mögliche Rezyklierung
3 Als working cell bank (WCB) wird die Startkolonie bezeich-
net, die am Beginn der Anzuchtschiene (seed train) im
Labor steht. Sie leitet sich aus der master cell bank ab
(MCB), die die Ursprungskolonie des Produzentenstamms
darstellt und häufig in der Stammentwicklung verbleibt.
83 3
von Inhaltsstoffen andererseits kann es
zu unerwünschten Nebeneffekten in dem
nachgeschalteten Aufarbeitungsprozess
kommen. Auch diese gilt es in Vorversuchen zu
überprüfen.
Von der Modellierung her kann ein wiederholtes
Zulaufverfahren analog zu einem Zulaufprozess
behandelt werden.
3.3.3 Kontinuierliche Fermentationen
Kontinuierliche Kultivierungen zeichnen sich
dadurch aus, dass das Reaktionsvolumen im Biore-
aktor in der Regel konstant bleibt und der Prozess
in einem Fließgleichgewichtszustand, also bei dX/
dt = 0, betrieben werden kann. Hierin beschreibt X
einen Zustandsvektor, der aus den Konzentrationen
für Biomasse, Substrat und Produkt besteht.
z Chemostat
Die chemostatische Betriebsweise basiert auf der
Vorgabe einer konstanten Verdünnungsrate D für
einen kontinuierlichen Prozess (. Abb. 3.9). Diese
wird technisch dadurch realisiert, dass beispielsweise
das Gewicht des Bioreaktors kontinuierlich gemessen
wird und dadurch die dem Zulauf analoge Masse aus
dem Reaktor hinaus gepumpt wird. Alternativ dazu
kann auch versucht werden, das Bioreaktorvolumen
konstant zu halten, was eine spezielle Füllstandskont-
rolle verlangt. Hierbei ist zu beachten, dass durch die
eingebrachte Rührenergie und durch die im Reaktor
vorhandenen Gasblasen, das tatsächliche Flüssigvo-
lumen (Reaktionsvolumen) in einem Betriebspunkt
nur schwer ermittelbar sein kann.
Die chemostatische Betriebsweise ist bei einfa-
cher Sättigungskinetik für das limitierende Substrat
autostabil. Ist ein stabiler Arbeitspunkt erreicht und
wird das System kurzfristig aus diesem ausgelenkt
(etwa durch Prozessierung unerwarteter Messfehler
oder stochastische Schwankungen), so stellt sich nach
einer Anpassungsphase wieder der alte Arbeitspunkt
ein. Dieser Sachverhalt ist anschaulich in . Abb. 3.10
dargestellt. Hierzu wird die Bilanzgleichung für das
Substrat im Fließgleichgewicht (Gl. 3.17) mit dem Kon-
vektionsterm auf der linken Seite und dem Reak-
tionsterm auf der rechten Seite dargestellt:
 84 R. Takors und D. Weuster-Botz
. Abb. 3.9  Chemostat – Durch Vorgabe der
Verdünnungsrate stellen sich im Bioreaktor
Fließgleichgewichtskonzentrationen für das Substrat cS und
die Biomasse cX ein (cSF = 10 g L–1; µmax = 1 h–1; KS = 0,2 g
L–1; YXS,µ = 0,5 g g–1; mS = 0,02 g g–1 h–1). Anzumerken ist,
dass nur Verdünnungsraten <μmax – mS YXS,µ zu stabilen
Arbeitspunkten führen. Darüber hinaus wird sich im
Bioreaktor eine Substratkonzentration einstellen, die der des
Zulaufs cSF entspricht, da keine Verbraucher mehr vorhanden
sind
D ⋅ (cSF − cS) = cX ⋅ qS  Gl. 3.49
Bei Verwendung einer einfachen Sättigungskinetik
für das limitierende Substrat und hier zur Vereinfa-
chung ohne Berücksichtigung des Erhaltungsstoff-
wechsels ergibt sich mit cX = YXS,µ · (cSF – cS):
µmax ⋅ cS
D ⋅ (cSF − cS) = ⋅ (cSF − cS)  Gl. 3.50
( KS + cS)
Durch Variation der Verdünnungsrate ändert sich
die Steigung des Konvektionsterms. Gl. 3.50 ist im
Schnittpunkt von Konvektions- und Reaktionsterm
erfüllt.
Erfolgt beispielsweise eine kurzfristige Erhöhung
der Verdünnungsrate über den stabilen Arbeitspunk-
tes D* hinaus, so wird dem Bioreaktor mehr Substrat
über den Zulauf zugeführt, als durch die Zellen ver-
braucht wird. Die limitierende Substratkonzentra-
tion steigt in der Folge an. Damit steigt entsprechend
dem Reaktionsterm auch die Substratverbrauchsrate
. Abb. 3.10  Stabilität von Arbeitspunkten im
chemostatischen Betrieb (cSF = 10 g L–1; µmax = 1 h–1;
KS = 0,2 g L–1). Kurzfristige Erhöhungen oder Reduktionen
der Verdünnungsrate oder der Substratkonzentrationen
an einem stabilen Arbeitspunkt (hier D* = 0,7 h–1) führen
nach einer Adaptation wieder zurück an den ursprünglichen
Arbeitspunkt. Zur Erläuterung siehe Text
an (. Abb. 3.10). Der Substratverbrauch im Reaktor
nimmt zu, weshalb die Substratkonzentration wieder
auf diejenige im alten Arbeitspunkt zurückfällt.
Analog verhält es sich bei kurzfristiger Reduktion
der Verdünnungsrate. Durch die Verringerung der
Substratzufuhr fällt die limitierende Substratkonzen-
tration ab und damit entsprechend dem Reaktions-
term auch der Substratverbrauch im Reaktor. Durch
den verringerten Substratverbrauch steigt die Subst-
ratkonzentration im Reaktor wieder an, bis der stabile
Arbeitspunkt vor Auslenkung wieder erreicht ist.
Zu beachten ist, dass dauerhafte Veränderungen
der Verdünnungsraten (die Steigung des Konvek-
tionsterms ändert sich, . Abb. 3.10) dazu führen, dass
sich neue Arbeitspunkte einstellen (neue Schnitt-
punkte mit dem Reaktionsterm).
Diese anschauliche Beschreibung der autosta-
bilen Prozessregelung kann auch systemtheoretisch
durch eine Stabilitätsanalyse nach Lyapunov unter-
mauert werden. Danach ist ein System genau dann
stabil, wenn alle Eigenwerte der charakteristischen
Gleichung eines (linearisierten) Systems am Arbeits-
punkt negative Realanteile besitzen. Für kontinuier-
lich betriebene Bioreaktoren ist dies genau dann der
Fall wenn
Kapitel 3 · Prozessmodelle
85 3

∂µ*
>0  Gl. 3.51
∂cS

d. h. wenn eine Erhöhung der Substratkonzentra-

tion am Arbeitspunkt (*) dazu führt, dass auch die
Wachstumsrate der Zellen μ* ansteigt. Für die ein-
fache Sättigungskinetik ist diese Bedingung offen-
sichtlich erfüllt:

∂µ* KS
= µmax 2
>0  Gl. 3.52
∂cS (cS + KS)
Das System ist demnach autostabil.
Anders kann aber wiederum keine generelle
Autostabilität für Wachstumskinetiken erwartet
werden, die eine Substratüberschussinhibierung
aufweisen. Ist die höchste Wachstumsrate µopt über-
schritten, was bei Substratkonzentrationen cS > cS,opt
der Fall ist (7 Abschn. 2.3.2), gilt offenkundig
∂µ*
<0  Gl. 3.53
∂cS
da eine weitere Steigerung der Substratkonzentration
zur Abnahme des Zellwachstums führt (7 Kap. 2).
Solche Systeme können innerhalb dieser kritischen
Substratbereiche nicht chemostatisch stabil einge-
regelt werden.
Durch Auftragung von Konvektionsterm und
Reaktionsterm als Funktion der Substratkonzent-
ration im kontinuierlich betriebenen idealen Rühr-
kesselreaktor im Fließgleichgewicht bei Vorliegen
einer Substratüberschussinhibierung kann dies ver-
anschaulicht werden (. Abb. 3.11). Bei vorgegebe-
ner Verdünnungsrate im Betriebspunkt (hier D* =
0,5 h–1) hat der Konvektionsterm drei Schnittpunkte
mit dem Reaktionsterm. Die Schnittpunkte α und γ
(Auswaschpunkt) sind stabil, während der Schnitt-
punkt β instabil ist. Kommt es hier zu stochastischen
Abweichungen von der Substratkonzentration im
Bioreaktor, erfolgt eine negative Verstärkung: Steigt
die Substratkonzentration im Reaktor leicht an, sinkt
aufgrund der Substratüberschussinhibierung der
Reaktionsterm weiter ab bis der stabile unerwünschte
Arbeitspunkt γ (Auswaschpunkt) erreicht ist. Sinkt
die Substratkonzentration bei β leicht ab, erhöht sich
der Reaktionsterm und die Substratkonzentration
nimmt weiter ab, bis der gewünschte Arbeitspunkt α
. Abb. 3.11  Stabilität von Arbeitspunkten
im chemostatischen Betrieb bei Vorliegen einer
Substratüberschussinhibierung (cSF = 10 g L–1; µmax =
1 h–1; KS = 0,2 g L–1; KI = 5 g L–1). Kurzfristige Erhöhungen
oder Reduktionen der Verdünnungsrate oder der
Substratkonzentrationen an einem stabilen Arbeitspunkt
(hier D* = 0,5 h–1) führen nach einer Adaptation wieder zurück
an den stabilen Arbeitspunkt α. Dies ist nicht der Fall im
instabilen Arbeitspunkt β. Nur im grau schraffierten Bereich
sind stabile Arbeitspunkte möglich. Zur Erläuterung siehe Text
erreicht ist. Bei dieser Auftragung von Reaktionsterm
und Konvektionsterm über der Substratkonzentra-
tion im Bioreaktor im Fließgleichgewicht wird auch
deutlich, dass nur bei hohen Umsätzen (cS ≤ cS,opt)
stabile Arbeitspunkte bei Vorliegen einer Substrat-
überschussinhibierung möglich sind.
z Turbidostat
Der turbidostatische Betrieb verwendet die Konzen-
tration der Biomasse – beispielsweise erfasst über die
on-line Messung der Trübung in der Suspension –
als Regelgröße. Offenkundig ist damit insbesondere
der Bereich der Durchflussrate nahe dem Auswasch-
punkt (engl. wash-out) gut einstellbar. Gerade dieser
Bereich wäre für eine chemostatische Fahrweise nur
schwer zugänglich, da kleine Schwankungen in der
Durchflussrate schnell zum unerwünschten Aus-
waschen führen würden. Auch Betriebspunkte, die
sich bei Vorliegen einer Substratüberschussinhibie-
rung im Chemostaten nicht stabil einstellen lassen,
können prinzipiell mit Hilfe eines Turbidostaten
eingeregelt werden (. Abb. 3.12). Allerdings ist der
 86 R. Takors und D. Weuster-Botz

z Nutristat
In Analogie zum Turbidostat funktioniert auch die
nutristatische Regelung. Anstelle des Trübungssig-
nals wird allerdings hier die aktuelle Substratkonzen-
tration als Regelgröße verwendet (. Abb. 3.13). Für
einen funktionierenden, geschlossenen Regelkreis ist
3 auch in dieser Anordnung ein Schätzer notwendig,
der die aktuelle Substratverbrauchsrate aus Werten
der Vergangenheit ermittelt. Zu beachten ist, dass –
anders als bei der Trübungsmessung – das Substrat-
signal in der Regel zwar auch on-line erfassbar ist,
aber nicht in-situ gemessen werden kann. Proben
werden hierzu über Probenahmesonden dem Biore-
aktor automatisiert entnommen und einem geeigne-
ten Analysator zur automatisierten at-line Messung
zugeführt. Übliche Messfrequenzen für solche auto-
matisierten at-line Analysen, beispielsweise mit Hilfe
. Abb. 3.12  Turbidostat – Durch Regelung der von enzymatischen Messungen oder HPLC, liegen
Konzentration an Biomasse ist die Einstellung von zwei bei einer Abtastzeit von 3–15 Minuten und Tot-
unterschiedlichen Arbeitspunkten D* für den kontinuierlichen zeiten (Zeit von der Probenahme bis zum Vorlie-
Betrieb möglich (cSF = 10 g L–1; µmax = 1 h–1; KS = 0,2 g L–1; KI =
gen des Analysenwerts) von einigen Minuten. Dem
5 g L–1; YXS,µ = 0,5 g g–1; mS = 0,02 g g–1 h–1). Zur Erläuterung
siehe Text Schätzalgorithmus kommt daher die erschwerende
Aufgabe zu, Substratverbräuche bei relativ geringer
turbidostatische Betrieb für einen weiten Bereich
mittlerer Durchflussraten nicht anwendbar, da die
δc
Sensitivität der Regelgröße x nur sehr gering ist
δD
(. Abb. 3.12, grau hinterlegter Bereich).
Das Grundprinzip der Regelung besteht darin,
eine Sollgröße für die Trübung (= Konzentration der
Biomasse) vorzugeben. Diese wird durch Variation
der Zuflussrate (und damit der Zugabe an Substra-
ten) in einem geschlossenen Regelkreis eingestellt.
Das aktuelle Trübungssignal wird einem ‚Beobach-
ter‘ übergeben, der aus der Kenntnis der zurücklie-
genden Einstellungen der Zuflussrate eine aktuelle
Wachstumsrate und damit eine aktuelle Substrat-
verbrauchsrate schätzt. Diese Größen werden für die
Parametrisierung des Regeleingriffs zur Einstellung
des gewünschten Arbeitspunktes im nächsten Zeit-
intervall verwendet (7 Kap. 8). Wenn das limitierende
Substrat auch für den Erhaltungsstoffwechsel benö-
tigt wird, gibt es bei Vorgabe eines Sollwerts für die . Abb. 3.13  Nutristat – Durch Regelung
Trübung (Biotrockenmassekonzentration) allerdings der Substratkonzentration im kontinuierlich
betriebenen Rührkesselreaktor ist die Einstellung von
beim Turbidostaten zwei mögliche Betriebspunkte
beliebigen Arbeitspunkten D* auch bei Vorliegen
(. Abb. 3.12). Der turbidostatische Betrieb eines kon- einer Substratüberschussinhibierung möglich (cSF = 10 g
tinuierlich betriebenen Rührkesselreaktors ist daher L–1; µmax = 1 h–1; KS = 0,2 g L–1; KI = 5 g L–1; YXS,µ = 0,5 g g–1;
nur eingeschränkt möglich. mS = 0,02 g g-1 h–1). Zur Erläuterung siehe Text
Kapitel 3 · Prozessmodelle
Messfrequenz und zeitverzögert vorliegenden Mes-
sungen ausreichend genau zu schätzen (7 Kap. 8).
Da die Substratkonzentration unmittelbar als
Regelgröße verwendet wird, eignet sich die nutristati-
sche Prozessführung besonders gut, um bei Vorliegen
einer Substratüberschussinhibierung auch Betriebs-
punkte oberhalb der kritischen Substratkonzentration
cS,opt in kontinuierlichen Prozessen sicher einregeln
zu können (. Abb. 3.13). Auch treten nicht wie beim
Turbidostaten zwei mögliche Betriebspunkte auf.
3.4 Sauerstoffeintrag
3.4.1 Stofftransportmodelle
Zu Beginn der Entwicklung eines neuen Bioprozesses
sollte die Frage beantwortet werden, ob der Prozess
aerob oder anaerob betrieben werden soll. Letzte-
res bietet den Vorteil, den apparativen Aufwand
für Sauerstoffeintrag und Kühlung zu minimieren.
Dagegen offerieren aerobe Prozesse den inhärenten
Vorteil, dass für die metabolische Umsetzung des
Substrates in das Zielprodukt mehr Energie in Form
von ATP zur Verfügung steht [10]. Unter realisti-
schen Bedingungen, das bedeutet unter Annahme
eines P/O Verhältnisses4 von 1,1), stehen beispiels-
weise E. coli etwa 15 ATP pro umgesetzter Glucose
aerob zur Verfügung, während anaerob nur 2 ATP
netto in der Glykolyse gebildet werden.
Wird ein aerober Prozess angestrebt, kommt dem
optimalen Sauerstoffeintrag eine besondere Bedeu-
tung zu. . Abb. 3.10 skizziert den Weg, den Sauerstoff
aus einer Blase über die Lösung zu den Zellen bzw.
einem Zellverband zurücklegen muss.
Üblicherweise wird die Sauerstoff-enthaltende
Zuluft dem Prozess über geeignete Begasungsorgane
steril zugeführt. Großtechnisch können Hitzeinak-
tivierung nach Kompression der Zuluft oder Filter
für die Sterilisation eingesetzt werden. In Laborre-
aktoren werden häufig Zuluftfilter verwendet. Der
Aufbau und die Geometrie von Begasungsorganen
sind sehr unterschiedlich. Im Wesentlichen verfolgen
4 P/O Verhältnis ist die Fähigkeit einer Zelle unter aeroben
Bedingungen über die Atmungskette ATP durch Oxida-
tion von NADH bzw. FADH herzustellen.
87 3
sie alle das Ziel, Blasen mit möglichst großer, defi-
nierter Oberfläche im Bioreaktor zu erzeugen. Meist
sind entsprechende Begasungsorgane nahe dem
Rührwerk angebracht, um mit Hilfe der dort lokal
eingebrachten hohen Rührenergie kleine Blasengrö-
ßen zu erzeugen und zu dispergieren.
Für die Modellierung des mehr-phasigen O2-
-Transports wurde bereits 1923 durch Lewis und
Whitman [15, 4] das Zwei-Film-Modell formuliert.
Es nimmt an, dass beiderseits einer Phasengrenzflä-
che zwischen Blasen und Flüssigkeit eine laminare
Grenzschicht existiert, in der der Stofftransport dif-
fusiv geschieht. Weiter entfernt von der Grenzfläche
werden der Partialdruck po2, g bzw. die Gelöstsau-
erstoffkonzentration cO2,L erreicht. An der Grenz-
fläche selbst stehen der Partialdruck von Sauerstoff
in der Gasphase und dessen gelöste Konzentration in
der flüssigen Phase in einem Gleichgewicht (Index *).
Das Verhältnis zwischen Konzentration in der flüssi-
gen Phase und dem dazugehörigen Gleichgewichts-
Partialdruck in der Gasphase wird durch die Henry-
Konstante HO2 beschrieben.
Es kann gezeigt werden ( 7 Kap. 5), dass die
Sauerstoffeintragsrate
Sauerstoffeintragsrate OTR (oxygen transfer rate)
wie folgt beschrieben werden kann:
nO2, L A *
OTR = = kL ⋅ ⋅ (c O2, L − cO2, L )  Gl. 3.54
VL VL
Hier bezeichnet c*O2,L  die Sauerstoffkonzentration in
der Flüssigphase, die mit der Gasphase im Gleichge-
wicht steht und  cO2,L die Konzentration an gelöstem
Sauerstoff in der Kernströmung der Flüssigkeit. Das
Produkt kL · A/VL wird zu dem volumetrischen Stoff-
transportkoeffizienten kLa vereinigt. Dieser besteht
somit aus dem Stofftransportkoeffizienten kL und der
volumenspezifischen Stoffaustauschoberfläche aller
Blasen a. Erhöht sich beispielsweise die Viskosität des
Mediums während der Kultivierung, so verschlechtert
sich kL was zu einer Verringerung der Sauerstoffein-
tragsrate OTR führt. Wird die Begasungsrate erhöht,
steigt a und damit der kLa, was zu einer Steigerung
der Sauerstoffeintragsrate OTR führt. Eine Drucker-
höhung wirkt sich über den Henry-Koeffizienten pro-
portional positiv auf c*O2,L und damit auf die Sauer-
stoffeintragsrate OTR aus.
 88 R. Takors und D. Weuster-Botz

Im Zwei-Film-Modell ist der kLa proportional überall implementierte Messgrößen. Bilanziert man
zum binären Diffusionskoeffizienten D L. Andere die Mengen an ein- und austretenden O2-Molenst-
Annahmen, wie beispielsweise die Penetrations- römen gemäß . Abb. 3.14, so folgt daraus Gl. 3.57, die
theorie von Higbie [3] oder die Oberflächenerneue- konstanten Druck p und Temperatur T annimmt:
rungstheorie von Danckwert [2], sehen die Propor-
tionalität von kLa ~ DL vor. Dies ergibt sich aus der nO2 = nO2,in − nO2,out =
3 Modelvorstellung, dass einzelne Volumenelemente Gl. 3.57
p 
an die Gas/Flüssig-Phasengrenzschicht antranspor- (
V ⋅Y
RT g,in O2,in
−Vg,out ⋅ YO2,out  )
tiert und dort instationär mit O2 beladen werden. So
führt die Penetrationstheorie zu der Aussage: Zu beachten ist, dass durch die Freisetzung an CO2
durch die Stoffwechselaktivität der Zellen der austre-
1 tende Molenstrom der Abluft deutlich über dem der
 P  4
  Zuluft liegt. Außerdem kann die Abluft auch Wasser
4 ⋅ DL  VL 
kLa = ⋅    Gl. 3.55 bis zur Sättigungsgrenze enthalten. Letzteres wird
π  v  während des Durchgangs durch die Flüssigkeit von
 
  dort aufgenommen. Zur akkuraten Berechnung der
Stoffströme wird die Inertgas-komponente N25 wie
mit P als der eingebrachten Leistung pro Reaktions- folgt bilanziert:
volumen VL und v als kinematischer Viskosität.
Gl. 3.55 berücksichtigt den lokalen Energieeintrag V Y
n N,in = n N2,out ⇒  g,in = N2,out  Gl. 3.58
und findet daher sehr häufig Anwendung in com- Vg,out YN2,in
putational fluid dynamics Ansätzen (CFD), die die
räumlich aufgelöste Beschreibung von Stofftransport Wird ferner angenommen, dass Zu- und Abluft
und Hydrodynamik in Reaktoren zum Ziel haben. jeweils aus 3-Komponenten bestehen (N2, O2 und
Zur einfachen technischen Anwendung wird CO2), so kann Gl. 3.57 umformuliert werden zu:
allerdings meist der integrale kLa für einen Bioreak-
tor bestimmt. Van’t Riet veröffentlichte 1979 einen
n O2 = n O2,in − n O2,out =
Exponentialansatz, der offenkundig durch Gl. 3.55
motiviert ist [13]. pVg,in  1 − YO2,in − YCO2,in 
YO2,in − ⋅ YO2,out 
RT  1 − YO2,out − YCO2,out 
 P α
kLa = C ⋅   ⋅ ulβ  Gl. 3.56
 Gl. 3.59
VL 

Darin wird mit P die eingebrachte Leistung pro Reak- Üblicherweise werden die Sauerstofftransferraten
tionsvolumen VL berücksichtigt neben der Gas- auf das Reaktionsvolumen bezogen, was zu der For-
leerrohrgeschwindikeit uL. C, α und β sind empi- mulierung der Sauerstoffaufnahmerate OUR (oxygen
risch ermittelte Parameter, die in Abhängigkeit von uptake rate) führt:
der Viskosität und dem Koaleszenzverhalten des
Mediums sowie der Rührerbauart und -geometrie nO2
= OUR =
gewählt werden müssen. Beispiele sind in Takors VL
(2014) aufgeführt [11].
Vg,in  1 − YO2,in − YCO2,in 
YO2,in − ⋅ YO2,out 
VLVm  1 − YO2,out − YCO2,out 
3.4.2 Bilanzierung von Zu- und Abluft  Gl. 3.60

Für die Überwachung von Bioreaktoren sind die

Kenntnis von O2- und CO2-Gehalten (Volumenan- 5 Für mikrobielle Umsetzungen ist N2 inert, da Stickstoff
teile YO2 bzw. YCO2) in der Abluft wichtige und meist nur aktiviert z. B. in Form von NH4+ aufgenommen wird.
Kapitel 3 · Prozessmodelle
89 3
. Abb. 3.14  O2-Bilanzierung in
Zu- und Abluft eines Bioreaktors. Y
bezeichnet die Volumenanteile der
angezeigten Komponenten in der Zu-
( Vg,in ) bzw. in der Abluft ( Vg,out ). Die
gestrichelte Linie stellt den Bilanzraum
für die Gasphase dar

*
Darin wurde das Molvolumen Vm zur Vereinfachung das mittlere treibende Konzentrationsgefälle CO , L
2
verwendet. – CO , L über das logarithmische Konzentrationsge-
2
Wird ein Bioreaktor mit der Biomassekonzent- fälle abschätzbar:
ration cX betrieben und besitzen die Zellen die spe-
zifische Sauerstoffaufnahmerate qO2, so kann Gl. 3.60 H O2 ⋅ ( pO2,in − pO2,out )
*
cO 2, L − cO2, L = 
gleichgesetzt werden mit Gl. 3.42. Ebenfalls kann mit H ⋅p − cO2, L Gl. 3.63
ln O2 O2,in
Hilfe von Gl. 3.42 und Gl. 3.54 der kLa aus Abgasmes- H O2 ⋅ pO2,out − cO2, L
sungen und Bestimmung der Gelöstsauerstoffkon-
zentration CO , L bestimmt werden, wenn die Sätti-
2
gungskonzentration C *O , L bekannt ist. 3.4.3 CO2 Transfer
2

OUR Sowohl im Zitronensäurestoffwechsel wie auch im

kLa =  Gl. 3.61
(cO* 2,L − cO2,L )
Hierzu müsste der Sauerstoffpartialdruck in jeder
Gasblase im Bioreaktor bekannt sein. Für den Fall,
dass neben der Flüssigphase auch die Gasphase im
homogen durchmischten Bioreaktor als ideal rück-
vermischt betrachtet werden kann, ist die Sättigungs-
konzentration C *O , L mit Hilfe des Henry-Geset-
2
zes einfach über die Abgaszusammensetzung zu
bestimmen.
Pentose-Phosphat-Weg wird durch die Metabolisie-
rung von Glucose CO2 über Decarboxylase-Reaktio-
nen freigesetzt. Diese Anteile können leicht 30–50 %
der gesamten Kohlenstoffumsetzung in aeroben Fer-
mentationen betragen. Daher ist die Erfassung ent-
sprechender Signale und Molenströme zur Prozess-
überwachung von großer Bedeutung.
In Analogie zur Sauerstoffaufnahme (Gl. 3.60)
kann die CO2-Emissionsrate CER (carbon dioxide
emission rate) bestimmt werden.

*
cO 2, L = H O2 ⋅ pO2,out  Gl. 3.62 Vg,in
CER = −
VLVm
Für den Fall, dass die Gasphase als ideale Rohrströ-
 1− YO2,in − YCO2,in 
mung vom Boden des Bioreaktors bis zur Gasfrei- 
YCO2,in − 1− Y ⋅ YCO2,out 
setzung an der Flüssigkeitsoberfläche betrachtet  O2,out − YCO2,out 

werden kann, während die Flüssigphase weiterhin
 Gl. 3.64
als homogen durchmischt angenommen wird, ist
 90 R. Takors und D. Weuster-Botz
Das Verhältnis von CER und OUR wird Respirations-
quotient RQ genannt:
CER
RQ =  Gl. 3.65
OUR
Für exponentiell wachsende Zellen ohne Nebenpro-
3 duktbildung ist bei reiner Sauerstoffatmung und bei-
spielsweise Glucose als Kohlenstoffquelle der RQ = 1.
Ist dagegen der Metabolismus zur Herstellung eines
niedermolekularen Produktes molekularbiologisch
verändert, so kann sich das auch auf den RQ auswir-
ken. Stöchiometrische Analysen des Stoffwechsels
sollten im Vorfeld durchgeführt werden, um den RQ
für eine optimale Produktbildung zu ermitteln und
diese Größe als on-line Qualitätssignal zur Bewer-
tung der Güte des Prozesses zu nutzen.
Prinzipiell sollte beachtet werden, dass die For-
mulierung von Stofftransportmodellen für CO2
aufwendiger als für O2 ist. Dies liegt in der Tatsa-
che begründet, dass CO2 mit Kohlensäure (H2CO3),
Bicarbonat (HCO 3– ) und Carbonat (CO 32– ) in
Wasser ein Dissoziationsgleichgewicht eingeht
(„Kohlensäuregleichgewicht“). Details sind in Blom-
bach und Takors dargestellt [1].
3.5 Rohrreaktor
Bei der Verwendung von Zellen oder Enzymen als
Biokatalysatoren kann es vorteilhaft sein, einen
Rohrreaktor anstelle eines Rührreaktors einzusetzen.
Die Umsetzung des Substrates erfolgt dann entlang
des Rohres in axialer Richtung, was zu einem konti-
nuierlichen Betrieb mit hohen Produktaustrittskon-
zentrationen führen kann. Häufig werden dazu auch
immobilisierte Biokatalysatoren eingesetzt.
Im Rohrreaktor kommt es primär zur Ausbil-
dung von Konzentrationsgradienten in axialer Rich-
tung. . Abb. 3.15 zeigt schematisch einen kleinen
Ausschnitt. Vereinfachend wird ideale Durchmi-
schung in radialer Richtung angenommen.
Bilanziert man die Komponente i in dem Volu-
menelementdVL = A · dz,so muss deren Massen-
änderung aufgrund der volumenspezifischen
Reaktionsrate ri sowie durch alle konvektiven und
diffusiven Stofftransportströme über die Bilanz-
grenzen erfolgen. Das heißt, eintretende Ströme
an der Länge z werden positiv formuliert, während
die austretenden Stoffströme an z + dz negativ
˜c L
X] ' L ā
/ ] G] ˜] ] G]
G] UL
] $
˜FL
X] ' L ā
˜] ]
. Abb. 3.15  Bilanzierung eines Volumenelementes
im Rohrreaktor. Die Querschnittsfläche A wird auf der
Höhe z durch konvektiven Transport mit der mittleren
Strömungsgeschwindigkeit uz durchströmt. Gleichzeitig
findet ein diffusiver Transport, charakterisiert mit dem binären
Diffusionskoeffizienten Di, über die Querschnittsfläche A statt.
Analog erfolgt der Stoffaustritt auf der Höhe z + dz. Innerhalb
des Bilanzelementes reagiert die Komponente mit ri
berücksichtigt werden. Es wird angenommen, dass
die mittlere Strömungsgeschwindigkeit uz und der
binäre Diffusionskoeffizient der Komponente Di
nicht von der Länge z abhängen und isotherme,
isobare und isochore Reaktionsbedingungen herr-
schen. Zu beachten ist, dass in diesem Fall die Dif-
fusion gleichgerichtet zur Strömung für die Bilan-
zierung berücksichtigt wurde (.   Abb. 3.15), die
Konzentration der betrachteten Komponente ci
also in Strömungsrichtung abnimmt (Substratkon-
zentrationen). Eine entgegengerichtete Annahme,
also die Zunahme der betrachteten Komponente ci
in Strömungsrichtung (Produktkonzentrationen)
führt zu einer Vorzeichenumkehrung für den Dif-
fusionsterm. Es gilt:
dmi d (VL ⋅ ci ) ∂c
= = u z ⋅ A ⋅ ci |z + A ⋅ Di ⋅ i |z
dt dt ∂z
∂ci
−u z ⋅ A ⋅ ci |z+dz −A ⋅ Di ⋅ | +r ⋅ dVL
∂z z+dz i
Gl. 3.66
Kapitel 3 · Prozessmodelle
91 3
Durch Berücksichtigung einer Taylor-Abschätzung uz ⋅ L
können folgende Terme abgeleitet werden: Boi =  Gl. 3.74
Di

∂ci Ist Bo ≫ 100, kann von einer idealen Pfropfenströ-

ci ( z + dz ) = ci ( z ) + ⋅ dz  Gl. 3.67
∂z mung im Rohrreaktor ausgegangen werden, d. h. der
Einfluss der Diffusion6 gegenüber der Konvektion ist
u z ⋅ A ⋅ ci |z −u z ⋅ A ⋅ ci |z +dz vernachlässigbar (siehe auch 7 Abschn. 3.8.3).
∂ci ∂c Durch Verwendung der Bodensteinzahl und
= −A ⋅ u z ⋅ ⋅ dz = −dVL ⋅ u z ⋅ i  Gl. 3.68
∂z ∂z nach Einführung der dimensionslosen Länge z = z /L
wird Gl. 3.73 im Fließgleichgewicht (steady-state) zu
∂ci ∂c
A ⋅ Di ⋅ | −A ⋅ Di ⋅ i |z +dz u z ∂ci Di ∂ 2ci
∂z z ∂z 0=− ⋅ − ⋅ +r  Gl. 3.75
L ∂z L2 ∂ ~z 2 i
∂ 2ci ∂ 2c
= −A ⋅ Di ⋅ 2 ⋅ dz = −dVL ⋅ Di ⋅ 2i  Gl. 3.69
∂z ∂z bzw. zu:
∂ci 1 ∂ 2ci L
Somit vereinfacht sich Gl. 3.66 zu: 0=− − ⋅ + r Gl. 3.76
∂z Bo ∂z 2 u z i
d (VL ⋅ ci ) ∂c Für hohen Bo Zahlen kann Gl. 3.76 daher vereinfa-
= −dVL ⋅ u z ⋅ i
dt ∂z chend geschrieben werden als
∂ 2ci ∂ci
−dVL ⋅ Di ⋅ 2 + ri ⋅ dVL  Gl. 3.70 L
= r Gl. 3.77
∂z ∂z u z i
Wird weiterhin beachtet, dass dV L/dt = 0, kann Das Konzentrationsprofil der Komponente ci wird
Gl. 3.70 in die endgültige Form überführt werden zu: somit allein von der Reaktionsrate ri und der mittle-
ren Strömungsgeschwindigkeit uz determiniert.
dci ∂c ∂ 2c
= −u z ⋅ i − Di ⋅ 2i + ri  Gl. 3.71
dt ∂z ∂z
3.6 Blasensäule und Airlift Reaktor
Dies entspricht der Formulierung für die allgemeine
Stoffbilanz in z-Richtung in der Form: Sollen Bioreaktoren aerob mit großen Reaktionsvo-
lumina >300–500 m³ betrieben werden, so werden
dci die Anforderungen zur technischen Realisierung
+ ∇ z (uiz ⋅ ci ) = ri  Gl. 3.72
dt des Sauerstofftransfers, der ausreichenden Durch-
mischung und des Wärmetransportes sehr hoch.
Zu beachten ist, dass uiz die individuelle Geschwin- Daraus resultieren hohe wirtschaftliche Aufwen-
digkeit der Komponente i in z-Richtung angibt. Diese dungen für die Erstinvestitionen wie aber auch für
ergibt sich aus der Überlagerung der konvektiven den Betrieb der Anlage. Alternativ kann in solchen
und der diffusiven Geschwindigkeitsbeiträge [11]. Fällen ein Blasensäulen- beziehungsweise Gaslift-
Befindet sich ein Rohrreaktor im Fließgleichge- Reaktor eingesetzt werden (bei aeroben Prozessen
wicht (steady-state) gilt dci/dt = 0. Zeitliche Ände- wird oftmals Gaslift durch Airlift ersetzt). Deren
rungen des Konzentrationsprofils finden nicht prinzipieller Aufbau ist in 7Abschn. 6.2 gezeigt.
mehr statt. Wohl aber ändert sich die Konzentration
entlang der Lauflänge gemäß der Beziehung:
6 Im realen Betrieb kommt es bei turbulenter Strömung zur
∂ci ∂ 2c
uz ⋅ + Di ⋅ 2i = ri  Gl. 3.73 Ausprägung von lokalen, mikroskopischen Wirbeln, soge-
∂z ∂z nannten micro eddies. Diese überlagern die idealisierten
konvektiven und diffusiven Stoffströme. Der Vorgang
Häufig wird zur Beschreibung des Verhältnisses zwi- wird als Dispersion bezeichnet und statt des binären Dif-
schen Konvektion und Diffusion die dimensionslose fusionskoeffizienten (Stoffkenngröße) muss der Disper-
Bodenstein-Zahl Bo eingesetzt. sionskoeffizient (Prozesskenngröße) eingesetzt werden.
 92 R. Takors und D. Weuster-Botz
3 ˜FL
X] ' L ā
/ ] G] ˜] ] G]
G] G9/ UL N/D G9J
] $
˜FL
X] 'L ā
˜] ] sinnvoll sein, den Biokatalysator – Zellen oder iso-
. Abb. 3.16  Bilanzierung eines idealisierten
Volumenelementes bestehend aus flüssiger (dVL) und
gasförmiger (dVg) Phase in der Blasensäule. Zwischen
gasförmiger und flüssiger Phase findet der O2-Transport
über die Höhe dz statt. Die Querschnittsfläche A wird auf
der Höhe z durch konvektiven Transport mit der mittleren
Strömungsgeschwindigkeit uz und durch den diffusiven
Transport mit der Diffusionskonstanten DO2 durchströmt.
Analog erfolgt der Stoffaustritt auf der Höhe z+ dz. Innerhalb
des Bilanzelementes wird O2 mit rO2 verbraucht
Charakteristisch ist, dass – in Erweiterung zu den
Ausführungen in 7 Abschn. 3.5 – die Bilanzierung
über ein Zwei-Phasen-System bestehend aus Gas-
phase (dispergierte Gasblasen) und Flüssigphase7
durchgeführt werden muss. Der schematische
Aufbau ist in . Abb. 3.16 gezeigt.
Wird der O2-Gehalt im Volumenelement dVL
nach . Abb. 3.15 bilanziert, so kommt zu dem Ver-
brauchsterm ri der Sauerstoffimport aus der Gas-
phase hinzu. Das geschieht über die Phasengrenze
dz. Die spezifische Sauerstoffaustausch-Oberfläche
a ist in der zweidimensionalen Darstellung a = dz/
dVL. Unter Berücksichtigung von Gl. 3.71 folgt daher:
dcO2 ∂c ∂ 2cO2
= −u z ⋅ O2 − DO2 ⋅
dt ∂z ∂z 2
−rO2 + kLa ⋅ (cO  Gl. 3.78
O2 )
* −c
2 =
7 Zur Vereinfachung wird die Biomasse zur flüssigen Phase
hinzugerechnet.
Unter Verwendung von Gl. 3.78 können somit Kon-
zentrationsprofile für Gelöstsauerstoff – einer
wesentlichen Einflussgröße dieser Reaktortypen –
berechnet werden. Für die Konzentrationsprofile der
anderen Komponenten gilt weiterhin Gl. 3.72.
3.7 Diffusion in Zell- und
Enzymschichten
Für einige biotechnische Anwendungen kann es
lierte Enzyme – zu immobilisieren. Dadurch wird
die Verweilzeit des Mediums von der des Katalysa-
tors entkoppelt (siehe 7 Abschn. 3.3.3), was schluss-
endlich zur erhöhten Produktivität des Produktions-
prozesses führt.
Technisch werden solche Ansätze beispiels-
weise durch Immobilisierung des Biokatalysators auf
(beziehungsweise in porösen) kugelförmigen Trä-
germaterialien, röhrenartigen Membranstrukturen
oder planaren Flächen realisiert (. Abb. 3.17). Für
die Auslegung derartiger Prozesse ist das Verständ-
nis des Stofftransportes innerhalb des ‚Biofilms‘ von
großer Bedeutung. So können darauf basierend opti-
male Trägergeometrien und Betriebsweisen des Bio-
reaktors bestimmt werden.
Eine analoge Bedeutung kommt der Unter-
suchung des Stofftransports in Pilzfermentatio-
nen zu. Wachsen die Pilze zu Pellets heran (siehe
7 Abschn. 2.4), bilden Sie eine kugelförmige Struktur.
Durch diese muss der gelöste Sauerstoff im Idealfall
bis in den Kern diffundieren, um dort die innersten
Zellen zu versorgen. Derartige Modellierungsansätze
erfolgen in Analogie zur Beschreibung des Stofftrans-
ports in den oben beschriebenen Biofilmen.
Für die Ausprägung eines kugelförmigen Bio-
films nach . Abb. 3.17A lässt sich der Stofftrans-
port einer Komponente i durch eine kugelförmige
Schnittfläche A im steady-state beschreiben zu:
dmi d (VL ⋅ ci )
∂c
= A(r ) ⋅ Di ⋅ i r
dt dt ∂r
∂ci 
−A(r ) ⋅ Di ⋅ +r ⋅ dVL = 0  Gl. 3.79
∂r r +dr i
Kapitel 3 · Prozessmodelle
93 3
. Abb. 3.17  Schematische
Darstellung der Oberflächen im
Innern von Kugeln (A), Rohren (B)
und Platten (C) die diffusiv von einer GU U

Komponente ci von außen nach innen

GU
durchdrungen werden. Bilanziert wird G]
jeweils das Volumenelement A(r) ·
dr bzw. A · dz
D E F

Im Vergleich zu Gl. 3.66 wird ersichtlich, dass ∂ 2ci

Di = ri  Gl. 3.84
ausschließlich die Diffusion zum Stofftransport ∂z 2
berücksichtigt wird. Konvektive Terme wurden
wegen der angenommenen hohen Dichte des Bio- Die Gleichungen Gl. 3.82–3.84 geben somit die stationä-
films nicht beachtet. Der binäre Diffusionskoeffizi- ren Konzentrationsprofile einer Komponente i in einem
ent Di im Biofilm ist in der Regel von der Zelldichte Biofilm wieder, die sich aus der Überlagerung von dif-
des Biofilms abhängig und immer geringer als Di fusiven Antransport und verbrauchender Reaktion ri
in Wasser. ergeben. Zur Verdeutlichung dieser Wechselwirkung
Für die Betrachtung einer Kugel muss für A die wird häufig das Thiele-Modul Φ als dimensionslose
Oberfläche AKugel = 4πr2 eingesetzt werden. Für eine Kennzahl eingeführt. Sie kann verstanden werden als
röhrenartige Struktur der Länge L gilt analog ARohr
= 2πrL. Für die Kugel folgt daher: Verbrauch der Komponente
Φ=  Gl. 3.85
diffusiver Antransport

 ∂c ∂c 
−4π Di r 2 i |r −r 2 i |r +dr  = ri ⋅ 4πr 2dr Gl. 3.80 Am Beispiel eines kugelförmigen Biofilms wird die
 ∂r ∂r  Implementierung des Thiele-Moduls verdeutlicht.
Zunächst werden dimensionslose Variablen für den
Durch analoge Anwendung von Gl. 3.67 (für z = r) Radius r = r /R und c = c/c* mit R als äußerem
folgt daraus: Kugelradius und c* als Startkonzentration auf der
Kugeloberfläche eingeführt. Gl. 3.82 wird dadurch zu
∂  2 ∂ci 
Di r  dr = ri ⋅ r 2dr  Gl. 3.81
∂r  ∂r   2 c* ∂c * 2 
i + c ∂ ci 
Di  = r  Gl. 3.86
 r R ∂r
2 R 2 ∂r 2  i
bzw. nach Anwendung der Produktregel und Kürzen:
Wird angenommen, dass die Biokatalysatoren
 2 ∂c ∂ 2c  (Zellen oder Enzyme) die Komponente ci in Analo-
Di  i+ i= r  Gl. 3.82
 r ∂r ∂r 2  i gie zu einer Sättigungskinetik verbrauchen, gilt

Würde anstelle einer Kugel der Biofilm auf einem  2 c* ∂c * 2 

Di  i + c ∂ ci  
Rohr bilanziert (. Abb. 3.16B) folgt für Gl. 3.82 analog:  r R ∂r
2 R 2 ∂r 2 
 1 ∂c ∂ 2c  c* ⋅ ci
Di  i+ i= r  Gl. 3.83 = qi, max ⋅ ⋅c  Gl. 3.87
 r ∂r ∂r 2  i c* ⋅ ci + K S X,C

Für eine Platte ( .Abb. 3.16C ) gilt der einfache wobei cX,C die Biotrockenmassekonzentration im
Diffusionsansatz: Biofilm darstellt. Nach Umgruppierung folgt
 94 R. Takors und D. Weuster-Botz
2 ∂ci ∂ 2ci K ⋅c
+ = Φ2 ⋅ * S i  Gl. 3.88
r ∂r ∂r 2 c ⋅ ci + KS
Darin ist das Thiele-Modul8 definiert als:
qi, max ⋅ cX,C
3 Φ=R
Di ⋅ KS
 Gl. 3.89
Ein hoher Thiele-Modul gibt demnach einen hohen
Verbrauch der Komponente i im Vergleich zum dif-
fusiven Transport im Biofilm wieder. Geringe Zah-
lenwerte drücken aus, dass eine gute diffusive Ver-
sorgung im Biofilm zu erwarten ist.
Dieser Sachverhalt kann beispielsweise zur
Bewertung der Sauerstoffversorgung im Innern von
Pilzpellets herangezogen werden. In der Nomenklatur
der Gleichungen Gl. 3.88 und 3.89 entspricht i dann O2.
. Abb. 3.18 verdeutlicht schematisch die Abhängig-
keit des Verhältnisses zwischen wahrer Sauerstoff-
aufnahmerate OUR und maximal möglicher Sauer-
stoffaufnahmerate OURmax in Abhängigkeit von der
Begasungsrate. Bei geringem Thiele-Modul Φ führt
die Erhöhung der externen Begasungsrate zu einer
Steigerung der Sauerstoffaufnahmerate bis OURmax
erreicht ist. Dieser Wert kann trotz Erhöhung der
externen Begasungsrate nicht gesteigert werden, da

285 ĭ
D
285 PD[ QV
WH
LJ
HQ
G
 (ideale Rührkesselreaktoren) oder als ideale Rohr-
%HJDVXQJVUDWH
. Abb. 3.18  Verhältnis von aktueller und maximaler
Sauerstoffaufnahmerate OUR in Abhängigkeit von der
Begasungsrate und dem Thiele-Modul Φ
8 Alternativ wird in der Literatur diese Kennzahl auch als
Damköhler-Zahl II DaII bezeichnet.
die zelluläre Verbrauchsrate ihr Maximum erreicht
hat. Werden jedoch Szenarien betrachtet, die sich
durch erhöhte Thiele-Module Φ auszeichnen, müssen
höhere Begasungsraten eingestellt werden, um die
Sauerstoffaufnahmerate zu verbessern. Doch limi-
tiert bereits die interne Diffusion den O2-Transport so
stark, dass maximale Sauerstoffaufnahmeraten nicht
mehr erreicht werden können. Im Innern des Pellets
kommt nur ein kleiner Teil des von außen antrans-
portierten O2 an. Eine Steigerung der externen Bega-
sungsrate bringt keine Verbesserung der O2 Versor-
gungssituation im Innern des Zellverbandes.
In Erweiterung des Ansatzes wird häufig auch
der Wirkungsgrad oder Biokatalysatornutzungsgrad
η definiert als
v
η=  Gl. 3.90
v (ci,o )
Er gibt das Verhältnis an zwischen der beobach-
teten Transportgeschwindigkeit v des Substrates
an der Oberfläche des Biofilms und der maximal-
theoretischen Transportgeschwindigkeit bei kon-
stanter Konzentration c* im gesamten Biofilm. Bei
einem Wirkungsgrad η von 1,0 tritt damit keine dif-
fusive Stofftransportlimitierung im Biofilm auf. Bei
hohem Thiele-Modul Φ sinkt der Biokatalysatornut-
zungsgrad η. Der Zusammenhang zwischen beiden
Größen kann bei Vorliegen einer Sättigungskinetik
nur durch numerische Lösung der oben angegebenen
Differentialgleichungen im individuellen Fall erhal-
ten werden (siehe auch 7 Kap. 10).
3.8 Nicht-Ideale Bioreaktoren
Den unter 7 Abschn. 3.2, 3.5, 3.6 bilanzierten Bioreak-
toren war gemein, dass sie jeweils als ideal angenom-
men wurden, entweder als homogen durchmischt
reaktoren mit axialer Rückvermischung. Mit dem
Begriff ‚ideal‘ wird damit die Reaktoreigenschaft ver-
bunden, dass keine Totvolumina, Kurzschlussströ-
mungen oder interne Rezirkulationen existieren.
Totvolumina bezeichnen unvollständig vermischte
Anteile des Reaktionsvolumens, die beispielsweise
an oder in Ventileinbauten auftreten können. Kurz-
schlussströmungen sind dadurch charakterisiert,
Kapitel 3 · Prozessmodelle
95 3
ā F7UDFHU ā F7UDFHU ā F7UDFHU
9 9 9
ā
9D

ā
9E
9/D 9/D 9/D

D E F
F7UDFHU F7UDFHU F7UDFHU

9/W

0 0 0

. Abb. 3.19  Schematische Darstellung der Nicht-Idealität von Bioreaktoren am Beispiel eines kontinuierlich betriebenen
Rührreaktors. Analoge Mechanismen existieren für Rohrreaktoren, Blasensäulen oder Airlift-Reaktoren. a Ein mit dem
Volumenstrom V  durchströmter Reaktor besitzt das gesamte Reaktionsvolumen VL, was sich jedoch in den aktiven Anteil
VLa und das Totvolumen VLt aufteilt. b Ein Teil des eintretenden Volumenstroms Vb nimmt einen verkürzten Weg durch den
Bioreaktor (Kurzschlussströmung). c Im Innern des Bioreaktors können lokale, stabile Wirbel auftreten, die die Verweilzeit der
dort befindlichen Volumenelemente signifikant erhöhen

dass die Verweilzeit von Volumenelementen dieses
Stroms deutlich unter der mittleren Verweilzeit aller
Volumenelemente im Bioreaktor ist. Das Gegen-
stück dazu sind Rezirkulationen, also interne Wir-
belströme, die die Verweilzeit von Volumenele-
menten ‚künstlich‘ verlängern. Eine schematische
Übersicht ist in . Abb. 3.19 am Beispiel eines konti-
nuierlich betriebenen Rührkesselreaktors gegeben.
Für besonders interessierte Leser werden die Ausfüh-
rungen von Levenspiel empfohlen [5]. Diese verfol-
gen im Wesentlichen den Ansatz, nicht-ideal durch-
mischte Reaktoren in Verschaltungen mit ‚idealen‘
Reaktoren modellierungstechnisch zu überführen.
Die damit einhergehende eher grobkörnige Granu-
larität der Vorhersagen wird durch heutige Metho-
den der computational fluid dynamics (CFD) verbes-
sert. Sie eröffnen die Möglichkeit, Energieeinträge,
Geschwindigkeitsvektoren, Stofftransporte und auch
Kinetiken lokal zu simulieren (siehe beispielsweise
[8]). Eine Vorstellung dieser Ansätze würde jedoch
weit über den Rahmen dieses Buches hinausgehen.
Daher wird nachfolgend nur ein erster Einblick in
die Modellierung des nicht-idealen Reaktorverhal-
tens mittels Kompartimentierungsansätzen gegeben.
3.8.1 Charakterisierung der Nicht-
Idealität von Bioreaktoren
Um festzustellen, ob beziehungsweise inwieweit
nichtideales Verhalten eines Bioreaktors vorliegt,
sollten Markierungsstudien mit Markierungssubs-
tanzen (engl. tracer) durchgeführt werden. Dabei
wird die Markierung entweder als Puls (Dirac-Stoß)
oder als Sprungfunktion auf einen kontinuierlich
betriebenen Reaktor aufgegeben und die Antwort als
Funktion der Zeit am Ausgang des Bioreaktors auf-
genommen. Die so erfassten Antwortkurven bilden
die Grundlage für nachfolgende Modellierungsan-
sätze (siehe 7 Abschn. 3.8.2 und 3.8.3). Sie werden
als Verweilzeitfunktionen bezeichnet. Als Markie-
rungssubstanz können beispielsweise Salze einge-
setzt werden, die durch Leitfähigkeitsmessungen
im Bioreaktor in situ sehr schnell detektiert werden
können. Alternativ sind auch optische Messungen
nach Zugabe von Farbindikatoren möglich. Grund-
sätzlich dürfen hierbei nur Markierungssubstan-
zen verwendet werden, die unter den eingestellten
Bedingungen nicht reagieren oder in anderer Form
mit dem Reaktor oder Reaktorinhalt wechselwirken
 96 R. Takors und D. Weuster-Botz

. Abb. 3.20  Markierungssubs-

tanzen können in Form eines Pulses ( LQ J D E H $ XVJDEH
(oben) oder einer Stufenfunktion/
Sprungfunktion (unten) aufgegeben F 7UDFHU
werden. Durch das Verweilzeitver-
halten des kontinuierlich betriebenen 5HDNWRU
Bioreaktors werden Antwortsignale
3 erhalten, die sich von dem Verweilzeit- 9
ā 9/
verhalten idealer Bioreaktoren unter-
scheiden können. Diese Antwortkur-
ven sind die Verweilzeitfunktionen der
Markierungssubstanzen im Reaktor IJ W

können (wie beispielsweise Adsorption an Oberflä- Wird die Verweilzeitdichtefunktion E(t) integ-
chen). . Abb. 3.20 gibt Beispiele für Signalaufgabe riert, erhält man die Verweilzeitsummenfunktion
und -antworten. F(t)
Statistische Momente können zur Qualifizierung
des Reaktorverhaltens nach Aufgabe eines Dirac- ∞  Gl. 3.95
Impulses ausgerechnet werden. Das 0. statistische F( t ) = ∫ E (t ) ⋅ dt
0
Moment M0 gibt die Menge an aufgegebener Mar-
kierungssubstanz mTracer pro Volumenstrom V an, Sie kann alternativ für die Identifizierung von Reak-
M1 die mittlere Verweilzeit τ und M2 die Varianz der tormodellen eingesetzt werden. Allerdings zeigt die
Verweilzeit σ2. Es gilt im Einzelnen: Praxis, dass sich E(t) besser als Datensatz für die
Modellierung eignet [5].
∞ mTracer  Gl. 3.91 Die Verweilzeitdichtefunktion E(t) kann einfach
M0 = ∫ cTracer ⋅ dt = über die Aufgabe eines Dirac-Impulses und Messung
0 V
des Antwortsignals am Reaktorausgang bestimmt
werden:
∞

M1
∫
= 0
t ⋅ cTracer ⋅ dt
=τ  Gl. 3.92 cTracer (t ) = E (t )⋅ c0,Tracer ( Dirac)  Gl. 3.96
M0
Zur Messung der Verweilzeitsummenfunktion F(t)
∞ bietet sich die Aufgabe einer Sprungfunktion und
M2 =
∫0 t 2 ⋅ cTracer ⋅ dt
− τ 2 = σ 2  Gl. 3.93 Messung des Antwortsignals an. In diesem Fall gilt:
M0
cTracer (t ) = F (t )⋅ c0,Tracer ( Sprung )  Gl. 3.97
Aus der Verweilzeitfunktion cTracer(t) kann durch
Bezug auf M0 die Verweilzeitdichtefunktion bezie- Im Folgenden sollen die Funktionen Gl. 3.94 und
hungsweise das Verweilzeitspektrum E(t) ermittelt Gl. 3.95 für reale Beispiele angewendet werden. Geht
werden. man zunächst davon aus, dass ein idealer, kontinuier-
lich betriebener Rührkesselreaktor zum Zeitpunkt t
cTracer (t ) c (t ) =0 mit einer Tracer-Substanz markiert wird (Dirac-
E (t ) = = Tracer   Gl. 3.94
M0 mTracer / V Impuls), so lässt sich dessen Bilanzgleichung formu-
lieren zu:
Sie stellt eine Normierung der gemessenen Verweil-
dmTracer d (cTracer ⋅ VL ) dV
zeitfunktion auf eine idealisierte Konzentration c0- = = cTracer L +
dt dt dt
,Tracer dar. Diese ergäbe sich, wenn die Tracer-Menge
mTracer gleichverteilt im Volumenstrom V vorhan- dcTracer
VL = −cTracer ⋅ V
den wäre. dt
 Gl. 3.98
Kapitel 3 · Prozessmodelle
Dies führt bei einem konstanten Reaktionsvolumen
VL zu
dcTracer V
= − ⋅ cTracer 
dt VL
was nach Variablentrennung und Integration mit der
Ausgangskonzentration an Tracer c0,Tracer aufge-
löst zu
 V 
cTracer = c0,Tracer ⋅ exp − ⋅ t   Gl. 3.100
 VL 
wird.
Das heißt, die zu Beginn aufgegebene Tracerkon-
zentration c0,Tracer wird in einem idealen, kontinu-
ierlich durchflossenen Rührkesselreaktor analog zu
. Abb. 3.18 mit der Zeit exponentiell verdünnt.
Unter Verwendung der Definition für die Ver-
weilzeitdichtefunktion Gl. 3.94 lässt sich für diesen
Idealfall E(t) bestimmen zu
97 3
Da VLt < VL ist die Steilheit der Abklingkurve für ein
Totvolumen größer als im Idealfall. Details können
der . Abb. 3.20 entnommen werden. Anzumerken
Gl. 3.99 ist, dass Fall C angenähert durch die Gl. 3.103 und
3.104 ebenfalls beschrieben werden kann.
Zur Herleitung der Verweilzeitdichtefunktion
.
von Fall B (mit Kurzschlussströmung Vb ) erfolgt
zunächst eine Bilanz um den Bioreaktor mit dem
Ergebnis
V  V 
′
cTracer = a ⋅ c0,Tracer ⋅ exp − a ⋅ t  Gl. 3.105
V  VL 
.
Darin ist berücksichtigt, dass nur der Teil Va / V der
Markierungssubstanz im Bioreaktor zunächst ver-
bleibt. Aus der Massebilanz für den Tracer folgt:
′
cTracer ⋅Va =V ⋅ cTracer  Gl. 3.106
Daraus ergibt sich für die Formulierung von Ek(t) mit
der Tracer-Konzentration cTracer analog zu Gl. 3.101

 V   
Va2  V 
c0,Tracer ⋅ exp − ⋅ t  Ek (t ) =   
⋅ exp − ⋅ t  
a
 VL  V  V  Gl. 3.107
E (t ) = = ⋅ exp − ⋅ t  V ⋅VL  VL 
c0,Tracer ⋅ VL / V VL  VL   
 Gl. 3.101 und für Fk(t)

 
Zum Zeitpunkt t = 0 gilt E (0) = V / VL während für Va  V 
 
große Prozesszeiten E(t) gegen Null geht. Fk (t ) = 1−  ⋅ exp − ⋅ t  
a
Gl. 3.108
V  VL 
Die Summenfunktion F(t) kann analog unter  
Verwendung von Gl. 3.95 bestimmt werden:
Die Kurvenverläufe der Funktionen sind schema-
 V  tisch in der nachfolgenden . Abb. 3.21 dargestellt.
F (t ) = 1 − exp − ⋅ t   Gl. 3.102
 VL  Neben den in . Abb. 3.19 skizzierten nichtidealen
Reaktorcharakteristiken sind noch weitere Fälle, bei-
Zu Beginn (t = 0) ist deren Wert daher Null und strebt spielsweise als Verschaltung der oben beschriebenen
für große t gegen 1. Einzelbeispiele, denkbar. Details sind in Levenspiel
Wird der nicht-ideale Fall A (mit Totvolumen aufgeführt [5].
VLt) der . Abb. 3.19 untersucht, so tritt in Gleichun-
gen Gl. 3.101 und 3.102 anstelle des gesamten Reak-
tionsvolumens VL der kleinere Teil VLa = VL – VLt 3.8.2 Modell der Rührkesselkaskade
was zu Et bzw. Ft führt:
Zur Beschreibung der Nichtidealität von Verweilzeit-
V  V  verteilungen (engl. residence-time distribution, RTD)
Et (t ) = ⋅ exp − ⋅ t  Gl. 3.103
VLt  VLt  können verschiedene Modellansätze herangezogen
werden. Ein einfaches Modell wurde von MacMul-
 V  lin und Weber vorgestellt [6]. Danach wird ein nicht-
Ft (t ) = 1 − exp − ⋅ t  Gl. 3.104
 VLt  idealer Rührkessel in eine Serie (Kaskade) von glei-
chen, idealisierten Rührkesselreaktoren überführt.
 98 R. Takors und D. Weuster-Botz

ā
9
9/W
ā  )W
9 (W )
9/

ā ( )N
9D
3 ā
9 ā 9/ 9
ā
± āD
(N 9

W W

. Abb. 3.21  Schematische Verläufe der Verweilzeitdichtefunktion E(t) und der Summenfunktion F(t) für einen idealen
Rührkesselreaktor (gestrichelt) im Vergleich zu einem Reaktor mit Totvolumen (Index t, Fall A aus . Abb. 3.18) und einem
Reaktor mit Kurzschlussströmung (Index k, Fall B aus . Abb. 3.19). Für t → ∞ nähern sich alle Verweilzeitdichtefunktionen Null
und alle Summenfunktionen dem Wert 1. Für t = 0 ergeben sich die angegebenen Werte

Jeder einzelne besitzt die Verweilzeitdichtefunktion

Gl. 3.101, was für eine Serienschaltung aus N idealen )V
Reaktoren zu der mittleren Verweilzeitdichtefunk-

tion ES führt: )

 t N −1 N N  t  1 DQVWHLJHQG
ES (t ) =   ⋅ exp − N   Gl. 3.109
τ  ( N −1)!  τ  1 

Darin bezeichnet τ die mittlere hydraulische Verweil-

zeit, die sich aus dem Verhältnis V / VL ergibt. Aus
einer experimentell ermittelten Verweilzeitdichte-
funktion kann somit via nichtlinearer Parameterre-
gression die Anzahl N an idealen Rührkesselreakto-
ren mit gleichem Volumen in einer Serienschaltung
ermittelt werden. Für große N (N > 50) wird die Ver-
weilzeitdichtefunktion symmetrisch und nähert sich
einer Gaußverteilung an. Die Strömung ist somit
einer Rohrströmung mit axialer Rückvermischung
sehr ähnlich, und der Einfluss eines individuellen
Reaktors ist kaum noch erkennbar.
Analog zum Verweilzeitspektrum ES kann auch
die Verweilzeitsummenfunktion FS für N seriell
geschaltete, gleich große, ideale Rührkesselreakto-
ren bestimmt werden zu:
 2
1 + N ⋅ θ + ( N ⋅ θ )
 2 !
FS (t ) = 1 − exp (−N ⋅ θ )  N −1
 ( N ⋅ θ)
+…+
 ( N −1)!
 Gl. 3.110
1 ’
 W
ș IJ
. Abb. 3.22  Summenfunktion FS(t) für N in Reihe
geschaltete, gleich große, ideale Rührkesselreaktoren. Für
eine unendliche Zahl N wird die ideale Rohrströmung (ohne
axiale Rückvermischung) wiedergegeben
θ wurde als dimensionslose Zeit für den Ausdruck t/τ
eingeführt. . Abb. 3.22 veranschaulicht die Abhän-
gigkeit der Verweilzeitsummenfunktion von der
Anzahl der in Serie geschalteten Reaktoren.
3.8.3 Dispersionsmodell


 Eine Alternative zu dem Kaskadenansatz stellt das

 Dispersionsmodell dar. Es eignet sich insbesondere

für die Modellierung von Rohrreaktoren, deren
+…
 Pfropfenströmung gering bis moderat vom idealen
Strömungsprofil eines Rohrreaktors abweicht. Für
Kapitel 3 · Prozessmodelle
99 3
größere Abweichungen sind stärker kompartimen-
tierte Modellansätze zu bevorzugen [5].
(ș
Wird auf einen idealen Rohrreaktor ein Dirac-
'
Puls aufgegeben, so würde am Ende die Signalant- X/

'
wort in einem scharf definierten, symmetrischen X/

Signal mit der Form einer Gaußverteilung, sicht- '

X/
bar werden. Nichtidealitäten im Strömungsprofil '

machen sich somit in Abweichungen der Peakform X/
von der idealen Gaußverteilung bemerkbar. Diese
Idee liegt dem Dispersionsmodell zu Grunde.
Unter Verwendung der dimensionslosen Zeitva-
riablen θ = t/τ mit τ als mittlerer hydraulischer Ver-  WIJ
ș 
weilzeit der Volumenelemente kann die Verweilzeit-
dichtefunktion ED (θ) angegeben werden zu [5] . Abb. 3.23  Verweilzeitdichteverteilung ED(θ) eines
Strömungsrohrs für verschiedene Werte D/uL
 ( L − ut )2 
u3
ED (θ ) = exp − 

4π DL  4DL / u  einen turbulenten Beitrag erhöht wird. Entspre-
  chende Korrelationsgleichungen können in Leven-
1  (1 − θ )2 
= exp −  Gl. 3.111
spiel nachgelesen werden [5].
D D  Analog zu Gl. 3.95 ergibt sich die Summenfunk-
τ ⋅ 4π  4 
uL  ul  tion als
θ
Hierin bezeichnet u die mittlere Leerrohrgeschwin- FD (θ ) = ∫ ED (θ )⋅ dθ  Gl. 3.113
digkeit und L die Länge des Rohrreaktors. Zu beach-
0
ten ist, dass D der Dispersionskoeffizient ist. Unter
dem Begriff der longitudinalen (axialen) Dispersion Deren Form ähnelt den Kurven in . Abb. 3.22.
werden alle Effekte summiert, die auf die Profilaus- Anstelle der Abhängigkeit von der Anzahl idealer
prägung entlang der Längsachse eine Auswirkung Rührkesselreaktoren N muss allerdings jetzt die
zeigen. Die molekulare Diffusion ist nur ein Teil- Einflussgröße D/uL verwendet werden. Ideales Strö-
einfluss neben lokalen Wirbeln, turbulenten Vermi- mungsrohrverhalten ergibt sich analog für kleine
schungen, Umlaufströmungen und anderen. Werte D/uL < 0,01 (. Abb. 3.23).
Aus Gl. 3.111 wird ersichtlich, dass die Peakform
stark durch den Faktor D/uL bestimmt wird. Die
dimensionslose Größe ist charakteristisch für die 3.9 Parameteridentifizierung
Qualifizierung des Strömungsprofils. In der klassi-
schen Definition, das bedeutet unter ausschließli- Zur Modellierung des Prozessverhaltens der in
cher Betrachtung der molekularen Diffusion D wird . Abb. 3.2 vorgestellten Betriebsweisen müssen die
dieser Quotient auch als 1/Bo (Bo = Bodensteinzahl) Reaktionsterme ri durch die Reaktionsmodelle der
oder in der inversen Definition als Peclet (Pe)- Zahl 7 Kap. 1 und 2 ersetzt werden. Neben der passenden
verwendet. Modellstruktur dieser formalkinetischen Ansätze
ist dafür ebenfalls die Kenntnis der genauen Modell-
uL 1
Bo = =  Gl. 3.112 parameter notwendig. Sie werden auf der Basis expe-
D Pe
rimenteller Daten abgeschätzt. So kann beispielsweise
Als ‚Daumenregel‘ kann angenommen werden, dass ein experimenteller Beobachtungsvektor y bestehend
Strömungsprofile mit Bo < 3 durch molekulare Dif- aus der Wachstumsrate μ, der biomassespezifischen
fusion dominiert sind, hier ist D = D. Für Bo > 50 Substrataufnahmerate qS und der biomassespezifi-
dominieren turbulente Effekte in denen D durch schen Produktbildungsrate qP definiert werden zu
 100 R. Takors und D. Weuster-Botz

 µ  gemessenen Raten. Zu beachten ist, dass die Raten

 
y = −qS  Gl. 3.114
selbst von den gemessenen Zustandsgrößen abhän-
  gen y  = f(x). Zur Berücksichtigung dieser Abhän-
 qP  gigkeit wird die nichtlineare Funktion für den inte-
ressierenden ‚Arbeitspunkt‘ mittels Taylor-Reihe
Ziel der Modellierung ist es, die experimentell beob- 1. Ordnung angenähert und linearisiert. Für m
3 achteten Reaktionsraten durch Modelle zu simulie- Zustandsgrößen gilt für ein einfaches Modell y an
ren. Gesucht werden demnach Modellansätze, die einem Arbeitspunkt somit:
unter Verwendung der unabhängigen, gemessenen
Zustandsgrößen x (beispielsweise Biomasse-, Subs- ∂y ∂y ∂y
dy = dx + dx +…+ dx  Gl. 3.118
trat- oder Produktkonzentrationen, Temperatur und ∂x1 1 ∂x2 2 ∂xm m
andere) und einem Parametersatz Θ (beispielsweise
µmax, KS, …) Modellaussagen f(x,Θ) berechnen, die Wird beispielsweise die Abhängigkeit der Wachs-
möglichst nahe an den Beobachtungen y sind. tumsrate µ aus dem Beobachtungsvektor y (siehe
 )T
Gl. 3.114) für die Zustandsgrößen x = (c x ,cS ,cP ,V,VL
y = f ( x,Θ) + ε  Gl. 3.115 betrachtet so gilt:

Die Ungenauigkeit der Aussage ε muss somit mini- ∂µ ∂µ ∂µ

dµ = dc + dc + dc
miert werden. Während für lineare Modelle der ∂cX X ∂cS S ∂cP P
Form y = x · θ der gesuchte Parametervektor θ̂ sich zu ∂µ  ∂µ
+ dV + dV  Gl. 3.119
−1
∂V ∂VL L
θ̂ = ( )
xT x xT y  Gl. 3.116
Würde µ aus einem kontinuierlich betriebenen,
ergibt, ist die direkte Berechnung für die in der Fließgleichgewichtsexperiment abgeleitet, so gilt
Regel nichtlinearen, formalkinetischen Wachs- unter Berücksichtigung von Gl. 3.20
tumsmodelle nicht möglich. Die Parameterermitt-
lung muss aufgrund einer Schätzung erfolgen. Das 1  V
dµ = 0 + 0 + 0 + dV − 2 dVL  Gl. 3.120
setzt voraus, dass das System überbestimmt ist (siehe VL VL
auch 7 Kap. 13).
Geht man davon aus, dass das Modell aus k unab- Die individuelle Varianz σµ2 ergibt sich an diesem
hängigen Gleichungen besteht und n unabhängige Arbeitspunkt i somit aus
Datensätze existieren, so kann der gesuchte Parame-
tervektor θ̂ bestimmt werden gemäß  dc 2  dc 2 
V  
 X X
 1
 2 σµ2 = 0; 0; 0; ;− 2  ⋅     
argmin  k n (
yij − f ( xi, θ )  )  VL VL   2 2
θ  ∑ j =0 ∑i =0
ˆ  
θ=
σ 2yij  dV  dV  i

   T
1 V 
 Gl. 3.117 ⋅0; 0; 0; ;− 2 
 VL VL 

Es handelt sich somit um eine gewichtete Fehlerqua-  Gl. 3.121
dratminimierung, bei der die Gewichtung durch die
individuelle Varianz jeder einzelnen Messung σ 2yij vor- Für ein mehrdimensionales Modell, wie beispiels-
genommen wird. Zur Parameteridentifizierung können weise in Gl. 3.114, wird die Jakobi-Matrix als J = dy/dx
diverse numerische Optimierungsverfahren eingesetzt definiert. Die Varianzen σ 2yij können dann der Kova-
werden, wie beispielsweise das klassische Nelder-Mead rianz-Matrix des Messfehlers entnommen werden:
oder das Levenberg-Marquardt Verfahren.
Die praktische Anwendung des Ansatzes Cov ( y ) = J ⋅ Λ ⋅ J T  Gl. 3.122
Gl. 3.117 verlangt eine Angabe zur Genauigkeit der
Kapitel 3 · Prozessmodelle
Die Matrix Λ besteht aus den Quadraten der absolu-
ten Messfehler der Zustandsgrößen an dem betrach-
teten Betriebspunkt. Sind die Messungen unabhän-
gig voneinander, sind nur die Diagonalelemente der
Matrix durch die gesuchten Varianzen besetzt.
Eine wichtige Frage, die vor Verwendung expe-
rimenteller Datensätze für die Parameteridentifizie-
rung geklärt werden sollte ist, ob deren Qualität für
die weitere Verwendung überhaupt ausreicht. Sind
vielleicht grobe, systematische Messfehler (gross
measurement errors) vorhanden, die zumindest einer
teilweisen Verwendung der Daten widersprechen?
Wang und Stephanopoulos [14] haben hierzu einen
umfassenden statischen Ansatz vorgelegt, der auch
in Nielsen et al. nachzulesen ist [7]. Im Folgenden
wird lediglich der Grundgedanke wiedergegeben,
der auf der stöchiometrischen Analyse des Substrat-
umsatzes erfolgt.
Die aerobe Umsetzung eines Substrates kann als
Summenformel beschrieben werden zu
λx ⋅ CcsH hsOos + λO2 ⋅ O 2 + λN ⋅ NH3 →
λCO2 ⋅ CO 2 + λX ⋅ CcxH hxOox N nx +
λP ⋅ CcpH hpOop + λH2O ⋅ H 2O
 Gl. 3.123
Hieraus ergeben sich die Elementbilanzen für C, H,
N und O, die gegebenenfalls noch durch eine Enthal-
piebilanz ergänzt werden können. Die Summen-
formel Gl. 3.123 lässt sich auch in Matrix-Notation
umformulieren zu
A⋅ x = b  Gl. 3.124
wobei A die stöchiometrische Matrix der Elemente,
x der Vektor der stöchiometrischen Faktoren λi und
b die Bedingung zur Elementerhaltung beziehungs-
weise zur Enthalpieproduktion darstellt.9
Es wird davon ausgegangen, dass die stöchio-
metrischen Faktoren x, die aus den Bilanzglei-
chungen in 7 Abschn. 3.2 abgeleitet werden, einen
9 Die stöchiometrischen Faktoren λi leiten sich aus den
Ertragskoeffizienten Yi–1ab, welche in der Regel in g/g
angegeben werden. Für reine Elementbilanzen sollte
b Null ergeben.
101 3
normalverteilten Fehler aufweisen. Das heißt der
wahre Wert von x weicht vom dem gemessenen Mit-
telwert x um eine Fehler δ ab, dessen Erwartungs-
wert Null ist.
Die Residuen der Bilanzgleichungen ε ergeben
sich zu
ε = −A ⋅ x  Gl. 3.125
Deren Erwartungswert ist wiederum Null und die
dazugehörige Kovarianz-Matrix ergibt sich zu
Cov (ε) = A ⋅ Cov (δ )⋅ AT = φ  Gl. 3.126
Es kann gezeigt werden [14] dass die experimen-
tellen Datensätze genau dann verwendet werden
können, wenn sie die Anforderung eines χ2 Hypo-
thesentests erfüllen. Dazu wird zunächst das Krite-
rium h bestimmt
h = εT φ−1ε  Gl. 3.127
Darüber hinaus ist die Angabe des Freiheitsgrades
und die Auswahl des statistischen Signifikanzniveaus
notwendig. Ersterer ergibt sich aus der Anzahl der
Zeilen in Matrix A. Letzteres ist prinzipiell frei
wählbar, sollte aber in der Praxis 90 % oder 95 % sein.
Aus statistischen Tabellenwerken ergibt sich somit
eine Obergrenze von h. Wird diese mit dem Wert
aus Gl. 3.127 überschritten, so liegt ein systemischer
Fehler in den Messdaten vor. Die weiterführende
Bearbeitung sollte darauf abzielen, den Messfehler zu
identifizieren, was durch die schrittweise Elimination
einzelner Komponentenmessungen erfolgen kann.
3.10 Beispiele
Zur Veranschaulichung der in den Kapiteln 1 bis
3 vorgestellten Modellierungsansätze werden
nachfolgend zwei einfache Prozessbeispiele vor-
gestellt. Beide gehen von einer aeroben Kultivie-
rung von Mikroorganismen oder Zellen mit der
Biomasse (Konzentration c X ) aus. Das Wachs-
tum wird als Zweisubstratkinetik mit cS (beispiels-
weise Glucose) und Sauerstoff cO  (O2) als inter-
2
aktiv komplementären limitierenden (essenziell)
Substraten (7 Abschn. 2.3.5) formuliert (. Tab. 3.1).
 102 R. Takors und D. Weuster-Botz

Die physikalischen Parameter aus . Tab. 3.2 wurden

. Tab. 3.1  Kinetische Parameter der nachfolgend
aufgeführten Simulationsbeispiele verwendet
Die Modellierung des Sauerstofftransports OTR
Parameter Einheit Wert erfolgt nach Gl. 3.55.

μmax 1/h 0,5

3 KS g/L 0,5 3.10.1 Schüttelkolben
KO2 mg/L 1
mS g/gh 0,015 Als erstes Beispiel wird die aerobe Kultivierung in
YXO2 g/g 1,1*
einem Schüttelkolben betrachtet. Nach wie vor ist der
Schüttelkolben ein sehr häufig eingesetzter Bioreak-
YXS,µ g/g 0,35
tor in der Stammentwicklung (7 Abschn. 6.4). Eine
übliche Praxis besteht darin, Zellen ‚über Nacht‘ im
* wird vereinfachend als konstant angenommen
Satzverfahren im Schüttelkolben zu kultivieren und
am nächsten Tag zu ernten. Oftmals wird implizit
davon ausgegangen, dass die Kultivierungsbedingun-
Die limitierenden Substrate werden auch zur gen im Schüttelkolben keine signifikanten Auswirkun-
Deckung des Erhaltungsstoffwechsels benötigt gen auf das Fermentationsergebnis haben und dass
(7 Abschn. 2.3.4). beispielsweise genetische Stammveränderungen sich
Daraus ergibt sich die Formulierung der Wachs- eindeutig in einem Wachstumsphänotyp zeigen. Um
tumskinetik wie folgt: zu untersuchen, ob eine unerwartete Sauerstofflimitie-
cS cO2 rung im Schüttelkolben auftritt, die unter Umständen
µ = µmax ⋅ ⋅ das Wachstum beeinträchtigt, wurde die nachfolgende
cS + KS cO2 + K O2  Gl. 3.128
Simulation durchgeführt. Die Größen cO2,L und cO2,g
entsprechend den Konzentrationen an O2 in der Flüs-
µ sigkeit (L) beziehungsweise der Gasphase (g).
qS = + mS  Gl. 3.129
YXS,µ Das zugrunde liegende Gleichungssystem des
Prozessmodells (ideale Homogenisierung von Flüs-
Anzumerken ist, dass bei Gl. 3.128 vereinfachend sigphase und Gasphase, Satzverfahren) ist wie folgt:
die Verringerung der Wachstumsrate aufgrund
des Erhaltungsstoffwechsels nicht berücksichtigt dcO2,g VL
= −OTR ⋅  Gl. 3.131
wurde, da bei interaktiv komplementären Substra- dt VG
ten zunächst unklar ist, welches Substrat berücksich-
tigt werden muss (–mS · YXS,µ oder –mO · YXO,µ). Die dcO2, L
= OTR − OUR  Gl. 3.132
Sauerstoffaufnahmerate OUR wird berechnet zu: dt
µ
OUR = ⋅c  Gl. 3.130 dcX
YXO2 X = µ ⋅ cX  Gl. 3.133
dt

. Tab. 3.2  Physikalische Parameter der Simulation dcS

= −qS ⋅ cX  Gl. 3.134
Parameter Einheit Wert
dt

HO2 gO2/L bar 0,038 (Henry- Die Gleichungen Gl. 3.131 und 3.132 gehen implizit
Konstante) davon aus, dass Sauerstoff lediglich im Kopfraum
T K 309 des Schüttelkolbens oder zu Beginn als gelöstes Gas
R J/(mol K) 8,314 (universelle
im Reaktionsmedium VL vorhanden ist. Darüber
Gaskonstante) hinaus wird hier kein weiterer diffusiver Sauerstoff-
transport durch die Sterilstopfen des Schüttelkolbens
Kapitel 3 · Prozessmodelle
103 3

. Tab. 3.3  Startwerte der Simulation des Schüttelkolbens

Parameter/ Einheit Wert Anmerkung

Variable

cX0 g/L 0,02 Animpfkonzentration zu Beginn der Satzkultivierung

cS0 g/L 10 Vorgelegte Substratkonzentration
yO2 Vol% 21 Sauerstoffgehalt der Umgebungsluft, die mit Flüssigkeit zu Beginn im
Gleichgewicht steht
VL L 0,2 Flüssigvolumen im Schüttelkolben
VK L 2 Gesamtvolumen des Schüttelkolbens; VG = VK – VL
k La 1/h 150 Realistischer Wert für Schüttelkolbenbetrieb in der üblichen (nicht immer
optimalen) Betriebspraxis
p bar 1 Umgebungsdruck

. Abb. 3.24  Simulation zur

Herstellung von Mikroorganismen
im Schüttelkolben. Zur detaillierten
Information siehe Text

vorgesehen. Bei ungünstiger Wahl von Sterilstopfen
kann der Sauerstofftransport durch den Stopfen so
gering werden, dass diese Annahme als Grenzbe-
trachtung (worst-case) durchaus gerechtfertigt sein
kann (. Tab. 3.3).
. Abb. 3.24 zeigt deutlich, dass unter den ange-
nommenen Kultivierungsbedingungen die Fer-
mentation nach rund 14 h in eine Sauerstofflimi-
tierung gerät. Die Wachstumsrate verringert sich
bereits nach etwa 10 h aufgrund von Sauerstoffman-
gel. Auch nachdem die Zellen kein Wachstum mehr
zeigen, wird dennoch weiterhin die Kohlenstoff-
quelle (Substrat) umgesetzt, was durch den Bedarf
für den Erhaltungsstoffwechsel begründet ist. In der
Praxis geht diese Phase oftmals mit der Bildung von
organischen Säuren einher, die zusätzlich den pH
im Schüttelkolben (bei unzureichender Pufferung)
herabsetzen. Es empfiehlt sich daher dringend, die
Planung von Schüttelkolbenexperimenten so durch-
zuführen, dass keine ungewollte Sauerstofflimitie-
rung auftreten kann. Dies kann beispielsweise durch
Verbesserung des Leistungseintrages oder durch Ver-
ringerung der vorgelegten Substratkonzentration
geschehen (siehe auch 7 Abschn. 6.4).
3.10.2 Zulaufverfahren
Zur Veranschaulichung von Fermentationsver-
läufen im Produktionsmaßstab wird der oben auf-
geführte kinetische Ansatz mit einem Prozessmo-
dell für einen 20.000 L Bioreaktor verknüpft, der
 104 R. Takors und D. Weuster-Botz

im Zulaufverfahren betrieben und sowohl für die zugrunde gelegt, das in den nachfolgenden Abbil-
Flüssigphase, als auch für die Gasphase als ideal dungen durch die Zunahme an Reaktionsvolumen
homogenisierter Rührkesselreaktor betrachtet wird VL indirekt gezeigt ist.
(. Tab. 3.4). Das zugrunde liegende Gleichungssys- Zu Beginn des in . Abb. 3.25 darstellten Zulaufver-
tem ist wie folgt: fahrens (Phase A) wachsen die Zellen exponentiell. Die
Konzentrationen an O2 in der Gas- und in der Flüs-
3 sigphase nehmen ebenso wie die Substratkonzentra-
dcO2,g VG  M ⋅p 
=  yO2,in ⋅ O2 ges − cO2,g  tion entsprechend ab, während die Konzentration von
dt VG  R ⋅T 
Biomasse ansteigt. Der Beginn der Phase B ist dadurch
VL gekennzeichnet, dass der Substratzulauf startet,
−OTR ⋅  Gl. 3.135
VG weshalb die Substratkonzentration kurzfristig leicht
ansteigt. Dies ist auch in der vorübergehenden Auf-
dcO2, L F rechterhaltung der Wachstumsrate µ zu erkennen, die
dt
=
VL
(0 − cO2,L ) + OTR − OUR  Gl. 3.136 in der Folgezeit jedoch wegen der abnehmenden Subs-
tratkonzentration drastisch langsamer wird (Phase C).
dcX F Die Gelöstsauerstoffkonzentration kann in dieser Pro-
= (0 − cX ) + µ ⋅ cX  Gl. 3.137
dt VL zessphase auf einem Niveau von etwa 7,5 mg/L gehal-
ten werden. In Phase D wird der Zulauf jedoch stark
dcS F erhöht, was zu einer entsprechenden Zunahme an Bio-
= ⋅ (cS, F − cS ) − qS ⋅ cX  Gl. 3.138
dt VL masse führt. Die O2 Konzentrationen in der Gas- wie
auch in der Flüssigphase nehmen entsprechend ab.
dVL Durch die Zunahme an Biomasse steigt der volumet-
=F Gl. 3.139
dt rische Substratverbrauch an, was – bei gleichbleiben-
der Zugabe – zu einer Verknappung an Substrat im
Die Massenbilanz für den Sauerstoff in der Gasphase Bioreaktor führt. Als Folge fällt die Wachstumsrate µ
berücksichtigt den über die Zuluft eingebrachten weiter ab. Zu Beginn von Phase E wird der Zulauf dras-
Anteil, dessen Angabe von Vol% in g/L umgerech- tisch reduziert, was die Zellaktivität und die Biomasse-
net wird. Die analoge Bilanz in der Flüssigphase sieht bildung deutlich limitiert. Am Ende wird ein Füllvo-
neben den Eintrags- und Verbrauchstermen auch die lumen von etwa 16,5 m3 erreicht, das bedeutet 3,5 m3
Verdünnung der Konzentration durch Volumenzu- verbleiben als Kopfraumvolumen und als ‚Puffer‘ für
nahme vor. Für den Substratzulauf wird ein Profil eventuell auftretende Schaumbildung.

. Tab. 3.4  Startwerte der Simulation des Zulaufverfahrens

Parameter/ Einheit Wert Anmerkung

Variable

cX0 g/L 0,02 Animpfkonzentration zu Beginn der batch Kultivierung

cS0 g/L 10 vorgelegte Substratkonzentration
yO2 Vol% 21 Sauerstoffgehalt der Umgebungsluft, die mit Flüssigkeit zu Beginn im
Gleichgewicht steht
VL0 L 12.500 Flüssigvolumen im Bioreaktor zu Prozessbeginn
VR L 20.000 Gesamtvolumen des Bioreaktors; VG = VK – VL
k La 1/h 600 Durchschnittlicher Wert für einen Rührreaktor im Produktionsbetrieb
P bar 1,3 Es wird ein zusätzlicher Kopfdruck von 0,3 bar angenommen.
Der durch die Wassersäule im Reaktor ausgeübte Druck wird
vereinfachend vernachlässigt.
Kapitel 3 · Prozessmodelle
105 3
. Abb. 3.25  Simulation von
mikrobiellem Wachstum im
Zulaufverfahren. Zur detaillierten
Information siehe Text

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 107 4

Rheologie von
­Biosuspensionen
Horst Chmiel und Eckehard Walitza

4.1 Die parallele Schichtenströmung – 108

4.2 Viskosimeterströmungen inkompressibler Flüssigkeiten – 110

4.2.1 Die stationäre Rohrströmung – 111
4.2.2 Die Zylinder-Couette-Strömung – 112
4.2.3 Die Kegel-Platte-Strömung – 114

4.3 Mathematische Modellierung der stationär ermittelten

Fließkurve – 115
4.3.1 Potenzansatz – 115
4.3.2 Polynomansätze – 116
4.3.3 Modellfunktionen für Fließkurven mit Fließgrenze – 116

4.4 Repräsentative Viskosität – 116

4.5 Das Rührer-Rheometer – 118

4.6 Die instationäre Scherströmung viskoelastischer

Fluide – 119
4.6.1 Das sinusförmig oszillierende Scherexperiment – 119
4.6.2 Oszillierendes Scherexperiment in Rotationsviskosimetern – 121

4.7 Dehnströmungen – 122

4.8 Das Fließverhalten von Fermentationsbrühen – 122

4.8.1 Rheologisch relevante Parameter – 123
4.8.2 Stationäres Fließen – 124
4.8.3 Lineare Viskoelastizität – 126
4.8.4 Fließverhalten im Verlauf einer Fermentation – 127

Literatur – 129

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2018

H. Chmiel, R. Takors, D. Weuster-Botz (Hrsg.), Bioprozesstechnik,
https://doi.org/10.1007/978-3-662-54042-8_4
 108 H. Chmiel und E. Walitza

Unter Biosuspensionen seien im Folgenden suspen-

dierte biogene Materialien verstanden. Sie bestehen
aus Mikroorganismen und deren extrazellulären
Stoffwechselprodukten suspendiert in einem wäss-
rigen Nährmedium. Wegen ihres häufig komplexen
Fließverhaltens – das wiederum starken Einfluss auf
das Impuls-, Stoff- und Wärmeaustauschverhalten,
und somit auf die Verfahrenstechnik von biotech-
4 nologischen Prozessen, ausübt – müssen sie mög-
lichst vollständig rheologisch charakterisiert werden.
Den Grundlagen hierzu widmet sich dieses Kapitel,
. Abb. 4.2  Deformation eines Flüssigkeitselementes in
wobei, wenn nicht anders spezifiziert, von isother-
paralleler Schichtenströmung
men Bedingungen ausgegangen wird.

Wie man sieht, ist im Fall der einfachen Scher-

4.1 Die parallele Schichtenströmung
Werden zwei planparallele Platten, zwischen
denen sich eine Flüssigkeit befindet, mit konstan-
ter Geschwindigkeit v 0 gegeneinander bewegt, so
stellt sich unter der Voraussetzung, dass die Flüs-
sigkeit an den Wänden haftet und Randeffekte ver-
nachlässigbar sind, im stationären Zustand aufgrund
innerer Kräfte in der Flüssigkeitsschicht ein lineares
Geschwindigkeitsprofil analog . Abb. 4.1 ein.
Newton fand 1723, dass die zur Verschiebung der
beiden Platten notwendige Kraft pro Flächeneinheit,
τ, proportional ist der Geschwindigkeitsänderung
senkrecht zur Verschiebungsrichtung, dv/dy, d. h.
dv
τ =η⋅  Gl. 4.1
dy
η ist ein Proportionalitätsfaktor, die dynamische
Zähigkeit oder auch Viskosität. Das Flüssigkeitsele-
ment wird aufgrund der angreifenden Schubspan-
nung τ wie in . Abb. 4.2 dargestellt deformiert.
strömung der Geschwindigkeitsgradient dv/dy iden-
tisch mit der zeitlichen Änderung des Deformations-
winkels γ, also dγ/dt. Letztere wird als Scherrate
bezeichnet und mit γ abgekürzt. In komplizierten
Strömungsformen, z. B. in der später noch zu behan-
delnden Zylinder-Couette-Strömung, ist die Scher-
rate nicht mehr mit dem Geschwindigkeitsgradien-
ten dv/dy identisch. Ist die Viskosität konstant und
somit unabhängig von der Scherrate, dann lautet das
newtonsche Gesetz:
τ = η ⋅ γ  Gl. 4.2
Misst man die Schubspannung als Funktion der
Scherrate, die sogenannte Fließkurve, dann ergibt
sich bei Gültigkeit von Gl. 4.2 eine Gerade, die durch
den Koordinatenursprung geht.
Derartige Fluide bezeichnet man als newtonsch.
Eine große Zahl von Flüssigkeiten zeigt jedoch
eine gekrümmte Fließkurve, d. h. die Viskosität ist
eine Funktion der Scherrate. Es sind dies vor allem

. Abb. 4.1  Scherbeanspruchung

einer Flüssigkeit zwischen zwei
planparallelen Platten
Kapitel 4 · Rheologie von ­Biosuspensionen
. Abb. 4.3  Fließkurve einer CMC-
Lösung, 0,6 %, 19,7 °C
Polymerschmelzen, Lösungen von Hochpolymeren,
Suspensionen elastischer Partikel und die hier beson-
ders interessanten Biosuspensionen.
. Abb. 4.3 zeigt eine solche gekrümmte Fließ-
kurve am Beispiel einer wässrigen Carboxymethyl-
cellulose(CMC)-Lösung. Das Molekulargewicht des
gelösten Polymers ist größer als 10 Millionen Dalton.
Flüssigkeiten, die eine derartige nicht-lineare Fließ-
kurve besitzen, bezeichnet man als nichtnewtonsch.
Ihre sogenannte „variable Viskosität“, definiert durch
τ depunkt und nähert sich bei sehr hohen Scherraten
η= 
γ
ist keine Stoffkonstante mehr, sondern von der Bean-
spruchung abhängig.
. Abb. 4.4  Viskosität als Funktion
der Scherrate für eine CMC-Lösung,
0,5 %, 19,7 °C
109 4
. Abb. 4.4 zeigt für die gleiche Polymerlösung die
variable Viskosität als Funktion der Scherrate. Der
Kurvenverlauf ist typisch für derartige verdünnte
Flüssigkeiten. Der bei verschwindender Beanspru-
chung vorhandene Anfangswert der Viskosität – er
wird auch Nullviskosität genannt – bleibt zunächst
im Rahmen der Messgenauigkeit in einem gewissen
Scherratenbereich konstant.
Mit zunehmender Beanspruchung nimmt die
Viskosität stark ab. Die Kurve durchläuft – das ist
nicht mehr in . Abb. 4.4 dargestellt – einen Wen-
einem unteren Grenzwert.
Neben der gekrümmten Fließkurve unterschei-
den sich die oben genannten Flüssigkeiten von den
newtonschen Flüssigkeiten rheologisch durch das
 110 H. Chmiel und E. Walitza
4 bedenkt, dass die Normalspannungen den hydrosta-
. Abb. 4.5  Spannungen an einem Volumenelement in
einer parallelen Schichtenströmung
Auftreten von elastischen Effekten. Deshalb werden
sie häufig auch viskoelastisch genannt. In . Abb. 4.5
ist das bereits diskutierte Flüssigkeitselement der
parallelen Schichtenströmung räumlich dargestellt.
Neben der mit x bezeichneten Strömungsrich-
tung und der mit y bezeichneten Scherrichtung wird
eine zusätzliche – in die indifferente Richtung wei-
sende – Koordinate notwendig, die z genannt werden
soll. Bei einer newtonschen Flüssigkeit sind die in
den drei Richtungen auftretenden Normalspannun-
gen gleich, d. h.
σ x = σ y = σz = − p + 
Bei viskoelastischen Flüssigkeiten sind erfahrungs-
gemäß die drei Normalspannungen nicht gleich.
Nimmt man an, die Spannung in z-Richtung sei –p+,
dann lässt sich das rheologische Verhalten viskoelas-
tischer Flüssigkeiten im hier vorliegenden Sonder-
fall der parallelen Schichtenströmung durch folgende
Stofffunktionen beschreiben:
τ = F (γ )  Gl. 4.3
σ x = − p+ + F1(γ 2 ) 
σ y = − p+ + F2 (γ 2 ) 
σz = − p + 
Es ist noch zu begründen, warum –p+ auch in σy und
σx auftritt und weshalb diese beiden Normalspan-
nungen – abgesehen von –p+-Funktionen des Qua-
drats der Scherrate sind:
Das Erstere erscheint sinnvoll, wenn man
tischen Anteil mit enthalten, d. h., erhöht man den
Druck bei gleichbleibender Scherrate, so erhöhen
sich die drei Normalspannungen gleichermaßen.
Dies wird durch den isotropen Anteil –p+ berück-
sichtigt, der im Allgemeinen noch von γ abhängt,
für γ  = 0 jedoch mit dem hydrostatischen Druck
identisch ist. Der zweite Punkt ist einzusehen, wenn
man beachtet, dass die Normalspannungen σy und σx
von dem Vorzeichen der Scherrate unabhängig sein
müssen, was formal nur dann erfüllt ist, wenn die
Funktionen F1 und F2 von der Scherrate mit geradem
Exponenten abhängen. Die Normalspannungsfunk-
tionen F1(γ 2) und F2( γ 2) sind durch Differenzbil-
dung aus den Normalspannungen zu ermitteln.
σ x − σz = F1(γ 2 )  Gl. 4.4
σ y − σz = F2 (γ 2 ) 
Eine Ursache für das Auftreten elastischer Effekte ist
die reversible Deformation der Partikel. Ein zweiter
elastischer Anteil entsteht aus der Wechselwirkung
zwischen Agglomeraten aus Einzelpartikeln und Trä-
gerflüssigkeit der Art, dass die Agglomerate im Scher-
feld eine reversible Strukturveränderung erfahren.
4.2 Viskosimeterströmungen
inkompressibler Flüssigkeiten
Viskosimeter sind Messapparaturen, die zur Messung
der Viskosität dienen. Rheometer sind Apparate, mit
denen sich die Viskosität und weitere wichtige rheo-
logische Größen messen lassen.
In den hier vorzustellenden Viskosimetern bzw.
Rheometern (Rohr-, Couette- und Kegel-Platte-Vis-
kosimeter) geht man von der Voraussetzung aus, dass
die Flüssigkeiten einer reinen Scherbeanspruchung
Kapitel 4 · Rheologie von ­Biosuspensionen
ausgesetzt sind. Dies ist nicht die einzig mögliche
Beanspruchungsform, was an den Beispielen Rohr-
krümmer, konvergenter und divergenter Kanal
gezeigt werden kann. Eine theoretische Lösung
dieser Strömungsprobleme ist allerdings im Fall der
viskoelastischen Flüssigkeiten nur mit erheblichem
mathematischem Aufwand möglich und soll hier
ausgeklammert werden. Lediglich die reine Dehn-
strömung wird noch besonders angesprochen.
4.2.1 Die stationäre Rohrströmung
Zur rheologischen Beschreibung der stationären
Schichtenströmung in einem Rohr bedient man
sich eines Zylinderkoordinatensystems. Die Fließ-
richtung sei mit x, die Scherrichtung mit r und die
indifferente Richtung mit φ bezeichnet. Die Stoff-
funktionen lauten dann:
τ = F (γ )  Gl. 4.5
σ x − σϕ = F1(γ 2 ) 
σr − σϕ = F2 (γ 2 ) 
Da weder σφ noch σx messtechnisch zu erfassen
sind, muss man sich auf die Ermittlung der Fließ-
kurve [ τ = F (γ ) ] beschränken. In einer stationären
Rohrströmung können folgende Größen gemessen
werden: der Volumenstrom V und der Druckverlust
pro Längeneinheit Δp/Δx. Über eine Gleichgewichts-
betrachtung lässt sich die Schubspannungsverteilung
. Abb. 4.6  Kräftegleichgewicht
an einem zylindrischen
Flüssigkeitselement (a)
und daraus resultierende
Schubspannungsverteilung (b) in
einer stationären Rohrströmung
111 4
über den Rohrquerschnitt ermitteln. Der Einfach-
heit halber soll die Ableitung hier für eine newton-
sche Flüssigkeit erfolgen; das Resultat ist jedoch
ebenso für nichtnewtonsche Flüssigkeiten gültig. In
. Abb. 4.6 ist ein zylindrisches Flüssigkeitselement
mit den daran angreifenden Kräften dargestellt.
An der Stelle x = x0 wirkt die Kraft p · π · r2, an
der Stelle x = x0 + Δx die Kraft −(p − Δp)· π · r2.
Daraus ergibt sich eine Resultierende in positiver x-
Richtung der Größe Δp · π · r2, die der an der zylind-
rischen Mantelfläche angreifenden Schubspannung
das Gleichgewicht halten muss, derart, dass τ · 2 · π·
r · Δx = Δp · π · r2. Führt man noch Δp/Δx = p′ ein,
so erhält man die Schubspannung als Funktion des
Radius r
r
τ = p′ ⋅  Gl. 4.6
2
und für die Schubspannung an der Wand
R
τ w = p′ ⋅ 
2
d. h. die Schubspannung hängt linear vom Rohr-
radius ab und ist maximal an der Wand, wie in
.  Abb. 4.6 dargestellt. Es ist zu beachten, dass für
Gl. 4.6 keine Annahmen über das Fließverhalten
getroffen werden müssen, es wird lediglich stationäre
parallele Schichtenströmung verlangt. Der Volumen-
strom einer laminaren Rohrströmung lässt sich bei
Wandhaftung folgendermaßen berechnen:
R
V = 2 ⋅ π ⋅ ∫ v(r ) ⋅ r dr  Gl. 4.7
0
Durch partielle Integration ergibt sich
 112 H. Chmiel und E. Walitza

 R  haben, bedarf es einer Anlaufstrecke. Bei viskoelas-

 R 
V = π  r 2 ⋅ v (r ) − ∫ r 2 ⋅ dv (r )  tischen Flüssigkeiten kann erst nach etwa einer
 0  Länge von 150 d mit Sicherheit damit gerechnet
 0 
werden, dass obige Bedingung ausreichend erfüllt
und mit der Randbedingung v (R) = 0 und der ist. Daneben ergeben sich am Rohraustritt End-
Beschränktheit von v(r), d. h. v(0) ≠ ∞ effekte, die die Messergebnisse verfälschen. Diese
Endeffekte können aber experimentell eliminiert
R werden. Ermittelt man nämlich für zwei Rohre glei-
dv(r )
4 V = −π ⋅ ∫ r 2 ⋅
dr
dr  chen Durchmessers, jedoch unterschiedlicher Rohr-
0 länge, den Zusammenhang für V und Δp, so ergibt
sich ein Verlauf, wie er in . Abb. 4.7a schematisch
dargestellt ist.
dv(r )
Führt man − = F (τ ) ein, dann erhält man Für einen bestimmten Durchsatz V 1 ist der
dr
Unterschied in den Druckdifferenzen, Δp1, abzu-
unter Benutzung der Gl. 4.6 mit lesen und durch die Längendifferenz der beiden
Rohre ΔL zu dividieren, p1′ = Δp1/ΔL. Mithilfe der
r = Rτ / τ w  Gl. 4.8 und 4.9 erhält man ein Wertepaar τ und γ1
1
(siehe oben) der Fließkurve (. Abb. 4.7b). Wieder-
π⋅ R 3 τw holt man die Messung der Druckdifferenz für weitere
V = 3 ∫0 τ 2 ⋅ F ( τ ) dτ  Gl. 4.8
τw Durchsätze, so erhält man die weiteren Messpunkte
der Fließkurve.
V
Mit der Abkürzung = φ und Differenzieren
τ R3
nach τw geht Gl. 4.8 über in
4.2.2 Die Zylinder-Couette-Strömung
dφ
γ w = F (τ w ) = 3 ⋅ φ + τ w  Gl. 4.9 Als Zylinder-Couette-Strömung bezeichnet man
dτ w
eine Flüssigkeitsbewegung, die sich zwischen zwei
konzentrischen Zylindern einstellt, wenn diese sich
Gl. 4.9 ist unter dem Namen Rabinowitsch-Mooney- mit konstanter Winkelgeschwindigkeitsdifferenz Ω
Beziehung bekannt. Mit ihrer Hilfe können Rohr- gegeneinander drehen.
rheometermessungen ausgewertet werden, da nun In . Abb. 4.8 wird der äußere Zylinder angetrie-
sowohl die Schubspannung als auch die Scherrate ben, während am inneren Zylinder das Drehmoment
an der Wand aus den Messgrößen V und p′ ermit- gemessen werden kann, das sich aufgrund der Flüs-
telt werden können. Die Methode hat den Nachteil, sigkeitsreibung einstellt. Abgesehen von Störungen
dass der gemessene Zusammenhang V = f(Δp) dif- am Boden und an der Flüssigkeitsoberfläche verläuft
ferenziert werden muss. Im Sonderfall der newton- die Strömung stationär in konzentrischen parallelen
schen Flüssigkeit wird der Term τw (dϕ/dτw) gleich Schichten.
ϕ, was eingesetzt in Gl. 4.9 zu dem Hagen-Poiseuil- In einem Couette-Rheometer können die Win-
le’schen Gesetz führt. kelgeschwindigkeit Ω und das Drehmoment M
gemessen und daraus die relevanten rheologischen
τ w 4 V Größen abgeleitet werden. Für eine gegebene Geo-
= ⋅ 3 Gl. 4.10
η π R metrie (ra = Radius des äußeren Zylinders, ri = Radius
des inneren Zylinders und h = Höhe des mit Flüssig-
Somit sind alle relevanten Größen, die zur Messung keit gefüllten Ringspaltes) ist bei konstantem Ω das
der Viskosität benötigt werden, hergeleitet. gemessene Drehmoment M ein Maß für die Visko-
Für die Ermittlung der Fließkurve wurde voll- sität der Flüssigkeit.
entwickelte, parallele, stationäre Schichtenströmung Die radiale Schubspannungsverteilung ergibt
vorausgesetzt. Bis sich diese Verhältnisse ausgebildet sich hier aus einer Gleichgewichtsbetrachtung der
Kapitel 4 · Rheologie von ­Biosuspensionen
113 4
. Abb. 4.7  Volumenstrom in
Abhängigkeit der Druckdifferenz
an Rohren verschiedener Länge
einschließlich der Endeffekte (a) und
daraus resultierende Fließkurve (b)

dvϕ d (r ⋅ω(r)) dω
= = ω(r) + r ⋅
dr dr dr


enthält mit ω(r) die Rotation der Teilchen. Da die

Scherrate aber definitionsgemäß ausschließlich die
Deformation des Flüssigkeitselementes beschreiben
soll, muss von dvφ/dr die örtliche Winkelgeschwin-
digkeit ω(r) abgezogen werden. Es gilt daher im vor-
liegenden Fall

. Abb. 4.8  Die Zylinder-Couette-Strömung dω

γ = −r ⋅  Gl. 4.13
dr
wegen γ = τ / η folgt
Drehmomente. Im Fall der stationären Strömung ist
das Drehmoment konstant, d. h. vom Radius unab- τ 1
d ω = − ⋅ dr 
hängig. Gleichgültig welcher Zylinder angetrieben η r
wird, gilt der Zusammenhang:
Die Differenziation von Gl. 4.12 liefert dr/r = –dτ/2τ
M = 2 ⋅ π ⋅ h ⋅ r 2 ⋅ τ = konst.  Gl. 4.11 und damit
1
oder dω = dτ  Gl. 4.14
2⋅ η
M Für den newtonschen Fall ergibt die Integration von
τ=  Gl. 4.12
2⋅ π ⋅ h⋅ r2 Gl. 4.14
τ
Die örtliche Scherrate im Couette-Spalt darf nicht – ω= + c1
2⋅η 
analog der ebenen Scherströmung – mit
dvϕ Wird der äußere Zylinder angetrieben und ruht der
γ = berechnet werden. innere Zylinder, so erlaubt die Randbedingung am
dr
inneren Zylinder, r = ri; ω = 0; τ = τ(ri), die Konstante
Die Beziehung c1 zu bestimmen,
 114 H. Chmiel und E. Walitza

τ (ri ) τ = F (γ ) 
c1 = − 
2⋅η
σϕ − σr = F1(γ 2 )  Gl. 4.18
und aus der Randbedingung am äußeren Zylinder,
r = ra: ω = Ω; τ = τ(ra) folgt
σϑ − σr = F2 (γ 2 ) 

τ (ra ) − τ (ri ) τ (ri )  τ (ra ) 

Ω= =  −1. 
2⋅η 2 ⋅ η  τ (ri )  Unter der bereits oben genannten Voraussetzung
4 eines sehr kleinen Winkels ergibt sich für die Scherrate
Mit vϕ Ω ⋅ r ⋅ cos α
= 
τ (ra ) ri2 h r ⋅ sin α
= =β 
τ (ri ) ra2 Das bedeutet, dass sie im gesamten Scherspalt kon-
stant ist und aus der Winkelgeschwindigkeit Ω wie
wird schließlich folgt berechnet werden kann:

τ (ri ) Ω
Ω= ⋅ (β −1).  Gl. 4.15 γ =  Gl. 4.19
2⋅η tan α

Berechnet man beispielsweise Scherrate und Schub- Die zugehörige Schubspannung τ lässt sich aus dem
spannung am Innenzylinder, so liefern die Gl. 4.12 und gemessenen Moment ermitteln. Es gilt:
4.15 ein korrespondierendes Wertepaar der Fließkurve.
R
2⋅π 3
M M = ∫ τ ⋅ 2 ⋅ π ⋅ r 2 dr; M = ⋅ R ⋅τ 
τ (ri ) =  Gl. 4.16 3
2 ⋅ π ⋅ h ⋅ ri2 0

2 ⋅Ω
und  γ (ri ) =  Gl. 4.17
( −1)
β
Abgesehen vom Vorzeichen erhält man das gleiche
Ergebnis, wenn der Innenzylinder rotiert und der
Außenzylinder ruht, und solange parallele Schich-
tenströmung vorliegt.
4.2.3 Die Kegel-Platte-Strömung
Zwischen einer horizontalen Platte und einem Kegel
befindet sich eine Flüssigkeit. Damit die Kegelspitze
die Platte nicht berührt und so das Ergebnis verfäl-
schen würde, ist sie um wenige µm abgeschnitten
(. Abb. 4.9). Dreht sich der Kegel gegenüber der Platte
mit konstanter Winkelgeschwindigkeit Ω, so stellt
sich im Spalt näherungsweise eine stationäre paral-
lele Schichtenströmung ein, wenn der Winkel α klein
genug ist (α ≈ 1°).
Mit den Koordinaten φ als Fließrichtung, ϑ als
Scherrichtung und r als indifferente Richtung lauten
die rheologischen Stofffunktionen:
3 M
d. h.  τ = ⋅  Gl. 4.20
2 π ⋅ R3
Beim Kegel-Platte-Rheometer kann demnach
aus gemessenem Drehmoment und zugehöriger
Drehzahl mit Gl. 4.19 und 4.20 auf einfache Weise
ein Wertepaar der Fließkurve berechnet werden.
Darüber hinaus ist auch die Ermittlung der Nor-
malspannungsfunktionen F 1 ( γ 2 ) und F 2 ( γ 2 )
möglich (sie werden im weiteren Verlauf mit F1 und
F2 abgekürzt). Auf die Theorie dazu soll hier nicht
näher eingegangen werden; dafür wird das Lehr-
buch von [2] empfohlen. Es sei jedoch angeführt,
dass die Summe der Normalspannungsfunktio-
nen F1 und F2 sich durch die Messung des Boden-
drucks pw an radial verschiedenen Stellen der Platte
(. Abb. 4.9) über die folgende Gleichung bestim-
men lässt:
r
pw = −(σϑ ) = −( F1 + F2 ) ⋅ ln − σϑ ( R )  Gl. 4.21
w R
Aus Gl. 4.21 geht hervor, dass eine grafische Darstel-
lung der Messergebnisse in der Form pw über ln(r/R)
Kapitel 4 · Rheologie von B
­ iosuspensionen
. Abb. 4.9  Die Kegel-Platte-Strömung
Geraden liefert, deren Steigung gleich (F1 + F2) ist. Die
Differenz der Normalspannungsfunktion (F1 – F2)
lässt sich aus der Axialkraft K berechnen, die auf den
Kegel ausgeübt wird. Da für r = R die Normalspannung
am Boden in indifferenter, also in radialer Richtung,
abgesehen vom Vorzeichen gleich dem Außendruck p0
ist [σr(R) = –p0 für ϑ = π/2], folgt – unter der Annahme,
dass an dieser Stelle tatsächlich noch parallele Schich-
tenströmung herrscht – aus den Gl. 4.18 und 4.21
pw = −( F1 + F2 )⋅ ln
r
− F2 + p0 
R Ansatz der Form
R⋅cosα
K = 2⋅π⋅ ∫ p w ⋅ r dr = π ⋅ R2 ⋅ p0 − π ⋅ R 2 ⋅ F2
0
π ⋅ R2
+ ⋅ ( F1 + F2 )
2 gestattet, eine beliebige parallele Schichtenströmung
π ⋅ R2
K = π ⋅ R 2 ⋅ p0 + ⋅ ( F1 − F2 )  Gl. 4.22
2 Betrachtet man jedoch die . Abb. 4.3, so erkennt
Wird die Axialkraft K und der Bodendruck an zwei
radialen Positionen gemessen, dann lassen sich beide
Normalspannungsdifferenzen bestimmen.
Hat die zweite Normalspannungsdifferenz keine
große Bedeutung, wie das häufig der Fall ist, so
genügt eine der genannten Messungen, um die erste
Normalspannungsdifferenz zu ermitteln. Auf weitere
Rheometerströmungen soll hier nicht näher einge-
gangen werden. Vielmehr soll etwas später noch eine
115 4
mehr praxisbezogene Methode, das Rührer-Rheo-
meter, angesprochen werden.
4.3 Mathematische Modellierung
der stationär ermittelten
Fließkurve
Durch Aneinanderreihen von Messungen mit den
verschiedenen im vorigen Abschnitt behandel-
ten Rheometertypen ist man in der Lage, die Fließ-
kurve τ( γ ) einer Flüssigkeit in einem außerordent-
lich weiten Beanspruchungsbereich experimentell
zu ermitteln. Der nächste Schritt ist der Versuch,
die gefundenen Messwerte durch eine mathema-
tische Funktion zu beschreiben. Dadurch wäre es
möglich, andere Strömungsformen – beispielsweise
die parallele Schichtenströmung in einem breiten
Spalt oder weitere komplexe Prozessströmungen –
zu berechnen. Für Biosuspensionen bieten sich fol-
gende Ansätze an: (1) Potenzansätze, (2) Polynome,
(3) Modelle für Fließkurven mit Fließgrenzen.
4.3.1 Potenzansatz
Lassen sich die Wertepaare τ und γ einer gemesse-
nen Fließkurve in einer doppeltlogarithmischen Auf-
tragung durch eine Gerade annähern, so führt ein
τ = k ⋅ γ n  Gl. 4.23
zum Ziel. Der Vorteil der Gl. 4.23 liegt vor allem in
dem sehr einfachen mathematischen Aufbau, der es
analytisch zu behandeln. k wird der Konsistenz-, n
der Fließindex genannt.
man, dass ein Potenzansatz nur kleine Bereiche der
abgebildeten Fließkurve mathematisch beschrei-
ben kann, da sich die Steigung in dieser Kurve
ständig ändert. Beispielsweise lässt sich der Bereich
von γ  = 5 · 102 s–1 bis  γ  = 104 s–1 in der vorliegenden
doppeltlogarithmischen Auftragung ausreichend
genau durch eine Gerade und damit mittels Gl. 4.23
darstellen. Der entscheidende Nachteil des Potenz-
ansatzes wird jedoch in einer etwas anderen Schreib-
weise von Gl. 4.23 ersichtlich
 116 H. Chmiel und E. Walitza
τ Für höhere Scherraten ist jedoch, wie man
η= = k ⋅ γ n−1 
γ
Für n ≠ 1 und γ  → 0 geht η→ 0, d. h. bei verschwin-
dender Beanspruchung wird die mit Gl. 4.23 berech-
nete Viskosität null. Ein weiterer Mangel ist, dass die
Dimension von k vom Exponenten n abhängt.
Trotz dieser formalen Nachteile gibt es genü-
4 gend Beispiele für eine sinnvolle Anwendung des
Potenzansatzes dank des einfachen mathematischen
Aufbaus. Beispielsweise lässt sich damit für nicht zu
niedrige Scherraten die Geschwindigkeitsverteilung
in einem Couette-Spalt für nicht-Newton’sche new-
tonsche Flüssigkeiten vorausberechnen.
4.3.2 Polynomansätze
Die Erfahrung lehrt, dass der Anfangsbereich der
Fließkurve jeder nichtnewtonschen Flüssigkeit ausrei-
chend genau durch die folgende Gleichung erfüllt ist:
3
γ τ τ 
= +    Gl. 4.24
C A  A
A und C sind Konstanten. . Abb. 4.10 zeigt dies am
Beispiel einer 0,8 %igen wässrigen Polyacrylamid-
Lösung (Molekulargewicht: ca. 107 Dalton).
. Abb. 4.10  Fließkurve einer 0,8 %igen wässrigen
Polyacrylamid-Lösung. Die eingezeichnete Kurve stellt ein
Polynom dritten Grades dar, die unterschiedlichen Symbole
deuten die Verwendung verschiedener Rheometertypen an
sieht, ein Polynom dritten Grades nicht mehr fle-
xibel genug. Aus . Abb. 4.3 ist zu ersehen, dass ein
Polynom siebten Grades der Form
 τ  τ 3  τ 5  τ 7 
γ = c ⋅  +   + d ⋅   + e    Gl. 4.25
 a  a  a a 

(durchgezogene Kurve) einen außerordentlich
weiten Bereich der gemessenen Fließkurve mathe-
matisch annähert (a, c, d und e sind Konstanten). Mit
dem Polynomansatz lassen sich also typische Kurven
wie in . Abb. 4.3. besser beschreiben. Der mathema-
tische Aufbau ist jedoch komplexer.
4.3.3 Modellfunktionen für
Fließkurven mit Fließgrenze
Für viele Suspensionen wird die Existenz einer Fließ-
grenze postuliert; d. h. erst oberhalb einer Mindest-
schubspannung τ0 beginnt die Suspension zu fließen.
Casson hat zur Beschreibung eines derartigen Fließ-
verhaltens eine Beziehung der Form
1/ 2
τ1/ 2 = (b ⋅ γ ) + τ10/ 2  Gl. 4.26
angegeben. b ist eine Konstante, die sich aus dem
asymptotischen Verhalten für große  γ  als η∞ ergibt.
Gl. 4.26 ist – wie später noch gezeigt wird – in einer
modifizierten Form in der Lage, das stationäre Fließ-
verhalten einer Reihe von Biosuspensionen in einem
weiten Beanspruchungsbereich zu beschreiben.
Herschel und Bulkley schlagen folgende Bezie-
hung vor:
τ = τ HB + C ⋅ γ p  Gl. 4.27
mit τ HB , der Fließg renze nach Hers chel/
Bulkley; C, dem Fließkoeffizient; und p, dem
Herschel-Bulkley-Exponenten.
4.4 Repräsentative Viskosität
In 7 Abschn. 4.2 wurden Formeln zur Berechnung
von rheologischen Größen für Strömungen, die in
Experimenten einfach erzeugt werden können, her-
geleitet. Diese Formeln sind für den newtonschen
Kapitel 4 · Rheologie von ­Biosuspensionen
117 4
Fall einfach aufzulösen, jedoch nicht immer für den Ω = 1 s−1 aufgetragen. Man erkennt, dass sich γ rep für
nichtnewtonschen Fall. Dafür sind verschiedene große Couette-Spalte, (ri/ra) → 0, einem konstanten
Methoden erarbeitet worden. Im 7 Abschn. 4.1 wurde Wert annähert, d. h. es ist dann unabhängig von der
am Beispiel des Rohrrheometers ein Weg gezeigt, bei Spaltweite. Schon für Radienverhältnisse von ri/ra =
welchem eine Differenziation des gemessenen Zusam- 0,3 liegt der Wert von γ rep nur noch 10 % über dem
menhangs V =  V (Δp) zur wahren Fließkurve führt. Da konstanten Wert.
diese und andere exakte Methoden aufwendig sind, Weiterhin soll der repräsentative Radius rrep
bestand der Bedarf an einer einfach durchzuführenden angegeben werden. Er kennzeichnet die Stelle im
Auswertung. Als solche ist die Methode der repräsen- Couette-Spalt, an der die repräsentative Scher-
tativen Viskosität zu sehen. Dieser liegt der folgende rate mit der Scherrate eines newtonschen Fluids
Gedanke zugrunde: Man werte die Messergebnisse übereinstimmt.
zunächst so aus, als ob es sich um ein newtonsches
2
Fluid handle. Die so gewonnene Viskosität kann als rrep γ New 2
= = 
wahre Viskosität bei einer, der jeweiligen Geometrie ri2 γ rep ξ ⋅ (1 − β )
entsprechenden, repräsentativen Scherrate interpre-
tiert werden. Letztere bleibt dann zu bestimmen. oder
Für mehrere Stoffklassen konnte gezeigt werden,
dass die repräsentative Scherrate γ rep sich nur um rrep 2
=  Gl. 4.29
einen nahezu konstanten Faktor von der für newton- ri ξ ⋅ (1 − β )
sche Fluide verwendeten Scherrate γ New unterschei-
det. So ist z. B. im Couette-Rheometer . Abb. 4.12 zeigt den repräsentativen Radius in
Abhängigkeit vom Quadrat des Radienverhältnisses
2 ⋅Ω für den Polynomansatz. Für große Spaltweiten befin-
γ rep = ξ ⋅ Ω = ξ * ⋅ γ New = ξ * Gl. 4.28
(1 − β ) det sich der repräsentative Ort in konstanter Entfer-
nung vom Innenzylinder. Für enge Spalte nähert er
Je nachdem, ob man γ rep auf γ New oder auf Ω bezieht, sich dem inneren Rand.
erhält man unterschiedliche Proportionalitätskons- Analog dem Vorgehen für das Couette-Rheome-
tanten ξ oder ξ*. ter kann man für das Rohr oder andere Strömungs-
Das zunächst empirisch eingeführte Verfahren geometrien verfahren. Man erhält für das Rohr die
kann auch theoretisch begründet werden [5]. repräsentative Scherrate
In . Abb. 4.11 ist γ rep, welches für den Polynoman-
satz Gl. 4.24 exakt errechnet wurde, über dem Radien- V π
γ rep = 3 = γ New  Gl. 4.30
verhältnis ri/ra bei konstanter Winkelgeschwindigkeit R 4

. Abb. 4.11  Repräsentative

Scherrate γ rep in Abhängigkeit
vom Radienverhältnis ri/ra des
Couette-Systems, berechnet für den
Polynomansatz dritter Ordnung, bei
konstanter Winkelgeschwindigkeit
Ω = 1 s−1
 118 H. Chmiel und E. Walitza

. Abb. 4.12  Auf ri bezogener

rrep in Abhängigkeit vom Quadrat
β des Radienverhältnisses ri/ra des
Couette-Systems, berechnet für den
Polynomansatz dritter Ordnung

Die mit rrep aus der wahren Fließkurve gewonnene nicht geeignet. Dies liegt daran, dass die suspendierte
repräsentative Viskosität ηrep hat den Vorteil – wenn Biomasse oft schnell sedimentiert und außerdem für
man mit ihr die in der Strömungstechnik für die die Spaltgeometrien zu große Teilchen enthält. Um
Rohrströmung gebräuchliche Reynoldszahl diese Schwierigkeiten zu umgehen, kann man den
inneren Zylinder eines Zylinder-Couette-Rheo-
v⋅ d ⋅ρ meters durch einen Rührer ersetzen [3]. Durch die
Re =  Gl. 4.31 Mischwirkung des Rührers kann die Sedimentation
ηrep
weitgehend vermieden werden; auch das Problem
4 ⋅V des engen Spaltes tritt nicht mehr auf. Für den lami-
bildet (mit v = der mittleren Strömungsge-
π⋅d2 naren Bereich wurde die folgende empirische Aus-
schwindigkeit, d dem Rohrdurchmesser und ρ der wertemethode entwickelt, die nur solange gilt, wie
Dichte der Flüssigkeit) und den Widerstandsbei- elastische Effekte zu vernachlässigen sind.
wert f Die Leistung P eines Rührers ergibt sich aus dem
am Rührerschaft auftretenden Drehmoment M und
p′d
f =  Gl. 4.32 der Drehzahl n zu
2 ⋅ v2
P = 2⋅ π ⋅ n⋅ M  Gl. 4.34
mit ihr korreliert –, dass der für die laminare Rohr-
strömung newtonscher Flüssigkeiten gefundene Andererseits hängt die Leistung im laminaren
Zusammenhang Bereich (Re < 10) bei newtonschen Flüssigkeiten von
den Rührerdimensionen und der Drehzahl ab, wie es
16
f =  Gl. 4.33 in Gl. 4.35 angegeben ist.
Re
auch für nichtnewtonsche Flüssigkeiten seine Gül- C
P= ⋅ ρ ⋅ n3 ⋅ d 5  Gl. 4.35
tigkeit behält. Re

C ist eine Konstante, die von der Geometrie des

4.5 Das Rührer-Rheometer Rührers bestimmt wird. Re, die Reynoldszahl des
Rührers für newtonsche Flüssigkeiten, ist als
Die in den vorausgegangenen Abschnitten beschrie-
ρ⋅ n⋅ d 2
benen Rheometeranordnungen sind für die Verwen- Re =  Gl. 4.36
η
dung von Fermentationsbrühen unter Umständen
Kapitel 4 · Rheologie von B
­ iosuspensionen
definiert (siehe auch 7 Kap. 6). d ist der Rührer-
durchmesser, ρ die Dichte und η die Viskosität der
Flüssigkeit.
Die Konstante C wird unter Verwendung eines
newtonschen Fluids mit bekannter Viskosität (z. B.
ein Eichöl) für den jeweiligen Rührer bestimmt. Mit
den Gl. 4.35 und 4.36 kann man den Zusammenhang
zwischen den Messgrößen M und n und der Visko-
sität herstellen:
C dafür sind die bereits unter 7 Abschn. 4.1 aufgeführten
M= ⋅η ⋅n⋅d3  Gl. 4.37
2⋅π
Verwendet man nichtnewtonsche Flüssigkeiten im
Rührer-Rheometer, dann befindet man sich in der-
selben Situation wie bei den im Vorausgegangenen
behandelten Rheometerströmungen. Wegen der
komplizierten Verhältnisse im Rührer-Rheometer
lässt sich allerdings nicht einmal für ein newton-
sches Fluid das Geschwindigkeitsfeld berechnen,
aus welchem man eine Scherrate ermitteln könnte.
Im Falle der nichtnewtonschen Flüssigkeit
ersetzt man wieder η durch ηrep und hat dann mit
Gl. 4.37 eine Möglichkeit, eine Fließkurve anzugeben.
Betrachtet man den aus Gl. 4.37 ermittelten repräsen-
tativen Wert als einen Wert der wahren Fließkurve –
die in diesem Fall als bekannt angenommen werden
muss –, so lässt sich der Drehzahl eine repräsentative
Scherrate zuordnen.
Bei Untersuchungen mit verschiedenen nicht-
newtonschen Flüssigkeiten ergab sich, dass die reprä-
sentative Scherrate proportional zur Drehzahl ist,
wobei die Proportionalitätskonstante c von der Geo-
metrie des Rührers abhängt.
γ rep = c ⋅ n  Gl. 4.38
Für einen Propellerrührer wurde z. B. C = 10, für
einen Turbinenrührer c = 15 und für einen Wendel-
rührer c = 30 gefunden.
Wird das Rührer-Rheometer wie ein Rührkes-
sel betrieben, kann man unter Verwendung von
Gl. 4.37, der wahren Fließkurve und der repräsen-
tativen Scherrate die notwendige Leistung voraus-
berechnen. Es sei nochmals betont, Gl. 4.37 gilt nur
für laminare Strömung und inelastische Fluide. Der
turbulente Bereich kann leicht an einem plötzlichen
Anstieg der Leistungsaufnahme erkannt werden.
119 4
4.6 Die instationäre Scherströmung
viskoelastischer Fluide
Wird eine viskoelastische Flüssigkeit – eine Flüssig-
keit, die sowohl viskose als auch elastische Eigenschaf-
ten hat – einer plötzlichen Deformation unterworfen,
dann stellt sich der neue Spannungszustand, selbst
wenn Trägheitseffekte vernachlässigt werden können,
erst mit einer gewissen zeitlichen, für die Flüssigkeit
charakteristischen Verzögerung ein. Verantwortlich
Wechselwirkungen der im Fluid befindlichen Teil-
chen mit der sie umgebenden Flüssigkeit oder unter-
einander, die mit Desagglomeration/Agglomeration,
elastischer Deformation und/oder Orientierung in
der Scherströmung verbunden sind. Je nach der Grö-
ßenordnung der zu erwartenden charakteristischen
Zeiten bieten sich verschiedene Messverfahren an,
wie z. B. das Aufbringen einer sprunghaften Ände-
rung der Scherrate (Spannungsrelaxationsversuch),
einer kontinuierlich mit der Zeit zu- und anschlie-
ßend wieder abnehmenden Scherrate für große cha-
rakteristische Zeiten, oder das oszillierende Scher-
experiment, auf das hier näher eingegangen werden
soll. Die im Folgenden beschriebenen Oszillations-
Messverfahren sind stets auf den linearen Bereich
begrenzt, d. h. dass man sich bei realen Fluiden im
Allgemeinen auf kleine Deformationen bzw. Defor-
mationsgeschwindigkeiten beschränken muss.
4.6.1 Das sinusförmig oszillierende
Scherexperiment
Zur Bestimmung der sogenannten Materialfunk-
tionen der linearen Viskoelastizität wird am häu-
figsten das sinusförmig oszillierende Scherexperi-
ment mit kleiner Amplitude durchgeführt. Was in
diesem Experiment bei einer viskoelastischen Flüs-
sigkeit zu erwarten ist, erkennt man am besten,
wenn man zunächst die idealen Fälle des newton-
schen Fluids und des Hooke’schen Körpers betrach-
tet (. Abb. 4.13).
Für das newtonsche Fluid mit der konstanten
Viskosität η gilt, dass die Schubspannung τ propor-
tional zur Scherrate (. Abb. 4.13a) ist. Das „Ersatz-
schaltbild“ ist der Dämpfer (rechts). Für eine sinus-
förmig oszillierende Scherrate folgt
 120 H. Chmiel und E. Walitza

Nachdem die Scherrate, die ja die zeitliche Ableitung

des Scherwinkels γ ist, als

γ = γ 0 ⋅ sin ω ⋅ t 

angesetzt war, gilt für die Scherung

γ 0
γ =− ⋅ cos ω ⋅ t = γ 0 ⋅ cos ω ⋅ t 
4 ω
Für Gl. 4.41 kann man deshalb auch schreiben

τ 0 ⋅ cos ϕ τ ⋅ sin ϕ
τ= ⋅ γ + 0 ⋅ γ = η′ ⋅ γ + G′ ⋅ γ 
γ 0 γ0

Gl. 4.42
. Abb. 4.13  Das sinusförmig oszillierende
Scherexperiment: (a) newtonsches Fluid, (b) Hooke’scher Kennt man also die Phasenverschiebung φ zwi-
Körper und (c) viskoelastische Flüssigkeit (rechts jeweils das schen Schubspannung und Scherrate sowie die
dazugehörige mechanische Modell) Amplituden der beiden Letzteren, dann lässt sich
die Schubspannung nach Gl. 4.42 in einen der
τ = τ 0 ⋅ sin ω ⋅ t = η ⋅ γ 0 sin ω ⋅ t  Gl. 4.39 Scherrate und einen der Scherung proportiona-
len Anteil zerlegen. Die Proportionalitätskonstan-
ten sind jeweils eine Viskosität η′ und ein elasti-
Beim Hooke’schen Körper mit dem konstanten elas- scher Modul G′, die in Gl. 4.42 definiert sind. Beide
tischen Modul G ist die Schubspannung proportional zusammen bestimmen die Materialfunktion der
der Scherung γ. Im Fall sinusförmig oszillierender linearen Viskoelastizität.
Scherung gilt also Eine andere Vorgehensweise, die Materialfunk-
tion der linearen Viskoelastizität einzuführen, ist die
τ = Gγ 0 ⋅ sin ω ⋅t  Gl. 4.40 folgende: In Analogie zum stationären Fließen wird
durch den Quotienten der sinusförmig oszillierenden
Da die Scherrate um π/2 gegen die Scherung ver- Größen τ und γ , ausgedrückt in komplexer Schreib-
schoben ist, bedeutet Gl. 4.40 auch, dass beim Hoo- weise durch τ* und γ *, eine komplexe Viskosität
ke’schen Körper die Spannung um π/2 gegen die η*definiert:
Scherrate verschoben ist (. Abb. 4.13b). Das „Ersatz-
i⋅(ω ⋅t −ϕ)
schaltbild“ ist die Feder (rechts). τ * τ 0e τ e−i⋅ϕ τ 0.(cos ϕ − i ⋅ sin ϕ )
η* = = ⋅ω ⋅
= 0 =
Ein Fluid, welches sowohl viskose als auch elasti- γ * γ 0 ⋅ e i t γ 0 γ 0
sche Eigenschaften besitzt und sich linear verhält, wird τ0 τ
= η* e−i⋅ϕ = η′ − i ⋅ η′′ = ⋅ cos ϕ − i ⋅ 0 ⋅ sin ϕ
also auf eine sinusförmig oszillierende Scherrate mit γ 0 γ 0
einer ebensolchen Schubspannung antworten, wobei
sich ein Phasenwinkel φ zwischen Schubspannung  Gl. 4.43
und Scherrate einstellt, der irgendwo (je nach Fluid)
zwischen 0 und π/2 liegt (. Abb. 4.13c). Das „Ersatz- Der Realteil η′ wird viskose, der Imaginärteil η″ wird
schaltbild“, Dämpfer und Feder in Reihe geschaltet elastische Komponente der komplexen Viskosität
(rechts), wird auch Maxwell-Modell genannt. genannt (. Abb. 4.14).
Diese Bezeichnungen leuchten durch Vergleich
τ = τ 0 ⋅ sin (ω ⋅ t + ϕ ) mit Gl. 4.42 ein. Der Phasenwinkel φ wird auch vis-
= τ 0 (cos ϕ ⋅ sin ω ⋅ t + sin ϕ ⋅ cos ω ⋅ t )  Gl. 4.41 koelastischer Phasenwinkel genannt. Er stimmt mit
Kapitel 4 · Rheologie von B
­ iosuspensionen
121 4
4.6.2 Oszillierendes Scherexperiment
in Rotationsviskosimetern

Das oszillierende Scherexperiment kleiner Ampli-

. Abb. 4.14  Darstellung der komplexen Viskosität η* im
Vektordiagramm
dem Phasenwinkel φ in . Abb. 4.13c überein. Bezieht
man τ* auf γ*, so kann ein komplexer, elastischer
Modul G* definiert werden:
tude im Kegel-Platte- oder im Zylinder-Couette-Sys-
tem wird im Allgemeinen so durchgeführt, dass eine
der Flächen, die den Messspalt begrenzen, in sinus-
förmige Oszillationen versetzt wird. Durch das im
Spalt befindliche Fluid wird ein Drehmoment auf die
gegenüberliegende, starre Seite übertragen und kann
dort leicht gemessen werden. Θ sei der Winkel, der
die Position des bewegten Teils des Messsystems von
einem Bezugspunkt aus beschreibt, und es gelte für
die Schubspannung τ und die Scherung γ in komple-
xer Schreibweise der jeweils lineare Zusammenhang
τ * = e ⋅ M *; γ * = d ⋅ Θ*  Gl. 4.46

τ* Mit τ* = G* · γ* folgt dann

G* = = G* ⋅ eiϕ = G′ + i ⋅ G′′  Gl. 4.44
γ*
d * *
M*= ⋅ G ⋅Θ 
e
Wegen des Zusammenhangs γ * = i · ω · γ*, lässt sich
G* in η* umrechnen. Es ist nämlich d/e = b ist eine Konstante, die von der Geomet-
rie des Messspalts abhängt. Sie lautet im Falle des
τ* τ* G* Kegel-Platte-Systems
η* = = = −i ⋅ 
γ * i⋅ω ⋅ γ * ω
2 ⋅ π ⋅ R3
b=  Gl. 4.47
3⋅α
woraus folgt
worin R den Kegelradius und α den Winkel der
G′ = ω ⋅ η′′; G′′ = ω ⋅ η′  Gl. 4.45 Kegelmantelfläche gegen die Platte bedeuten. Für
das Zylinder-Couette-System gilt
Je nachdem, ob man sich mit mehr flüssigen oder
mehr festen Stoffen beschäftigt, ist die Verwendung 4 ⋅ π ⋅ ri2 ⋅ ra2 ⋅ h
b=  Gl. 4.48
von η* oder G* angezeigt. Sie enthalten jedoch die- (ra2 − ri2)
selbe Information. G′ nennt man auch den Speicher-
modul und G″ den Verlustmodul. mit ri, dem inneren Radius; ra, dem äußeren Radius;
Die experimentelle Ermittlung von η* und G* und h, der Höhe des Messspalts.
kann in den üblichen Messgeometrien durchge- Die Messung von |Θ*| und |M*| sowie des Pha-
führt werden, wobei je nach Fluid die eine oder senwinkels ϕ zwischen Θ* und M*, erlaubt G* bzw.
andere besser geeignet ist. Die Schubspannung η* (siehe Gl. 4.46) zu bestimmen. Für die Komponen-
und die Scherrate sind dabei, wie schon bei den ten des elastischen Moduls G* ergibt sich
stationären Methoden gezeigt wurde, nicht direkt *
zugänglich, sondern sie müssen aus den messba- 1 M
G′ = ⋅ * ⋅ cos φ  Gl. 4.49
ren Größen abgeleitet werden. Wie dies zu gesche- b Θ
hen hat, soll am Beispiel der Kegel-Platte-, der
*
Zylinder-Couette- und der Rohrgeometrie gezeigt 1 M
G′′ = ⋅ * ⋅ sin φ  Gl. 4.50
werden. b Θ
 122 H. Chmiel und E. Walitza
4.7 Dehnströmungen
Bisher wurden nur reine Scherströmungen betrach-
tet. In einem Bioreaktor aber ist die Strömung,
welche die Sedimentation verhindern und den
Stofftransport verbessern soll, keine reine Scher-
strömung, sondern es sind auch Dehnanteile ver-
treten. Der Dehnviskosität kommt damit derselbe
4 Stellenwert wie der Scherviskosität zu. Bei kompli-
ziertem Fließverhalten gibt es keine Möglichkeit,
aus dem Scherverhalten auf das Dehnverhalten zu
schließen. Für eine vollständige rheologische Cha-
rakterisierung müssen also beide Größen bestimmt
werden.
Während bei Festkörpern die Bestimmung der
mechanischen Eigenschaften unter Dehnverformung
weit entwickelt wurde, ist das bei Flüssigkeiten nicht
der Fall. Ursache dafür ist, dass reine Dehnströmung
als Rheometerströmung bei Flüssigkeiten nicht so
leicht zu erzeugen ist. Reine Dehnströmungen zeigen
nur Veränderungen der Geschwindigkeitskomponen-
ten in der jeweiligen Koordinatenrichtung. In kartesi-
schen Koordinaten treten also nur die Deformations-
geschwindigkeitskomponenten ∂v x/∂x, ∂v y/∂y und
∂vz/∂z auf.
Wegen der Inkompressibilität der hier verwende-
ten Flüssigkeiten gilt auch div(v ) = 0. Unter Berück-
sichtigung von div(v ) = 0 kann man unterscheiden
nach ebener oder planarer Dehnung
∂v x ∂v ∂v z
=− y ; =0
∂x ∂y ∂z
einfacher monoaxialer Dehnung
∂v x ∂v y ∂v 1 ∂v
≠ 0; = z =− ⋅ x 
∂x ∂y ∂z 2 ∂x
und zweifacher oder biaxialer Drehung
∂v ∂v
∂v x ∂v
≠ 0; x = y ; z = −2 ∂v x  Gl. 4.51
∂x ∂x ∂y ∂z ∂x
Wegen der Inkompressibilität können nur Differen-
zen von Normalspannungen gemessen werden, und
es treten somit höchstens zwei Normalspannungs-
differenzen auf. Mithilfe der einfachen monoaxialen
Dehnung definiert man die Dehnviskosität ηd
ηd =
(
2 ⋅ σx − σ y ) Gl. 4.52
∂v x / ∂x
ηd nennt man auch die Trouton-Viskosität. Sie ist beim
newtonschen Fluid das Dreifache der Scherviskosität.
In der Literatur sind nur wenige Dehnrheometer
für Flüssigkeiten bekannt geworden. Zu nennen sind
der 4-Rollen-Apparat nach Taylor [2] und weitere
diverse Apparate, in denen Staupunktströmungen
erzeugt werden. Bei Flüssigkeiten, aus welchen ein
Faden gezogen werden kann, lässt sich über das
Messen der Fadendicke und der Fadenspannung
ebenfalls die Dehnviskosität in monoaxialer Bean-
spruchung bestimmen.
Dehnung kann genauso wie die Scherung oszil-
lierend betrieben werden, und man erhält die ent-
sprechenden viskoelastischen Materialfunktionen
wie bei der Scherung.
Besondere Bedeutung hat die Dehnviskosität für
die Begasung von Bioreaktoren, da die Prozesse der
Blasenentstehung, des Dispergierens von Blasen und
die Blasenkoaleszenz mit Dehnströmung verbunden
sind, und zwar solange die Blasen groß sind gegen-
über den Bestandteilen, die der Biosuspension die
viskoelastischen Eigenschaften verleihen. Nur dann
kann die extreme Zunahme der Dehnviskosität mit
der Dehngeschwindigkeit, wie man sie bei viskoelas-
tischen Stoffen findet, wirksam werden.
4.8 Das Fließverhalten von
Fermentationsbrühen
Die meisten Literaturdaten zu rheologischen Unter-
suchungen an Fermentationsbrühen beschränken
sich auf stationäre Messungen.
[6] fanden bei der batch-Fermentation von Peni-
cillium chrysogenum mit dem Couette-Rheometer
für Scherraten oberhalb 1 s−1 eine Fließkurve, die
sich gut durch ein Potenzgesetz beschreiben lässt
(. Abb. 4.15). Parameter ist die Biomassekonzentra-
tion. Für den gleichen Mikroorganismus untersuchten
[11] den Einfluss der Morphologie. Sie fanden, dass
sich die rheologischen Eigenschaften der Biosuspen-
sion während der Fermentation nicht nur in Abhän-
gigkeit von Biomassekonzentration, sondern auch mit
der Morphologie des Penicillium chrysogenum ändern.
Kapitel 4 · Rheologie von B
­ iosuspensionen
. Abb. 4.15  Scheinbare Viskosität
einer Biosuspension von Penicillium
chrysogenum für verschiedene
Biomassekonzentrationen nach [6]
(1999)
Systematische rheologische Untersuchungen
an Fermentationsbrühen, welche sowohl das statio-
näre als auch das instationäre Fließen zum Gegen-
stand haben, sind in der Literatur bisher nur spärlich
bekannt geworden (z. B. [8]). Im Folgenden sollen
aus eigenen Untersuchungen an einem speziellen
Beispiel eines mycelbildenden Bakteriums aus der
Gruppe der Actinomyceten, Streptomyces tendae,
die variable Viskosität und die Viskoelastizität dar-
gestellt werden.
4.8.1 Rheologisch relevante
Parameter
Als die wichtigsten Parameter des Fließverhaltens
von Fermentationsbrühen sind zu nennen: die Vis-
kosität der flüssigen Phase, die volumetrische Zell-
konzentration, die Morphologie und die physikali-
schen Eigenschaften des Mycels.
Bei einer Messung mit einer der herkömmlichen,
makrorheologischen Messmethoden, bei denen
ein homogenes Kontinuum vorausgesetzt wird,
bekommt man ein globales Bild des Fließverhaltens
und der oben angeführten Parameter.
123 4
Um die Ergebnisse richtig interpretieren zu
können, muss für die jeweilige Probe jeder der
genannten Parameter bekannt sein. Die Viskosität
der flüssigen Phase und die volumetrische Zellkon-
zentration sind relativ einfach zu bestimmen. Als
Maß für Letztere kann die Biotrockenmasse ver-
wendet werden. Schwieriger ist es bei der Morpho-
logie. Hierbei handelt es sich nicht um eine einzige
physikalische Größe, sondern um ein Phänomen,
welches nur mithilfe mehrerer Größen beschrieben
werden kann.
Neben Form und Größenverteilungen – . Abb. 4.16
zeigt eine typische Pelletgrößenverteilung einer im
Schüttelkolben durchgeführten Fermentation von
Streptomyces tendae –, die ein „äußeres Bild“ des Mycels
abgeben, ist es auch wichtig, die Struktur im Kleinen zu
kennen. Ein geeignetes Maß dafür könnte eine Perme-
abilität und eine Porosität sein, wie man sie dem Mycel
über eine hydraulische Permeation, z. B. realisiert in
einer Kuchenfiltration, zuordnen kann.
Zur Bestimmung der physikalischen Eigenschaf-
ten des Mycels sind die sogenannten mikrorheolo-
gischen Methoden, wie sie z. B. in der Blutrheolo-
gie schon lange angewandt werden, angezeigt. Mit
diesen Methoden versucht man, Elastizitätsmoduln
 124 H. Chmiel und E. Walitza
4
. Abb. 4.16  Pelletgrößenverteilung von Streptomyces
tendae aus einer Fermentation im Schüttelkolben.
Aufgetragen ist die Anzahl der Pellets aus 1 mL Brühe, die in
das Pelletdurchmesserintervall zwischen d und d + Δd fallen,
pro Intervallbreite Δd
von Mycel direkt an einer Mycelflocke oder im
noch kleineren Maßstab direkt an einer Hyphe zu
bestimmen.
Die elastische Deformierbarkeit und die Per-
meabilität einer Mycelflocke sind von entschei-
dender Bedeutung für den intra-myceliären Stoff-
transport, da eine Flocke auf ihrem Weg durch den
Reaktor lokal sehr unterschiedlichen Spannungen
ausgesetzt wird, was entsprechend der jeweils daraus
resultierenden Deformation zu Volumenverschie-
bungen aus dem Mycel in den umgebenden Raum
und umgekehrt führen kann, wobei die jeweiligen
Deformationsänderungen sich nur gemäß dem Rela-
xationsverhalten einstellen können. Im Falle reiner
Diffusion werden die intra-myceliären Diffusionsko-
effizienten durch die Porosität beeinflusst.
Bei einer vollständigen Bestimmung der oben
angeführten Parameter müsste sich eine Stoffglei-
chung erstellen lassen, die allein daraus das Fließ-
verhalten einer Fermentationsbrühe beschreiben
könnte. Wegen der Komplexität der Morphologie
und der physikalischen Eigenschaften wird man
jedoch bei vertretbarem Aufwand immer auf die
„Kontinuums-Rheologie“ angewiesen sein, sodass
Mikro- und Makrorheologie sich ergänzen müssen.
Alle rheologischen Messungen, die im Folgenden
gezeigt sind, wurden im konventionellen Zylinder-
Couette-System mit 3 mm weitem Spalt durchgeführt.
4.8.2 Stationäres Fließen
von André Braun überarbeitet
In . Abb. 4.17 ist die variable Viskosität in Abhängig-
keit der Scherrate für verschiedene Zellmassekon-
zentrationen (in Gramm Trockenmasse pro Liter
Fermentationsbrühe) dargestellt. Die unterschied-
lichen Konzentrationen sind durch Abziehen bzw.
Zugabe von flüssiger Phase hergestellt, wodurch die-
selbe Partikel-Größenverteilung erhalten bleibt.
Für die Kurven mit den höheren Konzentratio-
nen ist bei den kleinsten gemessenen Scherraten eine
starke Abhängigkeit von der Scherrate vorhanden.
Dies und weitere Untersuchungen, auf die hier nicht
weiter eingegangen werden soll, deuten auf das Vor-
handensein einer Fließgrenze hin – darunter ver-
steht man eine mit verschwindender Scherrate über
alle Grenzen wachsende Viskosität bzw. die Möglich-
keit, trotz γ = 0 eine Schubspannung aufrechterhal-
ten zu können. Bei der relativ kleinen Zellkonzentra-
tion von 1 g/L, erhält man bei kleinen Scherraten eine
konstante Viskosität. In diesem Fall ist die Zellmas-
sekonzentration so klein, dass es zu einer Überbrü-
ckung des Messspalts durch Mycelagglomerate und
damit zur Ausbildung der Fließgrenze nicht kommen
kann. Für einen Reaktor hat eine Fließgrenze insofern
Bedeutung, als durch sie in Zonen mit entsprechend
niedriger Schubspannung jede Bewegung unterbun-
den wird. Bei den höchsten Scherraten wird im Allge-
meinen eine weitere Grenzviskosität η∞ asymptotisch
erreicht. Diese deutet sich in . Abb. 4.17 allerdings nur
bei den Proben mit den kleinen Konzentrationen an.
Die Ursache für die Scherverdünnung, d. h. die
Abnahme der Scherviskosität mit zunehmender
Scherrate, liegt vermutlich im Abbau von Myce-
lagglomeraten und anschließender Deformation
und Ausrichtung der einzelnen Mycelgebilde in der
Rheometerströmung. Hinweise hierauf ergaben sich
aus eigenen Beobachtungen der gescherten Suspen-
sion – der äußere Zylinder des Rheometers war aus
Plexiglas gefertigt – und aus Analogien zu anderen
Kapitel 4 · Rheologie von ­Biosuspensionen
. Abb. 4.17  „Scheinbare Viskosität“
einer Suspension aus Pellets von
Streptomyces tendae in Abhängigkeit
der Scherrate für verschiedene
Zellkonzentrationen (Trockenmasse in
Gramm pro Liter Fermentationsbrühe)
biologischen Suspensionen, z. B. Blut, wo ein quali-
tativ ähnliches Fließverhalten gefunden wird.
Die Kurven mit großen Biomassekonzentratio-
nen zeigen bei etwa γ = 3 s–1 deutliche Steigungsän-
derungen. Diese Tatsache lässt auf Veränderungen
der Vorgänge im Messspalt schließen, welche durch
die folgenden Beobachtungen bei zunehmender
Scherrate bestätigt werden.
Bei niedrigen Scherraten bilden filamentöse
Mycelgebilde bzw. Pellets ein Netzwerk, das den
Messspalt überbrückt. Mit wachsender Scherrate tritt
an der Wand Schlupf auf, und zwar zuerst innen, wo
die höhere Spannung auftritt. Oberhalb γ = 3 s–1 löst
sich der Verband in Einzelgebilde bzw. -pellets auf.
In diesem Scherratenbereich kommt die Strömungs-
form derjenigen der parallelen Schichtenströmung
am nächsten.
Wie in . Abb. 4.17 zu sehen ist, haben die Fließ-
kurven in der doppelt logarithmischen Darstellung
oft eine ähnliche Form. Durch geschicktes „Verschie-
ben“ der einzelnen Kurven lassen sich diese in einer
einzigen Kurve (einer sogenannten Masterkurve)
zusammenfassen. Dahinter steckt das Prinzip der
rheologischen Ähnlichkeit. Zwei Flüssigkeiten sind
sich dann ähnlich, wenn ihre Fließkurven in der
doppelt logarithmischen Darstellung kongruent
sind. Die Lage der beiden Fließkurven ist dabei nicht
von Bedeutung. Verschieben lassen sich die Kurven
mit der Normierungsfunktion [9, 10]
125 4
η / H = f (γ / Γ)  Gl. 4.53
Die beiden Schlüsselparameter (H, Γ) sind bestimmt
durch das Verhältnis geeigneter Bezugspunkte in
den beiden Kurven. Als Bezugspunkte eignen sich
die Null- oder Unendlichviskosität sowie die Fließ-
grenze, sofern vorhanden. Im Beispiel einer Potenz-
flüssigkeit sind diese Größen nicht vorhanden und
die Bezugspunkte können willkürlich festgesetzt
werden.
. Abb. 4.18 zeigt die Masterkurve der einander
ähnlichen Kurven aus . Abb. 4.17. Als Bezugspunkte
wurden dabei die Punkte gewählt, die den Übergang
von der scherverdünnenden Region zur Region mit
konstanter Viskosität bei hohen Scherraten anzei-
gen, (durch den Pfeil markiert). Durch Verschieben
rheologisch ähnlicher Viskositätskurven lässt sich
eine Masterkurve erstellen, in der sich die Kurven
in einer einzigen Kurve zusammenfassen lassen. Die
Pfeile markieren die zur Verschiebung verwendeten
Bezugspunkte.
Damit ist nun eine dimensionslose Formulierung
der rheologischen Stoffgrößen möglich, wobei die
Formulierung mittels der Schlüsselparameter „cha-
rakteristische Viskosität H″ und „charakteristische
Schergeschwindigkeit Γ″ erfolgt. Eine dimensions-
lose Formulierung ist bei der Maßstabsübertragung
von großem Interesse. Dieses Thema wird in 7 Kap. 5
ausführlich behandelt.
 126 H. Chmiel und E. Walitza

. Abb. 4.18  Masterkurve aus den

rheologisch ähnlichen Kurven in
. Abb. 4.17

4.8.3 Lineare Viskoelastizität von η″ und G″. Aus dem Voigt-Modell (Parallelschal-
tung von Feder und Dämpfer, . Abb. 4.21a), berech-
Wie schon beschrieben, wird die lineare Viskoelastizi- net man aus dem Quotienten von η′ und G′ die Retar-
tät am besten im sinusförmig oszillierenden Scherex- dationszeit (auch Voigt-Relaxationszeit genannt).
periment bestimmt. Es zeigt sich, dass Suspensionen Wenn eine Scherbelastung plötzlich aufgeho-
von Streptomyces tendae stark viskoelastisches Verhal- ben wird, ist die Spannungsrelaxationszeit ein Maß
ten haben. Anhand der Parameter der linearen Visko- für das Abklingen der Spannung, hingegen ist die
elastizität η′ und η″ ist dies in den . Abb. 4.19 und 4.20 Retardationszeit ein Maß für das Abklingen einer
im Vergleich zu wässrigen Polyacrylamid-Lösungen Deformation, wenn eine Spannung plötzlich aufge-
dargestellt. Man erkennt wieder die starke Konzentra- hoben wird. Ist die Ursache für das viskoelastische
tionsabhängigkeit der rheologischen Größen.
Die Frequenzabhängigkeit von η′ ist ähnlich der
Scherratenabhängigkeit der scheinbaren Viskosität.
Ursachen für den elastischen, also energiespeichern-
den Anteil bei der oszillierenden Beanspruchung der
Suspension sind reversible Strukturveränderungen
(Auf- und Abbau von Agglomeraten) und elastische
Verformungen einzelner Mycelgebilde.
Am Spannungsrelaxations- oder am Retarda-
tionsverhalten kann man sich die Bedeutung der
viskoelastischen Parameter klar machen. Hierzu
müssen allerdings einfache rheologische Modelle
(z. B. das phänomenologische Feder-Dämpfer-Sys-
tem) herangezogen werden (. Abb. 4.21). Für diese
kann ein Zusammenhang zwischen den viskoelasti-
schen Parametern und den Relaxationszeiten herge-
stellt werden. Beim Maxwell-Modell (Serienschal-
. Abb. 4.19  Viskose Komponente der „komplexen
tung eines Dämpfers und einer Feder, . Abb. 4.13c) Viskosität“ von Streptomyces-tendae-Suspensionen (S.t.),
ergibt sich die Spannungsrelaxationszeit (auch Max- in Abhängigkeit der Kreisfrequenz. Vergleich zu wässrigen
well-Relaxationszeit genannt) aus dem Quotienten Polyacrylamid-Lösungen (PAA)
Kapitel 4 · Rheologie von ­Biosuspensionen
. Abb. 4.20  Elastische Komponente der „komplexen
Viskosität“ von Streptomyces-tendae-Suspensionen (S.t.) in
Abhängigkeit der Kreisfrequenz. Vergleich zu wässrigen
Polyacrylamid-Lösungen (PAA)
Verhalten eine Strukturveränderung im Fluid, so
sind die Relaxationszeiten ein Maß für das Zeitver-
halten der Strukturumbauvorgänge. Es leuchtet ein,
dass bei komplexen mikrobiellen Suspensionen, wie
z. B. von Streptomyces tendae, eine ganze Reihe von
Spannungsrelaxationszeiten (Relaxationszeitspek-
trum) wirksam ist, die sich näherungsweise durch
die Parallelschaltung von Dämpfer-/Federelementen,
ein sogenanntes verallgemeinertes Maxwell-Modell
(. Abb. 4.21b), beschreiben lassen.
4.8.4 Fließverhalten im Verlauf einer
Fermentation
von André Braun überarbeitet
Fermentationen werden überwiegend nicht-kon-
tinuierlich betrieben. Dabei bleibt weder die
. Abb. 4.21  (a) Voigt-Modell und
(b) verallgemeinertes Maxwell-Modell
127 4
Zusammensetzung der flüssigen noch die der festen
Phase der Fermentationsbrühe erhalten. Das Fließ-
verhalten der flüssigen Phase variiert nur leicht,
wenn keine weitere Änderung als die der Substrat-
konzentration auftritt, jedoch stark, wenn extrazellu-
läre Biopolymere entstehen, wie es z. B. bei der Pro-
duktion von Xanthan durch Xanthomonas campestris
oder Dextrane durch die Milchsäurebakterien Weis-
sella ciberias der Fall ist.
Anhand der letztgenannten Organismen sind
Viskositätskurven während der Fermentation in
. Abb. 4.22 gezeigt. Das Nährmedium sowie die Bak-
teriensuspension während den ersten zwei Stunden
zeigen praktisch ein newtonsches Fließverhalten auf.
In dieser Zeit wurde nur 0,4 g/L Dextran erzeugt, was
den leichten Viskositätsanstieg erklärt. Mit steigen-
der Fermentationszeit nimmt die Dextran-Produk-
tion drastisch zu (nach 4 h: 2,5 g/L; nach 6 h: 4,2 g/L;
nach 8 h: 5,1 g/L) was durch die Viskositätskurve
wiedergegeben wird: die Nullviskosität nimmt zu
und die Suspension weist ein zunehmendes scher-
verdünnendes Verhalten auf. Natürlich nimmt die
Zahl der Bakterien ebenfalls zu mit zunehmender
Fermentationszeit. Jedoch bleibt die Zellzahl auch
nach 8 Stunden Fermentation zu klein, um einen
solch starken Viskositätsanstieg zu ermöglichen.
Bei mycelbildenden Organismen kann das
Wachstum der Mikroorganismen während der Fer-
mentation einen großen Einfluss auf das Fließverhal-
ten haben. Es ändert sich dabei nicht nur der Volu-
menanteil der Organismen am Gesamtvolumen der
Suspension, ausgedrückt durch das Trockengewicht,
sondern auch die Morphologie der Biomasse. Um
das zu demonstrieren, seien begleitende Viskositäts-
messungen zu einer Fermentation von Streptomyces
tendae in einem 110-Liter-Schlaufenreaktor ange-
führt. In . Abb. 4.23a ist die scheinbare Viskosität,
wie sie mit einem Couette-System mit einer Spalt-
weite von 3 mm gemessen wurde, für drei Scherraten
 128 H. Chmiel und E. Walitza

. Abb. 4.22  Viskositätskurve

zu verschiedenen Zeitpunkten
während der Fermentation des
Milchsäurebakteriums Weissella
ciberias (freundlicherweise zur
Verfügung gestellte, unveröffentlichte
Ergebnisse aus der Masterarbeit von
M. Raps, TU München (2014))

. Abb. 4.23  (a) Scheinbare

Viskosität η (Parameter ist die
Scherrate) sowie (b) viskoser und
elastischer Anteil der „komplexen
Viskosität“ und jeweils das
Trockengewicht (TG) während einer
Fermentation von Streptomyces tendae
im 110-Liter-Schlaufenreaktor
Kapitel 4 · Rheologie von B
­ iosuspensionen
über der Zeit aufgetragen. Zum Vergleich enthält das
Diagramm auch den Verlauf des Trockengewichts
(TG) während der Fermentation.
Die Viskosität steigt zu Beginn der Fermenta-
tion, in der exponentiellen Wachstumsphase, so wie
man es vom Verlauf des Trockengewichts erwarten
würde, erreicht jedoch das Plateau der stationären
Phase früher als das Trockengewicht. Hier verändert
sich trotz Zunahme des Trockengewichts um ca. 30 %
die Viskosität nicht. Offensichtlich findet gleichzeitig
eine Veränderung der Morphologie oder der mecha-
nischen Eigenschaften des Mycels statt. In der statio-
nären Phase verändert sich die Viskosität kaum, fällt
jedoch im Verlauf der Absterbephase um eine Zeh-
nerpotenz. Vergleicht man die drei Viskositätskur-
ven, fällt auf, dass die Scherverdünnung zum Ende
der Fermentation kaum abnimmt.
Neben den stationären Viskositätsmessungen
wurden während der oben erwähnten Fermenta-
tion im Schlaufenreaktor ebenfalls instationäre Mes-
sungen durchgeführt. Beispielhaft zeigt . Abb. 4.23b
den viskosen Anteil η′ und den elastischen Anteil η″
der komplexen Viskosität einer oszillierenden Anre-
gung mit der Scherratenamplitude γ = 1 s–1 und einer
Kreisfrequenz von ω = 0,22 s−1, wieder zusammen
mit dem Trockengewicht. Die Periodendauer der
ausgewählten Kreisfrequenz entspricht etwa der
Umlaufzeit im Schlaufenreaktor.
Die Kurven η und η″ ähneln den Kurven der sta-
tionären Viskosität in . Abb. 4.23a. Sie steigen zu
Beginn mit dem Trockengewicht an und fallen zum
Ende der Fermentationszeit wieder ab. Auffallend ist
der relativ hohe elastische Anteil während der sta-
tionären Phase. Dies deutet auf ein stark verhaktes
Mycel hin. Der deutliche Rückgang der Viskoelas-
tizität nach der 50. Fermentationsstunde, ohne dass
die Biotrockenmasse abnimmt, ist auf eine zu lange
Wartezeit zwischen Probeentnahme und Messung
zurückzuführen. Durch die fehlende Sauerstoffzu-
fuhr werden die Hyphen offensichtlich weicher und
weniger elastisch. Ansonsten liegt der elastische
Anteil η″ während der gesamten Fermentations-
dauer niedriger als der viskose, er fällt jedoch insge-
samt weniger ab. Dies trifft nur für sehr kleine Win-
kelgeschwindigkeiten ω zu, die zum stationären Fall
tendieren. Bei größeren ω findet man umgekehrte
Verhältnisse. Insgesamt verlaufen η′ und η″ ähnlich
wie die Biotrockenmasse.
129 4
Als Fachliteratur wird empfohlen: für die Rheo-
logie Barnes [1], für die Rheometrie [7], für die Mas-
terkurve [10] und für die Zusammenhänge zwischen
Rheologie und Mikrostruktur [4].
Literatur
  [1] Barnes HA (1989) An Introduction to Rheology. Elsevier,
Amsterdam
  [2] Bird RB, Armstrong RC, Hassager O (1977) Dynamics of
polymeric liquids. John Wiley & Sons, New York
  [3] Bongenaar JJTM, Kossen WWF, Metz B, Meijboom FW
(1973) A method for characterizing the rheological pro-
perties of viscous fermentation broths. Biotechnol Bioeng
15:201
  [4] Brader JM, Fuchs M, Voigtmann T, Weyßer F, Cates ME,
Henrich O, Ballauff M, Siebenbürger M (2009) Rheology
of colloidal dispersions close to glass or gel transitions.
Proceedings of the 5th International Symposium on Food
Rheology and Structure. Laboratory of Food Process
Engineering. ETH Zürich, Zürich
  [5] Giesekus H, Langer G (1977) Die Bestimmung der wahren
Fließkurven nicht-Newtonscher Flüssigkeiten und plasti-
scher Stoffe mit der Methode der repräsentativen Viskosi-
tät. Rheologica Acta 16:1–22
  [6] Goudar CT, Strevett KA, Shah SN (1999) Influence of
microbial concentration on the rheology of non-New-
tonian fermentation broths. Appl Microbiol Biotechnol
51:310–315
  [7] Mezger TG(2010) Das Rheologie Handbuch. Vincentz Ver-
lag, Hannover
  [8] Moheseni M, Kautola H, Grant AD (1997) The viscoelastic
nature of filamentous fermentation broths and its influ-
ence on the directly measured yield stress. J Ferment
Bioeng 83:281–286
  [9] Pawlowski J (2005) Zur ähnlichkeitstheoretischen Dis-
kussion von Transportvorgängen in nicht-Newtonschen
vFluide. Chem-Ing-Tech 77:1910–1914
[10] Pawlowski J (2013) Dimensional Analysis of non-Newton-
ian Fluids. Chem Biochem Eng Q 27(2):119–123
[11] Riley GL, Tucker KG, Paul GC, Thomas CR (2000) Effect of
biomass concentration and mycelial morphology on fer-
mentation broth rheology. Biotechnol Bioeng 68:160–172
 131 5

Transportvorgänge in
­Biosuspensionen
Horst Chmiel und Eckehard Walitza

5.1 Maßstabsübertragung – 132

5.1.1 Stationäre Rohrströmung – 133
5.1.2 Stoffübergang an einer Gasblase – 134

5.2 Leistungseintrag beim Rühren von Flüssigkeiten – 136

5.2.1 Leistungseintrag beim Rühren newtonscher und nichtnewtonscher
Flüssigkeiten – 136
5.2.2 Leistungseintrag beim Rühren begaster newtonscher
Flüssigkeiten – 140
5.2.3 Leistungseintrag beim Rühren begaster viskoelastischer
Flüssigkeiten – 141

5.3 Stofftransport in Biosuspensionen – 142

5.3.1 Sauerstoffeintrag in Fermentationsbrühen – 144
5.3.2 Sauerstoffeintrag in viskoelastische Biosuspensionen – 146
5.3.3 Einfluss des metabolischen Sauerstoffverbrauchs auf den
Sauerstofftransport – 147
5.3.4 Die Bestimmung des Sauerstoff-Transportkoeffizienten kla′ – 149
5.3.5 Bestimmung von kla′ mittels der Sulfit-Methode – 149
5.3.6 Stoffübergang an einzelnen Blasen und Blasenschwärmen – 149

5.4 Wärmeübergang im Bioreaktor – 151

5.4.1 Einfluss der Begasung auf den Wärmeübergang – 152
5.4.2 Viskoelastizität und Wärmeübergang – 153

Literatur – 156

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2018

H. Chmiel, R. Takors, D. Weuster-Botz (Hrsg.), Bioprozesstechnik,
https://doi.org/10.1007/978-3-662-54042-8_5
 132 H. Chmiel und E. Walitza

5.1 Maßstabsübertragung ein, nachdem man Gl. 5.1 durch die systemspezifi-
schen Größen an den entsprechenden Stellen erwei-
Bei der Übertragung von Bioprozessen in den tech- tert hat, dann wird daraus
nischen Maßstab treten im Bioreaktor häufig Trans-
portprobleme auf, die im Labormaßstab nicht beob- ρ ⋅ v ∂v* 0, 5 ⋅ ρ ⋅ v 2 ∂p*
⋅ * =− ⋅ *
achtet bzw. vernachlässigt werden konnten, nun aber t 0 ∂t d ∂x
prozesslimitierend sind. Ursache dafür ist eine nicht  ∂v* 
korrekte Maßstabsübertragung. Für eine richtige ∂ r * ⋅ * 
η ⋅ v 1  ∂r   Gl. 5.2
Vorgehensweise leistet die Ähnlichkeitstheorie gute + 2 ⋅ *⋅
d r ∂r *
Dienste. Dort werden dimensionslose Kennzahlen
5 zur Beschreibung eines physikalisch-technischen Da die hervorgehobenen Terme schon dimensions-
Sachverhalts verwendet, welche beim Übergang auf los sind, genügt es, einen von seiner Faktorengruppe
einen anderen Maßstab im Zahlenwert beizubehal- zu befreien, wodurch die beiden anderen dadurch
ten sind, damit die physikalische Ähnlichkeit erhal- entstehenden Gruppen dimensionslos werden. Wird
ten bleibt. Gl. 5.2 also durch v /d2 dividiert, so erhält man
Eine Möglichkeit zur Herleitung der dimensions-
losen Kenngrößen bieten die systembeschreibenden
ρ ⋅ d 2 ∂v* 0, 5 ⋅ ρ ⋅ v ⋅ d ∂p*
Differenzialgleichungen. Unter Verwendung charak- ⋅ =− ⋅ *
t0 ⋅ η ∂t * η ∂x
teristischer Größen des Systems werden zunächst die
dimensionsbehafteten abhängigen und unabhängi-  * ∂v* 
r . 
gen Variablen der Gleichungen in eine dimensionslose 1  ∂r *   Gl. 5.3
+ *.
Form gebracht. Sodann kann man die sonst noch auf- r ∂r *
tretenden Faktoren bzw. Faktorengruppen durch geeig-
nete Multiplikationen ebenfalls dimensionslos machen, Der dimensionslosen Faktorengruppe beim dimen-
wodurch sich die entsprechenden dimensionslosen sionslosen Druckgradienten in Gl. 5.3, die das Ver-
Kennzahlen ergeben. Am Beispiel der Navier-Stokes- hältnis der Trägheits- zur Zähigkeitskraft angibt, hat
Gleichung für die instationäre Rohrströmung soll diese man den Namen Reynoldszahl, Re, gegeben.
Vorgehensweise demonstriert werden. Die systembe-
schreibende Differenzialgleichung lautet: ρ ⋅ v ⋅d 
Tragheitskraft
Re = =  Gl. 5.4
η 
Zahigkeitskraft
 ∂v 
∂ r 
∂v ∂p 1  ∂r  Die andere Gruppe ist im Fall z.B. einer mit der
ρ⋅ =− +η⋅ ⋅  Gl. 5.1
∂t ∂x r ∂r Frequenz f sinusförmig oszillierenden Rohrströ-
mung das Produkt aus Re und der Strouhalzahl Sr,
Hier sind die Geschwindigkeit v, der Druck p, die wobei Sr sich mit t0 = 1/f berechnet zu Sr = f · d/v.
Ortskoordinaten x und r und die Zeit t dimensions- Sind die systembeschreibenden Gleichungen
los zu machen. Als systemspezifische Bezugsgrößen in ihrer Gesamtheit explizit nicht bekannt, so wie
eignen sich dafür die mittlere Geschwindigkeit v , es bei Problemstellungen aus der Biotechnik oft der
der mittlere Staudruck 0,5 · ρ · v 2 , der Rohrdurch- Fall ist, dann bedient man sich der Dimensionsana-
messer d und t0, eine Systemzeit (z. B. die Perioden- lyse nach dem Buckingham’schen π-Theorem. Letz-
dauer, wenn eine oszillierende Anregung vorliegt, teres beinhaltet die grundsätzliche Darstellbarkeit
oder eine systemspezifische Länge des Systems divi- von physikalischen Gesetzmäßigkeiten durch soge-
diert durch die systemspezifische Geschwindigkeit). nannte dimensionslose π-Größen. Seine Bedeutung
Führt man nun die Größen liegt nicht nur in der rationellen Darstellung – die
Zahl der Einflussgrößen reduziert sich –, sondern
v*= v / v; p* = p / (0, 5 ⋅ ρ ⋅ v 2 ); auch darin, dass jedem Zustandspunkt des π-Ra-
umes unendlich viele physikalische Realisierungs-
x*= x / d; r * = r / d; t * = t / t0 
möglichkeiten entsprechen, was die Grundlage der
Kapitel 5 · Transportvorgänge in B
­ iosuspensionen
133 5
Maßstabsübertragung bildet. Es soll nun ein Schema Die Anordnung innerhalb der Relevanzliste ist zwar
vorgeführt werden, mit dessen Hilfe man unter unerheblich, man kann dabei aber auch zielstre-
Benutzung des π-Theorems den relevanten Kennzah- big vorgehen, wie man am dargestellten Formalis-
lensatz für einen physikalischen Sachverhalt ermit- mus, der zu den dimensionsfreien π-Größen führt,
teln kann. erkennen wird. Dieser sieht so aus, dass mithilfe von
erlaubten Zeile/Zeile-Operationen für Matrizen,
wie sie aus der linearen Algebra bekannt sind, die
5.1.1 Stationäre Rohrströmung 7 Matrix 5.1 so transformiert wird, dass links eine
(n, n)-Einheitsmatrix und rechts die (n, n − m)-K-
Dies soll am Beispiel der – hier stationären – Rohr- oeffizientenmatrix Pij entsteht.
strömung erläutert werden. Matrix 5.2:
Für den Fall einer newtonschen Flüssigkeit
ergeben sich sechs Einflussgrößen, deren Dimen- v η d ρ Δp l
1 0 0 –1 1 0 Pij
sionen mit den drei Grundeinheiten Länge (L), Zeit 0 1 0 1 1 0
(T) und Masse (M) gebildet werden: 0 0 1 –1 –1 1

mittlere Geschwindigkeit v [L/T]

dynamische Viskosität η [M/LT] Man wird also die Reihenfolge der Größen in
Rohrdurchmesser d [L] der Relevanzliste so wählen, dass links in der
Rohrlänge l [L] 7  Matrix 5.1 auf jeden Fall die linear unabhängi-
Dichte des Fluids ρ [M/L3] gen Spaltenvektoren stehen und diese so, dass man
Druckverlust Δp [MT2/L] schon vor den Umwandlungen möglichst nahe an
die Einheitsmatrix kommt. Die linear unabhängigen
Unter Verwendung des sogenannten Relatio- π-Größen lassen sich nun aus folgender Beziehung
nenpostulats kann man annehmen, dass zwischen gewinnen
den m dimensionsbehafteten Einflussgrößen ein
Zusammenhang − pij
π j = x j ⋅ Πi yi j = 1, …, m − n; i = 1, …, n

f (v, η, d , ρ, ∆p, l ) = 0  Gl. 5.5  Gl. 5.6

existiert, welcher nach dem π-Theorem gleichbedeu- die wegen der Produktbildung den dimensionslo-
tend ist mit g(π1, π2, …, πm–k) = 0. sen Größen auch den Namen π-Größen gegeben hat.
Die Anzahl der π-Größen, gegeben durch m − n, Dabei ist unter y der Vektor mit den Elementen (v ,
mit n, der Anzahl der Grundeinheiten, hat im Fall des η, d) und unter x der mit den Elementen (ρ, Δp, l) zu
gewählten Beispiels den Wert drei. Die Argumenten- verstehen. Angewandt auf obige Matrix erhält man
liste von f wird auch die Relevanzliste des betrachte-
ten Problems genannt. π3 = l ⋅ d −1 = l / d  Gl. 5.7
Aus den m Größen der Relevanzliste und den n
Grundeinheiten wird eine (n, m)-Matrix gebildet, π2 = ∆p ⋅ d ⋅ η−1 ⋅ v−1  Gl. 5.8
deren Element i, j angibt, mit welcher Potenz die
i-te Grundeinheit in der j-ten dimensionsbehafte-
π1 = ρ ⋅ v ⋅ d ⋅ η−1  Gl. 5.9
ten Größe vorkommt.
Matrix 5.1:
Daraus lassen sich unmittelbar bzw. durch Kombi-
v η d ρ Δp l nation drei dimensionslose Kennzahlen gewinnen:
L 1 –1 1 –3 –1 1
1  
M 0 1 0 1 1 0 π3 = dimensionslose Lange Gl. 5.10
T –1 –1 0 0 –2 0 d
 134 H. Chmiel und E. Walitza
π2 d ⋅ ∆p2
= Widerstandsbeiwert ξ /2
π1 ⋅ π3 l ⋅ ρ ⋅ v 2
 findliches Maß für die Ermittlung viskoelastischer
 Gl. 5.11
ρ ⋅v ⋅ d
π1 = Reynodszahl Re  Gl. 5.12
η
Im Angelsächsischen wird statt dem Widerstands-
beiwert f = ξ/4 verwendet.
5 In . Abb. 5.1 ist der Zusammenhang zwischen
Wider­standsbeiwert f und Reynoldszahl Re – er wird
allgemein als Widerstandscharakteristik bezeich-
net – für newtonsche Flüssigkeiten und einige Poly-
merlösungen dargestellt.
Für newtonsche Flüssigkeiten findet man für den
laminaren Bereich den Zusammenhang f = 16/Re
und die sprunghafte Erhöhung beim Übergang in
die Turbulenz bei Re = 2300.
Für die Polymerlösungen wurde Re mit der
repräsentativen Viskosität gemäß Gl. 4.29 und 4.30
gebildet, wodurch die oben abgeleiteten dimensions-
losen Kennzahlen auch für nichtnewtonsche Flüssig-
keiten anwendbar sind.
Man erkennt in . Abb. 5.1, dass die Messpunkte
für die Polymerlösungen im laminaren Bereich mit
guter Genauigkeit auf der Kurve f = 16/Re liegen.
Wichtiger aber ist, dass diese Flüssigkeiten ein deut-
lich viskoelastisches Verhalten zeigen, was sich in
einem stark veränderten Turbulenzverhalten gegen-
über newtonschen Flüssigkeiten bemerkbar macht.
Der Übergang von der laminaren zur turbulenten
Strömung ist verzögert und der Widerstandsbeiwert
. Abb. 5.1  Widerstandscharakteristik verschiedener
wässriger Polyacrylamid-Lösungen (Parameter ist die PAA-
Konzentration) im Vergleich zu newtonschen Flüssigkeiten [7]
f deutlich vermindert. Die turbulente Widerstands-
charakteristik liefert also ein außerordentlich emp-
Effekte. Andererseits geht daraus hervor, dass Ein-
flussgrößen, die das viskoelastische Verhalten
beschreiben, zu berücksichtigen wären, was zu wei-
teren Kennzahlen führt (7 Abschn. 5.2.1).
5.1.2 Stoffübergang an einer Gasblase
Als zweites Beispiel wird der Stoffübergang an frei in
einer Flüssigkeit aufsteigenden Gasblasen des Durch-
messers d gewählt, der für den Sauerstoffeintrag in
Fermentationsbrühen (7 Abschn. 5.3.1) wichtig ist.
Aus . Abb. 5.10, die schematisch die Widerstände
beim Transport von Sauerstoff von einer Gasblase
in eine Zelle wiedergibt, wird neben dem Diffusions-
koeffizienten DAB über Gl. 5.62 (7 Abschn. 5.3.6) der
Stofftransportkoeffizient kl als wichtige Einflussgröße
für den Stoffübergang abgeleitet. Für den Fall einer
newtonschen Flüssigkeit lassen sich damit acht Ein-
flussgrößen nennen, deren Dimensionen von den
drei Grundeinheiten Länge (L), Zeit (T) und Masse
(M) abhängen:
Stofftransportkoeffizient kl [L/T]
Diffusionskoeffizient DAB [L2/T]
dynamische Viskosität ηl [M/TL]
Dichte ρl [M/L3]
Dichtedifferenz Δρ = (ρl – ρg) [M/L3]
Erdbeschleunigung g [L/T2]
charakteristische Länge d [L]
Oberflächenspannung σ [M/T2]
wobei die Indizes l und g für Flüssigkeit und
Gas stehen. Unter Verwendung des oben genannten
Relationenpostulats kann man annehmen, dass zwi-
schen den m dimensionsbehafteten Einflussgrößen
ein Zusammenhang
f (kl, DAB, ηl, ρl, ∆ρ, g, d , σ ) = 0 Gl. 5.13
existiert, welcher nach dem π-Theorem gleichbedeu-
tend ist mit g(π1, π2, …, πm–n) = 0.
Die Anzahl der π-Größen hat im Falle dieses Bei-
spiels den Wert fünf.
Aus den m Größen der Relevanzliste und den n
Grundeinheiten wird wieder eine 7 (n, m)-Matrix 5.3
gebildet:
Kapitel 5 · Transportvorgänge in B
­ iosuspensionen
135 5
Matrix 5.3:
ηl
1/π1 = = Sc Gl. 5.21
kl DAB ηl ρl Δρ g d σ
ρl ⋅ DAB

L 1 2 –1 –3 –3 1 1 0
T –1 –1 –1 0 0 –2 0 –2
Vernachlässigt man die Gasdichte gegenüber der
M 0 0 1 1 1 0 0 1
Flüssigkeitsdichte, dann erhält man weiterhin

g 2d 5ρl3
und mithilfe der erlaubten Zeile/Zeile-Operationen Gr 2 / (π5 ⋅ π4 ⋅ π2 ) = = We
in die 7 Matrix 5.4 transformiert. σ ⋅ ηl2
Matrix 5.4:  Gl. 5.22

kl DAB ηl ρl Δρ g d σ Führt man über das Gleichgewicht von Stokes’scher

1 0 0 0 0 3 –1 1 Pij
0 1 0 –1 –1 –1 1 0
Reibungskraft und Auftrieb die Blasenaufstiegsge-
0 0 1 1 1 0 0 1 schwindigkeit v ein und vernachlässigt ρg gegenüber ρl,
so ergibt sich die gebräuchlichere Form der Weberzahl
Gl. 5.6, angewandt auf obige 7 Matrix 5.4 ergibt
v2 ⋅ d ⋅ ρl
We =  Gl. 5.23
σ
1 ⋅ η −1 = ρ ⋅ DAB 
π1 = ρl ⋅ k 0j ⋅ DAB Gl. 5.14
l l
ηl Um zur Grashof- und zur Weberzahl zu gelan-
gen, sind im vorgeführten Beispiel umständliche
1 ⋅ η −1 = ∆ρ ⋅ DAB Umrechnungen aller hier gewonnenen π-Größen
π2 = ∆ρ ⋅ ki0 ⋅ DAB l Gl. 5.15
ηl notwendig geworden. Bei einer jeweils anderen Rei-
henfolge in der Relevanzliste hätten sich beide Kenn-
g⋅D zahlen leichter erzeugen lassen.
π3 = g ⋅ kl−3 ⋅ DAB
1 ⋅ η0 =
l
AB  Gl. 5.16
kl3 Häufig findet man Beschreibungen des Stoffüber-
gangs in Abhängigkeit der Reynoldszahl, die im Falle
−1 d ⋅ kl des obigen Beispiels die Blasenaufstiegsgeschwin-
π4 = d ⋅ kl1 ⋅ ( DAB ) ⋅ ηl0 =  Gl. 5.17
DAB digkeit v enthält. Da diese Geschwindigkeit von Δρ
abhängt, könnte sie in der Relevanzliste dagegen aus-
σ getauscht werden. Das hat zur Folge, dass man bei der
π5 = σ ⋅ kl−1 ⋅ DAB
0 ⋅ η −1 =
l  Gl. 5.18 Berechnung der π-Größen die Reynoldszahl statt der
kl ⋅ ηl
Grashofzahl erhält.
Weitere Kennzahlen lassen sich durch Kombina-
Daraus lassen sich direkt, bzw. durch Kombination, tionen aus den bisher abgeleiteten erzeugen, wie z. B.
die vier Kennzahlen Grashofzahl Gr (für Stoffüber- die später noch zu verwendende Froudezahl Fr, die
tragung), Sherwoodzahl Sh, Schmidtzahl Sc und die entsprechend Gl. 5.24 definiert ist.
Weberzahl We definieren.
v2
Fr =  Gl. 5.24
g ⋅d
π43 ⋅ π1 ⋅ π2 ⋅ π3 =
g ⋅ d 3 ⋅ ρl ⋅ (ρl − ρg ) = Gr Gl. 5.19
ηl2 Wenn wieder die Dichte des Gases gegenüber der
Dichte der Flüssigkeit vernachlässigt wird, lässt sich Fr
 aus der Reynoldszahl und der Grashofzahl berechnen.

Re2
Fr =  Gl. 5.25
Gr
kl ⋅ d
π4 = = Sh  Gl. 5.20 Die Herleitung des obigen Formalismus ist bei
DAB Pawlowski [15] sehr ausführlich beschrieben. Ihre
 136 H. Chmiel und E. Walitza
Darstellung überschreitet aber den hier gesteck-
ten Rahmen, denn sie verlangt Kenntnisse aus der
Funktionalanalysis.
5.2 Leistungseintrag beim Rühren
von Flüssigkeiten
Als Beispiel für Impulstransport sei das Rühren von
Flüssigkeiten betrachtet. Die zum Rühren im statio-
5 nären Fall erforderliche Leistung setzt sich zusam-
men aus der zum Dispergieren aufzubringenden
Arbeit und der durch Reibung in Wärme umgewan-
delten kinetischen Energie des Mediums.
5.2.1 Leistungseintrag beim
Rühren newtonscher und
nichtnewtonscher Flüssigkeiten
überarbeitet von André Braun
z Newtonsche Flüssigkeiten
Das in 7 Abschn. 5.1 vorgestellte Verfahren soll
zunächst auf das Rühren einer Newton’schen Flüs-
sigkeit angewandt werden, wobei eine weitere für
die Biotechnik interessante Kennzahl, die Leis-
tungskennzahl Ne, auch Newtonzahl genannt, ein-
geführt wird.
Die Relevanzliste lautet, mit P, dem Leis-
tungseintrag, v1, der kinematischen Viskosität,
ρ1, der Dichte, n, der Rührerdrehzahl, und d, dem
Rührerdurchmesser:
f ( P, v1, ρ1, n, d ) = 0  Gl. 5.26
Die dimensionslosen Kennzahlen können nun
analog zu den vorherigen beiden Beispielen
(7 Abschn. 5.1.1 und 5.1.2) mittels dem Aufstellen
und Berechnen der Dimensionsmatrix bestimmt
werden. Hinter dem Berechnen der Einheitsma-
trix und der Koeffizientenmatrix stecken jedoch
Äquivalenztransformationen, wie sie aus der linea-
ren Algebra bekannt sind. Solche Berechnungen
können auch mit Matrizenorientierten Software-
systemen automatisch durchgeführt werden. Dies
ist insbesondere bei einer größeren Anzahl von Ein-
fluss- und Grundgrößen sinnvoll, um Rechenfehler
zu vermeiden und Rechenzeit zu sparen. Es lassen
sich damit folgende π-Zahlen herleiten:
v1
π1 = v1⋅ d −2 ⋅ n−1 ⋅ ρ10 =  Gl. 5.27
d2⋅n
P
π2 = P ⋅ d −5 ⋅ n−3 ⋅ ρ1−1 =  Gl. 5.28
d 5 ⋅ n3 ⋅ ρ1
Damit werden nun die Rührer-Reynoldszahl Re und
die Leistungskennzahl Ne definiert
n⋅d2
π1−1 = Re =  Gl. 5.29
v1
P
π2 = Ne =  Gl. 5.30
d 5 ⋅ n3 ⋅ ρ 1
Der Zusammenhang zwischen der Leistungskenn-
zahl und der Rührer-Reynoldszahl ist graphisch in
der sogenannten Leistungscharakteristik darge-
stellt. Die Charakteristiken von ausgewählten Rüh-
rertypen sind in . Abb. 5.2 vorgestellt. Diese Kurven
werden häufig für Maßstabsübertragungen heran-
gezogen, da sie für alle geometrisch ähnlichen Rüh-
rertypen gelten.
Des Weiteren lassen sich drei Strömungsberei-
che erkennen: der laminare Strömungsbereich,der
Übergangsbereich sowie der turbulente Strömungs-
bereich. Man erkennt, dass im laminaren Bereich
die Leistungskennzahl umgekehrt proportional zur
Reynolds-Zahl
Ne = C1 / Re  Gl. 5.31
und im vollturbulenten Bereich konstant
Ne = C2  Gl. 5.32
ist. Die beiden Konstanten C1 und C2 müssen für
die jeweiligen Rührwerksgeometrien experimen-
tell ermittelt oder aus der Literatur beschafft werden
(z. B. [22]).
z Nichtnewtonsche Flüssigkeiten
Im Fall einer newtonschen Flüssigkeit, bei der die
Viskosität unabhängig von der Scherrate und somit
konstant ist, ist die Reynoldszahl eindeutig definiert
und somit die Abhängigkeit der Leistungskennzahl
 Kapitel 5 · Transportvorgänge in B
­ iosuspensionen
137 5

 H DDV
EEV
 FFV
G



 IIV

 LLV
FV
3SQ āG  

JV

EV JV
KV

DV
1H


HG D LV
 IV

 EF
KV
 L I

 ±
                    

5H QG   Y

. Abb. 5.2  Leistungscharakteristik verschiedener Rührertypen (nach [22]); a, as = Kreuzbalkenrührer, b, bs = Gitterrührer,

c, cs = Blattrührer, d = Ankerrührer, e = Wendelrührer, f, fs = MIG-Rührer, gs = Scheibenrührer, hs = Proprellerrührer, i, is =
Schaufelrührer. S = mit Strombrecher

von der Reynoldszahl gegeben, wie in . Abb. 5.2
abgebildet. Im Fall einer nichtnewtonschen Flüs-
sigkeit variiert die Viskosität mit der Scherrate. Bei
gewissen Flüssigkeiten nimmt die Viskosität mit stei-
gender Scherrate um mehrere Dekaden ab. Daher
stellt sich nun das Problem, welcher Viskositätswert
zur Berechnung der Reynoldszahl zur Verwendung
kommt. Es gibt mehrere Lösungsansätze, wie mit
diesem Problem umzugehen ist, wobei zwei davon
im Folgenden vorgestellt werden.
Das Metzner-Otto-Verfahren ist die am häufigs-
ten in der Literatur anzutreffende Methode. Dabei
wird angenommen, dass das Strömungsprofil linear
ist und dass die Fließeigenschaften der Flüssigkei-
ten plastischer Natur sind. Darauf basierend wird
postuliert, dass sich die Rührgeschwindigkeit einer
Scherrate linear zuordnen lässt [13]. Die sogenannte
repräsentative Scherrate, γ rep, ist dann proportional
zur Drehgeschwindigkeit
γ rep = K MO ⋅ n Gl. 5.33
wobei die Proportionalitätskonstante gewöhnlich
experimentell ermittelt wird und konstant für geo-
metrisch ähnliche Rührwerke ist. Für die Berechnung
der Reynoldszahl wird dann der Wert der Viskosität
bei dieser repräsentativen Scherrate verwendet.
Diese Methode erlaubt also, dass bei nichtnew-
tonschen Flüssigkeiten auf die Leistungskennzahl-
charakteristik einer newtonschen Flüssigkeit zurück-
gegriffen wird. Der Vorteil dieser Methode ist, dass
sie sich sehr einfach durchführen lässt und nur die
Proportionalitätskonstante, KMO, zusätzlich zur
Leistungscharakteristik ermittelt werden muss. Es
bleibt jedoch fraglich, ob sich Charakteristiken von
 138 H. Chmiel und E. Walitza
nichtnewtonschen (insbesondere viskoelastischen)
Flüssigkeiten auf die Charakteristiken von newton-
schen Flüssigkeiten reduzieren lassen [3, 16].
Diese Kritik hat u. a. Pawlowski [16] aufgenom-
men, die Problemstellung dimensionsanalytisch auf-
gearbeitet und so eine weitere Methode im Umgang
mit nichtnewtonschen Flüssigkeiten präsentiert.
Aufgrund der rheologischen Ähnlichkeit werden
zur Beschreibung der rheologischen Stoffgrößen
die beiden Parameter Γ und H (siehe 7 Abschn.
5 4.8.2) anstatt der newtonschen Viskosität η verwen-
det. Die Referenzliste ist somit um einen Parameter
angewachsen und die resultierenden dimensionslo-
sen Kennzahlen sind:
P
Ne =  Gl. 5.34
ρ ⋅ n3 ⋅ d 5
ρ⋅ n⋅ d 2
ReH =  Gl. 5.35
H
ρ ⋅ Γ⋅ d 2
B=  Gl. 5.36
H
Die Leistungskennzahl hängt nun von der modifi-
zierten Reynoldszahl, ReH, und von B, ab (Ne = f(ReH,
B)). Durch das zusätzliche Argument unterscheidet
sich die Leistungscharakteristik von ihrem newton-
schen Analogon fundamental.
Dies wird anhand von eigenen Arbeiten mittels
drei geometrisch ähnlicher Ankerrührer und unter-
schiedlichen rheologisch ähnlichen Flüssigkeiten
gezeigt. Dafür wurde für verschiedene scherver-
dünnende Flüssigkeiten die Viskositätskurve gemes-
sen (siehe . Abb. 5.3a) und mittels des Konzepts der
rheologischer Ähnlichkeit eine Masterkurve gebil-
det (siehe . Abb. 5.3b). Die zur Verschiebung ver-
wendeten H und Γ-Parameter wurden dann für die
Leistungscharakteristik in . Abb. 5.4 verwendet.
Der Zusammenhang Ne = (ReH, B) ist dabei klar
ersichtlich. Dank der hier vorgestellten Methode
von Pawlowski kann in Modellversuchen getrost
ein Modellfluid verwendet werden und die Maß-
stabsübertragung kann mit genügender Genauig-
keit durchgeführt werden [17].
z Viskoelastische Flüssigkeiten
Im 7 Kap. 4 wurde bereits ausführlich auf die visko-
elastischen Fließeigenschaften von Biosuspensionen
hingewiesen. Dies ist ggf. bei den entsprechenden
Stoffwerten in den jeweiligen Kennzahlen zu berück-
sichtigen. Dazu muss noch einmal auf die Visko-
elastizität zurückgekommen werden. Die typischen
Erscheinungen beim Fließen viskoelastischer Flüs-
sigkeiten sind eine starke Abhängigkeit der Scher-
viskosität von der Scherrate, das Auftreten von
Normalspannungsdifferenzen und eine Spannungs-
relaxation im instationären Fall. Spannungsrelaxa-
tion bedeutet, dass die Spannungen auf plötzliche
Veränderungen relevanter kinematischer Größen
nur verzögert folgen, entsprechend der Spannungs-
relaxationszeit. Letztere ist diejenige Zeit, nach der
die Spannungsänderung zu (1 − 1/e) 100 % abge-
laufen ist, wobei ein exponentieller Verlauf unter-
stellt wird. Dasselbe gilt im umgekehrten Fall für die
kinematischen Größen, wenn die Spannung plötzlich
verändert wird (Retardation). Normalspannungsdif-
ferenzen machen sich in solchen Strömungsfeldern
bemerkbar, wo die Strömung mehrere Geschwindig-
keitskomponenten hat, wenn man von Wirkungen
auf die Strömungsberandung absieht.
Für Transportvorgänge in strömenden viskoelas-
tischen Flüssigkeiten ergeben sich deshalb neben den
oben genannten drei Kennzahlen noch zwei weitere,
die die soeben geschilderten Erscheinungen berück-
sichtigen. Es handelt sich um die Deborahzahl De
λm
De = Gl. 5.37
t0 
welche eine charakteristische Materialzeit λm (z. B.
Spannungsrelaxationszeit) mit einer charakteristi-
schen Systemzeit t0 (z. B. Verweilzeit, Dauer eines
periodischen Vorgangs usw.) vergleicht, und um die
Weissenbergzahl Wn
σ1 − σ2  Gl. 5.38
Wn =
τ
welche die erste Normalspannungsdifferenz mit der
Schubspannung vergleicht. Im Falle einiger einfacher
viskoelastischer Modellgleichungen wird Wn zu
λm ⋅ v
Wn =  Gl. 5.39
d
d ist dabei eine charakteristische Länge und v die
mittlere Strömungsgeschwindigkeit.
Kapitel 5 · Transportvorgänge in B
­ iosuspensionen
139 5
. Abb. 5.3  (a) Rheologisch
ähnliche Viskositätskurven von  
Xanthan, Guar und PAA bei ;DQWKDQ
;DQWKDQ
unterschiedlichen Konzentrationen.
;DQWKDQ
(b) Masterkurve der Fluide aus (a),  
;DQWKDQ
wobei die Normierungsfunktion (4.61) ;DQWKDQ
angewendet wurde ;DQWKDQ
 
;DQWKDQ
*XDU
*XDU
 

η
3$$

 

 

 
           
γ

 

 
η +

 

 
       
γī

Die Bestimmung der charakteristischen Mate-

rialzeit λm betreffend, sei ein kleiner rheologischer
Exkurs eingeschoben. λ m kann aus verschiede-
nen rheologischen Materialfunktionen bestimmt
werden. Eine Möglichkeit besteht darin, den Schub-
spannungsverlauf nach einem Sprung in der Scher-
rate zu messen und daraus, wie oben beschrieben,
λm zu bestimmen. Das impliziert einen exponen-
tiellen Verlauf der Schubspannungsänderung, wie
das beim phänomenologischen Modell eines Dämp-
fers (für die Materialeigenschaft Viskosität) in Serie
mit einer Feder (für den elastischen Schubmodul),
dem sogenannten Maxwell-Modell, der einfachs-
ten viskoelastischen Modellgleichung, der Fall ist
(7 Kap. 4).
Bei der Verwendung anderer rheologischer
Materialfunktionen für die Bestimmung von λm
muss man ebenfalls viskoelastische Modelle voraus-
setzen, um eine Relaxationszeit zuordnen zu können.
Am einfachsten ist es wiederum, das Maxwell-Mo-
dell oder das Voigt-Kelvin-Modell (eine Feder par-
allel zu einem Dämpfer) zu verwenden. Letzte-
res ist bei Stoffen, deren Fließverhalten dem eines
festen Stoffes näher kommt als dem einer Flüssig-
keit angebracht.
Auf diese Weise kann man anhand der viskoelas-
tischen Materialfunktionen η′ und η″ (bzw. G′ und
G″) Materialzeiten wie die Spannungsrelaxations-
zeit λm oder die Retardationszeit λv bestimmen
 140 H. Chmiel und E. Walitza

. Abb. 5.4  Leistungskennzahlcha-

rakteristik in Abhängigkeit der modi- 104
log(B) = -8.62
fizierten Reynoldszahl und dem Para-
meter B. Legende gemäß . Abb. 5.3
log(B) = -6.15
log(B) = -0.18

log(B) = -3.15

log(B) = 1.95

P/ρn3d5
102

5
100

10-4 10-2 100 102

ρnd2/H

η′′ η′′
λm = = (Maxwell)  Gl. 5.40
G′′ η′ω
η′ η′
λv = = (Voigt-Kelvin)  Gl. 5.41
G′ η′′ω
In . Abb. 5.5 ist die Retardationszeit, mit der das
Abklingen der Deformation bei der abrupten Ver-
änderung der Spannung beschrieben wird, bestimmt
aus η′ und G′, als Funktion der Frequenz bei zwei ver-
schiedenen Amplituden der Scherung (7 Kap. 4) für
eine Suspension von Streptomyces tendae dargestellt.
Offenbar hat man es nicht mit einer einzigen
Retardationszeit zu tun, denn λv erweist sich als stark
abhängig von der Frequenz und ist somit keine reine
Materialeigenschaft mehr. Ursache dafür ist, dass ein
so einfaches Modell wie das Voigt-Kelvin-Modell
nicht in der Lage ist, so komplizierte Flüssigkeiten
wie Biosuspensionen zu beschreiben.
Denkt man sich das Fließverhalten durch eine
Superposition einer Vielzahl von in Serie geschal-
teten Voigt-Kelvin-Modellen zustande gekommen,
so kann man dem Verlauf η*(ω) ein Spektrum von
Retardationszeiten zuordnen [5] und man erhält mit
dem gesamten Spektrum wieder eine reine Material-
eigenschaft. Bei einem breiten Spektrum kann das
viskoelastische Verhalten in einem großen Bereich
von Systemzeiten für Transportvorgänge im Bioreak-
tor eine Rolle spielen. Zur Verwendung in der Debo-
rahzahl bietet sich die Retardationszeit an, die mit
der höchsten Intensität im Spektrum auftritt.
Prinzipiell möglich, jedoch messtechnisch
schwieriger zu realisieren, ist die Bestimmung von
Wn, entsprechend Gl. 5.38, über Normalspannungs-
messungen. Die Weissenberg- und die Deborahzahl
lassen sich über die Dimensionsanalyse einführen,
wenn man die Relevanzliste Gl. 5.26 um σ1 − σ2 und
λm erweitert.
5.2.2 Leistungseintrag beim
Rühren begaster newtonscher
Flüssigkeiten
Für die Leistungskennzahl Ne des Rührers gilt
allgemein
Ne = f ( Re, Fr, Q,We)  Gl. 5.42
Hier wird eine weitere dimensionslose Kennzahl, die
Gasdurchsatzkennzahl Q
qG
Q=  Gl. 5.43
n⋅d3
verwendet. qG ist dabei der Gasvolumenstrom. Im
unbegasten System, wenn Q = 0, und bei entspre-
chenden Einbauten, kann die Froudezahl vernach-
lässigt werden, sodass die Leistungskennzahl-wie
oben gezeigt wurde- nur noch von der Reynolds-
zahl abhängt. In . Abb. 5.6 ist für diesen Fall und
Kapitel 5 · Transportvorgänge in B
­ iosuspensionen
141 5
. Abb. 5.5  Retardationszeit λv
als Funktion der Frequenz für eine
Streptomyces tendae-Suspension,
ermittelt aus der komplexen Viskosität,
für zwei verschiedene Amplituden im
oszillierenden Scherexperiment

eine Reihe verschiedener Rührertypen die Leistungs-
kennzahl Ne = f(Re) qualitativ dargestellt.
Man erkennt, dass im vollturbulenten Bereich die
Leistungskennzahl von der Reynoldszahl unabhän-
gig ist, während im laminaren Bereich für die Rühr-
leistung P
der eingetragenen Rührleistung zu beobachten
(. Abb. 5.7). Diese Abnahme wird – so lautet eine
mögliche Erklärung – durch Gaspolster verursacht,
die sich hinter den Rührerblättern ausbilden und den
Strömungswiderstand reduzieren.

P ~ n 2 ⋅ d 3 oder Ne ~
1
 Gl. 5.44
Re
gilt. Ein ähnliches Verhalten kennt man vom Druck-
verlust in der Rohrströmung. Die konstante Leis-
tungskennzahl im Turbulenten und der Proportio-
nalitätsfaktor im Laminaren hängen von der Art des
Rührers ab.
In begasten Systemen ist im turbulenten Bereich
mit zunehmender Gasbelastung eine Abnahme
5.2.3 Leistungseintrag beim Rühren
begaster viskoelastischer
Flüssigkeiten
Es ist zunächst daran zu erinnern, dass das visko-
elastische Verhalten einer Biosuspension sowohl von
der flüssigen Phase (Beispiel: Xanthan in wässriger
Lösung) als auch von den Zellen, der dispersen Phase
(Beispiel: Streptomyces tendae), herrühren kann. Aus

. Abb. 5.6  Leistungskennzahl Ne

als Funktion der Reynoldszahl für drei
verschiedene Rührertypen [1]
 142 H. Chmiel und E. Walitza
. Abb. 5.7  Normierte
Leistungskennzahl in Abhängigkeit
von der Gasdurchsatzkennzahl Q für
newtonsche Fluide im turbulenten
Bereich. Ne0 ist die Leistungskennzahl
für Q = 0 [1]
den . Abb. 4.19 und 4.20 geht hervor, dass sich wäss-
rige Polyacrylamid-Lösungen und eine Fermenta-
tionsbrühe von Streptomyces tendae rheologisch qua-
litativ ähnlich sind; beide sind stark scherentzähend
und verhalten sich viskoelastisch. Wässrige Polyac-
rylamid-Lösungen sind daher in Untersuchungen,
in denen das Fließverhalten relevant ist, als Modell-
fluide für Biosuspensionen geeignet. Beispielsweise
ist für die Widerstandscharakteristik von Biosus-
pensionen ein ähnlicher Verlauf zu erwarten, wie es
in . Abb. 5.1 für wässrige Polyacrylamid-Lösungen
gezeigt wurde: eine drastische Widerstandsvermin-
derung im turbulenten Bereich einer Rohrströmung
als Folge einer gedämpften Turbulenz. Analoge Ver-
hältnisse, die Turbulenz betreffend, wurden im Rühr-
reaktor gefunden. Im Laminaren findet man aber im
Rührreaktor auch schon Unterschiede, da wegen der
Normalspannungsdifferenzen bei den viskoelasti-
schen Flüssigkeiten andere Strömungsbilder entste-
hen als bei den newtonschen oder rein viskosen.
In . Abb. 5.8 ist die Leistungskennzahl Ne als
Funktion der Galileizahl für verschiedene wässrige
Lösungen aufgetragen. Die Galileizahl Ga ist defi-
niert als
Re2 g ⋅ d 3
Ga = = 2  Gl. 5.45
Fr v
und entspricht damit, wenn ρl ≫ ρg, der schon defi-
nierten Grashofzahl. Die Größe v in Gl. 5.45 ist die
kinematische Viskosität Im vorliegenden Fall ist
Fr = 1 und damit wird Ga = Re2. Die Reynoldszahl
wird dabei, wie in 7 Kap. 4 beschrieben, mit einer
nach Metzner und Otto [13] bestimmten reprä-
sentativen Viskosität gebildet. Der Parameter in
. Abb. 5.8 ist die Gasdurchsatzkennzahl Q. Alle
untersuchten Fluide sollten bei gleicher Galilei-
zahl in den turbulenten Bereich übergehen, ver-
bunden mit einem sprunghaften Anstieg von Ne.
Tatsächlich erfolgt der Übergang in die Turbu-
lenz bei der Polyacrylamid-Lösung (PAA) nahezu
zwei Zehnerpotenzen später als bei der Glycerin/
Wasser- und der Carboxymethylcellulose-Lösung
(CMC). Außerdem macht sich die mit wachsen-
dem Q zunehmende Widerstandsverminderung
beim PAA erst bei höheren Ga bemerkbar, kommt
dann aber schneller zur vollen Wirkung. Für das
vergleichbare Verhalten von Glycerin und CMC
ist die Verwendung der repräsentativen Viskosi-
tät verantwortlich. Der Befund bei der PAA-Lö-
sung ist Folge der ausgeprägten elastischen Kom-
ponenten in der Viskoelastizität die zu einer stark
gedämpften Turbulenz führen und kann durch
die repräsentative Viskosität allein offenbar nicht
erfasst werden.
5.3 Stofftransport in
Biosuspensionen
Beim Stofftransport können die folgenden vier
Systeme unterschieden werden.
Gas/Flüssigkeit: Wegen der geringen Löslich-
keit von Sauerstoff in wässrigen Lösungen muss
bei allen aeroben Prozessen der Versorgung der
Kapitel 5 · Transportvorgänge in B
­ iosuspensionen
. Abb. 5.8  Leistungskennzahl Ne als Funktion der
Reynoldszahl beim Scheibenrührer für newtonsche (Glycerin),
schwach viskoelastische (CMC) und stark viskoelastische
Fluide (PAA). Parameter ist die Gasdurchsatzkennzahl [10]
Mikroorganismen mit Sauerstoff besondere Beach-
tung geschenkt werden. Auch als Substrat finden
gering lösliche Gase, wie Methan und andere leichte
Kohlenwasserstoffe, in Bioprozessen – z. B. bei der
Produktion von single-cell-Proteinen – Anwendung.
Flüssigkeit/Flüssigkeit: Ist die Nahrungsquelle
der Mikroorganismen ein flüssiger Kohlenwasser-
stoff, oder wird als Produktaufarbeitungsverfahren
die Flüssig/flüssig-Extraktion angewandt, so verlau-
fen die entscheidenden Stoffübertragungsvorgänge
an flüssigen Grenzflächen.
Flüssigkeit/Feststoff: In modernen Bioreakto-
ren wird der Biokatalysator häufig an festen Oberflä-
chen fixiert (7 Kap. 6). Weiterhin gibt es eine ganze
Reihe chromatographischer Produktaufarbeitungs-
verfahren (Adsorption, Gelchromatographie, Affi-
nitätschromatographie). In allen genannten Fällen
erfolgt der Stoffaustausch zwischen einer flüssigen
und einer festen Grenzfläche.
143 5
Gas/Feststoff: Der Einsatz von Wirbelschichten
ist aus vielen Anwendungen der Lebensmittelverfah-
renstechnik, z. B. beim Trocknen und Instantisieren,
bekannt. Ein ganz neuer Anwendungsbereich liegt
in der Verwendung der Gas/Feststoff-Fluidisation
für die Fermentation unter wasserreduzierten Bedin-
gungen. Ein Beispiel ist die Erzeugung von Ethanol
im Wirbelschichtfermenter mit der Hefe Saccharo-
myces cerevisiae.
Oft ist ausreichende Sauerstoffversorgung der
Mikroorganismen im Bioreaktor nur durch zusätz-
lichen Leistungseintrag durch Rühren möglich. Der
erhöhte Stofftransport durch starkes Rühren im Ver-
gleich zur Konvektion als Folge der frei aufsteigenden
Blasen hat folgende Ursachen:
1. Die hohe dynamische Beanspruchung an der
Rührerspitze erzeugt örtlich sehr feine Blasen.
Nimmt die Koaleszenzneigung nicht im
gleichen Maße zu, so erhöht sich dadurch die
mittlere spezifische Austauschfläche a′
2. Im Fermentationsfluid befindliche Kompo-
nenten unterschiedlicher Dichte (z. B.
Gasblasen, flüssige Kohlenwasserstoffe, Zellag-
glomerate etc.) werden durch den Rührvorgang
dispergiert und bleiben auf diese Weise über das
gesamte Reaktorvolumen gleichmäßig verteilt.
3. Die durch starkes Rühren erzeugte Turbulenz
verringert den Blasendurchmesser und erhöht
damit a′.
4. Die maximale Größe der Zellaggregate
(Mycelien, Pellets etc.) wird durch Rühren
vermindert. Andererseits beobachtet
man häufig bei zu starker Scherung eine
Verminderung der Produktivität, die ihre
Ursache offensichtlich in einer mechanischen
Schädigung von Zellen oder Enzymen hat.
5. Gelegentlich ist die Biosuspension so
hochviskos, dass erst durch intensives Rühren
eine Homogenisierung des Reaktorinhalts
erzielt wird.
Die relevanten Kennzahlen sind Re, Fr, Sh, We, Wn,
De und Sc. In ausreichend großen Reaktoren, bei
denen durch entsprechende Einbauten die kontinu-
ierliche Phase gut gemischt ist, ist der Einfluss der
freien Oberfläche auf die Stoffübertragung (Fr) ver-
nachlässigbar. Die Sherwoodzahl ist dann nur noch
eine Funktion von Re, Sc, We, Wn und De.
 144 H. Chmiel und E. Walitza
5.3.1 Sauerstoffeintrag in
Fermentationsbrühen
Auf das Thema Sauerstoffeintrag in Fermentations-
brühen wurde bereits im 7 Abschn. 3.4 eingegangen.
Das am häufigsten auftretende Problem bei der Aus-
legung von Bioreaktoren für aerobe Prozesse ist die
Versorgung der Mikroorganismen mit Sauerstoff.
Unter Gleichgewichtsbedingungen gilt an einer
Phasengrenzfläche Gas/Flüssigkeit das Henry’sche
5 Gesetz
Hcli = cgi  Gl. 5.46
mit cli und cgi als Grenzflächen-Konzentrationen der
Komponente in der Flüssigkeit bzw. im Gas und H als
Henry’schem Verteilungskoeffizient.
H ist erheblich von der Temperatur und den
Medienbestandteilen abhängig. In . Abb. 5.9 ist die
Temperaturabhängigkeit der Löslichkeit von Sauer-
stoff in Form des Bunsenkoeffizienten α dargestellt.
Der Bunsenkoeffizient entspricht dem auf 0 °C und
1 bar reduzierten Gasvolumen, welches von der
Volumeneinheit des Lösungsmittels bei einem Gas-
partialdruck von 1 bar gelöst wird.
Die Sauerstofflöslichkeit in Wasser bei 1 bar
nimmt mit zunehmender Temperatur von
2,18 mmol/L bei 0 °C auf 1,03 mmol/L bei 40 °C ab.
Elektrolyte bewirken ebenfalls eine Verringerung der
Sauerstofflöslichkeit. Beispielsweise reduziert eine
Konzentration an NaCl von 2 mol/L in Wasser die
O2-Löslichkeit bei 25 °C auf 60 % des Ausgangswer-
tes. Andererseits benötigt eine aktive Hefe bei einer
Populationsdichte von 109 Zellen/mL pro Stunde bei
Raumtemperatur ca. 750-mal so viel O2 wie in Sät-
tigung gelöst ist. Bei Bakterien kann der Sauerstoff-
bedarf sogar bis zu 3000 mL/(g h) betragen. Die Ver-
sorgung der Mikroorganismen mit derart großen
Mengen Sauerstoff ist nicht trivial, da wegen der
geringen O2-Löslichkeit und der damit verbunde-
nen niedrigen Konzentrationsgradienten die treiben-
den Kräfte klein sind.
. Abb. 5.10 zeigt schematisch den Stofftransport
zwischen einer Gasblase (z. B. Sauerstoff enthaltende
Luft) und einem Zellverband. Für einen Transport
Flüssigkeit/Flüssigkeit gilt Analoges. Der Sauerstoff
muss eine Reihe von Transportwiderständen über-
winden, und zwar:
. Abb. 5.9  Temperaturabhängigkeit der Löslichkeit von
Sauerstoff in Wasser. Bunsenkoeffizient α als Funktion der
Temperatur [20]
1. vom Kern der Gasblase zur Grenzschicht Gas/
Flüssigkeit;
2. die Grenzschicht Gas/Flüssigkeit;
3. das die Blase umgebende, nicht gemischte
Flüssigkeitsgebiet;
4. das gut gemischte Flüssigkeitsgebiet;
5. das den Zellverband umgebende, nicht
gemischte Flüssigkeitsgebiet;
6. den Zellverband, das Mycel oder ein
Feststoffpartikel;
7. die Zellmembran und intrazellulär zu den
Reaktionsplätzen.
In Sonderfällen kann der eine oder andere Wider-
stand verschwinden. Mikroorganismen lagern sich
gerne an Grenzflächen an, z. B. an der Gasblase,
sodass der Widerstand 4 nicht vorhanden ist. Exis-
tiert die Zelle nicht im Verband, dann entfällt der
Widerstand 6.
Drei Modellvorstellungen über den Stoff-
transfer sind weit verbreitet – die Zweifilmtheo-
rie, das Penetrationsmodell und die Theorie der
Oberflächenerneuerung.
Der Zweifilmtheorie liegen folgende Annah-
men zugrunde: Auf jeder Seite der Grenzfläche gibt
es einen Film, durch den der Stofftransport per Diffu-
sion erfolgt. An der Phasengrenze soll sich die über-
gehende Komponente im Gleichgewicht mit der
jeweiligen Phase befinden. An der Phasengrenze
bleibt also die den Gleichgewichtskonzentrationen
entsprechende Konzentrationsdifferenz erhalten.
Kapitel 5 · Transportvorgänge in B
­ iosuspensionen
145 5

. Abb. 5.10  Schematische Darstellung der Widerstände

beim Transport von Sauerstoff von einer Gasblase in eine . Abb. 5.11  Schematische Darstellung der
Zelle. Zu den Zahlen (1 bis 7) siehe Text [1] Sauerstoffkonzentration als Funktion des Ortes vom Inneren
einer Gasblase zum Flüssigkeitskern [1]

In den Phasenkernen sollen durch ständige Vermi- Kraft“ die Konzentrationsdifferenz cl* − cl; cl* ist die
schung die Konzentrationen konstant bleiben. Konzentration in der Flüssigphase, die im Gleich-
Beim Penetrationsmodell findet der Stoffüber- gewicht steht mit derjenigen im Kern der Gasphase
gang zwischen laminar bewegten Phasen durch zeitlich (. Abb. 5.11)
begrenzte und instationäre Diffusion in eine räumlich
unbegrenzte Phase statt. Ein Beispiel für diese Modell- Hc∗1 = cg  Gl. 5.49
vorstellung liefert der Stoffübergang im Rieselfilm.
Die Theorie der Oberflächenerneuerung geht Die Sauerstoffstromdichte ist dann
von einer ständigen Erneuerung der Volumenele-
mente an der Grenzfläche aufgrund turbulenter qO’ = K l ⋅ (cl* − cl )  Gl. 5.50
2
Bewegung aus. Die Austauschzeit wird durch eine
Wahrscheinlichkeitsfunktion erfasst. Die Kombination der Gl. 5.48, 5.49 und 5.50 führt
Die genannten Modelle berücksichtigen die zu der Beziehung zwischen dem Gesamtstoffaus-
realen hydrodynamischen Gegebenheiten nur unzu- tauschkoeffizienten Kl und den physikalischen Para-
reichend. Das Penetrationsmodell setzt ein falsches metern des vorliegenden Zweifilm-Problems, kg, kl
Geschwindigkeitsprofil voraus. Die Theorie der und H:
Oberflächenerneuerung arbeitet mit der Oberflä-
1 1 1
chenerneuerungshäufigkeit, die zahlenmäßig nicht = +  Gl. 5.51
K l kl H ⋅ kg
bekannt ist. Das Zweifilmmodell postuliert laminar
strömende Filme, die experimentell nicht nachzu- Für gering lösliche Gase ist H viel größer als 1; außer-
weisen sind. Dennoch soll das letztgenannte Modell dem ist kg beträchtlich größer als kl. Unter diesen
wegen seiner einfachen Berechenbarkeit und seiner Umständen gilt näherungsweise Kl = kl, d. h. der
Anschaulichkeit im Folgenden angewandt werden. gesamte Stofftransportwiderstand liegt auf der Seite
Mit cl und cg als Konzentrationen im Kern von des Flüssigkeitsfilms.
Flüssigkeit bzw. Gas müssen im stationären Zustand Der Sauerstoffstrom pro Reaktorvolumen qO
2
folgende Beziehungen für die Sauerstoffstromdichte sei definiert als
gelten A *
qO = k ⋅ ⋅ (c − cl ) oder
2 V l
2
( )
q'O = kg ⋅ cg − cgi (Gasfilm)  Gl. 5.47
qO = kl ⋅ a′ ⋅ (cl* − cl )  Gl. 5.52
2

q'O = kl ⋅ (cli − cl ) (Flüssigkeitsfilm)  Gl. 5.48

2 wobei A die Oberfläche der Gasblasen, V das Flüs-
sigkeitsvolumen und a′ = A/V dementsprechend
Da die Grenzflächenkonzentration gewöhnlich nicht die Gas/Flüssigkeitsgrenzfläche pro Volumenein-
gemessen werden kann, wird der Gesamtstofftrans- heit Flüssigkeit sind. Statt Kl wurde der Näherungs-
portkoeffizient Kl eingeführt und als „treibende wert kl als Stofftransportkoeffizient gewählt. Das
 146 H. Chmiel und E. Walitza
häufig in der Literatur zu findende a bezieht sich im
Gegensatz zu a’ auf das Gesamtvolumen im Biore-
aktor (also Flüssigkeits- plus Gasvolumen). Es muss
beachtet werden, dass qO 2 der örtliche Sauerstoff-
strom ist, entsprechend dem Ort, an welchem die
Konzentrationsdifferenz (cl* − cl) vorliegt. Ein Mit-
telwert für den Sauerstoffstrom pro Reaktorvolu-
men qO 2 ergibt sich aus einer Mittelung über den
gesamten Reaktor
5 qO = OTR =
1 V
⋅ ∫ qO dV
 Gl. 5.53
2 V 0 2 PAA-Lösung. Zwar ist dabei in der Reynoldszahl
Man nennt diesen Wert auch die Oxygentransfer-
rate (OTR) in Anlehnung an den angelsächsischen
Sprachgebrauch. Er hängt ab von einer Vielzahl von
Parametern, wie z. B. Leistungseintrag pro Volumen-
einheit, Fließeigenschaften, Grenzflächeneigenschaf-
ten (Koaleszenzverhalten), Charakteristik des Sauer-
stoffeintrags und den Strömungsbildern im Reaktor.
Auf die Messung lokaler Sauerstoffkonzentrationen
wird in 7 Kap. 7 eingegangen.
Zum Kohlendioxid, welches aus Fermenta-
tionsbrühen im Allgemeinen zu entfernen ist, sei
angemerkt, dass es in der Flüssigkeit in vier Formen
gelöst vorliegt: als CO2, H2CO3, HCO3– und CO32–.
Unterhalb pH 5 ist nahezu ausschließlich CO2
gelöst, während bei einem pH zwischen 7 und 9
Bicarbonat und oberhalb von pH 11 Carbonat
dominieren. Daher ist, je nach den Umständen, der
geschwindigkeitsbestimmende Schritt der CO2-E­
ntfernung ein chemischer oder physikalischer.
5.3.2 Sauerstoffeintrag in
viskoelastische Biosuspensionen
Unter Benutzung der repräsentativen Viskosität
lässt sich die OTR in einem begasten Rührreak-
tor auch für nichtnewtonsche, aber quasi unelas-
tische Flüssigkeiten vorausberechnen, wenn man
die für newtonsche Fluide gefundenen Zusam-
menhänge verwendet. Bei viskoelastischen Flüs-
sigkeiten dagegen versagt dieses Konzept. Im
letzten Abschnitt war darauf hingewiesen worden,
dass durch das viskoelastische Verhalten die Tur-
bulenz gedämpft und damit der Leistungseintrag
vermindert wird. Entsprechend muss sich auch der
Stofftransport verschlechtern.
Dies konnten [18] bei der kla-Bestimmung in
einem mit CO2 begasten Rührkessel anhand ver-
schiedener wässriger Modell-Lösungen zeigen.
Wenn nur die Sherwoodzahl (hier modifiziert als
klad2/D Co 2 (η/ηw)–1,39, mit d, dem Kesseldurch-
messer, und ηw, der Viskosität des Wassers) gegen
die Reynoldszahl aufgetragen wird (. Abb. 5.12a),
so zeigt die weniger elastische CMC-Lösung nicht
dieselbe Abhängigkeit wie die stark viskoelastische
schon eine für den Rührreaktor repräsentative Vis-
kosität verwendet worden, aber offenbar liegt hier
noch der Einfluss einer weiteren Größe vor. Wird
die Deborahzahl in die empirische Korrelation mit
aufgenommen, dann können alle Messwerte durch
denselben Zusammenhang beschrieben werden
(. Abb. 5.12b). Schon ab Deborahzahlen größer als
0,01 ist hier ein Effekt festzustellen.
Ein weiterer Nachweis für die Relevanz der Vis-
koelastizität ergibt sich, wenn man den Stoffüber-
gang von der Oberfläche einer sich bewegenden
Blase mit mobiler Oberfläche an die flüssige Phase
betrachtet. Dieser kann mittels der folgenden Kor-
relation für die Sherwoodzahl, die von [2] abgeleitet
wurde, berechnet werden,
kl ⋅ d 2  π 0,5
Sh = = ⋅  ∫ U 0 (θ ) ⋅ sin 2 θ dθ ⋅ Pe0,5
DAB π  0 
 Gl. 5.54
wobei U0(θ) die Geschwindigkeitsverteilung der
Flüssigkeit an der Blasenoberfläche ist, die für die
jeweilige viskoelastische Flüssigkeit noch zu bestim-
men wäre und ganz anders aussieht als bei newton-
schen Flüssigkeiten; θ ist der entsprechende Winkel
in einem Kugelkoordinatensystem und Pe die Péclet-
zahl (Pe = vd/DAB). Die Tatsache, dass U0(θ) auf jeden
Fall vom Fließverhalten, und zwar nicht nur von einer
repräsentativen Viskosität allein, sondern auch von
den Normalspannungsdifferenzen abhängt, macht
auch hier deutlich, dass Kennzahlen wie Wn und De
für den Stofftransport Bedeutung haben.
Bisherige Untersuchungen zum Einfluss des vis-
koelastischen Fließverhaltens auf den Stofftransport
Kapitel 5 · Transportvorgänge in B
­ iosuspensionen
. Abb. 5.12  Empirischer Zusammenhang zwischen
Stoffübergang und Reynoldszahl im CO2-begasten Rührkessel
für verschiedene Modellflüssigkeiten, (a) ohne und (b) mit
Berücksichtigung der Deborahzahl. □: CMC-Lösung; ■: PAA-
Lösung [18]
beschränken sich auf viskoelastische Modell-Lö-
sungen. Bei Fermentationsbrühen ist sowohl über
das rheologische Verhalten als auch über den Stoff-
transport berichtet worden, eine Korrelation von
Viskoelastizität und Stofftransport für dieses Stoff-
system steht allerdings noch aus.
147 5
5.3.3 Einfluss des metabolischen
Sauerstoffverbrauchs auf den
Sauerstofftransport
Für den Stofftransport in Fermentationsbrühen ist zu
beachten, dass durch die Existenz lebender Organis-
men lokale Quellen und Senken für Stoffe auftreten,
die die Diffusions- und Konvektionsbeiträge erheblich
beeinflussen können. Der durch die Zelle aufgenom-
mene Sauerstoff wird allgemein für die Energiegewin-
nung, für Synthesereaktionen, für den Zellmassen-
aufbau und den Erhaltungsstoffwechsel verbraucht.
Beschränkt man sich bei der Betrachtung des
Sauerstoffbedarfs einer Zelle zunächst auf den Anteil
zum Aufbau von Zellmasse, ergibt sich nach 7 Kap. 3
der maximale Sauerstoffverbrauch zu xµmax/Y O 2 ,
wobei x die Zellkonzentration und Y O 2 die gebil-
dete Biomasse pro verbrauchtem Sauerstoff darstel-
len. Für kla′(cl* – cl) ≫ xµmax /Y O 2 liegt der Haupt-
widerstand beim mikrobiellen Metabolismus. Im
umgekehrten Fall kann cl ≈ 0 gesetzt werden; der
Reaktor arbeitet dann transportlimitiert. Die reale
Situation ist komplizierter.
Im stationären Zustand muss der absorbierte
gleich dem konsumierten Sauerstoff sein:
x⋅µ
kl ⋅ a′ ⋅ (cl* − cl ) = Gl. 5.55
YO
2
Jeder Mikroorganismus benötigt eine bestimmte
O2 -Mindestkonzentration c O 2 , kr. Für die meisten
Mikroorganismen liegt c O 2 , kr zwischen 3 . 10−3
mmol/L und 50 · 10−3 mmol/L, das bedeutet ca. 0,1
bis 1 % der O2-Löslichkeit in Wasser. Ist cl > c O , kr,
2
dann liegt keine O2-Limitation vor. Die Art der Koh-
lenstoffquelle beeinflusst den Sauerstoffbedarf  beson-
ders stark. Beispielsweise bewirken Paraffine oder
Methan eine höhere Sauerstoffaufnahme durch die
Zellen als Glucose.
Gl. 5.55 ist die in der Biotechnik übliche Beschrei-
bung des Stofftransports und setzt voraus, dass der
O2-Verbrauch der Mikroorganismen den eindiffun-
dierenden O2-Strom nicht beeinflusst (1. Fick’sches
Gesetz). Wie eingangs erwähnt, ist bei vielen Fer-
mentationen diese vereinfachte Betrachtungsweise
auch ausreichend. Bei mycelbildenden Mikro-
organismen jedoch muss der O2-Transport durch
 148 H. Chmiel und E. Walitza
zusätzliche Analyse der Transportwiderstände im
Inneren des Mycels unter Umständen aber auch
durch den Transport an das Mycel ergänzt werden
(s. 7 Abschn. 3.7, . Abb. 3.16). Im Folgenden sei der
Sauerstofftransport innerhalb eines Mycelteilchens,
idealisiert als Diffusionsproblem mit Senken, näher
betrachtet.
Unter Annahme einer kugeligen Gestalt des
Mycels (Pellet) und einer in dieser Kugel gleichmä-
ßig verteilten Biomasse, lautet die Bilanzgleichung
5 des Sauerstoffs unter Berücksichtigung von Diffu-
sion, Reaktion, aber keiner Konvektion
∂c  d 2c 2 dc 
= Deff  2 + ⋅  − qO+ ⋅ x′  Gl. 5.56
∂t  dr r dr  2 ϕ ist eine dimensionslose Kennzahl und wird als
mit Deff, dem effektiven Diffusionskoeffizienten des
Sauerstoffs im Mycel; c, der örtlichen Konzentra-
+
tion des Sauerstoffs; qO2 ·x′ dem volumenbezoge-
nen Reaktionsstrom des Sauerstoffs (Senke); qO+ ,
2
der spezifischen Sauerstoffaufnahmerate der Zellen;
und x′, der Konzentration der Biomasse im Pellet.
Gl. 5.56 vereinfacht sich für den stationären Zustand
zu
 d 2c 2 dc 
Deff  2 + ⋅  = qO+ ⋅ x′  Gl. 5.57
 dr r dr  2
Unter der Bedingung, dass der Widerstand für den
Transport des Sauerstoffs aus dem Kern der Flüs-
sigkeit an die Pelletoberfläche zu vernachlässigen
ist, folgt als Randbedingung für die Oberfläche
r = R, c = c0 = const. Wegen der Symmetrie des Pro-
blems verschwindet der Konzentrationsgradient im
Zentrum der Kugel, d. h. es wird dort dc/dr = 0.
Mit der dimensionslosen Konzentration c
c = c / c0 
und der dimensionslosen Ortkoordinate r
r = r /R 
lautet Gl. 5.57 in dimensionsloser Form
2 +
d 2c 2 dc R ⋅ qO2 ′
+ ⋅ = ⋅x  Gl. 5.58
r2 r dr c0 ⋅ Deff
Führt man für den spezifischen Sauerstoffverbrauch
eine Michaelis-Menten-Kinetik in der Form
c
qO+ = qO+ max  Gl. 5.59
2 2 KM + c
ein, dann wird Gl. 5.58 zu
d 2c 2 dc c
+ ⋅ = φ2  Gl. 5.60
dr 2 r dr 1 + cc0 / K M
mit
qO+ max ⋅ x′
φ = R⋅ 2
 Gl. 5.61
Deff ⋅ K M
Thielemodul bezeichnet. Das Quadrat dieser Kenn-
zahl entspricht dem Verhältnis eines Stoffstroms
(Senke), hier resultierend aus einer Reaktion erster
Ordnung, zu einem reinen Diffusionsstrom. Bei
einem kleinen spezifischen Verbrauch und einem
großen Diffusionskoeffizienten ist ϕ klein. Es stellt
sich dann kein nennenswerter Gradient der Sauer-
stoffkonzentration im Pellet ein, und die Biomasse
kann überall bei der maximal möglichen Konzen-
tration ,atmen'. Im Extremfall sehr hohen spezi-
fischen Verbrauchs und eines kleinen Diffusions-
koeffizienten, das entspricht einem großen ϕ, wird
der im Pellet vorhandene Sauerstoff sehr schnell
verbraucht sein und die Diffusion kann nicht mehr
genügend nachliefern. Im stationären Fall wird
dann nur noch eine dünne Randschicht, innerhalb
der die Sauerstoffkonzentration auf null absinkt, am
Gesamtverbrauch beteiligt sein. Bei kleinen ϕ ist
offenbar das Pellet besser versorgt als bei großen.
Nun ist der gesamte Sauerstoffverbrauch aus Kon-
tinuitätsgründen durch folgende Größen bestimmt:
die Pelletoberfläche, das Pelletvolumen, den Dif-
fusionskoeffizienten und den Konzentrationsgra-
dienten an der Oberfläche, also durch den von der
Oberfläche ins Pelletinnere gerichteten Diffusions-
strom. Bezieht man diesen auf den Verbrauch bei
ϕ = 0, d. h. auf den Verbrauch bei dem die gesamte
Biomasse bei maximaler Sauerstoffkonzentration
c0 ,atmet', dann erhält man ein Maß für die Versor-
gung des Pellets mit Sauerstoff, den sogenannten
Effektivitätskoeffizienten. Um für den allgemeinen
Kapitel 5 · Transportvorgänge in B
­ iosuspensionen
Fall Angaben über den Effektivitätskoeffizienten
machen zu können, muss Gl. 5.58 numerisch gelöst
werden [1].
5.3.4 Die Bestimmung des Sauerstoff-
Transportkoeffizienten kla′
Wie oben dargelegt, ist die Größe kla′ für die Versor-
gung einer Biosuspension mit Sauerstoff von großer
Bedeutung. Sie eignet sich sowohl für den Vergleich
verschiedener Belüftungssysteme bei sonst glei-
chen Parametern, wie Rührer- und Reaktorgeome-
trie, Grenzflächen- und rheologischen Eigenschaf-
ten der Biosuspension usw., als auch zum Vergleich
unterschiedlicher Reaktorkonstruktionen bei glei-
chem Stoffsystem. Ihre experimentelle Bestimmung
ist besonders unter realen Fermentationsbedingun-
gen sinnvoll, aber mit erheblichem Aufwand – z. B.
bei der Reaktoroptimierung – verbunden.
In . Abb. 5.13 ist der Verlauf der Sauerstoffkon-
zentration während der Durchführung der soge-
nannten „dynamischen Methode“ zur Bestimmung
von kla′ dargestellt.
In Phase I befindet sich der Reaktor im stationä-
ren Zustand. Dann wird die Sauerstoffzufuhr sprung-
artig ausgeschaltet, und die Sauerstoffkonzentration
fällt entsprechend dem Verbrauch durch die Bio-
masse. Zu Beginn von Phase III wird die Belüftung
wieder eingeschaltet und die Sauerstoffkonzentration
steigt auf den ursprünglichen Wert an. Eine ausführ-
liche Beschreibung zur Bestimmung von k1a′ nach
dieser Methode findet man z. B. bei [14].
. Abb. 5.13  Konzentration des gelösten Sauerstoffs als
Funktion der Zeit bei der Bestimmung von kla′ und q+o2·x
nach der dynamischen Methode
149 5
5.3.5 Bestimmung von kla′ mittels der
Sulfit-Methode
Weil die Ermittlung von kla′ in Biosystemen mit einer
Reihe von Schwierigkeiten verbunden ist (sterile
Technik, Kosten für Inokulum und Medium, Prob-
leme der Mess- und Regeltechnik), weicht man auf
Modellsysteme aus. Als Modellsysteme kommen vor
allem chemische Systeme zur Anwendung, wie bei
der Hydrazin-Methode oder der Sulfit-Methode. Bei
Letzterer wird eine Natriumsulfit-Lösung (oft 0,8-
molar) belüftet. Durch den Luftsauerstoff wird Nat-
riumsulfit unter katalytischer Wirkung von Metall-Io-
nen (meist Co2+ oder Cu2+) zu Natriumsulfat oxidiert.
Dieser chemische Sauerstoffverbrauch soll also den
bei der biologischen Fermentation vorliegenden
ersetzen. Von Nachteil dabei ist, dass die so gefun-
denen kla′-Werte nicht übereinstimmen können mit
denen, die sich in der realen Fermentation ergeben,
da die Phasengrenzfläche von Grenzflächeneigen-
schaften des Systems stark beeinflusst ist. Ein weiterer
Nachteil ist auch, dass die Ergebnisse sehr stark von
der Hatta-Zahl, d. h. vom Verhältnis Antransport zur
diffusiven Weiterleitung, abhängen. Trotzdem erlau-
ben chemische Modellsysteme, wegen ihrer relativ
einfachen Handhabung, eine schnellere Grundop-
timierung (ca. eine Nacht), als biologische Systeme.
5.3.6 Stoffübergang an einzelnen
Blasen und Blasenschwärmen
Da der Antransport zum Film gleich der diffusiven
Weiterleitung ist, gilt für die örtliche Stoffstrom-
dichte an der Grenzfläche Gas/Flüssigkeit einer Blase
 ∂c 
kl ⋅ (cl* − cl ) = −DAB   ,
 ∂z ( z =0)
wobei die z-Koordinate senkrecht zur Grenzfläche
in die Flüssigkeit weisen möge. Der Stofftransport-
koeffizient ist dann
1  ∂c 
kl = − ⋅ DAB    Gl. 5.62
( cl* − cl )  ∂z ( z =0)
 150 H. Chmiel und E. Walitza

oder dimensionslos d 2 ⋅ ∆ρ ⋅ g
v=  Gl. 5.67
18η1
kld 1  ∂c 
Sh = =−   Gl. 5.63
DAB 1 − c  ∂z ( z =0) Setzt man Gl. 5.67 in Gl. 5.66 ein, ergibt sich Gl. 5.68

wenn d einen charakteristischen Blasendurchmesser  d 3 ⋅ ∆ρ ⋅ g 1/3  d 3 ⋅ ρ ⋅ ∆ρ ⋅ g 1/3


Sh = 1, 01⋅   = 1, 01⋅  1 
und DAB den Diffusionskoeffizienten des Gases in 18η ⋅ D   18η 2 
1 AB 1
der Flüssigkeit bedeuten. An der Grenzfläche erhält
1/ 3
man die dimensionslose Konzentration c über eine  η 
⋅ 1 
Lösung der Transportgleichung, die wie folgt aus-  ρ1 ⋅ DAB 
5 sieht (s. auch Abschnitt 5.1.2)

c = f ( z, Sh, Sc, Gr ) Gl. 5.64 Sh = 0, 39 ⋅ Gr1/ 3Sc1/ 3  Gl. 5.68

Benutzt man diesen Ausdruck zur Berechnung der
Ableitung
 ∂c 
  
 ∂z ( z =0)
in Gl. 5.63, so ergibt sich für die Sherwoodzahl Sh ein
Zusammenhang
Sh = F ( Sc, Gr ) 
d. h. der dimensionslose Stofftransportkoeffi-
zient Sh ist nur eine Funktion von Sc und Gr. In
der Literatur findet man stattdessen gelegentlich
dimensionslose Gruppen wie Reynoldszahl Re und
Pécletzahl Pe. Substituiert man aber die charakte-
ristische Geschwindigkeit über die Dichtedifferenz
Δρ = (ρl – ρg), so erhält man wieder die Gl. 5.65.
Der Stofftransport an einzelnen kugelförmigen
Blasen mit starrer Oberfläche kann für den Fall Re 
<< 1 und Pe >> 1 (d. h. ρl · d · /η1 << 1 << · d/DAB,
was impliziert, dass ηl/ρlDAB = Sc >> 1) theoretisch
berechnet werden. In wässrigen Fluiden ist die kine-
matische Zähigkeit  l = ηl/ρl ungefähr 10−2 cm2/s,
und DAB liegt für Sauerstoff bei 10−5 cm2/s. Daraus
ergibt sich eine Schmidtzahl von ca. 103. Für Rey-
noldszahlen von 10−1 bis 10−2 gilt
1/ 3
Sh = 1, 01 ⋅ Pe1/ 3 = 1, 01 ⋅ (νd / DAB )
Bei derart kleinen Reynoldszahlen ist die Geschwin-
digkeit veiner in der Flüssigkeit aufsteigenden kugel-
förmigen Blase im stationären Zustand
also, wie erwartet, eine Beziehung Sh = F(Gr, Sc).
Für etwas größere Reynoldszahlen und einzelne
kugelförmige Blasen mit starrer Oberfläche in lami-
narer Strömung gilt
Sh = 2, 0 + 0, 6 ⋅ Re1/ 2 ⋅ Sc1/ 3  Gl. 5.69
In vielen industriellen luftbegasten Reaktoren steigen
die Gasblasen als Schwärme auf, sodass sich Hydro-
Gl. 5.65 dynamik und Stofftransport deutlich von denen der
Einzelblase unterscheiden. Calderbank und Moo-
Young [6] fanden in ihren Versuchen mit schwer
löslichen Gasen in Flüssigkeiten bei chemischer
Absorption zwei Bereiche. Für Blasen mit einem
Durchmesser d ≤ 2,5 mm gilt
Sh = 0, 31⋅ Gr1/ 3 ⋅ Sc1/ 3  Gl. 5.70
und für d > 2,5 mm
Sh = 0, 42 ⋅ Gr1/ 3 ⋅ Sc1/ 2  Gl. 5.71
Daraus folgt, dass der Stofftransportkoeffizient
kl (oder Sh), bei denselben Gr und Sc, bei Blasen-
schwärmen rund 20 % niedriger ist als bei Einzel-
blasen mit starrer Oberfläche.
Ist mit einer der obigen Gleichungen kl berechnet
worden, so ist noch die Austauschfläche pro Volu-
 Gl. 5.66 meneinheit a′ zu bestimmen, um kla′ zu erhalten.
Falls der mittlere Blasendurchmesser d (eventuell
fotografisch) und die Blasenverweilzeit im Reaktor
tb ermittelt werden können, ist a′ (Koaleszenz ver-
nachlässigt) gegeben durch
Kapitel 5 · Transportvorgänge in B
­ iosuspensionen
π ⋅ d 2 1 nd ⋅ qG,0 ⋅ tb 6
a′ = nd ⋅ qG,0 ⋅ tb ⋅ ⋅ = ⋅ bei zu starker Wärmeproduktion beim Rühren
π 3 V V d
d
6 oder durch exotherme Umsetzungsreaktionen
 Gl. 5.72
V ist dabei das Flüssigkeitsvolumen, qG,0 der Gas-
strom pro Düse und nd die Anzahl der Düsen.
Tatsächlich ändert sich aber der Blasendurch-
messer im Bioreaktor häufig als Folge der Wechsel-
wirkungen zwischen örtlichen Fluidkräften und den
Grenzflächenspannungen, denn Scher- und Normal-
spannungen brechen Blasen in kleinere auf, anderer-
seits stabilisieren die Grenzflächenkräfte die Blasen in
kugeliger Form (Minimierung der Grenzflächenener-
gie). Der größte stabile Durchmesser, der sich dabei
ergeben kann, wird auch kritischer Blasendurchmes-
ser genannt. Das Verhältnis zwischen den fluiddyna-
mischen Eigenschaften und der Grenzflächenspan-
nung beschreibt die Weberzahl We (Gl. 5.23), die mit
dem kritischen Blasendurchmesser gebildet, die kriti-
sche Weberzahl Wekr ergibt. Für ein reines Luft/Was-
ser-System hat Wekr ungefähr die Größe 1.
5.4 Wärmeübergang im Bioreaktor
Verglichen mit dem Transport von Stoff und Impuls ist
dem von Wärme in Bioprozessen bisher nur geringe
Aufmerksamkeit geschenkt worden. Ein Grund dafür
mag die Annahme sein, es könnten die bei newton-
schen Fluiden bekannten Analogien zwischen den
Transportvorgängen für Impuls, Stoff und Wärme
auch bei Fermentationsbrühen angewandt werden.
Diese Annahme ist allerdings nur solange richtig, als
die Fermentationsbrühen sich wie newtonsche Fluide
verhalten. Somit besteht noch ein Defizit an grund-
sätzlichen Untersuchungen zum Wärmeübergang,
was insbesondere die stark viskoelastischen Fermen-
tationsbrühen in begasten Bioreaktoren betrifft. Im
Folgenden muss deshalb mehr als bisher auf andere
Geometrien und auf Ergebnisse der chemischen Ver-
fahrenstechnik zurückgegriffen werden.
Es gibt viele Gründe, warum einem Bioreak-
tor Wärme zu- oder abgeführt werden muss. Einige
Beispiele sind die Hitzesterilisation, das Einstel-
len optimaler Arbeitstemperaturen (z. B. 55–66
151 5
°C bei thermophilen Bakterien), Wärmeabfuhr
oder das Trocknen von Zellsuspensionen durch
Wasserabdampfen.
Die Wärmeübertragung kann auf verschie-
dene Weise realisiert werden, z. B. mithilfe eines
Heiz- oder Kühlmantels, einer in den Reaktor
getauchten Heiz- oder Kühlschlange, durch
Abdampfen von Wasser etc. Wie bei der Stoff-
übertragung liegt auch bei der Wärmeübertragung
der Haupttransportwiderstand in der Flüssigkeits-
grenzschicht unmittelbar an der Übertragungsflä-
che. Die den Wärmetransport bestimmende Flüs-
sigkeitsgrenzschicht ist aber im Bioreaktor im
Allgemeinen nicht identisch mit der den Stoff-
transport bestimmenden Grenzschicht. Schon
deshalb können aus globalen Transportkoeffizi-
enten, die am Reaktor gewonnen wurden, keine
Analogieschlüsse gezogen werden.
Für die Bestimmung des Wärmestroms Q W, der
in einer vorgegebenen Konfiguration auftritt, geht
man von der folgenden Gleichung aus:
Q W = k W ⋅ A ⋅∆T  Gl. 5.73
Darin ist kW der Wärmetransportkoeffizient, A die
Austauschfläche und ΔT die treibende Temperatur-
differenz. Der Gesamtwärmewiderstand 1/kW ist im
Allgemeinen die Summe von Einzelwiderständen.
Im Falle des Wärmedurchtritts durch eine ebene
Schicht der Dicke d lautet er
1 / kW = 1 / α1 + d / λ + 1 / α2  Gl. 5.74
wobei α1 und α2 die Wärmeübergangszahlen vor und
hinter der Schicht und λ die Wärmeleitfähigkeit der
Schicht bedeuten.
Wird die Wärmeübergangszahl jeweils durch λ
und d dimensionslos gemacht, so erhält man mit
α⋅d  Gl. 5.75
Bi =
λ
die Biotzahl. Handelt es sich bei dem Medium vor der
Schicht um eine Flüssigkeit und macht man α durch
λ1, die Wärmeleitfähigkeit der Flüssigkeit, und d1,
 152 H. Chmiel und E. Walitza
die Dicke der Flüssigkeitsschicht, dimensionslos, so
ergibt sich die Nusseltzahl
α ⋅ d1
Nu =
λ1 
In der angelsächsischen Literatur wird für die Dar-
stellung der Wärmeübergangscharakteristik im All-
gemeinen die Stantonzahl St oder die Colburnzahl
j verwendet:
5 Unterschiede in den Koeffizienten a, b, c, d ergeben
St = Nu ⋅ Re−1 ⋅ Pr −1
j = St ⋅ Pr 2 / 3 
Die Prandtlzahl, die in diesen Beziehungen auf-
taucht, ist eine weitere dimensionslose Einflussgröße;
sie wird nur aus Stoffgrößen gebildet
cp ⋅ η1
Pr =  Gl. 5.79
λ1
cp ist dabei die spezifische Wärme bei konstantem
Druck. Nimmt man noch die Reynoldszahl und im
Falle der Rohrströmung zusätzlich das Verhältnis der
Rohrlänge zum Rohrdurchmesser (L/d) hinzu, dann
hat man einen Satz von Kenngrößen, der für viele
Fälle ausreicht, den Wärmetransport anhand von Nu
dimensionslos zu beschreiben:
Nu = f ( Pr, Re)
bzw.
Nu = g ( Pr, Re, L /d ) 
Für newtonsche Flüssigkeiten gilt beispielsweise für
die turbulente Rohrströmung
Nu = 0, 012 ⋅ ( Re0,8 − 280) ⋅ Pr 0, 4
⋅ 1 + (d /L )
0,666 
  Gl. 5.82

(104 ≤ Re ≤ 1, 2 ⋅106;1, 5 ≤ Pr ≤ 500; L / d ≥ 1)
Für den laminaren Bereich der Rohrströmung und
rein viskose Flüssigkeiten gilt
1/ 3
Nu = 3, 663 + 1, 613 ⋅ Re ⋅ Pr ⋅ d / L  Gl. 5.83
Im Rührkessel kann der Wärmeübergang mit einem
Gl. 5.76 der Gl. 5.82 ähnlichen Typ beschrieben werden:
 η d
Nu = a ⋅ Reb ⋅ Pr c ⋅  1   Gl. 5.84
 ηw 
Gl. 5.77 sich bei unterschiedlicher Strömungsart (laminar,
turbulent), bei verschiedenem Rührertyp (Propel-
Gl. 5.78 ler-, Scheiben-, Ankerrührer) und bei unterschied-
licher Austauschfläche (Kühlschlange innen, Kühl-
schlange außen, Reaktorinnenwand usw.). Gl. 5.83 gilt
auch für nichtnewtonsche, aber inelastische Fluide,
wenn man anstelle der Viskosität eine für den Rührer
repräsentative Viskosität verwendet.
In den Standardlehrbüchern [4, 9] und Handbü-
chern (z. B. [21]) zur Wärmeübertragung können die
Zusammenhänge für die verschiedensten Wärme-
übertragungssituationen, auch für Rührkessel, nach-
gesehen werden, solange mit newtonschen oder rein
viskosen Fluiden gearbeitet wird. Hier wird deshalb
auf weitere Angaben dazu verzichtet. Es muss aber
darauf hingewiesen werden, dass wegen des Tempe-
ratur- und des Geschwindigkeitsgradienten variable
Stoffwerte auftreten. Je nach dem zu behandelnden
Problem sind dementsprechende, effektive Stoffwerte
Gl. 5.80 zu verwenden. Wie die Letzteren aussehen, soweit
es den Geschwindigkeitsgradienten betrifft, wird an
einem Beispiel in 7 Abschn. 5.4.2 gezeigt. Den Tempe-
raturgradienten betreffend, behilft man sich meistens
Gl. 5.81 mit einer mittleren Temperatur des jeweiligen Stoffes.
Im Folgenden wird noch auf zwei für Biopro-
zesse typische Besonderheiten eingegangen, die
Beeinflussung des Wärmeübergangs durch Bega-
sung und durch das viskoelastische Fließverhalten
der Fermentationsbrühen.
5.4.1 Einfluss der Begasung auf den
Wärmeübergang
Häufig ist die Stoffübertragung von einem Gas in eine
Flüssigkeit, insbesondere die Sauerstoffübertragung
in die Fermentationsbrühen, ein wichtiger Bestand-
teil eines Bioprozesses. In diesem Kapitel ist es deshalb
Kapitel 5 · Transportvorgänge in B
­ iosuspensionen
interessant zu wissen, wie sich die Begasung auf den
Wärmeübergang z. B. im Rührkessel auswirkt.
In der Literatur sind dazu etwas voneinander
abweichende Ergebnisse angegeben worden. Eine
Gruppe von Autoren fand eine Erhöhung des Wär-
meübergangskoeffizienten bis zu einer bestimmten
Rührerdrehzahl, ab welcher kein Einfluss des Gases
mehr feststellbar ist. Die Wirkung des Gases, so wird
argumentiert, besteht in einer zusätzlichen Zirku-
lationsströmung, die mit zunehmender primärer
Turbulenz immer weniger wirksam wird. Andere
Autoren fanden unterhalb einer kritischen Rührer-
drehzahl ebenfalls eine Erhöhung der Wärmeüber-
tragung mit zunehmender Begasung. Oberhalb der
kritischen Drehzahl, wenn bei fester Rührerdrehzahl
die Begasung verändert wurde, ergab sich bei abneh-
mendem Gasvolumenstrom eine Abnahme der Wär-
meübertragung. Für Gasvolumenströme größer als
ein kritischer Wert zeigte sich kein Einfluss. Ursache
dafür könnte die Reduktion der Zirkulationsge-
schwindigkeit sein, die sich aufgrund des reduzierten
Leistungseintrags bei Begasung einstellt (. Abb. 5.8).
Um hier Klarheit zu erlangen, sind weitere
grundsätzliche Untersuchungen notwendig. Soweit
bisher bekannt, ist der Einfluss der Begasung auf die
Wärmeübertragung mit 20 bis 30 % bei newtonschen
Flüssigkeiten aber gering und hat vermutlich auch
deshalb nur wenig Beachtung gefunden. Bei visko-
elastischen Flüssigkeiten ist bisher nichts bekannt
geworden. Hier könnte der Einfluss anders sein, und
er verdient durchaus Beachtung.
5.4.2 Viskoelastizität und
Wärmeübergang
Es wurde schon mehrfach darauf hingewiesen, dass
viele Biosuspensionen sich rheologisch nichtnew-
tonsch, vor allem viskoelastisch verhalten. Das macht
sich natürlich auch beim Wärmetransport bemerk-
bar. Die Vorgänge, die hierbei wirksam werden, sind
wie beim Impuls- und beim Stofftransport wieder
fluiddynamischer Natur. Im Laminaren sind es im
Allgemeinen die Sekundärströmungen, die zusätz-
lich zur Hauptströmung durch die bei viskoelasti-
schen Fluiden auftretenden Normalspannungsdif-
ferenzen erzeugt werden [5]. Im Turbulenten ist es
pauschal gesprochen der Einfluss der Elastizität auf
die turbulenten Austauschmechanismen.
153 5
Für den Wärmeübergang ist die Grenzschichtdi-
cke von besonderer Bedeutung. Sie ist bei viskoelas-
tischen Fluiden erheblich dicker als bei nichtnew-
tonschen, aber inelastischen, und entsprechend ist
der Wärmeübergang verschlechtert. Beispielsweise
ist die Stantonzahl in einer turbulenten Rohrströ-
mung für eine 1 %ige wässrige PAA-Lösung – je nach
Rohrdurchmesser – bis zu einem Faktor 3 kleiner
als für eine newtonsche Flüssigkeit gleicher effekti-
ver Prandtlzahl. Ähnliches wurde im Rührreaktor
für sogenannte Bingham-Flüssigkeiten – das sind
Flüssigkeiten mit einer Fließgrenze – beobachtet.
Als Ursachen dieses Verhaltens werden der Einfluss
der Elastizität auf die Charakteristika der Grenz-
schichten zwischen turbulentem Kern und der Wand
und die Qualität der Turbulenzballen genannt. Die
beteiligten physikalischen Mechanismen sind jedoch
noch unklar.
Im Fall der voll entwickelten laminaren Rohr-
strömung verhalten sich viskoelastische Flüssigkei-
ten – die Wärmeübertragung betreffend – so, wie rein
viskose oder auch newtonsche Flüssigkeiten; in dieser
Geometrie können nämlich keine von den Normal-
spannungsdifferenzen induzierten Sekundärströme
auftreten. Anders ist es in Bioreaktoren, bei denen
wegen ihrer im Allgemeinen komplizierten Geomet-
rie das Auftreten von Sekundärströmen eher die Regel
als die Ausnahme ist. Im Gegensatz zur turbulenten
Strömung, wo eine Erniedrigung des Wärmeüber-
gangskoeffizienten auftritt, ergibt sich im Lamina-
ren mit Sekundärströmungen gemeinhin eine Erhö-
hung. Da für Bioreaktoren, soweit es den Autoren
bekannt ist, keine systematischen Untersuchungen
mit viskoelastischen Fluiden im Zusammenhang mit
der Übertragung von Wärme durchgeführt wurden,
sei zum Zweck der Demonstration die Strömung in
Röhren mit rechteckigem Querschnitt angeführt.
Diese Geometrie, mit einem Seitenverhältnis von
2:1, wurde von Hartnett und Xie [12] unter Verwen-
dung wässriger Carbopol-Lösungen (Carboxypoly-
ethylen) untersucht. Wenn die obere und die untere
Fläche beheizt wurden und die schmaleren Seitenflä-
chen isoliert waren, ergab sich ein Zusammenhang
zwischen der Nusselt- und der Reynoldszahl
Nu = C ⋅ Re0, 2  Gl. 5.85
Die Konstante C zeigte sich von der Konzentra-
tion der Lösung abhängig und war bei 1000 ppm
 154 H. Chmiel und E. Walitza

Gewichtsanteilen 6,0. Bei einer Reynoldszahl von viskoelastische Flüssigkeiten an, und zwar verwen-
629 (die weiteren Parameter dazu sind: Pr = 126, dete er für die in f vorkommende Reynoldszahl die
L = 640 cm und dh = 1,2 cm) erhält man damit eine in 7 Kap. 4 für die Rohrströmung definierte reprä-
Nusseltzahl von 21,8. Re wird mit dem hydraulischen sentative Viskosität, für Pr eine für die Grenzschicht
Durchmesser dh und der repräsentativen Viskosität effektive Viskosität ηe
gebildet. Verwendet man statt Gl. 5.85 und 5.82, den ηe ⋅ c p
für rein viskose Flüssigkeiten bekannten Zusam- Pr =  Gl. 5.87
λ
menhang, so findet man eine Nusseltzahl von 8,7,
wodurch die starke Zunahme der Wärmeübertra- und für den dimensionslosen Geschwindigkeits-
gung durch die Sekundärströmung verdeutlicht wird. verlauf U+ im Bereich der Übergangsschicht den
5 Beim turbulenten Wärmeübergang viskoelasti- üblicherweise für viskoelastische Flüssigkeiten ver-
scher Fluide kann man sich ebenfalls bisher nur auf wendeten und experimentell verifizierten logarith-
die Ergebnisse der Rohrströmung stützen. Untersu- mischen Verlauf
chungen an Rührkesseln oder Bioreaktoren sind nur
in sehr geringer Zahl erschienen. U + = a ⋅ ln Y + + b  Gl. 5.88
Eine viel beachtete Arbeit zum Wärmeüber-
gang in turbulenter Rohrströmung mit newton- a und b in Gl. 5.88 sind Konstanten, Y+ ist der dimen-
schen Fluiden stammt von Reichardt [19]. Sie muss sionslose Abstand von der Wand
als Grundlage nahezu aller neueren Untersuchun-
y ⋅ τ w /ρ
gen auf diesem Gebiet gewertet werden. Reichardt Y += . Gl. 5.89
v
fand den folgenden Zusammenhang zwischen dem
Wärmeübergang, welcher durch die Stantonzahl St Die effektive Viskosität ηe ist aus der Fließkurve für
beschrieben wird, und dem durch den Reibungsbei- das jeweilige Fluid mithilfe der Schubspannung τe,
wert f beschriebenen Druckverlust die zwischen dem Übergangsbereich in den voll tur-
bulenten Kern und der laminaren Unterschicht auf-
α f /2 tritt, zu bilden. τe wiederum wurde empirisch als das
St = =
v ⋅ ρ ⋅ cp 1, 2 + U z+ ⋅ ( Pr −1) ⋅ Pr −1/ 3⋅ f / 2 1,08-fache der Wandschubspannung τw ermittelt. Im
Reibungsbeiwert f steckt implizit der Einfluss der
 Gl. 5.86
Elastizität. Bei viskoelastischen Fluiden kann f durch
den folgenden Zusammenhang beschrieben werden
Darin ist U+z eine für das turbulente Geschwindig-
1  E 
keitsprofil charakteristische Größe, nämlich die ( )
= 4 + 1  ⋅ log Re ⋅ f − 0, 394

dimensionslose Geschwindigkeit (U = u / τ w /ρ )
+ f  2
an der Grenze des turbulenten Kerns und v die mitt- E 2d ⋅ E2
lere Strömungsgeschwindigkeit. Die Voraussetzun- − 1 ⋅ log
2 v 
gen, die für die Herleitung der Gl. 5.86 gemacht werden
 Gl. 5.90
mussten, sind folgende:
55 Wärme- und Impulsaustausch finden nur
senkrecht zur Strömungsrichtung statt; E1 und E2 sind dabei von der Elastizität der Flüssig-
55 thermisch und hydrodynamisch vollausge- keit bestimmte Parameter der Druckverlustcharak-
bildete Strömung; teristik, d ist der Rohrdurchmesser. Auf diese Weise
55 die turbulenten Austauschgrößen für Impuls kann man sich offenbar auf die Bestimmung der
und Wärme, sogenannte turbulente, kinema- scheinbaren Viskosität beschränken, denn das vis-
tische Viskosität und turbulente Wärmeleitzahl koelastische Verhalten wird über den Druckverlust
(engl. eddy diffusivities) sind gleich. in die Gl. 5.86 eingebracht.
Bei der soeben beschriebenen und mehreren
Gl. 5.86 wurde von verschiedenen Autoren für visko- anderen Erweiterungen von Gl. 5.86 wurde angenom-
elastische Fluide erweitert. Unter Beibehaltung von men, dass die turbulente, kinematische Viskosität εm
Gl. 5.86 passte Chmiel [7] die Größen f, U+z und Pr an und die turbulente Wärmeleitzahl εH einander gleich
Kapitel 5 · Transportvorgänge in B
­ iosuspensionen
155 5
sind. Die Gültigkeit dieser Annahme ist auch Voraus-
setzung für die Gültigkeit einer Analogie zwischen
der Impuls- und der Wärmeübertragung. εm und
εH – das sei hier nur sehr kurz angemerkt, denn für
Weitergehendes muss auf die Lehrbücher der Fluid-
dynamik verwiesen werden – sind Koeffizienten zu
Beiträgen, die in den Transportgleichungen zusätz-
lich auftauchen (turbulente Spannungen und tur-
bulente Wärmeströme), wenn man mit den zeitlich
schwankenden Größen der turbulenten Strömung in
die sonst für laminare Strömungen geltenden Glei-
chungen eingeht und dann eine zeitliche Mittelung . Abb. 5.14  Colburnzahl j für die Wärmeübertragung in
vornimmt. Abhängigkeit der Reynoldszahl für wässrige Polyethylenoxid-
Wann εm = εH anzunehmen nicht mehr gerecht- Lösungen, gemessen in Rohren mit inneren Durchmessern
von 1,11 und 1,88 cm [8]
fertigt ist, wurde von Kwack und Hartnett [11]
gezeigt. Grundlage ihrer Untersuchungen waren
Messungen des Reibungsbeiwertes, des Geschwin-
digkeitsprofils und des Wärmeübergangskoeffizien- maximalen Wärmeübertragung, die unter Verwen-
ten in der turbulenten Rohrströmung viskoelasti- dung der Prandtlzahl von Wasser bei 20 °C in . Abb.
scher Flüssigkeiten. Das Verhältnis εm/εH in der Nähe 5.14 eingetragen ist.
der Wand zeigte sich stark abhängig von der Weis- Eine Weiterentwicklung Gl. 5.91 von Reichardts
senbergzahl Wn. Bei kleinen Wn ist εm/εH ungefähr Gleichung, ohne die einschränkende Voraussetzung
1. Bei großen Wn – größer als eine kritische Weissen- gleicher turbulenter Austauschgrößen, wurde von
bergzahl Wnkr – ist εm/εH wieder konstant und unge- Ghajar und Yoon [8] gegeben.
fähr 10. Dazwischen steigt es monoton an. Weiter-
hin zeigte sich eine schwache Abhängigkeit von der
Reynoldszahl. In dem Ergebnis der Untersuchun-
0,6
f /2 (1− FR)
St =
gen von Kwack und Hartnett schlägt sich die Erfah- 1, 2 + ( Pr −1) ⋅ f /2 ⋅ (9,2 Pr−0,258 + 1,2Wn 0,565 Pr−0,236)
rung nieder, dass sich mit zunehmender Elastizität  Gl. 5.91
einer Flüssigkeit der Wärmeübergang stärker ver-
schlechtert als es der Abnahme des Druckverlustes Hier ist FR = (fp − fs)/fs das Verhältnis des Unter-
entspricht, wenn man von einem analogen Verhalten schieds (fp − fs), z. B. zwischen den Widerstands-
ausgeht. Weiterhin dokumentiert sich eine maximale beiwerten einer Polymerlösung und ihrem reinen
Weissenbergzahl oberhalb der es zu keiner weiteren Lösungsmittel, zum Widerstandsbeiwert des
Erniedrigung der Transportkoeffizienten kommt, reinen Lösungsmittels fs. Die Weissenbergzahl Wn
was als die Asymptoten der maximalen Absenkung ist aus der charakteristischen Materialzeit t0 und
des Druckverlustes bzw. der Wärmeübertragung einer Systemzeit gebildet, letztere, als d/v, wiede-
bekannt ist. Bei Polymerlösungen entspricht dies rum aus dem Rohrdurchmesser d und der mittle-
einer maximalen Konzentration, ab der keine weite- ren Geschwindigkeit v . t0 wurde ermittelt durch
ren Absenkungseffekte mehr feststellbar sind. Anpassung der Fließkurve an das Powell-Eyring-
In . Abb. 5.14 sind Messungen der Colburn- Modell, welches durch den Zusammenhang
zahl j angegeben, die das eben Gesagte belegen. Es
wurde bei zwei verschiedenen Rohrdurchmessern η = η∞ + η0 − η∞ ⋅ sin h−1(t0 ⋅ γ ) / (t0 ⋅ γ )
(1,11 und 1,88 cm) gemessen, die verwendeten Flüs-
sigkeiten sind wässrige Polyethylenoxid-Lösungen.  Gl. 5.92
Die Reynoldszahl wurde bei diesen Untersuchungen
mit der Viskosität an der Wand gebildet. Zu kleinen gegeben ist. Da hier ausschließlich die stationäre
Weissenbergzahlen hin bestimmt ein der Gl. 5.81 Fließkurve eingeht, kann die so ermittelte charak-
sehr ähnlicher Zusammenhang die Asymptote der teristische Materialzeit nur als grobe Näherung
 156 H. Chmiel und E. Walitza

betrachtet werden. Sowohl die Reynoldszahl (impli-
zit in f auftretend) als auch die Prandtlzahl wurden
mit der Viskosität an der Rohrwand gebildet. Man
sieht, dass sehr unterschiedliche repräsentative Stoff-
werte Verwendung finden. Für Fr = 0 und Wn = 0
sollte Gl. 5.91 in die Gl. 5.86 für den newtonschen Fall
übergehen, was nur näherungsweise der Fall ist.
Die in . Abb. 5.14 gezeigten experimentellen Über-
gangskoeffizienten werden nach Angabe der Autoren
jedoch gut durch die Gl. 5.91 beschrieben.
[16] Pawlowski J (2004) Prozessbeziehungen bei nichtnew-
tonschen Stoffen – Kritik des Metzner-Otto-Konzepts.
Chem-Ing-Tech 76:910–914
[17] Pawlowski J (2013) Dimensional Analysis of non-Newton-
ian Fluids. Chem Biochem Eng 27:119–123
[18] Ranade VR, Ulbrecht, J. J. (1978) Influence of polymer
additives on the gasliquid mass transfer in stirred tanks.
AIChE J 24:796
[19] Reichardt H (1951) Die Grundlagen des turbulenten Wär-
meüberganges. Arch Ges Wärmetechn 6/7:127
[20] Schumpe A, Quicker G (1982) Gas solubilities in microbial
culture media. Adv Biochem Eng 24 :1–38

5 Eine sehr gute Übersicht über dimensionslose
Kennzahlen findet man in Zlokarnik [23] und [24].
Literatur
[21] VDI-Wärme-Atlas (2002) VDI-Verlag, Düsseldorf
[22] Zlokarnik M (1999) Rührtechnik. Springer-Verlag, Berlin
[23] Zlokarnik M (2001) Scale-up, Modellübertragung in der
Verfahrenstechnik. Wiley-VCH, Weinheim
[24] Zlokarnik M (2006) Scale-up in Chemical Engineering.
Wiley-VCH, Weinheim

  [1] Bailey JE, Ollis DF (1991) Biochemical engineering fun-

damentals. McGraw-Hill, New York
  [2] Baird MHI, Hemielec AE (1962) Forced convection transfer
around sheres at intermediate Reynolds numbers. Can J
Chem Eng 40:119
  [3] Böhme G, Stenger M (1988) Consistent Scale-up Procedu-
re for the Power Consumption in Agitated Non-Newton-
ian Fluids. Chem Eng Technol 11:199–205
  [4] Bird RB, Stewart WE, Lightfoot EN (1976) Transport pheno-
mena. John Wiley & Sons, New York
  [5] Bird RB, Armstrong RC, Hassager O (1977) Dynamics of
polymeric liquids. John Wiley & Sons, New York
  [6] Calderbank PH, Moo-Young M (1961) The continuous
phase heat and mass transfer properties of dispersions.
Chem Eng Sci 16:39
  [7] Chmiel H (1971) Wärmeübertragung in der turbulenten
Rohrströmung viskoelastischer Flüssigkeiten. Disserta-
tion, Aachen
  [8] Ghajar AJ, Yoon HK (1989) A heat transfer correlation
for viscoelastic turbulent pipe flows. Chem Eng Comm
78:167–177
  [9] Grigul U (1963) Die Gesetze der Wärmeübertragung.
Springer Verlag, Berlin
[10] Höcker H, Langer G (1977) Power behaviour of gased stir-
rers in Newtonian and non-Newtonian fluids. Rheol Acta
16:400–412
[11] Kwack EY, Hartnett JP (1984) Estimated eddy diffusivities
of momentum and heat of viscoelastic fluids. Int J Heat
Mass Transfer 27:1525–1532
[12] Hartnett JP, Xie C (1989) Influence of polymer concentrati-
on on laminar heat transfer to aqueous Carbopol polymer
solutions in a 2:1 rectangular duct. AIChE Symp Series,
Heat Transfer Philadelphia 269: 454–459
[13] Metzner AB, Otto RE (1957) Agitation of non-Newtonian
fluids. AIChE J 3:3
[14] Moser A (1981) Bioprozeßtechnik. Springer, Heidelberg
[15] Pawlowski J (1971) Die Ähnlichkeitstheorie in der physi-
kalisch-technischen Forschung (Grundlagen und Anwen-
dung). Springer, Heidelberg
 157 6

Bioreaktoren
Horst Chmiel und Dirk Weuster-Botz

6.1 Bioreaktoren mit Leistungseintrag über mechanisch

­bewegte Einbauten (Rührkesselreaktoren) – 160
6.1.1 Bauelemente des Rührkesselreaktors – 161
6.1.2 Rührorgane und Leistungscharakteristik – 163
6.1.3 Homogenisieren und Wärmeübergang – 166
6.1.4 Stofftransport gasförmig/flüssig – 170
6.1.5 Maßstabsübertragung (scale-up und scale-down) – 171

6.2 Bioreaktoren mit Leistungseintrag über Gasexpansion

(Blasensäulenreaktoren) – 175
6.2.1 Bauformen, Strömungsführung, Betriebszustände – 175
6.2.2 Leistungseintrag und Gasanteil – 177
6.2.3 Stofftransport Gas-Flüssig – 178
6.2.4 Homogenisieren – 179
6.2.5 Maßstabsvergrößerung – 180

6.3 Bioreaktoren mit Leistungseintrag über Kreislauf mit

Pumpe – 181
6.3.1 Festbett-/Fließbettreaktoren – 182
6.3.2 Membranbioreaktoren – 185
6.3.3 Fotobioreaktoren – 188

6.4 Bewegte Bioreaktoren – 196

6.4.1 Schüttelkolben und Mikrotiterplatten – 196
6.4.2 Geschüttelte Bioreaktorsysteme im großen Maßstab – 207

6.5 Parallelbioreaktorsysteme für die

Bioprozessentwicklung – 209
6.5.1 Überwachung der Atmungsaktivität bei Kultivierungen in Schüttel-
kolben (RAMOS) – 209

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2018

H. Chmiel, R. Takors, D. Weuster-Botz (Hrsg.), Bioprozesstechnik,
https://doi.org/10.1007/978-3-662-54042-8_6
6.5.2 Online Überwachung in orbital geschüttelten Mikrotiterplatten
(BioLector) – 211
6.5.3 Miniaturisierte Rührkesselreaktoren (Bioreaktorblock) – 213

6.6 Spezielle Bioreaktoren – 217

6.6.1 Einweg-Bioreaktoren für Säugertierzellen – 217
6.6.2 Bioreaktoren für das Tissue Engineering – 218

Literatur – 223
Kapitel 6 · Bioreaktoren
Unter einem Bioreaktor wird ein Apparat verstan-
den, in dem unter Mitwirkung von Biokatalysa-
toren Stoffumwandlungen mit Enzymen, Mikro-
organismen oder Zellen stattfinden. Bioreaktoren
können ein sehr geringes Volumen aufweisen wie
beispielsweise in mikrofluidischen Picoliterbiore-
aktoren zur Einzelzellkultivierung [47], aber auch
sehr groß werden wie beispielsweise bei der biolo-
gischen Abwasserbehandlung mit Bioreaktorvolu-
mina von mehreren 10.000 m3. Auch die Vielfalt der
verwendeten Bioreaktorbauformen in unterschiedli-
chen Maßstäben und Ausführungen ist enorm: Mik-
rotiterplatten, Schüttelkolben, Rührkesselreaktoren,
Blasensäulenreaktoren, Festbett- und Fließbettreak-
toren, Tropfkörperreaktoren, Membranreaktoren,
Fotobioreaktoren und viele mehr.
Alle Bioreaktoren haben trotz ihrer sehr unter-
schiedlichen Bauformen bis zu fünf grundlegende
Aufgaben zu erfüllen:
55 Homogenisieren
55 Suspendieren
55 Dispergieren
55 Energie- und Stoffaustausch mit der Umgebung
55 Sterilbarriere
Eine gute Durchmischung (Homogenisierung) ist in
vielen Fällen erforderlich, um die für die biologische
Reaktion optimalen Temperatur-, pH- und Substrat-
konzentrationsbereiche an jedem Ort im Bioreaktor
sicherstellen zu können. Nur so kann das Reaktor-
volumen optimal genutzt werden.
Zellen und Mikroorganismen sind Feststoffe und
müssen, wenn sie in Suspensionskultur im wässri-
gen Reaktionsmedium als Biokatalysatoren genutzt
werden, möglichst gut suspendiert werden, um das
zur Verfügung stehende Reaktorvolumen optimal
auszunutzen. Aber auch viele Substrate werden nicht
in gelöster Form, sondern als disperse Feststoffe zur
biologischen Umsetzung in Bioreaktoren einge-
bracht wie beispielsweise gemahlenes Stroh, Stär-
kepartikel oder schlecht wasserlösliche Edukte für
Biotransformationen. Auch diese Substrate müssen
zur effizienten biologischen Umsetzung im gesam-
ten Reaktionsvolumen verteilt (suspendiert) werden.
Weiterhin werden Enzyme oftmals in Trägerparti-
keln mit wenigen 100 µm Durchmesser immobili-
siert. Auch hier ist gegebenenfalls das Suspendieren
159 6
dieser Träger im Bioreaktor essentiell, damit Subst-
rate ungehindert zum Biokatalysator gelangen und
die Reaktionsprodukte ungehindert abtransportiert
werden können.
Ein möglichst feines Dispergieren einer Gas-
phase im wässrigen Reaktionsmedium ist bei vielen
Bioprozessen von großer Bedeutung, wenn die Lös-
lichkeit der für die biologische Umsetzung erfor-
derlichen Gaskomponenten in der wässrigen Phase
gering ist. Dies ist beispielsweise bei allen Biopro-
zessen der Fall, bei denen Mikroorganismen oder
Zellen auf Sauerstoffatmung angewiesen sind und
somit der Sauerstoff aus der Gasphase über die Pha-
sengrenzfläche gasförmig-flüssig ständig nachge-
liefert werden muss. Hier spielt die Erzielung einer
großen Stoffaustauschfläche gasförmig-flüssig eine
große Rolle, sodass die Gasphase möglichst fein dis-
pergiert werden muss. Analoges gilt beim Einsatz
von flüssigen, nicht mit Wasser mischbaren organi-
schen Stoffen wie beispielsweise Pflanzenölen, die
als Kohlenstoffquellen in vielen mikrobiellen Bio-
prozessen verwendet werden. Bei Biotransformatio-
nen kann es umgekehrt erforderlich sein, den in der
wässrigen Phase gelösten Biokatalysator als fein dis-
pergierte Wassertropfen in einer organischen Phase
zu verteilen, die zur in-situ Substratbereitstellung
und Produktextraktion in einem Bioreaktor bereit
gestellt wird.
Der kontrollierte Energie- und Stoffaustausch
über die Bioreaktorhülle mit der Umgebung stellt
eine weitere grundlegende Aufgabe von Bioreakto-
ren dar. Die bei der biologischen Umsetzung frei-
werdende Reaktionswärme, aber auch die in einen
Bioreaktor eingetragene mechanische Leistung zum
Homogenisieren, Suspendieren und Dispergieren,
die letztendlich als Wärme dissipiert wird, muss über
Wärmetauscher abgeführt werden, um eine für die
biologische Umsetzung geeignete Temperatur im
Bioreaktor sicherstellen zu können.
Schlussendlich muss ein Bioreaktor in der Regel
so gestaltet und konstruiert werden, dass alle mit
dem Reaktionsmedium in Kontakt kommenden
Oberflächen und der gesamte Reaktorinhalt sterili-
sierbar sind. Darüber hinaus müssen alle Stoffströme,
die in den Bioreaktor hineingehen oder diesen ver-
lassen, wie beispielsweise Substrat- und Produktlö-
sungen oder die Gasphase sterilisierbar sein, sodass
 160 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
die Bioreaktorhülle zusammen mit den zur Sterilisa-
tion von Stoffströmen notwendigen Sterilfiltern eine
Sterilbarriere darstellt. Ziel ist der Ausschluss von
Kontaminationen durch Fremdorganismen aus der
Umgebung während des Betriebs und häufig auch die
Verhinderung der Freisetzung der (wertvollen) Pro-
duktionsorganismen in die Umgebung.
Zum Homogenisieren, Suspendieren und Dis-
pergieren müssen fluide Phasen im Bioreaktor
transportiert und intensiv miteinander in Kontakt
gebracht werden. Hierzu ist Energie erforderlich.
Daher ist es konsequent, die vielfältigen Baufor-
men von Bioreaktoren nach Art des Energieeintrags
6 in verschiedene Gruppen zu klassifizieren. Hierbei
können folgende klar voneinander abgegrenzte Bio-
reaktorgruppen unterschieden werden. Es gibt Bio-
reaktoren, bei denen der Energieeintrag
55 durch mechanisch bewegte Einbauten
55 durch Expansion einer Gasphase oder
55 durch einen Kreislauf mit Pumpe
erfolgt.
Bei Rührkesselreaktoren wird die Energie zum
Homogenisieren, Suspendieren und Dispergieren
durch mechanisch bewegte Einbauten (Rührorgane
auf einer rotierenden Achse) eingebracht. Bei Blasen-
säulenreaktoren geschieht der Energieeintrag durch
Expansion einer Gasphase, die über Gasverteiler
am Boden des Bioreaktors fein dispergiert wird. Bei
Festbett-, Fließbett- und Membranreaktoren sowie
vielen anderen Bioreaktoren erfolgt der Energieein-
trag durch eine oder mehrere Pumpen, die das Reak-
tionsmedium im Kreislauf transportieren.
Geschüttelte Bioreaktoren stellen einen Sonder-
fall der ersten Gruppe dar, da hierbei der Energie-
eintrag durch mechanische Bewegung des gesamten
Bioreaktors erfolgt.
Im Folgenden werden in diesem Kapitel die drei
genannten Bioreaktorklassen sowie geschüttelte Bio-
reaktoren jeweils getrennt voneinander behandelt,
die wesentlichen Eigenschaften im Hinblick auf die
oben genannten Grundaufgaben beschrieben und
die Vorgehensweisen zur Maßstabsvergrößerung
von Bioprozessen mit den jeweiligen Bioreaktoren
erläutert. Sterilisationsverfahren und die Konstruk-
tionsprinzipien von Bioreaktoren und Apparaten zur
Sicherstellung einer Sterilbarriere werden im darauf
folgenden 7 Kap. 7 beschrieben.
6.1 Bioreaktoren mit
Leistungseintrag über
mechanisch bewegte Einbauten
(Rührkesselreaktoren)
Werner Himmelsbach
Der Rührreaktor ist der Standardapparat für die
industrielle Biotechnologie zur Herstellung groß-
volumiger Produkte wie beispielsweise Enzyme,
Aminosäuren, Polysaccharide, Antibiotika oder
Pharmawirkstoffe. Der gerührte Bioreaktor wird
überwiegend im Zulaufverfahren (engl. fed-batch)
betrieben. Der Prozess wird dabei mit einem Teil-
volumen begonnen und zunächst die Biomasse ver-
mehrt. Dann wird weiter Nährlösung zudosiert,
bis das Endvolumen und der geforderte Stoffum-
satz erreicht sind. Reiner Satzbetrieb (engl. batch),
bei dem das gesamte Nährmedium vorgelegt wird,
ist eher die Ausnahme, ebenso der kontinuierliche
Betrieb.
Eine wesentliche Aufgabe des Rührkesselreaktors
ist die Versorgung von Mikroorganismen mit Sauer-
stoff, der aus der zugeführten und vom Rührorgan
dispergierten Gasphase (in der Regel Luft) in die
wässrige Lösung zu bringen ist. Die Gelöstsauerstoff-
konzentration darf an keiner Stelle im Rührreaktor
einen kritischen Wert unterschreiten, da ansonsten
die Mikroorganismen ihre Produktivität einbüßen
und in manchen Fällen auch nicht wiedererlangen.
Des Weiteren sind überall im Rührreaktor optimale
Reaktionsbedingungen für die Organismen sicher-
zustellen. Hierzu dient eine möglichst große Homo-
genität nicht nur der Gelöstsauerstoffkonzentration,
sondern auch der Substratkonzentrationen, des pH
und der Temperatur. Letztere erfordert die Abfuhr
der Wärme aus dem Stoffwechsel der Mikroorganis-
men (etwa 500 kJ/mol umgesetzten Sauerstoff O2)
und der eingetragenen Rührleistung, die vollständig
als Wärme dissipiert wird. Im industriellen Maßstab
führen Wärmetauscher innerhalb des Rührreaktors
die Wärme ab.
Diese Anforderungen können nur dann optimal
erfüllt werden, wenn das Rührwerk und der Behäl-
ter mit allen funktionalen Einbauten in ihrem
Zusammenwirken betrachtet werden. Darüber
hinaus sind die Anforderungen des Sterilbetriebs zu
Kapitel 6 · Bioreaktoren
berücksichtigen, ebenso die betriebssichere Ausfüh-
rung aller Bauteile. Die genannten Aspekte werden
im Folgenden näher erläutert.
6.1.1 Bauelemente des
Rührkesselreaktors
Werner Himmelsbach
Gerührte Bioreaktoren überdecken einen Größen-
bereich von bis zu 50 m3 für die Herstellung von
Impfgut (engl. seed) und bis rund 1000 m3 für die
Produktion. . Abb. 6.1 zeigt die wesentlichen Kom-
ponenten eines solchen Rührreaktors. Der meist
schlanke Behälter ist über Pratzen, Tragringe oder
eine Standzarge fixiert. Das von oben eingebaute
Rührwerk besteht aus dem Antriebsstrang mit Motor
und Getriebe und der Lagerlaterne, in der sich auch
die Wellenabdichtung befindet und mit der das
. Abb. 6.1  Prinzipskizze eines gerührten Bioreaktors mit
Bauelementen
161 6
Rührwerk auf dem Behälterflansch befestigt ist. Die
Rührwelle überträgt die Leistung zu den Rührorga-
nen. Unten ist die Welle meist in einem Gleitlager
geführt, das einen Teil der Radialkräfte der Rühr-
organe aufnimmt, was zu einer kostengünstigeren
Gesamtkonstruktion führt. Innerhalb des Behälters
befinden sich Stromstörer, häufig Wärmetauscher
(Rohrbündel oder Schlangen) und Vorrichtungen
zur Einspeisung der Gasphase, von Substraten und
zur pH-Regelung sowie Messsonden (Temperatur,
Gelöstsauerstoff, pH).
Bei der Auslegung eines gerührten Bioreaktors
werden die mechanischen Beanspruchungen häufig
unterschätzt: der Konstruktionsdruck der Behälter
liegt bei rund 3 bar. Eine statische Auslegung auf
diesen Lastfall erfordert auch unter Berücksichtigung
des Rührwerkgewichts nur sehr dünne Wandstär-
ken. Hinzu kommen aber dynamische Belastungen
in Form von Biege- und Drehmomenten, die über
die Rührwelle und die Lagerlaterne in den Behälter-
deckel übertragen werden. Auch die Einbauten sind
hohen dynamischen Belastungen durch die turbu-
lente Strömung im Behälter ausgesetzt, liegen doch
die spezifischen Rührleistungen in Produktionsre-
aktoren in der Größenordnung von 0,5–8 kW/m3.
Die Flächenbelastung p eines angeströmten Bauteils
ergibt sich aus der bekannten Beziehung
ρ
p = Cw ⋅ ⋅ u 2  Gl. 6.1
2
wobei der jeweilige Widerstandsbeiwert Cw der Lite-
ratur zu entnehmen ist [71]. Neben der dynamischen
Druckbelastung auf solche Einbauten ist zu berück-
sichtigen, dass die Drehfrequenz der Rührwelle und
die Blattpassierfrequenz als dominante Erregerfre-
quenzen alle genannten Bauteile in ihrer Eigenfre-
quenz zum Schwingen anregen können. Ein weiterer
Erreger ist die Wirbelablösung bei der Umströmung
von Bauteilen (Karman-Wirbel), deren Frequenz
u
f W = Sr ⋅  Gl. 6.2
b
ist, wobei der jeweilige Betrag der Strouhal-Zahl
Sr von der Geometrie des umströmten Körpers
abhängt. Insbesondere bei komplexeren Bauteilen
liefert die numerische Strömungssimulation (CFD)
zuverlässige Werte der örtlichen Geschwindigkeiten,
 162 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
aus denen dann unmittelbar auch die Druckvertei-
lung oder Flächenlast mit ihrer örtlichen Auflösung
abgeleitet werden kann.
Bei Übereinstimmung von Erreger- und Eigen-
frequenz sind Resonanzschwingungen die Folge.
Schäden treten meist schon nach kurzer Zeit auf.
Die Folgekosten betreffen nicht nur Reparaturen und
Umbauten. Produktverlust und Produktionsausfall-
kosten können diese bei weitem übertreffen. Auch
der gesamte Behälter mit seiner Tragkonstruktion
stellt ein schwingfähiges System dar, das in seiner
Eigenfrequenz angeregt werden kann. Um dem vor-
zubeugen, sollte zur Bestimmung der Eigenfrequenz
6 von Behälter und Rührwerk eine Schwingungsana-
lyse oder eine Finite-Elemente (FE)-Berechnung
durchgeführt werden.
Gegebenenfalls kann die Eigenfrequenz
durch konstruktive Maßnahmen beeinflusst und
so die Betriebssicherheit der Anlage gewährleis-
tet werden. Dabei ist zu berücksichtigen, dass das
umgebende Fluid die Eigenfrequenz eines Bauteils
gegenüber der üblichen Berechnung drastisch her-
untersetzt (Fluid-Struktur-Kopplung) [151, 152].
. Abb. 6.2 zeigt beispielhaft die Verformungen eines
. Abb. 6.2  Von der Konstruktion eines Rohrbündels
(links) zum numerischen Computermodel mit dem Resultat
der Finite-Elemente-Analyse (rechts). Die Farben im Beispiel
zeigen die örtlichen Verformungen
Rohrbündelwärmetauschers aus einer FE-Analyse.
So ermittelte Schwachpunkte wie unzulässige Span-
nungen, Verformungen oder Resonanz können dann
durch einfache konstruktive Maßnahmen vermie-
den werden.
Je nach Verwendungszweck der Endprodukte
des Fermentationsprozesses können sich hohe
Anforderungen an die steriltechnische Ausführung
des Rührwerks ergeben. Insbesondere die Rühr-
werksdichtung, Flanschkupplung, Rührorganbefes-
tigung und Oberflächengüte der produktberührten
Rührwerkskomponenten sind hier zu überprüfen.
Das Gleiche trifft auch für den Behälter und seine
Bauteile zu.
. Abb. 6.3 zeigt die Ausführung einer doppelt
wirkenden Gleitringdichtung mit Sterilinstallation.
Die Funktion der Sperrflüssigkeit übernimmt ste-
riles Kondensat. Damit der Schmierfilm im Dicht-
spalt der Gleitringe nicht durch partielles Verdamp-
fen abreißt, wird das Kondensat vor Eintritt in die
Dichtung abgekühlt. Die Gleitringdichtung ist mit
Kondensat gefüllt und über zwei Leitungen mit
einer Vorlage verbunden. Die Umwälzung des Kon-
densats gewährleistet eine in die Gleitringdichtung
integrierte Pumpe. Die Sterilisation erfolgt nach
dem Austritt aus der Dichtung durch zuströmen-
den Frischdampf, der die Umwälzung unterstützt.
Im Vorratsgefäß reichert sich durch den nachströ-
menden Dampf Kondensat an, bis der Druck dem
des Dampfnetzes entspricht. Überschüssiges Kon-
densat wird am Vorratsgefäß abgeleitet. Die Kühlung
der Sperrflüssigkeit im Vorlauf der Dichtung führt zu
einem Druckabfall und damit zu einer erneuten Ste-
rilisation durch den nachströmenden Dampf, der das
System wieder aufheizt. Die Häufigkeit dieses Sterili-
sierungsvorgangs kann über den Kühlwasserdurch-
satz geregelt werden. Im Stillstand wird die Gleitring-
dichtung mit Sattdampf beaufschlagt und sterilisiert.
Für sterile Bedingungen konzipierte lösbare
Flanschkupplungen und Rührorganbefestigun-
gen zeigt beispielhaft . Abb. 6.4. Hierbei werden
an der Flanschkupplung noch vorhandene Spalte
über spaltarme O-Ring-Abdichtungen und bei der
Rührorganbefestigung durch Schweißen auf ein
Minimum reduziert. Zu weiteren Fragen zum Ste-
rildesign von Bioreaktoren (Fermentern) sei auf
7 Kap. 7 verwiesen.
Kapitel 6 · Bioreaktoren
163 6

. Abb. 6.3  Installation der

Sterildichtung (doppelt wirkende
Gleitringdichtung EKATO ESD44S)

6.1.2 Rührorgane und

Leistungscharakteristik
)ODQVFKNXSSOXQJ

Werner Himmelsbach

In der Rührtechnik begegnet man einer großen

Vielfalt von Rührorganen für die unterschiedlichs-
ten Einsatzgebiete. Beispiele hierfür findet man
in .  Abb. 6.5. Grundsätzlich ist es sinnvoll, Rühr-
organe nach den folgenden Gesichtspunkten zu
kategorisieren:
55 primär erzeugte Strömungsrichtung – axial,
radial oder tangential,
55 wandgängige und nichtwandgängige
25LQJ$EGLFKWXQJ
Rührorgane,
5KURUJDQEHIHVWLJXQJ 55 Umfangsgeschwindigkeit und
3UIERKUXQJ 55 Zähigkeits- oder Strömungsbereich – laminar,
turbulent oder Übergangsbereich

Neben Standardausführungen kommen zunehmend

3UI
QXWH
EHL%HKlOWHUPRQWDJHYHUVFKZHL‰W
. Abb. 6.4  Sterilausführung einer lösbaren
Flanschkupplung und einer Rührorganbefestigung
auch Rührorgane zum Einsatz, die individuell für
spezifische Aufgaben entwickelt wurden, siehe bei-
spielsweise [36].
In der Praxis hat die Charakterisierung von
Rührorganen nach der primär erzeugten Strö-
mungsrichtung die größte Bedeutung. Wie der Ver-
gleich in . Abb. 6.6 zeigt, induziert beispielsweise
 164 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
. Abb. 6.5  Beispiele für Rührorgane
in unterschiedlichen Einsatzgebieten.
Konventionelle Rührorgane:
Propeller (1), Schrägblattrührer
(2), Scheibenrührer (3), Wendel (4),
Intermig (5); Hochleistungsrührer:
Paravisc (6), Combijet (7), Phasejet (8),
Isojet B (9)
der Scheibenrührer eine radiale Strömung, während
der Propellerrührer eine axiale Strömungsrichtung
erzeugt.
Bei konventionell ausgelegten Anlagen wurden
industrielle Rührbioreaktoren bisher meist mit
mehrstufigen Scheibenrührern ausgeführt, wobei
das Verhältnis von Rührer- (d2) zu Behälterdurch-
messer (d1) 0,3–0,5 beträgt. Bei mehrstufiger Anord-
nung von Scheibenrührern kommt es allerdings
zu einer Kompartmentbildung im Rührkesselre-
aktor. Hierbei bildet zwar jede Rührstufe eine gut
. Abb. 6.6  Flüssigkeitsströmung im Rührkesselreaktor für
axial fördernde Propellerrührer (links) und radial fördernde
Scheibenrührer (rechts), nach [182]
durchmischte Zone um das Rührorgan mit zwei
stabilen Ringwirbeln aus. Zwischen diesen einzel-
nen Kompartments findet allerdings nur ein relativ
geringer Stoffaustausch statt. Folglich nimmt die
Mischzeit für den gesamten Reaktor mit zunehmen-
dem Schlankheitsgrad des Behälters deutlich zu. Es
können sich dadurch Inhomogenitäten beispiels-
weise beim pH oder der Verteilung von Nährstof-
fen einstellen, was das Regelverhalten dieser Größen
negativ beeinflusst.
Die Leistungsaufnahme eines Rührers berech-
net sich zu
P = Ne ⋅ ρ ⋅ n3 ⋅ d 25  Gl. 6.3
Die Newton-Zahl Ne wird als Funktion der Re-Zahl
experimentell ermittelt. Im turbulenten Strömungs-
bereich gilt Ne = konstant, im laminaren Bereich ist
Ne ~ 1/Re, dazwischen liegt der Übergangsbereich
(. Abb. 6.7).
Bei Begasung ändert sich der Leistungsbei-
wert (Newton-Zahl). Dieser Zusammenhang lässt
sich ebenfalls dimensionslos als Funktion der
Kapitel 6 · Bioreaktoren
. Abb. 6.7  Leistungscharakteristik verschiedener
Rührorgane: 1 EKATO Paravisc, 2 Scheibenrührer Sechsblatt,
3 Schrägblattrührer Vierblatt (h2/d2 = 0,125), 4 Intermig
07 zweistufig, 5 Propellerrührer dreiflügelig, 6 Intermig 09
zweistufig
Froude-Zahl Fr und der Begasungskennzahl Q dar-
stellen (siehe . Abb. 6.8).
Beim Scheibenrührer fällt der Leistungseintrag
unter Begasung sehr stark ab. Der Motor muss dann
auf den Leistungseintrag im unbegasten Fall ausge-
legt werden, was zusätzliche mechanische Sicher-
heiten und damit Kosten nach sich zieht. Alter-
nativ lässt sich auch ein Frequenzumformer oder
polumschaltbarer Motor installieren. Bei fester
Drehzahl ändert sich mit wechselnden Begasungs-
raten während der Prozesszeit die Leistungsauf-
nahme. Eine optimale Auslegung hinsichtlich der
Sauerstoffeintragsleistung OTR wird damit schwie-
rig. Ein weiterer Nachteil des Scheibenrührers bei
dieser Rühraufgabe liegt darin begründet, dass es
mit steigenden Begasungsraten relativ rasch zur
. Abb. 6.8  Abfall des Leistungsbeiwerts für verschiedene
Rührorgane mit zunehmender Begasung
165 6
„Überflutung“ durch die Gasphase kommt, wodurch
diese nicht mehr vollständig dispergiert wird. Die
Gasphase steigt stattdessen in relativ großen Blasen
entlang der Welle auf. Dieser Zustand muss vermie-
den werden, weil der kLa beim Überfluten des Rühr-
organs drastisch absinkt.
Flutgrenzen lassen sich ebenfalls dimensionslos
als QF = (Fr, d1/d2, C) darstellen, wobei C die Eigen-
schaften des eingesetzten Rührers und allgemeine
Geometriefaktoren zusammenfasst [52].
Die Schwächen der traditionellen Scheibenrüh-
rer können mit einer Kombination aus einem radial
fördernden Primärdispergierer für die eingespeiste
Luft (beispielsweise Ekato Phasejet) und einem axial
fördernden Sekundärrührer (beispielsweise Ekato
Combijet) umgangen werden (. Abb. 6.9).
Beide Rührorgane gehören zur Familie der
Konkavrührer und zeichnen sich durch ein stabi-
les Betriebsverhalten hinsichtlich der Leistungsauf-
nahme aus (siehe . Abb. 6.8). In vielen Fällen kann
das Rührwerk mit fester Drehzahl für wechselnde
Begasungsfälle wie auch für den unbegasten Betrieb
ausgelegt werden, was sich günstig auf die Investi-
tionskosten auswirkt. Die Flutgrenze des Phase-
jet liegt – verglichen mit dem Scheibenrührer – bei
wesentlich höheren Begasungsraten. Dies bietet ein
Potenzial für Kapazitätserweiterungen. Der Com-
bijet erzeugt hauptsächlich axiale Strömungskom-
ponenten. Dadurch ergibt sich ein rascher kon-
vektiver Stofftransport zwischen den einzelnen
Rührerstufen. Die Mischzeiten lassen sich bei glei-
chem Leistungseintrag und Luftdurchsatz mehr als
halbieren. Die höhere Homogenität im Bioreaktor
zahlt sich nicht nur über ein stabileres Regelverhal-
ten aus. Gleichmäßigere Reaktionsbedingungen
. Abb. 6.9  Moderne Begasungsrührer: Phasejet mit
rotierendem Gasverteiler (unten) und drei Kombijets
 166 H. Chmiel und D. Weuster-Botz

für die Biokatalysatoren erhöhen auch deren Pro-

duktivität und führen zu einem verminderten
Nebenproduktspektrum.
Die mit dem Rührorganen eingebrachte mecha-
nische Energie bewirkt in Form von laminaren und
turbulenten Scherkräften einerseits die erwünschte
Zerteilung von Gasblasen, kann andererseits jedoch
auch zur unerwünschten Zerstörung von Zellver-
bänden führen, wenn die erzeugten Mikrowirbel
die Größenordnung des betrachteten Teilchens
erreichen. Im wässrigen Medium entstehen bei
den üblichen Leistungseinträgen Mikrowirbel,
die bei Hefen und Bakterienzellen im Allgemei-
6 nen keine mechanischen Schädigungen hervorru-
fen. Bei myzelbildenden Mikroorganismen oder
bei der Bildung von Pellets oder Zell-Clustern,
die die Größe der Einzelzellen um ein Vielfaches . Abb. 6.10  Isoenergetische Linien ε/ε für verschiedene
Rührertypen (für Re > 104; mit ε = P/Vρ) nach [43]
überschreiten, können dagegen Beschädigungen
der Zellverbände mit negativen Auswirkungen auf
die Produktivität auftreten. Abhilfe schaffen hier
scherarme Rührsysteme, mit denen die erforder- Rührsysteme hinsichtlich der Scherbeanspruchung.
liche Leistung möglichst gleichmäßig eingetra- Es lässt sich darüber hinaus der Mikromaßstab der
gen wird. Dies ist dann der Fall, wenn das von den Turbulenz abschätzen,
Rührorganen bestrichene Volumen möglichst groß
ist. Scherarm sind Rührer mit hohen Leistungsbei-  v3 0, 25
λ =    Gl. 6.4
werten (Blattzahl/-höhe) in mehrstufiger Ausfüh-  ε 
rung und mit großem Durchmesserverhältnis d2/d1
[55]. und für Modellüberlegungen zur Beanspruchung
Für eine Beurteilung der Beanspruchung des Bio- der Organismen verwenden (mit λ = Größe der
katalysators im Bioreaktor ist aber die Energiedis- Mikrowirbel und v = kinematische Viskosität). Eine
sipationsrate ε maßgebend [43, 89]. Durch Berech- Faustregel besagt hierzu, dass Teilchen mit einer
nung der mittleren Energiedissipationsrate ε = P/Vρ Größe x < (3 bis 5) λ durch turbulente Schubspan-
und Messung der lokalen isotropen Turbulenzfelder nungen nicht mehr beeinflusst und damit geschä-
lässt sich die lokale Energiedissipationsrate ε berech- digt werden.
nen. Das Verhältnis ε/ε gestattet die dimensionslose
Darstellung gleich großer Energiedissipationsraten,
sogenannte isoenergetische Linien. 6.1.3 Homogenisieren und
. Abb. 6.10 zeigt dies für den Scheibenrüh- Wärmeübergang
rer (links) und den Propellerrührer (rechts). Man
erkennt, dass an den Spitzen des Scheibenrührers Werner Himmelsbach
eine wesentlich höhere lokale Energiedissipation auf-
tritt, als beim Propellerrührer und dass dies durch- Bewegen sich Mikroorganismen immer wieder
aus zur Schädigung empfindlicher Mikroorganismen durch Zonen stark unterschiedlicher örtlicher Tem-
(insbesondere Mycel) führen kann. peraturen, pH und Konzentrationen von Substra-
Heute lässt sich die Verteilung der relevanten ten, so leiden das Wachstum und die Produktivität.
Turbulenzgrößen im Behälter, insbesondere die Zusätzlich wird die Bildung von Nebenproduk-
Energiedissipationsrate ε mittels CFD berechnen. ten gefördert. Besonders ausgeprägt ist diese Situ-
Dies erlaubt nicht nur einen Vergleich verschiedener ation im Bodenbereich des Rührbehälters und in
Kapitel 6 · Bioreaktoren
der Nähe der Flüssigkeitsoberfläche. Unten wird
die Gasphase (Luft) eingespeist, auf die Oberfläche
werden oftmals die (limitierenden) Substrate zuge-
geben. Auf Grund des hohen Partialdrucks ergibt
sich unten ein Sauerstoffüberschuss bei gleichzei-
tigem Substratmangel, umgekehrt tendiert an der
Oberfläche der Gelöstsauerstoff gegen Null bei
gleichzeitigem Nährstoffüberschuss. Das Gleiche
trifft für die pH-Regelung zu: die Messstelle befindet
sich meist im unteren Bereich des Rührbehälters,
Säure oder Lauge werden aber oftmals ebenfalls
auf die Flüssigkeitsoberfläche dosiert. Die daraus
resultierende Totzeit zwischen Korrekturmittelzu-
gabe und Messung wird durch eventuell vorhan-
denen Schaum auf der Flüssigkeitsoberfläche noch
vergrößert.
Das Ziel der Rührerauslegung ist neben der
Erzielung eines ausreichenden Stoff- und Wärme-
übergangs eine maximale Homogenität. Zwar ist eine
genaue Vorhersage von Konzentrationsprofilen bei
gleichzeitig auftretenden Quellen und Senken und
erzwungener Konvektion allenfalls mit komple-
xen numerischen Modellen möglich. Ein Vergleich
verschiedener Rührertypen und Anordnungen ist
aber über die Mischzeit verhältnismäßig einfach
zugänglich.
Mischzeit und Mischgüte
Die Mischzeit ist die Zeit, die zum Erreichen einer
definierten Mischgüte in einem Rührkessel erforder-
lich ist. Die Mischgüte ist durch die zeitliche Ände-
rung der Konzentration eines Tracers von c0 nach
c(t) gegeben zu
c0 − c (t )
M (t ) =  Gl. 6.5
c0 − c∞
Mischzeiten sind nur für gleiche Mischgüten ver-
gleichbar, wobei ein gängiger Mischgütewert M95 =
95 % ist. Abweichende Mischgüten erfordern unter-
schiedliche Mischzeiten θX gemäß
 x 
ln 1 −
 100 
θX = θ95 ⋅  Gl. 6.6
 95 
ln 1 −  mit unterschiedlichen Rührorganen im laminaren, Übergangs-
 100 
167 6
Zum Messen der Mischgüten in Rührkesselreakto-
ren wird eine Vielzahl von Messmethoden benutzt.
Sondenmethoden für Temperatur-, pH- oder Leit-
fähigkeitsmessungen haben den Vorteil einer hohen
Reproduzierbarkeit. Der ermittelte Wert gilt jedoch
streng genommen nur für den Ort der Messung. Vor
allem im Übergangs- und laminaren Strömungsbe-
reich treten schlecht durchmischte Zonen, Ringwir-
bel und Ähnliches auf, die von Sonden möglicher-
weise nicht erfasst werden [51]. Hier ist die visuelle
Beurteilung mit Entfärbemethoden nach wie vor
ein schnelles und robustes Verfahren, mit dem der
gesamte Kessel erfasst werden kann.
Die Mischzeitcharakteristik gemäß . Abb. 6.11
zeigt die Durchmischungskennzahl n · θ als Funk-
tion der Reynoldszahl Re. Im turbulenten Bereich
(Re > 104) ist n · θ konstant, so dass sich die Misch-
zeit umgekehrt proportional zur Drehzahl n ändert.
Dies bedeutet, dass zum Erreichen einer Mischgüte
eine bestimmte Anzahl von Rührerumdrehungen
erforderlich ist. Mit zunehmenden Viskositäten ver-
schiebt sich die Rührwerksströmung in den Über-
gangs- und laminaren Bereich (Re < 104), wobei eine
rein laminare Strömung (Re < 100) nur im Labormaß-
stab erreicht wird. Dies führt zu einer Verlängerung
der Mischzeit, was sich im ansteigenden Kurvenver-
lauf widerspiegelt.
Gleichzeitig verdeutlicht die Mischzeitcharakte-
ristik, dass eine Verbesserung der Homogenität durch
einen erhöhten Rührleistungseintrag im industriellen
Maßstab kaum wirtschaftlich ist. Um gemäß Gl. 6.6
. Abb. 6.11  Mischzeitcharakteristik in Rührkesselreaktoren
und turbulenten Bereich
 168 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
die Mischgüte von 95 % auf 99 % zu erhöhen, verlän-
gert sich die erforderliche Mischzeit um den Faktor
1,54. Um diese Verbesserung in der ursprünglichen
Zeit zu erzielen, müsste im turbulenten Strömungs-
bereich (n · θ = konstant) die Rührerdrehzahl um den
gleichen Faktor 1,54 erhöht werden, was gemäß Gl. 6.3
aber einer Steigerung der Wellenleistung auf das 3,6-
fache entspricht.
Im turbulenten Strömungsbereich lassen sich
die Mischzeiten für einstufige Rührorgane in
einem Behälter mit einem Verhältnis von Füllhöhe/
Durchmesser h1/d1 ≈ 1 und axial fördernde Rührer
berechnen:
6 inhalt nicht repräsentativ. Hierfür kann eine Behäl-
 d −2
n ⋅ θ = 5, 5 ⋅  2  ⋅ Ne−1/ 3  Gl. 6.7
 d1 
Radialförderer weisen einen geringfügig abweichen-
den Faktor vor beziehungsweise Exponenten über
dem Durchmesserverhältnis auf [62, 112]. Damit
ergeben sich unabhängig vom Rührertyp die Ein-
flussgrößen auf die Mischzeit zu
1/ 3
 P −1/ 3  d1 
θ ~   ⋅   ⋅ d12 / 3  Gl. 6.8
V   d 2 
In schlanken Behältern werden die Mischzeiten
nochmals drastisch länger, Gl. 6.7 ist mit einem Kor-
rekturterm für den Schlankheitsgrad zu versehen
 h x
n ⋅ θ ~  1   Gl. 6.9
 d 
1 Der Einfluss des Leistungseintrags und des Durch-
mit x = 1,5–2,5, wobei der Wert des Exponenten
neben dem Durchmesserverhältnis vor allem vom
Rührertyp und der Anzahl der Rührstufen abhängt.
Außerdem wird ersichtlich, dass Behälter mit hohem
Schlankheitsgrad h1/d1 hinsichtlich der Homoge-
nitätsanforderungen ungünstig sind. Über diesen
Zusammenhang treten auch deutliche Unterschiede
in der Eignung von Rührern zu Tage.
Homogenisieren newtonscher Medien
im Übergangsgebiet
Steigt die Viskosität des gerührten Mediums und wird
dadurch eine kritische Reynoldszahl Rek,TÜ unter-
schritten, so ändert sich die Mischzeitcharakteristik.
cTU
Rek,TU =  Gl. 6.10
Ne1/ 3
TÜ steht für den Wechsel vom turbulenten in den
Übergangsbereich. Diese kritische Reynoldszahl
Rek,TÜ ist um 1–2 Zehnerpotenzen höher als die-
jenige, bei der der Anstieg des Leistungsbeiwer-
tes Ne beginnt. Hier zeigt sich die Problematik der
Anwendung der Rührer-Reynoldszahl auf Durch-
mischungsvorgänge. Die Rührer-Reynoldszahl
beschreibt streng genommen nur die durch Druck-
und Zähigkeitskräfte bedingten Verhältnisse am
Rührorgan selbst, ist aber für den gesamten Behälter-
ter-Reynoldszahl ReB definiert werden, die ihrerseits
dem Kehrwert einer Fourier-Zahl entspricht:
1 d 2⋅ρ
ReB = = 1  Gl. 6.11
Fo θ⋅η
Im Übergangsbereich nimmt die Mischzeit in new-
tonschen Medien proportional zur Viskosität zu:
n ⋅ θ ~ Re−1 Gl. 6.12
Analog zu Gl. 6.7 für den turbulenten Bereich ergibt
sich im Übergangsbereich [123]:
−2 / 3  2/3
η  p   d1 
θ ~ ⋅   
⋅   ⋅ d1−2/3  Gl. 6.13
ρ V   d 2 
messerverhältnisses ist hier größer als im Turbulen-
ten. Paradox erscheint die Tatsache, dass umgekehrt
zum turbulenten Bereich in größeren Behältern die
Mischzeit kürzer wird. In größeren Behältern liegen
höhere Re-Zahlen vor, was sich gemäß Gl. 6.12 positiv
auswirkt. Dieser Maßstabseffekt erklärt auch, warum
Prozesse im Labor- oder Pilotmaßstab ungünstiger
verlaufen können als in der Betriebsanlage.
Homogenisieren nichtnewtonscher
Medien im Übergangsgebiet
Die in den vorhergehenden Abschnitten angege-
benen Beziehungen gelten ausschließlich für new-
tonsche Medien. In den meisten Fällen sind Fer-
mentationsmedien mit steigender Viskosität jedoch
Kapitel 6 · Bioreaktoren
169 6
nichtnewtonsch (in der Regel strukturviskos, gele-
gentlich mit Fließgrenze). Dies erschwert die Betrach-
tung der Strömungsvorgänge im Behälter, da in
Rührernähe turbulente Strömung vorherrscht, mit
zunehmendem Abstand aber der Übergang zu lami-
narer Strömung erfolgt. Im Bereich der Flüssigkeits-
oberfläche oder im Strömungsschatten von Einbau-
ten können sogar vollständig stagnierende Zonen
auftreten.
Numerische Strömungssimulationen (CFD) erlau-
ben heute mit entsprechendem Aufwand, den Verlauf
der örtlichen Viskositäten im Behälter zu berechnen
[63]. Zur Bestimmung der für den Wärmeübergang
relevanten Viskosität im Wandbereich kommen halb-
empirische Ansätze zur Anwendung [2, 36].

Wärmeübergang
Der Wärmeübergang im Bioreaktor wurde in
7 Abschn. 5.4 bereits ausführlich behandelt. Um den
Reaktorinhalt auf gleichbleibender Temperatur zu
halten, müssen die Stoffwechselwärme (Richtwert
500 kJ/mol O2) und die in Wärme umgesetzte Rühr-
wellenleistung abgeführt werden. In modernen Hoch-
leistungsbioreaktoren ergibt das 30–40 kW/m3. Hierzu
reicht die Behälterwand als Wärmeaustauschfläche bei
weitem nicht aus, zumal auch die Temperaturdifferenz
zum Kühlwasser gering ist. Zum Einsatz kommen
daher senkrechte Rohrbündel oder Kühlschlangen,
. Abb. 6.12  Doppelrohrschlangen-Wärmetauscher mit
wie in . Abb. 6.12 beispielhaft gezeigt. Die Absenkung Stromstörern und Halterungen, Finite-Elemente-Modell
der Kühlwassertemperatur mittels Kältemaschinen
deckt zwar Lastspitzen ab, vermeidet jedoch grund-
sätzlich nicht zusätzliche Wärmetauscher. Durchmesserverhältnis Rührer/Behälter. Für Rohr-
Die wärmetechnische Auslegung des Rühr- bündel- oder Spiralwärmetauscher genügt eine
bioreaktors erfolgt, wie im VDI-Wärmeatlas [165] Anpassung von c. Der Viskositätsterm berücksich-
beschrieben. Zur Ermittlung der Wärmedurchgangs- tigt die örtliche Änderung der Viskosität im Tem-
zahl k muss der Wärmeübergangskoeffizient auf der peraturprofil der Wandgrenzschicht beim Heizen
Produktseite, also auf der Wand- und Rohroberflä- oder Kühlen.
che bekannt sein. Ermittelt wird er für die Wand aus Gl. 6.14 gilt für turbulente Strömung und im
einer mit dem Behälterdurchmesser gebildeten Nus- Übergangsbereich nur für newtonsche Flüssig-
selt-Zahl Nu der Beziehung keiten. Bei der Herstellung von Antibiotika oder
Ver­dickungsmitteln wie Xanthan oder Gellan treten
αi ⋅ d1  η 0,14 hohe Viskositäten mit zusätzlich viskoelastischem
Nu = = c ⋅ Re 2 / 3 ⋅ Pr1/ 3 ⋅    Gl. 6.14
λ  η W  Verhalten auf. Hierzu und insbesondere auf die dann
notwendige Verwendung einer repräsentativen Vis-
Die Konstante c berücksichtigt den Rührorgan- kosität wird auf 7 Kap. 4 verwiesen. Von Ammanul-
typ und Geometriefaktoren wie Stufenzahl oder lah et al. [2] wird die repräsentative Viskosität an der
 170 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
Wärmeaustauschfläche über ein Schubspannungs-
modell abgeschätzt. Auch hierfür erlauben ange-
passte CFD-Modelle heute eine genauere Berech-
nung. In 7   Kap. 5 werden Besonderheiten beim
Wärmeübergang an viskoelastische Flüssigkeiten
behandelt.
Bei zu hohen Viskositäten sind Rohrbündel-
oder Spiralwärmetauscher nicht mehr sinnvoll, da
die Rohrzwischenräume nicht mehr durchströmt
werden. Hier wird dann allerdings durch die visko-
sitätsbedingte Limitierung des Stoffübergangs auch
die abzuführende Wärme begrenzt sein.
6 die Temperatur aber auch die Konzentration gelös-
6.1.4 Stofftransport gasförmig/flüssig
Werner Himmelsbach
Der Stofftransport und insbesondere der Stofftrans-
port Gas/Flüssigkeit wurde bereits ausführlich in
7 Abschn. 3.4 und 7 Abschn. 5.3 behandelt. Die spe-
ziell für den Sauerstoffeintrag in wässrige Lösungen
maßgebende Größe, der volumetrische Stofftrans-
portkoeffizient kLa wurde in 7 Abschn. 3.4 vorgestellt.
In diesem Kapitel sollen daher technische Aspekte
des Sauerstoffeintrags in gerührten Bioreaktoren im
Vordergrund stehen.
Der für den Stoffwechsel der Mikroorganismen
benötigte Sauerstoff muss vom Begasungssystem in
gelöster Form zur Verfügung gestellt werden. Hierzu
wird Luft unterhalb der unteren Rührerstufe einge-
speist. Ein Begasungsring oder eine Lanze bei einem
rotierenden Gasverteiler (. Abb. 6.1) sorgt für die
Vorverteilung der Luft, die dann an den Rührorganen
in feine Blasen dispergiert wird und so mit großer
Phasengrenzfläche für den Stofftransport zur Ver-
fügung steht. Für Prozesse mit tierischen oder Pflan-
zenzellen stehen spezielle Begasungsvorrichtungen
wie beispielsweise Membranen zur Verfügung, die
hier jedoch nicht weiter beschrieben werden. Der
Sauerstoffbedarf liegt in modernen Produktions-
prozessen bei Spitzenwerten von OURmax = 200 bis
250 mol m–3 h–1 (6,4 bis 8 kg m–3 h–1), wobei aus Kos-
tengründen oftmals OURmax von 150 bis 180 mol m–3
h–1 realisiert werden.
Die volumetrische Sauerstoffübertragungsrate
OTR (engl. Oxygen Transfer Rate) ergibt sich aus dem
volumetrischen Sauerstoffübertragungsvermögen
k La, der Sauerstofflöslichkeit in der Flüssigkeit
co* , L und der Gelöstsauerstoffkonzentration co ,L
2 2
gemäß Gl. 3.54. Durch den Eintrag und Verbrauch
an Sauerstoff stellt sich im Reaktionsmedium ein
dynamisches Gleichgewicht zwischen OUR und OTR
ein, das zu der Gelöstsauerstoffkonzentration in der
Kernströmung co2,L führt.
Die Sauerstofflöslichkeit an der Phasengrenze gas-
förmig/flüssig auf Flüssigkeitsseite co* ,L wird durch
2
den mittleren Sauerstoffpartialdruck zwischen Ein-
und Austritt der Luft und damit vorwiegend auch
durch den Betriebsdruck und die statische Höhe an
der Gaseinspeisestelle bestimmt. Daneben spielen
ter Stoffe sowie Antischaummittel und Sub­strate eine
Rolle.
Die Mikroorganismen erzielen ihre maximale
Stoffwechselrate, wenn die Konzentration an gelös-
tem Sauerstoff co*2 ,L nicht unter eine kritische und
für den jeweiligen Organismus typische Grenze
fällt. Deshalb ist es wichtig, dass dieser Wert im
gesamten Reaktor eingehalten werden kann. Der
spezifische Sauerstoffverbrauch ist in der Regel
aus Pilotversuchen oder aus Daten bereits laufen-
der Anlagen bekannt. Um die nötige Sauerstoff-
eintragsrate OTR zu erzielen, muss das Rühr- und
Begasungssystem einen ausreichend hohen kLa zur
Verfügung stellen. Dieser wird in einem gegebe-
nen Stoffsystem in erster Linie durch den spezifi-
schen Leistungseintrag der Rührorgane P/VL und
die Gas-Leerrohrgeschwindigkeit uG beeinflusst
(siehe Gl. 3.56).
Dabei stellt die Leerrohrgeschwindigkeit keinen
wirklichen Freiheitsgrad dar, da die Luftmenge über
die Sauerstoff-Mengenbilanz weitgehend vorgegeben
ist. Die Proportionalitätskonstante C dieser empiri-
schen Korrelationsbeziehung (Gl. 3.56) fasst die Stoff-
eigenschaften von Gas und Flüssigkeit und die Leis-
tungsfähigkeit des Begasungssystems zusammen.
Sie ist ebenso wie die Exponenten α und β für ein
gegebenes System neben Stoffeigenschaften wie der
Oberflächenspannung stark vom Koaleszenzverhal-
ten der dispersen Phase abhängig. Wenn C, α und β
nicht aus Erfahrung mit vergleichbaren Fermenta-
tionen bekannt sind, müssen sie über Pilotversuche
bestimmt werden. Die hier vereinfacht dargestellten
Transportvorgänge werden in 7 Kap. 5 ausführlicher
erläutert.
Kapitel 6 · Bioreaktoren
6.1.5 Maßstabsübertragung (scale-up
und scale-down)
Ralf Takors
Der englische Begriff scale-up bezeichnet als Ang-
lizismus im Deutschen allgemein die Übertragung
eines Prozesses aus dem Labor- in den großvolu-
migen (industriellen) Produktionsmaßstab. Dieser
erreicht 5–20 m3 für die Herstellung von Biophar-
mazeutika mit Säugerzellprozessen, 5–50 m3 für die
Produktion von Feinchemikalien und 100–800 m3
für die Herstellung von Grundstoffen. Analog dazu
bezeichnet scale-down die Simulation großvolumi-
ger Einflüsse im Milliliter- bis Liter-Maßstab des
Labors. Entsprechende Studien sollen dazu dienen,
unerwünschte Effekte des Produktionsansatzes mög-
lichst frühzeitig zu erkennen und wenn möglich zu
vermeiden.
Ein scale-up ist dann erfolgreich, wenn im groß-
volumigen Produktionsmaßstab die gleichen Leis-
tungsdaten wie in den vorangegangen Laborunter-
suchungen erzielt werden. Zu beachten ist, dass aus
wirtschaftlicher Sicht vermeintlich geringe techni-
sche Übertragungsprobleme schon zum Misserfolg
führen können. Ein klassisches Beispiel stellt die
verstärkte Neigung zur Schaumbildung im Produk-
tionsreaktor dar. Tritt diese im Produktionsprozess
unerwartet auf, können Endvolumina und damit
Produktmengen und -reinheiten oftmals nicht wie
geplant eingehalten werden. Die Folge sind über-
höhte Herstellkosten pro Produkteinheit, was die
Wirtschaftlichkeit des Ansatzes an seine Grenzen
führen kann.
Neben der Schaumbildung kann die Übertra-
gung eines Prozesses vom Labor- in den industriel-
len Maßstab auch andere Größen wie beispielsweise
die Wachstumsrate, die Biomasse/Substrat-Aus-
beute, die Produkt/Substrat-Ausbeute oder auch die
Nebenproduktbildung verschlechtern. In Lara et al.
[96] sind einige Beispiele aufgeführt. Weitere Einbli-
cke in die Problematik des scale-up bieten die Über-
sichtsartikel von Junker [73], Schmidt [146], Hewitt
and Nienow [60], Garcia-Ochoa und Gomez [42],
Junne [7].
Prinzipiell können die scale-up-bedingten Ein-
flüsse in chemische, biologische und physikalische
Faktoren unterteilt werden.
171 6
Zu den chemischen Faktoren zählt die Qualität
der eingesetzten Medien. Während im Labormaßstab
oftmals sehr reine Substanzen verwendet werden,
unterliegt die industrielle Produktion engen wirt-
schaftlichen Zwängen. Dies führt häufig zur Verwen-
dung von alternativen, teils verunreinigten Medien-
bestandteilen, deren Einfluss auf die Leistungsdaten
des Prozesses untersucht werden muss. Auch sollte
beachtet werden, dass Produktionsanlagen im Tages-
bzw. Wochenrhythmus mit neuen Substratlieferun-
gen versorgt werden, was eine zusätzliche Quelle
schwankender Qualität sein kann. Im Laborbereich
wird meist voll entsalztes Wasser für die Kultivierun-
gen eingesetzt. In der Produktion werden natürliche
Wasserquellen verwendet, die bezüglich der Salzge-
halte deutliche Abweichungen aufweisen können.
Ein weiterer Unterschied stellt die Wahl des Titra-
tionsmittels dar. Während in Laboruntersuchun-
gen meist flüssige Komponenten wie beispielsweise
Ammoniakwasser eingesetzt werden, kommen in
der Produktion zur Vermeidung von unnötigen
Verdünnungseffekten auch Gase wie Ammoniak
zur Verwendung. Prinzipiell sollte beachtet werden,
dass das Pufferpotenzial der Fermentationsmedien
eines Produktionsprozesses deutlich über dem eines
Laborprozesses liegt. Im Wesentlichen ist dies eine
Folge der sich einstellenden mittleren Betriebsdrü-
cke im Bioreaktor. Die liegen wegen der verwende-
ten Kopfdrücke und der herrschenden Wassersäule
meist über den Laborwerten. Dadurch steigt die Lös-
lichkeit von CO2 und damit die Pufferkapazität über
das CO2/HCO3–-Gleichgewicht [11].
Zu den biologischen Faktoren zählt beispiels-
weise die Anzahl der Generationen. Es ist offen-
kundig, dass mehrere Stufen zur Biomasse-Her-
stellung in einer Produktionsanlage durchlaufen
werden müssen, bevor der eigentliche großvolu-
mige Produktionsprozess gestartet werden kann.
Die Unterschiede in der Anzuchtschiene (engl. seed
train) können leicht 10–20 Generationen der Zelltei-
lung umfassen. Produktionszelllinien müssen daher
robust genug sein, um auch bei erhöhter Genera-
tionszahl noch die gewünschten Leistungsdaten zu
liefern. Dies schließt auch die Toleranz gegenüber
Einflüssen innerhalb der Anzuchtschiene im teils
harschen Produktionsbetrieb ein.
Zu den physikalischen Faktoren zählen beispiels-
weise Unterschiede in Geometrie und Ausstattung
 172 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
des Produktionsreaktors gegenüber dem Laborsys-
tem. Häufig werden in industriellen Bioreaktoren
andere Begasungs- und Rührorgane eingesetzt, als
dies im Laborreaktor der Fall ist. Unterschiede im
Design spiegeln wirtschaftliche Investitionsgrenzen
wie auch prinzipielle physikalische Einflüsse wider.
So erhöht sich für eine zylindrische Bauform die
Außenoberfläche nicht im gleichen Maße wie das
Reaktionsvolumen. Dies hat zur Folge, dass höhere
Anforderungen an die Wärmeabfuhr und damit an
die Größe und Bauform der zu installierenden Wär-
metauscher gestellt werden. Auch zeigt sich, dass
dem Wunsch einer möglichst identischen Einstel-
6 lung von volumetrischen Leistungseinträgen im Pro-
duktionssystem im Vergleich zum Laborsystem tech-
nische und wirtschaftliche Grenzen gesetzt sind. In
Bioreaktoren >5 m3 sind daher meist geringere volu-
metrische Leistungseinträge installiert als im Labor-
reaktor. Als Folge treten größere Mischzeiten und
damit Gradienten für Substrate, gelöste Gase und pH
in großvolumigen Reaktoren auf. Anzumerken ist,
dass die vertikale Bildung von Gradienten gelöster
Gase (O2, CO2) Spiegelbild der lokalen Gaslöslich-
keit in Abhängigkeit vom Druck der Wassersäule im
Bioreaktor ist.
Richtlinien für die
Maßstabsvergrößerung (scale-up)
Abgeleitet aus den Erfahrungen des chemischen
Apparate- und Anlagebaus wurden Richtlinien mit
dem Ziel formuliert, die physikalischen Einflüsse der
Maßstabsvergrößerung zu minimieren. Diese scale-
up-Kriterien versuchen die äußeren Reaktionsbedin-
gungen für die Kultivierung der Zellen im Reaktor
annähernd ähnlich zu gestalten. Sie sind aber im
Kern nicht biologisch motiviert.
In der Praxis werden meist mehrere Kriterien
gleichzeitig angewandt. Die Auswahl geeigneter
Kombinationen ist oftmals sensitiv und individuell
durch Vorversuche zu ermitteln. Es sollte unbedingt
beachtet werden, dass einzelne Kriterien einan-
der widersprechen können. Eine Auswahl gängi-
ger Ansätze ist in . Tab. 6.1 aufgeführt (siehe auch
[159]).
Zur Anwendung der nachstehend aufgeführ-
ten Kriterien wird der idem Grundsatz verfolgt.
Demnach sollte eine Bedingung formuliert für das
Labor (1) den analogen Wert im Produktionsansatz
(2) erreichen.
In der Praxis hat sich für das erfolgreiche ­scale-up
von Pilzfermentationen das Kriterium der Rührer-
spitzengeschwindigkeit als vorteilhaft erwiesen.
Für aerobe Kultivierungen mit Suspensionskultu-
ren wird häufig eine Kombination der oben angege-
benen Bedingungen angewendet. In Säugerzellan­
sätzen ist es oftmals technisch leichter, die Vorgabe
eines ähnlichen volumetrischen Leistungseintrages
auch im Produktionsansatz zu erfüllen. Für mikro-
bielle Produktionen im mehrere 100 m3-Maßstab ist
dies kaum möglich. Als Konsequenz wird meist – zur
Erzielung ähnlich hoher kLa – die (relative) Belüf-
tungsrate erhöht, was zu einer verstärkten Schaum-
bildung führen kann.
Ansätze zur Maßstabsverkleinerung
(scale-down)
Um die möglichen, leistungsmindernden Einflüsse
eines scale-up bereits während der Prozessentwick-
lung zu erkennen und Gegenmaßnahmen einzu-
leiten, werden scale-down-Ansätze durchgeführt.
Deren Ziel ist es beispielsweise, großvolumige Gra-
dienten der Sauerstoffverfügbarkeit oder Substrat-
versorgung in Laborstudien abzubilden. . Abb. 6.13
stellt einige Vertreter der kompartimentierten Auf-
bauten dar.
Die Ansätze haben gemein, dass Gradienten für
Sauerstoff oder Substrate in einem Kompartiment
(2. Rührkessel oder im Strömungsrohr) künstlich
auferlegt werden und die physiologische Auswir-
kung auf die Produktionsorganismen durch Pro-
bennahme analysiert werden. Im Aufbau . Abb.
6.13c behindern Einbauten die Strömung im Bio-
reaktor. Nur durch kleine Bohrungen wird ein
Austausch zwischen den Segmenten zugelassen.
Heutige Entwicklungen verfeinern diese Grundty-
pen immer weiter, etwa durch Hinzunahme meh-
rerer Strömungsrohre [99] oder Bioreaktoren im
Umlauf [21].
Kapitel 6 · Bioreaktoren
173 6

. Tab. 6.1  Übersicht über einige ausgewählte scale-up-Kriterien

Name Kriterium Bemerkung

Geometrische Ähnlichkeit Zur Formulierung der geometrischen

Rührerspitzengeschwindigkeit
(impeller tip speed)
Volumetrischer Leistungseintrag
Sauerstofftransferrate
Belüftungskennzahl
Relative Belüftungsrate
Sauerstofftransportkoeffizient
Mischzeit
DT, 2  D 1/ 3
=  T, 2  Ähnlichkeit wird häufig das Höhe-zu-
DT,1  DT,1  Durchmesser Verhältnis H/D verwendet.
N1, max ⋅ DR,1 = N 2, max ⋅ DR, 2 Zur Einstellung der am besten geeigneten
Morphologie wird dieses Kriterium besonders
in Pilzfermentationen häufig angewendet.
c Nach Einsele [35] kann c = –0,37 für das
( P0 / VT )2  VT,1  nebenstehende Verhältnis aus (unbegasten)
= 
( P0 / VT )1 VT, 2  mechanischem Leistungseintrag zum
Reaktionsvolumen angenommen werden.
OTR1 = OTR2 Es wird versucht, die Profile des
Sauerstofftransfers – gänzlich oder in
ausgewählten, kritischen Prozessphasen – im
Labor- und Produktionsreaktors vergleichbar
zu gestalten
Vair,1 Vair, 2 Die Belüftungszahl, das Verhältnis zwischen
= Belüftungsrate und dem Produkt aus
N1 ⋅ DT3,1 N 2 ⋅ DT3, 2
Rührerdrehzahl mit Reaktordurchmesser,
wird konstant gehalten.
Vair,1 Vair, 2 Das oftmals mit der Bezeichnung vvm = idem
= bekannte Kriterium versucht, die relative
VT,1 VT, 2
Belüftungsrate konstant vorzugeben.
kL ⋅ αO = kL ⋅ αO Der kLa ist von dem volumetrischen
2,1 2, 2
Leistungseintrag, der Begasungsrate und
der Viskosität des Mediums abhängig. Daher
kann eine Konstanz nur für ausgewählte,
sensitive Prozessphasen angestrebt werden.
tmix,1 = tmix,2 Die Mischzeit hängt sehr stark vom
volumetrischen Leistungseintrag, der
Reaktorgeometrie und der Viskosität
des Mediums ab. Daher ist eine analoge
Einstellung für großvolumige Prozesse meist
nicht möglich.

Indizes
1: Labor
2: Produktion
T: Innendurchmesser des Bioreaktors
R: Rührer
Parameter:
D: Durchmesser
V: Volumen
N: Rührerdrehzahl
V: Belüftungsrate
P0: Leistungseintrag im unbegasten Reaktor
 174 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
Mischzeiten großvolumiger Bioreaktoren liegen
oftmals im Bereich von 30–180 Sekunden. Entspre-
chend werden die Verweilzeiten in den Gradienten-
behafteten Kompartimenten eingestellt. Für die Aus-
legung des Strömungsrohrs aus . Abb. 6.13b sollte
zusätzlich beachtet werden, dass die Bodensteinzahl
Bo > 100 ist (siehe 7 Kap. 3).
In Ergänzung zu den in . Abb. 6.13 dargestell-
ten scale-down-Ansätzen werden ebenfalls experi-
mentelle Studien nach . Abb. 6.14 durchgeführt.
Ziel der Arbeiten ist es, die kurzfristige metabo-
lische Antwort auf extrazelluläre Stimuli, so wie
sie sich beispielsweise innerhalb von Gradienten
6 eines Bioreaktors ergeben, aufzulösen. Im Unter-
schied zu den Ansätzen aus . Abb. 6.13 steht somit
nicht die Aufklärung der kumulativen scale-up-Ef-
fekte eines gesamten Prozesses im Vordergrund,
sondern die Untersuchung der kurzfristigen meta-
bolischen Antwort auf einzelne Stimuli. Diesbezüg-
liche Arbeiten verlangen, dass der zelluläre Stoff-
wechsel bei Probennahme unmittelbar gestoppt
wird, um nur die interessierende Zellantwort auf
den Stimulus und keine unerwünschten Nebenef-
fekte der Probennahme zu untersuchen. Die Iden-
tifizierung geeigneter Probennahme und –prozes-
sierungsansätze ist nach wie vor ein anspruchsvolles
Forschungsgebiet.
Erste diesbezügliche Arbeiten gehen auf Theo-
bald et al. [162] zurück und wurden 1997 durch die
Auflösung und Modellierung der metabolischen
. Abb. 6.13  (a) Aufbau des ersten 2-Kompartment-
Bioreaktorsystems nach Oosterhuis und Kossen [119]
zur Untersuchung des Einflusses unterschiedlicher
Sauerstoffkonzentrationen, (b) Verschaltung eines
Rührkesselreaktors (RK) und eines Gradienten-behafteten
Strömungsrohrs (SR) nach Sweere et al. [157, 158]), (c)
Mehrfach kompartimentierter Rührkesselreaktor nach
Schilling et al. [140]
Dynamik in Hefen nach Glucose-Stimulus weiter-
geführt [163]. Ähnliches gelang für Escherichia coli
und Corynebacterium glutamicum. Apparatetech-
nisch wurde für die schnelle Probennahme unter
anderem ein Probenahmeschlauch vorgeschlagen
[175]. Nach Aufgabe des Stimulus im Bioreaktor
wurde ein Ventil geöffnet und so die Suspension
in den Schlauch geleitet. Durch schnelles Einfrie-
ren konnte die zelluläre Antwort dort fixiert und
für spätere Analysen zur Verfügung gestellt werden.
Alternativ wurde eine automatisierte Probennahme-
einheit entwickelt [122], die mit einer Probenahme-
frequenz von 4–5 Hz den zellulären Metabolismus
durch Quenchen bei ca. –20 °C unmittelbar stoppte
[136]. Darüber hinaus sind auch spezielle Ventile
für einzelne Probennahmen bekannt [61, 93, 137].
Ein alternativer Versuchsansatz besteht darin,
den Stimulus nicht im Hauptreaktor sondern in
einem 2. Reaktor oder in einer speziellen Probenah-
meeinheit aufzugeben. Der Vorteil dieser Vorgehens-
weise besteht unter anderem darin, dass mehrere
Stimuli untersucht werden können, ohne dass der
Hauptprozess („Master“) gestört wird (. Abb. 6.14,
rechts). El Massaoudi et al. [34] stellten das Sensor
Reactor-Konzept vor, in dem ein Satellitenreak-
tor („Slave“) parallel zum „Master“ betrieben wird.
Stimuli (auch 13C-Markierungen) wurden dort auf-
gegeben, um so mehrfach Stoffflussänderungen im
Prozessverlauf zu dokumentieren. Einen ähnlichen
. Abb. 6.14  (a) Aufgabe des Stimulus im Bioreaktor. Die
schnelle Probennahme dokumentiert die zelluläre Reaktion.
Dies kann entweder durch einen Probennahmeschlauch oder
durch eine schnelle Ventilschaltung geschehen. (b) Aufgabe
des Stimulus in eine separaten Einheit. Entweder wird
der Stimulus in einer Probeneinheit aufgegeben und die
kurzfristige Antwort gemessen, oder ein „Slave“-Reaktor wird
parallel zum ‚Master‘-Reaktor betrieben und dort der Stimulus
(auch mittelfristig) gemessen
Kapitel 6 · Bioreaktoren
Ansatz verfolgten Aboka et al. [1] mit dem BioCur-
ve-Konzept. Mauch et al. [107] und Buziol et al.
[22] waren die ersten, die eine stop-flow-Technolo-
gie für die schnelle Probennahme nach Pulsaufgabe
während der Probennahme vorstellten. In ähnlicher
Weise wurde dieser Ansatz durch das BioScope-Sys-
tem [168] übernommen.
In silico Ansätze
Die numerischen Möglichkeiten zur Simulation der
mehrphasigen Hydrodynamik und des Stofftrans-
ports verbessern sich ständig – auch für die Anwen-
dung in großvolumigen Bioreaktoren. Der Kern
diesbezüglicher Arbeiten wird computational fluid
dynamics genannt. Vrabel et al. [170] und Schmalz-
riedt et al. [143] waren die ersten, die Simulationen
zum mehrphasigen Stofftransport in kompartimen-
tierten Bioreaktoren an mikrobielle Kinetik kop-
pelten. Diese Ansätze wurde in der Folgezeit wei-
tergeführt und durch die Betrachtung individueller
Zellen einer Saccharomyces cerevisiae- bzw. E. coli-
Population verfeinert [94, 95]. Mit der zunehmenden
Stärke der Rechnerleistung werden solche Ansätze
zukünftig sicherlich eine größere Bedeutung bekom-
men. Dies ist auch nötig, um die Prädizierbarkeit für
eine erfolgreiche Maßstabsvergrößerung weiter zu
verbessern [118].
6.2 Bioreaktoren mit
Leistungseintrag
über Gasexpansion
(Blasensäulenreaktoren)
Blasensäulenreaktoren stellen Stoffaustausch- und
Reaktionsapparate dar, in denen ein Gas mit einer
Flüssigphase in Kontakt gebracht wird. Kennzeich-
nend für Blasensäulen ist, dass der Gasstrom in der
flüssigen Phase in Form von Blasen dispergiert wird.
Blasensäulen-Reaktoren zeichnen sich durch ihre
einfache Konstruktion und die völlige Abwesenheit
von mechanisch bewegten Einbauten aus. Dieser
Bioreaktortyp gilt als kostengünstig im Betrieb und
kann auch mit großem Reaktionsvolumen betrieben
werden (>300 m3). In der Biotechnologie werden
Blasensäulenreaktoren in unterschiedlichen Baufor-
men sowohl bei der aeroben Abwasserbehandlung
175 6
(Reaktorvolumen bis 20.000 m3, siehe 7 Kap. 11),
heterotrophen Prozessen beispielsweise zur Her-
stellung von Hefen (Starterkulturen) sowie auch in
speziellen Fotobioreaktoren (Flachplattenreaktoren,
siehe auch 7 Abschn. 6.3.3) oder bei Syngasfermenta-
tionen eingesetzt. Die grundlegenden Eigenschaften
von Blasensäulenreaktoren, sowie daraus abgeleitet
deren Vor- und Nachteile insbesondere gegenüber
dem Rührkesselreaktor, sollen im Folgenden zusam-
mengefasst werden.
6.2.1 Bauformen, Strömungsführung,
Betriebszustände
Die einfachste Ausführungsform eines Blasensäu-
lenreaktors ist ein senkrecht stehender zylindrischer
Behälter, der am Boden mit einem Gasverteiler und
am Kopf oftmals mit einem Gasabscheider ausge-
stattet ist (siehe . Abb. 6.15). Die Flüssigphase wird
in der Regel ebenfalls am Boden des Reaktors zuge-
führt. Im Schwerefeld sorgt der Dichteunterschied
zwischen der am Boden dispergierten Gasphase und
der Flüssigphase für die Durchmischung des Reak-
tionsmediums durch die aufsteigenden Gasblasen.
Gleichzeitig erfolgt der Stofftransport gasförmig-
flüssig über die Phasengrenze zwischen Gasblasen
und Flüssigphase.
Um eine definiertere Strömungsführung in Bla-
sensäulenreaktoren zu erzielen, werden diese häufig
mit Leitrohren ausgestattet, wobei nur ein Teil der
Querschnittsfläche begast wird (. Abb. 6.15). Diese
Bauformen werden häufig als Gaslift-Reaktor oder
bei Luft als Gasphase als Airlift-(Schlaufen)Reaktor
bezeichnet. Da die mittlere Dichte des Teils des
Reaktors mit dispergierter Gasphase geringer ist als
der unbegaste Teil, stellt sich im Schwerefeld eine
Umlaufströmung (Zirkulationsströmung) der flüssi-
gen Phase ein. Bei Blasensäulenreaktoren mit großer
Querschnittsfläche werden in der Regel mehrere
Leitrohre eingebracht. Statt eingebauten Leitrohren
kann auch ein äußerer Umlauf durch außerhalb des
zylindrischen Reaktorbehälters angeordnete Rohr-
leitungen erreicht werden (siehe . Abb. 6.15d). In
jedem Fall bewirkt die definierte Strömungsführung
durch eingebrachte Leitrohre und partielle Begasung
eine bessere Homogenisierung der Flüssigphase und
damit eine deutliche Verringerung von Mischzeiten.
 176 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
. Abb. 6.15  Prinzipskizzen D E
zu Bauformen von
Blasensäulenreaktoren: (a) einfache
Blasensäule, (b) Gaslift Reaktor
mit äußerem Umlauf, (c) Gaslift
Reaktor mit innerem Umlauf, (d)
Blasensäulenreaktor mit externem
Umlauf
6 Sterilisation und Abfuhr der Reaktionswärme
insbesondere bei aeroben Prozessen erfolgt über
Wärmetauscher, die entweder als senkrecht ange-
ordnete Rohrbündel in den Blasensäulenreaktor
eingebracht werden können oder bevorzugt in den
äußeren Umlauf integriert sind (in . Abb. 6.15 nicht
eingezeichnet).
Als Gasverteiler kommen entweder statische
oder dynamische Begaser zum Einsatz. Bei stati-
schen Begasern erfolgt die Gasdispergierung durch
Poren oder Bohrungen im Gasverteiler. Zum Einsatz
kommen Sinterplatten oder Lochplatten, bezie-
hungsweise Begasungsrohre. Begasungsrohre stellen
im Vergleich zu Loch- oder Sinterplatten weniger
wirksame Gasverteiler dar, da der erzielbare Gasge-
halt im Reaktor und die Stoffaustauschfläche gerin-
ger sind.
Bei dynamischen Begasern handelt es sich um
Zweiphasendüsen in unterschiedlichsten Baufor-
men, bei denen ein Flüssigkeitsstrahl in Kontakt
mit der Gasphase gebracht wird und die kinetische
Energie des Flüssigkeitsstrahls (Treibstrahl) genutzt
wird, um die Gasphase in kleine Primärblasen zu zer-
teilen. Anschließend koaleszieren die Gasblasen, bis
ein Gleichgewichtsblasendurchmesser erreicht ist.
Beispiele für dynamische Begaser sind in der Litera-
tur beschrieben (beispielsweise [28]).
Grundsätzlich lassen sich in Blasensäulenreakto-
ren oder im begasten Teil von Gaslift-Reaktoren drei
verschiedene Betriebszustände beobachten (siehe
.   Abb. 6.16). Bei niedrigen Gasvolumenströmen
oder Gasleerrohrgeschwindigkeiten uG (hier wird
der eingebrachte Gasvolumenstrom auf die gesamte
Querschnittfläche des begasten Teils bezogen) treten
nahezu gleich große, kugelförmige Gasblasen mit
F G
einer engen Größenverteilung auf (homogene Bla-
senströmung). Dies führt dazu, dass die Blasenauf-
stiegsgeschwindigkeit nahezu einheitlich ist.
Wird die Gasleerrohrgeschwindigkeit weiter
gesteigert, kommt es zunehmend zu Blasenaggre-
gaten und zur Ausbildung von großen Gasblasen,
die im Innern der Blasensäule sehr viel schneller
aufsteigen. Diese großen Gasblasen verlieren ihre
Kugelform und ziehen beim Aufstieg im Schlepp-
tau kleinere Gasblasen mit (heterogene Blasen-
strömung). Die größeren Gasblasen weisen zwar
aufgrund der erhöhten Relativgeschwindigkeit
zwischen Gas- und Flüssigphase höhere Stoffüber-
gangskoeffizienten kL auf, die Phasengrenzfläche
und die mittlere Verweilzeit der Gasblasen in der
Blasensäule verringern sich jedoch stark. Im hete-
rogenen Betriebsbereich liegen damit die Umset-
zungsgeschwindigkeiten fast immer niedriger als
im (noch) homogenen Bereich, wenn der Stoff-
transport gasförmig-flüssig geschwindigkeitsbe-
stimmend ist. Die Gasleerrohrgeschwindigkeit
beim Übergang vom homogenen zum heterogenen
Betriebszustand ist in erster Linie von den Koales-
zenzeigenschaften des Mediums und der Art der
Gasverteilung abhängig.
In Blasensäulenreaktoren oder innen begasten
Leitrohren mit geringem Durchmesser (<20 cm bei
wässrigen Fermentationsmedien und Luft als Gas-
phase) können die im heterogenen Betriebsbereich
auftretenden großen Gasblasen durch die Rohrwand
stabilisiert werden, sodass diese den gesamten Quer-
schnitt ausfüllen und intermittierend als Gaspfropfen
(engl. slugs) nach oben strömen. Dieser auch Gaskol-
benströmung genannte Betriebsbereich ist unbedingt
zu vermeiden.
Kapitel 6 · Bioreaktoren
D E
. Abb. 6.16  Betriebszustände von Blasensäulenreaktoren (linke Seite: (a) homogene Blasenströmung, (b) heterogene
Blasenströmung) und typische Betriebsbedingungen für das Stoffsystem wässriges Reaktionsmedium/Luft (rechte Seite: der
schraffierte Bereich markiert das unerwünschte intermittierende Auftreten von Gasblasen über den gesamten Querschnitt)
6.2.2 Leistungseintrag und Gasanteil
Der Leistungseintrag in Blasensäulenreaktoren
erfolgt alleine durch Erzeugung einer dispersen Gas-
phase am Gasverteiler und setzt sich aus bis zu vier
Anteilen zusammen:
1. Leistungseintrag durch isotherme Expansion
der Gasphase,
2. Leistungseintrag aufgrund der Bildung von
Grenzflächen,
3. Leistungseintrag aufgrund der Trägheitskräfte
der verdrängten Flüssigkeit und
4. Leistungseintrag durch Verdrängung der
Flüssigphase (Schubspannungskräfte).
In Blasensäulenreaktoren mit statischen Begasern
wird der Leistungseintrag fast ausschließlich durch
die Expansion der Gasphase beim Aufstieg durch die
Flüssigkeitssäule bestimmt. Der Leistungseintrag
aufgrund der Bildung von Grenzflächen sinkt beim
Stoffsystem Wasser/Luft beispielsweise auf unter 1 %
sobald eine Wassersäule von 5 m überschritten wird,
die beiden anderen Leistungseinträge sind vernach-
lässigbar gering. Daher lässt sich der Leistungsein-
trag in Blasensäulenreaktoren einfach über die geleis-
tete Expansionsarbeit PExp abschätzen
177 6
Vgas ⋅ ρgas  ∆PH O 
PExp =  ⋅ R ⋅ T ⋅ ln 1 + 2 
 Gl. 6.15
M gas  PU 
wobei V gas den Gasvolumenstrom, ρgas die Gas-
dichte, M das Molekulargewicht des Gases, R die
gas
allgemeine Gaskonstante, T die absolute Temperatur,
ΔPH O die hydrostatische Druckdifferenz zwischen
2
Gasverteiler und Umgebungsdruck (ΔPH O = ρL · g ·
2
HL) und den Umgebungsdruck PU am Kopf des Bla-
sensäulenreaktors darstellen.
Der volumenbezogene Leistungseintrag in
technischen Blasensäulenreaktoren hängt damit
direkt von der Höhe der Wassersäule über dem
Begaser ab. Besonders bei niedriger Höhe der Was-
sersäule (<6–8 m) kann der volumenbezogene Leis-
tungseintrag bis zu einer Zehnerpotenz niedriger
als in Rührkesselreaktoren derselben Größe sein.
Die Energie wird in Blasensäulenreaktoren jedoch
sehr viel homogener verteilt als in Rührkessel-
reaktoren, da die isotherme Expansion der Gas-
phase gleichmäßig über die gesamte Flüssigkeits-
säule erfolgt.
Der auf das Volumen der begasten Dis-
persion bezogene Gasanteil ε G verringert das
aktive Reaktionsvolumen von Blasensäulenre-
aktoren und muss daher zur Abschätzung von
 178 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
Reaktionsgeschwindigkeiten bekannt sein. Der Gas-
anteil εG lässt sich im Betrieb von zylindrischen Bla-
sensäulenreaktoren einfach über die Füllhöhen im
begasten und unbegasten Zustand bei unveränderter
Flüssigkeitsmenge bestimmen:
H begast − H unbegast
εG =  Gl. 6.16
H begast
Bei homogener Blasenströmung sind die Gasbla-
sen gleichmäßig in der Flüssigkeit verteilt, die Bla-
sengrößenverteilung εG ist eng und die Blasenauf-
stiegsgeschwindigkeit uB ist nahezu einheitlich. In
6 diesem Fall ist der Gasanteil direkt proportional zur
Gasleerrohrgeschwindigkeit uG und umgekehrt pro-
portional zur mittleren Blasenaufstiegsgeschwindig-
keit uB:
uG
εG =  Gl. 6.17
uB
Bei homogener Blasenströmung entspricht die Bla-
senaufstiegsgeschwindigkeit uB der Aufstiegsge-
schwindigkeit der größten stabilen Einzelblase [88]:
∆ρ ⋅ g ⋅σ
uB = 1, 24 ⋅ 4  Gl. 6.18
ρl 2
Bei heterogener Blasenströmung können Gasblasen
nicht mehr einzeln betrachtet werden, sondern es
müssen Blasenschwärme und der Flüssigkeitsrück-
fluss berücksichtigt werden. Für den Gasanteil εG
ergibt sich bei heterogener Blasenströmung
εG ~ uG n  Gl. 6.19
wobei der Exponent n je nach Stoffsystem zwischen
0,4 < n < 0,7 liegt (n = 1,0 bei homogener Blasenströ-
mung). Zur Abschätzung des mittleren Gasgehalts
sind bei heterogener Strömung verschiedene Glei-
chungen verfügbar (siehe beispielsweise [88]). In der
Regel muss hier aber eine experimentelle Bestimmung
des mittleren Gasgehaltes εG im Betrieb erfolgen, da
die spezifischen Eigenschaften des Stoffsystems gas-
förmig-flüssig und hier besonders die Grenzflächen-
spannung großen Einfluss auf den Gasgehalt haben.
Die Stoffeigenschaften (Fließverhalten des wässri-
gen Reaktionsmediums und Grenzflächenspannung
gasförmig-flüssig) können sich bei biologischen Pro-
duktionsprozessen um Zehnerpotenzen im Prozess-
verlauf ändern. Typische Gasgehalte liegen an der
Grenze zwischen homogener und heterogener Bla-
senströmung bei εG = 15–20 % Volumenanteil (uG ~
0,05 m s–1).
Die sich einstellende Umlaufgeschwindigkeit der
Flüssigphase uL,gaslift bei Gaslift-Reaktoren verringert
den Gasgehalt im begasten Teil, da die Blasenauf-
stiegsgeschwindigkeit von dieser überlagert wird. Die
Umlaufgeschwindigkeit lässt sich über eine Energie-
bilanz herleiten [88]:
uL,gaslift = C ⋅ 3 g ⋅ H ⋅ug  Gl. 6.20
wobei sich die Gasleerrohrgeschwindigkeit auf den
begasten Teil des Gaslift-Reaktors bezieht. Damit
wird Gl. 6.17 zu:
uG
εG =  Gl. 6.21
uB + uL,gaslift
6.2.3 Stofftransport Gas-Flüssig
Zur Abschätzung des volumenbezogenen Sauerstoff-
transportkoeffizienten kLa in Blasensäulenreakto-
ren ist zunächst eine Abschätzung des Primärblasen-
durchmessers der am statischen Begaser dispergierten
Gasphase notwendig. Die Primärblasengröße db kann
unmittelbar aus einem Kräftegleichgewicht zwischen
der über den Zeitraum des Blasenbildungsvorgangs
zeitlich gemittelten Auftriebskraft FA der kugelförmigen
Primärblase und der entgegengerichteten Kapillarkraft
Fσ an der Öffnung einer Pore des statischen Begasers,
der Trägheitskraft FT der verdrängten Flüssigkeit und
der Schubspannungskraft Fn aufgrund der inneren
Reibung der Flüssigkeit berechnet werden [169]:
FA = Fσ + FT + Fη  Gl. 6.22
Die einzelnen bei der Blasenbildung angreifenden
Kräfte lassen sich wie folgt formulieren:
π
FA = ⋅ ∆ρ ⋅ g ⋅ d b3  Gl. 6.23
6
Fσ = π ⋅ d P ⋅ σ  Gl. 6.24
Kapitel 6 · Bioreaktoren
179 6

V 2 Der Korrelationsfaktor f ist eine Funktion der Rey-


FT = 1, 3 ⋅ ρL ⋅  G, P   Gl. 6.25 noldszahl der aufsteigenden Gasblasen Reb = uB ·
 d b  db/vl und beträgt f = 0,95 bei Reb > 103 [111].
VG, P Weitere Bestimmungsgleichungen zur Abschät-
Fη = 15 ⋅ η ⋅  Gl. 6.26 zung des Sauerstofftransportkoeffizienten kLa insbe-
db
sondere auch bei heterogener Gasblasenströmung
finden sich beispielsweise in [28, 88, 111]. Zusam-
wobei Δρ die Dichtedifferenz zwischen Gas und menfassend lässt sich feststellen, dass der Sauerstoff-
Flüssigkeit darstellt, dP den Porendurchmesser des transportkoeffizienten kLa sowohl im homogenen,
statischen Begasers, σ die Grenzflächenspannung als auch heterogenen Blasenströmungsbereich mit
zwischen Flüssigkeit und Gas, ρL die Dichte der Flüs- zunehmender Gasleerrohrgeschwindigkeit zunimmt:
sigkeit, V G,P den Gasvolumenstrom in der Pore und
η die dynamische Viskosität der Flüssigkeit. kLa = C ⋅uG n  Gl. 6.30
Der Gasvolumenstrom durch die Poren des sta-
tischen Begasers V G,P ist über eine Massenbilanz Insbesondere die Art des (statischen) Gasverteilers
als Funktion der Porosität εP des Gasverteilers, der und die Stoffeigenschaften bestimmen die je nach
Querschnittsfläche A des Begasers, des mittleren Anwendungsfall unterschiedlichen Proportionali-
Porendurchmessers dP und des gesamten Gasvolu- tätskonstanten C und den Exponenten n (0,7 < n <
menstroms V zugänglich: 0,92) [88].
Die Sauerstoffeintragsrate OTR lässt sich nur
π bei Kenntnis der in der Regel von der Reaktorhöhe
VG ⋅ ⋅ d P 2
VG,P = 4  Gl. 6.27 abhängigen Sauerstoffkonzentrationen in der Gas-
A ⋅ εP phase und in der Kernströmung der Flüssigphase
durch Integration über die Höhe der Flüssigkeits-
In koaleszierenden Systemen wird der Blasendurch- säule berechnen (siehe auch 7 Abschn. 3.6).
messer nicht mehr alleine durch den Primärblasen-
durchmesser bestimmt, sondern es stellt sich bei
ausreichender Höhe der Flüssigkeitssäule ein Gleich- 6.2.4 Homogenisieren
gewichtsblasendurchmesser db* ein, der bei homo-
gener Blasenströmung der größten stabilen Einzel- In Blasensäulenreaktoren steigen größere Gasblasen
blase entspricht [88]: bevorzugt in der Säulenmitte auf, sodass sich insbe-
sondere mit zunehmenden Gasleerrohrgeschwindig-
6 ⋅ σ keiten ein ausgeprägtes Strömungsprofil der Flüssig-
d b* =  Gl. 6.28
∆ρ ⋅ g phase als Funktion des Radius ausbildet. Aufgrund
des in der Säulenmitte höheren Gasgehalts und damit
Der Sauerstofftransportkoeffizient kLa kann bei geringerer mittlerer Dichte, kommt es zur Rückströ-
Kenntnis des mittleren Blasendurchmessers d b mung von Flüssigkeit in den wandnahen Bereichen
(Gl. 6.22 ff) oder db* (Gl. 6.28), der Blasenaufstiegs- (Prinzipskizze siehe . Abb. 6.17). Hierdurch kommt
geschwindigkeit u B ( Gl. 6.18), des Gasanteils ε G es zur Ausbildung von Zirkulationszellen entlang
(Gl. 6.17), des binären Diffusionskoeffizienten von der Reaktorhöhe, deren Höhe bei schlanken Blasen-
Sauerstoff in der Flüssigphase Do /W und eines säulenreaktoren oder innerhalb begaster Leitrohre
2
dimensionslosen Korrelationsfaktors f wie folgt bei Gaslift-Reaktoren etwa dem Durchmesser ent-
beschrieben werden [169]: spricht. Die Zirkulationsgeschwindigkeiten hängen
dabei wesentlich von der Gasleerrohrgeschwindig-
  D keit, dem Gasgehalt und der Viskosität der Flüssig-
 2 u ⋅d O /W 6 ⋅ ε
kLa = 2 + f ⋅ ⋅ B b  ⋅ 2 ⋅ phase ab.
 π DO / W  d b db
2 Eine stark vereinfachte Abschätzung von Kon-
 Gl. 6.29 zentrationsgradienten entlang der Wassersäule in
 180 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
Blasensäulenreaktoren beruht auf der Ausprägung
dieser Zirkulationszellen [28]. Bei dem resultieren-
den Zirkulationszellenmodell (siehe .  Abb. 6.17)
werden sowohl die Flüssigphase, als auch die Gas-
phase in jeder Zirkulationszelle als ideal durch-
mischt angenommen. Das Volumen der Zirkula-
tionszellen und der Gasgehalt werden ebenfalls als
konstant betrachtet. Darüber hinaus werden kons-
tante Austauschströme zwischen den einzelne Zir-
kulationszellen sowohl für die Flüssigphase als auch
für die Gasphase angenommen. Damit wird ein
Differentialgleichungssystem 1. Ordnung (Kaska-
dierung von idealen Rührkesselreaktoren) erhalten
6 (siehe 7 Abschn. 3.8.2). Die unbekannten Rücklauf-
ströme zwischen den einzelnen Zirkulationszel-
len sowohl für die Flüssig-, als auch die Gasphase
müssen über Tracermessungen identifiziert werden.
Da diese stark vereinfachte aus der Beobachtung
von Zirkulationszellen abgeleitete Betrachtung nur
zu diskreten, mittleren Stoffkonzentrationen in jeder
der hintereinander geschalteten als ideale Rührkes-
selreaktoren betrachteten Zirkulationszellen führt,
werden Blasensäulenreaktoren in der Regel mit
Hilfe von Dispersionsmodellen beschrieben (siehe
7 Abschn. 3.6). Die hierfür benötigten axialen Dis-
persionskoeffizienten sind für Flüssigphase und Gas-
phase unterschiedlich. Beide hängen primär von der
Gasleerrohrgeschwindigkeit uG ab:
D E
. Abb. 6.17  Prinzipskizze (a) zur Flüssigkeitsströmung und (b) zur Ausbildung von Zirkulationszellen in einer Blasensäule,
sowie (c) zum daraus abgeleiteten Zirkulationszellenmodell (G Gasphase, L Flüssigphase, Erläuterungen siehe Text)
Dax ~ uG m  Gl. 6.31
Zusammenstellungen von Beziehungen zur Abschät-
zung axialer Dispersionskoeffizienten in Blasen-
säulen- und Gaslift-Reaktoren sowohl für die Flüs-
sigphase als auch für die Gasphase finden sich
beispielsweise in [30, 92, 149].
6.2.5 Maßstabsvergrößerung
Die oben genannten, möglichst in Technikums- oder
Pilotversuchen identifizierten Dispersionsmodelle
können direkt zur Maßstabsvergrößerung von Bla-
sensäulen- und Gaslift-Reaktoren genutzt werden.
Auf die Durchführung von Technikums- oder Pilot-
versuche kann in der Regel nicht verzichtet werden,
da Gasgehalt und Stofftransport gasförmig-flüssig
ganz wesentlich von den Stoffeigenschaften, ins-
besondere dem Fließverhalten der Flüssigphase
und der Grenzflächenspannung gasförmig-flüs-
sig abhängen. Beide Stoffeigenschaften verändern
sich oftmals sehr stark bei der biologischen Umset-
zung. Auch die ereignisgesteuerte Zugabe von Anti-
schaummitteln während der biologischen Reaktion
führt zu dynamischen Veränderungen insbesondere
der Grenzflächenspannung.
F
Kapitel 6 · Bioreaktoren
Aufgrund der geringen Wasserlöslichkeit von
Sauerstoff ist bei aeroben Prozessen bei der Maß-
stabsvergrößerung mit Hilfe von Simulationsstudien
in besonderem Maße zu prüfen, ob am Kopf des Bla-
sensäulenreaktors noch genügend Sauerstoff in der
Flüssigphase vorhanden ist. Aufgrund des hydro-
statischen Drucks ist die Sauerstofflöslichkeit an der
Phasengrenze gasförmig-flüssig am Boden des Bla-
sensäulenreaktors hoch, sodass eine schnelle Ver-
armung der Gasphase an Sauerstoff beim Aufstieg
durch den Blasensäulenreaktor erfolgen kann (siehe
. Abb. 6.18).
Bei Gaslift-Reaktoren verlängert sich darüber
hinaus bei der Maßstabsvergrößerung die hydraulische
Verweilzeit im Rücklauf, sodass geringe Sauerstoff-
konzentrationen am Kopf des Reaktors zu Sauerstoff-
limitierungen im Rücklauf führen können. Darüber
hinaus ist mit Hilfe von Simulationsstudien unter
Zuhilfenahme von Dispersionsmodellen besonders bei
Substrat-limitierten Prozessen zu prüfen, wie groß die
Konzentrationsgradienten im technischen Blasensäu-
len- beziehungsweise Gaslift-Reaktor werden können.
Um die Auswirkungen auf den Produktionsprozess
. Abb. 6.18  Sauerstoffkonzentrationen in der Flüssigphase
(rot) und an der Phasengrenze gasförmig-flüssig (schwarz)
in einem Gaslift-(Airlift-)Umlaufreaktor als Funktion der
Reaktorhöhe H (Flüssigkeitssäule). Die Linien stellen
die Sättigungskonzentrationen bei dem angegebenen
Sauerstoffgehalt der Gasphase dar (Henry-Konstante für
Sauerstoff KH(O2) = 1,148 mol m–3 bar–1 bei T = 30 °C)
181 6
(Ausbeuten und Produktkonzentrationen) realistisch
darstellen zu können, müssen die mit dem Disper-
sionsmodell verwendeten kinetischen Ansätze (siehe
7 Kap. 2) ausreichend aussagekräftig sein.
Der homogene Leistungseintrag in Blasensäu-
len-Reaktoren wiederum hat unmittelbare Aus-
wirkungen auf morphologisch veränderliche bio-
logische Systeme. Wiebe berichtet beispielsweise
von einem Prozess zur Herstellung von Mycopro-
teinen für die menschliche Ernährung als Fleisch-
ersatz mittels des Ascomycen Fusarium venena-
tum [178]. Moor et al. beschreiben die Kultivierung
dieses Pilzes in einem 150 m3 Gaslift-Reaktor [114].
Da die durch aufsteigende Pressluftblasen erzeugte
Konvektion wesentlich geringere Scherkräfte indu-
ziert als ein Rührkesselreaktor und der Prozess
kontinuierlich betrieben wird, bleiben die Hyphen
dieses filamentösen Pilzes lang. Um einer möglichen
genetischen Veränderung vorzubeugen wird nach
etwa 1000 Betriebsstunden der Produktionsprozess
unterbrochen und der Gaslift-Schlaufenreaktor
mit neuen Reinkulturen von Fusarium venenatum
beimpft. Auf diese Weise können bis zu 300 kg h–1
Biomasse in diesem Gaslift-Reaktor erzeugt werden.
Dieses Produkt wird nach thermischer Behand-
lung zur Reduktion des RNA-Gehaltes von 10 % auf
unter 2 % unter dem Handelsnahmen QuornTM vor
allem in den USA, Frankreich, England und Schweiz
verkauft.
6.3 Bioreaktoren mit
Leistungseintrag über Kreislauf
mit Pumpe
Bei Festbett-, Fließbett-, vielen Membran- und auch
Fotobioreaktoren erfolgt der Energieeintrag im
Wesentlichen durch eine oder mehrere Pumpen,
die das Reaktionsmedium im Kreislauf transportie-
ren. Die Kreislaufführung des flüssigen Reaktions-
mediums ermöglicht dabei oftmals die einfache
Integration von zusätzlichen Funktionen wie Wär-
metauscher zur Temperaturkontrolle oder Mess-
und Regelstrecken zur pH-Kontrolle des Reak-
tionsmediums in den Kreislauf. Die grundlegenden
Eigenschaften von Bioreaktoren mit Leistungsein-
trag über einen Kreislauf mit Pumpe werden in den
folgenden Unterkapiteln dargestellt, wobei auch
 182 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
jeweils Bioreaktorvarianten mit berücksichtigt
werden, bei denen der Leistungseintrag verstärkt
über mechanisch bewegte Einbauten (Rührkessel)
oder durch eine Expansion der Gasphase erfolgt
(Blasensäulen).
6.3.1 Festbett-/Fließbettreaktoren
Festbett- und Fließbettreaktoren sind in der Regel
zylindrische Reaktionsapparate, bei denen fluide
Phasen katalytisch aktive Feststoffe umströmen,
die durch das Fest- oder Fließbett gepumpt werden
6 (Prinzipskizzen siehe . Abb. 6.19). In der Biotech-
nologie werden hierzu Biokatalysatoren (Enzyme
oder Zellen) auf oder in Trägermaterialien immobi-
lisiert. Im Festbettreaktor liegt eine feste Packung von
umströmten Trägermaterialien vor, die ihre Position
im Reaktor nicht verändern. Bei Fließbettreaktoren
wird die Anströmung der Trägermaterialien durch
die fluide Phase so groß, dass die Trägerpartikel
nicht mehr als feste Packung vorliegen, sondern im
anströmenden Fluid schweben (die Sinkgeschwin-
digkeit ist gleich der Anströmgeschwindigkeit) und
damit ihre feste Position im Reaktor verlieren. Fest-
bettreaktoren werden industriell hauptsächlich bei
enzymatischen Prozessen (siehe 7 Kap. 10) und bei
der biologischen Abwasserbehandlung als anaerobe
. Abb. 6.19  Prinzipskizzen zu (a) Festbett-, (b) Festbettumlauf- und (c) Fließbettreaktoren, bei denen das wässrige
Reaktionsmedium in der Regel die kontinuierliche fluide Phase darstellt, sowie (d) Tropfkörperreaktoren mit der Gasphase
als kontinuierliche Phase (Festbett- und Festbettumlaufreaktoren können prinzipiell auch von oben nach unten durchströmt
werden)
Festbettumlauf- und Fließbettreaktoren oder Tropf-
körperreaktoren eingesetzt (siehe 7 Kap. 11).
Entsprechend vielfältig sind die verwendeten
Trägermaterialen zur Immobilisierung von Bioka-
talysatoren. Während bei enzymatischen Prozessen
poröse sphärische Partikel aus unterschiedlichs-
ten Materialien mit Durchmessern von 0,2–1 mm
mit großer innerer Oberfläche zur Anbindung von
Enzymen zum Einsatz kommen (siehe 7 Abschn.
10.2), werden zur Immobilisierung von Mikroorga-
nismen oder Zellen (Biofilmbildung) entweder Füll-
körper oder Wickelelemente aus unterschiedlichen
Kunststoffmaterialien oder anorganische Materia-
lien wie Sand, Lavaschlacke oder Sinterkeramiken
verwendet (siehe . Abb. 6.20). Kann die Immobi-
lisierung von Biokatalysatoren nur an der äußeren
Oberfläche beispielsweise von Füllkörpern oder
Sandpartikeln erfolgen, wird dies auch als ‚2-dimen-
sional‘ bezeichnet, während die Immobilisierung bei
porösen Trägermaterialien wie beispielsweise Sinter-
keramiken ‚3-dimensional‘ genannt wird.
Wesentliche Bauelemente sind bei Festbett- und
Fließbettreaktoren neben der Pumpe zum Trans-
port der fluiden Phase der Flüssigkeitsverteiler am
Boden und der Trägermaterial- und gegebenenfalls
Gasabscheider am Kopf des Reaktors. Der Flüssig-
keitsverteiler muss sicherstellen, dass die Flüssig-
phase homogen über die gesamte Querschnittsfläche
Kapitel 6 · Bioreaktoren
. Abb. 6.20  Beispiel für ein „2-dimensionales“
Trägermaterial (a) Füllkörper (Polymerer Aufwuchsträger,
mit freundlicher Genehmigung der RVT Process Equipment
GmbH) und für ein „3-dimensionales“ Trägermaterial (b)
Sinterkeramik zur Immobilisierung von Mikroorganismen
über Biofilmbildung, sowie (c) Pore der Sinterkeramik gefüllt
mit Bakterien
183 6
des meist zylindrischen Behälters verteilt wird, um
radiale Inhomogenitäten zu vermeiden. Darüber
hinaus muss der Flüssigkeitsverteiler mechanisch
sicherstellen, dass bei Unterbrechung der Flüssig-
keitszufuhr und damit fehlender Durchströmung
kein (disperses) Trägermaterial aus der Schüttung
austreten kann. Eine Aufweitung des zylindrischen
Behälters am Kopf des Fließbettreaktors (siehe bei-
spielsweise . Abb. 6.19c) ist in der Regel zur Träger-
materialabscheidung ausreichend, da hierdurch die
Anströmgeschwindigkeit disperser Träger reduziert
und damit deren Sinkgeschwindigkeit größer als die
Auftriebsgeschwindigkeit wird.
Bei homogener Flüssigkeitsverteilung über die
gesamte Querschnittsfläche am Boden des Fest-
bett(umlauf )- oder Fließbettreaktors bilden sich
axiale Gradienten der an und in den Trägermateria-
lien mit immobilisierten Biokatalysatoren verbrauch-
ten Substrate und gebildeten Produkte, sowie gege-
benenfalls des pH in der Kernströmung des Reaktors
aus. Die axiale Gradientenbildung kann in manchen
Fällen reaktionstechnisch unvorteilhaft sein, sodass
dann versucht werden sollte, diese durch intensi-
vere Kreislaufführung der fluiden Phase, also Erhö-
hung des Leistungseintrags über den Kreislauf mit
Pumpe zu reduzieren (Wechsel vom Festbett- zum
Festbettumlauf-Reaktor).
Die biokatalytische Umsetzung findet in der
Regel nur im Trägermaterial mit den immobilisierten
Biokatalysatoren statt. Stofftransport und Reaktion
im Trägermaterial oder Biofilm ist in 7 Abschn. 3.7
beschrieben (Wirkungsgrad η und Thiele-Modul Φ),
der Stofftransport aus der Kernströmung zur Ober-
fläche des Trägermaterials in 7 Kap. 5 (Sherwood-
zahl Sh). Die Abhängigkeit des Wirkungsgrads oder
Biokatalysatornutzungsgrads η von Φ2 und Sh ist in
. Abb. 6.21 für kugelförmige poröse Trägerpartikel
mit immobilisierten Biokatalysatoren für eine ein-
fache Sättigungskinetik bei verschiedenen Substrat-
konzentrationen in der Kernströmung gezeigt.
Um den in der Regel teuren immobilisierten
Biokatalysator möglichst gut auszunutzen, sollte
der Wirkungsgrad η möglichst im gesamten Fest-
bett- oder Fließbettreaktor trotz axial unterschiedli-
cher Substratkonzentrationen in der Kernströmung
möglichst hoch sein. Mit abnehmender Substrat-
konzentration in der Kernströmung ist dies prin-
zipiell nur bei verringertem Thiele-Modul Φ und/
 184 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
. Abb. 6.21  Wirkungsgrad η als Funktion des Thiele-
6 Modul2 Φ2 für kugelförmige Trägerpartikel mit in den Poren
immobilisierten Biokatalysatoren (Enzyme oder Zellen)
mit einfacher Sättigungskinetik bei unterschiedlichen
Substratkonzentrationen in der Kernströmung (rot cS = KS,
schwarz cS = 10 · KS, grau cS = 100 · KS) und unterschiedlicher
Umströmung der Trägerpartikel (durchgezogene Linien Sh
= 2, gestrichelte Linien Sh = 80). Auf der rechten Seite ist das
Substratkonzentrationsprofil bei umströmten kugelförmigen
Trägerpartikeln als Funktion des Radius bei geringem
Wirkungsgrad η skizziert
oder erhöhter Sherwoodzahl Sh also erhöhter Über-
strömgeschwindigkeit der Trägerpartikel möglich.
Da Φ ~ R bei kugelförmigen Trägerpartikeln mit
dem Radius R gilt (siehe Gl. 3.89), kann Φ durch
kleinere Trägerpartikel an niedrige Substratkonzen-
trationen in der Kernströmung angepasst werden.
Eine Erhöhung von Sh bedeutet gleichzeitig eine
Verringerung axialer Substratgradienten in der
Kernströmung, sodass ein Festbettumlauf- oder
Fließbettreaktor zu einem immer größeren Teil
des Reaktors unter Auslaufbedingungen betrieben
wird. Damit legt der gewünschte Substratumsatz
den Durchmesser der zu wählenden Trägerparti-
kel fest.
Die Anströmgeschwindigkeit der Trägerparti-
kel mit dem Durchmesser dP und damit Sh lässt sich
im Betrieb eines Festbett-/Fließbettreaktors mit dem
Durchmesser dR jedoch nur soweit steigern, bis die
stationäre Sinkgeschwindigkeit des Trägerpartikel-
kollektivs v erreicht ist [130]:
v =vS ⋅10−dP / dR ⋅ ε n  Gl. 6.32
v ist direkt proportional zur stationären Sinkge-
schwindigkeit eines einzelnen Trägerpartikels v S.
Bekanntermaßen lässt sich die Sinkgeschwindigkeit
einer Einzelkugel über eine Kräftebilanz ermitteln:
4 ⋅ g ⋅∆ρ ⋅ d P
vS=  Gl. 6.33
3⋅ cW ⋅ρL
wobei Δρ die Dichtedifferenz zwischen Fluid und
Trägerpartikel darstellt, ρL die Dichte der fluiden
Phase und cW­ den Widerstandsbeiwert.
Der Widerstandsbeiwert c W ist von der Rey-
noldszahl der umströmten Einzelkugel Red abhän-
gig und kann für 0 < Red < 2 · 105 wie folgt berechnet
werden [148]:
24 4
cW = + + 0, 4  Gl. 6.34
Red Red
v ist weiterhin proportional zur Porosität des Fließ-
betts εn (siehe Gl. 6.32), wobei der Expansionsindex
n erneut von Red abhängt [115]:
n = 4, 45 ⋅ Red−0,1 (1 < Red ≤ 500)  Gl. 6.35
Der qualitative Zusammenhang zwischen Anström-
geschwindigkeit der Trägerpartikel (Leerrohrge-
schwindigkeit u = v) und der Porosität des Festbett-/
Fließbettreaktors ist in . Abb. 6.22 gezeigt. Hier wird
deutlich, dass Gl. 6.32 erst anwendbar ist, wenn das
Festbett durch die zunehmende Leerrohrgeschwin-
digkeit u so weit aufgelockert ist, dass die Trägerpar-
tikel sich in der Fluidströmung frei bewegen können.
Die Bestimmung der Porosität ε eines Fließbett-
reaktors als Funktion der Leerrohrgeschwindigkeit u
hat große praktische Bedeutung bei Auslegung und
Betrieb, da hierdurch die maximal einzubringende
Menge an Trägermaterial mit immobilisierten Bioka-
talysatoren bei vorgegebenen Reaktorvolumen fest-
gelegt wird. In der Regel muss zur Bestimmung von
ε die Abweichung der Einzelpartikel von der Kugel-
form, die Veränderung der Dichtedifferenz Δρ und
des Partikeldurchmessers dP bei Biofilmbildung ins-
besondere auf der Oberfläche von Trägerpartikeln
(‚2-dimensionale‘ Biofilmbildung) und gegebenen-
falls eine disperse Gasphase berücksichtigt werden.
Vorteile des Fließbettreaktors gegenüber dem Fest-
bett(umlauf)reaktor sind in der Regel bei der Immo-
bilisierung von Mikroorganismen (Biofilmbildung)
die Erzielung weitaus höhere Raum-Zeit Ausbeuten
Kapitel 6 · Bioreaktoren
. Abb. 6.22  Porosität ε einer
Trägerpartikelschüttung als Funktion der
Leerrohrgeschwindigkeit u. Mit zunehmender
Leerrohrgeschwindigkeit wird das Festbett (Porosität
der Schüttung ~ 0,4) zunächst aufgelockert, bevor aus
dem Festbett ein Fließbett wird, dessen Porosität mit
zunehmender Leerrohrgeschwindigkeit entsprechend
Gl. 6.32 (rote Linie) zunimmt
(volumetrische Produktivitäten) aufgrund des ver-
besserten Stofftransports aus der Kernströmung und
der Vermeidung von Biofilmbildung auf und zwischen
den Trägermaterialien und damit der Unterbindung
von Totzonen durch Inhomogenitäten (Kanalbil-
dung). Auch können feststoffhaltige Medien verwen-
det werden und das intermittierende Ausspülen von
akkumulierenden Biofilmen zwischen den Trägerma-
terialien in der Festbettschüttung ist nicht erforder-
lich. Erkauft werden höhere Raum-Zeit Ausbeuten
in Fließbettreaktoren (niedrigere Investitionskosten)
allerdings durch einen weitaus höheren Energieein-
trag im Vergleich zu Festbettreaktoren (niedrigere
Betriebskosten). In Trägermaterialien immobilisierte
Enzyme – hier tritt keine Biofilmbildung auf – werden
daher üblicherweise in Festbettreaktoren eingesetzt
(siehe beispielsweise 7 Abschn. 10.2.2).
6.3.2 Membranbioreaktoren
In 7 Kap. 2 war darauf hingewiesen worden, dass
sowohl hohe Substrat-, als auch hohe Produktkon-
zentrationen die Produktbildung hemmen können.
In 7 Kap. 3 wurden zur Lösung dieser Probleme das
Zulaufverfahren (engl. fed-batch) zur Überwindung
der Substratüberschussinhibierung und das kon-
tinuierliche Verfahren ohne und mit Verweilzeit-
entkopplung von Biokatalysator und Reaktions-
medium vorgestellt. Zur Rückhaltung des gelösten
185 6
oder suspendierten Biokatalysators (Enzyme oder
Zellen) im Bioreaktor eignen sich insbesondere
Membranverfahren. Da Membranen ausführlich
erst in 7 Kap. 9 behandelt werden, wird hier im Vor-
griff die Membran definiert als flächiges Gebilde, das
die einzelnen Komponenten einer Suspension oder
eines Flüssigkeitsgemisches selektiv permeieren lässt.
Sie kann im Bioreaktor intern oder extern integriert
werden.
Grundsätzlich ist die Integration von Memb-
ranen zur Rückhaltung von Biokatalysatoren (B)
bzw. zum Produktaustrag in jeder Art von Bioreak-
toren möglich. Bezogen auf die beiden Idealtypen
Rührreaktor (STR) und Rohrreaktor (PFR) sind in
.  Abb. 6.23 die „Ersatzschaltbilder“ für den STR
(oben) und den PFR (unten) einmal mit interner
(links) – auch als „getauchte Membranen“ bezeich-
net – und einmal mit externer (rechts) Membran-In-
tegration dargestellt.
. Abb. 6.24 zeigt ein Beispiel mit intern integrier-
ter Membran. In einem als Blasensäule betriebenen
Bioreaktor sind keramische Mikrofiltrations-Flach-
membranen integriert, die den kontinuierlichen oder
zyklischen Produktaustrag ermöglichen sollen. Diese
Anordnung wurde erfolgreich für die Produktion
von rekombinanten Lipasen mittels Pichia pastoris
verwendet [99].
Allerdings beobachtete der Autor eine
durch Ablagerungen auf der Membran (sogen.
Mem­b ranfouling) verursachte Abnahme der
 186 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
6XEVWUDW 6XEVWUDW
3URGXNWH
3URGXNWH
6XEVWUDW
. Abb. 6.23  Ersatzschaltbilder für einen ideal gerührten Reaktor (oben) und Rohrreaktor (unten), mit intern integrierter
Membran (links) und externer Membran (rechts). B = Biokatalysator
Permeabilität. Das bedeutet, der transmembrane
Fluss nimmt bei konstanter Druckdifferenz mit
zunehmender Betriebsdauer ab. Eine zyklische
Umkehr der Strömungsrichtung (reverse flow) – die
man auch dazu nutzte, dem Bioreaktor steril Medium
zuzuführen – verbessert die Situation nur vorüber-
gehend, weil die relativ dicke keramische Stützstruk-
tur der Membran sich ebenfalls durch Ablagerungen
zusetzte. Eine dann notwendige chemische Reini-
gung der Membran war nur nach Stillsetzung des
Bioreaktors möglich. Auch ist die Maßstabsvergrö-
ßerung begrenzt durch die Tatsache, dass das Reak-
torvolumen mit der dritten Potenz, die Membran-
oberfläche aber nur mit der zweiten Potenz wächst.
Carstensen et al. [23] empfehlen stattdessen die
Integration von Hohlfasern in den Bioreaktor und
stellen in diesem Zusammenhang die sogen. „Revers-
flow-Diafiltration“ (RFD) vor [96]. Das Prinzip ist in
. Abb. 6.25 schematisch dargestellt. Das Verfahren
empfiehlt sich besonders für schersensitive Biokata-
lysatoren und soll am Beispiel der Produktion von
3URGXNWH
6XEVWUDW
3URGXNWH
Antikörpern mittels einer CHO-Zelllinie erläutert
werden [108].
Die im Bioreaktor integrierte Mikrofiltrations-
Membran dient abwechselnd der Substratzufuhr
und dem Produktaustrag. Um dabei möglichst wenig
Produkt zu verlieren, wird vor dem Umschalten von
Substratzufuhr auf Produktaustrag die Pumpe P 1
kurzfristig auf Rücklauf gestellt. Die Pumpe P2 wirkt
dabei wie ein geschlossenes Ventil, sodass das Totvo-
lumen der Membran in den Substrattank zurückge-
führt wird. Analog verfährt man beim Umschalten
von Produktaustrag auf Substratzufuhr, wo kurz-
fristig beide Pumpen laufen, bevor nach Stoppen
der Pumpe P1 der Unterdruck zum Absaugen von
Produkt wieder aufgebaut wird. Wird ein kritischer
Permeatfluss von 9 L m–2 h–1 nicht überschritten,
so setzt sich die Membran nicht zu, kann also län-
gerfristig betrieben werden. Schon beim Einsatz von
Membranen für die künstliche Niere war beobach-
tet worden [11], dass bei der Hämodialyse und der
Hämodiafiltration – wenn ein kritischer Fluss nicht
Kapitel 6 · Bioreaktoren
. Abb. 6.24  Bioreaktor mit integrierten keramischen
Mikrofiltrations-Flachmembranen
. Abb. 6.25  Schema eines
Bioprozesses mit Revers-flow
Diafiltration zur Substratzufuhr und
Produktentfernung mittels intern
integrierter Membran
187 6
überschritten wird – das Membranfouling geringer
ist, als z. B. bei der Plasmapherese. Grund dafür ist
offensichtlich die Tatsache, dass bei den beiden erst-
genannten Prozessen beidseits der Membran eine
wässrige Lösung oder Zellsuspension strömt und die
damit verbundenen Stoffströme senkrecht zur Mem-
branfläche die Foulingneigung reduzieren. Aller-
dings wurden bei den Untersuchungen von Meier
et al. [108] nur ca. 50 % der produzierten Antikörper
ausgetragen. Hier könnten nach Ansicht der Autoren
Membranen mit geringerem Rückhalt für Proteine
die Ausbeute verbessern.
Carstensen et al. [146] nutzten die interne RFD
zur kontinuierlichen Produktion von Itaconsäure
mittels Ustilago maydis in einem 2-L-Rührkesselre-
aktor. Über eine Fermentationszeit von 50 Stunden
wurden 4 g L–1 Itaconsäure bei einem Trockenzell-
gewicht von ca. 35 g L–1 produziert. Dies war etwa
10-mal höher als ohne Zellrückhaltung. Allerdings
konnten nur etwa 60 % des Produkts ausgetragen
werden, was auf ein Membranfouling zurückgeführt
wurde. Der Pilz Ustilago maydis ist dafür bekannt,
dass er auch grenzflächenaktive Biopolymere pro-
duziert, die die Membran verblocken.
In solchen Fällen sollte die externe Membranin-
tegration angewandt werden (. Abb. 6.26), die eine
definierte Überströmung, die zyklische Rückspülung
mit erhöhtem Druck und eine gelegentliche chemi-
sche Reinigung der Membran ermöglicht, ohne den
Bioprozess unterbrechen zu müssen. Auch ist diese
Verfahrensweise variantenreicher. Sie reicht von der
%LRUHDNWRU
0HGLHQ
NRPSRQHQWHQ
6XEVWUDW 3HUPHDW
WDQN 3XPSH WDQN
3URGXNW
DXIDUEHLWXQJ
3XPSH 0HPEUDQPRGXO
%OHHG
 188 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
einfachen Biomasserückhaltung mittels Mikrofiltra-
tionsmembran, wie in . Abb. 6.26 gezeigt, über Ultra­
filtration, Pervaporation bis zur Pertraktion (siehe
7 Kap. 9).
Der Vollständigkeit halber soll hier noch der
Einsatz von Membranen in der biologischen Abwas-
serreinigung erwähnt werden. Beim sogenannten
Membranbelebungsverfahren werden Membranen –
zur Erhöhung der Biomassekonzentration oder zur
Nachklärung – sowohl integriert als auch extern ein-
gesetzt (siehe 7 Kap. 11, Abb. 11.12b).
Petrinic und Helix-Nielsen [4] schlagen den
Membranbioreaktor sogar für die kombinierte
6 anaerobe/aerobe Reinigung von Textilabwässern
vor. Deren besonders hohes Fouling-Potential soll
durch die Verwendung einer besonders dünnen
Umkehrosmose-Membran im sog. forward-osmo-
se-Betrieb reduziert werden. Dabei wird der Trans-
port des gereinigten Wassers dadurch erzielt, dass auf
der Permeatseite der Membran eine verdünnte Salz-
lösung (z. B. Meerwasser) geführt wird. Der dadurch
entstehende osmotische Differenzdruck reicht nach
Ansicht der Autoren für den Abtransport des gerei-
nigten Wassers. Für weitere Beispiele zur Anwen-
dung des MBR in der Abwasserreinigung siehe [86].
6.3.3 Fotobioreaktoren
Clemens Posten
Fotobioreaktoren werden zur Kultivierung von Mi­
kroalgen eingesetzt. Darunter werden allgemein ver-
schiedene Gruppen photosynthetischer ein- oder
0)
0HPEUDQ
3URGXNW
:7
HO
%LRUHDNWRU
. Abb. 6.26  Bioreaktor mit externer Membranintegration.
WT = Wärmetauscher, MF = Mikrofiltration
mehrzelliger Mikroorganismen verstanden. Dazu
zählen mehrere grundsätzlich verschiedene Gruppen
eukaryotischer Organismen, aber auf Grund ihrer
Wuchsform auch prokaryotische Cyanobakterien.
Hochwertprodukte aus Algen sind beispielsweise
Carotinoide wie Astaxanthin, mehrfach ungesättigte
Fettsäuren und andere Lipide, Polysaccharide sowie
Vitamine und Proteine. Neben hochpreisigen Feinche-
mikalien wird auch die Nutzung von Algen zur Erzeu-
gung von Lebensmitteln, Grundchemikalien und zur
Energiegewinnung diskutiert und erforscht. Die Pro-
duktion von Bioenergie mit positiver Energiebilanz
wird bislang jedoch kontrovers diskutiert und hängt
stark vom Gesamtsystem ab (beispielsweise Nutzung
von industrieller Abwärme, von CO2-Abgasen oder
von Abwasserströmen für die Nährstoffversorgung).
Gegenüber Landpflanzen haben Mikroalgen verschie-
dene Vorteile wie die stöchiometrisch hohen Anteile
an verwertbaren Produkten und die hohen auf das ein-
fallende Licht bezogenen Ausbeuten. Weiterhin wird
lediglich unbegrenzt verfügbares Salzwasser benötigt.
Von den bisher behandelten Bioreaktoren unter-
scheidet sich der Fotobioreaktor dadurch, dass für die
Versorgung des Biokatalysators zusätzlich Licht benö-
tigt wird. Statt des Sauerstoffeintrags wird Kohlenstoff-
dioxid über eine Gasphase eingetragen und Sauerstoff
abgeführt. Der Fotobioreaktor kann also als ein Vier-
phasensystem verstanden werden, mit den Zellen als
feste partikuläre Phase, dem Medium als flüssige Phase,
den Blasen als Gasphase und dem Licht als vierte Phase,
wobei das Strahlungsfeld des Lichtes die drei anderen
Phasen überlagert. Der Fotoreaktor muss die Umge-
bungsbedingungen wie Licht und CO2 in geeignete
Bedingungen für das Algenwachstum transformie-
ren. Dabei sind sowohl die stöchiometrisch benötigte
Menge als auch die durch Wachstumskinetiken vorge-
gebenen Konzentrationen zu betrachten.
Für die Auslegung von Fotoreaktoren müssen
sowohl für den Lichteintrag als auch für den Gasein-
trag spezifische Zusammenhänge betrachtet werden,
wie in . Abb. 6.27 dargestellt. Das auf die Reaktorober-
fläche fallende Licht wird von den ersten Algenschich-
ten absorbiert bzw. gestreut, wodurch es zu Gradienten
entlang der Lichteintrittsrichtung kommt und damit
zur Lichtlimitierung im dem Licht entgegengesetzten
Teil des Reaktors. Zur Einsparung von Mischenergie
wird der Reaktor nur gering im laminaren Bereich
begast. Es entstehen dadurch Gradienten der Gelöst-
gaskonzentrationen entlang der Gaseintragsrichtung.
Kapitel 6 · Bioreaktoren
. Abb. 6.27  Die wichtigsten
Stoff- und Energieströme in einem
Fotobioreaktor und die dadurch
entstehenden spezifischen Probleme
Kinetische Grundlagen
Zum Wachstum benötigen Algen Licht, Kohlen-
dioxid und Nährsalze in wässrigem Medium. Sie
nehmen anorganisch gelöstes CO2 aus dem Medium
auf. Die genaue CO2-Spezies (CO2, HCO3–, CO32–)
differiert je nach Algengruppe oder ist nicht genau
geklärt. Für die Prozessführung ist die einzutra-
gende Gesamtmenge an Kohlenstoffdioxid zu klären
sowie die aufrecht zu erhaltende Konzentration im
Medium, um der Algenzelle eine kinetisch nicht limi-
tierte Aufnahme zu ermöglichen (Vermeidung von
Stofftransportlimitierungen). Der Kohlenstoffgehalt
von Algen beträgt etwa 50 Gewichtsprozent. Je nach
Anteilen von Kohlenhydraten oder Ölen in der Bio-
masse ergibt sich ein Wert von 1,5–2,5 kg CO2/kg
Biomasse. Genaue Aufnahmekinetiken sind nicht
bekannt, jedoch liegt die Sättigungskonzentration
im Bereich von 1 kPa CO2-Partialdruck, also deut-
lich über dem Partialdruck in der Atmosphäre. Zum
Erreichen dieser Partialdrücke werden beispielsweise
5 % CO2 im zugeführten Gas benötigt.
Wie alle Organismen brauchen Mikroalgen
Mineralstoffe einerseits zum Aufbau der Biomasse
und andererseits zur Aufrechterhaltung des extra-
zellulären Milieus. Der Bedarf ergibt sich aus der
Elementenbilanz (hypothetische Summenformel
CO0,48H1,83N0,11P0,01). Neben Phosphat als Phos-
phorquelle werden Ammonium und Nitrat als Stick-
stoffquelle eingesetzt. Soll der Preis für Mikroalgen-
produktion stark sinken, sind die Nährsalze auch als
Kostenfaktor nicht mehr zu vernachlässigen.
189 6
Das Licht ist jedoch der wichtigste Wachstums-
faktor für phototrophe Organismen. Etwa 43 % der
Energie des Sonnenlichtes sind photosynthetisch
nutzbare Wellenlängen (sog. PAR, photosyntheti-
cally active radiation, 400 bis 700 nm). Die Strah-
lungsintensität I wird in µE/(m2 s) angegeben. Dabei
steht das „E“ für Mol Photonen, die pro Zeiteinheit
auf die gegebene Fläche fallen. Hintergrund dieser
Angabe ist, dass jedes Photon dieselbe Ausbeute an
Photosyntheseprodukten liefert unabhängig von
seiner physikalischen Energie. Das Licht wird von
den Zellen absorbiert, in den Chloroplasten zu Pro-
duktion von ATP und NADH genutzt, daraus wird
mit Hilfe des aufgenommenen CO2 Stärke gebildet.
Diese wird im Plasma und in den Mitochondrien ver-
gleichbar mit einem heterotrophen Organismus in
Biomasse umgesetzt.
Die energetische Effizienz dieses Vorgangs wird
als Photo-Konversions-Effizienz (PCE) bezeichnet
und als Quotient aus der Energie des aufgenomme-
nen Sonnenlichtes zur chemischen Energie des Pro-
duktes berechnet.
∆H c0,Prod ⋅ mProd
PCE =  Gl. 6.36
∫∫ h ⋅ l ( f ) df dt
mit h als dem Planck’schen Wirkungsquantum und f
der Frequenz der jeweiligen Lichtfarbe. Für den
PAR-Bereich ergibt sich ein Wert von etwa 210 kJ
mol–1. ∆H co, Prod ist die Verbrennungsenthalpie des
 190 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
jeweiligen Produktes. Diese beträgt bei durchschnitt-
licher Biomasse etwa 20 MJ kg–1, bei lipidreicher Bio-
masse bis zu 30 MJ kg–1. Den theoretisch höchsten
Wert erhält man für rotes Licht und dem Chloroplas-
ten als Bilanzgrenze, also der Photosynthese bis zur
Stärkebildung, zu 24 %. Die Stoffwechselvorgänge
in der Algenzelle wie die ATP-abhängigen Synthe-
sen, Transport- und Reparaturvorgänge, Photore-
spiration und Atmung führen zu Energieverlusten
auf der Zellebene, sodass sich für die Biomasse als
Ganzes Werte von bis zu 17 % ergeben. In künstlich
mit LEDs beleuchteten Reaktoren für die Herstel-
lung von Hochwertprodukten wie Astaxanthin oder
6 rekombinante Proteine werden solche Werte erreicht.
Für den gesamten PAR-Bereich beobachtet man eine
PCE von maximal 10 %. Verluste auf der Reaktor-
ebene (Reflektion, Flächen zwischen den Modulen)
und die Einbeziehung des IR-Lichtes im Sonnenlicht
erlauben eine praktisch realisierbare PCE von 5 %.
Für Mitteleuropa heißt das, dass von den etwa 115 W
m–2 Sonneneinstrahlung im Jahresmittel maximal
5 W m–2 chemisch gebundene Energie als Biomasse
gewonnen werden kann. Klassische Energiepflanzen
bringen es nur auf 1–2 %.
Trägt man den Zusammenhang zwischen spe-
zifischer Wachstumsrate und Lichtintensität gegen-
einander auf, so erkennt man, dass nur bei geringen
Lichtstärken die Algen mit optimalem Wirkungsgrad
wachsen (siehe . Abb. 6.28). Bei höheren Lichtstär-
ken wird ein Teil der Lichtenergie als Wärme oder
. Abb. 6.28  Spezifische
Wachstumsrate in Abhängigkeit von
der Lichtintensität. I: Lichtlimitierung
bei hohem Wirkungsgrad, II:
Lichtsättigung mit abnehmendem
Wirkungsgrad, III: Lichtinhibierung.
Die Messdaten stammen von der
Alge Chlamydomonas reinhardtii in
kontinuierlicher Kultivierung
Fluoreszenzlicht wieder abgestrahlt und nicht photo-
synthetisch genutzt. In einem technischen Produk-
tionssystem muss deshalb das Licht „verdünnt“
werden. Bei schräg einfallendem Sonnenlicht auf
senkrechte Platten (siehe . Abb. 6.27) tritt nur die
Komponente in Normalenrichtung in den Reaktor
ein, was zu einer Lichtverdünnung entsprechend
dem Oberflächen/Grundflächen-Verhältnis führt.
Die negativen Folgen einer zu starken Belich-
tung können durch eine schnelle Folge von hellen
und dunklen Phasen abgemildert werden. Der
­Flashing-Light-Effekt besagt, dass im Starklichtbe-
reich angeregte Elektronen im Photosystem kurzzei-
tig gespeichert werden können und dann im dunklen
Bereich des Reaktors weiter von der Zelle genutzt
werden. Die Mischzeit in Richtung des Lichteinfalls
muss dafür allerdings deutlich höher als 0,1 s sein.
Raceway Ponds
Natürliche „Produktionsanlagen“ für Mikroalgen
finden sich u. a. in offenen Gewässern. Beispielsweise
werden in Myanmar in Kraterseen Spirulina Algen
(wissenschaftliche Bezeichnung Arthrospira) zur
Nahrungsergänzung produziert. Derartige natürli-
che Standorte sind allerdings global nur sehr limitiert
verfügbar und weisen auch andere Nachteile auf (u.
a. jahreszeitliche Schwankungen, Schädlingsbefall).
Zur Erschließung von Standorten auf ansonsten
ungenutzten und an sich trockenen Flächen werden
Kapitel 6 · Bioreaktoren
deshalb künstliche offene Becken (engl. open ponds)
eingesetzt. Diese werden üblicherweise über einen
geschlossenen Strömungsweg mittels eines Schau-
felrades (engl. paddle wheel) umgepumpt und dabei
gemischt. Solche sogenannten Raceway Ponds gibt
es in verschiedenen Konfigurationen. Dabei werden
Anlagen aus parallel betriebenen Einzelbecken
bis zu einer Gesamtgröße von mehreren Hektar
betrieben.
Raceway Ponds bilden in sich geschlossene Rezir-
kulationskanäle (. Abb. 6.29) und bedecken als ein-
zelner Pond maximal eine Fläche von 0,5 ha. Neben
der Durchmischung müssen Möglichkeiten vorge-
sehen werden für die Einbringung der Nährsalze,
für die Ernte, für das Begasen mit Kohlenstoffdioxid
(CO2), für Überlauf und Drainage bei Regen und für
die Säuberung.
Die mittlere Fließgeschwindigkeit in einem der-
artigen Raceway Pond ergibt sich aus der Vermei-
dung von Sedimentation und der Forderung nach
einer gleichmäßigen Strömung. In der Praxis werden
oft 0,3 m s–1 eingestellt. Der dafür nötige mechani-
sche Energieeintrag PW [W] ergibt sich zu
PW = 1, 59 ⋅ AG ⋅ρL ⋅ g ⋅uf 3 ⋅ f M 2 ⋅ d h−1/3  Gl. 6.37
mit der Grundfläche A G [m 2 ], der Dichte des
Mediums ρL [kg L–1], also praktisch 1 kg L–1, der Erd-
beschleunigung g [m s–2], der Fließgeschwindigkeit vf
[m s–1], dem Manningfaktor fM [s m–1/3] mit Werten
. Abb. 6.29  Grundriss einer
typischen Raceway Pond-Anlage, die
wichtigsten Maße und peripheren
Einheiten sind eingezeichnet
191 6
je nach Rauigkeit der Oberfläche zwischen 0,01 und
0,016. Der hydraulische Durchmesser dh [m] ergibt
sich aus der Reaktorgeometrie zu 4 · w · h/(w + 2 · h).
Der zum Antrieb der Strömung nötige mechanische
Energieeintrag für das Schaufelrad ist mit beispiels-
weise 0,5 W m–2 bzw. 1 W m–3 also relativ gering. Das
Schaufelrad selbst hat oft allerdings einen schlechten
Wirkungsgrad, sodass für die tatsächliche elektrische
Leistung mehr als das Doppelte der mechanischen
Leistung entstehen kann. In modernen Bauformen
werden die starren Blätter mit Kippmechanismen aus-
gestattet, die zu einem senkrechten Eintauchen in das
Medium führen und sie so effektiver arbeiten lässt.
Dafür werden aber auch nur geringe flächenbe-
zogene Produktivitäten von im Jahresmittel unter
15 g Biomasse m–2 d–1 erreicht, was einem PCE von
rund 1–2 % entspricht. Ein Grund dafür ist, dass die
Oberfläche direkt dem Sonnenlicht ausgesetzt ist und
damit eine Lichtsättigung entsteht, während die tie-
feren Bereiche verschattet (dunkel) sind und damit
der Anteil der Atmungsverluste ansteigt. Weiterhin
sind oft starke Kontaminationen zu beobachten, die
durch die Wahl von Mischpopulationen und extre-
mophilen Stämmen unterdrückt werden können.
Üblicherweise werden auch nur geringe Biomas-
sekonzentrationen erreicht. Dies führt zu höheren
Energiekosten bei der Ernte, da pro geerntete Algen-
menge viel Wasser durch die Zentrifuge oder das
Filter transportiert werden muss.
Weitere technische Faktoren und Bedingungen
an die Umgebung, die in der Praxis berücksichtigt
 192 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
werden müssen, sind die Umgebungstemperatur,
CO2-Verluste über die große Oberfläche, die Nie-
derschläge und die Verfügbarkeit von (Meer-)Wasser
zum Ersetzen der Verdunstungsverluste. Je nach Lage
und Jahreszeit verliert ein Open Pond zwischen 1 und
10 mm d–1 Wassersäule. Im Extremfall entspricht dies
seinem gesamten Inhalt in einem Monat. Diese Ver-
luste müssen durch die Zugabe von Wasser wieder
ausgeglichen werden. Schätzungen für den Wasser-
bedarf pro produzierter Biotrockenmasse belau-
fen sich auf rund 500 L kg–1. Aus diesem Wasser-
verbrauch resultiert auch – je nach Lage der Anlage
– ein erheblicher Energiebedarf zum Pumpen. Die
6 benötigten Wassermengen liegen in einer Größen-
ordnung, mit der man auch beim üblichen Acker-
bau in derartigen Regionen rechnen muss. Jedoch
ist die Möglichkeit der Verwendung von Salzwasser
von Vorteil, da dieses potenziell unbegrenzt verfüg-
bar ist. Der große Wasserkörper und die Verduns-
tung tragen auch zur Temperaturkontrolle bei, sodass
sich ein offenes Becken auch ohne äußere Kühlung
(die in der Praxis nicht bezahlbar ist) üblicherweise
nicht mehr als um 10 °C aufheizt.
Bis heute findet der bei weitem größte Anteil der
Mikroalgenproduktion in Raceway Ponds statt. Der
Hauptgrund dafür sind die insgesamt überschauba-
ren Kosten und der relativ geringe Energieeintrag.
Auch wenn es letztlich gelingt, die Prozessstabilität
(Wetterabhängigkeit, Kontamination) etwa durch
Überdeckung mit Folien (Covered Ponds) zuneh-
mend besser zu beherrschen, bleibt die Systemper-
formance aber begrenzt. Aktuelle Entwicklungen
beziehen sich auf die sogenannten geschlossenen
Reaktoren.
Plattenreaktoren
Der Plattenreaktor . Abb. 6.30 ist der am häufigs-
ten eingesetzte Photobioreaktor. Dabei wird eine
dünne Wasserschicht zwischen zwei transparenten
Flächen eingeschlossen. Solche Installationen lassen
sich einfach bauen, flexibel an räumliche Gegeben-
heiten anpassen und relativ einfach betreiben. Ein-
gesetzt werden Säcke (engl. bags) aus PE oder PVC,
die durch geeignete Stellagen in Form gehalten
werden. Die Durchmischung und CO2-Versorgung
erfolgt durch Begasung von unten. Wichtigster
Faktor bei der Auslegung ist das Oberflächen- zu
Grundflächenverhältnis AR/AG. Dieses bestimmt
den Grad der Lichtverdünnung, um aus dem direk-
ten Sonnenlicht in den linearen Teil der Wachstums-
kinetik zu kommen. AR/AG weist beim Plattenreak-
tor Werte von 5 bis 10 auf.
Die Dicke dR der Platte bestimmt die Länge des
freien Lichtweges. Je nach Algenkonzentration sind
nur wenige cm möglich, weil sonst an der lichtab-
gewandten Seite Dunkelzonen entstehen. Je dünner
die Schicht ist, desto höhere Algenkonzentrationen
können erreicht werden. Letztlich soll also zur Pro-
zessintensivierung so viel Licht wie möglich in ein
gegebenes Volumen eingetragen werden. Dieser
Zusammenhang wird durch das Oberflächen- zu
Volumenverhältnis AR/AG charakterisiert. Für eine
Platte mit einer Dicke d ist das Verhältnis 2/dR .
Übliche Oberflächen- zu Volumenverhältnisse liegen
im Bereich 50 m–1 bis 100 m–1 (bei Open Ponds sind
es lediglich 3 m–1). Moderne Konzepte gehen in Rich-
tung höherer Oberflächen- zu Volumenverhältnisse.
In solchen „Dünnschichtreaktoren“ können Biomas-
sekonzentrationen von bis zu 10 g L–1 erreicht werden.
Die Wachstumskurve in Fotobioreaktoren unter-
scheidet sich deutlich vom exponentiellen Wachstum
bei heterotrophen Kultivierungen, . Abb. 6.31 zeigt
einen typischen Verlauf.
Die Algen sind zunächst gleichmäßig über die
Dicke des Reaktors mit Licht versorgt, erkennbar
am transmittierten Lichtanteil. Sie wachsen solange
nahezu exponentiell, bis die durchschnittliche Licht-
stärke limitierend wird. Schließlich erreicht kein
Licht mehr die gegenüber liegende Seite. Jetzt ist der
eingetragene Lichtstrom wachstumsbestimmend
(dcx/dt ≈ I0) und es kommt zu linearem Wachstum.
Je dünner die Schicht ist, desto steiler steigt die Bio-
massekurve. Schließlich ist der Dunkelbereich so
groß, dass die Atmung gegenüber der Photosyn-
these einen zunehmenden Anteil am Stoffwechsel
erhält, sodass die Biomassenzunahme abflacht. Dazu
kommt gegebenenfalls Mangel an Nährsalzen. Die
tatsächliche Wachstumsrate hängt also vom Ort im
Reaktor ab. Die beobachtete spezifische Wachstums-
rate ergibt sich aus der Integration über die Reak-
tordicke. Dieses Verhalten wird als „μ-Integration“
bezeichnet. Die Auftragung spezifischer Wachstums-
raten über die Lichtstärke I0 an der Oberfläche oder
über die durchschnittliche Lichtstärke im Reaktor
kann also nur einer ersten Übersicht dienen.
Kapitel 6 · Bioreaktoren
193 6

. Abb. 6.30  Grundprinzip des Plattenreaktors

. Abb. 6.31  Typischer Wachstumsverlauf in einem Fotobioreaktor; im Bereich I herrscht exponentielles Wachstum, in Bereich
II ergibt sich lineares Wachstum, im Bereich III ist die stationäre Phase erreicht
 194 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
Ein weiterer kritischer Faktor ist die Begasung.
Typische Begasungsraten sind 0,15 vvm (von engl.
volume per volume per minute) mit volumetrischen
Energieeinträgen von 50 W m–3. Die Berechnung
erfolgt analog der Blasensäule für den laminaren
Bereich. Solche geringen Begasungsraten sind möglich,
da die volumetrischen Stoffumsätze etwa 2 Zehner-
potenzen unter der von heterotrophen Kultivierun-
gen liegen. Trotzdem verursacht die Begasung einen
erheblichen Anteil an der Energiebilanz, da der aufzu-
wendende Energieeintrag die Größe der tatsächlich in
chemische Energie umgesetzten Lichtenergie überstei-
gen kann. Nur für den Gasaustausch wären noch gerin-
6 gere Begasungsraten möglich, jedoch sorgen die Blasen
auch über einen Airlift-Effekt für akzeptable Mischzei-
ten von etwa 100 s in der vertikalen Richtung zur Ver-
meidung zu großer Gradienten und 1 s in der Lichtein-
falls-Richtung zur Nutzung des Flashing-Light-Effektes.
Da die Höhe des Reaktors durch die Lichtver-
dünnung und den kLa (Aufstiegszeit der Blasen) defi-
niert ist und die Dicke durch den freien Lichtweg,
ist die einzige Dimension zur Skalierung die Breite
des Reaktors. Die Bedeckung eines gegebenen Areals
mit parallel neben- und hintereinander aufgestellten
Reaktoren wird als Numbering-Up bezeichnet. Eine
entsprechende Anlage ist in . Abb. 6.32 gezeigt.
In solchen Anlagen werden in Mitteleuropa Pro-
duktivitäten von bis zu 40 g Biomasse m–2 d–1 erzielt.
Rohrreaktoren
Rohrreaktoren bestehen aus Glas- oder Kunststoff-
rohren, die mäanderartig zu sogenannten „Zäunen“
installiert werden. Die Rohre erreichen Längen
. Abb. 6.32  Eine Algenproduktionsanlage mit Bags aus speziellem reißfestem Kunststoff der Firma Phytolutions
von mehreren 100 m, siehe . Abb. 6.33, die Länge
eines Zauns beträgt um 100 m. Die Dicke der Rohre
beträgt maximal 5 cm, um den freien Lichtweg klein
zu halten. Rohrreaktoren werden als Strömungsrohr
im Umlauf mit etwa 0,2–1 m s–1 Strömungsgeschwin-
digkeit betrieben, angetrieben durch Kreiselpum-
pen. Dadurch befindet sich das System im turbulen-
ten Bereich, was den schnellen Hell/Dunkel-Wechsel
aus Sicht der Algenzellen unterstützt. Der Gasaus-
tausch erfolgt in Rührkesseln, die in den Kreislauf
eingekoppelt sind. Rohrreaktoren gehören zu den
größten kommerziell betriebenen Produktionsan-
lagen im Bereich der geschlossenen Reaktoren.
Die Bauform erlaubt deutlich höhere Lichtver-
dünnungen bei Oberflächen-/Volumen-Verhältnis-
sen von 100 m–1. Zusätzlich ist der Lichtgradient im
Rohr geringer als in der Platte, da das eintreffende
Licht zwar auch abgeschwächt wird, jedoch sich
zur Rohrachse hin durch den Fokussierungseffekt
sammelt. Der Rohrreaktor erlaubt dadurch die Pro-
duktion von hochwertigen Stoffen. Durch die photo-
synthetische Aktivität der Zellen kommt es jedoch
längs des Rohres zu ausgebildeten Gradienten von
pO2, pCO2 und pH, die problematisch sein können
und die Maßstabsvergrößerung in axialer Richtung
limitieren. Rohrreaktoren können auch mit reinem
CO2 begast werden, ein Blasenanteil von beispiels-
weise 20 %, der über CO2-angereicherte Luft erreicht
wird, kann jedoch den Gradienten geringer halten.
Der volumetrische Leistungseintrag ist mit Werten
von bis zu 500 W m –3 sehr hoch. Eine aktuelle
Bauform zeigt . Abb. 6.34. Das durchströmte Rohr ist
hier konisch aufgewickelt, um eine bessere Lichtaus-
nutzung im Freiland zu erreichen. Das Medium wird
Kapitel 6 · Bioreaktoren
195 6
. Abb. 6.33  Schematische
Darstellung des Rohrreaktors mit
typischen Abmessungen

in einem gepulsten Betrieb gefördert, um Algenab-
lagerungen zu vermeiden und die Gasphase dispers
zu halten. Ein innenliegendes Rohr dient der Ver-
meidung des inneren Dunkelbereichs und kann zur
Temperierung genutzt werden.
Entwicklungstendenzen
Die bislang in geschlossenen Reaktoren produ-
zierte Biomasse bewegt sich in einem Preisniveau
von mehr als 10 € kg–1 Trockengewicht. Das ist für
höherwertige Produkte in den Bereichen Kosmetik
und Nahrungsergänzung angemessen. Zur Produk-
tion von rekombinanten Proteinen, eine spannende
Alternative zu tierischen Zellen, kommen auch über
Leuchtdioden (LED von engl. light-emitting diode)
künstlich beleuchtete Reaktoren in Betracht. Aktu-
elle Nutzung von Algenbiomasse in großen Markt-
volumina richtet sich auf die Fischzucht zur Reduk-
tion des Einsatzes von Fischmehl aus Beifang. Auch
die Nutzung als Lebensmittel für den menschlichen

. Abb. 6.34  Der Rohrreaktor

der Firma Gicon nach dem
„Tannenbaumprinzip“, hier mit
künstlicher Beleuchtung
 196 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
Bedarf über die Nahrungsergänzung hinaus wird ins
Auge gefasst. Dabei kommen farb-, geschmacks- und
geruchsneutrale Extrakte in Betracht. Speziell in den
Entwicklungsländern herrscht Proteinmangel, der
durch lokale Algenanlagen bei Nutzung von Son-
nenlicht und Salzwasser überwunden werden kann.
Für die Produktion von Grundchemikalien oder erst
recht für eine energetische Nutzung sind aber nach
wie vor keine kommerziellen Anlagen in Betrieb.
Grund sind zunächst die hohen Reaktorkosten. Diese
liegen bei 200 € m–2 (Rohrreaktor), aber mindesten
bei 50 € m–2 bei Plattenreaktoren aus Kunststoff. Ein
weiteres Problem ist der hohe Bedarf an Hilfsenergie
6 für die Wasser- und Gasführung sowie die Produkt-
aufbereitung. Eine übliche Begasung benötigt bei-
spielsweise mehr als 5 W m–2, sollte aber nicht mehr
als 1 W m–2 erfordern.
Zur Senkung der Kosten werden in modernen
Designs geringe Bauhöhen (geringere Druckabfälle,
weniger Material, keine Gestelle) vorgeschlagen.
Durch strukturierte Oberflächen und lichtleitende
Einbauten fällt die Lichtverteilungs- und Verdün-
nung-Dimension mit der Höhe zusammen, sodass
flache Geometrien entstehen, die in den zwei hori-
zontalen Raumrichtungen beliebig skalierbar sind.
Der Gaseintrag kann über Membranen oder Kopf-
raumbegasung erfolgen, damit wird eine blasen-
freie Begasung erreicht, die weniger Energie ver-
braucht und weniger mechanischen Stress auf die
Algen ausübt. Des Weiteren lassen sich bei diesen
horizontalen Reaktoren (Zick-Zack, transparenter
Schwamm) Oberflächenbeschichtungen applizie-
ren, die beispielsweise zum Antifouling beitragen
oder IR-Licht reflektieren und sogar in Elektrizität
umwandeln können. Damit sollen Reaktoren verfüg-
bar werden, die sich ideal in ein vorhandenes Gelände
einpassen, keine Gestelle benötigen und ohne Zufuhr
von Hilfsenergie für Mischen und Begasen zu betrei-
ben sind. Weiter offen ist die Frage nach den Materia-
lien, wobei besser lichtbeständige Kunststoffe bereits
in der Entwicklung sind. Effektive Mechanismen zur
Dämpfung von Temperaturschwankungen wie die
Zwischenspeicherung der Überschusswärme vom
Tag zur Nutzung in der Nacht sind weitere Optio-
nen der Zukunft.
Gleichwohl wird die Kultivierung von Mikro-
algen von internationalen Experten und Politikern
zunehmend als Schlüsseltechnologie zur Erreichung
einer umweltverträglichen und nachhaltigen Versor-
gung mit Rohstoffen gesehen. Die hohen flächenbe-
zogenen Produktivitäten und die Nutzung arider
Landflächen werden daher als bedeutende Argu-
mente genannt. In der Tat sind Algenkult­vierungen
die mit Abstand produktivsten Systeme zur Erzeu-
gung von Biomasse. Weitere Steigerungen sind durch
Fortschritte in der Stammentwicklung und im Reak-
tordesign in Sicht [8, 12, 164, 128].
6.4 Bewegte Bioreaktoren
Tobias Ladner und Jochen Büchs
6.4.1 Schüttelkolben und
Mikrotiterplatten
Geschüttelte Bioreaktoren sind die am weitesten
verbreiteten Reaktionsgefäße in der Biotechnologie
[15]. Insbesondere Schüttelkolben und Mikrotiter-
platten werden häufig als Bioreaktoren in den ersten
Stufen der biotechnologischen Prozessentwicklung
eingesetzt [9, 15]. Mit diesen Kultivierungssyste-
men können zahlreiche Untersuchungen binnen
kurzer Zeit durchgeführt werden, weshalb in diesem
Zusammenhang auch von Hochdurchsatzsystemen
(siehe 7 Abschn. 6.5) gesprochen wird. Aufgrund des
reduzierten Materialeinsatzes werden besonders bei
teuren Substraten oder Ausgangsstoffen zusätzlich
Kosten eingespart [81]. Entsprechend ist es nicht
verwunderlich, dass Bioreaktoren mit Volumina im
µL- und mL-Bereich für Entwicklungs- und Opti-
mierungsanwendungen zunehmend eine Schlüssel-
rolle in der Bioprozessentwicklung einnehmen [94].
Schüttelkolben sind in unterschiedlichsten Aus-
führungen verfügbar: Nennvolumen von 25 mL bis
6 L, Kolben mit oder ohne Schikanen, gefertigt aus
Glas oder Kunststoff [15]. Auch zahlreiche Typen
von Mikrotiterplatten sind kommerziell erhältlich.
Hier gibt es Unterschiede bei der Anzahl der Wells
(engl. Bohrloch) (24, 48, 96 oder 384), der Well-
ausführung (Rund, Eckig oder weitere Spezialfor-
men), der Wellhöhe (Standardplatten oder deep-well
Platten), dem Material (Polystyrol oder Polypropy-
len), der Transparenz (klares Material, schwarzes
oder weißes undurchsichtiges Material, ohne oder
Kapitel 6 · Bioreaktoren
mit durchsichtigem Boden) oder auch dem Wellbo-
den (Flach- oder Rundboden) [32, 82].
Sowohl Schüttelkolben als auch Mikrotiterplatten
werden zur Durchführung von Kultivierungen auf
Schüttelmaschinen mit orbitaler Rotationsbewegung
oder linearer reziproker Hin- und Herbewegung
fixiert. In der Vergangenheit waren Schüttelmaschi-
nen mit linearer reziproker Hin- und Herbewegung
verbreiteter. Heute jedoch werden weitestgehend
nur noch Schüttelmaschinen mit orbitaler Rota-
tionsbewegung eingesetzt [15]. Durch die orbitale
Schüttelbewegung wirkt die Zentrifugalkraft auf das
Reaktionsmedium, wodurch sich eine hoch reprodu-
zierbare rotierende Flüssigkeitssichel ausbildet. Dies
bewirkt eine Durchmischung des Reaktionsmediums
im Schüttelkolben beziehungsweise den Wells einer
Mikrotiterplatte und führt zu einer vergrößerten Gas-
Flüssigkeits-Austauschfläche [20]. Trotz dieses, auf
den ersten Blick, einfachen Systems können schwer-
wiegende Fehler bei der Wahl der Betriebsparameter
begangen werden [15]. Die prinzipiell einfache Funk-
tionsweise führte dazu, dass lange Zeit die Bedeu-
tung verfahrenstechnischer Parameter wie dem spe-
zifischen Leistungseintrag (7 Abschn. 6.4.1.1) oder
der Gas-Flüssigkeits-Stofftransfer (7 Abschn. 6.4.1.5)
unterschätzt wurde [15, 82]. In den letzten Jahren
konnten jedoch deutliche Fortschritte auf diesem
Gebiet gemacht werden. So wurde beispielsweise
das Außer-Phase-Phänomen (engl.: out-of-phase)
(7 Abschn. 6.4.1.2) entdeckt, welches unter ungünsti-
gen Betriebsbedingungen in Schüttelkolben auftre-
ten und sich extrem negativ auf die Kultivierung aus-
wirken kann [19]. Mit dem erlangten Wissen ist es
möglich, Prozesse kontinuierlich zu optimieren und
die Produktivität der mikrobiologischen Kulturen
weiter zu erhöhen. Die wichtigsten grundlegenden
Aspekte zur Auslegung orbital geschüttelter Biore-
aktoren und deren Betriebsbedingungen werden in
den folgenden Abschnitten behandelt.
Spezifischer Leistungseintrag
Der spezifische Leistungseintrag (P/V) quantifiziert
die Gesamtleistung (P), die pro Volumen (V) in die
Flüssigkeit eines Bioreaktors eingetragen wird und ist
einer der grundlegende Parameter zur Charakterisie-
rung von Reaktoren. Schon früh wurde der spezifi-
sche Leistungseintrag als Parameter herangezogen,
197 6
um einen Prozess aus dem Schüttelkolben in Rühr-
kesselreaktoren zu übertragen (Scale-up) [153]. Die
eingetragene Leistung erzeugt eine Fluidbewegung
im Reaktor und bewirkt somit die Durchmischung
der Kulturbrühe. Zudem führt die Reibung der
bewegten Flüssigkeit zu einem Wärmeeintrag. Der
Leistungseintrag wird auch von Eigenschaften des
Reaktionsmediums wie beispielsweise der Viskosität
beeinflusst. Bis zu einem kritischen Wert nimmt der
spezifische Leistungseintrag mit steigender Viskosi-
tät zu [17]. Das Überschreiten des kritischen Werts
führt allerdings dazu, dass die Flüssigkeit in den
Außer-Phase Zustand (7 Abschn. 6.4.1.2) gerät und
die eingetragene Leistung stark abnimmt [19]. Letzt-
lich wirkt sich dies sowohl auf den Grad der Durch-
mischung als auch auf den Gas-Flüssigkeits-Stoff-
transfer negativ aus [124].
Sowohl in Rührkesselreaktoren als auch in Schüt-
telkolben liegt der spezifische Leistungseintrag unter
typischen Betriebsbedingungen für mikrobielle Kul-
tivierungen in einem Bereich zwischen 1 und 10 kW
m–3 [17]. Während die Leistung in Rührkesselreak-
toren mittels eines elektrisch betriebenen Rührers
eingetragen wird, erfolgt die Energiedissipation in
Schüttelkolben (7 Abschn. 6.4.1.3) an der Kontakt-
fläche zwischen Schüttelkolbenwand und Reaktions-
medium. Die experimentelle Bestimmung des spe-
zifischen Leistungseintrags ist über die Bestimmung
der Flüssigkeitstemperaturänderung, den Energie-
verbrauch des Schüttler- bzw. Rührantriebs oder
über die Messung des mechanischen Drehmoments
möglich [17]. Zur Vermeidung zeitaufwendiger
Experimente kann eine mathematische Korrelation
verwendet werden, die den spezifischen Leistungs-
eintrag in Schüttelkolben als dimensionslose Kenn-
zahl angibt. Die Leistung (P) eines bewegten Rührers
lässt sich als Produkt von Drehmoment (M) und
Winkelgeschwindigkeit (ω) beschreiben, wobei das
Drehmoment wiederum dem Produkt aus Kraft (F)
und Hebelarm (r) entspricht.
P = M ⋅ω = F ⋅ r ⋅ω  Gl. 6.38
Da der Leistungseintrag in Schüttelkolben über die
Reibung des Reaktionsmediums an der Schüttel-
kolbenwand erfolgt, lässt sich die Kraft F mit dem
Produkt von Wandschubspannung (τw) und der ent-
sprechenden Reibungsfläche (Aw) ersetzen:
 198 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
P = F ⋅ r ⋅ ω = τ w ⋅ Aw ⋅ r ⋅ ω  Gl. 6.39
Die Wandschubspannung (τw) wiederum ist eine
Funktion der Flüssigkeitsströmung in Abhängigkeit
der Reynolds-Zahl (Re) [141]:
τ w = c1 ⋅ρ ⋅ r 2 ⋅ ω 2 ⋅ f ( Re)  Gl. 6.40
wobei c1 eine Konstante und ρ die Dichte der Flüssig-
keit ist. Die Reynolds-Zahl Re ist wie folgt definiert:
ρ ⋅n⋅d 2 
6 Re =
η
Gl. 6.41
η ist die dynamische Viskosität des Fluids, n die
Schüttelfrequenz und d entspricht dem maximalen
Innendurchmesser des Schüttelkolbens [17].
Mit Hilfe eines komplexen und aufwendigen
Modells zur Beschreibung der Flüssigkeitsvertei-
lung in Schüttelkolben niedrigviskoser Flüssigkeiten
lässt sich auch die exakte Reibungsfläche Aw berech-
nen [20]. Da sich die Reibungsfläche Aw jedoch nicht
signifikant mit dem Schütteldurchmesser und der
Schüttefrequenz ändert, kann die Reibungsfläche
Aw vereinfacht als Produkt von Schüttelkolbenum-
fang (U = 2 · π · r) und Flüssigkeitshöhe (h) beschrie-
ben werden [17]:
Aw = 2 ⋅π ⋅ r ⋅ h  Gl. 6.42
Durch Ersetzen der Flüssigkeitshöhe (h) mit dem
charakteristischen Längenmaß (VL1/3) wird eine
Abhängigkeit vom einfach zu bestimmenden bzw.
bekannten Füllvolumen erreicht (VL).
Aw = 2 ⋅π ⋅ r ⋅VL1/3  Gl. 6.43
Mit Einsetzen von Gl. 6.40 und 6.43 in Gl. 6.39, sowie
unter Berücksichtigung der Winkelgeschwindigkeit
(ω = 2 · π · n) und dem Schüttelkolbendurchmesser
(d = 2 · r), ergibt sich für die Leistung somit:
P = c1⋅π4 ⋅ f ( Re)⋅ρ ⋅ n3 ⋅ d 4 ⋅VL1/3  Gl. 6.44
Durch Einführung einer modifizierten Newton-Zahl
Ne′
P
Ne′ =  Gl. 6.45
ρ ⋅ n3 ⋅ d 4 ⋅ VL1/ 3
kann der spezifische Leistungseintrag durch die
dimensionslose Kennzahl beschrieben werden:
P
Ne′ = = c1⋅π4 ⋅ f ( Re)  Gl. 6.46
ρ ⋅ n3 ⋅ d 4 ⋅VL1/3
Die Gültigkeit von Gl. 6.46 ist auf Schüttelkol-
ben ohne Schikanen beschränkt, welche In-Phase
(7  Abschn. 6.4.1.2) betrieben werden. Turbulentes
Strömungsverhalten liegt vor, wenn Re > 60.000 ist
[125]. Diese Bedingungen sind in der Regel bei Flüs-
sigkeiten mit niedriger Viskosität erfüllt und f(Re)
kann mit der Korrelation für turbulente Bedingun-
gen (c2 · Re–0,2) ersetzt werden [18]. Bei erhöhter
Viskosität kann jedoch eine transitionale oder gar
laminare Strömung vorliegen. Entsprechend muss
Gl. 6.46 mit einem zusätzlichen Term für transitionale
(Re–0,6) und laminare (Re–1) Strömungsverhältnisse
erweitert werden [18]:
Ne′ = cla ⋅ Re−1 + ctr ⋅ Re−0,6 + ctu ⋅ Re−0,2  Gl. 6.47
Zur dimensionslosen Darstellung des spezifischen
Leistungseintrags (Ne′) ist in Gl. 6.47 jeweils ein
Parameter für laminare (cla), tranistionale (ctr) und
turbulente (ctu) Strömungsverhältnisse enthalten.
Diese Parameter wurden auf Basis von mehr als 2000
Untersuchungen in Schüttelkolben von 25 mL bis 5 L
und einem Füllvolumen zwischen 2 % und 40 % mit
der Methode der kleinsten Fehlerquadrate bestimmt
[18]. Aus den experimentell ermittelten Daten ergibt
sich unter In-Phase-Bedingungen in Schüttelkolben
ohne Schikanen [18]:
Ne′ = 70 ⋅ Re−1 + 25⋅ Re−0,6 + 1, 5⋅ Re−0,2  Gl. 6.48
In . Abb. 6.35 ist der Zusammenhang zwischen der
ermittelten empirischen Korrelation (Gl. 6.48) und
dem zugrundeliegenden experimentellen Datensatz
dargestellt.
Eine Zunahme des spezifischen Leistungs-
eintrags kann durch Erhöhung der Schüttelfre-
quenz n, Reduzierung des Füllvolumens V L, Ver-
größerung des Schüttelkolbendurchmessers d (bei
Kapitel 6 · Bioreaktoren
199 6

. Abb. 6.35  Modifizierten Newton-Zahl (Ne′) in Abhängigkeit von Reynolds-Zahl (Re) mit unterschiedlichen
Schüttelkolbennennvolumen, Viskosität (0,8–200 mPa s), Schütteldurchmesser (2,5–5 cm) und unterschiedlicher
Schüttefrequenz (80–400 rpm). Experimente, die unter In-Phase-Bedingungen durchgeführt wurden sind mit Symbolen
gekennzeichnet, während Untersuchungen, welche unter Außer-Phase-Bedingungen durchgeführt, mit kleinen Kreuzen
markiert sind. Insgesamt sind 2143 Messungen dargestellt

konstantem Verhältnis von V L1/3 zu d) sowie bei
Erhöhung der Viskosität η (unter In-Phase-Be-
dingungen) erreicht werden. Interessanter Weise
hat die Veränderung des Schütteldurchmessers
bei 500 mL Schüttelkolben im Bereich von 2,5 bis
10 cm unter In-Phase Bedingungen keinen signi-
fikanten Einfluss auf den spezifischen Leistungs-
eintrag in Schüttelkolben [84]. Die Einflussfakto-
ren und deren Auswirkungen auf den spezifischen
Leistungseintrag sind in . Tab. 6.2 übersichtlich
zusammengefasst.
Auch auf Basis der numerischen Strömungsme-
chanik (engl. computational fluid dynamics, CFD)
wurde der spezifische Leistungseintrag in Schüttel-
kolben ohne Schikanen untersucht [109, 120, 181].
In diesen Untersuchungen konnten Werte für den
spezifischen Leistungseintrag berechnet werden, die
weitgehend mit experimentell bestimmten Werten
übereinstimmen.
Schüttelkolben mit Schikanen werden häufig
verwendet, um die Durchmischung zu verbessern
sowie den Sauerstoffeintrag in die Kulturbrühe im
Vergleich zu Standardkolben (bei gleicher Schüttel-
frequenz) zu erhöhen. Dennoch wird in der Litera-
tur empfohlen, auf Schüttelkolben mit Schikanen
möglichst zu verzichten [15, 57, 108]. Die Schika-
nen in den Schüttelkolben werden von Glasblä-
sern von Hand und nicht automatisiert hergestellt,
sodass jeder Schüttelkolben individuelle Eigenschaf-
ten aufweist. Somit ist die Reproduzierbarkeit von
Schüttelkolben zu Schüttelkolben nur unvollstän-
dig gegeben und ein sinnvoller Vergleich paralleler
Kulturen schwer möglich [15, 108]. Somit kann für
den spezifischen Leistungseintrag in Schüttelkolben
 200 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
. Tab. 6.2  Zusammenfassung der Auswirkungen auf den spezifischen Leistungseintrag bei Änderungen
unterschiedlicher Betriebsparameter
Änderung des Betriebsparameters Einfluss auf P/V
n↑ ↑
VL ↑ ↓
d↑ ↑ Verhältnis von VL1/3 zu d konstant
η↑ ↑ unter In-Phase-Bedingungen
mit Schikanen keine präzise und in weiten Bereichen
6 anwendbare Korrelation angegeben werden [125].
Mit Hilfe von CFD-Modellen für Schüttelkolben mit
Schikanen konnte der spezifische Leistungseintrag
bestimmt werden und in Kultivierungen von fila-
mentösen Pilzen erfolgreich validiert wenden [100].
Auch zur Charakterisierung des spezifischen
Leistungseintrags in Mikrotiterplatten wurden CFD
Modelle entwickelt, die eine gute Übereinstimmung
mit experimentell bestimmten Werten aufweisen
[183, 7]. Es konnte gezeigt werden, dass die Durch-
mischung der Flüssigkeit in einer 96-Well Mikro-
titerplatte intensiver ist als in einer 24-Well Mik-
rotiterplatte [183]. Für die untersuchten 24-Well
Mikrotiterplatten wurde zudem ein durchschnitt-
licher Leistungseintrag von 70 bis 100 W m –3
bestimmt, welcher für 96-Well Mikrotiterplatten
deutlich höher bei 500 bis 1000 W m–3 liegt [183]. Bei
der Untersuchung des Wachstums von Hybridomzel-
len in 24-Well Mikrotiterplatten wurde mittels CFD-
Simulationen für den Leistungseintrag ein Bereich
zwischen 5 bis 35 W m–3 ermittelt [7].
Außer-Phase-Phänomen
z Auswirkungen des Außer-Phase-Phänomens
Schüttelkolben werden oft als Reaktionsgefäße in
den ersten Stufen der biotechnologischen Prozess-
entwicklung eingesetzt [9, 38]. So werden beispiels-
weise im Stamm-Screening mehrere Schüttelkol-
ben mit unterschiedlichen Mikroorganismen oder
Mutanten parallel betrieben und hinsichtlich der
Produktbildung bewertet. Auch in Medienoptimie-
rungen können mehrere Schüttelkolben parallel ein-
gesetzt werden, wobei sich in diesem Fall nicht der
Anmerkung
Mikroorganismus, sondern die Medienzusammen-
setzung unterscheidet. Entsprechend ist es unerläss-
lich, die Vergleichbarkeit zwischen parallel betrie-
benen Bioreaktoren sicherzustellen. Nur so ist es
letztlich möglich, verlässlich den Einfluss aufgrund
der geänderten Betriebsparameter zu ermitteln.
Bei orbital geschüttelten Bioreaktoren erzeugt
die Rotationsbewegung des Schütteltablars eine
Zentrifugalkraft, die auf das Reaktionsmedium im
Inneren des Schüttelkolbens wirkt. Unter geeigneten
Betriebsbedingungen führt dies dazu, dass sich eine
charakteristische Flüssigkeitssichel bildet, welche
der Kreisbewegung des Schütteltablars in Rich-
tung der Zentrifugalkraft folgt [20, 19]. Aufgrund
dieser klar definierten Flüssigkeitsverteilung ist es
möglich, die Kontaktfläche zwischen Reaktionsme-
dium und Schüttelkolbenwand sowie die Gas-Flüs-
sigkeits-Austauschfläche genau zu berechnen [20].
Schüttelkolben, die in diesem Zustand betrieben
werden, sind In-Phase und bieten ein hohes Maß an
Reproduzierbarkeit.
Komplett anders verhält es sich mit Schüttelkol-
ben, die unter Außer-Phase-Bedingungen betrie-
ben werden. Außer-Phase-Bedingungen können
beispielsweise bei Kultivierungen filamentös wach-
sender Mikroorganismen oder bei der Biopolymer-
produktion durch Viskositätsänderungen des Reak-
tionsmediums auftreten [124]. In diesem Zustand
führt die orbitale Rotationsbewegung nicht zur Aus-
bildung der charakteristischen Flüssigkeitssichel.
Zudem folgt die Flüssigkeit nicht mehr der Bewegung
des Schütteltablars [19]. Ein großer Teil des Reak-
tionsmediums verbleibt stattdessen am Boden des
Schüttelkolbens und zeigt keine relative Bewegung.
Dies führt dazu, dass der Leistungseintrag deutlich
reduziert ist, das Mischverhalten sich verschlechtert
Kapitel 6 · Bioreaktoren
und der Gas-Flüssigkeits-Stofftransfer abnimmt [124,
18]. Insbesondere die ausreichende Sauerstoffversor-
gung der Mikroorganismen ist nicht mehr gewähr-
leistet [124]. Unter diesen Bedingungen ist ein Ver-
gleich zwischen parallel betriebenen Schüttelkolben
nicht mehr sinnvoll möglich [105]. Durch Außer-
Phase-Bedingungen in Screeningversuchen wird
ein (meist ungewollter) Selektionsdruck hinsichtlich
einer veränderten Morphologie in Richtung hefear-
tigem Wachstum erzeugt. Somit wird im Stamm-
Screening von filamentös wachsenden Mikroorga-
nismen bei den üblichen Endpunktbestimmungen
der Produktkonzentration tendenziell eine Mutante
ausgewählt, welche aufgrund einer veränderten Mor-
phologie zu einer geringen Viskositätserhöhung neigt
und somit die Sauerstofflimitierung später oder gar
nicht eintritt [124]. Die Tendenz zu einer geringeren
Viskositätserhöhung der Kulturbrühe kann aufgrund
der reduzierten benötigten Rührleistung im Rührkes-
sel des späteren Produktionsprozesses auch als posi-
tiver Effekt betrachtet werden.
z Mathematische Bestimmung von Außer-
Phase-Bedingungen
Zur Bestimmung von In-Phase-Bedingungen in
Schüttelkolben ohne Schikanen kann die dimen-
sionslose Phasen-Zahl Ph herangezogen werden.
Die Phasen-Zahl muss den Wert von 1,26 überstei-
gen, um In-Phase-Bedingungen sicherzustellen [17]:
d0
Ph = ⋅(1 + 3⋅ log10 ( Ref )) > 1, 26  Gl. 6.49
d stark reduziert [19]. Dies kann dazu führen, dass ein
mit der Film-Reynolds-Zahl Ref:
 2
 ρ ⋅ n ⋅ d 2  π  4 V 1/3 2 
   L  
Re f =  η  ⋅ 2 ⋅1− 1− π ⋅ d  
 
Gl. 6.50
wobei diese nur eine Gültigkeit bei einer Froude-
Zahl (Fra) größer als 0,4 besitzt [17]:
(2 ⋅π ⋅ n) ⋅ d 
2 2
 0
Fra =   > 0, 4  Gl. 6.51
 2 ⋅ g 
 schen oder filamentösen Zellkulturen Auswirkungen
201 6
In Gl. 6.49–6.51 sind die Variablen wie folgt defi-
niert: d0 ist der Schütteldurchmesser, d der Schüt-
telkolbeninnendurchmesser, ρ die Dichte der
Kulturbrühe, n die Schüttelfrequenz, η die dyna-
mische Viskosität, VL das Füllvolumen und g die
Erdbeschleunigung.
Bei Verwendung von Schüttelkolben mit einem
Innendurchmesser zwischen 25 und 50 mm und
einem Füllvolumen kleiner als 1 L besteht die Gefahr
in Außer-Phase-Bedingungen zu gelangen haupt-
sächlich bei erhöhter Viskosität der Kulturbrühe
[19]. Erhöhte Viskosität tritt beispielweise bei fila-
mentös wachsenden Mikroorganismen oder bei der
Biopolymerproduktion auf. Bei solchen Kultivierun-
gen wird empfohlen, die Phasen-Zahl zu berechnen
[105]. Sollte die Phasen-Zahl von 1,26 unterschritten
werden, ist es in den meisten Fällen am einfachsten,
Schüttelmaschinen mit einem größeren Schüttel-
durchmesser zu verwenden, da dieser am direktes-
ten in die Phasenzahl eingeht.
Auch in orbital geschüttelten Mikrotiterplatten
kann das Außer-Phase-Phänomen auftreten. Auf-
grund des mechanistischen Hintergrunds von Gl. 6.49–
6.51 können diese Gleichungen auch zur groben
Abschätzung der Bedingungen bei Kultivierungen in
Mikrotiterplatten verwendet werden [78].
In Schüttelkolben mit Schikanen wurden Außer-
Phase-Bedingungen bereits bei wasserähnlicher Vis-
kosität und einem Füllvolumen kleiner als 1 L ent-
deckt. Durch zu groß gewählte Schikanen wird die
Geschwindigkeit der rotierenden Flüssigkeitssichel
Teil des Reaktionsmediums trotz der Schüttelbewe-
gung am Boden des Schüttelkolbens verharrt und die
Durchmischung sowie der Sauerstoffeintrag deut-
lich zurückgehen [124]. Entsprechend sollte bei der
Verwendung von Schikanen die Anzahl und Form
der Schikanen sorgfältig abgewogen werden, um eine
Verbesserung der Hydrodynamik zu erzielen und
Außer-Phase-Bedingungen zu vermeiden.
Energiedissipation beim Betrieb von
Schüttelkolben
Die hydromechanischen Belastungen, welche in
einem Bioreaktor auf die Mikroorganismen im Reak-
tionsmedium wirken, können insbesondere bei tieri-
 202 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
auf das Wachstum und die Produktbildung haben.
Die Belastung ist von Reaktor zu Reaktor unter-
schiedlich. Auch innerhalb eines Reaktors ist der
Leistungseintrag in das Reaktionsmedium nicht an
jeder Stelle identisch [165]. Bei einem Vergleich von
Schüttelkolben und Rührkesselreaktoren ist die hyd-
romechanische Belastung der verfahrenstechnische
Parameter, welcher sich in beiden Reaktoren wohl
am meisten voneinander unterscheidet [16, 26].
Während orbital geschüttelte Bioreaktoren einen
geringen lokalen Leistungseintrag aufweisen, ist der
maximale lokale Leistungseintrag bei gleichem spe-
zifischem Leistungseintrag (7 Abschn. 6.4.1.1) bei
6 Rührkesselreaktoren um den Faktor 10 bis 20 höher
[16]. In begasten Rührkesselreaktoren muss beach-
tet werden, dass die dispergierten Gasbläschen eine
turbulenzdämpfende Wirkung aufweisen und so der
lokale Leistungseintrag reduziert wird [26, 27]. Somit
ist es wenig überraschend, dass beim Transfer von
Bioprozessen aus Schüttelkolben in Rührkesselreak-
toren Probleme bei empfindlichen Mikroorganismen
auftreten können. Nicht selten entstehen während
einer Kultivierung in Schüttelkolben größere Pellets
als in Rührkesseln [125]. Aufgrund des längeren
Diffusionsweges in großen Pellets ist die Sauerstoff-
versorgung der Mikroorganismen im Inneren der
Pellets verschlechtert und kann Auswirkungen auf
die Produktbildung haben.
Entsprechend ist es wichtig, die hydromechani-
sche Belastung bei der Maßstabsvergrößerung (engl.
scale-up) eines Bioprozesses zu berücksichtigen. Als
Vergleichskriterium hinsichtlich der hydromechani-
schen Belastung unterschiedlicher Bioreaktoren ist
die lokale maximale Energiedissipationsrate εmax eine
aussagekräftige Größe [53]. Zur Quantifizierung der
maximalen Energiedissipationsrate in Dispergier-
vorrichtungen wird folgender Ansatz genutzt [100]:
u3
εmax = 0,1⋅  Gl. 6.52
h1
wobei u die Geschwindigkeit des turbulenzerzeugen-
den Bauteils ist und h1 die charakteristische Höhe des
leistungseintragenden Bauteils beschreibt. In Rühr-
kesselreaktoren wird die Spitzengeschwindigkeit
des Rührers (u = π · n · d) als Geschwindigkeit und
die Höhe der Rührblätter als charakteristische Höhe
verwendet. Gl. 6.52 ist jedoch nur gültig, wenn eine
voll ausgebildete turbulente Strömung im Reaktor
herrscht [100].
Zur Bestimmung der maximalen Energiedissi-
pationsrate in Schüttelkolben werden je nach vor-
herrschendem Flussregime zwei unterschiedliche
Ansätze verwendet [125]. Die Auswahl des Ansat-
zes erfolgt anhand der Reynolds-Zahl (Re). Bei einer
Reynolds-Zahl größer als 60.000 (turbulent) kann
die maximale Energiedissipationsrate entsprechend
Gl. 6.52 berechnet werden, wobei für h1 die maximale
Flüssigkeitshöhe eingesetzt wird. Zur Beschreibung
der Flüssigkeitsverteilung in Schüttelkolben ohne
Schikanen ist ein komplexes Modell vorhanden, aus
dem mit einigem Aufwand auch die maximale Flüs-
sigkeitshöhe (h1) berechnet werden kann [20]. Zur
vereinfachten Bestimmung der maximalen Flüssig-
keitshöhe wurden zwei empirische Korrelationen
entwickelt [125], die in Abhängigkeit von der axialen
Froude-Zahl (Fra)
2
(2 ⋅π ⋅ n) ⋅ d 0
Fra =  Gl. 6.53
2⋅ g
mit dem Schütteldurchmesser d0, der Schüttelfre-
quenz n und der Erdbeschleunigung g verwendet
werden dürfen. In Abhängigkeit von Fra lässt sich
die maximale Flüssigkeitshöhe wie folgt berechnen
[125]:
, ⋅ d00,18 ⋅ d −0,11⋅ n0,44 ⋅VL0,34
Fra > 0, 4; h1 = 111
 Gl. 6.54
Fra < 0, 4; h1 = 1, 31⋅ d 00,28 ⋅ d 0,02 ⋅ n0,9 ⋅VL0,35
 Gl. 6.55
wobei h1, d0, d in Meter [m], n pro Sekunde [s–1] und
VL in Kubikmeter [m3] angegeben werden.
Für den Fall nicht turbulenter Strömung (Re <
60.000) kann die maximale Energiedissipationsrate
(εmax) gleich der mittleren Energiedissipationsrate
(εϕ) angesehen werden [125]:
P
εφ = = Ne′ ⋅ n3 ⋅ d 4 ⋅VL−2/3  Gl. 6.56
VL ⋅ρ
In Schüttelkolben mit Schikanen kann unab-
hängig von der Reynolds-Zahl die maximale
Kapitel 6 · Bioreaktoren
Energiedissipationsrate mit Gl. 6.52 abgeschätzt
werden [125].
Mischverhalten in Schüttelkolben und
Mikrotiterplatten
Eine gute Durchmischung des Reaktionsmediums
im Bioreaktor ist eine Voraussetzung, um eine
homogene Substratversorgung der Mikroorganis-
men sicherzustellen und reproduzierbare Versuchs-
ergebnisse zu erhalten. Ist das Mischverhalten in
einem Bioreaktor nicht optimal, so können (lokale)
Sauerstofflimitierungen oder Substrat-/Produkt-
überschussinhibierungen auftreten und die Pro-
duktionsleistung der Mikroorganismen signifikant
reduziert werden.
Neben dem spezifischen Leistungseintrag
(7 Abschn. 6.4.1.1) ist die Mischzeit von den Eigen-
schaften des Reaktionsmediums insbesondere der
Viskosität abhängig. Bei niedriger Viskosität ist die
Mischzeit bis zur vollständigen Durchmischung
prinzipiell kürzer als bei viskosen Flüssigkeiten. Mit
zunehmender Viskosität sinkt zudem die Phasen-
zahl (7 Abschn. 6.4.1.2), was aufzeigt, dass das Risiko
zunimmt in Außer-Phase-Bedingungen im Schüttel-
kolben zu gelangen.
Zur experimentellen Bestimmung der Misch-
zeit gibt es mehrere Ansätze: Messung der Tem-
peratur, der Leitfähigkeit, des pH oder auch über
visuelle Methoden [160, 174]. Es konnte in Schüt-
telkolben gezeigt werden, dass mit wässrigen Medien
eine Durchmischung nach 2 Sekunden erreicht wird
[160]. Für eine viskose Flüssigkeit (38 mPa s) hin-
gegen wurde eine Mischzeit von bis zu 65 s bis zur
vollständigen Durchmischung benötigt [160]. Unter-
sucht wurden unterschiedliche Schüttelkolbengrö-
ßen (100 bis 500 mL), verschiedene Schütteldurch-
messer (25 bis 50 mm) und Schüttelfrequenzen (100
bis 300 min–1) basierend auf dem pH-abhängigen
Farbumschlag von Bromthymolblau. In . Abb. 6.36
ist die Abhängigkeit der Mischzeit von der Phasen-
Zahl (Ph) grafisch dargestellt.
Auch für Mikrotiterplatten mit 24 und 96 Wells
wurde die Mischzeit untersucht [7, 174, 183]. In einer
24-Well Mikrotiterplatte wurde eine mittlere Misch-
zeit von 1,7 s für Flüssigkeiten mit wasserähnlicher
Viskosität ermittelt [7]. In Untersuchungen mittels
Verfahren der numerischen Strömungsmechanik
203 6
(engl. Computational Fluid Dynamics, CFD) wurde
zusätzlich das Mischverhalten in 96-Well Mikrotiter-
platten untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass
das Mischverhalten in 96-deep-well Mikrotiterplat-
ten prinzipiell besser ist als in 24-Well Mikrotiter-
platten [183].
Gas-Flüssigkeits-Stofftransfer in
Schüttelkolben und Mikrotiterplatten
Bei der Auslegung geschüttelter Kleinkultursysteme
spielt der Gas-Flüssigkeits-Stofftransfer eine ent-
scheidende Rolle. In aeroben Kultivierungen wird
der im Reaktionsmedium gelöste Sauerstoff aufgrund
der mikrobiellen Atmung kontinuierlich verbraucht.
Im Gegenzug werden Stoffwechselprodukte wie Koh-
lenstoffdioxid und gegebenenfalls weitere gasförmige
oder flüchtige Produkte von den Mikroorganismen
ausgeschieden. Entsprechend ist es wichtig, einen
ausreichenden Austausch zwischen der Gasphase
und der Flüssigkeit sicherzustellen. Insbesondere
das Einbringen ausreichender Sauerstoffmengen
ist essentiell, um sauerstofflimitierte Bedingungen
zu vermeiden und so beispielsweise die Bildung
unerwünschte Nebenprodukte zu verhindern [104,
153]. Daher müssen die Betriebsparameter (z. B.
Schüttelfrequenz, Füllvolumen, Schütteldurchmes-
ser) so gewählt werden, dass die Kultivierung unter
optimalen Bedingungen abläuft [15].
z Messung der Sauerstofftransferrate
In der Literatur sind zahlreiche Messmethoden zur
Bestimmung der maximalen Sauerstofftransferka-
pazität (OTRmax) beziehungsweise des volumen-
bezogenen Sauerstoffübergangskoeffizienten (kLa)
beschrieben. Es gibt Methoden, die auf der Bestim-
mung der Gelöstsauerstoffkonzentration (engl. dis-
solved oxygen tension, DOT im deutschen auch als
pO2 bezeichnet) basieren [58]. Alternativ kann direkt
die Messung der Sauerstofftransferrate (engl.: oxygen
transfer rate, OTR) mittels des Respiration Activity
MOnitoring Systems (RAMOS, 7 Abschn. 6.5.1) erfol-
gen [3, 4]. Weitere Ansätze bestimmen die OTR über
den Einsatz von Oxydasen [32].
In vielen Fällen kann die Verwendung der chemi-
schen Sulfit-Methode zur Messung der ORTmax sinn-
voll sein [106, 166]. Dieses chemische Modellsystem
bietet den Vorteil, dass keine sterilen Bedingungen
 204 H. Chmiel und D. Weuster-Botz

. Abb. 6.36  Einfluss der Viskosität

auf die Mischzeit im Schüttelkolben.
Mit zunehmender Viskosität steigt
die Mischzeit bei Annäherung
an die kritische Phasen-Zahl (Ph)
von 1,26 stark an. Unter Außer-
Phase-Bedingungen (Ph ≤ 1,26)
verbleibt ein Teil der Flüssigkeit auf
dem Boden des Schüttelkolbens.
Unter In-Phase-Bedingungen (Ph
> 1,26) folgt die Flüssigkeit der
Rotationsbewegung des Schüttlers.
Schüttelbedingungen: 250 mL
Schüttelkolben, Schüttelfrequenz n
= 200 rpm, Füllvolumen VL = 25 mL,
6 Schütteldurchmesser d0 = 50 mm

während der Messung im Reaktor herrschen müssen. der Gas-Flüssigkeit-Austauschfläche größer als bei
Zudem kann sichergestellt werden, dass sauerstoff- der Diffusion durch den Schüttelkolbenverschluss
limitierte Bedingungen im Reaktor vorherrschen. [115, 173]. Basierend auf der Sauerstoffmassenbilanz
Bei Anwendung der Sulfit-Methode ist jedoch eine kann die Sauerstofftransferrate aus der Gasphase in
ausreichende Durchmischung des Reaktors Voraus- die Flüssigkeit wie folgt berechnet werden:
setzung. Durch Inhomogenitäten im Reaktionsme-
dium kann es zu lokalen Sulfit-Konzentrationssen-
ken an der Flüssigkeitsoberfläche kommen, wodurch 2
(
OTR = kL ⋅ a ⋅ LO ⋅ pAbs γ O
2,Gas
− γO 
2,Flussig
)
die Oxidation nicht erfolgt und somit letztlich für die  DOT 
= kL ⋅ a ⋅ LO ⋅ pO ,Gas − ⋅ pO ,Kal 
2  100 
OTRmax falsche Werte gemessen werden [102]. 2 2

z Diffusionswiderstände bei Kultivierungen im
Schüttelkolben
Um Kontaminationen von Schüttelkolben während
der Kultivierung zu verhindern, wird die Schüttel-
kolbenöffnung meist mit Watte-, Papier- oder Poly-
merschaumstopfen verschlossen [115, 117]. Durch
solche Stopfen wird zwar die Sterilität während der
Kultivierung sichergestellt, zeitgleich wird jedoch
auch ein Diffusionswiderstand für den Gasaustausch
mit der Umgebungsluft erzeugt. Dies führt dazu, dass
der Sauerstoffpartialdruck im Kopfraum des Schüt-
telkolbens während einer Kultivierung niedriger ist
als der Sauerstoffpartialdruck in der Umgebungsluft.
Unter gewöhnlichen Schüttelbedingungen stellt die
Diffusion durch den Schüttelkolbenstopfen jedoch
nicht den limitierenden Schritt der Sauerstoffversor-
gung dar [48]. Aufgrund der geringen Sauerstofflös-
lichkeit von etwa 1 mmol L–1 (30 °C) in wässrigen
Medien bzw. Salzlösungen ist der Widerstand an
 Gl. 6.57
Die OTR ist somit vom Massentransferkoeffizient
(kL), der spezifischen Grenzfläche (a), der Sauer-
stofflöslichkeit (LO ) im Reaktionsmedium sowie
2
vom Sauerstoff-Molanteil in der Gas-γ O ,Gas ) und
2
Flüssigphase (γ O , Flussig ) abhängig. Der treibende
2 
Gradient kann auch mittels der Differenz des Sauer-
stoffpartialdrucks in der Gasphase über der Flüssig-
keit ( pO ,Gas ) und der Gelöstsauerstoffkonzentration
2
DOT unter Berücksichtigung des Sauerstoffpartial-
drucks bei der Kalibrierung (DOT/100 · pO , Kal )
2
beschrieben werden.∆pO , Kal ist der bei der Kalib-
2
rierung gewöhnlich mit Luft herrschende Sauerstoff-
paritaldruck über der Flüssigkeit. Wenn DOT nahezu
Null ist (γ O , Flussig ) ≈ 0) und der Sauerstoffmolan-
2 
teil im Kopfraum des Schüttelkolbens angenähert
0,21 beträgt, entspricht die Sauerstofftransferrate
(OTR) der maximalen Sauerstofftransferkapazität
(OTRmax).
Kapitel 6 · Bioreaktoren
z Einfluss der Betriebsparameter auf die
maximale Sauerstofftransferkapazität in
Schüttelkolben
Entsprechend Gl. 6.57 ist die OTR vom volumenbe-
zogenen Sauerstoffübergangskoeffizient (kLa) abhän-
gig. Dieser setzt sich zusammen aus dem Massen-
transferkoeffizient (kL) und der volumenspezifischen
Phasengrenzfläche (a). Beide Parameter sind von den
gewählten Betriebsbedingungen abhängig.
Eine empirische Korrelation zur Abschätzung
der maximalen Sauerstofftransferkapazität wurde
auf Basis der Sulfit-Methode entwickelt [149]. Zur
Abschätzung in Kulturmedien muss zusätzlich die
Sauerstofflöslichkeit im Medium bekannt sein,
welche sich unter anderem rechnerisch bestimmen
lässt [133, 173]. In einer aktuellen Arbeit wurde eine
empirische Korrelation unter Berücksichtigung der
Osmolarität zur Abschätzung der OTRmax vorgestellt
[110]. Sie repräsentiert angenähert die Änderungen
der Sauerstofflöslichkeit und des Diffusionskoeffi-
zienten mit der Konzentration des Mediums. Die
Osmolarität des Mediums lässt sich ohne großen
Aufwand messen und muss nicht berechnet werden.
Auf Basis von über 350 Experimenten wurde fol-
gende empirische Gleichung bestimmt [110]:
 Osmol 
, −
118
OTRmax − 7 0,05
= 3, 72 ⋅10 ⋅Osmol ⋅ n  10,1 
⋅VL−0,74 ⋅ d00,33 ⋅ d 188
, ⋅ p ⋅ y*
R O
 Gl. 6.58
wobei die Schüttelfrequenz (n) [min–1], das Füll-
volumen (VL) [mL], der Schüttelradius (d0) [cm],
der maximaler Kolbeninnendurchmesser (d) [mm]
sowie die Osmolarität (Osmol) [Osmol kg–1] des
Mediums bekannt sein müssen. In diese empiri-
sche Gleichung sind sowohl Daten für wasserähn-
liche Viskositäten aus Modellversuchen mit dem
Sulfit-System als auch Messwerte aus mikrobiellen
Kultivierungen (16 unterschiedliche Medien und 10
unterschiedliche Organismen) eingeflossen. Durch
den großen verwendeten Datensatz ist die Gültig-
keit der Korrelation zudem in einem breiten Para-
meterbereich (Schütteldurchmesser: 1,25–10 cm;
Schüttelkolbendurchmesser: 51–131 mm (≙ Schüt-
telkolbennennvolumen: 50–1000 mL); Füllvolu-
men: 2–160 mL; Schüttelfrequenz: 100–450 rpm) für
205 6
Schüttelkolben ohne Schikanen gegeben. Für die mit
dieser Korrelation ermittelten OTRmax wurde eine
Genauigkeit von ±5 mmol L–1h–1 angegeben. In einer
weiteren Arbeit konnte gezeigt werden, dass kLa, die
mittels Gl. 6.58 berechnet wurden, sehr gut mit kLa
übereinstimmen, die basierend auf gemessenen OTR
und DOT während Kultivierungen von Kluyveromy-
ces lactis, Escherichia coli und Hansenula polymorpha
ermittelt wurden [39].
z Einfluss der Betriebsparameter auf die
maximale Sauerstofftransferkapazität in
Mikrotiterplatten
Mit der zunehmenden Verwendung von Mikrotiter-
platten als Bioreaktor sind auch vermehrt Korrela-
tionen zur Abschätzung der maximalen Sauerstoff-
transferkapazität zu finden [40, 78, 80]. Auf Basis
von Messungen in konventionellen 96-Well Mik-
rotiterplatten wurde ein starker Einfluss des Schüt-
teldurchmessers auf die maximale Sauerstofftrans-
ferkapazität festgestellt [59]. Des Weiteren wurde
die kritische Drehzahl (ncrit) eingeführt [59]. Diese
Drehzahl muss überschritten werden, um das Reak-
tionsmedium innerhalb der Wells in eine Rotations-
bewegung zu versetzen und die Ausbildung der cha-
rakteristischen Flüssigkeitssichel zu bewirken. Bei
 Drehzahlen kleiner als ncrit wurde trotz Rotation des
Schütteltablars keine Fluidbewegung detektiert. Zur
Berechnung von ncrit wurde eine Gleichung auf Basis
2
von Daten aus 96-Well Mikrotiterplatten bestimmt
[59], welche zudem auch für 48-Well Mikrotiterplat-
ten anwendbar ist [78]:
σ ⋅d  Gl. 6.59
ncrit =
4 ⋅π ⋅VL ⋅ρL ⋅ d0
σ ist die Grenzflächenspannung (Oberflächenspan-
nung) [N/m], d ist der Welldurchmesser [m], VL ist
das Füllvolumen [m3], ρL ist die Flüssigkeitsdichte
[kg m–3] und d0 ist der Schütteldurchmesser [m]. Die
Gleichung basiert auf der Annahme, dass die Ober-
flächenspannung der Flüssigkeit mit der Zentrifu-
galkraft, welche durch die orbitale Schüttelbewe-
gung erzeugt wird, überwunden werden muss, um
die Flüssigkeit in Bewegung zu versetzen. Erst nach
Überschreiten der kritischen Drehzahl ncrit ist die
OTRmax abhängig von der Schüttelfrequenz. Sofern
allerdings ncrit unterschritten wird, ist die OTRmax
 206 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
unabhängig von der Schüttelfrequenz und bleibt im
Bereich der Diffusionsrate von Sauerstoff in stehen-
den Flüssigkeiten.
Für 48-Well Mikrotiterplatten wurde zusätzlich
der Einfluss unterschiedlicher Schütteldurchmes-
ser (von 1 bis 50 mm) und verschiedener Füllvolu-
mina (300 bis 600 µL) auf den kLa untersucht [78].
Für einen Schütteldurchmesser von 1 mm wurde
keine Zunahme des kLa mit zunehmender Schüt-
telfrequenz ermittelt. Dieses Phänomen konnte
mit Außer-Phase-Bedingungen (7 Abschn. 6.4.1.2)
erklärt werden. Bei größeren Schütteldurchmessern
hingegen konnte eine Abhängigkeit des kLa von der
6 Schüttelfrequenz gezeigt werden.
Ähnlich dem Ansatz in Schüttelkolben, ist es in
Mikrotiterplatten möglich, die maximale Sauerstoff-
transferkapazität mit Hilfe von Schikanen zu erhöhen
[40, 98]. Dies ist insbesondere bei Kultivierungen
mit hohem Sauerstoffverbrauch empfehlenswert,
um sauerstofflimitierende Bedingungen zu vermei-
den. Im Gegensatz zur Herstellung der Schikanen in
Schüttelkolben aus Glas erfolgt die Herstellung von
Mikrotiterplatten nicht manuell. Somit ist sicherge-
stellt, dass die Schikanen in jedem Well die gleiche
Geometrie aufweisen und die einzelnen Wells unter-
einander verglichen werden können. In Mikrotiter-
platten mit Schikanen können 5- bis 10-fach höhere
OTRmax erreicht werden [40]. Um die OTRmax unter-
schiedlicher Mikrotiterplatten bzw. unterschiedli-
cher Wellformen vergleichen zu können, wurde fol-
gende empirische Korrelation entwickelt [98]:
−7 6.0 2.37 −0.64
OTRmax = 2.5 ⋅10 ⋅ Peri ⋅ n ⋅VL
+3.3 ⋅10−4
 Gl. 6.60
wobei n die Schüttelfrequenz [min–1] und VL das
Füllvolumen [µL] ist. Peri ein relativer Parameter
[–], der wie folgt berechnet wird [98]:
Umfang Schikanen
Peri =  Gl. 6.61
Umfang Rund
mit dem Umfang des Wells mit Schikanen
(UmfangSchikane) und dem Umfang des Wells mit
runder Referenzgeometrie (Umfang Rund). Es ist
zu beachten, dass die Querschnittsflächen der
verglichenen Wellgeometrien gleich sein müssen,
um identische Füllhöhen sicherzustellen. Durch
die Verwendung des relativen Parameters Peri wird
sowohl die Größe, als auch die Anzahl der Schika-
nen berücksichtigt.
z Einfluss des Reaktormaterials
Konventionelle Schüttelkolben werden aus Glas
gefertigt [15]. Inzwischen sind zudem Einweg-
schüttelkolben aus Polycarbonat oder Polypropylen
kommerziell erhältlich [81]. Bei der Herstellung von
Mikrotiterplatten wird häufig auf Polystyrol, Polytet-
rafluorethylen (Teflon) und Polymethylmethacrylat
zurückgegriffen [31]. Entsprechend der Vielfalt der
verwendeten Ausgangsmaterialien weisen die daraus
hergestellten Schüttelkolbenreaktoren unterschied-
liche Oberflächeneigenschaften auf.
Nach Gl. 6.57 hat die spezifische Austauschfläche
(a) einen direkten Einfluss auf die Sauerstofftransfer-
rate. Je nach verwendetem Material des Reaktors kann
die innere Reaktoroberfläche hydrophile oder hydro-
phobe Eigenschaften aufweisen. Diese Oberflächen-
eigenschaft entscheidet maßgeblich, ob sich ein Flüs-
sigkeitsfilm an der Reaktorwand durch das Anhaften
der Kulturbrühe ausbilden kann. An einer hydrophi-
len Reaktorwand, die entsprechend wasseranziehende
Eigenschaften aufweist, wird das Ausbilden eines
Flüssigkeitsfilms begünstigt und somit die Stofftrans-
ferfläche der Flüssigkeit vergrößert. Aufgrund der
vergrößerten Flüssigkeitsoberfläche wird der Stoff-
austausch mit der Gasphase verbessert [20]. In Schüt-
telkolben konnte die maximale Sauerstofftransferka-
pazität (OTRmax) um bis zu 50 % durch das Erzeugen
einer hydrophilen Oberfläche erhöht werden [106]. In
Mikrotiterplatten wurde das gleiche Verhalten beob-
achtet [59]. Bei Verwendung von hydrophilen Mikro-
titerplatten muss jedoch berücksichtigt werden, dass
die Schüttelfrequenz, bei der die Flüssigkeit aus dem
Well überschwappen kann, bereits früher erreicht
wird. Somit muss die Drehzahl reduziert werden, was
zu einer Reduzierung der OTRmax führt und letztlich
etwa wieder in den gleichen OTRmax-Niveaus wie bei
hydrophoben Mikrotiterplatten resultiert.
z Einfluss der Viskosität
Die Viskosität des Reaktionsmediums kann sich
beispielsweise durch filamentöses Wachstum oder
Bildung von Polymeren wie Xanthan [105] oder
Kapitel 6 · Bioreaktoren
γ-Polyglutamat [179] während der Kultivierung in
Schüttelkolben auf Werte deutlich über 100 mPa
s erhöhen. Die oben genannten Gleichungen zur
Abschätzung der maximalen Sauerstofftransferka-
pazität (OTRmax) wurden auf Basis von wasserähn-
lichen Flüssigkeiten bestimmt und sind somit nicht
für viskose Flüssigkeiten gültig.
Es wurde gezeigt, dass die Viskosität einen Ein-
fluss auf die OTRmax hat [44, 105]. Bei Kultivierun-
gen in Schüttelkolben ohne Schikanen wurde fest-
gestellt, dass die OTRmax bis zu einer Viskosität von
10 mPa s überraschenderweise zunimmt [44]. Der
Anstieg der OTRmax wurde mit dem Ausbilden eines
dickeren Flüssigkeitsfilms an der Wand des Schüt-
telkolbens begründet. Aufgrund des dickeren Flüs-
sigkeitsfilms sättigt sich dieser nicht so schnell mit
Sauerstoff auf. Dadurch wird das treibende Sauer-
stoffkonzentrationsgefälle zwischen Reaktionsme-
dium und dem Sauerstoffpartialdruck in der Gas-
phase des Schüttelkolbens vergrößert. Bei einer
weiteren Erhöhung der Viskosität (> 20 mPa s) zeigt
sich genau das gegenteilige Verhalten, die OTRmax
sinkt aufgrund eines reduzierten Sauerstoffdiffu-
sionsvermögens in der Flüssigkeit [44]. Ein Unter-
schreiten der OTRmax bei wasserähnlicher Visko-
sität (~1 mPa s) wurde bis zu einer Viskosität von
80 mPa s nicht detektiert. In diesem Punkt unter-
scheidet sich der Schüttelkolben extrem von Rühr-
kesselreaktoren. Bei einer Viskosität von 80 mPa
s in Rührkesselreaktoren werden lediglich noch
5 % von der OTRmax bei wasserähnlicher Viskosi-
tät erreicht [44].
z Einfluss der Scherrate
Bei der Auslegung eines Bioreaktors muss die effek-
tive Scherrate γ eff berücksichtig werden. Diese hat
einen entscheidenden Einfluss auf die apparente Vis-
kosität (ηapp) eines Reaktionsmediums mit nicht-
newtonschem strukturviskosen Fließverhalten und
beeinflusst somit unter anderem den Wärmetrans-
fer und das Mischverhalten (7 Abschn. 6.4.1.4) inner-
halb des Reaktors [44]. Die apparente Viskosität
(η app) von nichtnewtonschen strukturviskosen Kul-
turmedien lässt sich entsprechend dem Fließgesetz
von Ostwald und de Waele wie folgt beschreiben [10,
75]:
m−1
ηapp = K (γ eff )  Gl. 6.62
207 6
m ist der dimensionslose Index zum Beschreiben des
Fließverhaltens und K ist der Fluss-Konsistenz-Index.
Wasserähnliche Reaktionsmedien können als
newtonsche Fluide betrachtet werden, welche eine
konstante Viskosität über die Scherrate aufweisen.
Die Viskosität nichtnewtonscher Flüssigkeiten hin-
gegen weist eine Abhängigkeit von der Scherrate auf.
Mit Hilfe der folgenden Gleichung lässt sich γ eff [s–1]
in Schüttelkolben mit einem Fassungsvermögen von
50 bis 1000 mL unter In-Phase-Bedingungen berech-
nen [45]:
x / m+1
 P / VL 1/ m+1 VL1/3 
γ eff = L1/ m+1⋅ ⋅   Gl. 6.63
 K   d 
wobei P/V L der spezifische Leistungseintrag
(7   Abschn. 6.4.1.1) ist, VL dem Füllvolumen ent-
spricht und d der Schüttelkolbendurchmesser ist. Die
dimensionslosen Kennzahlen x = –0,331 (Exponent
der geometrischen Zahl) und L = 2,06 (Proportio-
nalitätsfaktor) sind in folgendem Parameterbe-
reich gültig [45]: P/VL = 0,71–15,1 kW m–3; VL =
10–100 mL; m = 0,107–1; K = 49–23.233 mPa sm.
Es ist bemerkenswert, dass hier für Schüttelkol-
ben eine Abhängigkeit vom Leistungseintrag gefun-
den wurde. Ältere Arbeiten mit nichtnewtonschen
Flüssigkeiten in Rührkesseln verwenden meist (aus
Mangel an anderen Korrelationen) das Metzner-Ot-
to-Konzept [113], bei welchem die Scherrate linear
mit der Drehzahl korreliert wird. Das Metzner-Ot-
to-Konzept wurde allerdings für laminare Bedin-
gungen abgeleitet und gilt nicht für turbulente Strö-
mungszustände [113]. Henzler und Kauling [56]
leiteten für Rührkessel das Leistungskonzept ab,
welches später bestätigt wurde [24, 54]. Es stellte
sich heraus, dass das Metzner-Otto-Konzept ein
Sonderfall des Leistungskonzepts für vollständig
bewehrte Rührkessel im laminaren Strömungszu-
stand darstellt.
6.4.2 Geschüttelte Bioreaktorsysteme
im großen Maßstab
Zur Produktion rekombinanter Proteine in tieri-
schen oder pflanzlichen Zellkulturen werden immer
öfter geschüttelte Systeme in einem Maßstab von 10
bis 2000 L eingesetzt [81]. Kultursysteme in diesem
 208 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
Maßstab bestehen in der Regel aus einer Schüttelma-
schine, welche mit zylindrischen Einwegbioreaktoren
ausgestattet werden [85, 103, 116, 184]. Solche zylin-
drischen Einwegbioreaktoren haben gegenüber kom-
plexeren Einwegsystem den Vorteil, dass kein aufwen-
diges Design, beispielsweise aufgrund der Integration
eines Rührsystems, entwickelt werden muss [81]. Des
Weiteren ist ein einfacher Scale-Up aus Schüttelkol-
ben und Mikrotiterplatten (7 Abschn. 6.4.1) möglich,
welche meist zum Stammscreening oder zur Medien-
optimierung eingesetzt werden, da ebenfalls eine reine
Oberflächenbegasung auftritt [161]. Zur Berech-
nung charakteristischer Parameter kann jedoch nicht
6 einfach auf Modelle oder empirische Gleichungen
aus Schüttelkolben zurückgegriffen werden, da die
Geometrien der Reaktoren deutliche Unterschiede
aufweisen [20]. Während orbital geschüttelte Biore-
aktorsysteme aus zylindrischen Gefäßen bestehen,
hat die Schüttelkolbenwand in der Regel eine sich
nach oben konische verjüngende Geometrie. Es ist
auch bei orbital geschüttelten zylindrischen Biore-
aktoren darauf zu achten, dass die in Schüttelkolben
beschriebenen Außer-Phase-Bedingungen (7 Abschn.
6.4.1.2) nicht auftreten. Daher wird empfohlen auf ein
bestimmtes Verhältnis von Schütteldurchmesser (d0)
zu Reaktordurchmesser (d) zu achten. Dieses Verhält-
nis (d0/d) wird als Geometrie-Zahl bezeichnet. Die
geometrischen Unterschiede zwischen Schüttelkol-
ben und zylindrischem Bioreaktor wirken sich auch
auf den spezifischen Leistungseintrag (P/V) in orbital
geschüttelten zylindrischen Bioreaktoren aus, welcher
sich nach [84] berechnen lässt:
P
= 9 ⋅ g −0,42 ⋅ρ 0,83 ⋅ d 3,34 ⋅ n3,67
V
⋅ η 0,17 ⋅VL−0,56 ⋅ d00,42  Gl. 6.64
mit g der Erdbeschleunigung [m s–2], ρ der Flüssig-
keitsdichte [kg m–3], d dem Reaktordurchmesser [m],
n der Schüttelfrequenz [s–1], η der dynamischen Vis-
kosität [kg m–1 s–1], VL dem Füllvolumen [m3] und
d0 dem Schütteldurchmesser [m]. Gl. 6.64 basiert auf
experimentellen Daten von orbital geschüttelten
zylindrischen Einwegbioreaktoren mit 10 bis 2000 L
Reaktorvolumen. Die Gültigkeit der empirischen
Korrelation ist auf folgenden Bereich beschränkt [84]:
d0
Geometrie-Zahl: 0, 08 < < 0, 36
d d
n2 ⋅ d0
Froude-Zahl: 0, 05 < < 0, 3
g
VL
Volumen-Zahl: 0, 085 < < 0, 5
d3
Reynolds-Zahl: 2400 < Re < 250.000
Zudem muss die kritischen Drehzahl (n′ crit)
überschritten werden. Bei Drehzahlen größer als
n′crit wird die Flüssigkeit in orbital geschüttelten
zylindrischen Bioreaktoren in Rotation versetzt. n′crit
kann wie folgt berechnet werden [84]:
1
n' crit= ⋅ 0, 28⋅VL ⋅ g  Gl. 6.65
d
Zu Gl. 6.64 bleibt anzumerken, dass der Schüttel-
durchmesser (d0) einen nicht vernachlässigbaren
Einfluss auf den spezifischen Leistungseintrag in
orbital geschüttelten zylindrischen Bioreaktoren
hat. Bei Schüttelkolben ist dies nicht der Fall, sodass
bei der Betrachtung des spezifischen Leistungs-
eintrags in Schüttelkolben d0 nicht weiter berück-
sichtigt werden musste (7 Abschn. 6.4.1.1) [17]. Der
unterschiedliche Einfluss des Schütteldurchmessers
auf den spezifischen Leistungseintrag bei orbital
geschüttelte Bioreaktoren und Schüttelkolben ist in
. Abb. 6.37 grafisch dargestellt.
Unter In-Phase-Betriebsbedingungen, mit Dreh-
zahlen größer als n′crit, lässt sich der volumenspezi-
fische Sauerstofftransferkoeffizient kLa mit folgender
Gleichung bestimmen, die aus einer Dimensionsana-
lyse hervorgegangen ist [83]:
kLa = 1, 06 ⋅10−3 ⋅ d 4,3 ⋅ n 2,12 ⋅
VL−1,2 ⋅ v−0,21⋅ DO0,12 ⋅ g −0,51  Gl. 6.66
2
mit d dem inneren Reaktordurchmesser [m], n der
Schüttelfrequenz [s–1], VL dem Füllvolumen [m3],
v der kinematischen Viskosität [m2 s–1], Do dem
2
Sauerstoffdiffusionskoeffizient [m2 s–1] und g der
–2
Erdbeschleunigung [m s ]. Gl. 6.66 ist nur gültig für
orbital geschüttelte zylindrische Bioreaktoren mit
einem Reaktorvolumen von 2 bis 200 L, wenn zudem
folgende Bedingungen erfüllt sind [83]:
d0
Geometrie-Zahl: 0, 06 < < 0, 42
Kapitel 6 · Bioreaktoren
209 6

n2 ⋅ d0
Froude-Zahl: 0, 013 < < 0, 097 
g
V
Volumen-Zahl: 0,18 < L3 < 0, 65
d
d3⋅ g
10
Galilei-Zahl: 6, 2 ⋅10 < 2 < 1, 88 ⋅1012
v
v
Schmidt-Zahl: 417 ⋅10 < 10 < 878
DO
2

6.5 Parallelbioreaktorsysteme für

die Bioprozessentwicklung

6.5.1 Überwachung der

Atmungsaktivität
bei Kultivierungen in
Schüttelkolben (RAMOS)

Tobias Ladner und Jochen Büchs

Die Selektion aussichtsreicher Biokatalysatoren,

Medienoptimierungen oder auch das Stammscree-
ning erfordern eine enorme Zahl von Parallelver-
suchen. Für solche Anwendungen werden überwie-
gend Parallelbioreaktorsysteme wie Schüttelkolben
und Mikrotiterplatten (7 Abschn. 6.4.1) eingesetzt
[9, 38]. Mit diesen Kultursystemen werden auf-
grund des geringeren Materialeinsatzes zum einen
Kosten eingespart und zum anderen können zahl-
reiche Fermentationen in kurzer Zeit durchgeführt
werden [97]. Auch in diesen miniaturisierten Biore-
aktoren ist die online Überwachung wichtiger bio-
logische Parameter wie der Sauerstofftransferrate
(OTR), die Gelöstsauerstoffkonzentration (DOT),
pH oder die Biomasse- und Produktkonzentration
unerlässlich, um das Prozessverständnis zu maxi-
mieren und die Betriebsbedingungen weiter zu
optimieren.
Mit RAMOS (Respiration Activity MOnito-
ring System) ist es möglich, die Atmungsaktivität
in acht parallelen Schüttelkolben online zu über-
wachen [4, 151]. Es handelt sich dabei um eine sehr
robuste Messtechnik, welche die Sauerstoff- (OTR)
und die Kohlendioxidtransferrate (CTR) sowie den
Respirationsquotienten (RQ) bereitstellt und damit
. Abb. 6.37  Einfluss des Schütteldurchmessers; (a)
zylindrisches Gefäß; Nominalvolumen: 20 L; Füllvolumen: 6 L;
(b) Schüttelkolben; Nominalvolumen: 500 mL; Füllvolumen:
50 mL
Informationen liefert, die sonst nur mittels einer auf-
wendigen Abgasanalytik verfügbar gemacht werden
können (. Abb. 6.38a).
Zur Erhöhung der Messdichte wurde zusätzlich
eine mathematische Analysemethode entwickelt
[50]. Die RAMOS-Technik erlaubt durch eine spe-
zielle Kalibrier- und Messprozedur die Anpassung
der Empfindlichkeit an die Atmungsaktivität der
untersuchten Mikroorganismen bzw. Zellen. Sie ist
daher auch für tierische Zellen anwendbar, welche
etwa eine um den Faktor 100 geringere Atmungsak-
tivität besitzen als Bakterien. Die RAMOS-Technik
ist primär dafür konzipiert, die Vorgänge im Scree-
ning zu erfassen und sichtbar zu machen. Da die Mög-
lichkeit besteht, parallel verschiedene Prozessgrößen
detailliert beispielsweise auch durch Berechnung von
Bilanzen und Stöchiometrien untersuchen zu können,
lassen sich mit dieser Technik auch Teilaufgaben, die
traditionell der Prozessentwicklung im Laborreaktor
 210 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
. Abb. 6.38  (a) Das Respiration
Activity Monitoring System (RAMOS)
zur Messung der Sauerstoff- und
Kohlendioxidtransferrate und
des Respirationskoeffizienten
(OTR, CTR, RQ) in Schüttelkolben
(b) BioLector-Technology: Quasi-
kontinuierlich Messung von Streulicht
und Fluoreszenzen sowie, bei
Verwendung von Optoden, pH und
Gelöstsauerstoffkonzentration in
Mikrotiterplatten
zugerechnet worden sind, abarbeiten [72, 153]. Durch
6 eine parallele Versuchsführung können kleinste
Unterschiede zwischen Kulturen aufgedeckt werden,
und die Notwendigkeit offline Proben zu analysieren
kann reduziert werden [87, 180].
Um neben OTR, CTR und RQ mittels RAMOS
auch die Gelöstsauerstoffkonzentration (DOT) und
den pH online in Schüttelkolben messen zu können,
werden spezielle Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt [5,
79]. Zur DOT Messung wird der sauerstoffsensitive
Farbstoff entweder als Optoden an die innere Schüt-
telkolbenwand geklebt oder als Nanopartikel in der
Kulturbrühe dispergiert [39]. Bei Verwendung von
Optoden ist jedoch zu beachten, dass es unter Schüt-
telbedingungen, die einen hohen Sauerstoffeintrag
(geringes Füllvolumen und hohe Schüttelfrequenz)
ermöglichen, keine Stelle im Schüttelkolben gibt, die
permanent mit Kulturbrühe bedeckt ist [49]. Somit
wird die DOT der Kulturbrühe nicht korrekt gemes-
sen, sondern ein Mischsignal aus dem Sauerstoff in
der Gasphase und der Gelöstsauerstoffkonzentra-
tion bestimmt [39]. Es konnte gezeigt werden, dass
die zugesetzten sauerstoffsensitiven Nanopartikel
keinen Einfluss auf die Kultivierung unterschied-
licher Mikroorganismen haben und verlässliche
DOT-Werte bestimmt werden können [39].
Mit Hilfe eintauchender autoklavierbarer pH-
Standardelektroden kann eine pH-Messung im
Schüttelkolben realisiert werden [176]. Durch das
Eintauchen der Sonde wird jedoch die Hydrody-
namik im Schüttelkolben verändert, weshalb ein
Vergleich mit Standardschüttelkolben nur bedingt
möglich ist [155]. Um eine Beeinflussung der Hydro-
dynamik im Schüttelkolben aufgrund der pH-Mes-
sung zu vermeiden, werden ebenfalls Optoden ein-
gesetzt [5, 79, 139].
Gerade für das Screening hat es sich als kritisch
erwiesen, dass dieses bisher ausschließlich im Satzbe-
trieb (engl. batch) erfolgt, die spätere Produktion aller-
dings oftmals im Zulaufverfahren (engl. fed-batch).
Daraus ergeben sich große, teils entscheidende Unter-
schiede in den Umgebungsbedingungen für die kul-
tivierten Mikroorganismen. Im Satzbetrieb kann es
zu einer Inhibierung durch Substratüberschuss oder
durch einen zu hohen osmotischen Druck kommen.
Viele Mikroorganismen neigen außerdem zu einem
overflow-Metabolismus bei dem eventuell hemmende
Nebenprodukte gebildet werden oder der pH in
ungünstige Bereiche abdriftet. Wenn die Produktbil-
dung einer Katabolitrepression unterliegt, produzieren
die Mikroorganismen auf Mineralmedium im batch so
gut wie kein Produkt und lassen sich nicht screenen.
Aus all diesen Gründen wird in der Produktion das
Zulaufverfahren bevorzugt. Es ist daher sehr sinnvoll
das Screening auch im fed-batch durchzuführen. Solche
Systeme können in der Regel mit RAMOS kombiniert
werden, sodass auch während Zulaufkultivierungen
OTR, CTR und RQ gemessen werden können. Zur Rea-
lisierung des Zulaufbetriebs in Schüttelkolben gibt es
neben Technologien, die auf einer Pumpensteuerung
basieren [176], auch Systeme, die auf der kontrollier-
ten enzymatischen Freisetzung [121] beruhen und dif-
fusionskontrollierte feeding-Systeme [72]. Ein Vorteil
der beiden letztgenannten Systeme besteht darin, dass
kein zusätzliches technisch aufwendiges Equipment
wie Pumpen und Ventile benötigt wird. Eine einfach
anzuwendende und kostengünstige Methode basiert
auf der enzymatischen Freisetzung von Glucose [46,
121]. Dazu werden Stärke und hydrolytische Enzyme
zum Reaktionsmedium gegeben. Durch die enzy-
matische Degradierung von Stärke wird Glucose im
Medium verfügbar, welche von den Mikroorganismen
Kapitel 6 · Bioreaktoren
aufgenommen und verwertet wird. Die Freisetzungs-
rate lässt sich über die Stärkekonzentration und die
zugesetzten Enzymmengen in einem weiten Bereich
kontrollieren. Diese Freisetzungssysteme sind jedoch
auf Glucose als Substrat limitiert und funktionieren nur
in einem begrenzten pH- und Temperaturbereich. Bei
Protease- oder Amylase-bildenden Mikroorganismen
ist die Methode nur sehr beschränkt anwendbar. Ein
Beispiel für ein diffusionskontrolliertes feeding-System
sind die sogenannten FeedBeads [72]. FeedBeads sind
Elastomerscheiben, die aus einer mit Glucosekristal-
len versetzten Silikonmatrix bestehen. Sie sind sche-
matisch in . Abb. 6.39 dargestellt. Bei Kontakt mit dem
Reaktionsmedium diffundiert Wasser in die Silikon-
matrix, wodurch die Glucosekristalle in Lösung über-
gehen und in die Kulturbrühe diffundieren. Die Freiset-
zungsrate kann über die chemische Beschaffenheit der
Polymermatrix, die Struktur und Größe der Elastomer-
scheiben sowie die immobilisierten Substratkonzentra-
tion eingestellt werden. Neben Glucose können so alle
kristallinen Nährstoffe freigesetzt werden. Daneben
sind auch pH-Stellmittel einschließbar, wodurch eine
pH-Regulierung möglich ist [139].
Ein weiteres diffusionskontrolliertes System ver-
wendet ein Substratreservoir, das zentral im Schüt-
telkolben eingelassen ist [6]. Mittels einer in das
Reaktionsmedium eingetauchten Spitze, die perma-
nent der Schüttelbewegung folgt, steht das Reservoir
über eine Membran kontinuierlich in Kontakt mit
der Flüssigkeit. Basierend auf der Diffusion durch
die Membran können sowohl flüssige als auch gelöste
. Abb. 6.39  Konzept der freisuspendierten polymerbasierten Freisetzungssysteme
211 6
feste Substrate in das Reaktionsmedium zugefüttert
werden, was somit auch eine pH-Regelung erlaubt.
6.5.2 Online Überwachung in orbital
geschüttelten Mikrotiterplatten
(BioLector)
Tobias Ladner und Jochen Büchs
Es ist nicht sinnvoll, nur den Durchsatz an Versuchen
zu erhöhen, ohne dafür Sorge zu tragen, dass diese
auch bei geeigneten Kulturbedingungen ablaufen und
ohne dass online Informationen über das Verhalten
der kultivierten Mikroorganismen erhalten werden.
Deswegen wurde die sogenannte BioLector-Techno-
logie entwickelt [77, 135]. Es handelt sich dabei um
ein faseroptisches Verfahren, bei dem die verschie-
denen Wells von Mikrotiterplatten unter fortgesetz-
tem Schütteln der Reihe nach abgefahren werden
(. Abb. 6.38b). Es werden das Streulicht und die Fluo-
reszenzen von beispielsweise Tryptophan, NADH und
Riboflavin ausgewertet. Wenn die kultivierten Mikro-
organismen oder Zellen Zielproteine exprimieren, die
mit einem Fluoreszenzprotein fusioniert sind, kann
sogar die Produktbildung on-line mitverfolgt werden.
Zusätzlich kann der pH und die Gelöstsauerstoffkon-
zentration (DOT) gemessen werden, wenn eine Mik-
rotiterplatte mit entsprechenden Optoden verwendet
wird. Alternativ kann die DOT mittels Sauerstoff-
sensitiver Nanopartikel, die dem Reaktionsmedium
 212 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
zugegeben werden, bestimmt werden [92]. Dieses
letztgenannte Messsystem hat den Vorteil, dass der
Anwender unabhängig von Optoden wird und
somit jede Mikrotiterplatte verwenden kann. Bei der
Nutzung sämtlicher optischer Messsysteme muss
jedoch darauf geachtet werden, dass keine Interfe-
renz zwischen der biologischen Fluoreszenz und der
Fluoreszenz des sensitiven Farbstoffes entsteht [90].
Durch solche Interferenzen können fehlerhafte Mes-
sungen ausgelöst werden, die sich nur zum Teil kom-
pensieren lassen [90]. Auch bei Mikrotiterplatten ist
es sinnvoll, die fed-batch-Betriebsweise zu realisieren,
um im Screening näher an den Bedingungen im späte-
6 ren Produktionsprozess zu sein. Ähnlich der Anwen-
dung in Schüttelkolben können Elastomerscheiben
zum Zufüttern von Nährstoffen oder pH-Stellmit-
teln eingesetzt werden [138]. In einer weiteren Arbeit
wurden Silikon-Elastomere als Depot auf dem Boden
der Wells immobilisiert und so Glucose während Kul-
tivierungen von Escherichia coli und Hansenula poly-
morpha in das Medium freigesetzt [70]. Des Weiteren
konnte die Machbarkeit von Mikrotiterplatten zum
einmaligen Gebrauch mit mikrofluidischen Vorrich-
tungen zur Zufuhr von Nährlösungen und pH-Stell-
mitteln von Volumina im Bereich von Nanolitern
. Abb. 6.40  Der RoboLector, eine Kombination von BioLector-Technologie und Pipettierroboter, ermöglicht eine
automatisierte Prozessführung
gezeigt werden [14]. Mit diesen Systemen sind pH-
geregelte Fermentationen und Zulaufverfahren mit
beliebigen Dosierprofilen im Maßstab von 500 µL rea-
lisierbar [41]. Es konnte außerdem für Escherichia coli
und Hansenula polymorpha gezeigt werden, dass sich
Kultivierungen aus Mikrotiterplatten (200-µL-Maß-
stab) gut im Laborfermenter (1,4-L-Maßstab) repro-
duzieren lassen [76]. Die Grenzen zwischen Screening
und Prozessentwicklung verschwimmen daher immer
mehr. In Zukunft werden wahrscheinlich Screening-
versuche bereits unter Bedingungen durchgeführt,
die dem Produktionsmaßstab qualitativ sehr nahe
kommen. Es wird eine ganze Reihe von Daten bereits
im Screening erfasst, die eine Maßstabsvergrößerung
auf Basis von verlässlichen Informationen ermöglicht.
Die bisher geübte rein empirische Vorgehensweise
beim Schritt vom Screening in Schüttelreaktoren hin
zu gerührten Bioreaktoren wird dann der Vergangen-
heit angehören.
Ein weiterer Vorteil der BioLector-Technolo-
gie besteht darin, dass eine Kombination mit einem
Pipettierroboter möglich ist und somit eine Prozess-
automatisierung erreicht wird [69, 134]. Dieses kom-
binierte System wird als RoboLector bezeichnet und
ist in . Abb. 6.40 dargestellt. Daraus resultieren ganz
Kapitel 6 · Bioreaktoren
neue Versuchsmöglichkeiten. So kann beispielsweise
bei induzierbaren proteinexprimierenden Stämmen
in einem einzigen Versuch die Induktorkonzentra-
tion und der Induktionszeitpunkt in 96 parallelen
Versuchen detailliert optimiert werden. In einer aktu-
ellen Arbeit wurde ein System vorgestellt, mit dem
auf die Zugabe eines Stoffs während der Kultivierung
zum Induzieren gänzlich verzichtet werden kann und
stattdessen die Induktion mittels Licht erreicht wird
[171]. Bei der Herstellung des Mediums wird photo-
aktivierbares Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid
(engl.: photocaged isopropyl β-D-1-thiogalactopyra-
noside, cIPTG) zugesetzt. Der Induktor (IPTG) wird
mittels Bestrahlung mit UV-Licht freigesetzt, worauf-
hin die Produktbildung induziert wird.
6.5.3 Miniaturisierte
Rührkesselreaktoren
(Bioreaktorblock)
Da Rührkesselreaktoren die Standardbioreaktoren
in der industriellen Biotechnologie darstellen, wird
seit einigen Jahren versucht, Rührkesselreaktoren
zu miniaturisieren und zu parallelisieren, um diese
für eine effiziente Bioprozessentwicklung nutzbar
zu machen. Hierzu müssen volumetrischer Leis-
tungs- und Sauerstoffeintrag vergleichbar zum tech-
nisch eingesetzten Rührkesselreaktor sein, wesent-
liche Prozessgrößen wie beispielsweise Temperatur,
Gelöstsauerstoffkonzentrationen und pH online
erfassbar und regelbar und alle üblichen Prozess-
führungen (Satz-, Zulauf- und kontinuierliche Pro-
zesse) im Parallelansatz realisierbar sein. Nur so ist
. Abb. 6.41  Gerührtes Parallelreaktorsystem im Milliliter-Maßstab (bioREACTOR48). (a) Parallelreaktorsystem mit 48
Rührkesselreaktoren auf der Arbeitsfläche eines Pipettierroboters. (b) Schematischer Aufbau der Milliliter-Reaktoren
(Erläuterungen siehe Text)
213 6
eine einfache Maßstabsvergrößerung möglich und
die im Parallelansatz zeiteffizient ermittelten Biopro-
zessdaten sind unmittelbar nutzbar. Der bioREAC-
TOR48 der Firma 2mag AG (München) ermöglicht
den gleichzeitigen sterilen Betrieb von 48 Rührre-
aktoren unter kontrollierten Bedingungen in einem
Reaktionsblock [129, 177]. Die Einweg-Reaktoren
aus Polystyrol haben ein Arbeitsvolumen von 8 bis
15 mL (Durchmesser: 20 mm, Höhe: 86 mm) und
enthalten vier Strömungsbrecher zur Unterstützung
der vollständigen Durchmischung. Jeder Reaktor
besitzt einen eigenen Gas-induzierenden Rührer aus
PEEK (Polyetheretherketon), der von einem mag-
netisch-induktiven Antriebssystem in Rotation ver-
setzt und über einen Wärmetauscher temperiert wird
(siehe . Abb. 6.41).
Die sterile Sauerstoffversorgung erfolgt durch
diese Gas-induzierenden Rührorgane (. Abb. 6.44a),
die über Hohlachsen Gas aus dem Kopfraum jedes
Reaktors ansaugen und durch Querbohrungen ins
Medium dispergieren (. Abb. 6.41). Hierdurch wird
eine gleichmäßige Verteilung der angesaugten Gas-
phase im Reaktionsmedium ermöglicht. Der Sauer-
stoffeintrag steigt mit der Drehzahl und erreicht im
Drehzahlbereich zwischen 2000 und 2800 min−1
einen kLa von 0,1 – 0,4 s−1 [167].
Zur Prozessüberwachung und -kontrolle ist jeder
Einweg-Rührkesselreaktor mit zwei immobilisier-
ten chemischen Sensoren für pH und pO2 am Reak-
torboden ausgerüstet, die berührungslos on-line von
unter den Reaktoren platzierten optischen Auslese-
einheiten ausgelesen werden [91, 177]. Durch Kom-
bination des Bioreaktorsystems mit einem Laborro-
boter können automatisiert Zulaufverfahren sowie
 214 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
die Titration von Base oder Säure zur pH-Rege-
lung für jeden Reaktor individuell realisiert werden.
Weiterhin können Probenahmen sowie eine at-line
Analyse der Proben auf beispielsweise Biomasse-,
Substrat- oder Produktkonzentrationen automati-
siert erfolgen (siehe beispielsweise [86, 167]).
Neben der Möglichkeit einer kontrollierten Pro-
zessführung ist vor allem die Ähnlichkeit der gerühr-
ten Milliliter-Bioreaktoren zu gerührten Standard-
bioreaktoren ein entscheidender Vorteil. So werden
in den Milliliter-Reaktoren vergleichbare Leistungs-
einträge und Energiedissipationen wie in Reakto-
ren des Labor- und Pilotmaßstabs erreicht [66].
6 Die Leistungscharakteristik der Gas-induzierenden
Rührorgane ist dabei dem aus Standardrührreakto-
ren bekannten Verhalten sehr ähnlich (. Abb. 6.42,
vgl. auch 7 Abschn. 6.1.2). Es lässt sich klar ein lamina-
rer Bereich und die Ausbildung vollturbulenter Strö-
mung (Leistungskennzahl Ne ist unabhängig von der
Strömungskennzahl Re) nachweisen, wobei bei Re >
3000 die Leistungskennzahl Ne ≈ 3,3 ist und damit in
einer vergleichbaren Größenordnung zu Standard-
rührreaktoren (Ne ≈ 4–5 für 6-Blatt-Scheibenrüh-
rer) liegt.
Die Nutzbarkeit des Milliliter-Parallelbioreaktor-
systems mit Gas-induzierenden Rührorganen für die
kontrollierte Durchführung von bis zu 48 parallelen
Bioprozessen im Satz- und Zulaufverfahren und die
Skalierbarkeit in den Litermaßstab wurde für ver-
schiedene mikrobielle Prozesse mit hoher paralleler
Reproduzierbarkeit gezeigt wie beispielsweise
. Abb. 6.42  Leistungskennzahl Ne
als Funktion der Reynoldszahl Re für
das Gas-induzierende Rührorgan des
Milliliter-Bioreaktorsystems
55 bei der Maßstabsverkleinerung des indust-
riellen Riboflavin-Produktionsprozesses mit
rekombinanten Bacillus subtilis im Zulaufver-
fahren[86, 167],
55 zur Herstellung von 2-Hydroxyisobuttersäure
mit rekombinanten Cupriavidus necator im
Zulaufverfahren [64],
55 bei der Ganzzellbiotransformation zur
Herstellung von (R)-2-Octanol mit rekombi-
nanten Escherichia coli in zweiphasigen flüssig-
flüssig Reaktionssystemen mit ionischen
Flüssigkeiten [30],
55 zur Herstellung von Bernsteinsäure mit
rekombinanten Escherichia coli im Zulaufver-
fahren [65],
55 bei Untersuchungen zur Herstellung von
Aceton, Butanol und Ethanol („ABE-Fer-
mentation“) mit rekombinanten Clostridium
acetobutylicum unter anaeroben Bedingungen
[147],
55 zur Produktion von Spinnenseidenproteinen
mit rekombinanten Escherichia coli im
Hochzelldichteverfahren mit Biomasse-
konzentrationen bis 70 g L–1 Biotrockenmasse
[37],
55 zur Herstellung von isotopenmarkierten
Zellextrakten mit rekombinanten Escherichia
coli für Metabolomanalysen bei der L-Phenyl-
alaninherstellung aus Glycerin [172],
55 bei der Verfahrensentwicklung zur Herstellung
halophiler Enzyme mit dem rekombinanten
Kapitel 6 · Bioreaktoren
extremophilen Bakterium Haloferax volcanii
[154] oder
55 zur Herstellung einer Lipase mit der rekombi-
nanten Hefe Komagataella pastoris im Zulauf-
verfahren bis 60 g L–1 Biotrockenmasse mit
Methanol als Induktor und Kohlenstoffquelle
[145]. Hier konnte auch eine direkte Maßstabs-
vergrößerung vom 10 mL- in den m3-Maßstab
demonstriert werden.
In zahlreichen industriell relevanten biotechnologi-
schen Prozessen finden mycel- und pelletbildende
Mikroorganismen Anwendung. Durch die komplexe
Morphologie dieser Mikroorganismen ergeben sich
neue Anforderungen an die Mikro-Bioverfahrens-
technik. Zum einen ist die Morphologie der Mik-
roorganismen von den im Bioreaktor auftretenden
Kräften abhängig, die wiederum einen starken Ein-
fluss auf die Produktivität der Zellen haben kann.
Zum anderen ändert das Kulturmedium, vor allem
bei Mycelwuchsform, seine Eigenschaften von
einem niedrigviskosen newtonschen Verhalten hin
zu stark strukturviskosem nichtnewtonschen Fließ-
verhalten. Dadurch kommt es vor allem zu Proble-
men bezüglich des Gas-Flüssig-Stoffaustausches,
die das in .  Abb. 6.41 und 6.44a gezeigte Gas-in-
duzierende Rührorgan nicht lösen kann. Weiterhin
neigen filamentöse Mikroorganismen stark zu einem
215 6
Bewachsen der Reaktorwände, was vor allen Dingen
in Milliliter-Bioreaktoren problematisch ist.
Um die Kultivierung mycel- und pelletbildender
Mikroorganismen im Milliliter-Maßstab zu ermög-
lich, wurde ein neuartiges, ebenfalls magnetisch-in-
duktiv antreibbares Rührorgan entwickelt (Paddel-
rührer), das schematisch in . Abb. 6.43 aufgezeigt
ist [67, 68]. Ein magnetisch-induktiv angetriebenes
Rührorgan rotiert in einem unbewehrten Reaktor
und erzeugt eine sich entlang der Reaktorwand aus-
breitende Flüssigkeitslamelle [13]. Dadurch entsteht
ein stark erhöhtes Oberflächen/Volumen-Verhält-
nis (. Abb. 6.44b), sodass ein hoher Sauerstoffein-
trag über die Oberfläche erfolgen kann (kLa > 0,15
s−1). Durch die schnell rotierende Flüssigkeitslamelle
werden Wandwachstum und Schaumbildung effek-
tiv verhindert.
Anhand der Kultivierung des Actinomyceten
Streptomyces tendae konnte beispielhaft gezeigt
werden, dass das neue Rührorgan für Kultivierungen
von Mycelbildnern geeignet ist. Wachstum und Pro-
duktbildung des pharmazeutisch wirksamen Fungi-
zids Nikkomycin Z zeigen im Milliliter-Bioreaktor (V
= 10 mL) und Laborbioreaktor (V = 2000 mL) über
mehr als 120 Stunden Kultivierungszeit einen nahezu
gleichen Verlauf, wobei in beiden Maßstäben hohe
Biomassekonzentrationen und Viskositäten vorlie-
gen (. Abb. 6.43, rechts).

. Abb. 6.43  (a) Schematischer Aufbau eines gerührten Milliliter-Bioreaktors mit Paddelrührer zur Kultivierung mycel- und
pelletbildender Mikroorganismen. (b) Gemessene Biotrockenmasse (Quadrate) und gebildete Menge des Fungizids Nikkomycin
Z (Dreiecke) bei der parallelen Satzkultivierung von Strepromyces tendae W42-0 in zwölf gerührten Milliliter-Reaktoren
(geschlossene Symbole, n = 1200 min–1, V = 10 mL, T= 29 °C) im Vergleich zu einem Referenzprozess im Labor-Rührkesselreaktor
(offene Symbole, n = 800 m–1, V = 2 L, T = 29 °C)
 216 H. Chmiel und D. Weuster-Botz

Die Nutzung von miniaturisierten Rührkessel-
reaktoren im Parallelansatz für enzymatische Pro-
zesse kann ebenfalls Entwicklungszeiten verkür-
zen. Einfach ist dies bei gelösten Substraten (siehe
beispielsweise [29]). In der industriellen Biotech-
nologie wird zunehmend versucht, Lignocellulose-
haltige pflanzliche Biomasse für Mikroorganismen
verfügbar zu machen. Hierzu müssen Pflanzenmate-
rialien wie beispielsweise Stroh zunächst gemahlen
und mit unterschiedlichen chemischen oder thermi-
schen Vorbehandlungsverfahren für die enzymati-
sche Verzuckerung von Cellulose und Hemicellu-
lose aufgeschlossen werden. Zur Suspendierung von
6 so vorbehandelten Pflanzenmaterialien in Milliliter-
Rührkesselreaktoren für enzymatische Umsetzungen
wurde ein weiteres spezielles Rührorgan entwickelt
[131, 132]. Mit diesem S-Rührer (siehe . Abb. 6.44c)
konnte beispielsweise gemahlenes und hydrothermal
aufgeschlossenes Weizenstroh mit einer Partikelgröße
von durchschnittlich 2 mm (maximal 15 mm) mit
Feststoffgehalten bis 10 % enzymatisch exakt genauso
wie im Litermaßstab verzuckert werden, sodass die
Anpassung von Enzymmischungen an unterschied-
liche oder unterschiedlich aufgeschlossene Pflanzen-
materialien effizient im Parallelansatz möglich ist.
Der kontinuierliche Betrieb von Milliliter-
Rührkesselreaktoren ist ebenfalls im Parallelansatz
ermöglicht worden [144]. Der kontinuierliche Zu-
und Ablauf der Flüssigphase erfolgt hierbei über
Kapillaren aus Edelstahl mit einem Innendurchmesser
von 250 µm und miniaturisierten Peristaltikpumpen,
sodass ein chemostatischer Betrieb möglich wird. In
einem Parallelansatz mit acht Chemostaten im Milli-
litermaßstab konnten damit beispielsweise genügend
Fließgleichgewichtszustände eingestellt werden, um
die kinetischen Parameter eines mikrobiellen Wachs-
tumsmodells für Escherichia coli schnell und effizient
zu identifizieren [144]. Damit kann der große Nachteil
von chemostatischen Untersuchungen in der Biopro-
zessentwicklung – die bei sequentieller Durchführung
im Litermaßstab notwendigen langen Prozesszeiten –
in einfacher Weise überwunden werden.
Parallele Rührkesselreaktoren im Millilitermaß-
stab (bioREACTOR48) ermöglichen Hochdurch-
satz-Bioprozessentwicklungen unter vergleichbaren
Bedingungen, wie sie in Rührreaktoren des Labor-
und Pilotmaßstabs vorliegen. Durch die Möglich-
keit, Rührorgane und Einweg-Bioreaktoren einfach
auszutauschen, ist dieses Parallelreaktorsystem für
eine Vielzahl unterschiedlicher Bioprozesse mit Mik-
roorganismen oder Enzymen nutzbar. Damit kann
die Entwicklung biotechnologischer Prozesse effizi-
ent stattfinden, da bereits zu einem früheren Zeit-
punkt in der Produktentwicklung viele parallele

D E F

. Abb. 6.44  Rührorgane des gerührten Parallelreaktorsystems im Milliliter-Maßstab (bioREACTOR48) am Gasverteilerdeckel.

(a) Gas-induzierendes Rührorgan im Einwegbioreaktor mit Schikanen (links) und ohne Einwegbioreaktor. (b) Paddelrührer
für mycelbildende Mikroorganismen (links) und CFD-Simulation der sich ausbildenden Flüssigkeitsoberfläche im Betrieb (die
Kontur des Einwegbioreaktors ohne Schikanen ist grau angedeutet). c) S-Rührer für stark feststoffhaltige Suspensionen im
Einwegbioreaktor ohne Schikanen (links) und ohne Einwegbioreaktor
Kapitel 6 · Bioreaktoren
Bioprozesse unter kontrollierten technischen Bedin-
gungen durchgeführt werden können. Weiterhin ist
durch die verfahrenstechnische Auslegung dieses
Milliliter-Bioreaktorsystems eine zuverlässige Maß-
stabsübertragung gewährleistet. Dies zeigt sich auch
an ersten Nutzungen in anderen Anwendungsgebie-
ten, beispielsweise bei der Prozessentwicklung zur
Herstellung von Polymervesikeln [127].
6.6 Spezielle Bioreaktoren
6.6.1 Einweg-Bioreaktoren für
Säugertierzellen
Franz Walz
Die Entwicklung von Einweg-Bioreaktoren (engl. dispo-
sable/single use bag bioreactors) ist in den letzten Jahren
enorm forciert worden [33] und der industrielle Einsatz
dieser Systeme hat sich weltweit auf breiter Front durch-
gesetzt. Aufgrund ihrer Eigenschaften sind Einweg-
Bioreaktoren vielseitig einsetzbar. Dies reicht von der
Züchtung individueller Stamm- und Blutzellen über die
Züchtung von Gewebe für medizinische Anwendungen
im kleinen Maßstab bis hin zur Herstellung therapeu-
tischer Proteine und antiviraler Impfstoffe im Maßstab
bis zu 2000 L. Inzwischen gibt es Produktionsanlagen
die ausschließlich mit Einweg-Systemen (Bioreaktoren
und Beutel) betrieben werden, da die initialen Investi-
tionskosten im Vergleich zu einer Edelstahl-Anlage um
mehr als einem Drittel geringer sein können. Zusätzlich
lassen sich damit die Realisierung und Inbetriebnahme
von Produktionsanlagen erheblich beschleunigen.
Diese Einweg-Bioreaktoren werden aus ver-
schiedenen, für diesen Verwendungszweck zuge-
lassenen Kunststoffen wie beispielsweise Poly-
ethylen (ULD-PE), Polypropylen (PP) oder
Polytetrafluorethylen (PTFE) hergestellt, die hin-
sichtlich der sich aus den Kunststoffen herauslö-
senden Stoffe (engl. leachables and extractables) gut
charakterisiert sind und die für die verschiedenen
Anwendungen stetig weiterentwickelt werden. Lea-
chables und extractables können für bestimmte
Anwendungen problematisch werden, da sie die
Zellkultivierung negativ beeinflussen, das Produkt
schädigen oder bedenkliche Verunreinigungen
217 6
darstellen können. Einweg-Bioreaktoren werden
in sehr unterschiedlichen Formen wie T- oder Rol-
lerflaschen, Schüttelkolben oder einfacher bezie-
hungsweise zylindrischer Beutel (engl. bags) in
Größen von 2 L bis derzeit 2000 L kommerziell
angeboten. Sie können sowohl statisch beispiels-
weise für adhärent wachsende Zellkulturen oder
bewegt in Form von Schüttelkolben, wave bags oder
Rührreaktoren eingesetzt werden. Sie haben den
Vorteil, dass sie flexibel und schnell einsatzfähig
sind, da sie Gamma-sterilisiert zu beziehen sind
(ready-to-use) und bei den Beutelsystemen mittels
spezieller Kupplungssysteme einfach sterile Ver-
bindungen hergestellt werden können. Die bewegt
betriebenen Systeme können mit disponiblen opti-
schen pH- und pO2-Sensoren ausgerüstet werden
und bieten damit alle wesentlichen Elemente kon-
ventioneller Bioreaktoren. Da diese Einweg-Biore-
aktoren nur einmal verwendet werden, entfällt die
Reinigung, was für den kommerziellen Gebrauch
unter cGMP (engl. current Good Manufacturing
Practice) das Risiko für Kreuzkontaminationen
von vornherein ausschließt.
Eine breite Verwendung hat inzwischen der soge-
nannte Wave Bioreactor® [126] gefunden, bei dem
die Zellen in einem Einweg-Plastikbeutel in einer
langsam schwingenden Wanne kultiviert werden
(. Abb. 6.45).
Bei den Rührreaktoren gibt es mittlerweile
ebenfalls umfangreiche Einweg-Systeme, die in ver-
schiedenen Größen bis zu 2000 L und mit der ent-
sprechenden Technik und Steuerung ausgestattet
. Abb. 6.45  Wave Bioreaktor® (mit freundlicher
Genehmigung der Fa. Sartorius Stedim Biotech)
 218 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
erhältlich sind. In . Abb. 6.46 ist ein 500 L Reaktor
dargestellt. In zahlreichen Studien wurde inzwi-
schen nachgewiesen, dass mit single-use bioreac-
tors (SUBs) in allen untersuchten Maßstäben bei der
Säugertierzellkultivierung vergleichbare Ergebnisse
erzielt werden können wie mit Edelstahlreaktoren
hinsichtlich Zellwachstum, Metabolismus und Pro-
duktqualität [150].
Für die Kultivierung von vorwiegend adhären-
ten Zellen können disponible Hohlfaser-Memb-
ranmodule verwendet werden. Hier wachsen die
Zellen auf der Außenseite und sind durch die semi-
permeable Membran vom mit Sauerstoff angerei-
6 cherten Nährmedium getrennt (. Abb. 6.47). Solche
Einweg-Hohlfasermodule werden für die schnelle
und flexible Herstellung kleinerer Mengen an Protei-
nen [25] oder für den Einsatz als künstliches Organ
verwendet.
6.6.2 Bioreaktoren für das Tissue
Engineering
Verena Charwat und Jan Hansmann
Tissue engineering ist ein dynamisch wachsendes,
stark inter- und transdisziplinäres Forschungsge-
biet. Der Begriff Tissue Engineering wurde auf einer
Konferenz der National Science Foundation 1988 wie
folgt definiert:
„[…] die Anwendung der Prinzipien und
Methoden der Ingenieur- und Lebenswissenschaf-
ten mit dem Ziel des grundlegenden Verständnis-
ses der Beziehung zwischen Struktur und Funktion
in normalen und erkrankten Säugergeweben und
. Abb. 6.46  Einweg-Rührreaktor BIOSTAT STR500 (a)
im leeren Zustand und (b) in Betrieb (mit freundlicher
Genehmigung der Fa. Sartorius Stedim Biotech)
. Abb. 6.47  Hohlfaser-Membranmodul
die Entwicklung von biologischem Ersatz zur Wie-
derherstellung, Erhaltung oder Verbesserung der
Gewebefunktion.“
Anders als in 7 Kap. 12, in dem die Zellkultivie-
rung der Vermehrung von Zellen oder der Produk-
tion von Pharmaka in Form von zellulären Proteinen
dient, hat das Tissue Engineering das Ziel, funktionel-
les Gewebe herzustellen. Das Vorgehen beim Tissue
Engineering ist in . Abb. 6.48 dargestellt. Nach der
Isolation primärer Zellen aus einer Gewebebiop-
sie erfolgt eine Vermehrung mittels Standardzell-
kulturmethoden. Im Anschluss daran werden die
Zellen auf eine formgebende Trägerstruktur ausge-
sät. Diese dient als Gerüst, beeinflusst aber auch die
Eigenschaften und Funktionen des Gewebes. Das
Konstrukt aus Zellen und Trägerstruktur unterläuft
dann eine Gewebereifungsphase innerhalb derer das
Gewebe Funktionen aufbaut. Nach der Reifung kann
das Gewebekonstrukt als Implantat oder Testsystem
verwendet werden. Dabei unterliegt die Herstellung
dieser Implantate, die als Advanced Therapy Medi-
cinal Products (ATMP) klassifiziert werden, stren-
gen Vorschriften und Richtlinien, die dem Schutz der
öffentlichen Gesundheit dienen.
Durch Methoden des Tissue Engineering erzeugte
Gewebe besitzen verschiedene Vorteile gegenüber
klassischen Spendergeweben. Beispielsweise ist der
Gewebe- oder Organersatz prinzipiell zu jedem
Zeitpunkt verfügbar, wodurch notwendige Opera-
tionen planbar werden. Ferner kann durch Erzeu-
gung autologer Implantate aus patienteneigenen
Zellen das Abstoßungsrisiko des Implantats mini-
miert werden. Hier kommen zunehmend Stamm-
zellen zum Einsatz, die unter optimierten Kultivie-
rungsbedingungen vermehrt und organspezifisch
ausdifferenziert werden. Die gute Verfügbarkeit
Kapitel 6 · Bioreaktoren
. Abb. 6.48  Phasen der
Gewebeherstellung im Tissue
Engineering
,9
*HZHEHKHUVWHOOXQJ
9
*HZHEHUHLIXQJLP
%LRUHDNWRU
und die Möglichkeit Gewebe mit humanen Zellen
unter standardisierten Bedingungen herzustellen,
eröffnen auch neue Wege innerhalb der Arzneimit-
telerforschung und -entwicklung. Bevor ein Medi-
kament in die klinische Prüfung gelangt, erfolgen
Untersuchungen, beispielsweise an Zellkulturen oder
im Tier. Während Zellkulturen ein sehr artifizielles
Testsystem darstellen, limitieren die Unterschiede
zwischen Mensch und Tier die Voraussagekraft
und Übertragbarkeit der Ergebnisse aus Tierversu-
chen. Mit Methoden des Tissue Engineering herge-
stellte humane Gewebe sind eine Technologie, die
es erlaubt, die Lücke zwischen dem Tierversuch
und der Anwendung eines Medikaments innerhalb
219 6
,,,
=HOOYHUPHKUXQJ
,,
=HOOLVRODWLRQ
,
3DWLHQW'RQRU
9,D %LRSVLH
9,E
7HVWV\VWHP
klinischer Studien am Menschen zu schließen. Da
die Gewebe mit Zellen menschlichen Ursprungs auf-
gebaut werden, lassen sie grundsätzlich eine genau-
ere Abschätzung der Wirkung einer Testsubstanz auf
den Menschen zu. Jedoch müssen zum Erreichen
einer regulatorischen Akzeptanz eines auf Tissue
Engineering basierenden Testsystems Endpunkte
definiert und die Testverfahren validiert werden.
Bereits regulatorisch akzeptierte Testverfahren wie
beispielsweise die Beurteilung der korrosiven und
irritativen Eigenschaften einer Substanz bestätigen
die Anwendbarkeit von künstlichen Geweben im
Bereich der kosmetischen, chemischen und pharma-
zeutischen Industrie. Im Vergleich zur Herstellung
 220 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
eines Implantats stellt die Produktion von Testsyste-
men hinsichtlich Chargengröße und Gewebeeigen-
schaften unterschiedliche Anforderungen. Handelt
es sich beim Implantat meist um ein patientenspezi-
fisches Produkt mit geringer Chargengröße, so sollen
Testsysteme in möglichst hoher Anzahl mit gleich-
bleibenden Eigenschaften bereitgestellt werden.
Die Komponenten eines Tissue Engineering Pro-
zesses sind Zellen, Nährmedien und Trägerstruk-
turen. Diese sind je nach Gewebe und Anwendung
sorgsam auszuwählen und aufeinander abzustimmen.
Während für klinische Anwendungen hauptsächlich
primäre Zellen, insbesondere Stammzellen, verwen-
6 det werden, ist der Aufbau von Testsystemen auch mit
Zelllinien möglich. Diese zeichnen sich durch gute
Verfügbarkeit aus, stellen jedoch ein Modellsystem
dar, welches nur begrenzt die Eigenschaften von pri-
mären Zellen wiedergibt. Die für das Tissue Enginee-
ring benötigten Nährmedien haben eine komplexe
chemische Zusammensetzung und werden zumeist
mit zelltypspezifischen Zusätzen wie Serum oder
Wachstumsfaktoren versetzt. Zur Herstellung spe-
zifischer Trägerstrukturen steht heute eine Vielzahl
an biologischen oder synthetischen Biomaterialien
zur Verfügung, die beispielsweise als Hydrogele,
gesponnene Fließe oder poröse Feststoffe zum Einsatz
kommen. Eine kritische Rolle innerhalb der Gewebe-
herstellung spielen die Kulturbedingungen während
der in . Abb. 6.48 als Prozessschritt V dargestellten
. Abb. 6.49  Kultursysteme für das
Tissue Engineering
Gewebereifungsphase. Diese Reifungsphase kann
je nach Gewebe mehrere Wochen dauern, wobei die
Funktionalität und die Gewebeeigenschaften des spä-
teren Produkts maßgeblich von den Prozessparame-
tern während dieser Phase beeinflusst werden.
Die Kultivierung der Gewebekonstrukte für
das Tissue Engineering erfolgte zunächst überwie-
gend unter statischen Bedingungen, also in Gewe-
bekulturschalen (. Abb. 6.49) wie sie aus der klassi-
schen Zellkultur bekannt sind. Problematisch dabei
ist, dass die Versorgung der Zellen mit Nährstof-
fen auf beziehungsweise innerhalb einer dreidi-
mensionalen Trägerstruktur inhomogen ist. Dies
kann zu einem verlangsamten Wachstum bis hin
zum Absterben der Zellen in der Trägerstruktur
führen. Der Anspruch möglichst schnell funktions-
fähiges Gewebe zu generieren führte in den letzten
Jahren zur Entwicklung von spezifischen Bioreak-
toren, die eine sichere Prozesskontrolle ermögli-
chen. Durch die Verwendung von Bioreaktoren ist
eine bessere Versorgung der Zellen mit Nährstof-
fen gewährleistet, sodass schneller ein biologisch
aktives Gewebe unter kontrollierten und reprodu-
zierbaren Bedingungen entsteht. Auf Grund der
komplexen und vielfältigen Ansprüche des Tissue
Engineering findet sich jedoch heute eine Vielzahl
an hochspezialisierten Einzellösungen während
Standardbioreaktoren vergleichsweise selten zum
Einsatz kommen.
Kapitel 6 · Bioreaktoren
Prinzipiell können sämtliche für Suspensions-
kulturen entwickelte Reaktorsysteme auch für das
Tissue Engineering eingesetzt werden. Allerdings
sind Anpassungen für adhärent wachsende Zellen
notwendig. Im einfachsten Fall dienen frei schwim-
mende Mikroträger, sogenannte Mikrocarrier, als
Trägerstrukturen. Sie ermöglichen die dynamische
Kultivierung adhärenter Zellen bei einem hohen
Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis. Mikrocarrier
sind jedoch für die Kultivierung von Gewebe nur
bedingt geeignet und werden hauptsächlich zur
Zellvermehrung eingesetzt. Alternativ können auch
Zellaggregate ohne zusätzliche Trägermaterialien in
Suspension kultiviert werden. Ein weitverbreiteter
Reaktortyp für Suspensionskulturen sind Spinner-
flaschen, die vom Aufbau und ihrer Funktionsweise
klassischen Rührkesselreaktoren ähnlich sind. Die
Suspension aus Zellkonstrukten und Nährmedium
wird mittels eines beispielsweise magnetgetriebe-
nen Rührers in Bewegung gehalten und so eine gute
Durchmischung und Nährstoffversorgung erzielt. Je
nach Zelltyp ist die durch das Rühren eingebrachte
mechanische Beanspruchung der Gewebekonstrukte
schädlich oder – innerhalb eines gewissen Bereichs –
förderlich. Gewebe wie beispielsweise Knorpel und
Knochen, die auch im Körper mechanischen Kräften
ausgesetzt sind, entwickeln ihre volle Funktionsfä-
higkeit erst unter entsprechender Stimulation. Hin-
gegen muss bei der Kultivierung von mechanisch
empfindlichem Gewebe die Rührleistung besonders
vorsichtig eingestellt werden. Zur Minimierung
mechanischer Kräfte können die Gewebekonstrukte
auch in eine schützende Hydrogelmatrix eingebet-
tet werden. Dies wird derzeit etwa bei organotypi-
schen Hirnkonstrukten erfolgreich angewendet. Eine
zellschonende Alternative zu gerührten Bioreakto-
ren stellen Beutelsysteme wie der Wave Bioreactor®
dar (siehe . Abb. 6.45). Die Zellsuspension wird in
Kunststoffbeutel gefüllt und auf einer Kippplattform
durch zwei- oder dreidimensionales Schwenken in
Bewegung gehalten. Ohne die Verwendung eines
Rührers arbeitet auch der rotating wall vessel reactor
(RWVR). Dieser Reaktortyp wurde im Jahr 1992 von
der NASA entwickelt, um Zellen in einer Umge-
bung simulierter Mikrogravitation zu kultivieren.
Er besteht aus einem rotierenden Zylinder, in dem
sich wiederum horizontal ein rotierendes Kulturge-
fäß befindet. Durch die Bewegungen der Zylinder
221 6
entstehen laminare Strömungsverhältnisse und das
Medium wird effizient durchmischt. Der RWVR hat
unter anderem für die Differenzierung von Zellen
zu Knorpel- und Nervengewebe Anwendung gefun-
den. Ein ähnliches Prinzip wird im biaxial rotieren-
den Bioreaktor (TisXell), von QuinXell angewendet.
Hier entsteht Mikrogravitation durch gleichzeitige
Rotation des Kulturgefäßes um 2 Achsen.
Neben Suspensionskulturen mit frei bewegli-
chen Zellaggregaten, kommen im Tissue Engineering
hauptsächlich Kultursysteme zur Anwendung, bei
denen fixierte Trägerstrukturen von Nährmedium
um- oder durchspült werden. Beispielsweise können
besiedelte poröse Trägerstrukturen an Nadeln im
Inneren von Spinnerflaschen befestigt werden. In
Anlehnung an den rotating wall vessel reactor gibt
es Systeme, die statt dem Gehäuse die Trägerstruk-
turen drehen. Dies erzeugt ebenfalls eine Scherbe-
lastung, und die Zellen können alternierend einer
Gas- und Flüssigkeitsphase ausgesetzt werden. Auf
diese Weise kultivierte Stammzellen zeigten eine
erhebliche Mineralisierung und exprimierte Gene,
die eine vorangeschrittene Differenzierung zu Kno-
chengewebe belegen. In speziellen Perfusionsreakto-
ren wie etwa dem kommerziell erhältlichen U-CUP-
Reaktor wird die Trägerstruktur so eingespannt,
dass das Kulturmedium nicht um das Gewebe her-
umströmen kann sondern durch die Poren des drei-
dimensionalen Konstrukts fließen muss. Dadurch
wird eine besonders effiziente Nährstoffversorgung
gewährleistet. Eine technische Variante der Perfu-
sionsreaktoren stellt das sogenannten T-CUP-Sys-
tem (Tissue Culture Under Perfusion) dar bei dem
die porösen Gerüste in einen beweglichen Stempel
eingebracht werden. Die Perfusion erfolgt somit
nicht durch Pumpen des Mediums sondern durch
Auf- und Abbewegung des Stempels. Durch die
fluidmechanische Belastung wird die Differenzie-
rung in Knochen- oder Knorpelgewebe induziert.
In Perfusionskulturen kann die Zellaussaat entwe-
der in statischer Vorkultur oder dynamisch inner-
halb des Reaktors erfolgen, indem die Zellsuspen-
sion dem Perfusionskreislauf zugeführt wird. Die
Perfusionsgeschwindigkeit muss an die verschiede-
nen Prozessschritte von Zellbesiedelung bis Gewebe-
reifung angepasst werden. Wird ein Perfusionsreak-
tor im kontinuierlichen Modus betrieben, so findet
ein permanenter Austausch von Zellkulturmedium
 222 H. Chmiel und D. Weuster-Botz
statt, wodurch sich die Konzentration toxisch wir-
kender Stoffwechselprodukte minimiert. Durch
Regulation der Flussrate lässt sich ferner die Nähr-
stoffkonzentration dem Zellmetabolismus anpas-
sen und der mechanische Scherstress einstellen. In
Kombination mit fluiddynamischen Modellen und
Computersimulationen erlauben Perfusionsbiore-
aktoren, Scherspannungen gezielt zur Beeinflus-
sung des Zellzustands zu nutzen. Perfusionsreakto-
ren werden häufig für Applikationen im Bereich des
Tissue Engineering von Knochen- und Knorpelkons-
trukten eingesetzt.
Eine spezielle Klasse der Perfusionskulturen
6 stellen sogenannte mikrofluidische Systeme dar. Es
handelt sich dabei um miniaturisierte Durchfluss-
kammern, in denen Zellen kultiviert und differen-
ziert werden. Oft erfolgt in mikrofluidischen Syste-
men die Integration von Sensoren oder Aktuatoren.
Ein aktueller Trend ist die Entwicklung komplexer
Co-Kultursysteme mit dem Ziel, funktionelle Organ-
modelle zu etablieren. Solche Systeme sind heutzu-
tage unter dem Begriff Organ-on-a-Chip bekannt. Auf
Grund ihrer geringen Größe eignen sich mikrofluidi-
sche Bioreaktoren ausschließlich für die Etablierung
von Testsystemen, während sie zur Gewebezüchtung
für klinische Anwendungen ungeeignet sind.
In den letzten Jahren erfolgte die Etablierung ver-
schiedener gewebespezifischer Bioreaktorsysteme,
in denen neben Scherkräften weitere mechanische
Reize wie beispielsweise Druck oder Zug zur geziel-
ten mechanischen Stimulation von Gewebe ausge-
übt werden können (. Abb. 6.49). Dabei ist es das
Ziel, die physikalischen Reize so anzupassen, dass
sie den physiologischen Bedingungen im Körper
nachempfunden sind. Vor allem bei der Herstel-
lung von Geweben des muskuloskeletalen Systems
(wie Knochen-, Knorpel-, Sehnengewebe) spielen
diese Systeme eine Rolle. Beispielsweise existieren
Bioreaktoren für Knorpelkonstrukte, die mechani-
sche Belastungen im Gelenk nachahmen. Hierfür
wird eine Kugel mit Druck über ein Zellkonstrukt
gerollt. Zusätzlich wird das Zellkonstrukt von oben
nach unten bewegt, um eine Modulation des Drucks
zu erreichen. Die entstehenden mechanischen Kräfte
umfassen Rotations- und Druckkräfte sowie Scher-
spannungen aufgrund der Bewegung des Zellkultur-
mediums. Die entstehenden mechanischen Stimuli
entsprechen der Belastung wie sie beim Beugen des
Knie- oder Ellenbogengelenks auftritt.
Auch im Bereich des kardiovaskulären Tissue
Engineering ist die mechanische Stimulation von
Gewebe von großer Bedeutung. Hierbei ist jedoch
eine pulsatile Druck- und Scherbelastung physiolo-
gisch, die normalerweise in den Blutgefäßen durch die
Herzaktivität hervorgerufen wird. Somit unterschei-
den sich Bioreaktoren für das kardiovaskuläre Tissue
Engineering von denen für Gewebe des muskuloskele-
talen Systems. Als Trägerstrukturen dienen meist aus
dehnbarem Biomaterial gefertigte Schlauchsysteme.
Diese werden an der Innenseite mit Endothelzellen
besiedelt und mit Zellkulturmedium perfundiert.
Die Außenseite des Konstruktes wird anschließend
mit glatten Muskelzellen besiedelt, um die natürli-
che Wand eines Blutgefäßes aufzubauen. Die Perfu-
sion des Lumens führt zu einer mechanischen Belas-
tung, wie sie im Körper vorhanden ist: Scherkräfte des
durchströmenden Blutes sowie radiale Dehnung der
Wand, wie sie beim Herzschlag erzeugt wird.
Die genannten Beispiele zeigen, dass Bioreaktoren
im Tissue Engineering abhängig von der Physiologie
gewebespezifisch konzipiert werden müssen, um eine
möglichst gute Annäherung an die im Körper herr-
schenden Bedingungen zu erreichen. Zusätzlich hat
sich herausgestellt, dass Designmerkmale wie die Aus-
legung als geschlossenes System und Einweg-Bioreak-
toren den erfolgreichen Einsatz von Bioreaktoren im
Tissue Engineering unterstützen und die Handhabung
verbessern. Zur Minimierung von Anwendungsfeh-
ler und zum Erreichen einer hohen Reproduzierbar-
keit, sollte die Komplexität eines Bioreaktorsystems
möglichst gering gehalten werden. Dies kann durch
die Integration verschiedener Komponenten wie Sen-
soren und Pumpen in ein Gesamtsystem mit zentra-
ler Bedienmöglichkeit erreicht werden. Aufgrund der
Abhängigkeit der Gewebeeigenschaften von den Kulti-
vierungsbedingungen müssen die für ein Gewebe rele-
vanten Prozessgrößen identifiziert und kontinuierlich
geregelt werden. Dazu ist die Messung aussagekräftiger
Prozessgrößen notwendig. Meist beschränkt sich das
Spektrum gemessener Prozessgrößen jedoch auf phy-
sikalische Größen wie Druck, pH oder Temperatur, da
Gewebeeigenschaften oft nur schwer zugänglich sind.
Die Entwicklung von zerstörungsfreien Messverfahren
zur Gewebecharakterisierung ist daher eine Schlüssel-
disziplin für Bioreaktoren und das Tissue Engineering.
Die dynamische Kultivierung in Bioreaktoren hat
die Möglichkeiten des Tissue Engineering stark erwei-
tert, allerdings können auch heutzutage noch keine
Kapitel 6 · Bioreaktoren
beliebig großen und komplexen Gewebekonstrukte
als Implantat oder Testsystem hergestellt werden. Ein
wichtiger Faktor, der in zahlreichen aktuellen For-
schungsansätzen bearbeitet wird, ist die Etablierung
von Gefäßstrukturen in künstlich erzeugtem Gewebe,
um eine optimale Versorgung unabhängig von der
Konstruktgröße zu erreichen. Eine weitere Limita-
tion der meisten heute verfügbaren Systeme stellt ihre
Spezialisierung auf ein einziges Gewebe dar. Wichtig
ist daher die Entwicklung von Bioreaktoren, die eine
Kombination unterschiedlicher Gewebetypen zu
komplexeren funktionellen Einheiten unterstützen.
Ein klinisch relevantes Beispiel dazu ist der Übergang
von hartem zu weichem Gewebe an der Schnittstelle
zwischen Knochen und Sehne. Ferner scheitert die
breite industrielle Anwendung von im Labor herge-
stellten humanen Geweben als Testsystem trotz deren
Vorteile unter anderem an den Herstellungskosten
und der meist limitierten Menge an verfügbarem
Ausgangsmaterial. Durch die Entwicklung von auto-
matisierten Produktionsverfahren in vollintegrierten
parallelisierbaren Bioreaktoren besteht die Möglich-
keit, Herstellungskosten zu verringern und die Ver-
fügbarkeit von Gewebemodellen weiter zu steigern.
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 231 7

Sterilisation und Sterildesign

Jörg Hinrichs, Heinrich Buck und Gerhard Hauser

7.1 Thermische Stabilität von Mikroorganismen – 232

7.2 Kinetik der thermisch induzierter Veränderungen – 233

7.3 Vergleich und Optimierung des Behandlungseffekts – 236

7.4 Sicherheitsniveau für Sterilisationsprozesse – 238

7.5 Kontinuierliche Verfahren zur thermischen

Mediumsterilisation – 238
7.5.1 Direkte Dampfsterilisation – 238
7.5.2 Indirekte Sterilisation über Wärmetauscher – 239

7.6 Sterilfiltration – 239

7.6.1 Sterilisation von Flüssigkeiten – 239
7.6.2 Sterilisation von Gasen – 242
7.6.3 Filterintegritätstest – 244

7.7 Funktion von Dampfsterilisatoren (Autoklaven) – 244

7.8 Sterilisierbare Bioreaktoren – 245

7.8.1 Aufbau autoklavierbarer Bioreaktoren – 245
7.8.2 Aufbau SIP-fähiger Bioreaktoren – 245

7.9 Sterildesign – 246

7.9.1 Material- und Oberflächenqualitäten für Bioreaktoren – 247
7.9.2 Stutzen für Messwertgeber – 249
7.9.3 Sterile Probenahmeventile – 251
7.9.4 Gestaltung der Zuluftstrecke – 253
7.9.5 Abdichtung von Rührerwellen – 255

Literatur – 258

Danke für die Unterstützung an Frau Dr. Zeynep Atamer und Herrn Dr. Dirk Sievers

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2018

H. Chmiel, R. Takors, D. Weuster-Botz (Hrsg.), Bioprozesstechnik,
https://doi.org/10.1007/978-3-662-54042-8_7
 232 J. Hinrichs et al.
Eine wesentliche Voraussetzung für die Produktions-
sicherheit biotechnologischer Prozesse ist, dass der
Fermentationsprozess nicht durch Fremdorganis-
men gestört wird. Daher müssen bevor der Biopro-
zess gestartet wird, Bakterien, Sporen und Virus-
partikel (ggf. auch Prionen) möglichst vollständig
abgetötet bzw. ausreichend inaktiviert werden (= Ste-
rilität). Zudem muss die Anlagentechnik so ausge-
führt sein (= Sterildesign), dass während des Betriebs
keine prozessfremden Organismen in die Anlage
gelangen und den Bioprozess stören (= aseptische
Betriebsweise, steriler Zustand). Wird mit patho-
genen oder gentechnisch modifizierten Organis-
men gearbeitet, so ist durch technische Maßnah-
men sicher zu stellen, dass keine Organismen und
7 Stoffe in die Umgebung gelangen. Steril bzw. frei von
störenden Organismen müssen damit die folgenden
Systeme sein:
55 das Substrat, alle dem Prozess zugeführten
sonstigen Stoffe, wie Nährstoffe, Pufferlösungen
etc. und auch Gase;
55 der Bioreaktor und die dazugehörige
Peripherie, wie Medienzu- und Ableitungs-
systeme, Belüftungssysteme, Messstutzen,
Probenahmeventile, Filter
55 Stoffe bzw. Stoffströme, die den Bioreaktor-
anlagenbereich verlassen.
Das am häufigsten eingesetzte Verfahren zur Inak-
tivierung von Mikroorganismen ist die Sterilisa-
tion mittels Hitze. Weitere Möglichkeiten sind die
Bestrahlung mit γ- oder Elektronenstrahlen, die Plas-
masterilisation, die Sterilfiltration und die chemische
Sterilisation (Desinfektion), die je nach Beschaffen-
heit des zu sterilisierenden Systems, z. B. Flüssigkeit,
Gas, Metalloberfläche etc. Anwendung finden.
Bioreaktoranlagen müssen so konstruiert und die
Oberflächen so beschaffen sein, dass sie leicht gerei-
nigt und vor der Inbetriebnahme sterilisiert werden
können (= Hygenic Design). Übliche Reinigungs-
schritte für einen Bioreaktor sind: Vorspülen mit
Wasser von 40-60 °C für mindestens 5 min; alkalische
(1–2,5 %) Reinigung mit 65–75 °C für mindestens
10 min; Zwischenspülen mit Wasser mit 65–75 °C für
mindestens 5 min, saure (1 %) Reinigung mit 65–75
°C für mindestens 10 min; Ausspülen mit Wasser
(65–75 °C). Die nachfolgende Sterilisation des Bio-
reaktorssystems erfolgt mit gesättigtem Wasserdampf
bei 121–150 °C für 30–20 min. Das Substrat und
dem Prozess zugeführte flüssige Medien werden
batchweise bei 110–120 °C für 40-20 min oder kon-
tinuierlich im Durchfluss mit Temperaturen von
135–150 °C für 10–1 s sterilisiert. Bei Anwesenheit
von Prionen ist eine Temperatur von 134 °C für min-
destens 18 min sicher zu stellen. Vergleichbare Erhit-
zungsbedingungen werden für flüssige Stoffströme
genutzt, die den Bioreaktoranlagenbereich verlas-
sen. Die Sterilfiltration wird für Gase genutzt. Ebenso
können flüssige hitzelabile Substrate oder Medien, die
keine prozessstörenden Teilchen wie z. B. Enzyme,
Prionen oder Viruspartikel enthalten und in denen
der Anteil an suspendierten Teilchen, die den Filter
verstopfen können, gering ist, sterilfiltriert werden.
7.1 Thermische Stabilität von
Mikroorganismen
Je nach Gattung, Art und z. T. Spezies besitzen Bak-
terien, Hefen, Schimmelpilze und auch Viruspartikel
eine unterschiedliche thermische Stabilität. Im Tem-
peraturbereich der Pasteurisation (65 °C für 30 min
bis 100 °C für einige Sekunden) werden diese jedoch
im Allgemeinen inaktiviert (. Abb. 7.1). Die thermi-
sche Sterilisation zielt insbesondere auf die Inaktivie-
rung bakterieller Sporen ab, die eine deutliche höhere
thermische Stabilität als Pilzsporen besitzen. Manche
Bakterien, z. B. Bacillus und Clostridien bilden bei
ungünstigen Lebensbedingungen Sporen, die sich
durch einen geringen Wassergehalt und eine beson-
dere Sporenhülle auszeichnen. Diese bakteriellen
Überlebensformen besitzen eine hohe Temperatur-
(<100 °C) und Druckresistenz (>1000 MPa), über-
stehen Austrocknen und man benötigt intensive
γ-Bestrahlung zur Inaktivierung. Sobald die Milieu-
bedingungen günstig sind, keimen die Sporen aus
und die Bakterien vermehren sich.
Die thermische Stabilität von Sporen wird durch
das Umgebungsmilieu beeinflusst: Tendenziell ist die
Stabilität im sauren etwas geringer und sie steigt mit
zunehmendem osmotischen Druck (bzw. abneh-
mender Wasseraktivität aw-Wert) oder abnehmender
relativer Luftfeuchte. So werden für die Sterilisation
von Oberflächen in trockener Luft Temperaturen von
180 °C eingesetzt und mit Sattdampf sind Tempera-
turen von 121 °C (200 kPa) üblich.
Kapitel 7 · Sterilisation und Sterildesign
. Abb. 7.1  Übliche
Temperaturbereiche für die
Fermentation, Pasteurisation und
Sterilisation von Substraten
Der traditionelle Weg für die Berechnung der
Effektivität des Erhitzungsprozesses basiert auf der
Annahme, dass die Abtötung der Mikroorganismen
linear, d. h. nach einer Reaktion 1. Ordnung, ver-
läuft. Jedoch ist die Abtötungskurve der Mikroorga-
nismen oft (in vielen Fällen) nicht linear. Die in der
. Abb. 7.2 dargestellten Grundtypen geben einen
Überblick über häufig beschriebene Kurvenverläufe
für Abtötungsreaktionen. Die Kurve A zeigt über
den gesamten Zeitbereich der Temperatureinwir-
kung einen streng log-linearen Verlauf entsprechend
einer Reaktionsordnung n = 1. Der Kurventyp B wird
typischerweise gefunden, wenn die erhitzte Sporen-
suspension aus zwei Stämmen besteht. Dabei wird
. Abb. 7.2  Häufig beobachtete Grundtypen von
Inaktivierungskurven mit log-linearem (A), biphasigem (B),
log-linearer Verlauf mit Tailing (C), Schulter mit log-linearem
Verlauf (D)
233 7
zuerst vor allem das Absterbeverhalten des empfind-
licheren, dann das der stabileren Sporenart erfasst.
Eine heterogen aus verschiedenartig hitzeresisten-
ten Sporen zusammengesetzte Mischflora führt zu
Kurven vom Typ C. Dieser Kurvenverlauf wird eben-
falls beobachtet, wenn nicht alle Sporen der erhitz-
ten Suspension einzeln vorliegen, sondern geringe
Mengen in Klumpen von mehreren Sporen. Aber
auch ein winziger Anteil Sporen mit extremer Hit-
zeresistenz kann zum sogenannten „Tailing“ führen.
Kurven vom Typ D zeigen eine scheinbar verzögerte
Abtötung, was als „Schulter“, bezeichnet wird. Diese
ausschließlich bei kurzen Erhitzungszeiten auftre-
tende Nichtlinearität ist häufig darauf zurück zu
führen, dass bei der Bestimmung der Ausgangsspo-
renzahl nicht alle Einzelsporen erfasst werden, und
zu Beginn der Erhitzung neben der Sporenabtötung
eine Hitzeaktivierung ruhender Sporen stattfindet.
7.2 Kinetik der thermisch
induzierter Veränderungen
Charakteristisch für thermische Sterilisationspro-
zesse sind definierte Temperatur-Haltezeit-Kombi-
nationen, mit denen vegetative Mikroorganismen
und bakterielle Sporen inaktiviert werden. Wird
ein komplexes Substrat thermisch behandelt, laufen
nicht nur die gewünschten Reaktionen ab, sondern
auch unerwünschte chemische Reaktionen, wie z.
B. Verlust an Vitaminen. Die auf molekularer Ebene
ablaufenden Reaktionen, wie z. B. bei der Sporen-
inaktivierung, und deren Kinetik (Geschwindig-
keit) sind häufig nicht vollständig bekannt, denn sie
werden durch die komplexe Zusammensetzung des
Substrats und die Milieubedingungen beeinflusst.
 234 J. Hinrichs et al.
Entsprechend arbeitet man vereinfacht mit der
sogenannten Formalkinetik, bei der die thermi-
sche Behandlung als „Black Box“ betrachtet wird.
Messbare Veränderungen, wie z. B. Konzentration
an Sporen oder eines Vitamins infolge einer Tem-
peratur-Zeit-Einwirkung werden quantifiziert und
modelliert.
Die Abnahme der Konzentration dC an Mikro-
organismen oder Sporen, der Abbau eines Inhalts-
stoffs oder die Aktivitätsabnahme eines Enzyms
innerhalb der Reaktionszeit dt kann bei konstanter
Temperatur T über einen allgemeinen Ansatz mit
n-ter Reaktionsordnung beschrieben werden.
dC
= −kT ⋅ C n 
7 dt
Der Proportionalitätsfaktor ist die Geschwindig-
keitskonstante der Reaktion kT. Die Reaktionsord-
nung n wird empirisch bestimmt und kann beliebige
Zahlenwerte oder auch Null annehmen. Für einer
Reaktionsordnung von n = 1 lässt sich Gl. 7.1 einfach
integrieren und es folgt:
Ct = C0 ⋅ exp (−kT ⋅ t ) 
Für eine Reaktionsordnung n ≠ 1 ergibt sich:
1/(1−n)
 (n−1) 
Ct = C0 ⋅ 1 + (n −1)⋅ kT ⋅ t ⋅ C0 
 
Die Geschwindigkeitskonstante kT ist temperatur-
abhängig (siehe . Abb. 7.3) und wird allgemein über
den Arrhenius-Ansatz beschrieben:
 E 1
1 
kT = kref ⋅ exp − A ⋅  −  
 R  T Tref 
kref repräsentiert die Geschwindigkeitskonstante bei
Referenztemperatur1 Tref [K], EA die Aktivierungs-
energie [J mol−1] und R = 8314 J (mol K)−1 die Allge-
meine Gaskonstante. Experimentell können kref, EA
1 Die Referenztemperatur kann beliebig gewählt werden.
Für Experimente ist es günstig diese in die Mitte der
betrachteten Temperaturbereiche zu legen.
(und auch n) graphisch über zwei Schritte bestimmt
werden, im ersten Schritt aus den Graphen Ct = f(t)
für jeweils T = const. die Geschwindigkeitskonstan-
ten kT aus der Steigung bestimmt werden. Im zweiten
Schritt werden über die Arrhenius-Auftragung log kT
= f(1/T) die Parameter kref und EA ermittelt. Möglich
ist es auch, alle Messdaten (Ct, t, T) in einem Schritt
mittels nichtlinearer Regression auszuwerten und die
Parameter kref, EA in einem Durchgang zu bestim-
men. Die Modellgleichung ergibt sich durch Einset-
zen von Gl. 7.4 in Gl. 7.2 zu
  E 1  
 1  
Ct = C0 ⋅ exp −kref ⋅ exp − A ⋅  −  ⋅ t  für n = 1
  R  T Tref  

Gl. 7.1
 Gl. 7.5
Für n ≠ 1 können die Parameter k, n, EA über Gl. 7.3
mit Gl. 7.4 bestimmt werden.
Eine Diskussion verschiedener Modelle zur
Auswertung experimenteller Inaktivierungsdaten
beispielsweise der Kurven in . Abb. 7.2 findet sich
bei Geeraerd et al. [4, 5]. Zu empfehlen ist in jedem
Fall die Eignung des Modells graphisch zu über-
Gl. 7.2 prüfen, indem die Messdaten C t(gemessen) den
berechneten Modelldaten C t(berechnet) gegen-
übergestellt werden.
Nach wie vor wird das klassische Konzept von
Bigelow, Ball und Stumbo mit Dϑ-, F-, und zϑ- Werten
 Gl. 7.3
zur Beschreibung der Inaktivierung von Mikroorga-
nismen, Sporen, Viren oder auch Enzymen genutzt
[11]. Das Konzept setzt allerdings einen log-linearen-
Verlauf der Inaktivierung voraus (siehe . Abb. 7.2,
Kurve A) bzw. der Ansatz ist nur gültig für n = 1. Der
Dϑ-Wert ist definiert als Zeit, die bei einer bestimm-
ten Temperatur notwendig ist, um die Konzentration
Gl. 7.4 auf 1/10 des Ausgangswerts zu reduzieren (. Abb.
7.3). Der Dϑ-Wert ist aus der temperaturabhängigen
Geschwindigkeitskonstante kT für Reaktionen mit n
= 1 zu berechnen:
2, 303
Dϑ = mit T [ K ] = 273 K + ϑ [ º C] Gl. 7.6
KT
Der F-Wert bezeichnet das Vielfache i des Dϑ-Werts:
F = i ⋅ Dϑ  Gl. 7.7
Kapitel 7 · Sterilisation und Sterildesign
235 7
von 2,5 min bei 121 °C genannt. Dieser ergibt sich
nach Gl. 7.7 aus einer angenommenen Reduktion der
Sporenanzahl von Clostridium botulinum (D121°C =
0,21 min) um i = 12 Zehnerpotenzen.
In einem engen Temperaturbereich und eben-
falls nur gültig für eine Reaktionsordnung von n =
1, gilt folgender Zusammenhang zwischen zϑ-Wert
und Aktivierungsenergie EA:

2, 303 ⋅ R ⋅ T 2
zϑ ≅ mit T [ K ] = 273 K + ϑ[°C]
Ea
 Gl. 7.8

Der zϑ-Wert stellt diejenige Temperaturerhöhung

. Abb. 7.3  Vorgehensweise zur Bestimmung der
temperaturabhängigen Geschwindigkeits¬konstante kT bzw.
des Dϑ-Werts für n = 1 (siehe Gl. 7.6)
und wird dazu genutzt, verschiedene Sterilisations-
prozesse bezüglich ihres Inaktivierungseffekts F-
Werts zu vergleichen. Als Referenzwert für die Ste-
rilisation von Lebensmitteln wird häufig ein F0-Wert
dar, die notwendig ist, um den gleichen Inaktivie-
rungseffekt in 1/10 der Zeit zu erreichen. In . Tab. 7.1
sind beispielhaft kinetische Daten zur Inaktivierung
von Mikroorganismen, Sporen, Bakteriophagen und
Enzymen in flüssigen Medien zusammengestellt.
Durch bestimmte Inhaltsstoffe, z. B. Zucker oder
den Matrixeffekt kann die thermische Resistenz von
Sporen zusätzlich erhöht werden.
Die thermische Inaktivierung von Sporen auf
Oberflächen mittels Luft hängt von der relativen

. Tab. 7.1  Größenordnung von Inaktivierungsdaten hitzeresistenter Sporenbildnern, Bakteriophagen, Vitamine und
Enzymen im flüssigen Medien (neutral, Wasser oder Pufferlösungen)

Gruppe Bezeichnung ϑref n kref [s–1]* EA[kJ Dϑ,ref zϑ,ref

[°C] [–] kref mol–1] [min] [K]
[C0(1−n)s−1]

Sporen Bacillus cereus 103 1 0,32 335 0,12 8,5

Clostridium botulinum 121 1 0,18 297 0,21 10
Geobacillus 135 1 0,55 377 0,07 8,1
stearothermophilus**
Bakteriophagen Phage P008 (Lactococcus 70 1,3 1,1·10–4 470 – –
lactis)
Phage P680 (L. lactis) 70 1,1 4,6·10–5 212 – –
Phage T4 (Escherichia Coli) 70 1 4,0·10–3 269 10 8,4
Enzyme Lipase (Pseudomonas 130 1 2,5·10–2 81,7 1,52 36
fluorescens)
Protease (Ps. fluorescens) 130 1 3,6·10–3 100 10,5 31
Vitamin Thiamin (Vitamin B1) 130 2 9,3·10–4 100 – –
* für n ≠ 1, **Prüfkeim für Sterilisation, Daten aus [1, 2, 9, 12, 13]
 236 J. Hinrichs et al.
. Tab. 7.2  Einfluss der relativen Luftfeuchte φ
auf die Geschwindigkeit kT und den Dϑ-Wert der
Inaktivierung von Sporen Bacillus subtilis var. niger bei
122 °C [8]
φ [–] k395 K [s–1] D122°C
1,0 102 3,84 · 10–4
0,6 10–1 3,84 · 10–1
0,2 10–6 3,84 · 104
Luftfeuchte φ ab, wie in . Tab. 7.2 gezeigt. Danach
verlängert sich für den gleichen Inaktivierungseffekt
(D122°C) die Erhitzungszeit in trockener Luft (φ = 0,2)
7 108-mal im Vergleich zu mit Wasserdampf gesättig-
ter Luft. Daher erfolgt die thermische Sterilisation
von Oberflächen entweder über heißes Wasser oder
durch gesättigten Wasserdampf bei mindestens 121
°C für 20–30 min. Für die Sterilisation von Oberflä-
chen mit Luft sind Bedingungen von 180 °C für min-
destens 30 min erforderlich.
Üblicherweise werden kinetische Inaktivie-
rungsdaten in Laborexperimenten mit geringen
Volumina gewonnen. Dabei wird davon ausgegan-
gen, dass die Aufheizzeit und die Abkühlphase einen
geringen Einfluss haben (. Abb. 7.5A). Nachdem
aber erst Temperaturen >100 °C zur Sporeninakti-
vierung beitragen, andererseits >130 °C die Inakti-
vierung relativ rasch abläuft, ist bei hohen Tempe-
raturen ein Beitrag der Aufheiz- und Abkühlphase
nicht auszuschließen. Mit einem integralen Ansatz
gelingt es, die Aufheiz- und Abkühlphase neben der
Heißhaltephase in die Bestimmung der kinetischen
Daten einzubeziehen [3]. Die experimentell ermit-
telten Ausgangskonzentrationen C0 und Endkon-
zentrationen Cm werden für jede einzelne Behand-
lung mit dem Temperaturprofil (z. B. . Abb. 7.5B)
über Gl. 7.5 direkt verknüpft. Für ein Experiment mit
C0 und Cm ergeben verschiedene Parameterkombi-
nationen aus kref und EA eine Lösung von Gl. 7.5. Die
verschiedenen Parameterkombinationen stellen
eine Lösungskurve dar (. Abb. 7.4). Jedes Experi-
ment ist durch eine Lösungskurve abgebildet und
der Bereich, in dem sich alle Lösungskurven schnei-
den, repräsentiert die Lösung kref und EA für alle
Experimente.
. Abb. 7.4  Vorgehensweise zur Bestimmung der
temperaturabhängigen Geschwindigkeitskonstante kref und der
Aktivierungsenergie EA aus experimentellen Inaktivierungsdaten
und dem Temperaturprofil für n = 1 (Lösungskurven T1, T2
und T3 für Gl. 7.5 für C0, Cm für verschiedene experimentelle
Temperaturprofile, z. B. . Abb. 7.5)
7.3 Vergleich und Optimierung des
Behandlungseffekts
Zur Abschätzung, zum Vergleich oder zur Optimie-
rung von Erhitzungsprofilen (. Abb. 7.5) nutzt man
den Behandlungseffekt (log C0/Ct), z. B. Reduktion der
Sporenkonzentration von C0 = 105 mL–1 auf eine Kon-
zentration von 1 Spore pro mL. Für den mikrobiologi-
schen Behandlungseffekt B* ergibt sich nach Umstel-
len von Gl. 7.2 (Achtung! Wechsel von ln auf log):
C0 kT=const
B* = log = ⋅ t  für n = 1 Gl. 7.9
Ct 2, 303
Analog kann die Gleichung für den chemischen
Behandlungseffekt C*, der beispielsweise den Verlust
an Vitaminen oder die Inaktivierung von Enzymen
beschreibt, formuliert werden. Für eine Reaktions-
ordnung n ≠ 1 wird Gl. 7.3 umgestellt und genutzt.
Die Gl. 7.9 ist geeignet, um den Effekt eines T-t-
Profils für kleine Volumina mit vernachlässigbarer
Aufheiz- und Abkühlphase (. Abb. 7.5A) zu berech-
nen. Das reale T-t-Profil der Sterilisation eines Bio-
reaktors weist allerdings eine längere Aufheizphase,
eine Haltezeit mit konstanter Temperatur und eine
Kapitel 7 · Sterilisation und Sterildesign
237 7
. Abb. 7.5  (a) Ideales
Temperatur-Zeit-Profil zur
experimentellen Bestimmung von
Inaktivierungskurven (vgl. . Abb. 7.2
und 7.3) und ermitteln von
Inaktivierungsdaten; (b) Beispiel eines
T-t-Profils einer Mediensterilisation
in einem Bioreaktor; (c) Beispiel einer
kontinuierlichen Hochtemperatur-
Kurzzeit-Sterilisation mit
Sattdampfinjektion

Abkühlphase auf (. Abb. 7.5b). Ein weiteres Bei- Mittels dieser Vorgehensweise können die Ste-
spiel zeigt . Abb. 7.5c, bei dem das Medium ab einer rilisationsbedingungen des Substrats so optimiert
bestimmten Temperatur mittels Dampfinjektion werden, dass ein vorgegebener B*-Wert, z. B. Inak-
(z. B. kontinuierliche Sterilisation) erhitzt wird. Zur tivierung von G. stearothermophilus um 9 log (B* =
Berechnung und zum Vergleich so unterschiedli- 9) erreicht wird und gleichzeitig chemischen Ver-
cher T-t-Profile ist die Temperaturabhängigkeit der änderungen, z. B. Verlust an Thiamin unter 3% (C*
Geschwindigkeitskonstante kT zu berücksichtigen: = 1,5) bleiben. Durch Umstellen von Gl. 7.5 werden
für den vorgegebenen B*-Wert auf Basis der Daten
t
C 1 in . Tab. 7.1 Temperatur-Zeit-Kombinationen für
B* = log 0 =
Ct 2, 303
⋅
∫ k 〈t〉 dt
T Linien gleichen Effekts berechnet.
0  Gl. 7.10
B*
t=
Da in den meisten Fällen eine analytische Lösung der kref  E 1 1 
exp − A ⋅  − 
Gleichung nicht einfach zugänglich ist, zerlegt man das 2, 303  R  T Tref 
T-t-Profil in m kleine Zeitintervalle Δti (. Abb. 7.5b), in
C
denen die Temperatur Ti als konstant angenommen log 0
Cm
wird. Die numerische Integration und Berechnung =
kref  E 1 1 
des B*-Wertes ist dann über das T-t-Profil möglich: exp − A ⋅  −  für n = 1Gl. 7.13
2, 303  R  T Tref 
C0 1 m
B* = log = ⋅ ∑ kTi ∆ti  Gl. 7.11 Für eine Reaktionsordnung n ≠ 1 werden analog
Cm 2, 303 i=1 Gl. 7.3 und Gl. 7.4 verknüpft. Die . Abb. 7.6 zeigt ver-
schiedene Linien gleichen Effekts. Das übliche Erhit-
Nach Einsetzen von Gl. 7.4 in Gl. 7.11 ergibt sich: zungsgebiet für die Batch-Sterilisation (grau) liegt
oberhalb der Linie für die Inaktivierung von G. stea-
m rothermophilus um 9 log. Dies führt allerdings zu
C0 k
B* = log = ref ⋅ ∑ exp einem hohen Verlust an Thiamin. Nachdem alle
Cm 2, 303 i=1
Temperatur-Zeit-Kombinationen auf der Linie
 E 1 1  B* = 9 zur Sterilisation geeignet wären, lassen sich
− A ⋅  −  ⋅∆t  Gl. 7.12

 R  Ti Tref  i die Erhitzungsbedingungen so optimieren, dass
der Thiaminverlust <3 % liegt. Geeignet sind nach
. Abb. 7.6 Temperaturen zwischen 135–150 °C für
(Mittels Excel-Tabelle können die Daten aus . Tab. 7.1 wenige Sekunden, die in der kontinuierlichen Ste-
über Gl. 7.12 mit einem gemessenen T-t-Profil ver- rilisation (Ultrahochtemperatur(UHT)-Behand-
knüpft werden und der B*-Wert für reale Prozesse lung) angewandt werden. Die Linien für die Pha-
rechnerisch abgeschätzt und verglichen werden.) geninaktivierung verdeutlichen, dass mit den
 238 J. Hinrichs et al.
7 Werte: B*(V = 10 mL) = 7; B*(V = 103 mL) = 9,
. Abb. 7.6  Beispiel mit Linien gleichen Effekts für
die Inaktivierung von Sporen, einem weit verbreiteten
Referenzphage P008 einem hitzeresistenten Phagen P680
sowie 3 % Thiaminverlust. Gebiete der Sterilisation liegen
oberhalb von B* = 9 (9-log Inaktivierung von Geobacillus
stearothermophilus)
Sterilisationsbedingungen auch hitzeresistente
Phagen sicher inaktiviert werden.
7.4 Sicherheitsniveau für
Sterilisationsprozesse
Der notwendige Behandlungseffekt der thermischen
Sterilisation B* ergibt sich aus der Konzentration an
Sporen C0 im zu sterilisierenden Medium und dem
geforderten Endwert Cm. Der Endwert ist abhängig
vom Volumen V des Bioreaktors und dem akzeptier-
ten Infektionsrisiko p. Wird ein unsteriler Prozess pro
10.000 Sterilisationen akzeptiert, bedeutet dies mit
akzept. unsteril  Gl. 7.14
p=
steril
ein p = 1/10.000 = 10 –4 . Da unabhängig vom
Volumen V (z. B. Labormaßstab mit 10 mL, Lebens-
mittel in 1-ltr-Dose = 103 mL, Bioreaktor mit 1000
L = 106 mL) bereits ein die Erhitzung überlebender
Sporus zum Schaden führt, folgt: Cm = 1 Sporus pro
Gesamtvolumen V. Daraus ergibt sich ausgehend
von Gl. 7.7 für das anzustrebende Sicherheitsniveau
in Bezug auf B*:
C0 C ⋅V
B* = log = log 0  Gl. 7.15
1/V ⋅ p p
Geht man von einer Sporenzahl von C0 = 102 Sporen
pro mL im Medium aus, so ergeben sich für ein
Sicherheitsniveau von p = 10–4 die folgenden B*-
B*(V = 106 mL) = 12. Dies bedeutet, dass der not-
wendige Behandlungseffekt für ein Fermentations-
medium bei gleichem Sicherheitsniveau p mit stei-
gendem Bioreaktorvolumen erhöht werden muss.
7.5 Kontinuierliche Verfahren
zur thermischen
Mediumsterilisation
In den kontinuierlichen Verfahren wird das Medium
direkt mit Dampf oder indirekt mit Dampf oder
Heißwasser auf die Sterilisationstemperatur erhitzt
und in einer Heißhaltestrecke für eine definierte
Zeit gehalten (7 Abschn. 7.3), um anschließend auf
Fermentationstemperatur gekühlt zu werden. Um
den Dampf- und Kühlwasserverbrauch und damit
die Betriebskosten zu senken, können regenerative
Wärmerückgewinnungssysteme eingesetzt werden.
7.5.1 Direkte Dampfsterilisation
Bei der direkten Dampfsterilisation wird gesättig-
ter Wasserdampf kontinuierlich durch einen Injek-
tor in den unter Überdruck stehenden Mediumstrom
eingedüst. Mit speziell entwickelten Dampfinjekto-
ren können Medium und Dampf intensiv für eine
schnelle und geräuscharme Kondensation vermischt
werden. Dabei wird das Medium sehr schnell auf Ste-
rilisationstemperatur aufgeheizt (typisches T-t-Profil
siehe . Abb. 7.5c). Nach der Haltestrecke wird der
Kapitel 7 · Sterilisation und Sterildesign
Mediumstrom in einem Vakuumbehälter entspannt,
sodass das Medium wiederum sehr schnell abgekühlt
wird. Das Verfahren kann nur angewandt werden,
wenn das Medium durch die Dampfblasenbildung
beim Entspannen nicht aufschäumt oder eine Ver-
dünnung des Medium durch das anfallende Kon-
densat negativen Einfluss auf die Medienqualität hat.
7.5.2 Indirekte Sterilisation über
Wärmetauscher
Bei der indirekten Sterilisation kommt der Dampf,
das Heiß- oder Kühlwasser nicht in direkten Kontakt
mit dem Medium. Das Medium wird indirekt in
Röhren- oder Plattenwärmetauscher aufgeheizt und
abgekühlt. Kriterien für die Auswahl und Auslegung
des Wärmetauschers sind die Produkteigenschaften
und die Prozessparameter aber auch die Reinig-
barkeit, Inspektions- und Wartungsfreundlichkeit.
. Abb. 7.7 zeigt das vereinfachte Schema einer Anlage
mit Röhrenwärmetauschern zum regenerativen Wär-
merückgewinnung. Das Medium wird in zwei Stufen
über die Wärmetauscher mit regelbaren Heißwas-
serkreisläufen erhitzt und danach bei Sterilisations-
temperatur heiß gehalten. Das Medium durchläuft
anschließend zwei Wärmetauscher zur Kühlung und
wird in den Steriltank/Bioreaktor gefördert. Vor der
eigentlichen Mediumsterilisation muss die gesamte
. Abb. 7.7  Kontinuierliche indirekte
Sterilisation mit Wärmerückgewinn
(WRG). T: Temperaturmessung
239 7
Anlage vorsterilisiert und wieder auf Betriebsbedin-
gungen gekühlt werden.
7.6 Sterilfiltration
Mit zunehmender Anzahl hitzelabiler Medien ist die
Bedeutung der Sterilfiltration in der pharmazeutischen
Biotechnik und Lebensmitteltechnik gestiegen. Oft ist
sie das einzige zuverlässige Verfahren, um Medien
wie z. B. Fermentationssubstrate oder Pufferlösun-
gen zu sterilisieren [30]. Als Sterilfilter wird ein Filter
definiert (FDA 2004) [31], der alle Mikroorganismen
aus einem Flüssigkeitsstrom entfernt und ein steriles
Filtrat gewährleistet. Zur Qualifizierung eines Filters
als Sterilfilter wird eine Bakterienbeaufschlagung mit
einer Konzentration von mindestens 107 Mikroorga-
nismen (Brevundimonas diminuta) pro Quadratzen-
timeter effektiver Filterfläche eingesetzt und das auf-
gefangene Filtrat auf Sterilität geprüft (Näheres siehe
PDA 2008) [32].
7.6.1 Sterilisation von Flüssigkeiten
Eine Sterilfiltration von flüssigen Medien wie Wasser
(Sterilwasser), Fermentationssubstraten oder Lösun-
gen mit Supplementen, z. B. Vitaminen, wird dann
eingesetzt, wenn die thermische Sterilisation nicht
 240 J. Hinrichs et al.

. Abb. 7.8  Schematische

Darstellung der Dead-End-Filtration
(A) und der Cross-Flow-Filtration (B) S $ %
Filtration
S S
Z
S70 '

S
P P
S

möglich ist. Eine Möglichkeit ist die sogenannte

7 Dead-End-Filtration (. Abb. 7.8A), in der die gesamte ∆pTM = p1 − p2  Gl. 7.17
zu filtrierende Flüssigkeit die Membran durch-
strömt. Enthaltene Mikroorganismen und Parti- und für die Cross-Flow-Filtration (. Abb. 7.8B) ergibt
kel/Inhaltsstoffe, die größer als die Porenweite der sich, nachdem es beim tangentialen Überströmen
Membran (cut off ≤ 0,2 µm) sind, werden zurückge- mit der Geschwindigkeit w der Membran zu einem
halten. Kleinere Partikel permeieren die Membran Druckabfall kommt:
oder können durch andere Mechanismen wie z. B.
Adsorption in der Membran zurückgehalten werden p1 + p2
∆pTM = − p3
(= Tiefenfilter). 2  Gl. 7.18
Im Lebensmittelbereich wird zusätzlich die
Cross-Flow-Filtration ( . Abb. 7.8B ) eingesetzt, Im Laufe der Filtration werden Mikroorganismen
bei der die flüssige Phase die Membran tangential und Substanzen auf der Membran abgelagert. Es
überströmt, ein Teil tritt durch die Membran (das bildet sich eine Deckschicht mit dem Widerstand ζD,
Permeat), der andere fließt als sogenanntes Retentat der den permeierenden Massenstrom nach Gl. 7.16
ab. Letzteres enthält die von der Membran zurück- bei ansonsten konstanten Bedingungen reduziert.
gehaltenen Mikroorganismen und andere größere
Bestandteile in erhöhter Konzentration (daher Kon- . A ⋅ ρ ⋅ ∆ pTM 1
m= ⋅
zentrat oder Retentat). 32 ⋅ η ζM + ζD  Gl. 7.19

Für beide Filtrationssysteme ergibt sich der per-

?
meierende Massenstrom m mit der Viskosität η Im Fall der Dead-End-Filtration sinkt deshalb im
und der Dichte ρ aus der angelegten transmembra- Laufe der Filtration der Massenstrom durch die
nen Druckdifferenz ΔpTM, der Membranfläche A und Membran immer weiter ab. Deshalb wird häufig ein
dem Membranwiderstand ζM. Filter vorgeschaltet, um grobe Feststoffe vorher zu
entfernen und somit die Standzeit des Sterilfilters zu
. A ⋅ ρ ⋅ ∆ pTM 1
m= ⋅ζ verlängern. Wird der Flux zu gering, wird der Steril-
32 ⋅ η M  Gl. 7.16 filter zur Sicherheit meist erneuert. Manche Dead-
End-Filtersysteme können auch durch Rückspülen
?
Häufig wird auch der sogenannte Flux J = m /A zur (CIP und SIP) gereinigt und dann weiter verwen-
Charakterisierung oder zum Vergleich von Memb- det werden.
ranen verwendet. Im Gegensatz zur Dead-End-Filtration kann
Die in Gl. 7.16 benötigte Druckdifferenz ergibt bei der Cross-Flow-Filtration durch das tangen-
sich für die Dead-End-Filtration (. Abb. 7.8A) aus: tiale Überströmen (bis 7 m/s) das Anwachsen der
Deckschicht kontrolliert werden, sodass sich nach
Kapitel 7 · Sterilisation und Sterildesign
Inbetriebnahme innerhalb kurzer Zeit ein nahezu
konstanter Filtratmassenstrom einstellt. Die Stand-
zeit ist dennoch begrenzt, da sich zum einen die
Deckschicht aus abgelagertem Material verdichtet
und zum anderen kleinere Partikel die Zwischen-
räume verstopfen. Vorteilhaft ist, dass das System
gereinigt werden kann; Nachteil ist, dass im Gegen-
satz zur Dead-End-Filtration immer ein Retentat mit
Mikroorganismen anfällt, das anderweitig verwertet
oder entsorgt werden muss.
Die Mehrzahl der verwendeten Membranen
(≤ 0,2 µm) für wässrige Prozessmedien ist hydrophil,
241 7
z. B. Polyethersulfon (PES), Polyvinylidenfluorid
(PVDF), Nylon 66 oder Celluloseester. In . Tab. 7.3
sind die Eigenschaften der Polymere, die für die
Auswahl herangezogen werden, zusammengestellt.
Alle Materialien sind bei 121 °C autoklavierbar und
weisen wenig extrahierbare Bestandteile auf; sie
unterscheiden sich jedoch z. B. in der Proteinbin-
dung oder in der pH-Beständigkeit.
Neben Partikeln und Mikroorganismen kann
mit Filtersystemen die Belastung von Medien mit
Viren (20–300 nm) [2, 10] oder Bakteriophagen
(40–200 nm) [10] minimiert werden. Geeignet

. Tab. 7.3  Die Eigenschaften der verwendeten Polymere im Filtermembran-Aufbau (modif. nach [14])

Medium Polymer Min. Auto- Extra- Benetzbar- Protein- Spezifische

Porengröße kla- hier- keit bindung Eigenschaften
(µm) vierbar bare Be-
bei stand-
121°C teile

flüssig PES 0,04 Ja niedrig hydrophil niedrig hohe

Massenströme,
Virusentfernung
Nylon 66 0,04 Ja sehr hydrophil niedrig positiv geladene
niedrig binden z. T.
Endotoxine
Celluloseester 0,025 Ja variiert hydrophil Acetate gute Festigkeit,
mit niedrig, hitzeresistent,
Qualität Nitrat und aber brüchig
Mischester
hoch

PVDF 0,1 Ja niedrig hydrophob, hydrophob Klassen mit guter

hydrophil hoch, Virusentfernung
verfügbar hydrophil verfügbar
sehr
niedrig
PP 0,2 Ja niedrig hydrophob niedrig flexibel
PTFE 0,1 Ja niedrig hydrophob, hydrophob extreme pH-
hydrophil hoch, Werte, hohe
verfügbar hydrophil Temperatur
niedrig
PA 0,2 Ja niedrig hydrophob hoch Laugen-,
Lösungsmittel-
tolerant
gas-fömig PVDF 0,1 Ja niedrig hydrophob
PTFE 0,1 Ja niedrig hydrophob hohe Temp.

PES: Polyethersulfon, PVDF: Polyvinylidenfluorid, PP: Polypropylen, PTFE: Polytetrafluorethylen, PA. Polyamid
 242 J. Hinrichs et al.

sind beispielweise PVDF- oder PES-Membranen
(. Tab. 7.3, unter „Spezifische Eigenschaften“).
. Abb. 7.9 zeigt beispielhaft die Wirkungsweise
eines häufig eingesetzten Sterilfilters, der soge-
nannten Filterkerze. Beim Durchströmen des Ste-
rilfilters werden Mikroorganismen und Partikel auf
oder im Filterelement (Tiefenfilter) zurückgehal-
ten und das sterile Medium wird zentral abgeführt.
Im Gehäuse befindet sich das Filterelement, das aus
einer oder mehreren Membranen besteht, die sowohl
anströmseitig als auch abströmseitig von einer Stütz-
und Drainagelage umgeben sind (. Abb. 7.9b). Die
Membran ist um einen zentralen Stützkörper ange-
ordnet oder auch gefaltet, wodurch eine größere Fil-
terfläche bereitgestellt wird. Oben und unten ist das
7 Filterelement mittels sogenannter Endkappen abge-
schirmt. Am oberen Ende besitzt das Filterelement
eine Zentrierspitze, die die Ausrichtung im Filterge-
häuse aus Edelstahl oder Kunststoff ermöglicht. Am
unteren Ende gewährleistet ein Adapter die Positio-
nierung und Abdichtung im Filtergehäuse.
7.6.2 Sterilisation von Gasen
Sterilluft ist das gebräuchlichste Gas, das bei Fer-
mentationen und aseptischen Abfüllanlagen benö-
tigt oder überlagert wird. Sterile Luft ist aber auch
notwendig, um einen Tank nach der Dampfsterilisa-
tion zu belüften (. Abb. 7.10). Andere Beispiele für
sterile Gase sind: Stickstoff bei oxidationsanfälligen
Substraten oder Produkten, Sauerstoff für Patienten
mit Atembeschwerden, Kohlendioxid für karboni-
sierte Getränke.
Gasfilter (. Abb. 7.9) arbeiten nach dem Dead-
End-Prinzip (. Abb. 7.8A). Sie können aus Cellulose,
Glas-Wolle- und Glas-Fiber-Mischungen oder aus
PVDF und PTFE bestehen (s. . Tab. 7.3 unten). Die

(QWOIWXQJV
)LOWHUHOHPHQW YHQWLO
*HKlXVH

unsteriles
Medium

steriles
Medium

. Abb. 7.9  Schematische Darstellung der Funktionsweise eines Sterilfilters mit Filterkerze (a). Beispiele für Kerzenfilter
(b) (Pall Life Sciences, BioPharmaceuticals)
Kapitel 7 · Sterilisation und Sterildesign
243 7
. Abb. 7.10  SIP-fähiger
Bioreaktor, SIP: Sterilisation-In-
Place, CIP: Cleaning-In-Place, T:
Temperaturmessung, K: kritische
Stellen

. Tab. 7.4  Reinraumklassifizierung („Clean room“) für Luftfilter nach Anzahl der gemessenen Partikel/m3 Luft (nach
[14])

System EU-GMP Partikel- 3 4 A/B 6 C D

Klasse größe
(µm)
ISO 5 7 8
14644-1
Klasse

Performanz- 0,1 1000 10000 100000 1000000 – –

Spezifikationen*
0,2 237 2370 23700 237000 – –
0,3 102 1020 10200 102000 – –
0,5 35 352 3520 35200 352000 3520000
1,0 8 83 832 8320 83200 832000
5,0 - 29 293 2930 29300

*Die Performanz-Spezifikation ist definiert über die Anzahl von Partikeln bestimmter Größe (µm) in einem m3 Luft.
 244 J. Hinrichs et al.
Einordung von Luftfiltern erfolgt in Klassen, die eine
maximale Anzahl an Partikeln in der filtrierten Luft
vorgeben. In . Tab. 7.4 ist die Reinraumklassifizie-
rung gemäß des ISO-Standards (EN ISO 14644-1,
ISO-Klasse 3 bis 8) und der EU-GMP-Richtlinien
(Gute Herstellungspraxis für Arzneimittel; Klasse A
bis D) zusammengestellt.
In aseptischen Abfüllbereichen werden üblicher-
weise EU-GMP Klasse A eingesetzt. Sogenannte
HEPA-Filter (high efficiency particulate arrestance)
sind darauf ausgelegt, auch kleine Partikel 0,3 μm
abzuscheiden, und erlauben damit aseptische Bedin-
gungen. Darüber hinaus werden mit ULPA-Filter
(ultra low particulate air) Partikel mit 0,1 µm abge-
schieden, womit auch mit Viren oder Bakteriopha-
7 gen belastete Aerosole behandelt werden können.
7.6.3 Filterintegritätstest
Mittels zerstörungsfreiem Filterintegritätstest ist ein
Sterilfilter sowohl vor dem Einsatz als auch nach der
Filtration zu überprüfen, um Undichtigkeiten oder
Filterdefekte festzustellen. Die Prüfungen erfordern
eine vollständige Benetzung der Filtermembran mit
Flüssigkeit: Wasser für hydrophile und z. B. Isopro-
panol/Wasser-Mischungen für hydrophobe Mate-
rialien (. Tab. 7.3). Die Integrität wird üblicherweise
durch einen Diffusionstest (Forward-Flow-Test)
oder einen Bubble-Point-Test geprüft. Im Diffu-
sionstest wird für einen vorgegebenen Testdruck der
Gasvolumenstrom gemessen, der durch die Poren
der benetzten Membran strömt. Im Bubble-Point-
Test wird der Druck des Luftdurchbruchs durch die
benetzte Membran bestimmt. Für die Durchführung
stehen Integritätstestgeräte zur Verfügung, die nach
Anschluss an eine Druckgasversorgung die Test-
phasen automatisch steuern und den Testverlauf
protokollieren.
7.7 Funktion von
Dampfsterilisatoren
(Autoklaven)
Dampfsterilisatoren zur sicheren Sterilisation von
Flüssigkeiten, z. B. Nährmedien und Festkörpern,
Filterträger, Verbrauchmaterialien, Geräte und
Ausrüstungsteile, gehören zur Standardausrüstung
in Laboren, Technikums- und Produktionsanlagen
der Bioprozesstechnik. Sie bestehen im Wesentlichen
aus einem Druckbehälter als Sterilisationskammer
von wenigen Litern bis mehreren m3 Kammervo-
lumen, einer Vakuumpumpe, Mess- und Regelein-
richtungen und einer programmierbaren Steuerung.
Als Versorgungsmedien werden Dampf, Kühlwas-
ser und Druckluft benötigt. Der Dampf wird extern
zugeführt oder im Autoklaven direkt aus einer Was-
servorlage generiert. Die Sterilisation erfolgt nach
verschiedenen vorprogrammierten Verfahren. Beim
Gravitationsverfahren werden der Innenraum und
das Gut mit Sattdampf überlagert. Der unten eintre-
tende Sattdampf verdrängt dabei die Luft über ein
oben angeordnetes Ventil nach außen. Beim Vaku-
umverfahren wird als erstes mittels Vakuumpumpe
die störenden Luft entfernt und danach mit Dampf
beaufschlagt. Der Vorgang kann mehrfach wieder-
holt werden (= fraktioniertes Vakuumverfahren).
Nach Entlüftung werden die Temperatur und der
Druck auf die vorgegebenen Werte geregelt.
Das zu sterilisierende Gut muss beständig
gegenüber den Sterilisationsbedingungen sein. Die
Kammer wird manuell mit dem Sterilisationsgut
beladen und gasdicht verschlossen. Je nach Belade-
gut wird ein dafür validiertes Verfahren ausgewählt
und die Sterilisation gestartet. Entlüftungs-/Aufheiz-
zyklus: Die Kammer mit dem enthaltenen Gut wird
mit Sattdampf aufgeheizt und über ein Ventil ent-
lüftet. Nach dem Entlüften steigt nach Schließen des
Ventils der Druck in der Kammer bis auf den Satt-
dampfdruck an. Zwischen Erreichen der Solltempe-
ratur in der Kammer und im Gut kann eine erheb-
liche Verzögerungszeit liegen. Sterilisationszyklus:
Nach Erreichen der Sterilisationstemperatur im Gut
wird der Zustand unter Sattdampfbedingungen eine
vorgegebene Zeit gehalten. Abdampf-/ Abkühlzyklus:
Die Kammer wird über ein Ventil langsam entspannt,
um einen Siedeverzug zu vermeiden. Das Sterilgut
im Autoklaven kann über Kühlwasser beschleunigt
bis auf die Entnahmetemperatur abgekühlt werden.
Trocknungszyklus: Bei Bedarf kann durch Anlegen
von Vakuum das Sterilgut getrocknet werden. Nach
Freigabe durch die Steuerung wird das sterilisierte
Gut entnommen. Dokumentation: Die Prozesspara-
meter jeder Sterilisation werden in einem Protokoll,
mit dem der Prozess überprüft und beurteilt wird,
Kapitel 7 · Sterilisation und Sterildesign
dokumentiert. Werden die Anforderungen nicht
erreicht, muss die Sterilisation wiederholt werden.
Mit einer Validierung muss nachgewiesen
werden, dass das jeweilige Verfahren für das Steril-
gut geeignet ist, die Sterilisationsbedingungen erfüllt
werden und das Ergebnis dokumentiert wird. In der
dabei enthaltenen Qualifizierung wird die Funktions-
tüchtigkeit des Autoklaven überprüft. Die Validie-
rung sollte mindestens jährlich durchgeführt werden.
7.8 Sterilisierbare Bioreaktoren
Hauptkomponente für die Kultivierung von Zellen
und Mikroorganismen ist der Bioreaktor, in dem
die optimalen Bedingungen für den jeweiligen Fer-
mentationsprozess eingestellt werden. Eine Grund-
voraussetzung ist die Herstellung und die Aufrecht-
erhaltung der Sterilität im Bioreaktor während der
gesamten Fermentationszeit, um Kontaminationen
auszuschließen. Der eigentlichen Fermentation ist
eine thermische Dampfsterilisation des gesamten
Systems (mobile Kleinfermenter) in einem Auto-
klaven oder die Sterilisation des Fermenters durch
die sogenannte Sterilisation-in-Place (SIP) vorge-
schaltet. Standardwerte der Sterilisation sind nach
dem europäischen Arzneibuch eine Temperatur von
121 °C für 15 min. In der Praxis werden die Werte
für eine erhöhte Sicherheit und zur Kompensation
von Messtoleranzen zum Beispiel auf 121,5 °C für
30 min erhöht. Die Effektivität der Verfahren wird
sowohl über die physikalischen Parameter Tempera-
tur, Druck und Zeit als auch über Bioindikatoren im
Rahmen einer Qualifizierung festgestellt.
Die Sterilisation kann prozess- und medienab-
hängig sowohl mit den bereits im Bioreaktor befind-
lichen Medien als auch mit dem leeren Bioreaktor
erfolgen. Medien mit hitzeempfindlichen Bestandtei-
len, wie z. B. Vitamine und Antibiotika werden dem
Bioreaktor sterilfiltriert zugeführt (7 Abschn. 7.6).
7.8.1 Aufbau autoklavierbarer
Bioreaktoren
Bioreaktoren im Laborbereich bestehen bei einem
Arbeitsvolumen von 1 L bis 20 L aus Borosilikat-
glas mit Kopf- und Bodenplatten aus Edelstahl. Ab
245 7
einem Arbeitsvolumen >20 L sind sie komplett aus
rostfreien Stahl (7 Abschn. 7.9). In der Kopfplatte
sind Stutzen für Messwertgeber und für die Zugabe
der Nährmedien, der Zellkulturflüssigkeit und der
Abluft sowie das Begasungsrohr eingeschweißt. Die
Durchmischung erfolgt in der Regel über Magnet-
rührwerke, die in der Bodenplatte eingeschweißt
sind. Über Temperaturfühler und den beheizbaren
Doppelmantel wird die Temperatur im Bioreaktor
geregelt. Die Kontrolle, Steuerung und Aufzeichnung
der Prozessparameter erfolgt über entsprechende
Steuereinheiten.
Für die Sterilisation des Laborbioreaktors im Auto-
klaven werden die nicht temperaturbeständigen Teile
wie Rührwerksmotor und Sondenkabel abgebaut. An
die Zugabestutzen werden Silikonschläuche mit Kunst-
stoffkupplungen und Inline-Sterilfilter angeschlossen.
Im Autoklaven wird über diese Einmalfilter die Luft im
Bioreaktor ausgetauscht. Der Bioreaktor wird je nach
Verfahren mit oder ohne Medien in den Autoklaven
eingebracht und dort nach einer festgelegt Tempera-
tur-Zeit-Prozedur dampfsterilisiert (7 Abschn. 7.7). Die
Zugabe der Nährmedien, der Zellkulturflüssigkeit und
anderer flüssiger Stoffe in den sterilisierten Bioreaktor
erfolgt durch Abnahme der Sterilfilter und die sterile
Ankopplung der ebenfalls dampfsterilisierten Gefäße
mit Silikonschläuchen unter einer Sicherheitswerk-
bank in steriler Umgebung oder mit speziellen Steril-
kupplungen in unsteriler Umgebung.
7.8.2 Aufbau SIP-fähiger Bioreaktoren
Die Bioreaktoren im Pilot- und Produktionsmaßstab
sind im wesentlichen Druckbehälter aus Edelstahl
von 10 L bis 20.000 L Arbeitsvolumen mit einem Ver-
hältnis von Höhe H zu Durchmesser D von 2:1 bis
3:1. Durch ein funktionelles Sterildesign (7 Abschn.
7.9) im Bioreaktor und der Peripherie muss sicher-
gestellt sein, dass die Reinigung und Sterilisation
erfolgreich durchführt werden können. Kritische
Stellen mit besonders hohem Kontaminationsri-
siko bei einem SIP- fähigen Bioreaktor (. Abb. 7.10)
sind statische oder dynamische Abdichtungen zur
Atmosphäre und Abdichtungen innerhalb der Pro-
zessanlage zwischen sterilen und nicht sterilen
Bereichen, den sogenannten Sterilgrenzen. Kritisch
sind auch Stellen, wo sich zum Beispiel Luftblasen,
 246 J. Hinrichs et al.
Kondensatansammlungen oder Kältebrücken bilden
können, da dort die Sterilisationstemperatur nicht
bzw. zeitverzögert erreicht wird.
Die Aufheizung bzw. Kühlung des Bioreaktors
erfolgt über Doppelmantel oder aufgeschweißte
Halbrohrschlangen. Im Behälterdeckel bzw. oberen
Klöpperboden verteilt befinden sich die einge-
schweißten Anschlüsse für die diversen Zuführungs-
leitungen. Im unteren Boden ist ein Bodenmagnet-
rührwerk oder falls von der Leistung erforderlich
ein konventionelle Bodenrührwerk mit doppelter
Gleitringdichtung eingebaut (7 Abschn. 7.9.5). Je
nach Rühraufgabe kommen unterschiedliche Rüh-
rertypen zum Einsatz. Des Weiteren sind im unteren
Boden Einschweißhülsen für Temperaturmessungen
7 und ein Bodenablassventil das sogenannte Ernteven-
til eingeschweißt. Im unteren zylindrischen Teil sind
seitlich Anschlüsse für Messsonden 7 Abschn. 7.9.2)
und Probenahme (7 Abschn. 7.9.3) angeordnet.
Zur Vorbereitung der Leersterilisation werden
die direkt am Bioreaktor liegenden Filtergehäuse mit
Sterilfilterkerzen bestückt und die Ventile auf der
Seite zum Bioreaktor geöffnet, um die Sterilisierung
über den Abdichtungssteg im Ventil zu ermöglichen.
Gesättigter Wasserdampf wird von oben eingeleitet
und der Bioreaktor in dampfgesättigter Atmosphäre
unter Druck auf Sterilisationstemperatur aufgeheizt.
Das Aufheizen wird durch die Mantelbeheizung
unterstützt. Über die auf der Sterilseite geöffneten
Ventile wird die Luft verdrängt und anfallendes Kon-
densat über thermische Kondensatableiter abge-
führt. Der Kondensatableiter führt das Kondensat
knapp unter der jeweiligen Sattdampftemperatur
verzögerungsfrei ab und entlüftet automatisch. Ist
die Sterilisationstemperatur an allen Schnittstellen
erreicht, beginnt die Haltezeit. Die Temperatur wird
an ausgesuchten kritischen Stellen während der Ste-
rilisation gemessen und überwacht, um eine aus-
reichend lange Sterilisationszeit an jeder Stelle des
Fermenters sicher zu stellen. In der Abkühlphase
kondensiert der Wasserdampf und das System wird
über einen Sterilfilter belüftet und ein leichter Über-
druck aufgebaut, um Kontaminationen auszuschlie-
ßen. Mit einem Druckhaltetest wird die Dichtigkeit
des Systems überprüft. Danach ist der Bioreaktor
bereit für die Zugabe von Medien über Sterilfilter
(7 Abschn. 7.6). Die Zellkulturflüssigkeit wird über
eine sterile Ankopplung zugeführt.
7.9 Sterildesign
Für Sterilprozesse müssen die verwendeten Appa-
raturen und Geräte neben funktionellen Anforde-
rungen selbst auch Sterilbedingungen erfüllen, um
Kontamination der sterilen Medien auszuschließen.
Nach DIN EN 12297 bedeutet dies die „Eignung von
Bauteilen, Geräten und Ausrüstungen, Apparateein-
heiten oder Anlagen steril gemacht zu werden“, was
mit Sterilisierbarkeit bezeichnet wird. In DIN EN
ISO 14159, die als grundlegende Norm für Hygie-
neanforderungen an die Gestaltung von Maschinen
gilt und die Biotechnologie einschließt, wird unter
Sterilisation ein Prozess definiert, bei dem alle Mik-
roorganismen und relevanten mikrobiellen Sporen
inaktiviert werden (7 Abschn. 7.4).
Untersuchungen und praktische Erfahrungen
haben gezeigt, dass bei hygienegerecht gestalteten
Apparaten bereits bei der Reinigung ein Großteil
an Mikroorganismen entfernt und damit das Aus-
gangsniveau wesentlich gesenkt wird (7 Kap. 7).
Eine sichere Sterilisation kann deshalb nur garan-
tiert werden, wenn alle produktberührten Oberflä-
chen leicht reinigbar gestaltet werden, um einwand-
freie Sauberkeit nach der Reinigung zu garantieren.
Schmutzschichten und Biofilme können Mikroorga-
nismen vor der Einwirkung der Sterilisationsbedin-
gungen schützen.
Der Begriff „leichte Reinigbarkeit“ wurde durch
eine Vielzahl grundlegender Leitlinien durch die
unabhängige europäische Gruppe EHEDG (Euro-
pean Hygienic Engineering and Design Group) zu
einer Standardanforderung im Bereich Hygiene.
Für produkt- oder medienberührten Bereiche
umfasst leichte Reinigbarkeit im Prinzip folgende
Maßnahmen[6]:
55 Auswahl und Einsatz geeigneter und gut zu
reinigender Werkstoffe,
55 Herstellung ausreichend glatter, leicht zu
reinigender Oberflächenstrukturen,
55 Vermeidung von Poren, Rissen, Spalten
und Fehlern jeder Art in nicht sichtbarer
(mikroskopischer) und sichtbarer Größe
an Oberflächen, festen und beweglichen
Fügestellen sowie Lagerungen,
55 Vermeidung von Toträumen sowie Vor- und
Rücksprüngen,
55 Vermeidung von inneren horizontalen Flächen,
Kapitel 7 · Sterilisation und Sterildesign
55 strömungsgünstige Gestaltung von in-line zu
reinigenden Bereichen,
55 vollständig entleerbare Ausführung aller
Elemente und Bereiche,
55 wartungsfreundliche Gestaltung kombiniert
mit vorausschauender Wartung, um durch
rechtzeitigen Austausch von Verschleißteilen
mikrobiologische Probleme auszuschließen.
Um sterile Verhältnisse zu garantieren, muss das
gewählte Sterilisationsmedium die sauberen Ober-
flächen an allen Stellen erreichen und dort unter
den geforderten Bedingungen lange genug einwir-
ken können. Für die Dampfsterilisation von Biore-
aktorsystem ist zu beachten, dass bei der konstrukti-
ven Gestaltung Totbereiche und Stellen zu vermeiden
sind, in denen Flüssigkeitsreste zurückbleiben oder
Kondensatbildung auftreten kann, sodass dort die
Temperatur nicht ausreichend hoch wird. Die in-line
Sterilisierbarkeit von kleineren Komponenten und
Geräten kann mit einer Testmethode überprüft und
verifiziert werden (EHEDG-Guideline, Doc 5).
In der EHEDG-Guideline, Doc. 39 wird eine
weitere Voraussetzung für das Sterildesign festge-
legt. Danach muss durch das Design gewährleistet
werden, dass während der Produktion der sterile
Zustand in den Apparaten und Anlagen aufrecht
erhalten bleibt. So wird verhindert, dass Mikroorga-
nismen aus der Umgebung in den Bioprozess eindrin-
gen bzw. umgekehrt z. B. pathogene oder genmodifi-
zierte Mikroorganismen in die Umgebung gelangen
(DIN EN 12296). Zusammenfassend sind für sterile
Apparate folgende Anforderungen zu erfüllen:
55 Hygienegerechte Gestaltung aller produktbe-
rührten Oberflächen, um „leichte“ Reinigung
on-line oder nach Zerlegen zu garantieren;
55 sterilisierbare Gestaltung aller produktbe-
rührten Oberflächen, um nach erfolgreicher
Reinigung den Kontakt in diesen Bereichen mit
dem Sterilisationsmedium zu erreichen und
dadurch alle relevanten Mikroorganismen und
Sporen abtöten zu können;
55 penetrationsfreie bzw. hermetische Abdichtung
der produkt- und medienberührten Bereiche,
um nach Erreichen des sterilen Zustands einen
sterilen Produktionsablaufs zu garantieren, indem
ein Eindringen von Mikroorganismen aus einem
kontaminierten Außenbereich verhindert wird.
247 7
In Normen über Ausrüstungen in der Biotech-
nik sind Anforderungen an Reinigbarkeit (DIN
EN 12296), Sterilisierbarkeit (DIN EN 12297) und
Leckagesicherheit (DIN EN 12298) festgelegt.
7.9.1 Material- und
Oberflächenqualitäten für
Bioreaktoren
Werkstoffe für Bioreaktoren müssen den einschlä-
gigen Richtlinien entsprechen und im produktbe-
rührten Bereich physiologisch unbedenklich sein.
Außerdem darf von ihnen keine Migration unzuläs-
siger Bestandteile in die herzustellenden Produkte
und Medien erfolgen. Die Oberflächen müssen mit
der erforderlichen Qualität fehlerfrei herstellbar
sein, die sich während der Lebensdauer der Appa-
rate z. B. durch Korrosion oder Abrasion nicht soweit
verschlechtern darf, dass Reinigbarkeit und Sterili-
sierbarkeit nicht mehr gewährleistet sind. Werkstoffe
für dampfsterilisierbare Apparate und Komponen-
ten müssen gegen kontinuierliche Dampfbeaufschla-
gung bei der entsprechenden Temperatur für eine
definierte Zeitspanne beständig sein. Alle produkt-
berührten Oberflächen müssen die geforderte Tem-
peratur über die notwendige Zeitdauer der Sterilisa-
tion erreichen können.
Diese Anforderungen sind bei austenitischen
rostfreien Edelstählen gewährleistet, die als Stan-
dardwerkstoffe für Bioreaktoren zu betrachten sind.
Gute Verform- und Schweißbarkeit bei gleichzeiti-
ger hoher chemischer Beständigkeit kennzeichnen
die Haupteigenschaften dieser Werkstoffgruppe.
Der Korrosionswiderstand wird aufgrund einer
dünnen Chromoxid-Deckschicht (Passivschicht)
erzielt, die wie ein Halbleiter Elektronen passieren
lässt, aber Ionen blockiert. Während sauerstoffspen-
dende Medien den Schichtaufbau unterstützen, ver-
ursachen reduzierende Medien (z. B. alkalische Rei-
nigungsmedien) eine schwächende Wirkung bzw.
Aktivierung der Oberfläche. An Poren oder Fehl-
stellen der Passivschicht, die bevorzugt an mikro-
skopisch kleinen Inhomogenitäten vorhanden sind,
kann ein Angriff in Form von Korrosion (Loch-
fraß, Spannungsrisskorrosion) als Folge elektro-
chemischer Vorgänge stattfinden. Ursache dafür
sind in erster Linie Chlor- und Chloridionen in
 248 J. Hinrichs et al.
Reinigungs- und Desinfektionsmitteln, die in Poren
adsorbiert werden und kleine anodische Bezirke
bilden, während die passive Umgebung als Kathode
wirkt. Bei Säure-Angriff kann es zur Zerstörung der
Passivschicht kommen, wobei aus dem Werkstoff
Eisen und Chrom in Lösung geht.
Bioreaktoren werden heute weitgehend aus
molybdänlegierten, austenitischen, rostfreien Edel-
stählen gefertigt (DIN EN10088-1). Für dünnwan-
dige geschweißte Konstruktionen ohne Spezialanfor-
derungen wird am häufigsten 1.4401 (AISI 316) mit
der chemischen Kennzeichnung X5CrNiMo17-12-2
und normalem Kohlenstoffgehalt von 0,05 % einge-
setzt. Zunehmend ist jedoch die Tendenz zu 1.4404
oder X2CrNiMo17-12-2 (≈ AISI 316 L) mit nied-
7 rigerem Kohlenstoffgehalt festzustellen, was durch
die AISI-Bezeichnung L („low carbon“) verdeut-
licht wird. Niedriger Kohlenstoffgehalt verhindert
vor allem zu starke Chromverarmung durch Chrom-
Carbid Bildung in der Schweißnaht und der unmit-
telbar benachbarten Zone beim Schweißen dicke-
rer Bleche. Für noch höhere Anforderungen werden
vollaustenitische Edelstähle mir niedrigem C-Gehalt
wie 1.4435 oder X2CrNiMo18-14-3 (≈ AISI 316L)
und 1.4539 oder X1NiCrMoCu25-20-5 (AISI 904L)
eingesetzt, da durch Gehalte an Martensit und Del-
ta-Ferrit die Korrosionsbeständigkeit beeinträch-
tigt wird. Unter Ferrit werden alle magnetinduktiv
erfassbaren Phasen im austenitischen Gefüge bei
einer Messtiefe von 3 mm verstanden. Mindestan-
forderungen bezüglich Delta-Ferrit, die besonders
auch für Schweißnähte gelten, wurden in der Basler
Norm BN 2 festgelegt.
Die Oberflächenqualität von Edelstahl-Oberflä-
chen wird durch Rauheit und Struktur beeinflusst.
Für leichte Reinigbarkeit wird für die Oberflächen-
qualität zurzeit der Mittenrauwert Ra < 0,8 µm gefor-
dert (EHEDG-Guideline, Doc. 8). Untersuchungen
zeigten jedoch, dass zwischen Ra = 0,5 µm und Ra
= 1,5 µm keine signifikanten Unterschiede in der
Reinigbarkeit feststellbar sind. Für nicht bearbei-
tete hygienegerecht hergestellte Schweißnähte wird
ein Ra < 4 µm akzeptiert. Zusätzlich ist für leichte
Reinigbarkeit die Oberflächenstruktur maßgebend,
die bei gleichem Rauheitswert je nach der Art der
Behandlung wie z. B. Schleifen oder Elektropolieren
unterschiedliche Reinigungs- und Desinfektionser-
gebnisse liefert.
In vielen Fällen ist wegen Oberflächen-Beschä-
digungen bei der Herstellung von Bioreaktoren ein
Schleifen der medienberührten Oberfläche not-
wendig. Für Fertigschliff werden meist die Kornab-
stufungen 80–120–180–240 gewählt, wobei unter-
schiedlichen Schleifverfahren wie Trocken- oder
Nassschliff angewendet werden können. Die Struktu-
ren sind im Endzustand durch feinste, scharfkantige,
gerichtete Riefen (Erhöhungen und Vertiefungen),
eventuell mit Graten, gekennzeichnet. Während die
offenen Strukturen leicht reinigbar und sterilisierbar
sind, kann es sich für die Reinigung und Sterilisation
als problematisch erweisen, dass Grate „umgebogen“
und Mikrorisse sowie Riefen beim Schleifen durch
zu hohen Andruck und Schleifmittelreste „zuge-
schmiert“ werden können und damit latent vorhan-
den sind. Für die Bearbeitung großflächiger Teile
werden Schleifautomaten mit schwingungsfreien
Vorrichtungen verwendet.
Beim mechanischen Polieren wird im Gegensatz
zum Schleifen kaum Material abgetragen. In Abhän-
gigkeit des verwendeten Verfahrens können unter-
schiedlich glatte Rauheitsstrukturen erzielt werden.
Die Oberfläche muss dabei ausreichend fein vorbe-
arbeitet und frei von Kratzern und Beschädigungen
sein. Ansonsten besteht ebenfalls die Gefahr, dass
Vertiefungen „zugeschmiert“ werden und später
Hygieneprobleme bereiten. Hochglanzpolierte spie-
gelnde Oberflächen sind aus Sicht der Reinigbarkeit
und Sterilisierbarkeit nicht notwendig, werden zum
Teil jedoch gefordert, um Verschmutzungen optisch
besser zu erkennen.
Die chemische Behandlung durch Beizen ist oft
notwendig, um die bei einer Wärmebehandlung
entstehenden Zunderschichten oder die sich beim
Schweißen bildenden Anlauffarben zu beseitigen.
Erzeugt wird eine metallisch blanke Oberfläche mit
der notwendigen Passivschicht, deren Oberflächen-
struktur sich durch nicht gerichtete abgerundete
Erhöhungen und Vertiefungen auszeichnet.
In vielen Fällen werden für Bioreaktoren elekt-
ropolierte Oberflächen verlangt. Im Gegensatz zur
mechanischen Bearbeitung werden dadurch bevor-
zugt Profilspitzen im Mikrobereich geglättet, sodass
eine wellige Oberflächenstruktur mit geringerer
Rauheit als das Ausgangsprofil entsteht. Im Ver-
gleich zum Schleifen wird eine riss- und porenfreie
Oberfläche erzeugt. Diese ist durch das ungestörte
Kapitel 7 · Sterilisation und Sterildesign
austenitische Kristallgefüge ohne höhere Fremd- und
Ferritanteile gekennzeichnet, die eine optimale Pas-
sivschicht aus Chromoxid aufweist.
In DIN EN 12347 wird bei den Leistungskri-
terien für Dampfsterilisatoren und Autoklaven
angemerkt: „Im Vergleich zu einer mechanischen
Oberflächenbehandlung ist eine elektrochemische
Oberflächenbehandlung des metallischen Werk-
stoffes vorzuziehen, weil diese eine glattere Ober-
fläche ergibt, sogar wenn die Ra-Werte gleich sind.“
Titan- und niobstabilisierte Stähle sind nur bedingt
für das Elektropolieren geeignet, da die Kristall-
strukturen dieser Legierungsbestandteile wesent-
lich härter sind und aus der Grundmatrix des Werk-
stoffs herausragen
Für Bauelemente von Bioreaktoren wie Dich-
tungen oder Membranen, die aus Polymeren oder
Elastomeren hergestellt werden, ist auf die Tempe-
raturbeständigkeit zu achten. Diese Anforderungen
erfüllen bei den Polymeren z. B. PEEK sowie PTFE
und dessen Modifikationen wie PFA und FEP. Bei
den Elastomeren können VQM, EPDM und FKM
unter Beachtung der Spezifikationen eingesetzt
werden. Aufgrund der geringeren Wärmeleitfähig-
keit gegenüber Edelstahl kann durch Kunststoffe
die Sterilisationswirkung an ungünstig gestalteten
Stellen behindert sein. Weitere wichtige Anforde-
rungen sind: chemische Inertheit und Beständigkeit
gegen die eingesetzten Medien, Reinigungs- und
Desinfektionsmittel sowie mechanische Festigkeit,
Steifigkeit und Elastizität im genutzten Temperatur-,
Über- und Unterdruckbereich.
Die Oberflächenbeschaffenheit von Kunststoff-
bauteilen muss glatt, sowie poren- und rissfrei sein.
Reinigbarkeitstests zeigten, dass die beim Spritzguss
oder Extrudieren entstehende „Haut“ als Struktur
den Abdruck der Form aufweist, die im Allgemei-
nen porenfrei und dicht ist. Die bei spanabheben-
der Bearbeitung erzeugte Oberfläche kann hingegen
riefenartig bis stark zerklüftet sein, wenn nicht mit
den richtigen Werkzeugen, Schnittgeschwindigkei-
ten und Temperaturen gearbeitet wird. Außerdem
werden tiefgehende Poren offen gelegt, wenn das
Material nicht ausreichend gefüllt ist. Diese können
weder sicher gereinigt noch sterilisiert werden. Um
die Sterilität aufrechterhalten zu können, wird Dicht-
heit der Kunststoffe gegen Wasserdampf, Gase und
Licht sowohl von innen als auch von außen gefordert.
249 7
7.9.2 Stutzen für Messwertgeber
Einbauten in Bioreaktoren sollten durch eine sorg-
fältige Qualifizierung vor der Herstellung der Behäl-
ter nach Anzahl und Art der Gestaltung festgelegt
werden. Vielfach werden Reaktoren angeboten und
verwendet, die aufgrund von Kleinserien mit einer
Vielzahl von meist zu langen, nicht reinigbaren
Stutzen versehen sind. Während in die benötigten
Stutzen die Messwertgeber eingebaut werden, ohne
hygienegerechte Lösungen einsetzten zu können,
werden die anderen mit Blinddeckeln verschlossen.
Dadurch ergeben sich im Bioreaktor nicht reinigbare
und sterilisierbare Spalte oder Toträume.
Viele Hersteller von Sensoren verfügen über hygie-
negerecht gestaltete und auf Grund von Reinigbarkeits-
test zertifizierte Messwertgeber und Adapter für den
Einbau in Reaktoren und Rohrleitungen. Zu berück-
sichtigen ist aber auch die Einbausituation in Stutzen
und die Gestaltung der Abdichtung der Messwertgeber.
Lösungen für deren Einbau müssen im Vorhinein bei
der Behälterplanung und -fertigung einfließen.
Am einfachsten sind die Verhältnisse, wenn
ein Messwertgeber oder eine entsprechende Hülse
. Abb. 7.11) ohne medienberührte Dichtstellen mit
einer Schweißverbindung in eine glatte produktbe-
rührte Behälteroberfläche eingeschweißt werden
kann, wie es z. B. bei Temperatursensoren möglich
ist. Für die hygienegerechte Ausführung sind die
Oberflächenqualität der Schweißnaht sowie die
. Abb. 7.11  Beispiel eines in die Reaktorwand
eingeschweißten Temperatursensors bzw. Schutzrohres
 250 J. Hinrichs et al.
strömungsgünstige Anordnung des Sensors ohne
Strömungsschatten wichtig. Wenn bei kleineren
dünnwandigen Behältern nur von außen geschweißt
werden kann, stellt die innen liegende Nahtwurzel
eine hygienisch relevante Oberfläche dar.
Für den festen Einbau von Messwertgebern in
Flansche und Behälterstutzen sollten die zur Verfü-
gung stehenden, dem Sensor angepassten sterilisier-
baren Lösungen verwendet werden. Die Dichtstellen
müssen auf der Medienseite frontbündig und spalt-
frei sowie dicht gegen Mikroorganismen abdichten.
Medienberührte Dichtungen sind aus konstruk-
tiver Sicht meist die hygienisch sensibelsten Ele-
mente. Eine Rekontamination von Produktchargen
durch falsch konstruierte Dichtstellen kann auftre-
7 ten, selbst wenn eine Validierung der Reinigung und
Sterilisation vorgenommen wurde. Das Risiko wird
mit zunehmender Betriebszeit aufgrund von Bean-
spruchungen der Dichtungen größer.
Penetration oder Leckage sind bei richtig ausge-
führten und funktionsfähigen statischen Dichtun-
gen nicht zu befürchten. Wesentliche Anforderun-
gen an die Dichtstelle sind, dass der Messwertgeber
in der Bohrung des Stutzens zentriert wird und ein
axialer Anschlag für die richtige Pressung der Dich-
tung sorgt, um enge Spalte und Toträume zu ver-
meiden. Ausdehnung und Kontraktion müssen bei
der Gestaltung durch Dehnungsräume an der nicht
produktberührten Seite der Dichtung berücksichtigt
werden. Im Folgenden sollen anhand von Beispielen
sowohl Problembereiche als auch günstige Lösungs-
möglichkeiten aufgezeigt werden.
Eine einwandfreie Lösung für die Dichtstelle an
einem Behälterstutzen lässt sich erreichen, wenn
. Abb. 7.12  Behälterstutzen
mit axial dichtendem Drucksensor;
Druckmittler mit geschweißter
Frontmembran
axial dichtende Ausführungen wie z. B. Aseptik-
Verbindungen nach DIN 11864 verwendet werden.
. Abb. 7.12 zeigt den Einbau eines Drucksensors
mit Frontmembran und Druckmittler, der mittels
Flansch nach DIN 11864-2 an einen Behälterflansch
mit kurzer konischer Bohrung angeschlossen ist.
Eine Klemmverbindung nach DIN 11864-3 ist eben-
falls möglich. Die Anordnung kann auch in schräger
Lage am Deckel oder horizontal an der Behälterwand
eingesetzt werden. Auch der Einbau von Sensoren,
die wie z. B. pH-Sonden zur Behälterwand geneigt
werden müssen, ist grundsätzlich möglich. Wichtig
ist, dass der bündig in den Behälter eingeschweißte
Stutzenflansch konisch ausgeführt wird, um den ent-
stehenden möglichst kurzen Rücksprung gut erreich-
bar für die Reinigung und Sterilisation zu machen. Der
Stutzen muss die erforderliche Nut für den O-Ring
erhalten. Trotz der hygienegerechten Gestaltung der
Dichtstelle liegt sie in der am weitesten von der Behäl-
teroberfläche entfernten Ecke des Rücksprungs, und
stellt damit nach wie vor eine kritische Stelle für die
Reinigung und Sterilisation dar. Die Abdichtung nach
DIN 11851 (Milchrohrverschraubung), DIN 32676
oder ISO 2852 kann im Medienbereich für Sterilan-
wendungen nur verwendet werden, wenn sie zur Rei-
nigung jedes Mal vollständig zerlegt wird [7]).
Der Sensorflansch sollte Bestandteil der Konst-
ruktion des Messwertgebers sein, sodass eine zusätz-
liche Abdichtung vermieden wird. Die metallische
Wellmembran ist in diesem Fall in das Sensorgehäuse
eingeschweißt. Hygienegerecht gestaltete und getes-
tete Adapter, in die Sensoren montiert werden, sind
ebenfalls verfügbar, enthalten aber eine zusätzliche
Dichtstelle.
Kapitel 7 · Sterilisation und Sterildesign
. Abb. 7.13  Behälterstutzen mit nicht sterilisierbarer
radialer Abdichtung eines Messwertgebers
Zum Teil werden radiale Abdichtungen von
Messwertgebern in Stutzenbohrungen verwen-
det, wobei die Abdichtung durch einen O-Ring
mit Rechtecknut an der zylindrischen Stutzenboh-
rung erfolgt . Abb. 7.13). Der Sensor wird dabei
mit dem Stutzen verschraubt. Da das Gewinde
nicht zentrierend wirkt, ergibt sich aufgrund der
Toleranzen zwischen Sensor und Stutzen bis hin
zur Abdichtung ein nicht definierter enger Spalt.
Untersuchungen haben gezeigt, dass stets Medium
in die Rechtecknut der O-Ringdichtung eindringt
und bei in-place Reinigung nicht entfernt werden
kann. Daher stellt eine O-Ringabdichtung mit
. Abb. 7.14  Prinzip einer hygienegerechten und sterilisierbaren frontbündigen Abdichtung in Behälterstutzen
251 7
Rechtecknut generell keine reinigbare und sterili-
sierbare Lösung dar [6].
Solche Probleme vermeidet eine frontbündige
Abdichtung . Abb. 7.14) mit Dichtungsnut z. B. in
Anlehnung an DIN 11864. Dies bedeutet zum einen,
dass die Verbindung zwischen Sensor und Stutzen
eine Zentrierung sowie einen axialen Anschlag zur
richtigen Pressung der Dichtung erhalten muss. Zum
andern ist eine Nut in der Stutzenbohrung erforder-
lich. Problematisch ist, dass der O-Ring, der weit-
gehend von der rund ausgeführten Nut im Mess-
wertgeber umschlossen wird, verletzungsfrei in die
Stutzenbohrung eingeführt werden muss.
Die rechte Detailansicht in . Abb. 7.14 zeigt, dass
bei abgewandelten frontbündigen Konstruktionen
der O-Ring im Stutzen durch eine angepasste koni-
sche oder ausgerundete Fläche zum Produktraum
hin axial gehalten wird, während über den Messwert-
geber mit ausgerundeter Nut die Anpressung erfolgt.
Die Montage ist in diesem Fall problemlos möglich.
Das Konzept kann für eine beliebige Lage der Stutzen
und Messwertgeber eingesetzt werden. Neben Elas-
tomer-O-Ringen werden auch hygienegerecht gestal-
tete PEEK-Formringe als Dichtungen verwendet.
7.9.3 Sterile Probenahmeventile
Armaturen zur Probenahme zweigen gemäß
. Abb. 7.15 aus einem strömenden oder ­ruhenden
Medium einen Teilstrom oder ein definier-
tes Volumen ab. Die on-line Probenahme aus
dem laufenden Prozess kann kontinuierlich oder
 252 J. Hinrichs et al.

. Abb. 7.16  Prinzipbeispiel eines Probenahmeventils mit

. Abb. 7.15  Prinzipdarstellung der Probenahme aus einem Faltenbalg
7 Bioreaktor

diskontinuierlich erfolgen. In beiden Fällen stellen zu vermeiden. Sie genügen daher nicht den Anfor-
Probenahmeventile die Schnittstelle zur Bioreak- derungen an Sterilisierbarkeit. Gelöst werden
toranlage dar. Dadurch, dass sie z. B. abwechselnd kann dieses Problem, indem der Medienraum des
mit dem Prozess und der Umgebung in Verbindung Ventils vom Außenbereich durch einen Faltenbalg
stehen und unabhängig von der Anlage gereinigt (. Abb. 7.16) oder eine porenfreie dichte Membran
werden müssen, sind an sterile Probenahmeventile (. Abb. 7.17) hermetisch abgetrennt wird. Außer-
besondere Anforderungen zu stellen [24]. dem ist für Reinigung und Sterilisation des medien-
Probenahmeventile können wie andere Ventile berührten Bereichs ein zusätzlicher Anschluss
in Behälter bzw. Rohrleitungen direkt eingeschweißt erforderlich. Das Ventilgehäuse mit Kolben und
oder in Stutzen eingebaut werden. Für die lösbaren Betätigungsmechanismus ( . Abb. 7.16) wird mit
Verbindungen zum Behälterstutzen ist eine hygie- Hilfe einer Klemmverbindung nach DIN 11864-3
negerechte sterilisierbare statische Abdichtung wie mit dem bündig in den Behälter eingeschweißten
z. B. nach DIN 11864 erforderlich, wie sie bereits in Stutzen verbunden. Der abdichtende Kolbenbereich
7 Abschn. 7.9.2 für Messwertgeber erläutert wurde.
Die Verbindung an den Stutzen für Probenahme
und Reinigungs- bzw. Dampfanschluss sollten mit
dem Ventilgehäuse orbital verschweißt werden. Vor-
aussetzung ist, dass ein in-line zerlegbares Ventil
verwendet wird, sodass Verschleißteile wie z. B.
Kolbendichtungen, Faltenbalg bzw. Membran aus-
getauscht werden können. Bei entfernbaren Leitun-
gen müssen zwangsläufig lösbare Verbindungen ein-
gesetzt werden.
Da die Probenahmeöffnung zum mediumbe-
rührten Bereich während der Probenahme geöff-
net und danach wieder geschlossen wird, müssen
zusätzlich zu statischen auch bewegte Ventilele-
mente hygienegerecht und sterilisierbar abgedich-
tet werden. Bei Abdichtung mit üblichen Dichtele-
menten wie O-Ringen oder Lippendichtungen ist ein
Transport von mikroskopischen Schmutzschichten . Abb. 7.17  Darstellung eines Probenahmeventils mit
und Mikroorganismen durch die Dichtstelle nicht Membran (Prinzip nach Südmo)
Kapitel 7 · Sterilisation und Sterildesign
oder der gesamte Kolben können aus einem Polymer
wie z. B. PEEK hergestellt werden, das gute elasti-
sche Dichteigenschaften besitzt. Die frontbündige
Abdichtung erfolgt in diesem Fall mit einem Kegel-
sitz zwischen hartem Polymer und Edelstahl. Muss
aus Gründen des Mediums ein Edelstahlkolben ver-
wendet werden, ist eine Elastomerdichtung in einer
Nut des Kolbens erforderlich, die hygienegerecht
zu gestalten ist (siehe z. B. [7]). Für Reinigbarkeit
und Sterilisierbarkeit des Faltenbalgs aus Kunststoff
oder Edelstahl sind vor allem Abstand und Tiefe der
Falten entscheidend. Der Faltenbalg wird jeweils mit
einer nach außen führenden Leckageanzeige ausge-
rüstet, um Undichtwerden des Balgs und damit ver-
bundene Risiken unverzüglich erkennen zu können.
Durch die gegenüber liegenden Stutzen wirkt bei
der Reinigung mit geschlossenem Ventil der lange
Gehäuseraum um den Kolben als Totraum. Zudem
muss bei der Reinigung in geschlossenem Zustand der
Behälter frei von Medium sein, da eine Gefährdung
durch die einfach wirkende Kolbenabdichtung nicht
auszuschließen ist, die gegen ihre Dichtrichtung gerei-
nigt wird. Dies könnte durch eine doppelte Abdich-
tung an dieser Stelle verhindert werden. Der bei
geschlossenem Ventil abgedeckte Bereich der Dicht-
stelle muss zusätzlich bei offenem Ventil gereinigt
werden, indem das Ventil für kurze Intervalle geöff-
net wird. Gleiches ist bei der Sterilisation zu beachten.
. Abb. 7.17 zeigt ein sterilisierbares Probenah-
meventil, dessen Gehäuse in den Behälter einge-
schweißt ist. Die hermetische Abdichtung erfolgt
durch eine Elastomermembran, die gleichzeitig den
Betätigungskolben umhüllt und zum Medienraum
des Behälters abdichtet. Das Membranende ist im
Gehäuse eingespannt und wirkt dort als statische
Dichtstelle. Der medienberührte Innenbereich des
Gehäuses ist hygienegerecht und ablaufend gestaltet.
Eine hermetische Abdichtung des bewegten Ventil-
kolbens wird dadurch erreicht, dass die Membran
einerseits an der Kolbenstange und andererseits im
Ventilgehäuse befestigt ist.
7.9.4 Gestaltung der Zuluftstrecke
Zuluftleitungen für Bioreaktoren dienen zum einen
zur Overlay-Belüftung des Kopfraums, wo keine
direkte Produktberührung, sondern der sogenannte
Spritzbereich vorliegt (DIN EN ISO 14159). Zum
253 7
anderen werden sie für die Submers-Begasung ver-
wendet, bei der sie direkt an eine medienberührte
Leitung angeschlossen sind. Nach DIN EN 1672-2
werden für den Spritzbereich dieselben Hygiene-
Anforderungen wie für produktberührte Bereiche
gestellt. Üblicherweise werden die Leitungen, die
während des Prozesses mit Sterilluft beaufschlagt
sind, nur mit Dampf sterilisiert (SIP) und nicht in
den CIP-Kreislauf einbezogen. Da in den Zuluftlei-
tungen Kondensat auftritt und eine Kontamination
nicht auszuschließen ist, sollten diese auch regel-
mäßig gereinigt werden. Generell sollten CIP- und
SIP-Prozesse zuerst für Zuluftleitung sowie andere
externe Leitungen durchgeführt werden und erst
danach die Reinigung und Sterilisation des Biore-
aktors erfolgen.
Die Luft wird bei einer fest verrohrten Overlay-
Belüftung über einen Sterilfilter direkt dem Behäl-
ter zugeführt (. Abb. 7.18). Meist wird ein Vorfil-
ter zur Entlastung der Endfilterstufe eingesetzt.
Falls Integritäts-Tests der Filter nach der Sterili-
sation durchgeführt werden sollen, sind am Filter
sterile Abzweigungen mit Ventilen erforderlich.
Am Behältereinlass sollte ein Ventil, das frontbün-
dig zum Innenraum montiert wird, das Abgrenzen
der Leitung zum Bioreaktor ermöglichen.
In Beispiel in . Abb. 7.18 kann der Filter mit Hilfe
der Ventilgruppe A1, A2, D1 und C1 während des Pro-
zesses ausgetauscht werden, sofern eine kurzzeitige
Unterbrechung der Luftzufuhr zulässig ist. Während
. Abb. 7.18  Fließbild der Overlay-Belüftung eines
Bioreaktors
 254 J. Hinrichs et al.
der Sterilisation sind die Ventile A1, A2, B, D1, D2, C1,
und C2 geschlossen. Durch Öffnen der Ventile D1
und C1 erfolgt ein Vorheizen des Systems. Danach
wird Ventil D1 geschlossen, während nach Öffnen
der Ventile D2, A2 und C2 der Filter in Richtung
des Luftdurchflusses sterilisiert wird und Konden-
sat in die Sammelleitung abfließen kann. Nach ent-
sprechender Sterilisationszeit werden nacheinan-
der C2, C1, A2 und D1 geschlossen. Die Sterilisation
von Filter und Sterilleitung ist danach bei geschlos-
senem Ventil A1 unabhängig vom Reaktor erfolgt.
Die Sterilisation des Filters könnte auch im Gegen-
strom durchgeführt werden, wenn die Dampfzufuhr
über Ventil D1 erfolgt. Die automatische Betätigung
und Verschaltung der Ventile ermöglicht die Über-
7 wachung und Dokumentation. Die Abluftleitung aus
dem Bioreaktor ist analog zu gestalteten.
Die Submers-Belüftung kann im Prinzip in glei-
cher Weise erfolgen, sie kann aber auch vorteil-
haft mit der Overlay-Belüftung kombiniert werden
(. Abb. 7.19). Zusätzlich zu . Abb. 7.18 enthält das
Belüftungssystem vor dem Behältereinlass eine Ver-
zweigung für die Versorgung von Gasraum und
Submers-Leitung. Die Regulierung des Gasstroms
erfolgt durch ein Drosselventil. Die mit Block 1 und
Block 2 gekennzeichneten Ventilgruppen können
durch totraumarme Ventilblöcke z. B. von Memb-
ranventilen (siehe [7]) realisiert werden. Die fest-
verrohrten Leitungen und Ventilanschlüsse sollten
orbital geschweißt und entleerbar angeordnet
. Abb. 7.19  Beispiel eines
Fließbilds für die Kombination von
Overlay- und Submers-Belüftung
eines Bioreaktors
werden. Integriert in das CIP-System kann der Ste-
rilteil der Leitung über Ventil D1 bei geschlossenem
Ventil A2 jeweils vor der Reinigung des Reaktors
gereinigt werden, wobei der Ablauf in den Reaktor
erfolgt. Der Kondensatablauf kann ebenfalls in die
Reinigung einbezogen werden.
Als sterilisierbare Ventile und Ventilkombina-
tionen sind hermetisch dichtende klassische Mem-
branventile nach . Abb. 7.20 geeignet, deren medien-
berührte Gehäuse in Edelstahl oder Kunststoff
verfügbar sind. Vorteilhaft ist, dass die Anschluss-
stutzen in einer Linie liegen. Nachteilig ist die Dop-
pelfunktion der Membran einerseits als statische
Abdichtung zum Gehäuse andererseits als Schließ-
mechanismus. Für die Membran werden Elastomere
oder Kombinationen aus PTFE und Elastomer ein-
gesetzt. In den meisten Fällen werden Gehäuse- und
Gegenflansch quadratisch mit vier Schrauben ausge-
führt. Wenn ein Anschlag fehlt, kann die Membran
durch unterschiedliches Anziehen der Schrauben
unterschiedlich gepresst werden. Um trotzdem eine
gute Dichtwirkung an der statischen Dichtstelle zu
erreichen, ist entweder auf Seiten des Gehäuseflan-
sches oder der Membran ein Wulst als „Dichtlippe“
vorhanden. Beim Öffnen und Schließen des Ventils
kann an der Einspannstelle der Membran ein Spalt
entstehen, der ein Risiko darstellt und regelmä-
ßig kontrolliert werden sollte. Konstruktionen mit
rund ausgeführter Einspannstelle minimieren das
Problem. Bei horizontalem Einbau muss das Ventil
Kapitel 7 · Sterilisation und Sterildesign
. Abb. 7.20  Prinzipdarstellung des medienberührten Bereichs eines Membranventils
geneigt werden, um ein völliges Entleeren des Ventils
in eine Richtung zu gewährleisten. Ventilkombina-
tionen wie die kreuzungsartige Anordnung der
Ventile in . Abb. 7.19 sind für Membranventile auch
als Ventilblock mit nur einem massiven Gehäuse ver-
fügbar. Vorteilhaft sind der geringe Totraum sowie
die platzsparende Anordnung, allerdings ist beim
Sterilisieren bzgl. des Aufheizverhaltens die größere
Masse des Ventilblocks zu beachten.
Ebenso sind Faltenbalgventile für den sterilen
Einsatz in Zuluftleitungen geeignet (. Abb. 7.21a).
Als sogenannte Sitzventile dichten sie zwischen Ven-
tilteller und Gehäuse ab, wie bereits für die Probe-
nahmeventile erläutert (. Abb. 7.17). Faltenbalgven-
tile sind meist mit senkrecht zueinander liegenden
Anschlussstutzen ausgeführt und mit Kunststoff-
balg z. B. mit integrierter Ummantelung des Ventil-
tellers oder mit Edelstahlbalg und getrennter Teller-
dichtung erhältlich. Die Bewegung der Ventilstange
wird durch den Faltenbalg hermetisch abgedichtet,
der im Ventilgehäuse und am Ventilkörper statisch
befestigt ist. Beim Öffnen und Schließen verändern
die Falten ihren Abstand, Zu enge Falten in Reini-
gungsposition können die Reinigbarkeit verschlech-
tern. In . Abb. 7.21a ist als Beispiel ein sterilisierba-
res Faltenbalgventil für den Anschluss an Behälter
dargestellt, und . Abb. 7.21b zeigt ein sterilisierbares
Eckventil mit einer hermetischen Abdichtung durch
eine elastische Membran und eine Elastomerdich-
tung zwischen Ventilteller und -gehäuse.
Kugelventile sind für Sterilanwendungen zu ver-
meiden. Sie verbinden beim Absperren den Innen-
raum des Gehäuses mit der Medienleitung, sodass
255 7
Medium dort zurückbleibt. Außerdem sind relativ
große nicht reinig- und sterilisierbare Dichtstellen
zwischen Kugel und Gehäuse vorhanden, auch wenn
der Gehäuseinnenraum bei einigen Konstruktionen
in die Reinigung einbezogen werden kann.
7.9.5 Abdichtung von Rührerwellen
Rührerwellen können vom Deckel oder vom
Boden her montiert sein, sodass die Dichtstelle
entweder im Spritzbereich oder im Produkt liegt.
In beiden Fällen stellt die Abdichtung der Dreh-
bewegung den Problembereich dar. Einfach wir-
kende dynamische Dichtungen sind gegenüber
Mikroorganismen nicht dicht. Allerdings ist bei der
Abdichtung rotierender Bauteile das Kontamina-
tionsrisiko durch Transport geringer eingeschätzt
als bei hin- und hergehend bewegten Konstruktio-
nen wie z. B. Ventilen. Außerdem steht der abzu-
dichtende, hygienisch sensible Bereich im Allge-
meinen unter Überdruck, sodass ein Druckgefälle
von der „reinen“ zur „unreinen“ Seite vorhanden
ist, wodurch das Kontaminationsrisiko vermindert
aber nicht ausgeschlossen ist.
Übliche dynamische Dichtungen wie z. B.
Wellendichtringe aus Kunststoff oder Stopfbuch-
sen sind wegen zu starkem Verschleiß und damit
zunehmender Leckage für Sterilanwendungen von
Rührern nicht geeignet. Ebenso bergen einfach wir-
kende Gleitringdichtungen ein Kontaminationsri-
siko. Eingesetzt werden Gleitringdichtungs-Paare,
die durch eine dazwischen liegende Spülkammer
 256 J. Hinrichs et al.

. Abb. 7.21  Beispiele hermetisch dichtender Sitzventile: (a) Faltenbalgventil mit Stutzen für Behälteranschluss und
7 integriertem Sterilisationsanschluss (nach Fa. GEA Tuchenhagen), (b) Membranventil mit getrennter Tellerdichtung

mit sterilem Sperrmedium geschützt werden. Eine

der Dichtungen übernimmt die Abdichtung zur
Produktseite, während die andere zur nicht steri-
len Seite abdichtet. In kritischen Fällen ist auch eine
dreifache Anordnung möglich. Das Spülmedium
muss mit dem Produkt im Reaktor kompatibel sein,
da geringste Mengen die Dichtstelle durchdringen
können. Außerdem muss die Spülkammer reinigbar
und sterilisierbar gestaltet werden.
Nach . Abb. 7.22 erfolgt die dynamische Abdich-
tung bei einer einfach wirkenden Gleitringdichtung
zwischen Gehäuse und Rührerwelle an der radialen . Abb. 7.22  Prinzipdarstellung einer Gleitringdichtung
Berührfläche eines mit der Welle umlaufenden Gleit-
rings und einem feststehenden mit dem Gehäuse
verbundenen Gegenring. Durch elastische statische ausreichende Notlaufeigenschaften besitzen, nicht zu
Dichtungen erfolgt die Abdichtung und elastische ungleichmäßigem Verschleiß und zu Riefenbildung
Lagerung der Gleitringe gegenüber den zugeordne- neigen, wodurch die Leckagerate steigt.
ten Bauteilen, wodurch zudem Temperatureinflüsse . Abb. 7.23 zeigt eine doppelte Anordnung von
kompensiert werden. Gleitringdichtungen mit sterilem flüssigem Trenn-
Die medienberührten Bauelemente müssen medium zur Abdichtung einer am Behälterdeckel
glatt und frei von Spalten sein. Ecken sind abzu- gelagerten Rührerwelle. Die Konstruktion ist als
runden und Totbereiche zu vermeiden. Offen lie- Cartridge einbaufertig gestaltet, sodass sie zusam-
gende Federn stellen ein Hygienerisiko dar, wenn men mit der Lagerung in den Behälterstutzen einge-
sie medienberührt sind, d. h. innerhalb des Reaktors setzt und angeflanscht werden kann. Die umlaufen-
oder im Spülraum zwischen den Gleitringdichtun- den Gleitringe sind auf einer Wellenbuchse befestigt.
gen liegen. Abgedichtete Schutzhülsen oder hermeti- Die Anpressung durch Federn erfolgt bei der pro-
scher Schutz durch einen Faltenbalg beseitigen dieses duktseitigen Gleitringdichtung über den im Gehäuse
Problem. Gleichzeitig ist auf eine hygienegerechte gelagerten Gegenring, auf der nach außen wirkenden
Ausführung der statischen Dichtungen zu achten. Die über den Gleitring. Hygienegerecht gestaltete stati-
Gleitwerkstoffe sollten bei geschmierten Gleitringen sche Dichtungen dichten an der produktberührten
Kapitel 7 · Sterilisation und Sterildesign
257 7

. Abb. 7.23  Beispiel einer doppelten Gleitringabdichtung mit sterilem Sperrmedium für eine Rührerwelle (Fa.
EagleBurgmann)

Seite zum Gleitring sowie zum Behälterstutzen ab. In . Abb. 7.25 ist eine gasgeschmierte sterilisier-
Auf der Produktseite tritt die sterile Leckageflüssig- bare Gleitringdichtung für den Einbau in den Deckel
keit direkt in den Kopfraum aus. Im Außenbereich eines Bioreaktors dargestellt. Mit dieser Konstruk-
liegen die Anschlüsse für das Sperrmedium sowie für tion kann eine flüssige Leckage in den Produkt-
die Leckageflüssigkeit, die an der äußeren Gleitpaa- raum an der produktseitigen Gleitfläche vermieden
rung auf der Seite des Gegenrings austritt. werden. Die beiden Gleitringe werden durch ein
Wie bereits erwähnt, sollten Dichtungseinheiten Gaspolster voneinander getrennt, das durch Steril-
mit Sperrflüssigkeit nicht nur sterilisiert, sondern luft oder –gas erzeugt wird. Durch speziell geformte
zumindest nach festgelegten Zeitintervallen auch
gereinigt werden. Für die Versorgung von Gleit-
ringdichtungen mit sterilem Sperrmedium werden
häufig Sperrdrucksysteme mit Schwerkraftumlauf,
sog. Thermosiphon-Systeme, eingesetzt. Gemäß
. Abb. 7.24 wird Dampfkondensat als Sperrdruck-
medium verwendet, das aus einem mit Luft beauf-
schlagten Behälter über den Vorlauf der Gleitring-
dichtung zugeführt wird und über den Rücklauf in
den Behälter zurückfließt.
Die Anordnung in . Abb. 7.24 erlaubt zudem
Gleitringdichtungen für erhöhte Bioreaktordrücke
mit Stützgas zu betreiben. Die Ventilgruppen A1, A2,
C1 und E1, E2, C2 können jeweils in Blockform rea-
lisiert werden. Ventil D ist als Druckregelventil in
Kombination mit einem Absperrventil auszuführen.
Insgesamt ergeben sich für die Sterilisation bis zu vier . Abb. 7.24  Prinzipdarstellung der
Bereiche, die je nach Anordnung zusammen oder Versorgungseinrichtung einer Gleitringdichtung mit sterilem
einzeln sterilisiert werden können. Sperrmedium durch Schwerkraft-Umlauf
 258 J. Hinrichs et al.
. Abb. 7.25  Konstruktive
Ausführung einer gasgeschmierten
sterilen Gleitringdichtung zur
Abdichtung einer Rührerwelle (Fa.
EagleBurgmann)
Gleitflächen wird es bereits bei geringen Drehzah-
7 len wirksam und sorgt für eine hohe Gasfilmsteifig-
keit sowie Betriebssicherheit bei minimaler Gasle-
ckage. Da sich die Gleitringe nicht berühren, gibt es
keinen Verschleiß und Abrieb. Damit ist eine Verun-
reinigung des Bioreaktormediums ausgeschlossen.
Die Befestigung und Abdichtung der beiden Gleit-
ringe erfolgt im dargestellten Beispiel auf der Wellen-
buchse. Die produktseitigen statischen Dichtungen
am Gleitring sowie am Stutzenende sind hygienege-
recht gestaltet. Die Dichtung ist CIP- und SIP-fähig
und kann in allen steriltechnischen Prozessen ein-
gesetzt werden. Zu beachten ist, dass die Bohrung
für Kondensataustritt direkt in den Kopfraum des
Reaktors führt.
Rührerwellen können auch hermetisch abge-
dichtet werden. Der Antrieb erfolgt in diesem Fall
magnetisch durch einen sogenannten Spalttopf
hindurch über eine Permanentmagnetkupplung
zur getrennten Rührerwelle. Da die Kupplungen
verschleißfrei arbeiten, ist eine hohe Lebensdauer
sichergestellt. Die übertragbare Rührerleistung ist
allerdings begrenzt. Unter hygienischen Aspekten
ist die Lagerung des angetriebenen Rührelements
zu lösen, die zwangsläufig im Bioreaktor liegt. Ein-
gesetzt werden sowohl Gleit- als auch Wälzlager
aus Keramik. Bei Gleitlagern für den Antrieb vom
Boden aus werden die Gleitflächen an der axialen
Lagerstelle mit Radialnuten und an der radialen
mit axialen Nuten versehen. Unterstützt durch die
Drehbewegung wird das Fermentations- bzw. Reini-
gungsmedium durch den Lagerpalt sowie die Nuten
transportiert. Bei schnelllaufenden Wellen reicht
im Allgemeinen der hydrodynamische Durchströ-
mungseffekt aus, ohne dass Nuten benötigt werden.
Keramische Wälzlager zeichnen sich durch eine hohe
Temperaturbeständigkeit aus und sind für nahezu
alle Medien geeignet. Sie sind jedoch sehr stoß- und
schlagempfindlich. Sie werden vom Produkt durch-
strömt und geschmiert. Wie bei Gleitlagern können
sie CIP gereinigt werden.
Öl- bzw. fettgeschmierte Lagerungen sind kri-
tisch zu betrachten, da sie den Vorteil der hermeti-
schen Trennung durch eine problematische Dicht-
stelle zu Nichte machen. In diesem Fall muss eine
sichere doppelte Abdichtung mit Sperrmedium ver-
wendet werden, deren produktseitige Abdichtung
hygienegerecht zu gestalten ist. Allerdings können
in diesem Fall hohe Axial- und Radialkräfte durch
handelsübliche Stahl-Wälzlager aufgenommen
werden.
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 261 8

Bioprozessanalytik und
-steuerung
Bernd Hitzmann und Thomas Scheper

8.1 Charakteristische Parameter für das

Bioprozessmonitoring – 263
8.1.1 Prozessgrößen – 263
8.1.2 Sensoren – 263
8.1.3 Analysenfrequenz – 265

8.2 Messtechnik – 265

8.2.1 Messung der Zustandsgrößen in der Gasphase – 265
8.2.2 Messung der Zustandsgrößen in der Flüssigphase – 267
8.2.3 pH-Messung – 269
8.2.4 Biomassebestimmung – 272
8.2.5 Bildgebende Verfahren – 273
8.2.6 Spektroskopische Sensoren – 274
8.2.7 Fluoreszenzspektroskopie – 275
8.2.8 Infrarotspektroskopie – 276
8.2.9 Optische Chemosensoren – 277
8.2.10 Biosensoren – 279
8.2.11 Single-use-Sensoren – 281
8.2.12 Fließinjektionsanalyse – 282
8.2.13 Probenahmesysteme – 283

8.3 Softwaresensoren – 284

8.3.1 Kalman-Filter – 284
8.3.2 Hauptkomponentenanalyse – 287

8.4 Automatisierung – 290

8.4.1 Regelung – 290
8.4.2 Steuerung – 291

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2018

H. Chmiel, R. Takors, D. Weuster-Botz (Hrsg.), Bioprozesstechnik,
https://doi.org/10.1007/978-3-662-54042-8_8
8.4.3 Zweipunktregler – 292
8.4.4 PID-Regler – 292
8.4.5 Digitale PID-Regler – 293
8.4.6 Einstellung von Regelparametern – 293
8.4.7 Alternative Reglerkonzepte – 296

Literatur – 297
Kapitel 8 · Bioprozessanalytik und -steuerung
8.1 Charakteristische Parameter für
das Bioprozessmonitoring
Das komplexe Mehrphasensystem in einem Biopro-
zess stellt höchste Anforderungen an die Mess- und
Regelungstechnik. Um die optimalen Bedingungen
für den gesamten Prozess aufrechtzuerhalten, muss
die Zusammensetzung der Flüssigphase (Medium),
der darin suspendierten Gasphase und der disper-
gierten Festphase (Zellen, Zellverbände) kontinuier-
lich erfasst werden. Die Interaktion dieser drei Phasen
ist komplex und verschiedenste Zeitkonstanten
machen eine Steuerung des Gesamtprozesses ohne
ausreichendes Prozesswissen schwierig. So wirkt sich
die Induktion eines Gens durch einen Temperaturs-
hift oder die Zugabe eines chemischen Induktors erst
nach mehreren Minuten durch die Expression des
gewünschten Proteins aus. Das Protein kann erst mit
einer Zeitverzögerung metabolisch aktiv sein. Auch
dieses Wissen muss für eine erfolgreiche Bioprozess-
steuerung auf der Basis einer detaillierten Prozess-
analytik eingebracht werden.
Bisher sind Bioreaktoren hauptsächlich mit Tem-
peraturfühlern, pH-Elektroden und Elektroden zur
Gelöstsauerstoffmessung ausgerüstet. Verglichen
mit den Prozesskontrollstrategien in der petroche-
mischen Industrie und der Pharmaindustrie ist der
Nachholbedarf in der Bioprozessindustrie groß.
Heute fehlen immer noch verlässliche Sensoren und
Analysemethoden für die On-line-Prozessbeobach-
tung, aber auch verlässliche quantitative und dyna-
misch korrekte Modelle.
8.1.1 Prozessgrößen
Das Dreiphasensystem eines Bioprozesses kann über
physikalische, chemische und biologische Zustands-
größen erfasst werden (. Tab. 8.1). Prinzipiell muss
darauf geachtet werden, dass selbst in ideal durch-
mischten Systemen lokale Unterschiede in den
Zustandsgrößen existieren (Beispiel: Sauerstoffpar-
tialdruck über die Höhe in einem Blasensäulenreak-
tor). Dies erfordert eigentlich eine Messung an ver-
schiedenen Reaktorpunkten.
Bei der Analyse des Zellzustands wird häufig
über integrale oder segregierte Messwerte gespro-
chen. Während der integrale Messwert über alle
263 8
Zellzustände im Prozess mittelt, kann mit anderen
Analysetechniken die Verteilung der Zelleigenschaf-
ten erfasst werden (z. B. Altersverteilung der Zellen).
Unter globalen Größen zur Beschreibung eines
Bioprozesses werden solche verstanden, mit denen
man das gesamte System nur unter exakt reprodu-
zierbaren Kultivierungsbedingungen beschreiben
kann. Die Wärmeentwicklung in einem Biopro-
zess ist ein Beispiel hierfür. Diese Größe umfasst die
metabolische Aktivität (Zelleigenschaft), die Ver-
fügbarkeit eines Substrates (Glucose in der Flüssig-
phase) und eines gasförmigen Cosubstrates (Sauer-
stoff in der Gasphase). Die Wärmeentwicklung kann
über Kalorimeter erfasst werden, sie ist jedoch nur
aussagekräftig, wenn der Prozess jeweils unter glei-
chen Bedingungen abläuft bzw. durch entsprechende
Modelle gestützt wird.
8.1.2 Sensoren
Die Begriffe Sensor, Sensorsystem und Analysensys-
tem werden häufig gleich verwendet, auch wenn dies
aus der Sicht der analytischen Chemie nicht korrekt
ist. Der Einfachheit halber wird in diesem Kapitel
der Sensor als ein Messsystem bezeichnet, das die
Erfassung einer Messgröße, die Verstärkung und die
Umwandlung in ein elektrisches Signal kombiniert.
Solche Sensoren können als in situ-Sensoren direkt
in den Prozess eingebracht werden und müssen für
biotechnologische Prozesse sterilisierbar bzw. auto-
klavierbar sein. Sie liefern kontinuierlich Messwerte
aus dem Bioreaktor, haben jedoch sensortypische
Ansprechzeiten. Gerade bei biotechnologischen
Prozessen ergeben sich erhebliche Schwierigkeiten
mit in situ-Sensoren, da sogenannte Fouling-Effekte
die Ansprechzeiten und die Sensitivitäten beeinflus-
sen oder die Sensoren nicht sterilisierbar sind (Bio-
sensoren, ionenselektive Elektroden). In diesem Fall
bietet es sich an, die Sensoren außerhalb des Reak-
tors in einen Probenstrom, der kontinuierlich dem
Reaktor entnommen wird, einzusetzen. Dies sind ex
situ-Sensoren. Die Probeentnahme aus dem Biore-
aktor erfolgt über entsprechende Filtrationsmodule
(7 Abschn. 8.2.13), die eine repräsentative Probe aus
dem Bioreaktor zum Sensor befördern. Der Pro-
bentransport führt zu einer weiteren Verzögerung
in der Analyse. Die dem ex situ-Sensor zugeführte
 264 B. Hitzmann und T. Scheper

. Tab. 8.1  Messprinzipien zur Erfassung verschiedener Messgrößen in der Bioprozesstechnik

Messgröße Messeinrichtung/Messprinzip (beispielhaft)

Physikalische Zustandsgrößen
Drehzahl Drehzahlmesser
Energieeintrag Drehmoment
Druck Membransensoren
Schaumerkennung Widerstandsmessung
Temperatur Thermometer, Thermoelement, Thermistor
Fluidzufuhr Tropfenzähler, Waage, Massflowmeter
Strömungsgeschwindigkeit des Fluids Wärmepulsmethode
Viskoseanteil des Fluids Viskometer
Leitfähigkeit elektrochemische Sensoren
Gaszufuhr Massflowmeter

8 Strömungsgeschwindigkeit des Fluids

Chemische Zustandsgrößen
Ultraschall-Doppler-Verfahren

pH pH-Glaselektrode
pO2 Clark-Elektrode, Chemosensor
pCO2 pH-Glaselektrode nach Severinghaus
volatile Substanzen Massenspektrometer
gelöste Komponenten via Biosensoren, HPLC, GC/MS-Kopplung (at-line)
via spektroskopischer Sensoren (in-line)
Biomassekonzentration optische Sensoren, Filtrationssonde, Impedanz
Redoxpotenzial elektrochemische Sensoren
Biologische Größen
Zellzustand Fluoreszenzsensoren, Impedanzmessung NMR, (in-line)Zellaufschluss,
HPLC (at-line)
in-situ-Mikroskopie
Zellmorphologie, Vitalität Durchflusszytometer, Mikroskopie (at-line)

Probe muss genau der Zusammensetzung des Bio-
prozesses entsprechen. Hier ergeben sich die übli-
chen Probleme wie bei Membrantrennverfahren
(z. B. bei hochmolekularen Substanzen) und der Ver-
stoffwechselung einzelner Komponenten während
der Zuführung zum Sensor. Der Vorteil der ex situ-
Analyse liegt darin, dass der Sensor jederzeit kalib-
riert oder ausgetauscht werden kann, ohne den Bio-
prozess zu stören (Kontaminationsrisiko).
Werden die Sensoren kontinuierlich an einem Bio-
prozess eingesetzt, spricht man von on-line-Analytik;
werden bei der ex situ-Analyse Fließinjektionsanaly-
sesysteme (7 Abschn. 8.2.13) oder komplexe Analy-
sensysteme wie HPLC, GC/MS und die Durchflusszy-
tometrie eingesetzt, spricht man von at-line-Analyse
(. Abb. 8.1). Die Messdaten fallen hier nicht konti-
nuierlich, sondern in bestimmten analysebedingten
Zeitabschnitten an. Die Zahl der in situ-Sensoren für
die Bioprozesstechnik ist gering und konzentriert sich
hauptsächlich auf die Messgrößen Temperatur, pH
und pO2. Im ex situ-Verfahren können prinzipiell
alle Sensoren oder hoch komplexe Analysensysteme
Kapitel 8 · Bioprozessanalytik und -steuerung
. Abb. 8.1  Mögliche
Sensorankopplungen an Bioreaktoren
verwendet werden. Hier stellt die adäquate Probe-
nahme den „Flaschenhals“ dar. Um die Gefahr von
Kontaminationen durch die Bioprozessanalytik zu
beschreiben, wird häufig auch der Begriff nicht-in-
vasiver Sensor bzw. invasiver Sensor verwendet. Bei
einem nicht-invasiven Sensor ist es nicht nötig, eine
Probe aus dem Bioprozess zu entnehmen oder im
Prozess zu analysieren, die Gefahr einer Kontami-
nation wird ausgeschlossen. Bei invasiven Sensoren
wird dem Bioprozess ein Aliquot entnommen und im
Sensor (oder im ex situ-System) analysiert.
8.1.3 Analysenfrequenz
Für in situ-Sensoren, die kontinuierlich Messwerte
liefern, ist die Ansprechzeit des Sensors wichtig,
um auf den Ist-Zustand des Reaktors rückschließen
zu können. Problematisch sind Änderungen des
Ansprechverhaltens durch Fouling-Prozesse, denn
die Ansprechzeit ändert sich dann während des Pro-
zesses unkontrolliert. Dieses Problem ist besonders
kritisch, da eine Kalibrierung von in situ-Sensoren
nach dem Sterilisationsprozess nicht mehr möglich
ist. Die Anforderungen an in situ-Sensoren für die
Bioprozesstechnik sind deshalb groß.
Die ex situ-Sensoren können mit den durch die
Probenahme bedingten Verzögerungen kontinuier-
lich oder in bestimmten Intervallen Analysendaten
liefern. Häufig werden, wie beispielsweise bei der
Verwendung von HPLC-Systemen, die Messdaten
mit großen Zeitabständen bereitgestellt. Handelt
es sich um Bioprozesse mit einer hohen Dynamik
(Aufarbeitungsprozesse, Kultivierung von Organis-
men mit hohen Wachstumsraten), so ergeben sich
Probleme, die nur durch die Verwendung geeigneter
265 8
Modelle überwunden werden können. Bei Prozessen
mit niedrigen Wachstumsraten (Kultivierung tieri-
scher Zellen) ergeben sich keine Probleme, wenn die
Messwerte auch mit einer Zeitverzögerung von ein bis
zwei Stunden für die Prozesskontrolle zur Verfügung
stehen. Generell sollten Sensoren verwendet werden,
deren Ansprechverhalten bekannt, kurz und konstant
ist. Gerade optische und spektroskopische Sensoren
bieten den Vorteil, Messwerte instantan zu liefern.
8.2 Messtechnik
Für die Erfassung von Zustandsgrößen, die auch für
die Beobachtung chemischer Prozesse wichtig sind
(speziell die Erfassung physikalischer Zustandsgrö-
ßen) wie Drehzahl, Viskosität, Druck und Tempe-
ratur, sei auf die allgemeine Messtechnik-Literatur
verwiesen. In diesem Kapitel werden speziell nur die
für die Bioprozesstechnik relevanten Messtechniken
kurz beschrieben.
8.2.1 Messung der Zustandsgrößen in
der Gasphase
Für aerobe Prozesse ist die schnelle und sichere Erfas-
sung der Gasphasenzusammensetzung wichtig. Die
Messung des Sauerstoff- und Kohlendioxidgehalts in
der Gasphase liefern wichtige Informationen über die
Zellaktivität. Bei anaeroben Prozessen (z. B. Biogas-
bildung) ist die Analyse der komplexen Gasphase,
beispielsweise mithilfe von Massenspektrometern
(CH4, H2 etc.) nötig. Prinzipiell lassen sich die Gaszu-
sammensetzungen im Abgasstrom mithilfe von Mas-
senspektrometern sehr detailliert erfassen. Gerade
 266 B. Hitzmann und T. Scheper
die Entwicklung kleiner kostengünstiger Massen-
spektrometer wird hier in der Zukunft eine wichtige
Rolle spielen.
Sauerstoffmessung in der Gasphase
Da Sauerstoff das einzige für die Biotechnologie rele-
vante paramagnetische Gas ist, kann diese Eigen-
schaft für die spezifische Erfassung von Sauerstoff in
der Gasphase genutzt werden. Der Paramagnetismus
des Sauerstoffs ist auf die ungepaarten Elektronen
in der äußeren Elektronenschale zurückzuführen.
Die Suszeptibilität ist ein Maß für den Paramagne-
tismus. Sie ist proportional zu der Kraft, mit der die
Gasmoleküle in einem magnetischen Feld angezo-
gen werden, und nimmt mit zunehmender Tempe-
ratur stark ab. Es existieren verschiedene Geräte zur
8 Konzentrationsbestimmung über den paramagne-
tischen Effekt.
Die Ringkammeranordnung ist in . Abb. 8.2
gezeigt. Das Messgas fließt durch einen Hohlring,
in dessen Mittelverbindung ein Dauermagnet ein-
gebracht ist. Der Sauerstoff im Abgas wird infolge
des Paramagnetismus zum Ort der größten Kraft-
flussdichte fließen. Ein Heizdraht, der im Bereich der
größten Kraftflussdichte angebracht ist, heizt das Gas
auf, der Paramagnetismus nimmt stark ab, und das
erwärmte Gas wird von nachströmendem kälterem
Gas verdrängt. Dadurch entsteht eine Strömung in
der inneren Verbindung des Hohlrings. Sie führt zu
einer Abkühlung, die proportional zum Sauerstoff-
gehalt ist. Der Strom, der benötigt wird, um den
Draht aufzuheizen, wird als Messsignal genutzt. Der
. Abb. 8.2  Prinzip der paramagnetischen
Sauerstoffmessung
entstehende Gasstrom wird als magnetischer „Wind“
bezeichnet. Es gibt verschiedenste Messanordnun-
gen, um den Sauerstoffgehalt über das Prinzip der
magnetischen Waage zu erfassen.
Eine Miniaturisierung dieser Geräte ist schwie-
rig, und zukünftig werden sicherlich eher Massen-
spektrometer verbreitet einen Einsatz zur Gasana-
lyse finden. Darüber hinaus haben auch Sensoren, die
den Zirkondioxidsensoren (Prinzip λ-Sonden) ent-
sprechen an Bedeutung gewonnen oder optische Sen-
soren (7 Abschn. 8.2.2.1). Im Allgemeinen wird das
Abgas der Bioreaktoren vor der Messung getrocknet,
um Störungen durch den Wasserdampfpartialdruck
und mögliche Kondensatbildung zu vermeiden.
Kohlendioxidmessung in der Gasphase
Da zur genauen Bestimmung der Stoffwechselakti-
vität in aeroben Bioprozessen auch der Kohlendi-
oxidgehalt in der Gasphase bekannt sein muss, soll
auch die Kohlendioxidmessung in der Abluft kurz
beschrieben werden. Kohlendioxid ist ein Infra-
rot aktives Gas, das Licht im Wellenlängenbereich
von 3 bis 4 µm absorbiert. Die Absorption ist pro-
portional zur Kohlendioxidkonzentration. Es exis-
tieren unterschiedliche Infrarot-Analysatoren. Das
Messgas wird zur Messung durch eine Messküvette
geführt. Die Geräte sind im Allgemeinen thermo-
statisiert und mit einer Kompensation für schwan-
kenden Luftdruck ausgerüstet. Das Abgas wird im
Vergleich zu einer Referenzmesskammer vermes-
sen, die Länge der Messküvette kann auf den Emp-
findlichkeitsbereich angepasst werden. Dies kann
mechanisch oder durch verschiedene Reflexionen
geschehen. Auch hier werden getrocknete Abgase
analysiert, um Fehler durch die Infrarot-Absorp-
tion des Wasserdampfs zu vermeiden. Die Analyse
wird generell von allen infrarot-aktiven Komponen-
ten (z. B. Methan) beeinträchtigt.
Grundsätzlich können mithilfe der Massenspek-
trometrie über geeignete Probenahmesysteme alle
gasförmigen oder volatilen Substanzen bestimmt
werden. Über die Partialdruckzusammenhänge
lassen sich damit auch die Konzentrationen in den
flüssigen Medien prinzipiell erfassen. Verschiedene
massenspektrometrische Systeme und Kombinatio-
nen (z. B. MS/MS, GC/MS etc.) können hierfür ver-
wendet werden.
Kapitel 8 · Bioprozessanalytik und -steuerung
267 8
8.2.2 Messung der Zustandsgrößen in zeigt. Bei einer amperometrischen Messung ist der
der Flüssigphase Stromfluss allein von der Konzentration (bzw. Akti-
vität) der zu bestimmenden Substanz abhängig, wenn
die Polarisationsspannung konstant ist und die Reak-
Gelöstsauerstoffgehalt tion diffusionskontrolliert ist. Dies gilt auch für den
Die Erfassung des Gelöstsauerstoffgehalts ist in gelösten Sauerstoff, der an der Kathode reduziert wird:
der Biotechnologie aerober Prozesse besonders
wichtig. Die Sauerstofflöslichkeit hängt stark von der O2 + 2 H2O + 4 e− → 4 OH−
Medienzusammensetzung und der Temperatur ab
(. Tab. 8.2). Da der Sauerstoffübergang aus der Gas- An der Gegenelektrode läuft im Allgemeinen die fol-
in die Flüssigphase einer der kritischen Transport- gende Reaktion ab:
schritte in biotechnologischen Prozessen ist, muss
für die Auslegung und Regelung dieser Prozesse Ag + Cl− → AgCl + e−
der Gelöstsauerstoffgehalt genau erfasst werden.
Unterschiedliche Verfahren stehen zur Verfügung, Die Gegenelektrode dient als Referenz. Die Pola-
wobei die Clark-Elektrode am weitesten verbrei- risationsspannung wird so gewählt, dass die Reak-
tet ist. Es gibt verschiedene Bauprinzipien, sodass tion an der Arbeitselektrode diffusionskontrolliert
nur das Messprinzip kurz erläutert werden soll. abläuft. Zu niedrige Spannungen führen dazu, dass
Gemessen wird im Allgemeinen der Sauerstoffpar- keine Diffusionskontrolle gewährleistet ist oder
tialdruck (pO2). Dieser korreliert mit der Löslich- die Umsetzung der Reaktanten nicht vollständig
keit des Sauerstoffs in den Medien. Die Löslichkeit ist. Bei zu hohen Polarisationsspannungen können
selbst ist stark von der Temperatur und der Medien- unerwünschte Nebenreaktionen den Stromfluss ver-
zusammensetzung abhängig. Somit werden auch stärken. Wie aus . Abb. 8.4 hervorgeht, generieren
der Sauerstoffgehalt und seine Bestimmung von der unterschiedliche Sauerstoffgehalte unterschiedli-
Temperatur und der Medienzusammensetzung stark che Stromflüsse. Aus dem Stromfluss in einer unbe-
beeinflusst. kannten Lösung kann somit auf den Sauerstoffgehalt
Der prinzipielle Aufbau einer Clark-Elektrode ist in zurückgeschlossen werden.
. Abb. 8.3a zu sehen, während . Abb. 8.3b den Aufbau Die galvanische Messung des Sauerstoffgehalts ist
einer kommerziell erhältlichen Sauerstoffelektrode in der Biotechnologie weniger verbreitet und soll hier
nicht näher beschrieben werden. Bei beiden Messun-
gen ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt die
. Tab. 8.2  Sauerstofflöslichkeit in Abhängigkeit der
Diffusion des Sauerstoffs zur Elektrodenoberfläche.
Temperatur und der Ionenstärke
Er ist proportional zur Sauerstoffkonzentration. Die
T [°C] O2 [mmol/L] Ionenstärke O2 Dicke der diffusionskontrollierenden Schicht zwi-
[M] [mmol/L] schen Elektrodenoberfläche und Kernströmung des
Mediums ist dabei wichtig. Wird diese durch Ände-
0 2,18 0,0 1,26
rung der Anströmgeschwindigkeit oder der Viskosi-
10 1,70 0,5 HCl 1,21 tät des Mediums beeinflusst, ändert sich das Messsig-
15 1,54 0,5 H2SO4 1,21 nal. Die Sauerstoffmessung wäre damit beispielsweise
20 1,38 0,5 NaCl 1,07 extrem anfällig bezüglich der Rührergeschwindigkeit
im Bioreaktor. Aus diesem Grund werden selektive,
25 1,26 1,0 HCl 1,16
gaspermeable Membranen vor die Kathode gesetzt,
30 1,16 1,0 H2SO4 1,12
um die Diffusionsstrecken konstant zu halten. Bei
35 1,09 1,0 NaCl 0,89 einer pO2-Elektrode ist der Elektrolytraum an der
40 1,03 2,0 HCl 1,12 Anode und Kathode somit von dem Kultivierungs-
2,0 H2SO4 1,02 medium getrennt. Der Sauerstoff permeiert durch
2,0 NaCl 0,71 die Membran in den Elektrolytraum und wird an
der Kathode (meist Platin), die im Allgemeinen
 268 B. Hitzmann und T. Scheper
. Abb. 8.3  Aufbau einer amperometrischen Sauerstoffelektrode. (a) Prinzip der Clark-Elektrode; (b) typische kommerziell
erhältliche Sauerstoffelektrode (rechts)
ein Potenzial von ca. −700 mV gegenüber der Sil-
beranode hat, reduziert. Teflonmembranen dienen
häufig als Sauerstoffdiffusionsmembranen. Da der
Sauerstoff aus der flüssigen Phase gasförmig durch
die Membran permeiert, wird mit dieser Anordnung
der Sauerstoffpartialdruck gemessen.
Gelöstkohlendioxidmessungen
Auf der Basis einer pH-Elektrode kann auch der
pCO2 nach dem Severinghaus-Prinzip in Medien
erfasst werden. Dazu wird der pH-Sensor in einen
Carbonatpuffer getaucht, der vom Medium durch
eine CO 2 -permeable Membran (z. B. Silikon)
getrennt ist (Prinzip, . Abb. 8.5 ). Der pH-Sen-
sor misst im Innenraum des Sensors den pH des
Carbonatpuffers, der über die Silikonmembran mit
dem CO 2-Gehalt im Medium im Gleichgewicht
steht. Erhöht sich die Kohlendioxidkonzentration im
Medium, diffundiert CO2 durch die Membran und
das innere Hydrogencarbonatgleichgewicht wird
entsprechend geändert. Der Sensor erfasst also den
Partialdruck des Kohlendioxids (pCO2). Die Hen-
derson-Hasselbach-Gleichung beschreibt die Ände-
rung des Puffer-pH-Wertes. Die Ansprechzeit dieser
Sensoren ist relativ langsam, da die Gleichgewichts-
einstellung der Carbonatpuffer sehr träge ist. Außer-
dem muss der innere Carbonatpuffer an die äußeren
Bedingungen angepasst werden, d. h. er muss ent-
weder für niedrige oder hohe CO2-Konzentrationen
ausgelegt sein. Eine Kalibration kann durch die Injek-
tion entsprechender Carbonatpuffer erfolgen. Alle
Kapitel 8 · Bioprozessanalytik und -steuerung
. Abb. 8.4  Zusammenhang zwischen Stromstärke und Sauerstoffgehalt der amperometrischen Sauerstoffmessung
. Abb. 8.5  Aufbau einer Gelöstkohlendioxidelektrode
nach dem Severinghaus-Prinzip
„sauren“ gasförmigen Substanzen, die durch die
Membran diffundieren können (H2S, Essigsäure),
stören die Messung.
8.2.3 pH-Messung
Eine andere wichtige Messgröße in der Biotechno-
logie ist der pH. Über pH-Elektroden und die pH-
Messungen gibt es ausreichend detaillierte Literatur,
269 8
sodass hier nur kurz das Prinzip erklärt wird. Für die
Messung des pH werden meist sogenannte pH-Ein-
stabmessketten verwendet (. Abb. 8.6b). In ihnen ist
die pH-Elektrode mit einer Referenzelektrode kom-
biniert. Der Temperatureffekt wird kompensiert. In
der pH-Elektrode selbst werden der Bezugselektro-
lyt und die Ableitelektroden durch eine Glasmemb-
ran von der Probelösung getrennt (. Abb. 8.6a). Das
Potenzial der Ableitelektrode muss gegen eine in die
Probelösung eintauchende Bezugselektrode gemes-
sen werden.
In der pH-Elektrode selbst misst die Ableitelek-
trode die an der Glasmembran entstehende elektri-
sche Spannung, die vom pH in der Lösung abhängt.
Diese elektrische Spannung entspricht bei optimier-
ten pH-Gläsern über einen großen pH-Bereich dem
Nernst-Gesetz. Die an der Ableitelektrode gemes-
sene Spannung wird dann gegen die Referenzelekt-
rode (meistens eine Ag/AgCl-Elektrode) gemessen.
In der Einstabmesskette ist die Referenzelektrode
über ein Diaphragma mit der Messlösung verbun-
den. Bei diesen Flüssigelektroden muss darauf geach-
tet werden, dass nicht durch Überdrücke im Reaktor
Flüssigkeit durch das Diaphragma gepresst wird und
der Elektrolyt in der Referenzelektrode „überläuft“.
Hierzu wurden für die Biotechnologie spezielle Elek-
troden entwickelt, die während der Sterilisation mit
Druck beaufschlagt werden. Bei den heute ver-
wendeten Gel- oder Polymerelektroden tritt dieses
Problem nicht auf.
 270 B. Hitzmann und T. Scheper
. Abb. 8.6  Prinzip von pH-Elektroden.
(a) pH-Elektrode ohne Referenzelektrode
(links); (b) pH-Elektrode in Kombination
mit Referenzelektrode
Neben den Glaselektroden werden auch andere
Systeme zur pH-Messung verwendet, die bisher
jedoch noch keinen breiten Einzug in die Biopro-
zessüberwachung gefunden haben. Aussichtsreich
sind die sogenannten pH-sensitiven Feldeffekt-
transistoren. Bei konventionellen Feldeffekttransis-
toren (FETs) wird durch das Anlegen einer Gate-
spannung ein leitender Kanal zwischen Quelle und
Senke erzeugt (. Abb. 8.7). Die Spannung steuert
also den elektrischen Strom in einem entsprechen-
den Ausgangsstromkreis. Anstelle eines metalli-
schen Gates wird bei pH-sensitiven FETs (als Spe-
zialfall eines ionenselektiven FETs, ISFET) ein Gate
aus bestimmten Metallnitriden und -oxiden (SeO2,
Al2O3, Si3N4, Ta2O5) verwendet. Dieses Gate ändert
in Abhängigkeit vom pH sein elektrisches Potenzial
an der Grenzfläche Gateoxid/Flüssigkeit. Ähnlich
wie bei einer pH-Elektrode wird so ein Potenzial-
bezug zum pH in der Messlösung hergestellt. Eine
Referenzelektrode ist nötig. Das vom pH einge-
stellte Potenzial steuert den elektrischen Stromfluss
(. Abb. 8.8). Der Vorteil dieser Systeme ist die Mini-
aturisierbarkeit und die Unterbringung von vielen
pH-sensitiven Messflächen auf kleinstem Raum.
Probleme liefern die Referenzelektroden, die im
Vergleich zum pH-FET groß oder nicht langzeitsta-
bil sind. Hier wird es sicherlich in der nächsten Zeit
weitere Entwicklungen geben.
Verschiedene andere Sensoren, die in der Bio-
technologie verwendet werden, sind Leitfähigkeits-
sensoren (Änderung der Osmolarität des Mediums,
Auflösung von Festmedien) und Redoxelektroden.
Hier sei auf die relevante Literatur verwiesen. Spe-
ziell bei den Redoxelektroden ist die Interpretation
der Signale äußerst schwierig, da alle redoxaktiven
Substanzen je nach Sensorbetrieb detektiert werden
und bisher kaum verlässliche Anwendungen bekannt
sind.
Kapitel 8 · Bioprozessanalytik und -steuerung
271 8

. Abb. 8.7  Prinzip eines Feldeffekttransistors (FET), UGS: Spannung zwischen Gate und Source, UDS: Spannung zwischen
Drain und Source, UBS: Spannung zwischen Substrat und Source, I: Stromstärke, n+: starke n-Dotierung

. Abb. 8.8  Prinzip eines pH-FETs. (a) MOSFET, Metall-Oxid-Halbleiter-FET; (b) ISFET, ionensensitiver FET, in Anwendung zur
pH-Messung; (c) Schaltplan eines pH-FETs; Vgate: Spannung am Gate, n+: starke n-Dotierung, p-Si: p-dotiertes Silicium, G: Gate, D:
Drain, S: Source, Vgs: Spannung zwischen Gate und Source, Vds: Spannung zwischen Drain und Source, Id: Drainstromstärke
 272 B. Hitzmann und T. Scheper
8.2.4 Biomassebestimmung
Die Biomassekonzentrationsbestimmung ist für alle
Bioprozesse wichtig, um die für den Bioprozess aktive
Zellmasse zu beschreiben. Wünschenswert wäre es,
in der gesamten Biomasse die Verteilung der Zellak-
tivität über die Zellen zu kennen oder mindestens die
Anzahl der lebenden und toten Zellen genau unter-
scheiden zu können. Zwei Arten der Biomassebestim-
mung existieren: die Messung der Zellzahl (Zellen/
Volumen, speziell in der Tierzellkultivierung) und die
Biotrockenmassekonzentration (Masse/Volumen).
Im Allgemeinen werden mikroskopische Techniken
verwendet, um die Zellzahl zu erfassen. Bei den klas-
sischen Verfahren wird die Zählung in einer Thoma
Kammer oder durch Ausplattieren durchgeführt. Bei
den manuellen Verfahren ist sehr viel Übung nötig,
8 um verlässliche Daten zu gewinnen. Es existieren
automatische Analysegeräte, die sowohl das Zählen
als auch das Ausplattieren durchführen.
Das Coulter-Counter System ist eines der auto-
matischen Zählgeräte, das nicht auf einem mikrosko-
pischen Verfahren beruht. Es wird im off-line-Betrieb
verwendet, d. h. Aliquote aus dem Fermentations-
medium werden damit analysiert. Das Messprinzip
(. Abb. 8.9) beruht auf einer Impedanzmessung zwi-
schen zwei Elektroden, wobei die Elektroden durch
eine Messzelle mit einer definierten Durchlassöff-
nung getrennt sind. Der Durchmesser der Mess-
blende muss auf die Zellgröße abgestimmt sein.
Während die Zellen durch einen Unterdruck in die
innere Messkammer gesaugt werden, kommt es beim
Durchtritt der Organismen zu einer kurzfristigen
Impedanzänderung. Ist der Volumenfluss durch die
. Abb. 8.9  Prinzip eines Coulter-Counters
Öffnung bekannt, entspricht jede Impedanzände-
rung einer Zelle. Mit dem Coulter-Counter können
bis zu 5000 Zellen pro Sekunde gemessen werden.
Mit entsprechenden Messblenden können auch Bak-
terien (1‒2 µm Durchmesser) erfasst werden. Für tie-
rische Zellen werden Messblenden mit größeren Öff-
nungen verwendet.
Die Durchflusszytometrie stellt ein weiteres Ver-
fahren zur Biomassebestimmung dar (. Abb. 8.10),
mit dem Zellpopulationen vermessen werden
können. Messungen bis zu 10.000 Ereignissen pro
Sekunde sind möglich. Bei einem Durchflusszyto-
meter wird eine Zellsuspension durch einen Unter-
druck in einen laminaren Mantelstrom gesaugt, der
die Zellsuspension umhüllt. Die laminare Strömung
führt dazu, dass die Zellen vereinzelt in den Mantel-
strom fließen und die Zellen, wie an einer Perlen-
kette aufgereiht, im Strom fließen. Dieser gerichtete
Zellstrom passiert einen Laser im rechten Winkel.
Jede Zelle wird von dem Laserlicht getroffen. Über
Streulichtmessungen (Vorwärts-, Seitwärts-, Nah-
winkel- und Rückstreuung) können Zelloberflä-
cheneigenschaften und Größen erfasst werden. Nach
geeigneter Färbung können auch Zelleigenschaften
wie Protein-, DNA- und Lipidgehalt in einzelnen
Zellen erfasst werden. Diese Färbungen basieren auf
Fluoreszenzverfahren, d. h. ein Fluoreszenzfarbstoff
wird verwendet, um einzelne Zellinhaltsstoffe selek-
tiv zu färben. Das Laserlicht regt die Farbstoffe in den
Zellen zur Fluoreszenz an. Diese wird pro Zelle von
geeigneten optischen Systemen erfasst. Mit geeigne-
ten Sortiersystemen können die Zellen einzeln aus-
sortiert werden. Dazu wird der laminare Strom nach
Passieren des Lasers in kleine Tröpfchen zerlegt, auf-
geladen und dann in einem elektrischen Feld abge-
lenkt und in einzelnen Gefäßen abgelegt. So ist es
möglich, einzelne Zellen mit bestimmten Eigen-
schaften aus einer Zellpopulation heraus zu sortie-
ren. Die Durchflusszytometrie liefert Informationen
über die Zellpopulation. Bei der genauen Aufgabe
von Volumina in das Durchflusszytometer können
dann Zellzahl und Zelleigenschaften pro Volumen
bestimmt werden. Die Methode ist normalerweise
sehr zeitaufwendig und bedarf geübten Personals.
Inzwischen sind auch Verfahren bekannt, um Durch-
flusszytometer an einen Bioprozess kontinuierlich als
at-line-Sensorsysteme anzukoppeln.
Mithilfe von turbidimetrischen Sensoren kann
die Zelldichte in situ erfasst werden. Hier bieten
Kapitel 8 · Bioprozessanalytik und -steuerung
. Abb. 8.10  Aufbau eines Durchflusszytometers
sich Durchlichtmessungen (Turbidimetrie) oder
Reflexionsmessungen (Nephelometrie) an. Ver-
schiedene kommerziell erhältliche Sensoren sind
auf dem Markt verfügbar. Ein Streulichtsensor ist
in . Abb. 8.11 dargestellt. Einfallendes Licht (meist
im roten Wellenlängenbereich) wird in das Mess-
medium geführt, und das rückgestreute Licht wird
erfasst. Je höher die Intensität des rückgestreuten
Lichtes, desto höher die Zahl der suspendierten
Teilchen. Diese Sensoren erfassen alle Komponen-
ten, die eine Trübung oder Streuung des Lichtes her-
vorrufen. Damit werden neben den suspendierten
Zellen auch Feststoffpartikel und Gasblasen erfasst.
Eine Bestimmung der biologisch aktiven Biomasse
ist nicht möglich. Da jedes biologische Zellsystem
ein anderes Streulichtverhalten aufweist, müssen die
Sensoren meist auf jedes biologische Zellsystem neu
kalibriert werden. Ansonsten gelten die für spekt-
roskopische Sensoren (7 Abschn. 8.2.6) üblichen
Eigenschaften.
Verschiedene Impedanzmesssysteme zur
Biomassebestimmung sind als in situ-Senso-
ren erhältlich. Hier wird ein sinusförmiges elek-
trisches Wechselfeld erzeugt und die Impedanz
(Wechselstromwiderstand) der Probe bestimmt.
Meist werden in Abhängigkeit der Frequenz zwei
273 8
Größen bestimmt: die Kapazität und der Wirkleit-
wert. Beide Messgrößen werden von der Biomasse
beeinflusst. Prinzipiell sollten mit diesen Methoden
nur lebende Zellen erfasst werden, doch ergeben
sich Probleme, beispielsweise bei hohen Leitfähig-
keiten des Mediums und unterschiedlichen Bega-
sungsraten, also bei allen Änderungen, die die
Impedanzmessung beeinflussen. Rückschlüsse auf
Zellkonzentrationen und Zelleigenschaften werden
durch Korrelation mit Kalibrierkultivierungen
ermöglicht.
8.2.5 Bildgebende Verfahren
Immer mehr setzen sich bei den optischen Verfah-
ren Systeme durch, die nicht nur die Trübung im Bio-
reaktor erfassen, sondern die suspendierten Parti-
kel genauer analysieren. Mit diesen Methoden wird
versucht, das biologische System näher zu charakte-
risieren und in seiner Morphologie besser zu erfas-
sen. Besonders die Durchflusszytometrie (7 Abschn.
8.2.4) bietet besondere Vorteile, da sie eine Vielzahl
von Zellcharakteristika und Eigenschaften erfasst.
Diese Messtechnik kann aber nur at-line betrieben
werden. In situ-Sensoren hätten den Vorteil, direkt
 274 B. Hitzmann und T. Scheper
. Abb. 8.11  Prinzip einer Streulichtsonde
im Prozessgeschehen Messungen möglich zu machen
und somit nicht-invasiv zu arbeiten.
Zur in situ-Erfassung streuender Partikel sind
Laserstreulichtsensoren kommerziell erhältlich, bei
denen der Strahl einer Laserdiode auf eine rotie-
8 rende, exzentrisch gelagerte Linse trifft. Diese fokus-
siert den Laserstrahl ins Medium auf eine kreisende
Fokusebene. Die Linse rotiert mit einer konstanten
Frequenz und „scannt“ die Fokusebene ab. Sobald
Streulicht durch Partikel wieder in die Sonde gelangt,
wird es erfasst und ausgewertet. Die Geschwindigkeit
des bewegten Laserstrahls ist größer als die der Parti-
kel. Bei starker Streuung werden scharfe Bilder erhal-
ten. Da der Brechungsindex von Zellen meist nur
unwesentlich größer ist als der des Mediums, werden
Zellen nur schlecht erfasst. Ähnliches gilt für Inst-
rumente, die wie ein Auflichtmikroskop mit mehre-
ren Lasern arbeiten. Auch hier ist der Einsatz bisher
hauptsächlich auf die Messung von Kristallsuspen-
sionen oder Öl-in-Wasser-Tröpfchen beschränkt.
Die in situ-Mikroskopie ist eines der Verfahren,
das sicherlich in der Zukunft an Bedeutung gewin-
nen wird [6]. Verschiedene Arbeitsgruppen haben
Messsysteme entwickelt, in denen ein Mikroskop-
objektiv im Inneren des Bioreaktors angebracht wird
(. Abb. 8.12). Die Zellsuspension kann im Inneren
des Reaktors durch einen Spalt zwischen Beleuch-
tungseinheit und Objektiv fließen. Wird das Anre-
gungslicht „blitzlichtartig“ gepulst, können Durch-
lichtaufnahmen auch bei stark strömenden Medien
generiert werden. Eine CCD-Kamera erfasst die
Bilder, die von einem Bildverarbeitungssystem aus-
gewertet werden. Bedingt durch die Lichtmikrosko-
pie können suspendierte Partikel oberhalb von einem
Mikrometer gut analysiert werden. Optimal ist der
Einsatz bei Tierzellkultivierungen. Hier kann neben
der Zellzahl und der Zellgröße auch die Zellkomple-
xität bzw. -morphologie interessante Hinweise auf
das Prozessgeschehen liefern.
Probleme ergeben sich, da oftmals nur wenige
Zellen pro Bild (bedingt durch das mikroskopische
Messfeld) erfasst werden können. Hier kann durch
eine hohe Aufnahmefrequenz (ca. fünf Bilder pro
Sekunde) eine statistische Verbesserung erreicht
werden. Bei hohen Zellkonzentrationen erschwert
sich die Auswertung der Einzelaufnahmen. Die
Bildverarbeitungsalgorithmen stellen oftmals einen
Engpass für die Auswertung und den breiteren
Einsatz dieser Messtechnik dar. Neuere Entwick-
lungen sind auf die Variation der Mikroskopietech-
nik ausgelegt. So sind in der Literatur Verfahren über
die Dunkelfeldmikroskopie, die Fluoreszenzmikro-
skopie und die Polarisationsmikroskopie beschrie-
ben. Mit ihnen scheint auch eine Unterscheidung in
Lebend- und Totzellzahl möglich.
8.2.6 Spektroskopische Sensoren
Unter spektroskopischen Sensoren versteht man
geeignete Lichtleitsysteme zur Ankopplung spektro-
skopischer Analysensysteme (UV/Vis [Ultraviolett/
sichtbares Licht, von engl. visible], NIR [Nahinfrarot],
MIR [mittlere Infrarot] und Fluoreszenz). Sie bieten
die Möglichkeit, Informationen über Zusammen-
setzungen der Medien oder der Zellen selbst durch
bekannte spektroskopische Verfahren zu gewinnen.
Die Methoden sind nicht-invasiv und liefern ohne
Zeitverzögerungen Informationen aus dem Biopro-
zessgeschehen, eine Störung durch elektromagneti-
sche Felder (schaltende Magnetventile o. Ä.) ist aus-
geschlossen. Standardspektroskopiegeräte können
verwendet werden. Die Ankopplung an den Biopro-
zess erfolgt meist über Glasfaserkabel. Schwierigkei-
ten bestehen in dem Aus- und Einkoppeln des Anre-
gungs- und Empfängerlichtes an den Faserenden im
Bioreaktor. Dies kann über einfache Durchflusssys-
teme geschehen oder Reflexionssysteme, bei denen
das reflektierte Licht aus dem Bioreaktor über die
Glasfaser aufgenommen wird oder über spezielle Ein-
und Auskopplungssysteme, wie ATR(attenuated total
reflection)-Kristalle oder ATR-Sonden. Diese bieten
Kapitel 8 · Bioprozessanalytik und -steuerung
. Abb. 8.12  Aufbau eines in situ-
Mikroskops
die Möglichkeit, Anregungslicht über definierte Weg-
strecken in das Prozessmedium einzuführen und
das Licht nach Passieren einer definierten Wegstre-
cke wieder in die Faser aufzunehmen (. Abb. 8.13).
Die Wegstrecke, die das Licht über ATR-Kristalle
zurücklegt, liegt im Bereich von 0,5 bis 5 µm. Durch
mehrfache Reflexion kann die Empfindlichkeit der
Messung erhöht werden. Das Licht durchläuft dann
eine längere Wegstrecke. Die Kosten für ATR-Kris-
talle sind relativ hoch, da die Systeme für die einzel-
nen Wellenlängen optimiert werden müssen. Inzwi-
schen sind auch Halogenid-ATR-Fasern bekannt, die
sicherlich in der Zukunft den Einsatz ‒ speziell in der
NIR- und MIR-Spektroskopie ‒ vereinfachen und
kostengünstiger gestalten werden. Über Multiplexer
können mehrere faseroptische Sensoren als Array
an ein Messgerät gekoppelt werden. Ein Reaktor
kann dann an mehreren Stellen oder viele Reaktoren
können parallel beobachtet werden.
. Abb. 8.14 zeigt den Wellenlängenbereich, in
dem verschiedene spektroskopische Sensoren ver-
wendet werden.
8.2.7 Fluoreszenzspektroskopie
Die Fluoreszenzspektroskopie erfolgt meist im
Reflexionsbetrieb, d. h. das rückwärtige Fluores-
zenzlicht wird über die Fasern aufgenommen. Die
275 8
Veränderungen der verschiedenen fluoreszieren-
den Komponenten im Medium ermöglichen es,
eine Vielzahl von Komponenten, selbst in nied-
rigen Konzentrationsbereichen, sicher zu detek-
tieren. Werden beim Messen das Anregungslicht
(Exzitation) und das Fluoreszenzlicht (Emission)
durchgescannt, werden alle fluoreszierenden Kom-
ponenten im Medium erfasst (3D-Fluoreszenzen;
. Abb. 8.15). Die Änderungen dieser Konzentra-
tionen geben einen direkten Einblick ins Prozess-
geschehen. Chemometrische Modelle sind nötig,
um aus den Spektren valide Prozessdaten zu gene-
rieren. Die Fluoreszenzmessung erlaubt es, auch
intrazelluläre Komponenten zu erfassen. Damit
ergibt sich die Möglichkeit, den metabolischen
Zustand der Zellen in der Kultivierung ohne Pro-
benahme zu bestimmen. Dabei wird beispielsweise
der NADH-Pool in den Zellen fluoreszenzspektro-
skopisch erfasst. Änderungen im NADH-Pool spie-
geln z. B. den Übergang von aerob zu anaerob oder
eine Verschiebung im Redoxzustand der Zelle wider
(. Abb. 8.16a). Auch beim Einsatz lumineszierender
Organismen oder bei der Herstellung fluoreszieren-
der Proteine (GFP-Fusionsproteine; . Abb. 8.16b)
ergeben sich mit dieser Methode Möglichkeiten,
direkt und nicht-invasiv Informationen über den
Prozessverlauf und die Dynamik der Proteinsyn-
these zu gewinnen. Mit dieser Methode werden die
aktiven, also lebenden Zellen erfasst.
 276 B. Hitzmann und T. Scheper
. Abb. 8.13  Prinzip eines
ATR(attenuated total reflection)-
Kristalls
. Abb. 8.14  Wellenlängenbereiche
für spektroskopische Sensoren
. Abb. 8.15  Aufbau eines 3-D-Spektralfluorometers mit Filterrädern für die Exzitations- und Emissionsmessung
8.2.8 Infrarotspektroskopie
Gerätetechnisch ist der Einsatz der Infrarotspek-
troskopie besonders interessant [4]. Durch den
Einsatz dieses spektroskopischen Verfahrens in ver-
schiedensten Bereichen der chemischen Industrie
ist das Angebot von Infrarot(IR)- und Mittelinfra-
rot(MIR)-Spektroskopiesystemen beachtlich. Die
Infrarotspektroskopie beruht darauf, dass die Mole-
külschwingungen fast aller organischen Verbindun-
gen im IR-Bereich typische spektrale Signaturen
aufweisen. Diese werden in den Nahinfrarotbereich
(NIR, Wellenbereich 4000–13.000 cm−1), den Mit-
telinfrarotspektroskopiebereich (MIR, Wellenbe-
reich 200–4000 cm−1) und den Ferninfrarotbereich
(FIR, 10–200 cm−1) aufgeteilt. Probleme ergeben
sich, wie schon oben erwähnt, durch die Lichtfüh-
rung. Das Infrarot-Anregungslicht muss gezielt
in den Reaktor eingebracht werden und definierte
Strecken durchlaufen, bevor es ausgewertet wird.
Das Ein- und Auskoppeln erfolgt im Allgemeinen
bei Bioprozessen durch ATR-Systeme und geeignete
Kapitel 8 · Bioprozessanalytik und -steuerung
277 8
. Abb. 8.16  Beispiele für
3-D-Fluoreszenzapplikationen. (a)
Differenz der Spektren zwischen einer
aeroben und anaeroben Kultur. Die
deutliche Zunahme der Fluoreszenz
im Bereich des NADH ist zu erkennen.
(b) Korrelation der GFP(grün
fluoreszierendes Protein)-Fluoreszenz
und des GFP-Proteingehalts

Lichtleitertechnik. Da die Biotechnologie haupt- in Konzentrationsbereichen oberhalb von einem

sächlich wässrige Medien verwendet, ergeben sich
Probleme mit der Infrarotabsorption von Wasser
unterhalb von 4000 cm−1. Die Summe aller Absorp-
tionsspektren der im Medium enthaltenen Kom-
ponenten wird erfasst. Chemometrische Modelle
sind nötig, um die Signale zu entfalten und auszu-
werten. Der Einfluss der Medien wird wie oftmals
bei spektroskopischen Sensorsystemen durch Kali-
brationsmessungen ausgeschlossen. In der Literatur
sind Einsatzmöglichkeiten unter verschiedensten
Kultivierungszwecken beschrieben. Hauptsäch-
lich werden die IR-Messtechniken zur Erfassung
von Glucose, Lactat, Glutamin und Ammoniak
verwendet. Die höchsten Genauigkeiten werden
Gramm pro Liter erhalten. . Abb. 8.17 zeigt ein typi-
sches MIR-Spektrum von vier relevanten Medienbe-
standteilen in Kaliumphosphatpuffer.
8.2.9 Optische Chemosensoren
Neben den spektroskopischen Sensoren sind die
optischen Chemosensoren in der Bioprozessbe-
obachtung von besonderem Interesse. Auch sie
ermöglichen einen nicht-invasiven Einblick in das
Prozessgeschehen und bieten eine robuste Informa-
tionsübertragung über Lichtleiterkabel. Bei diesen
Sensoren werden Indikatoren verwendet, deren
 278 B. Hitzmann und T. Scheper
. Abb. 8.17  Infrarotspektren biotechnologisch relevanter Medienkomponenten im Kaliumphosphatpuffer
optische Eigenschaften (Photolumineszenz, Absorp-
tion, Reflexion etc.) sich mit der Analytkonzentra-
tion ändern. Die Indikatoren können entweder am
Ende einer Glasfaser aufgebracht werden oder als
sogenannter patch innerhalb eines Bioreaktors auf
der Seite eines optischen Beobachtungsfensters. Über
die Glasfaser wird das Licht zum fixierten Indika-
tor geführt. Die Indikatoreigenschaften in Abhän-
gigkeit von der Analytkonzentration werden dann
über eine andere Lichtleiterfaser oder dieselbe Glas-
faser erfasst. In . Abb. 8.18 wird das Prinzip einer
pH- und pO2-Optode gezeigt. Hier ist der jeweilige
Indikator in einer Polyvinylalkohol- oder Silikonma-
trix am Faserende aufgebracht. Die Messung erfolgt
über Fluoreszenzänderungen (Intensität oder Pha-
senverschiebung). Das Anregungslicht wird von der
Lichtquelle zum Faserende geführt. Das veränderte
Fluoreszenzlicht wird über die gleiche Faser geleitet
(. Abb. 8.19).
Bei den Sauerstoffoptoden werden häufig Farb-
stoffe des Phenanthrolintyps verwendet. Die Fluo-
reszenzintensität ist bei Abwesenheit von Sauerstoff
besonders hoch und nimmt mit zunehmendem
Sauerstoffgehalt ab. Die Signale werden intern
linearisiert. Die Empfindlichkeit dieser Sensoren ist
gerade im Bereich von kleinen Gelöstsauerstoffkon-
zentrationen sehr hoch. Bei der Messung wird kein
Sauerstoff verbraucht, sodass auch in diffusionskon-
trollierten Bereichen genau gemessen werden kann.
Probleme ergeben sich durch das Ausbleichen der
Farbstoffe und Veränderungen in der Lichtführung,
z. B. durch starkes Biegen der Glasfaser. Verschiedene
Systeme sind inzwischen kommerziell erhältlich,
die diese Probleme überwinden. Zu den Vorteilen
der optischen Chemosensoren gehören Miniaturi-
sierbarkeit, Parallelisierbarkeit und die Messung an
schwer zugänglichen Stellen.
Bei den optischen pH-Sensoren werden Fluores-
cein oder beispielsweise 8-Hydroxy-1,3,6-pyrentri-
sulfonsäure (HPTS) als Indikatoren verwendet. Die
Fluoreszenzeigenschaften des pH-Indikators, der
in protonendurchlässigen Matrizes fixiert wird,
ändern sich mit dem pH im Medium. Hohe Steil-
heiten im Vergleich zur konventionellen pH-Elekt-
rode können in einem kleinen pH-Bereich erreicht
werden (Umschlagpunkt des Indikators). Jedoch ist
Kapitel 8 · Bioprozessanalytik und -steuerung
. Abb. 8.18  Prinzip optischer Chemosensoren (pH- und pO2-Optode)
es schwierig, einen optischen pH-Sensor über einen
breiten pH-Bereich zu erstellen. Darüber hinaus ist
das Autoklavieren dieser Farbstoffe schwierig, und
sie werden leicht ausgewaschen. Eine kovalente
Bindung verändert die Fluoreszenzeigenschaf-
ten stark. Diese Messtechnik bietet sich auch zur
Überwachung von Schüttelkolbenexperimenten an
(. Abb. 8.20).
Auch optische pCO2-Sensoren sind bekannt. Sie
basieren auf dem Prinzip der Severinghaus-Elek-
trode (7 Abschn. 8.2.2.2). Auch hier muss der optische
pH-Sensor in Kontakt mit einem Carbonatpuffer
gebracht werden, der vom Medium durch eine CO2-
permeable Membran getrennt ist. Die Ansprechzei-
ten dieser Sensoren sind ähnlich anfällig wie bei den
konventionellen pCO2-Elektroden, und das Quellen
der CO2-permeablen Membranen führt dazu, dass
nur eine geringe Lagerzeit erreicht wird. Dieser
Nachteil kann bei den optischen pCO2-Elektroden
durch folgenden Ansatz überwunden werden. Die
pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffe werden kom-
positartig mit langkettigen quarternären Alkyla-
minen ionisch eingebracht. Diese Kombination ist
in Silikon löslich und kann direkt zur pCO2-Mes-
sung eingesetzt werden, da das pH-Gleichgewicht
in dem Hydratmantel um den Farbstoff eingestellt
wird. Dieses Hydratwasser ist fest gebunden, sodass
der Sensor bei der Lagerung nicht dehydriert oder
stark aufquillt.
279 8
8.2.10 Biosensoren
Biosensoren bieten die Möglichkeit, hoch spezifisch
einzelne Komponenten in komplexen Probenmat-
rizes zu erfassen. Dazu werden biologische Erken-
nungs- und Umsetzungssysteme genutzt. Prinzipiell
sind Biosensoren, wie in . Abb. 8.21 gezeigt, so auf-
gebaut, dass eine biologische Komponente den zu
detektierenden Analyten hoch spezifisch umsetzt.
Die biologische Komponente befindet sich auf einem
entsprechenden Transducer, der die bei der spezi-
fischen Reaktion auftretenden Änderungen in der
Mikroumgebung (pH, Gewicht, Wärmeentwick-
lung, Sauerstoffverbrauch etc.) erfasst. Im Transdu-
cer wird diese Änderung in ein elektrisches Signal
umgewandelt, anschließend verstärkt und verarbei-
tet. Hauptsächlich werden als biologische Kompo-
nenten Enzyme, Organellen, Lectine, Antikörper
oder Oligonucleotide eingesetzt (. Abb. 8.21). Prin-
zipiell können auch Zellverbände oder ganze Organe
eingesetzt werden, wenn sie mit der zu analysieren-
den Substanz eine sensorisch schnell und selek-
tiv erfassbare Reaktion eingehen. Die biologische
Komponente und der Transducer müssen je nach
der detektierenden Reaktionsänderung kombiniert
werden (. Tab. 8.3).
Prinzipiell gibt es Einmal- und Mehrfachsenso-
ren. Bei den Einmalsensoren ist die Detektionsreak-
tion irreversibel, das biologische System wird bei der
 280 B. Hitzmann und T. Scheper
. Abb. 8.19  Aufbau eines
Messsystems für faseroptische
Chemosensoren
8 Bindung, des entrapment (Einschluss-Technik) und
. Abb. 8.20  Aufbau zur chemosensorischen Messung in
Schüttelkolben
Reaktion verbraucht. Hierzu sind z. B. DNA-Mikro-
arrays oder komplex aufgebaute Antikörper-Detek-
tionsreaktionen zu zählen. Für die Bioprozessanaly-
tik sind Mehrfachsensoren sinnvoll. Auf diese wird
im Folgenden näher eingegangen.
Beim Biosensor muss die biologische Kompo-
nente direkt und effektiv an den Transducer gebun-
den sein. Hierzu stehen die aus der Enzymimmo-
bilisierung bekannten Techniken der kovalenten
des crosslinking (Vernetzungs-Technik) zur Verfü-
gung. Die biologisch aktive Schicht muss dünn sein,
damit die Ansprechzeiten kurz sind. Im Allgemei-
nen sind Biosensoren nicht sterilisierbar, weshalb der
Einsatz als in situ-Sensoren wegfällt. Verschiedenste
Aufbauten sind in der Literatur beschrieben, die ein
Aufbringen der biologischen Komponenten nach
dem Sterilisationsprozess beschreiben. Der appa-
rative Aufwand hierfür ist jedoch sehr groß, sodass
sie sich nicht durchgesetzt haben. Im Allgemeinen
werden diese Sensoren deshalb außerhalb des Reak-
tors in Fließinjektionsanalysesysteme (7  Abschn.
8.2.12) eingesetzt. Fließinjektionsanalysen (FIA)
bieten den Vorteil, Einflussmöglichkeiten auf bio-
chemische Analysereaktionen zu vermindern. Zwei
Beispiele sollen dies erläutern:
Wird bei einem Biosensor eine enzymatische
Reaktion genutzt, bei der entsprechend dem Ana-
lytumsatz eine pH-Änderung auftritt, so ist das Sen-
sorsignal abhängig von der Pufferart, aber besonders
von der Pufferkapazität in der Reaktionslösung. Je
höher die Pufferkapazität, desto kleiner ist das Mess-
signal bei gleichem Umsatz. Da der pH eine logarith-
mische Größe ist, ist die umgesetzte Analytmenge
nicht gleich der pH-Änderung und die Kalibrierkur-
ven können nicht linear verlaufen. Darüber hinaus
nimmt mit größer werdender pH-Änderung die
Aktivität des Enzyms ab, und die Reaktion kann ab
einem bestimmten Umsatz zum Erliegen kommen.
Höhere Konzentrationen können dann nicht erfasst
Kapitel 8 · Bioprozessanalytik und -steuerung
. Abb. 8.21  Prinzip eines Biosensors
werden. Bei all diesen Problemen kann durch die
Fließinjektionsanalyse eine definierte Reaktionsum-
gebung für eine optimale Analyse geschaffen werden.
Wird eine sauerstoffverbrauchende enzymati-
sche Reaktion verwendet, ist der Umsatz abhängig
von der Gelöstsauerstoffkonzentration im Medium.
Sie limitiert den maximalen Umsatz des Sensors.
Auch hier muss durch die Fließinjektionsanalyse eine
definierte Sauerstoffkonzentration im Messvolumen
ermöglicht werden.
Im FIA-Betrieb werden Biosensoren verschie-
denster Art eingesetzt. Kommerziell erhältlich
sind Sensoren für die Analyse von Glucose, Lactat,
Ethanol, Glutamin und Glutamat. Die Sensoren
können ohne Probleme ausgetauscht werden, wenn
sie erschöpft sind. Eine Kalibrierung des Sensors ist
jederzeit, auf den jeweiligen Konzentrationsbereich
im Bioprozess angepasst, möglich.
. Tab. 8.3  Biologische Komponenten und Transducer, die zu Biosensoren kombiniert werden können
Biologische Komponente
Enzyme
Organellen
Lectine
Rezeptoren
Mikroorganismen
Zellverbände aus Pflanzen und Tieren
Organe bzw. Organteile, immunologische Systeme,
Polynucleotide, Oligonucleotide
281 8
8.2.11 Single-use-Sensoren
Mit dem Erfolg und verstärkten Einsatz von sin-
gle-use-Bioreaktoren wächst auch der Bedarf an
Sensoren, die nur einmal in der Bioprozesstech-
nik eingesetzt werden können [1]. Hier bieten sich
besonders die Sensoren an, die einen kostengünstig
herstellbaren Transducer nutzen. Besonders günstig
erscheinen optische Chemosensoren (Verwendung
von patches im single-use-Reaktor) oder elektroni-
sche Bauteile (z. B. pH-ISFETs, Leitfähigkeitssen-
soren, Dickschichtsensoren etc.). Der Transducer
ist dann im Inneren des Kunststoffreaktors ange-
bracht. Die Signale werden nach außen geführt,
oder es wird, wie bei optischen Sensoren üblich, das
Licht zu den patches durch ein Beobachtungsfens-
ter ein- und herausgeleitet. Außerhalb des Reaktors
befinden sich Datenerfassung und -umwandlung,
Transducer
konduktometrische Elektroden
amperometrische Elektroden
potenziometrische Elektroden
Thermistoren
optische Sensoren (Lumineszenz, Absorption,
Ellipsometrie, Glasfasertechniken)
Feldeffekttransistoren
Piezokristalle
 282 B. Hitzmann und T. Scheper
die für jeden neuen Gebrauch wieder verwendet
werden können. Die single-use-Sensoren haben oft
ein schlechteres Driftverhalten und eine geringere
Langzeitstabilität als konventionelle Bioprozesssen-
soren, müssen aber nur einmal verwendet werden.
Besonders gefragt sind Sensoren, die von außen
angebracht werden und ohne direkten Kontakt oder
Datenabgleich über Beobachtungsfenster arbei-
ten (optische Sensoren, Impedanzspektroskopie).
Oftmals werden bei größeren single-use-Reaktoren
(Volumen: 200–10.000-Liter-Bereich) eher konven-
tionelle Sensoren über spezielle Ports in den Reaktor
eingebracht, obwohl sich dadurch die Vorteile der
single-use-Bioreaktoren verringern.
8.2.12 Fließinjektionsanalyse
8 der Transportgeschwindigkeit als auch von der Geo-
Mithilfe der Fließinjektionsanalyse (FIA) können
Substrat-, Zwischenprodukt- und auch Produkt-
konzentrationen von biotechnischen Prozessen on-
line gemessen werden. Diese große Vielfalt möglicher
Analyten resultiert aus der sehr flexiblen Kombina-
tion von nasschemischen Analyseverfahren, die in
FIA-Systemen automatisiert genutzt werden können.
In diesen Systemen wird der Analyt zumeist in ein
einfach nachzuweisendes Reaktionsprodukt umge-
setzt und somit indirekt quantifiziert. FIA-Systeme
bestehen im Wesentlichen aus vier Komponenten:
Pumpe, Injektionsventil, Manifold (Reaktionsstre-
cke) und Detektor. Eine schematische Abbildung
eines FIA-Systems ist in . Abb. 8.22 dargestellt.
Wird das FIA-System zum Bioprozessmonito-
ring verwendet, so wird über ein Probenahmemodul
(7 Abschn. 8.2.13) ein kontinuierlicher Probenstrom
aus dem Fermenter gezogen und dem FIA-System
zugeführt. In den kontinuierlich fließenden Trä-
gerstrom wird ein Probesegment aus einer Proben-
schleife mithilfe eines Injektionsventils eingeschert.
. Abb. 8.22  Schema eines
Fließinjektionsanalyse(FIA)-Systems
5HDJHQ]LHQ
7UlJHUVWURP
3UREHQVWURP
3XPSH ,QMHNWLRQVYHQWLO
Sollte der Trägerstrom nicht alle Reagenzien enthal-
ten, werden diese separat beigemischt. Probe und
Reagenzien durchströmen die Reaktionsstrecke, in
der auch weitere für die Analyse notwendige Rea-
genzien zugegeben werden oder immobilisiert sein
können. So werden insbesondere für das Monitoring
von Bioprozessen in der Reaktionsstrecke Enzyme
immobilisiert (7 Abschn. 8.2.10). Der Analyt wird
hier zu einem einfach nachzuweisenden Reaktions-
produkt umgesetzt und dieses mit einem Detektor
registriert. Als Detektor kommen häufig elektroche-
mische oder optische Detektoren zum Einsatz. Das
durch die Injektion zunächst pfropfenförmig vorlie-
gende Konzentrationsprofil der Probe wird aufgrund
der Dispersion in der Fließstrecke unsymmetrisch
und peakförmig mit einem ausgeprägten Tailing. Die
Dispersion wird dabei sowohl vom Probenvolumen,
metrie (Länge, Durchmesser, Anordnung) der Reak-
tionsschleife wesentlich beeinflusst. Charakteristisch
für die FIA ist, dass am Detektorort die Nachweisre-
aktion weder im stationären Zustand noch die Ver-
mischung von Probenlösung und Trägerstromlö-
sung vollständig ist. Deshalb hat die reproduzierbare
Arbeitsweise von FIA-Systemen eine hohe Bedeu-
tung. Dies bedeutet, dass das Einbringen der Proben-
zone, ihre Verweilzeit sowie alle weiteren Prozesse,
die die Probenzone und die chemische Reaktion
betreffen, während der Kalibration und der eigent-
lichen Messung konstant gehalten werden müssen.
Um die Analytkonzentration aus dem peak-
förmigen Rohmesssignal zu quantifizieren, gibt es
unterschiedliche Verfahren. Sie basieren auf der
Bestimmung des Peakmaximums, der Peakfläche
oder -breite, die zumeist in einem logarithmischen
Verhältnis zur Analytkonzentration stehen. Aber
auch die Peakhöhe zu einem festen Zeitpunkt nach
Injektion kann zur Berechnung der Analytkonzen-
tration verwendet werden. In . Abb. 8.23 sind ein
),$6\VWHP
5HDNWLRQVVWUHFNH
'
'HWHNWRU
Kapitel 8 · Bioprozessanalytik und -steuerung
. Abb. 8.23  FIA-Messsignal mit
Auswertegrößen
typisches FIA-Messsignal und die charakteristischen
Größen zur Quantifizierung der Analytkonzentra-
tion dargestellt. Weniger häufig findet man eine Aus-
wertung, die auf der Hauptkomponentenanalyse
und/oder neuronalen Netzwerken beruhen.
FIA-Systeme zeichnen sich durch kleine Pro-
benvolumina, geringen Reagenzienverbrauch,
ideale Probenkonditionierung (z. B. Anpassung des
pH oder Pufferkapazität), kurze Analysezeiten und
hohen Automationsgrad aus. Dabei sind sie einfach
auf andere Analyten (z. B. durch Wechsel des immo-
bilisierten Enzyms) umzurüsten. Zur Überwachung
wesentlicher Prozessgrößen von biotechnischen Pro-
zessen (wie z. B. Glucose, Lactat, Glutamin und Glu-
tamat) ist derzeit eine Reihe von kommerziellen FIA-
Systemen verfügbar.
8.2.13 Probenahmesysteme
Für die Fließinjektionsanalyse muss eine repräsenta-
tive Probe aus dem Bioprozess zur Verfügung gestellt
werden. Das bedeutet, die Probe muss zeitnah ana-
lysiert werden und in ihrer Probenzusammenset-
zung genau dem Prozessgeschehen entsprechen.
Für diese Probenahme ist es wichtig, dass die Ste-
rilität des Gesamtprozesses unbedingt gewährleis-
tet ist. Prinzipiell könnte ein Tauchrohr verwendet
werden, das kontinuierlich eine zellhaltige Probe aus
dem Bioreaktor entnimmt. Bei geringem Durchmes-
ser können hohe Fließgeschwindigkeiten ein Rück-
wachsen von Keimen verhindern. Verschiedene
283 8
Systeme sind erhältlich, bei denen in einer Dop-
pelkanüle zusätzlich eine Stopplösung mit in den
Probenstrom einfließt. Dies gewährt die Unterbre-
chung jeglicher metabolischer Aktivitäten, sodass
extra- und intrazelluläre Messgrößen genau den
Werten bei der Entnahme aus dem Bioreaktor ent-
sprechen. Während des Flusses zum Analysenort
treten dadurch keine weiteren Veränderungen auf.
Diese sogenannten offenen Systeme bergen jedoch
die Gefahr eines unkontrollierten Ausströmens der
Stopplösung in den Bioreaktor. Die auf diese Weise
erhaltene zellhaltige Lösung kann direkt analysiert
werden, oder eine Trennung für die Analyse intra-
zellulärer und extrazellulärer Größen ist prinzipiell
möglich.
Häufig werden zur Probenahme geschlos-
sene Systeme verwendet, bei denen eine Membran
die Barriere zwischen dem Bioreaktor und dem
Inneren des Probenahmesystems darstellt. Bei den
sogenannten Dialysesystemen (. Abb. 8.24) wird
ein Trägerstrom in der Probenahmesonde an einer
Dialysemembran vorbeigeführt. Niedermolekulare
Substanzen können vom Bioreaktor in den Puffer-
strom diffundieren und anschließend analysiert
werden. Mit dieser Methode tritt zwar eine erhebli-
che Verdünnung der Analyten auf und die Dialyse-
membran kann sich durch Fouling-Effekte in ihrer
Durchlässigkeit verändern, doch ändert sich das Pro-
benvolumen im Reaktor nicht. Bei druckbeladenen
Reaktoren muss darauf geachtet werden, dass keine
Druckdifferenz zwischen dem Reaktor und dem Dia-
lysesystem besteht.
 284 B. Hitzmann und T. Scheper
8 teilt werden: Softsensoren, die ein theoretisches Pro-
. Abb. 8.24  Aufbau einer Dialyse-Filtrations-
Probenahmesonde
Das Beispiel einer Filtrationssonde ist in
. Abb. 8.25 zu sehen. Hier wird eine tubuläre Mikro-
filtrationsmembran verwendet (prinzipiell sind auch
andere Membrantypen denkbar), die eine Sterilbar-
riere darstellt. Über die Filtrationsmembran kann
zellfreies Medium aus dem Reaktor entnommen
werden. In der Literatur sind für solche Systeme Ant-
wortzeiten von wenigen Minuten (fünf Minuten für
90 %iges Antwortsignal), bei Filtrationsleistungen
zwischen ein und zwei Milliliter pro Minute beschrie-
ben. Probleme ergeben sich bei langen Prozesszeiten
in kleinen Reaktoren, da größere Mengen Medium
kontinuierlich abgeführt werden.
8.3 Softwaresensoren
Als Alternative für gar nicht oder nur sehr aufwen-
dig zu messende wesentliche Prozessgrößen können
Softsensoren dienen, die auch Softwaresensoren
genannt werden. Sie nutzen ein oder mehrere Roh-
messwerte sowie ein empirisches oder theoretisches
manchmal auch dynamisches Modell, um für einen
Prozess aussagekräftige Information bereitzustel-
len. Softsensoren gehören zur Klasse der indirekten
Messmethoden. Sie können in zwei Gruppen einge-
zessmodell nutzen, und solche, die ein empirisches
Modell zur Berechnung der Prozessgrößen anwen-
den. Die erste Gruppe von Softsensoren werden
auch Beobachter genannt. Sie verwenden Zustands-
differenzialgleichungen, mit denen das dynamische
Verhalten eines Prozesses meist mit einem mecha-
nistischen Modell beschrieben wird, in dem z. B.
Transportprozesse und Reaktionskinetiken abge-
bildet werden. In der zweiten Gruppe von Soft-
sensoren kommen datengetriebene Modelle (black
box-Modelle) zur Anwendung. Dabei dienen Regres-
sionsmodelle häufig in Kombination mit Verfahren
der Hauptkomponentenanalyse oder insbesondere
für nicht-lineare Zusammenhänge neuronale Netz-
werke, um den Zusammenhang zu den Prozessgrö-
ßen zu beschreiben.
8.3.1 Kalman-Filter
Das Kalman-Filter ist ein sogenannter Beobachter und
dient zur Schätzung von Zustandsgrößen. In der Sys-
temtheorie versteht man darunter die Größen, die den
Zustand eines Prozesses eindeutig festlegen. Für einen
Kultivierungsprozess könnten dies beispielsweise die
Biomasse-, die Substrat- und/oder die Produktkon-
zentration sein. Das Kalman-Filter kann verwendet
werden, um Messrauschen zu reduzieren oder um
Kapitel 8 · Bioprozessanalytik und -steuerung
. Abb. 8.25  Aufbau einer in situ-Filtrations-Probenahmesonde
nicht messbare Größen zu schätzen. Die Schätzung
basiert auf Messungen, deren Messfehler als normal-
verteilt angenommen werden, sowie entsprechende
Zustands- und Messgleichungen. Die Grundidee
der Filterung ist, dass durch sie die Schätzfehler(ko)
varianz der Zustandsgrößen möglichst klein wird.
Am Beispiel des diskreten Kalman-Filters soll das
Vorgehen erläutert werden. Das diskrete Kalman-Fil-
ter geht von einem diskreten dynamischen Prozess-
modell des Bioprozesses und statischen Ausgangs-
gleichungen aus. Letztere beschreiben die Messung.
Ein solches System kann mit den folgenden Glei-
chungen beschrieben werden:
Dynamische (lineare) Zustandsgleichung:
x (tn+1) = Dx (tn ) +v(tn )  Gl. 8.1
Statische Ausgangsgleichung:
y (tn ) = M x (tn ) + w(tn )  Gl. 8.2
x(tn) ist der wahre Wert der Zustandsgröße zum Zeit-
punkt tn; D beschreibt das dynamische Prozessver-
halten; y(tn) ist der Wert der Messgröße zum Zeit-
punkt tn, der mit M aus x(tn) berechnet werden kann;
v(tn) gibt den Anteil des Prozessrauschens an (Unsi-
cherheit des Prozessmodells) und w(tn) den Anteil
des Messrauschens. Liegen mehrere Zustandsgrößen
vor, so sind x(tn) und v(tn) Vektoren und D ist eine
Matrix. Für die Ausgangsgleichung gilt Entsprechen-
des. Die beiden Größen v(tn) und w(tn) sind Zufalls-
größen. Für die weitere Berechnung ist der Erwar-
tungswert einer Zufallsgröße von Bedeutung; er ist
für die Zufallsgröße z und ihre Wahrscheinlichkeits-
dichtefunktion pdf(z) wie folgt definiert:
285 8
∞
E〈z〉 = ∫−∞ z ⋅ pdf ( z )dz  Gl. 8.3
v(tn) und w(tn) sind mittelwertfrei, d. h. ihre Erwar-
tungswerte sind null E〈v〉 = E〈w〉 = 0; die Erwar-
tungswerte der Varianzen sind E 〈v2〉 = Q, E〈w2〉 = R.
Für die Berechnung des Kalman-Filters müssen
D und M sowie Q und R bekannt sein. Darüber
hinaus müssen zum Zeitpunkt t0 auch Schätzwerte
für x(t0) – bezeichnet mit x̂(t0) – und für die Schätz-
fehler(ko)varianz – bezeichnet mit P(t0) = E<[x(t0)
− x̂(t0)]2> – vorliegen.
Ist der Messwert y(ti) bekannt, so kann mit fol-
gender Gleichung aus dem Schätzwert der Zustands-
größe x der gefilterte Schätzwert ŷ F(ti) berechnet
werden.
Filtergleichung:
xˆF (ti ) = xˆ (ti ) + K ⋅  y (ti ) − yˆ (ti )  Gl. 8.4
In dieser Gleichung ist K die sogenannte Kalman-
Verstärkung. K wird so berechnet, dass die Schätzfeh-
ler(ko)varianz des gefilterten Wertes der Zustands-
2
größe E 〈 x (t1) − xˆ F (t1) 〉 minimal wird. ŷ (t 1 ) ist
der Schätzwert der Messgröße ŷ(t1) = M · x̂(t1). Bei
Anwendung der Filtergleichung wird zum Schätz-
wert der Zustandsgröße x ein Term addiert, der pro-
portional zur Differenz von dem Messwert y(t1) und
dem geschätzten Messwert ŷ(t1) ist. Sollten beide
Werte identisch sein, so ist der gefilterte Wert der
Zustandsgröße identisch mit seinem berechneten
Schätzwert.
Für den Zeitpunkt t1 folgt:
xˆ (t1) = D ⋅ xˆ (t0 )  Gl. 8.5
 286 B. Hitzmann und T. Scheper

Für die Schätzfehler(ko)varianz ergibt sich dann Die Filterung soll dazu führen, dass die Schätzfeh-
ler(ko)varianz möglichst klein wird. Sie muss also
2 minimiert werden. Da bislang K noch nicht festgelegt
P (t1) = E〈 x (t1) − xˆ (t1) 〉
wurde, kann der Wert von K so gewählt werden, dass
2
= E〈 D ⋅ x (t0 ) + v(t0 ) − D ⋅ xˆ (t0 ) 〉 die Schätzfehler(ko)varianz minimal wird.

2 dPF
= E〈 D ⋅ ( x (t0 ) − xˆ (t0 )) + v(t0 ) 〉 =0
  dK
2
= E〈 D ⋅ ( x (t0 ) − xˆ (t0 )) 〉+ E〈2 ⋅ D  x (t0 ) = 2 ⋅ P (1 − K ⋅ M ) ⋅ (−M ) + 2 ⋅ K ⋅ R = 0
  = −2 ⋅ P ⋅ M + 2 ⋅ P ⋅ K ⋅ M 2 + 2 ⋅ K ⋅ R = 0
2
−xˆ (t0 ) ⋅ v(t0 )〉+ E〈v(t0 ) 〉 ⇒ K ⋅ ( 2 ⋅ P ⋅ M 2 + 2 ⋅ R) = 2 ⋅ P ⋅ M

 Gl. 8.6 M
⇒ K = 2 ⋅ P ⋅
2 ⋅ P ⋅ M 2 + 2 ⋅ R= P*M / (P*M 2 + R)
Da E〈2 ⋅ D  x (t0 ) − xˆ (t0 ) ⋅ v(t0 )〉 = 0 , ergibt sich für  Gl. 8.9
die Schätzfehler(ko)varianz Es folgt also (Kalman-Verstärkung):
P⋅ M
8 P (t1) = D 2 ⋅ P (t0 ) + Q  Gl. 8.7 K=  Gl. 8.10
P⋅ M 2 + R
Sollte kein Messwert vorliegen, wird die Berech- Wird also K entsprechend berechnet, so führt die
nung der Schätzwerte von x und P wiederholt, bis ein Filterung zur Minimierung der Schätzfehler(ko)
Messwert vorhanden ist. Liegt ein neuer Messwert varianz. Dies ist das Ziel der Kalman-Filterung.
vor, dann kommt die Filtergleichung zur Anwen- Neben dem diskreten Kalman-Filter findet das
dung, und die Schätzfehler(ko)varianz nach der Fil- kontinuierlich-diskrete Kalman-Filter Anwendung
terung kann berechnet werden: beim Monitoring von Bioprozessen. Das kontinuier-
lich-diskrete Kalman-Filter nutzt neben einem kon-
2 tinuierlichen Prozessmodell, mit dem das dynami-
PF (t1) = E〈 x (t1) − xˆF (t1) 〉
sche Verhalten der Zustandsvariablen beschrieben
2
= E〈 x (t1) − xˆ (t1) − K ⋅  y (t1) − yˆ (t1)  〉 werden kann, diskrete Messgleichungen, die das sta-
  tische Verhalten der Messsysteme beschreiben.
2
= E〈 x (t1) − xˆ (t1) − K ⋅  M ⋅ x (t1) + w (t1)  〉 Die folgenden Gleichungen stellen ein allgemei-
  nes Prozessmodell sowie ein Messmodell dar:
−yˆ (t )
 1 
dx (t )
2 = f ( x (t ), u (t ), t ) + z (t )  Gl. 8.11
= E〈 x (t1) − xˆ (t1) − K ⋅  M ⋅ x (t1) + w (t1)  〉 dt
 
−M ⋅ xˆ (t )
 1 
y (ti ) = h ( x (ti )) + s (ti )  Gl. 8.12
2
 
= E〈 x (t1) − x (t1) − K ⋅ M ⋅ x (t1) + K ⋅ w (t1) 〉
ˆ
In diesen Gleichungen steht x(t) für die Zustandsva-
(−K ⋅ M ⋅ xˆ (t1)) riablen, deren zeitliche Änderung mit der Funktion
2 f() beschrieben wird, u(t) die Eingangsgrößen, t die
= E〈{ x (t1) − xˆ (t1)} ⋅ {1 − K ⋅ M } + K ⋅ w (t1) 〉
  Zeit und z(t) das Prozessrauschen. y(ti) beschreibt
2
= P (t1) ⋅ {1 − K ⋅ M } + K ⋅ E〈w (t1) 〉
2 2 die diskreten Messwerte zum Zeitpunkt ti ,mit dem
2
Messrauschen s(ti). Die Abhängigkeit der Messgröße
= P (t1) ⋅ {1 − K ⋅ M } + K 2 ⋅ R von den Zustandsvariablen wird mit der Funktion h
 Gl. 8.8 beschrieben.
Kapitel 8 · Bioprozessanalytik und -steuerung
. Abb. 8.26  Arbeitsweise eines
kontinuierlich-diskreten Kalman-
9RUKHUVDJH
Filters
Die Arbeitsweise des Kalman-Filters ist in
. Abb. 8.26 dargestellt. Solange keine Messwerte vor-
liegen, wird mit dem Prozessmodell der Verlauf der
Zustandsvariablen geschätzt sowie der Verlauf der
Schätzfehler(ko)varianzen, die mit folgender Glei-
chung berechnet wird:
dP (t )
= F (t ) ⋅ P (t ) + P (t ) ⋅ F T (t ) + Q  Gl. 8.13
dt
P(t) steht für die Schätzfehler(ko)varianzen, F(t) für
die Jacobi-Matrix von f(), FT(t) für die transponierte
Matrix von F(t) und Q für die Prozessrauschleis-
tungsmatrix. Ist ein Messwert vorhanden, werden die
Zustandsvariablen sowie die Schätzfehler(ko)varian-
zen gefiltert. Hierfür muss die Kalman-Verstärkung
K(t) bestimmt werden, die sich aufgrund der Mini-
mierung der Schätzfehler(ko)varianz des gefilterten
Wertes der Zustandsgröße berechnen lässt.
K (ti ) = P (ti ) ⋅ H (ti ) ⋅  H (ti ) ⋅ P (ti ) ⋅ H T 
 −1
(ti ) + R
 Gl. 8.14
H(t) ist die Jacobi-Matrix von h() und R die Mess-
rauschkovarianzmatrix. Die gefilterten Werte
werden mit den folgenden Gleichungen berechnet:
xˆf (ti ) = xˆ (ti ) + K (ti )  y (ti ) − h( xˆ (ti ))  Gl. 8.15
 
Pf (ti ) =  I − K (ti ) ⋅ H (ti ) ⋅ P (ti )  Gl. 8.16
x̂f (ti )  sind die gefilterten Schätzwerte der Zustands-
variablen, P f (t i ) die gefilterten Schätzfehler
(ko) - varianzen und I ist die Einheitsmatrix.
Die Gleichung zur Berechnung der gefilterten
287 8
)LOWHUXQJ
Schätzwerte ergibt sich aus dem Schätzwert vor Fil-
terung plus einem Term, der proportional zur Dif-
ferenz von Messwert und geschätztem Messwert ist.
Sind beide Werte identisch, so ist der gefilterte Wert
der Zustandsgröße identisch mit seinem Wert vor
der Filterung.
Für die Anwendung des Kalman-Filters wird Fol-
gendes benötigt:
55 Prozessmodell (Zustandsgleichungen),
Messmodell
55 Modellparameter
55 Anfangswerte der Zustandsvariablen
55 Anfangswerte der Schätzfehler(ko)varianz
55 Prozessmodellrauschleistungsmatrix Q
55 Messrausch(ko)varianzmatrix R
Das Kalman-Filter gehört zu den am weitesten ver-
breiteten Methoden zur Zustandsschätzung. Bei der
Anwendung des Kalman-Filters zum Monitoring
von Bioprozessen kommen zumeist theoretische
Modelle zum Einsatz, die auf Bilanzgleichungen der
Zellmasse und des Substrates sowie der Wachstums-
kinetik der Zellen basieren. So kann beispielsweise
mit einem Kalman-Filter nur aufgrund der Messung
der Glucosekonzentration mit einem FIA-System
die Biomasse sowie die spezifische Wachstumsrate
geschätzt werden. Jedoch wird dieses Verfahren
bislang nur sehr selten zur Beobachtung von indust-
riellen Kultivierungsprozessen eingesetzt.
8.3.2 Hauptkomponentenanalyse
Eine Alternative zu den auf theoretischen Modellen
beruhenden Softsensoren sind solche, die auf daten-
getriebenen Modellen basieren. Bei diesen Softsenso-
ren ist kein Prozesswissen Voraussetzung. Für diese
 288 B. Hitzmann und T. Scheper
Methoden müssen jedoch eine Vielzahl an Messwer-
ten bereitgestellt werden, aus denen der Zusammen-
hang von den Messwerten zu den aussagekräftigen
Prozessgrößen berechnet werden kann. Ein einfa-
ches Beispiel stellen hier multilineare Regressions-
modelle dar. Mit einem solchen Modell können z. B.
aus ausgewählten Intensitätswerten eines Spektrums
Biomasse-, Substrat- oder Produktkonzentrationen
berechnet werden.
Will man das gesamte Spektrum zur Berechnung
von Prozessgrößen nutzen, so muss man auf Verfah-
ren der Hauptkomponentenanalyse zurückgreifen,
die aus der Faktorenanalyse hervorgegangen sind.
Der Grund hierfür liegt in der typischerweise linea-
ren Abhängigkeit der Intensitätswerte von Spektren.
Wird ein Spektrometer als Prozessanalysator ver-
wendet, so zeigen Intensitätswerte, deren Frequen-
8 zen dicht beieinander liegen, meist einen sehr ähn-
lichen Verlauf während einer Kultivierung. Somit
können die Intensitätswerte, die bei einer Frequenz
aufgenommen werden, aus den Werten bei einer
anderen Frequenz mit einem linearen Modell berech-
net werden; sie sind linear voneinander abhängig.
Dies führt dazu, dass sie nicht gemeinsam in einem
multilinearen Regressionsmodell als unabhängige
Variable genutzt werden können. Da sie aber Infor-
mation tragen, ist es sinnvoll, sie zur Berechnung der
Prozessgrößen mit heranzuziehen. Hierfür bietet die
Hauptkomponentenanalyse (PCA, principal compo-
nent analysis) eine Möglichkeit. Um das Vorgehen zu
erläutern, ist die Betrachtung von nur zwei Sensoren
sinnvoll, deren linear abhängige Messsignale während
eines Prozesslaufs aufgenommen wurden. Um diese
Abhängigkeit der Messwerte zu kompensieren, wird
eine Transformation durchgeführt. Hierfür werden
die Daten zunächst mittelwertzentriert, d. h. für jeden
Sensor wird von jedem Datenpunkt der zugehörige
Mittelwert abgezogen. In . Abb. 8.27 sind die Werte
vor und nach der Mittelwertzentrierung dargestellt.
Nun wird eine sukzessive, Varianz maximie-
rende, orthogonale Rotationstransformation des
Koordinatensystems durchgeführt. Sukzessive
bedeutet dabei, dass die Achsen des neuen Koor-
dinatensystems eine nach der anderen berechnet
wird, und zwar so, dass jeweils die Varianz der Daten
maximal ist. Zunächst wird die erste Achse des neuen
Koordinatensystems so bestimmt, dass der Ursprung
des alten Koordinatensystems erhalten bleibt und die
Messdaten maximale Varianz besitzen. Dann wird
die nächste Achse so berechnet, dass sie senkrecht
(orthogonal) auf der ersten Achse steht und wiede-
rum maximale Varianz der Daten beschreibt. Dieses
Vorgehen (senkrecht auf allen schon bestimmten
Achsen und maximale Varianz) wird so lange wie-
derholt, bis die maximale Dimension der Messdaten
(z. B. Anzahl der unterschiedlichen Sensoren oder
Anzahl der unterschiedlichen Messpunkte eines
Spektrums) erreicht ist. In . Abb. 8.28 sind Mess-
punkte von zwei linear abhängigen Messsonden im
alten Koordinatensystem und neuen Koordinaten-
system dargestellt.
Typischerweise enthalten die ersten so berech-
neten Achsen die Prozessinformation, hingegen die
zuletzt berechneten Messrauschen. In . Abb. 8.28 ist die
Information in den Werten der Achse t1 konzentriert,
hingegen beinhalten die Werte der Achse t2 das Mess-
rauschen. Die Achsen, die Prozessinformation ent-
halten, werden als Hauptkomponenten (oder Scores)
bezeichnet. Mathematisch kann die Hauptkompo-
nententransformation als eine Näherung der Daten-
matrix X durch ein Produkt von zwei in der Dimen-
sion kleineren Matrices T und P dargestellt werden:
X = TP T + E  Gl. 8.17
Dabei wird T als Score-Matrix, P als Ladungsmatrix
(loading-Matrix) und E als Residuenmatrix bezeich-
net. Im Idealfall ist in E nur das Messrauschen von
X enthalten, aber auch Beiträge von nicht-linearen
Effekten können dort verborgen sein. Die Werte
der Hauptkomponenten, die in der Score-Matrix T
stehen, können zur Analyse von Prozessen genutzt
werden, indem die Werte in einem sogenannten
Score-Plot (Auftragung der Werte der Hauptkom-
ponenten gegeneinander) dargestellt werden, oder
sie können als unabhängige Variable in einem mul-
tilinearen Regressionsmodell genutzt werden, um
Prozessgrößen zu berechnen. Dies wird in zwei
Schritten durchgeführt. Zunächst werden bei einem
Prozesslauf die Messwerte von unspezifischen Sen-
soren (z. B. 2D-Fluoreszenzspektren) aufgenommen.
Parallel hierzu werden Off-line -Proben zur Bestim-
mung der interessierenden Prozessgrößen gezogen
und durch geeignete Messverfahren die gewünschten
Kapitel 8 · Bioprozessanalytik und -steuerung
. Abb. 8.27  Daten vor (links) und nach (rechts) der Mittelwertzentrierung
. Abb. 8.28  Messpunkte von zwei
linear abhängigen Messsonden im
alten (x1 und x2) und neuen (t1 und t2)
Koordinatensystem, d. h. vor und nach
der Rotationstransformation
Größen bestimmt. Diese Kalibrationsdaten werden
genutzt, um das Kalibrationsmodell zu berechnen
[5]. Mit den unspezifischen Daten wird eine Haupt-
komponentenanalyse durchgeführt. Hier kommt
häufig der NIPALS-Algorithmus (nonlinear itera-
tive partial least squares-Algorithmus) zur Anwen-
dung. Die berechneten Hauptkomponenten, deren
Anzahl z. B. darüber festgelegt wird, ob sie noch
einen signifikanten Beitrag zur Gesamtvarianz der
Daten liefern, dienen dann als unabhängige Variable
und die Werte der off-line bestimmten Prozessgrößen
als abhängige Variable für die multilineare Regres-
sion. Danach können in einem zweiten Schritt die
289 8
so bestimmten chemometrischen Modelle genutzt
werden, um bei einem neuen Prozesslauf on-line die
Prozessgrößen vorherzusagen (zu schätzen).
Besteht ein nicht-linearer Zusammenhang zwi-
schen den Werten der Hauptkomponentenanalyse
und den Prozessgrößen, so haben sich zur mathe-
matischen Beschreibung dieses Zusammenhangs
neuronale Netzwerke bewährt. Aber auch die Qua-
drate der Scores können in Ergänzung zu dem mul-
tilinearen Regressionsmodell hinzugefügt werden.
Die Kombination aus Hauptkomponentenanalyse
und multilinearer Regression wird auch als Haupt-
komponentenregression (PCR, principal component
 290 B. Hitzmann und T. Scheper
regression) bezeichnet. Eine Alternative hierzu ist
die PLS-Regression (partial least squares-Regress-
ion). Hierbei wird bei der Transformation der Daten
nicht nur ihre Varianz, sondern auch noch die Varianz
der zu berechnenden Prozessgrößen herangezogen.
Das heißt, bei dieser Transformation wird die innere
Beziehung der unabhängigen und der abhängigen
Variablen mit berücksichtigt. Dies soll zu einfache-
ren und stabileren Modellvorhersagen führen.
8.4 Automatisierung
Aufgrund des Strebens nach hoher Produktqualität,
-ausbeute und Prozesssicherheit sowie geringen Pro-
zesskosten (geringer Energie- und Substrateintrag
und geringe Personalkosten) gewinnt eine umfas-
8 sende Automatisierung biotechnischer Prozesse
ständig an Bedeutung [2]. Der Betrieb eines Pro-
duktionsfermenters ist gekennzeichnet durch nach-
einander ablaufende Betriebsphasen:
55 upstream processing (Befüllen, Sterilisieren,
Mischen)
55 Kultivieren (Züchtung und Produktion) und
55 downstream processing (Ernten und Aufarbeiten)
In jeder Phase ist ein hohes Maß an Automatisierung
gefordert. Dabei stellt das Kultivieren aus Sicht der
Regelung und Steuerung im Allgemeinen die höchs-
ten Ansprüche, da hier ein dynamisches Optimie-
rungsproblem vorliegt. Jedoch werden Verfahren der
Regelungstechnik bislang nur selten in dieser Phase
eingesetzt. Dies hat mehrere Ursachen:
Da Kultivierungsprozesse sowohl eine Viel-
zahl von dynamischen biochemischen Reaktio-
nen als auch vielschichtige Transportprozesse
beinhalten, sind sie sehr komplex, nicht-linear
und zeitvariant. Selten liegen im Detail umfas-
sende Kenntnisse über sie vor. Die zur Produk-
tion verwendeten Mikroorganismen besitzen ein
ihnen innewohnendes Regulationssystem, das nur
indirekt über die Umgebungsgrößen (physikali-
sche und chemische Größen) beeinflusst werden
kann. Wesentliche Prozessgrößen können nur –
wenn überhaupt – mit großem Aufwand gemes-
sen werden. Sie liegen mit großer Zeitverzögerung
sowie diskontinuierlich vor. Da im Allgemeinen
kein stationärer Betriebszustand bei Bioprozes-
sen angestrebt, sondern entweder ein Satzbetrieb
(batch-Betrieb) oder ein Zulaufbetrieb (fed-batch-
Betrieb) gewählt wird, besteht die eigentliche Rege-
lungsaufgabe fast ausschließlich darin, den Mikro-
organismen optimale Umgebungsbedingungen
bereitzustellen. Nur selten steht die Maximierung
der Biomasse oder der Produktkonzentration bei
einer Regelung direkt im Vordergrund, da die
hierfür notwendige Messtechnik fehlt.
Ziel der Regelung und Steuerung von Kultivie-
rungsprozessen ist es:
55 Störungen jeglicher Art auszugleichen,
55 den Energieeintrag zu minimieren,
55 die Ausbeute und Produktqualität zu
maximieren,
55 die sichere Durchführung des Prozesses zu
gewährleisten,
55 der Substrat-, Katabolit- und Produktinhi-
bierung vorzubeugen,
55 die gezielte Induktion und Repression der
Enzymbildung zu gewährleisten,
55 große Scherkräfte zu vermeiden und
55 den Organismen insgesamt ein optimales
Milieu (für Wachstum und oder Produkt-
bildung) zur Verfügung zu stellen.
Mithilfe von Standardverfahren der Regelungstech-
nik lassen sich einige dieser Ziele schon seit Län-
gerem erreichen. So gehört die Bereitstellung von
Modulen zur Regelung des Volumens, der Tempe-
ratur, des pH, der Gelöstsauerstoffkonzentration und
der Zugabe von Antischaummittel im Allgemeinen
zu der Grundausstattung eines Fermenters.
8.4.1 Regelung
Die Aufgabe der Regelung bei einem Prozess besteht
entweder darin, eine vorgegebene Größe, die sich
aufgrund von Störeinflüssen ändern kann, auf einen
gewünschten Wert zu bringen und diesen Wert zu
halten oder die vorgegebene Größe ständig an eine
sich ändernde Größe anzupassen. Die erstgenannte
Art einer Regelung nennt man Störgrößenregelung,
die zweite Nachlaufregelung. Bei der Regelung eines
Prozesses wird die zu regelnde Ausgangsgröße
Kapitel 8 · Bioprozessanalytik und -steuerung
eines Prozesses (Regelgröße; z. B. Temperatur, pH)
ständig gemessen und mit einem vorgegebenen
Sollwert (Führungsgröße) verglichen. Der Prozess
wird durch die Regelung dahingehend beeinflusst,
dass möglichst die Differenz von gewünschtem
Sollwert zum Wert der Regelgröße null wird. Diese
Differenz wird als Regeldifferenz oder Sollwert-
abweichung, der Wert der Regelgröße als Istwert
bezeichnet. Die Größe, mit der der Prozess über
eine Stelleinrichtung (Stellglied) beeinflusst wird,
heißt Stellgröße.
Weicht die Regeldifferenz von null ab, d. h. sind
der Istwert und der Sollwert unterschiedlich auf-
grund von Störungen oder der gezielten Änderung
des Sollwertes, so wird der Regler über das Stell-
glied so auf die Regelstrecke (den Prozess) einwir-
ken, dass der Istwert der Regelgröße sich dem Soll-
wert der Führungsgröße nähert. In . Abb. 8.29 sind
das Schema sowie die verschiedenen Größen eines
Regelkreises dargestellt.
Die Bestimmung eines aktuellen Stellwertes
und seine Einstellung am Stellglied kann von einem
Menschen (Handregelung) oder mit einem ent-
sprechenden Gerät durchgeführt werden. Werden
die mit einem Sensor ermittelten Istwerte der Regel-
größe mit einem Computer erfasst, in dem auch der
Regelalgorithmus implementiert und ausgeführt
wird, so nennt man diesen Regler auch Abtastreg-
ler bzw. digitalen Regler. Bei der Abtastung der
Messwerte wird ein Analog-Digital-Wandler (A/D-
Wandler) verwendet, der ein analoges Eingangssi-
gnal in ein digitales Ausgangssignal umsetzt und
dies dem Computer zur Verfügung stellt. Bei dieser
Messdatenaufnahme muss darauf geachtet werden,
dass die Information des analogen Messsignals
. Abb. 8.29  Schema eines
Regelkreises
6WHOOJOLHG
291 8
nur dann vollständig erhalten bleibt, wenn die
Abtastrate größer als das Doppelte der höchsten
Frequenzkomponente des analogen Signals ist
(Shannon-Abtasttheorem).
8.4.2 Steuerung
In der englischen Literatur wird zwischen den
Worten Regelung und Steuerung nicht unterschie-
den. Beides wird mit control übersetzt. Im Gegensatz
zur Regelung, bei der ein geschlossener Wirkungs-
ablauf charakteristisch ist, findet bei der Steuerung
kein Vergleich der Ausgangsgröße mit der Eingangs-
größe statt. Somit liegt ein offener Wirkungsablauf
vor, bei dem keine Rückkopplung vorhanden ist;
deshalb spricht man hier auch von einer Steuerkette
im Unterschied zum Regelkreis. Das Schema einer
Steuerung ist in . Abb. 8.30 dargestellt.
Nur wenn alle Einflussgrößen eines Prozesses
sowie ihre Wirkung auf die Ausgangsgröße hin-
reichend bekannt sind, erhält man bei einer Steue-
rung den gewünschten Verlauf der Ausgangsgröße.
Eine spezielle Art der Steuerung ist die Ablaufsteue-
rung. Hierbei liegen Weiterschaltbedingungen vor,
die einen schrittweisen Ablauf der Steuerbefehle
bewirken. Bei der zeitgeführten Ablaufsteuerung
hängen die Weiterschaltbedingungen nur von der
Zeit ab. Ein Beispiel hierfür ist die Steuerung von
Fließinjektionsanalysesystemen, bei denen Ventile
bzw. Pumpen nach einem fest vorgegebenen Zeit-
plan geschaltet werden. Sind die Weiterschaltbe-
dingungen jedoch von Signalen des zu steuernden
Prozesses abhängig, z. B. von einem Signal eines
Schwimmerschalters, so wird diese Steuerungsart
'HUPLWHLQHP
6HQVRUHUPLWWHOWH
,VWZHUWLWGHU
5HJHOJU|‰H

5HJOHU
'HUYRUJHJHEHQH
6ROOZHUWZWGHU
)KUXQJVJU|‰H
 292 B. Hitzmann und T. Scheper

8.4.4 PID-Regler
6WHXHUVWUHFNH $XVJDQJVJU|‰H
6WHOOJOLHG
3UR]HVV
'HUDXV Der PID-Regler (proportional integral derivative)
]XJHEHQGH
6WHOOZHUWXW
GHU6WHOOJU|‰H
6WHXHUXQJV (LQJDQJVJU|‰H
HLQULFKWXQJ
. Abb. 8.30  Schema einer Steuerung; im Gegensatz zur
Regelung ist kein geschlossener Wirkungsablauf vorhanden
als prozessabhängige Ablaufsteuerung bezeichnet.
Mithilfe einer Ablaufsteuerung wird in der Biopro-
zesstechnik z. B. das Mischen von Mediumbestand-
teilen, das Befüllen eines Fermenters sowie das Ste-
rilisieren automatisiert.
8 8.4.3 Zweipunktregler
Den einfachsten Typ eines Reglers stellt der Zwei-
punktregler dar. Er wird z. B. bei Bioprozessen zum
Regeln des pH oder der Temperatur eingesetzt. Wird
beispielsweise bei einer Kultivierung eine vorgege-
bene Temperatur (Grenzwert) überschritten, so hat
dies zur Folge, dass Kühlwasser durch den Mantel
des Reaktors geführt wird. Ist die Temperatur nied-
riger als der Grenzwert, so wird der Reaktor nicht
gekühlt. Somit zeigt der Zweipunktregler ein unste-
tes Verhalten.
Formelmäßig lässt sich dieser Regler wie folgt
beschreiben:
u , e(t ) ≤ 0
u (t ) =  min  Gl. 8.18
umax, e(t ) > 0
 Änderung der Regeldifferenz untersucht. Diese Ände-
e(t) wird die Regeldifferenz oder -abweichung
genannt und ist die Differenz von Sollwert w(t) und
Istwert i(t). umin und umax sind die beiden möglichen
Stellwerte dieses Reglers, d. h. die beiden möglichen
Werte von u(t). Im obigen Beispiel wäre die Pump-
rate des Kühlwassers null, wenn e(t) ≤ 0 ist, hingegen
hätte die Pumprate einen konstanten Wert größer
null für den Fall, dass e(t) > 0 ist. Dieser Reglertyp
ist zwar einfach zu implementieren, wird jedoch in
der Industrie selten verwendet, da er aufgrund seiner
unstetigen Arbeitsweise leicht zu Oszillationen der
Regelgröße führen kann. Die wohl größte Verbrei-
tung in der Industrie finden die PID-Regler.
wurde ursprünglich für die analoge Technik entwi-
ckelt und basiert auf folgender Gleichung:
 
 1 de(t ) 
u (t ) = K ⋅ e(t ) + ∫ t e(τ ) d τ + TD 
 TI 0 dt 
  
 Gl. 8.19
u(t) ist der Stellwert, e(t) die Regeldifferenz. Die
Regelparameter dieser Gleichung werden wie folgt
bezeichnet:
K = Verstärkungsfaktor
TI = Nachstellzeit
TD = Vorhaltezeit
Der Stellwert u(t) ist dabei proportional zu der
Regeldifferenz selbst sowie zu dem Integral und der
Ableitung der Regeldifferenz. Durch die Wahl der
Regelparameter wird der Charakter der Regelung
festgelegt, d. h. ob er proportionales, integrales und/
oder differenzielles Verhalten zeigt. Ist z. B. TD = 0,
so besitzt der Regler nur noch einen proportiona-
len und einen integralen Anteil und wird PI-Reg-
ler genannt. Ein PI-Regler wird insbesondere dann
verwendet, wenn der Istwert der Regelgröße stark
schwankt. Da sich die Steigung der Istwerte in einem
solchen Fall entsprechend stark verändern, würde ein
D-Anteil eine starke Änderung der Stellwerte bewir-
ken, was zu einer instabilen Regelung führt.
Das Verhalten eines Reglers kann durch seine
Sprungantwort charakterisiert werden. Hierbei wird
das Verhalten der Stellgröße bei einer sprungartigen
rung kann z. B. durch Verstellen des Sollwertes hervor-
gerufen werden. In . Abb. 8.31 ist die Sprungantwort
eines P-Reglers (d. h. TI = ∞, TD = 0) für unterschied-
liche Regeldifferenzen (e1 < e2 < e3) dargestellt.
Wie in . Abb. 8.31 zu erkennen ist, besteht beim
P-Regler zwischen einem Wert der Regeldifferenz
und dem entsprechenden Stellwert ein proportio-
naler Zusammenhang. Jedem Wert der Regeldiffe-
renz kann somit ein bestimmter Stellwert zugeord-
net werden, der sich nicht ändert. Dies ist bei einem
PI- oder einem I-Regler nicht möglich. Diese Regler
zeigen eine Stellgrößenänderung bei einem festen
von null abweichenden Wert der Regeldifferenz, d. h.
 Kapitel 8 · Bioprozessanalytik und -steuerung
293 8
Rechtecken), der Differenzialquotient durch eine Dif-
ferenz angenähert. Der Regelalgorithmus lautet dann:
H
5HJHOGLIIHUHQ]HW

 T K −1 
H u (k ) = K ⋅ e(k ) + A ∑ e(i)
TI i = 0
 
H
 e ( k ) − e ( k − 1)
H + T  Gl. 8.20
 D
T 
 A 
W =HLW
Hierbei sind u(k) und e(k) die zum Zeitpunkt t = k
· TA diskretisierten Werte von u(t) und e(t). Bei der
Verarbeitung mit einem Computer ist ein rekursi-
X ver Algorithmus einfacher zu implementieren. Um
diesen zu erhalten, wird die Differenz aufeinander-
folgender Stellwerte berechnet:
6WHOOJU|‰HXW

X

∆u = u (k ) − u ⋅ (k −1) = q0 ⋅ e(k ) + q1⋅ e ⋅ (k −1)

X
+ q2 ⋅ e ⋅ (k − 2)
X
 Gl. 8.21

W =HLW Hierbei wurden die folgenden neuen Parameter

eingeführt:
. Abb. 8.31  Sprungantwort von P-Reglern bei
unterschiedlichen Regeldifferenzen (e1 < e2 < e3)  T 
q0 = K ⋅ 1 + D   Gl. 8.22
 TA 
diese Regler bewirken solange eine Änderung des
Stellwertes, bis der Istwert mit dem Sollwert überein-  T T 
q1 = −K ⋅ 1 + 2 ⋅ D − A   Gl. 8.23
stimmt. Dieser Zusammenhang ist für die Sprung-  TA TI 
antwort dieser Regler in . Abb. 8.32 dargestellt; die
Nachstellzeit (TI) des I-Reglers ist ebenfalls einge- TD
q2 = K ⋅  Gl. 8.24
zeichnet. Wie in der Abbildung zu erkennen ist, TA
müsste der reine I-Regler um die Nachstellzeit früher
eingreifen als der PI-Regler, wenn er die gleiche
Wirkung erzielen soll. Der Einfluss der Nachstell-
zeit auf einen I-Regler ist aus der Gleichung des PID- 8.4.6 Einstellung von
Reglers leicht abzuleiten: Je kleiner die Nachstellzeit Regelparametern
ist, desto größer wird die Steigung der Stellgröße und
damit der I-Anteil eines PI-Reglers. Wenn die Dynamik und die Störeinflüsse eines Pro-
zesses bekannt wären, könnten die optimalen Para-
meter eines Reglers theoretisch berechnet werden.
8.4.5 Digitale PID-Regler Mit dem vorhandenen Wissen über den Prozess
muss ein mathematisches Modell der Regelstrecke
Aufgrund der weiten Verbreitung von PID-Reg- erstellt werden. In der Praxis ist dies jedoch meist
lern wurde sehr viel Know-how über sie gesammelt. sehr schwierig und auch zeitaufwendig. Ist aber ein
Derzeit werden nur noch digitale PID-Regler imple- Modell vorhanden, können der Reglertyp sowie
mentiert. Hierbei kann für kleine Abtastzeiten TA die die Reglerparameter basierend auf diesem Modell
Gleichung des analogen PID-Reglers durch Diskreti- ermittelt werden. Der Regler wird dann mit Hilfe von
sierung direkt in eine Differenzengleichung umgewan- Simulationen des gesamten Regelkreises in unter-
delt werden. Das Integral wird durch eine Summe (von schiedlichen Situationen getestet und optimiert.
 294 B. Hitzmann und T. Scheper

übernommen werden. Mithilfe der oben aufgeführ-

5HJHOGLIIHUHQ]HW

ten Umrechnung können dann die entsprechenden

H Parameter des digitalen Reglers berechnet werden.
H
Bei diesen Verfahren nutzt man nicht so sehr theo-
retisches Wissen, sondern führt Experimente durch.
H
Ein Verfahren basiert auf der Analyse des Antwort-
H
verhaltens der Regelstrecke (des Prozesses) auf
W =HLW eine stufenförmige Änderung der Werte der Stell-
größe (Stufenfunktion, Sprungfunktion). Der Wert
der Stellgröße wurde hierfür zu einem Zeitpunkt t0
7
sprunghaft von S0 auf S1 erhöht. Um das Antwortver-
halten des Regelkreises auf diese Stellgrößenände-
X rung zu messen, darf er natürlich nicht geschlossen
sein, d. h. die Regelstrecke wird vom Regler gelöst.
6WHOOJU|‰HXW
X
X
8 X
X
X
X
W =HLW
. Abb. 8.32  Sprungantwort des PI-Reglers
(durchgezogene Kurven) und des reinen I-Reglers (punktierte
Kurven) bei unterschiedlichen Regeldifferenzen (e1 < e2 < e3)
Hierbei kann es sich aber durchaus zeigen, dass
selbst das Modell und/oder der Reglertyp verändert
werden müssen. Die Güte des so erhaltenen Reglers
ist natürlich von der Güte des Modells abhängig.
Aufgrund der weiten Verbreitung des analo-
gen PID-Reglers sind hierfür verschiedene heuris-
tische Verfahren (empirische Einstellregeln) entwi-
ckelt worden. Wenn die Abtastzeiten der Messgrößen
des digitalen PID-Reglers klein sind, ist sein Verhal-
ten dem des analogen PID-Reglers sehr ähnlich.
Somit können die heuristischen Verfahren zur
Parametereinstellung auch für digitale PID-Regler
. Abb. 8.33  Verhalten einer
Regelstrecke auf eine stufenförmige
Änderung der Stellwerte bei einem
offenen Regelreis
In . Abb. 8.33 ist ein Schema dieser Untersuchung
dargestellt. Die von der Regelstrecke aufgezeichnete
Sprungantwort wird auch als Übergangsfunktion
bezeichnet.
Das in . Abb. 8.33 dargestellte Antwortsignal
hat einen sigmoiden Verlauf, der für viele Prozesse
typisch ist und annähernd dem Verhalten eines Pro-
zesses erster Ordnung, d. h. eines Prozesses, der
durch eine Differentialgleichung erster Ordnung
beschrieben wird, mit Totzeit entspricht.
Mit Hilfe der Stufenantwort der Regelstre-
cke werden zwei Zeiten ermittelt: die Ersatztotzeit
(Tt) und die Ersatzzeitkonstante (τk). Diese Zeiten
ergeben sich aus den Schnittpunkten der Tangente,
die durch den Wendepunkt der Sprungantwort
festgelegt ist, mit zwei Parallelen zur Abszisse, die
durch den Anfangs- und Endwert der Sprungant-
wort bestimmt sind. In . Abb. 8.34 ist die Ermittlung
der Ersatztotzeit und der Ersatzzeitkonstante sche-
matisch dargestellt. Mit Hilfe von Verfahren können
die Regelparameter aus den so ermittelten Größen
berechnet werden. In . Tab. 8.4 sind die jeweili-
gen Berechnungsformeln für die unterschiedlichen
Regler aufgeführt, die von Ziegler und Nichols auf-
gestellt wurden.
Kapitel 8 · Bioprozessanalytik und -steuerung
295 8

. Abb. 8.34  Die Bestimmung der Ersatztotzeit (Tt) und der Ersatzzeitkonstanten (τk) aus dem Signal der Stufenantwort einer
Regelstrecke

basiert entworfen – wird je nach individueller Gege-

. Tab. 8.4  Berechnungsformeln für die
benheit eines Prozesses nach bestimmten Kriterien
Regelparameter basierend auf der Auswertung einer
Stufenantwort durchgeführt.
Die Güte eines Reglers kann nicht generell,
Regler K TI TD sondern muss immer für die jeweiligen individuel-
len Gegebenheiten eines Prozesses beurteilt werden.
P τ K S1 − S0 – –
In jedem Fall muss aber als Mindestanforderung die
Tt A1 − A0
Stabilität eines jeden Regelkreises gesichert sein. Für
PI τ K S1 − S0 3,33 · Tt – die Stabilität gibt es unterschiedliche Kriterien. Das
0, 9
Tt A1 − A0 BIBO-Stabilitätskriterium (BIBO: Bounded Input –
Bounded Output) besagt, dass dann ein stabiler
Prozess vorliegt, wenn jedes beschränkte Eingangs-
PID τ K S1 − S0 2 · Tt 0,5 · Tt signal eines Prozesses zu einem beschränkten Ant-
1, 2
Tt A1 − A0 wortsignal der Ausgangsgröße führt.
Neben der allgemeinen Forderung, dass ein
Regelkreis stabil sein soll, gibt es eine Vielzahl unter-
Die mit den Parametern aus . Tab. 8.4 einge- schiedlicher Gütekriterien. Der Regler soll z. B. so
stellten Regler müssen meist noch am eigentli- ausgelegt werden, dass
chen Prozess optimiert werden. Ebenso werden 55 ein sich zeitlich ändernder Sollwert der
diese Parameter auch als Startwerte verwendet, Führungsgröße möglichst schnell vom Istwert
um einen Regelkreis mit Hilfe einer Simulation zu der Regelgröße erreicht wird.
optimieren. Wie schon erwähnt, ist aber hierfür 55 Störgrößen einen möglichst geringen Einfluss
ein brauchbares mathematisches Modell der Regel- auf die Regelgröße ausüben.
strecke notwendig. Die Beurteilung der Güte eines 55 die maximale Regeldifferenz so klein wie
Reglers – ob rein experimentell oder durch Modell möglich wird.
 296 B. Hitzmann und T. Scheper
55 die bleibende Regeldifferenz minimal wird.
55 ein möglichst geringes Überschwingen auftritt.
55 das Integral der absoluten Regeldifferenz oder
seines Quadrates minimal wird.
Dabei können häufig nicht mehrere Kriterien gleich-
zeitig erfüllt werden, sodass meist ein Kompromiss
notwendig ist. Will man z. B. einen Regler haben, der
dafür sorgt, dass ein Sollwert nach seiner Änderung
möglichst schnell erreicht wird, so muss wahrschein-
lich ein Überschwingen in Kauf genommen werden.
Um die Güte eines Reglers auf eine Stellgrößenände-
rung beurteilen zu können, wurden folgende charak-
teristische Kenngrößen im Antwortsignal definiert:
55 Die Verzugszeit wird festgelegt durch den
Schnittpunkt der ersten Wendetangente des
Antwortsignals mit der Parallelen zur Abszisse
8 (Zeitachse), die durch den Anfangswert der
Regelgröße bestimmt ist.
55 Die Anstiegszeit ergibt sich aus der Differenz
zweier Schnittpunkte der Wendetangente mit
zwei Parallelen zur Abszisse, die durch den
Anfangswert und Endwert der Regelgröße
bestimmt sind.
55 Die Anregelzeit ist definiert als der Zeitpunkt,
bei dem der Istwert der Regelgröße das erste
Mal mit dem Sollwert identisch ist.
55 Die Ausregelzeit ist festgelegt durch ein dauer-
haftes Erreichen eines Intervalls um den Sollwert.
55 Die maximale Überschwingweite gibt den
maximalen Wert der Regelabweichung an, der
nach erstmaligem Erreichen des Sollwertes
auftritt.
In . Abb. 8.35 sind einige dieser Kenngrößen in das
Antwortsignal eines geschlossenen Regelkreises ein-
gezeichnet, das nach einer Sollwertänderung regis-
triert wurde.
Je nach Anforderungen des jeweiligen Prozesses
kann es notwendig sein, für eine dieser charakteris-
tischen Kenngrößen ein Minimum zu gewährleisten
oder aber für mehrere Kenngrößen gleichzeitig einen
akzeptablen Kompromiss zu finden. Je nachdem, ob
ein gutes Führungsverhalten oder ein gutes Störver-
halten des Reglers bei einem Prozess gefordert ist,
sind unterschiedliche Werte der Regelparameter ein-
zustellen. So ist es für ein gutes Führungsverhalten
notwendig, dass der Regler nach einer Änderung des
Sollwertes den Stellwert so anpasst, dass der Wert
der Regelgröße dem des Sollwertes möglichst schnell
entspricht.
8.4.7 Alternative Reglerkonzepte
In den letzten Jahren wurden unterschiedliche Reg-
lerkonzepte für die Bioprozesstechnik veröffentlicht,
jedoch wurden die meisten nicht bei realen Prozess-
anwendungen sondern mit Hilfe von Simulationen
getestet [7]. Die überwiegende Anzahl an Applika-
tionen nutzen Kombinationen von Softwaresenso-
ren mit einem PID-Regler [3]. Dies unterstreicht die
Bedeutung der Bioprozessanalytik für die Regelung,
die direkte Messmethoden für robuste Sensoren zur
Istwertbestimmung zur Verfügung stellen muss. Um
dem dynamischen Verhalten von Kultivierungspro-
zessen Rechnung zu tragen, kommen Parameter-ad-
aptive Regler zur Anwendung, die in Abhängigkeit
der aktuellen Prozessphase einer Kultivierung unter-
schiedliche Regelparameter verwenden.
Bei der modellbasierten prädiktiven Regelung
wird ein dynamisches Prozessmodell genutzt, mit
dem der mögliche zukünftige Verlauf des Prozesses
bis zu einem vorher definierten Prädiktionshori-
zont in Abhängigkeit von unterschiedlichen Werten
der Führungsgröße simuliert wird. Basierend auf
einem Optimierungsalgorithmus wird der optimale
Verlauf der Führungsgröße in Echtzeit ermittelt und
entsprechend beim realen Prozess eingestellt. Somit
wird das erforderliche Prozessmodell auch während
des laufenden Prozesses genutzt, um der Situation
angepasst optimale Stellwerte zu berechnen. Diese
Regelungsstrategie, die auch eine Mehrgrößenrege-
lung ermöglicht, erfordert deshalb neben der extrem
hohen Rechenleistung des Computers ein hinrei-
chend genaues Prozessmodell. Dieses ist jedoch nicht
immer verfügbar. Deshalb sind hybride Regelsysteme
entwickelt worden, die theoretische Modelle mit Ver-
fahren der Fuzzy Logik und/oder künstlichen neuro-
nalen Netzwerken kombinieren.
Aber auch reine Fuzzy-Regler werden zur Rege-
lung von Kultivierungsprozessen angewendet.
Sie nutzen das vorhandene Erfahrungswissen des
Bedienpersonals in Form von Wenn-dann-Regeln,
Kapitel 8 · Bioprozessanalytik und -steuerung
297 8
PD[LPDOH 55 robustes Verhalten des Reglers gegenüber
hEHUVFKZLQJZHLWH Änderungen der Streckenparameter, des
Sollwerts sowie von Störungen.
$QWZRUW

6ROOZHUW
Für die Implementierung von Fuzzy-Reglern sind
jedoch keine systematischen Entwurfsverfahren
vorhanden und eine Stabilitätsanalyse ist schwierig.

Literatur
$QUHJHO]HLW $XVUHJHO]HLW =HLW
[1] Glindkamp A, Riechers D, Rehbock C, Hitzmann B, Sche-
. Abb. 8.35  Charakteristische Kenngrößen zur Beurteilung per T, Reardon KF (2009) Sensors in disposable bioreac-
von Reglern aufgrund ihres Antwortverhaltens tors status and trends. Adv Biochem Engin/Biotechnol
115:145‒169
die in einer Regelbasis im Computer abgelegt sind. [2] Junker BH, Wang HY. (2006): Bioprocess monitoring
and computer control: Key roots of the current PAT
Dabei wird der Stellwert nach Auswertung der Regel-
initiative. Biotechnol Bioeng 95(2):226-261. https://doi.
basis zyklisch bestimmt. In den Prämissen der Regeln org/10.1002/bit 21087
werden die Werte von Prozessgrößen den unscharfen [3] Klockow C, Hüll D, Hitzmann B. (2008) Model based subst-
Mengen (Fuzzy-Mengen) z. B. „niedrig“, „normal“, rate set point control of yeast cultivation processes based
„hoch“ oder „sehr hoch“ über Zugehörigkeitsfunk- on FIA measurements. Analytica Chimica Acta 623:30‒37
[4] Landgrebe D, Haake C, Höpfner T, Beutel S, Hitzmann B,
tionen zugeordnet. Die Istwerte der Regelgröße
Scheper T, Rhiel M, Reardon KF (2010) On-line infrared
werden mit Hilfe dieser Fuzzy-Mengen, Zugehö- spectroscopy for bioprocess monitoring. Appl Microbiol
rigkeitsfunktionen und der Fuzzy-Logik in drei Biotechnol 88:11–22
Phasen (Aggregation, Implikation und Akkumula- [5] Oliveira FRP, Goldberg K, Liese A, Hitzmann B. (2008)
tion) zyklisch verarbeitet. Der Wahrheitswert aller Chemometric modelling for process analyzers using
just a single calibration sample. Chemometr Intell Lab
Regeln der gesamten Regelbasis wird in der Aggre-
94:118‒122
gations-Phase ermittelt. Während der Implikation [6] Rudolph G, Lindner P, Bluma A, Joeris K, Martinez G, Hitz-
wird die Konklusion aller Regeln berechnet und in mann B, Scheper T. (2009) Optical inline measurement
der Akkumulations-Phase das Gesamtergebnis der procedures for counting and sizing cells in bioprocess
Regelbasis bestimmt. Diese Vorgehensweise erlaubt technology. Adv Biochem Engin/Biotechnol 116:125‒142
[7] Stanke M, Hitzmann B (2013) Automatic control of bio-
ein approximatives und unscharfes Schließen (Fuz-
processes. Adv in Biochem Engin/Biotechnol 132:35–63
zy-Inferenz), was dem Vorgehen von menschlichen
Experten sehr ähnlich ist. Eine Mehrgrößenregelung
ist ohne großen Aufwand zu realisieren. Da Stellglie-
der einen definierten Wert für die Stellgröße benöti-
gen, wird dieser im Rahmen einer Defuzzyfizierung
berechnet. Vorteile der Fuzzy-Regler sind:
55 das vorhandene Erfahrungswissen des Bedien-
personals kann direkt für die Regelung genutzt
werden,
55 kein mathematisches Modell ist erforderlich,
55 kürzere Entwicklungszeit zur Erstellung des
Regelalgorithmus werden benötigt,
55 keine teuren Messungen für die Modellbildung
und Parameteridentifikation sind notwendig,
55 Berücksichtigung vieler Messgrößen zur
Festlegung der Stellgröße ist einfach möglich
und
 299 9

Aufarbeitung (Downstream
Processing)
Horst Chmiel

9.1 Zellernte – 301

9.1.1 Sedimentation/Zentrifugation – 301
9.1.2 Filtration – 304

9.2 Zellaufschluss – 309

9.2.1 Kugelmühlen – 310
9.2.2 Hydrodynamischer Zellaufschluss – 312
9.2.3 Physiko-chemische und enzymatische Zelllyse – 316
9.2.4 Wahl des geeigneten Zellaufschlussverfahrens – 317

9.3 Produktisolation, -konzentrierung und -reinigung – 317

9.3.1 Präzipitation – 318
9.3.2 Kristallisation – 324
9.3.3 Flotation und Schaumseparation – 332
9.3.4 Membranseparation – 335
9.3.5 Solventextraktion – 359
9.3.6 Elektrokinetische Trennverfahren – 372
9.3.7 Adsorptive/Chromatographische Trennverfahren – 375

9.4 Trocknungsverfahren in der Bioprozesstechnik – 392

9.4.1 Grundlagen der Trocknungstechnologie – 392
9.4.2 Wichtige Trocknungsverfahren in der Bioprozesstechnik – 394
9.4.3 Weitere Einflussfaktoren bei der Trocknung
von Mikroorganismen – 397

Literatur – 397

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2018

H. Chmiel, R. Takors, D. Weuster-Botz (Hrsg.), Bioprozesstechnik,
https://doi.org/10.1007/978-3-662-54042-8_9
 300 H. Chmiel
Biokatalysatoren – gleichgültig, ob in Form von
Enzymen, Prokaryoten oder Eukaryoten – haben sich
als wesentlich spezifischer und damit wirkungsvol-
ler als irgendein anorganischer Katalysator erwiesen.
Wegen ihres begrenzten Temperatureinsatzbereiches
– für die meisten von ihnen wirken Temperaturen über
50 °C bereits deaktivierend – und weil sie in der Regel
nur in verdünnten wässrigen Systemen agieren, büßen
sie aber einen großen Teil dieses Vorteils wieder ein.
Hohe Kosten (für Enzyme) bzw. geringe Wachstums-
geschwindigkeiten (bei Prokaryoten und insbesondere
Eukaryoten) tun ein Übriges.
Ein wesentlicher Nachteil biotechnischer Pro-
zesse ist schließlich, dass das Produkt in verdünnter
wässriger Lösung anfällt und dass es häufig bereits
in relativ geringer Konzentration inhibierend wirkt.
. Abb. 9.1  Verfahrensschema eines
Bioprozesses. WT = Wärmetauscher,
MF = Mikrofiltration,
9 UF = Ultrafiltration
Soll unter diesen Umständen der biotechnische
Prozess mit dem chemischen konkurrenzfähig sein,
so müssen diese Randbedingungen berücksichtigt
werden. In der Regel wird daher wenn möglich eine
repeated fed-batch oder kontinuierliche Verfahrens-
weise angestrebt, und die Betrachtung darf sich kei-
nesfalls auf den Bioprozess beschränken. Vielmehr
muss die Optimierung sich über den Gesamtpro-
zess erstrecken, dazu gehören unter anderem die
Medienvorbereitung, die Sterilfiltration, das Abwas-
ser- und Abfallproblem und insbesondere die Pro-
duktaufarbeitung (siehe schematische Darstellung
in . Abb. 9.1).
Im Englischen haben sich hierfür die Termini
upstream und downstream processing eingebür-
gert.
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
301 9
Die Produktaufarbeitung mit den Schritten
55 Zellabtrennung,
55 Zellaufschluss (wenn Produkt intrazellulär
vorliegt),
55 Produktgewinnung und
Produktkonzentrierung,
55 Produktreinigung und
55 Konfektionierung

hat in der Regel einen Anteil, der mehr als die Hälfte
der Gesamtproduktkosten beträgt. Das trifft besonders
für Proteinwirkstoffe zu. Ziel muss also die Reduktion
der Kosten für die Produktaufarbeitung sein.
Das Auslaufen von Patenten biotechnisch gewon-
nener Pharmaprodukte lässt eine Flut von ­Generika
erwarten. Der Druck, schnell auf den Markt zu
kommen (time-to-market pressure), zwingt zur par-
allelen Entwicklung von Produktions- und Aufarbei-
tungsprozessen. Dabei muss eine riesige Zahl von
Parametern optimiert werden. Hilfe erwartet man
. Abb. 9.2  Schema für die Bioproduktaufarbeitung
sich bei der Optimierung der Produktaufarbeitungs-
prozesse von der modellbasierten Hybridprozess-
entwicklung unter Nutzung von Hochdurchsatzex- Die beiden erstgenannten haben als Trennprinzip
perimenten, wie sie bereits in 7 Abschn. 6.4 für die den Dichteunterschied zwischen fester und flüssi-
Bioprozessentwicklung vorgestellt wurden. ger Phase, wobei man die Sedimentation als Sonder-
Die Wahl der geeigneten Aufarbeitungsverfah- fall der Zentrifugation ansehen kann. Sie sollen daher
ren richtet sich nach der Art und Weise, in der das gemeinsam behandelt werden.
Produkt anfällt. Handelt es sich um einen enzymati-
schen Prozess oder um ein extrazelluläres Produkt,
so sollte der Biokatalysator im Reaktor verbleiben, 9.1.1 Sedimentation/Zentrifugation
d. h. das entstehende Produkt kontinuierlich mög-
lichst selektiv entfernt werden. Zur Beschreibung von Sedimentationsvorgängen
Liegt das Produkt dagegen intrazellulär vor, erfolgt wird das Stokes’sche Gesetz herangezogen. Danach
zunächst die Zellernte. Das intrazelluläre Produkt (in errechnet sich die Sedimentationsgeschwindigkeit
der Regel ein Protein) muss durch Zellaufschluss vs von kugeligen Partikeln im Bereich niedriger Rey-
freigelegt und die Zelltrümmer müssen abgetrennt noldszahlen (<0,25) zu
werden, bevor die Aufarbeitung analog der der extra-
zellulären Produkte erfolgen kann (. Abb. 9.2). d p2 ⋅ ∆ρ ⋅ g
vs=  Gl.9.1
18 ⋅ η

9.1 Zellernte und unter Einfluss einer Zentrifugalbeschleunigung

r · ω2 ist
Grundsätzlich kann die Abtrennung der Zellen aus
der Fermentationsbrühe auf verschiedene Weise d p2 ⋅ ∆ρ
vz = ⋅ r ⋅ ω2  Gl. 9.2
erfolgen, nämlich durch 18 ⋅ η
55 Sedimentation,
55 Zentrifugation, 55 dp = Partikeldurchmesser
55 Filtration. 55 ∆ρ = Dichtedifferenz
 302 H. Chmiel
55 g = Erdbeschleunigung
55 η = dynamische Viskosität der Trägerflüssigkeit
55 r = Abstand des beschleunigten Teilchens von
der Drehachse
55 ω = Winkelgeschwindigkeit der
Zentrifugentrommel
Man erkennt daraus die Bedeutung der beiden Para-
meter Dichtedifferenz zwischen Trägerflüssigkeit
und abzuscheidender Partikel sowie Partikeldurch-
messer. Je kleiner die Dichtedifferenz bzw. der Parti-
keldurchmesser, umso geringer wird die Sedimenta-
tionsgeschwindigkeit und umso schwieriger wird die
Abscheidung, wobei der Partikeldurchmesser sogar
quadratisch eingeht.
Insbesondere für die Abscheidung von Mikro-
organismen im Bereich biotechnologischer Auf-
arbeitungsverfahren scheidet die Sedimentation im
Erdschwerefeld in der Regel aus. Statt Sedimenta-
tionsgeschwindigkeiten in der Größenordnung von
9 1–10 mm in 24 Stunden nutzt man das Zentrifugal-
feld zur Beschleunigung des Absetzvorgangs um das
103- bis 104-fache analog dem Verhältnis
r ⋅ω 2 
Z= Gl. 9.3
g chen Zentrifuge mit neunfachem Durchfluss gefah-
für eine effektive Zellabscheidung.
Brunner [24] hat den Absetzvorgang von Partikeln
im Spalt von Tellerseparatoren untersucht. Unter einer
Reihe von vereinfachenden Annahmen zur Hydrody-
namik im Spalt, der Form der Partikel und eines schlupf-
freien Transports in der Strömung sowie der Überle-
gung, dass Partikel dann sicher abgeschieden sind, wenn
ihre Aufenthaltszeit im Tellerspalt größer/gleich ihrer
Sedimentationszeit (h = Tellerabstand) ist, lässt sich für
einen bestimmten Partikeldurchmesser dp der maxi-
male Durchsatz Q bei vollständiger Abscheidung fol-
gendermaßen berechnen. Ist das Gesamtvolumen aller
Tellerspalte VT = AT · h · NT mit der Mantelfläche
2 ⋅ π (ra3 − ri3)
AT =
3 ⋅ ra tan Θ
wobei ra = äußerer Tellerradius, ri = innerer Teller-
radius, θ = halber Öffnungswinkel des Tellerkonus,
NT = Zahl der Tellerspalte, dann ergibt sich für die
Verweilzeit
V
τ = T
Q
und bei einer Betrachtung des Einzelspaltes für die
Sedimentation
h 
t= Gl. 9.4
vz
Gleichsetzen von t und τ und Übertragung auf das
Tellerpaket mit Nt Tellern liefert die Beziehung:
2 ⋅ π (ra3 − ri3 ) ⋅ N T ra ⋅ ω 2 dp2 ⋅∆ρ ⋅ g
Q = ⋅ ⋅
3 ⋅ ra ⋅ tanΘ  g 18 η
⋅


AT Z vs
 Gl. 9.5
Hierin ist AT · Z die sogenannte äquivalente Klärflä-
che, die alle apparatespezifischen Parameter enthält;
im Gegensatz zu der Sedimentationsgeschwindigkeit
vs, die alle produktbezogenen Parameter einschließt.
Aus Gl. 9.5 lässt sich errechnen, dass z. B. im Ver-
gleich zu einer E. coli-Suspension (dp,min = 0,8 µm)
eine Hefesuspension (dp,min = 2,4 µm) – wegen des
quadratischen Einflusses von dp auf vs – in der glei-
ren werden kann [24].
Die äquivalente Klärfläche dient zur Maßstabs-
übertragung bei der Zentrifugenauslegung bei kon-
stanten Produkteigenschaften.
In den . Abb. 9.3–9.5 sind einige Grundformen
von Zentrifugen dargestellt. . Abb. 9.3 zeigt diskon-
tinuierlich arbeitende Zentrifugen. Dabei besitzt die
heute noch häufig im Labor verwendete Röhrenzen-
trifuge (. Abb. 9.3a) die geringste Klärfläche.
Tellerseparatoren (. Abb. 9.4) haben durch die
Vielzahl der im Abstand von 0,3–2 mm angeordneten
Teller nicht nur große Klärflächen sondern ermögli-
chen durch die konische Gestaltung den zyklischen
(. Abb. 9.4a) oder kontinuierlichen (.  Abb. 9.4b)
Feststoffaustrag.
Bei dem Separator in . Abb. 9.4a geschieht die
Selbstentleerung durch zyklisches Öffnen der geteil-
ten Trommel über Kolbenventil und Kolbenschieber.
Bei hohem Feststoffanteil empfiehlt sich der Düsen-
separator (. Abb. 9.4b).
Der Tellerseparator ist heute in der Biotechno-
logie die für die Zellernte am häufigsten verwendete
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
. Abb. 9.3  Diskontinuierlich arbeitende Zentrifugen: (a)
Röhrentrommel; (b) Kammertrommel
303 9
Zentrifuge, mit wirksamen Klärflächen bis zu
300.000 m2 und einem Durchfluss für E. coli bis zu
8 m3/h [23]. Aufgrund des geringen Tellerabstands
gelangt dieser Separator bei hohen Zellkonzentra-
tionen an seine Grenzen. Dies ist die Domäne des
Dekanters.
Der Dekanter, eine horizontal gelagerte Schne-
ckenzentrifuge mit zylindrisch-konischer Vollman-
teltrommel (. Abb. 9.5), erreicht den kontinuierli-
chen Austrag der abzentrifugierten Zellen durch eine
Differenz der Drehzahl der Förderschnecke gegen-
über derjenigen der Trommel. Wegen seines ver-
gleichsweise geringen Beschleunigungsverhältnisses
Z wird er vor allem zur Konzentrierung von Zellsus-
pensionen und zum Entwässern von Schlämmen ein-
gesetzt. In einer Sonderbauform, dem sogen. Trikan-
ter, lassen sich auch drei Phasen (flüssig/flüssig/fest)
voneinander kontinuierlich trennen.

. Abb. 9.4  Durch periodisches Öffnen der geteilten Trommel (a) bzw. über Düsen (b) selbstentleerende Tellerrseparatoren
(mit freundlicher Genehmigung der Fa. GEA Westfalia Separatoren GmbH)

. Abb. 9.5  Dekanter für die Abtrennung von Zellen (mit freundlicher Genehmigung der Fa. Flottweg)
 304 H. Chmiel
Beispiele für den Einsatz von Zentrifugen in der
Produktaufarbeitung finden sich in 7 Kap. 11 und 12.
9.1.2 Filtration
Die Abtrennung von Partikeln aus einer fluiden
Phase (Gas und Flüssigkeit) mittels poröser Gebilde
bezeichnet man bekanntlich als Filtration. Die viel-
fältigen Filtrationsverfahren versucht Scheuermann
[104] nach verschiedenen Unterscheidungskriterien
zu ordnen, wie z. B. nach
55 trennender Kraft (Über- und Unterdruck),
55 Teilchengröße (Fein- oder Grobfiltration),
55 Abscheidungsmechanismus (Sieb-,
Oberflächen- oder Tiefenfiltration),
55 Verfahren (statische oder dynamische
Filtration),
55 Aufgabe (Vor- oder Sterilfiltration).
9 In der Tat begegnen einem in der biotechnischen
Fachliteratur all diese Begriffe; es sei nur auf die ver-
schiedenen Sterilfilter up- und downstream des Bio-
prozesses (. Abb. 9.1) hingewiesen.
Für die Abtrennung von Zellen aus der flüssigen
Phase mit dem Ziel der Produktgewinnung (Zell-
ernte) muss eine hohe Zelldichte erreicht werden
(weitgehende Entfernung der wässrigen Phase).
Hierfür ist die Filtration dann der Zentrifuge
überlegen, wenn der Dichteunterschied zwischen
. Abb. 9.6  Abscheidungsmechanis-
men bei der dead-end-Filtration: (a)
Siebfiltration; (b) Oberflächenfiltration;
(c) Tiefenfiltration; (d) Vergrößerung
(nach [102])
abzutrennenden Schwebstoffen und flüssiger Phase
gering (Energiekosten) oder der zu behandelnde
Flüssigkeitsstrom klein ist (Investitionskosten).
Es wird in der Regel orthogonal oder quasi ortho-
gonal zum Stützmaterial, d. h. dead-end filtriert.
Gemäß . Abb. 9.6 unterscheidet man die fol-
genden Abscheidungsmechanismen:
Bei der Siebfiltration (. Abb. 9.6a) übernimmt
ein Sieb, Vlies oder Gewebe, mit Poren kleiner oder
gleich dem Durchmesser der Partikel, die Aufgabe
der Rückhaltung. Sie kommt hauptsächlich für die
Abscheidung geringer Partikelmengen und insbe-
sondere faseriger Stoffe, also beispielsweise zur Vor-
filtration, zum Einsatz. Adsorption gelöster Stoffe am
Filtermaterial ist nicht erwünscht.
Bei der Oberflächenfiltration (. Abb. 9.6b) hat
das Stützmaterial (Gewebe, Filz etc.) vor allem die
Aufgabe, das Filtermittel (z. B. Kieselgur oder Cellu-
losefasern) so zurückzuhalten, dass dieses, nach einer
möglichst kurzen Anfahrphase, die eigentliche Filter-
funktion übernehmen kann. Der sogenannte Trüblauf
während dieser Anfahrphase wird verworfen oder zum
Unfiltrat zurückgeführt. Adsorption gelöster Stoffe am
Filterhilfsmittel (z. B. Proteine bei der Bierfiltration)
ist erwünscht. Das Verfahren arbeitet in der Regel im
batch-Betrieb. Da die Konzentration an abzutrennen-
den Partikeln in der Suspension relativ hoch ist, nimmt
bei konstantem Fluss der Filtrationsdruck zu. Wird ein
vorgegebener Druck überschritten, wird die Filtration
unterbrochen und der Filter zurückgespült.
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
Bei der Oberflächenfiltration (. Abb. 9.6b) hat
das Stützmaterial (Gewebe, Filz etc.) vor allem die
Aufgabe, das Filtermittel (z. B. Kieselgur oder Cel-
lulosefasern) so zurückzuhalten, dass dieses, nach
einer möglichst kurzen Anfahrphase, die eigentliche
Filterfunktion übernehmen kann. Der sogenannte
Trüblauf während dieser Anfahrphase wird verwor-
fen oder zum Unfiltrat zurückgeführt. Adsorption
gelöster Stoffe am Filterhilfsmittel (z. B. Proteine
bei der Bierfiltration) ist erwünscht. Das Verfah-
ren arbeitet in der Regel im batch-Betrieb. Da die
Konzentration an abzutrennenden Partikeln in der
Suspension relativ hoch ist, nimmt bei konstantem
Fluss der Filtrationsdruck zu. Wird ein vorgegebener
Druck überschritten, wird die Filtration unterbro-
chen und der Filter zurückgespült. Eine kontinuier-
liche Arbeitsweise kann durch eine rotierende Filter-
trommel oder ein Bandfilter erzielt werden; darauf
wird später eingegangen.
Die Tiefenfiltration (. Abb. 9.6c) eignet sich zur
Abtrennung kleiner bis mittlerer Partikel (Bakterien,
Hefen) und bei geringen Partikelkonzentrationen.
Auf dem Stützmaterial werden möglichst kugel-
förmige Partikel gleichen Durchmessers als Filter-
mittel angeschwemmt. In den Hohlräumen dieses
Anschwemmfilters lagern sich die wesentlich klei-
neren, abzutrennenden Partikel ab (. Abb. 9.6d).
Der Tiefenfilter muss dann zurückgespült werden,
wenn es zum Durchbruch der Partikel durch den
Filter kommt, d. h. wenn im Wesentlichen alle Hohl-
räume im Anschwemmfilter belegt sind (. Abb. 9.6c).
Adsorption von Partikeln und gelösten Stoffen (ins-
besondere Proteine) ist zwar nicht erwünscht, aber
leider bei dieser konventionellen Filtertechnik kaum
zu vermeiden.
Zur Beschreibung der Durchströmung von Tie-
fenfiltern hat sich das Gesetz von Darcy bewährt:
v⋅η
∆p =  Gl. 9.6
RD
wonach der Druckverlust Δp der Strömungsge-
schwindigkeit v und der dynamischen Viskosität η
proportional und dem Filterwiderstand RD umge-
kehrt proportional ist.
Carman und Kozeny erweiterten Gl. 9.6 derart,
dass auch die spezifische Oberfläche as und die Poro-
sität εp des Schüttbetts mit einbezogen werden.
305 9
( )
∆p = v ⋅ L ⋅ η ⋅ as2 ⋅ f εp  Gl. 9.7
Die Porositätsfunktion f(εp) ist nach Carman und
Kozeny
2
(1− εp)
( )
f εp = RK ⋅
εp3
Bei der Annahme, dass die durchströmte Schicht aus
starren Partikeln mit einen Durchmesser d < 10 mm
besteht, kann RK = 5 gesetzt werden [107]. Leider
nimmt bei der konventionellen Filtertechnik die
Porosität durch Adsorption von gelösten Stoffen
und kleinen Partikeln laufend ab. Dies führt zu einem
starken Rückgang der Permeabilität. Sartor [102]
hat daher vorgeschlagen, die Schritte Abtrennung
der Partikel und der gelösten Stoffe voneinander zu
trennen. Die selektive Abtrennung sollte eine Tiefen-
filtration sein, und die hauptsächliche Trennwirkung
– durch Wahl geeigneter regenerierbarer Filtermit-
tel – auf der Nutzung elektrostatischer Abstoßungs-
kräfte beruhen.
Sartor et al. [103] haben Untersuchungen zur
elektrokinetischen Wechselwirkung zwischen Fil-
termittel und Mikroorganismen durchgeführt. Sie
konnten zeigen, dass durch Nutzung der elektroki-
netischen Repulsion die Adsorption verhindert und
ein kontrolliertes Eindringen der Mikroorganismen
in das Filterbett erreicht werden kann.
Zur Ermittlung des Einflusses der elektroki-
netischen Wechselwirkungen auf die Abtrennung
von Mikroorganismen in partikulären Schüttbet-
ten wurden die Zetapotenziale von Filtermittel und
abzutrennenden Mikroorganismen gemessen. Für
Einzelheiten zur Zetapotenzialmessung wird auf
Hunter [58] verwiesen.
In . Abb. 9.7 wird das Prinzip kurz erläutert. Bei
der Durchströmung von porösen Schichten in einer
flüssigen Phase entsteht ein Strömungspotenzial.
Ursache ist die Verschiebung der diffusen Schicht.
Die Messung erfolgte mit dem Strömungspotenzial-
messgerät EKA von Anton Paar, Graz, mit einer Faser-
messzelle sowie der Auswertesoftware EKS 100. Das
Strömungspotenzial lässt sich unmittelbar in das Zeta-
potenzial umrechnen. In Filtrationsversuchen wurde
das Zetapotenzial für zwei verschiedene Filtermittel
 306 H. Chmiel
. Abb. 9.7  Prinzip des Zetapotenzials (nach [64])
(Aluminiumoxid und Feldspat) und einen Mikroorga-
nismus (Saccharomyces carlsbergensis) als Funktion
des pH-Wertes ermittelt (. Abb. 9.8). Für den Mikro-
organismus wurde über den pH-Bereich von 4 bis 10
ein konstantes Zetapotenzial von −5 mV gemessen.
9
. Abb. 9.9  Trübung (schwarz) und Druckverlust (rot) bei der Filtration verschiedener Filtermittel bei pH 6: (a) Aluminiumoxid;
(b) Feldspat (nach [103])
. Abb. 9.8  Zetapotenziale als Funktion des pH-Wertes für
Aluminiumoxid, Feldspat und Hefe S. carlsbergensis (nach [103])
Mit den gleichen Filtermitteln folgten Filtra-
tionsuntersuchungen bei pH 6. In . Abb. 9.9 sind
sowohl der Verlauf der Trübung (als Trübungsver-
hältnis) als auch die Druckdifferenz über das Bett-
volumen dargestellt.
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
Beim Aluminiumoxid (Filtermittel mit positivem
Zetapotenzial) wird die Trübung um mehr als 98 %
reduziert, allerdings steigt die Druckdifferenz inner-
halb weniger Bettvolumina auf fast 2 bar an. Der
Feldspat (Filtermittel mit negativem Zetapotenzial)
zeigt eine nur unwesentlich geringere Reinigungs-
leistung, jedoch bei einer Druckdifferenz von ledig-
lich Δp = 0,2 bar. Erst nach einer Filtrationsdauer
von 25 Bettvolumen tritt bei diesem Filtermittel eine
deutliche Trübung des Filtrats auf (Rückhalt <94 %).
Als Ergebnis dieser Untersuchungen kann festgehal-
ten werden, dass man durch Wahl eines Filtermittels
mit gleichnamiger elektrischer Ladung, wie die der
zu entfernenden Partikel, eine optimale Tiefenfilt-
ration erzielen kann. Es entsteht keine Deckschicht
an der Oberfläche des Schüttbetts, sondern die abzu-
trennenden Partikel lagern sich gleichmäßig in den
Hohlräumen des Filtermittels ab. Ergebnis ist eine
Tiefenfiltration bei niedrigen Differenzdrücken.
Ein weiterer Vorteil ist die sehr gute Rückspülbar-
keit dieses Filters [103].
Daraus leitet sich für die Praxis ab, dass als Fil-
terhilfsmittel Partikel mit einer – unter Betriebs-
bedingungen – negativen elektrischen Ladung
gewählt werden sollten. Bei der Filtration lagern
sich dann die ebenfalls negativ geladenen Zellen
locker in den Hohlräumen zwischen den Partikeln
ein (.  Abb. 9.6d), sodass ein kurzer Rückspülim-
puls genügt, um sie in hoher Konzentration wieder
freizusetzen. Dies bedeutet zwar eine gewisse
. Abb. 9.10  Verfahrensschema
eines Vakuum-Trommelfilters (mit
freundlicher Genehmigung der Fa.
Andritz KMPT GmbH)
307 9
Konzentrationsverdünnung, kann aber – durch
geeignete Wahl des Rückspülmediums – als Schritt
zur Zellwäsche genutzt werden.
Für den technischen Einsatz bieten sich eine Viel-
zahl von Filterapparaten an. In . Abb. 9.10 und 9.11
sind beispielhaft zwei kontinuierlich arbeitende Filter
schematisch dargestellt.
Der in . Abb. 9.10 dargestellte Vakuum-Trom-
melfilter besitzt eine zylindrische Trommel deren
doppelwandiger Mantel in einzelne Zellen unterteilt
ist. Die Trommel taucht zum Teil in die Suspension
ein. Das Filtrat wird über Leitungen zum sogenann-
ten Steuerkopf geführt. Durch langsame Drehung
der Trommel passieren die einzelnen Zellen vier ver-
schiedene Filtrationsphasen:
1. Filtrierphase; durch Vakuum erzeugte
Kuchenbildung
2. Waschphase; Kuchenwäsche mittels
Waschflüssigkeit
3. Trocknungsphase; Entfeuchtung mit möglicher
Auspressung des Filterkuchens
4. Kuchenentfernung; Abnahme des Filterku-
chens vom Filtertuch.
Bei dem in . Abb. 9.11 gezeigten Bandfilter erfolgt
der Suspensionszulauf links am Anfang eines umlau-
fenden Filtertuchs. Das Filtrat wird über den an der
Unterseite des Bandes angelegten Unterdruck abge-
saugt. Der Filterkuchen bildet sich auf dem Tuch.
Er kann durch Auswaschen, Dämpfen, Extraktion
 308 H. Chmiel

Suspensionszulauf

Kuchenabnahme

Filtratablauf

. Abb. 9.11  Verfahrensschema eines kontinuierlich arbeitenden Bandfilters nach Stieß [119]

oder Trockensaugen weiterbehandelt werden. An
der Umlenkung des Bandes wird der Filterkuchen
abgeschält.
Bei allen bisher genannten Filtrationsverfahren –
übrigens auch bei den Zentrifugationsverfahren –
ist die Biomassekonzentration im Retentat, wie im
folgenden Kapitel noch gezeigt wird, für die nach-
folgende Zelllyse oft noch zu niedrig, sodass sich
eine weitere Aufkonzentrierung empfiehlt. Diese
ist mit der kontinuierlich arbeitenden Bandpresse
(. Abb. 9.12) möglich.
9 Die vorkonzentrierte Zellsuspension wird oben
links kontinuierlich und gleichmäßig auf das Unter-
band aufgegeben. Über die Keilzone wird das Ober-
band auf das Produkt geführt. Durch die Biegung
sorgt es für einen gleichmäßig ansteigenden Flä-
chendruck und formt dabei einen stabilen Produkt-
kuchen. Im Pressbereich erfolgt die Entwässerung
zunächst über eine L-Profilwalze, die für einen
schnellen Flüssigkeitsabfluss nach beiden Seiten
sorgt. Im Anschluss wird das Produkt über Press-
walzen mit abnehmendem Walzendurchmesser
endgepresst. Durch wechselnde Druck- und Scher-
belastung wird das Produkt effizient und schnell
entfeuchtet.
Bei großen Durchsätzen, hohem Feststoffge-
halt, und wenn hohe Biomassekonzentrationen
erzielt werden sollen, bietet sich die in . Abb. 9.13
gezeigte diskontinuierlich arbeitende Rahmenfil-
terpresse an. In die Hohlräume, die ein Filtertuch
bildet, das über Platten und Rahmen gespannt ist,
wird die Biosuspension unter hohem Druck einge-
presst. Am Ende des Filtrationsvorgangs können die
Platten auseinandergefahren und die – ggf. mehr-
fach gewaschene und entwässerte – Biomasse ent-
nommen werden.

. Abb. 9.12  Verfahrensschema einer kontinuierlich arbeitenden Bandpresse (mit freundlicher Genehmigung der Fa.
Flottweg)
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
309 9

. Abb. 9.13  Schematische Darstellung einer Rahmenfilterpresse

Weitere Filterapparate werden von Stieß [119]

erläutert.
Nicht zum Thema „Aufkonzentrierung der Bio-
masse“ jedoch zur Filtration gehörend, soll abschlie-
ßend noch die Sterilfiltration erwähnt werden.
Hierfür wird nochmals . Abb. 9.1 zitiert:
Neben den diversen Zu- und Abluftfiltern am
Bioreaktor, dem Nährlösungstank und dem Impf-
kulturbehälter gibt es eine große Zahl von Sterilfilt-
rationsschritten in der wässrigen Phase, z. B. bei der
Produktgewinnung, Produktreinigung und Konfek-
tionierung [65]. Insbesondere bei der Bioproduktion
parenteraler Pharmaka reichen die Bedingungen der
Good Manufacturing Practice (GMP 1989) nicht aus.
Wegen ihrer thermischen Labilität können diese Pro-
. Abb. 9.14  Schematische Darstellung einer Filterkerze
dukte nicht hitzesterilisiert werden. Gemäß den Vor-
schriften der U.S. Food and Drug Administration ist
jedoch eine Sterilisation mittels 0,2-µm-Filter, wie er in Verfahren, die für den Zellaufschluss Verwendung
. Abb. 9.14 schematisch dargestellt ist, zulässig. finden.
Bei den mechanischen Verfahren haben sich Ult-
raschall und Gefrierdispersion vor allem im Labor-
9.2 Zellaufschluss maßstab bewährt. Für den Aufschluss von Mikro-
organismen im Produktionsmaßstab werden bisher
Die Zerstörung der Zellwand – der Zellaufschluss – fast ausschließlich Kugelmühlen und Hochdruck-
ist ein wichtiger Verfahrensschritt bei der Gewin- homogenisatoren verwendet, die für andere Anwen-
nung intrazellulärer Produkte. Bei der Wahl geeig- dungen entwickelt wurden (z. B. für die Emulgierung
neter Verfahren ist – neben dem allgemeinen Aspekt von Lebensmitteln).
der Wirtschaftlichkeit – zu berücksichtigen, dass es In dem Maße in dem immer neue intrazelluläre
sich um biologisch aktive Moleküle handelt. Der Produkte mit unterschiedlichen Randbedingungen
Aktivitätsverlust sollte so gering wie möglich gehal- gewonnen werden, wächst das Interesse an möglichst
ten werden. . Tab. 9.1 gibt einen Überblick über angepassten Aufschlussverfahren. So erfordert z. B.
 310 H. Chmiel

. Tab. 9.1  Verfahren zum Zellaufschluss

Mechanische Verfahren physiko-chemische Verfahren biologische Verfahren

Ultraschall osmotischer Druck Einwirkung von

Kugelmühlen Gefrieren und Auftauen Viren
Homogenisatoren Gefriertrocknung Phagen
hydrodynamische Kavitation Lösungsmittel, Säuren, Basen Antibiotika
Detergentien lytischen Enzymen

die Freisetzung schersensitiver Enzyme andere Rand-
bedingungen, als die Gewinnung von Lipiden aus
Algen mit dem Ziel der Produktion von Biodiesel.
Unter diesem Gesichtspunkt werden im Folgenden
alternative Verfahren zum Zellaufschluss vorgestellt.
9.2.1 Kugelmühlen
Kugelmühlen sind in der Verfahrenstechnik zur
9 Zerkleinerung von Feststoffen seit vielen Jahrzehn-
ten bekannt. Im Inneren eines horizontal gelagerten,
rotierenden Hohlzylinders werden die Mahlkörper
(Kugeln) durch Reibungs- und Trägheitseffekte auf
eine gewisse Höhe mitgenommen und prallen dann
auf das zu zerkleinernde Gut. Die aufzuschließen-
den Zellen werden dabei Scher- und Normalspan-
nungen ausgesetzt.
Konventionelle Kugelmühlen
Für die Gewinnung von Bioprodukten aus Cyano-
bakterien empfehlen Balasundaram et al. [7] den
Einsatz der Kugelmühle ohne bewegte Einbauten.
Am Beispiel Chlorogloeopsis fritschii zeigten sie im
Pilotmaßstab, dass bei geeigneter Wahl der Parame-
ter Zellwand-assoziierte Produkte (Polysaccharide)
und zytoplasmatische Produkte (Antioxidantien) in
einem zweistufigen Verfahren voneinander getrennt
freigesetzt werden können. In der ersten Stufe wurde
die aus einem Porzellanzylinder bestehende Kugel-
mühle zu 48 Vol-% mit bleifreien Glaskugeln (2,0–
2,4 mm Durchmesser, Dichte 2,5 g/cm3) gefüllt und
mit einer Drehzahl von 500 min–1 für 20 min betrie-
ben. Anschließend wurden die Glaskugeln abge-
trennt und die zellreiche Phase durch Schwerkraft
sedimentiert, wobei die in der wässrigen Oberphase
verbleibenden Polysaccharide als Flockungsmittel
wirkten. Auf diese Weise konnten im Überstand ca.
50 % der insgesamt in den Zellen vorhandenen Poly-
saccharide selektiv gewonnen werden. Das zellreiche
Sediment wurde in einer zweiten Mühle, die zu 48
Vol-% mit Zirkonoxid-Kugeln (0,8–1,0 mm Durch-
messer, Dichte 3,8 g/cm3) gefüllt wurde, für 30 min
gemahlen. Zirkonoxid-Kugeln wurden wegen ihrer
höheren Dichte gewählt, da sich dadurch auch die
Normalspannungen auf die Zellen erhöht. Am Ende
erhielt man das zytoplasmatische Produkt, die Anti-
oxidantien (TEAC), nahezu vollständig. Die restliche
Biomasse diente als Fischfutter. Den Energieaufwand
für den Gesamtprozess benannten die Autoren mit
ca. 6,7 MJ/kg Biotrockenmasse.
Rührwerkskugelmühlen
Die Drehzahl und damit die Fallhöhe kann bei
Kugelmühlen ohne Einbauten verständlicherweise
nicht beliebig erhöht werden, da ab einer bestimm-
ten Drehzahl die Zentrifugalkraft die Mahlwirkung
aufhebt.
Bereits im Jahre 1928 schlug daher Szegvari vor,
die Mahlkörper – statt durch Rotation des Hohl-
zylinders – durch ein Rührwerk zu bewegen. 1948
setzte du Pont diesen Gedanken mit der sogenann-
ten sand mill, einer vertikal angeordneten Rühr-
werksmühle, um. Das Mahlgut wurde unten zuge-
führt und oben aus der offenen Mühle über ein Sieb
ausgetragen. Heute werden schnell laufende Rühr-
werke geschlossener Bauart – sowohl in vertikaler
als auch in horizontaler Anordnung – für den Auf-
schluss unterschiedlichster Mikroorganismen einge-
setzt. Dabei wird eine Fülle verschiedenartiger Rühr-
werke angeboten. So können die Antriebswellen mit
Stiften oder Scheiben bestückt sein. Letztere können
zentrisch oder exzentrisch angeordnet und mit Boh-
rungen oder Schlitzen versehen sein (. Abb. 9.15).
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
. Abb. 9.15  Schematische
Darstellung von Rührwerken für
Kugelmühlen
Durch die radiale Beschleunigung der Mahlkör-
per und deren Relativbewegung gegeneinander und
gegenüber dem fest stehenden Zylinder wirken auf
das Mahlgut – in diesem Fall die Zellen – sowohl
Scher- als auch Normalkräfte. Dies ist der Grund,
warum die spezifische Leistung, das ist die auf das
Mahlraumvolumen bezogene installierte Leistung,
bei Rührwerkskugelmühlen um den Faktor 100
größer ist als bei konventionellen Kugelmühlen. Als
Mahlkörper werden für den Zellaufschluss meist
bleifreie Hartglasperlen (zur Vermeidung von Akti-
vitätsverlusten beim Produkt) mit einem Durchmes-
ser von etwa 0,1–1 mm eingesetzt. Für hochviskose
Medien werden auch Kugeln höherer Dichte, z. B.
aus Zirkonoxid, eingesetzt, doch wiegt ein eventu-
ell besseres Mahlergebnis nur in seltenen Fällen den
wesentlich höheren Preis und die schlechtere Ver-
fügbarkeit auf. Der im Mittel mit 0,5 mm angegebene
Kugeldurchmesser macht deutlich, welche konstruk-
tiven Anforderungen an die Mahlgut-Mahlkörper-
Separation gestellt werden, die in Form von Siebpa-
trone, rotierendem Spaltsieb oder im Lagergehäuse
integriertem Ringspalt realisiert wird. Im Folgenden
sollen einige Parameter bezüglich ihres Einflusses auf
den Zellaufschluss untersucht werden.
Die Drehzahl des Rührwerks ist zwar keine
unmittelbare Kenngröße, bestimmt aber – bei
bekannter Geometrie – die mittlere Umfangsge-
schwindigkeit. Mit steigender Umfangsgeschwin-
digkeit nehmen Kollisionshäufigkeit der Mahlkör-
per und Schergeschwindigkeit zu. In gleichem Maße
erhöhen sich aber die Temperatur im Mahlgut, die
notwendige Antriebsleistung sowie der Verschleiß
der Mahlkörper. Eine Optimierung im Hinblick auf
311 9
die Effektivität der Produktfreisetzung ist daher emp-
fehlenswert. Beispielsweise zeigen die Ergebnisse von
Zellaufschlussuntersuchungen von Schütte et al.
[111] ein optimales Aufschlussergebnis für Bäcker-
hefe bei einer Drehzahl von 1500 min−1 und für Bak-
terien bei 190 min−1 für die gleiche Rührwerkskugel-
mühle. Höhere Drehzahlen werden im Wesentlichen
in Erwärmung des Mahlgutes umgesetzt.
Der optimale Mahlkörperfüllungsgrad, das Ver-
hältnis von tatsächlichem zu maximal möglichem
Mahlkörper-Schüttvolumen des Mahlraumes, ist vom
Kugeldurchmesser abhängig, liegt aber bei 80 % für
0,5 mm bzw. 85 % bei 1 mm Kugeldurchmesser. Bei
einem Füllungsgrad unter dem Optimum nimmt die
Aufschlusseffektivität deutlich ab, über dem Optimum
steigen Erwärmung und Verschleiß der Glaskugeln.
Der Einfluss der Suspensionskonzentration auf
die Effektivität wird in der Literatur allgemein als
gering angegeben [111].
Die Mahlguttemperatur sollte so niedrig wie
möglich gehalten werden. Einerseits wird während
des Zerkleinerungsvorgangs erhebliche Energie in
Wärme umgesetzt, andererseits beginnt die Dena-
turierung der aus der Zelle freigesetzten Proteine
oft schon sehr früh. Curie et al. [32] fanden, dass
die Desintegration der Zellen in einer Kugelmühle
einem Prozess erster Ordnung folgt
Rm
K ⋅ t = ln  Gl. 9.8
Rm − R
Rm = maximal freisetzbarer Proteingehalt
R = Proteingehalt zur Zeit t
K = Aufschlussgeschwindigkeitskonstante
 312 H. Chmiel
und dass die Aufschlussgeschwindigkeitskonstante
K von Bäckerhefe bei 5 °C um 20 % höher ist als bei
40 °C. Das legt nahe, das Mahlgut auf 5 °C herunter
zu kühlen, bevor man es der Rührwerkskugelmühle
zuführt. Dies vermindert auch das Kühlproblem
innerhalb der Mühle.
Es ist zu erwarten, dass der größte Einfluss auf
das Mahlergebnis von der Rührwerksgeometrie
ausgeht. Von Stehr und Schwedes [118] durchge-
führte verfahrenstechnische Untersuchungen an
Rührwerkskugelmühlen haben ergeben, dass
55 man es in der Regel mit einem voll turbulenten
Strömungszustand zu tun hat,
55 die mittlere Verweilzeit des Mahlgutes
näherungsweise mit der sogenannten idealen
Füllzeit
VMahlraum − VMahlkorper

tf =
QMahlgut
9 55 gleichgesetzt werden kann (Durchsatz Q Malgut =
Volumenstrom des Mahlgutes durch die Mühle),
55 die Verweilzeitverteilung so eng wie möglich
gehalten werden müsste, um ein gutes
Mahlergebnis zu erzielen. Das heißt die
Rückvermischung, die eine erhöhte Aufent-
haltsdauer eines Teils des Mahlgutes mit
entsprechender Erwärmung und der damit
verbundenen Gefahr der Produktinaktivierung
bedeutet, sollte möglichst vermieden werden.
Da die Rückvermischung mit steigendem
Durchsatz abnimmt und der Energieverbrauch
nur unwesentlich mit dem Durchsatz steigt,
empfehlen Kula und Schütte [71] mit einem
möglichst hohen Durchsatz zu fahren. Bei
ungenügendem Aufschlussgrad sollte besser
eine zweite Mahlstufe gewählt werden.
Vergleichende Untersuchungen verschiedener Rühr-
werke findet man in der Literatur [33, 72, 79, 89].
9.2.2 Hydrodynamischer
Zellaufschluss
Während in Kugelmühlen die aufzuschließenden
Mikroorganismen fast ausschließlich Scher- und
Normalspannungen ausgesetzt sind, kommen bei
den hydrodynamischen Zellaufschlussverfahren
noch Dehnspannungen und Kavitationsbeanspru-
chungen hinzu. Im Gegensatz zu den drei erstge-
nannten Beanspruchungen wurde die Kavitation in
7 Kap. 4 nicht behandelt. Das Prinzip soll daher hier
kurz erläutert werden. Unter Kavitation versteht man
die Bildung und das plötzliche Kollabieren von Gas-
blasen in Flüssigkeiten. Sie ist Folge abrupter Druck-
änderungen. Senkt man in einer Flüssigkeit den Druck
unter den Verdampfungsdruck, so bilden sich Blasen,
die bei einer plötzlichen Druckerhöhung kollabieren.
Dabei werden lokal extrem hohe Energien in Form
von Druck und Temperatur frei. Dieser als Kavitation
bezeichnete Vorgang wurde vor ca. 100 Jahren von
Lord Rayleigh entdeckt und für die an schnell laufen-
den Schiffsschrauben beobachteten Zerstörungen ver-
antwortlich gemacht. Seitdem ist die Kavitation ein
gefürchtetes Phänomen bei schnell laufenden Pumpen
und Propellern. Kavitation kann auch auf akustischem
Wege erzeugt werden und wird bereits als Ultraschall-
verfahren zum Aufschluss von Mikroorganismen
genutzt (akustische Kavitation). Gogate et al. [40]
beschreiben beispielsweise eine Apparatur, bei der
sechs Ultraschallgeber konzentrisch auf ein Quarz-
rohr gerichtet sind. Bei Betrieb dieser Ultraschallge-
ber mit geeigneten Frequenzen (16 KHz –100 MHz)
werden die Zellen einer durch das Quarzrohr strö-
menden Biosuspension durch die entstehenden und
kollabierenden Mikroblasen problemlos zerstört. Bei
einer Übertragung in den technischen Maßstab ver-
liert das Verfahren allerdings drastisch an Wirkungs-
grad. Es kommt hinzu, dass dann der Vorteil des
gezielt hohen Energieeintrags verloren geht.
Gogate und Pandit [41] widmeten sich daher der
hydrodynamischen Kavitation mit dem Ziel, sie für
Zellaufschluss und chemische Reaktionen zu nutzen
(7 Abschn. 9.2.2.3).
Bei den im Folgenden vorgestellten hydrody-
namischen Zellaufschlussverfahren kann – abhän-
gig von den Betriebsbedingungen – neben den
erwünschten Beanspruchungen parallel mehr oder
weniger Kavitation auftreten. Das gilt es zu beachten.
Rotor-Stator-Homogenisatoren
Wie der Name bereits sagt, besteht der Rotor-Sta-
tor-Homogenisator (RSH) aus einem Stator und
einem darin konzentrisch angeordneten Rotor, die
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
einen engen Spalt bilden. In der Regel handelt es sich
um eine konzentrische Zylinderanordnung, wie sie
in . Abb. 4.8 als Couette-Rheometer dargestellt ist,
jedoch besitzen Rotor und Stator zahlreiche Öff-
nungen, um die Zellsuspension zuzuführen (in der
Regel über die Hohlwelle des Rotors) und die auf-
geschlossenen Zellen (über den Stator) abzuführen.
Uesugi et al. [124] propagieren eine Ausführung, bei
der Drehzahlen bis 60.000 min–1 erreicht werden
können. Zur Erhöhung der Schergeschwindigkeit
können an beiden Zylindern auch scharfe Erhebun-
gen angebracht sein. Im technischen Maßstab kann
der Rotor auch mit Blättern versehen sein, an deren
äußeren Spitzen Geschwindigkeiten bis zu 50 m/s
auftreten. Daraus resultieren Schergeschwindigkei-
ten von 105 s–1 bis 106 s–1. Sahirgaonkar et al. [100]
berichten von Versuchen mit einem RSH, bei dem
der Rotor einen Durchmesser von 17 mm hatte. Bis
zu einer Drehzahl von 510 s–1 traten hauptsächlich
Scherspannungen auf. Oberhalb dieser Drehzahl war
die Kavitation als Aufschlussmechanismus domi-
nant. Unter erstgenannten Bedingungen wurden
800 mL einer Hefesuspension (Saccharomyces cerevi-
siae) mit einer Konzentration von 10 g/L nach 15 min
vollständig aufgeschlossen. Der Energieverbrauch
betrug 540 MJ/kg Trockenmasse.
Hochdruckhomogenisatoren
Das Arbeitsprinzip des Hochdruckhomogenisa-
tors (HPH) besteht im Aufbau eines hohen Flüssig-
keitsdruckes von bis zu 150 MPa (1500 bar) mittels
Kolbenpumpen, der durch Öffnen eines Ventils für
einige Millisekunden und geeignete Strömungsfüh-
rung auf kurzer Strecke abgebaut wird. Beispielsweise
. Abb. 9.16  Schematische Dar-
stellung eines Hochdruckhomogeni-
sierventils
313 9
wird die Flüssigkeit in . Abb. 9.16 am Ventilkörper
um 90° umgelenkt, gegen einen Prallring geschleu-
dert und verlässt anschließend – mit einer mittleren
Strömungsgeschwindigkeit von etwa 300 m/s [21] –
über einen Ringspalt das Ventil. Dieses ursprünglich
für die Homogenisierung von Flüssigkeiten (z. B. zur
Herstellung von Emulsionen) entwickelte Verfahren
wird zunehmend auch zum Zellaufschluss verwandt.
Die Beanspruchung der Zelle während der
Passage des Ventils ist komplex. Scher-, Normal-
und Dehnbeanspruchungen lösen sich ab bzw. über-
lagern sich; örtlich hohe Energiedichten durch Tur-
bulenz und Kavitation leisten ein Übriges. So ist es
nicht verwunderlich, dass exakte Angaben über die
Schädigungsmechanismen nicht bekannt sind und
eine Optimierung des Aufschlussergebnisses dem
Experiment überlassen bleibt. Zwar ist die Zahl der
variierbaren Parameter für vorgegebene Geometrie
mit den Größen Homogenisierdruck, Konzentration
der Zellsuspension und deren Temperatur kleiner als
bei der Rührwerkskugelmühle, aber bereits geringfü-
gige konstruktive Änderungen am Ventil zeigen eine
große Wirkung auf das Aufschlussergebnis.
Neben dem Design des Homogenisierventils hat
ohne Zweifel der Homogenisierdruck den größten
Einfluss auf die mechanische Zelllyse. Analog der
Nassvermahlung entspricht auch der Aufschluss
mittels HPH einer Kinetik erster Ordnung und lässt
sich analog Gl. 9.6 durch einen Ansatz der Form
Rm
K ⋅ N ⋅ p a = ln  Gl. 9.9
Rm − R
b e s ch reib en, mit N = Z a h l der Pass agen
durch das Hochdruckhomogenisierventil, p =
 314 H. Chmiel
Homogenisierdruck; der Exponent a ist abhängig
von der Art der aufzuschließenden Mikroorga-
nismen und liegt zwischen 1 und 3. Hetherington
et al. [55] bestimmten z. B. für Bäckerhefe einen
Exponenten von 2,9. Schütte und Kula [112] finden
für Bäckerhefe bei 55 MPa dreimal mehr Enzym
im Überstand als bei 30 MPa und empfehlen, zu
noch höheren Drücken zu gehen, da eine einmalige
Passage des Homogenisierventils selbst bei 55 MPa
nur 45 % der prinzipiell möglichen Enzymmenge
freisetzt. Die Erwärmung, die in der Literatur all-
gemein mit ca. 8,5 °C pro 100 bar angegeben wird,
setzt für temperaturempfindliche Enzyme Grenzen.
Dagegen spielt die Konzentration der Zellsus-
pension nach Brookman [21] zwischen 10 % und
80 % für das Aufschlussergebnis keine Rolle. Deshalb
empfehlen zahlreiche Autoren (z. B. [71]) aus wirt-
schaftlichen Gründen, die Konzentration so hoch
wie möglich zu wählen. Olmstead et al. [93] unter-
suchten für die Biodieselgewinnung aus Mikroalgen
9 (Nannochloropsis sp.) den Einfluss der Zellkonzen-
tration auf die extrahierten Lipide beim Zellauf-
schluss mittels HPH. Aus einem Zellkonzentrat von
30 % wurde durch Verdünnung mit Wasser eine
Reihe von Suspensionen zwischen 20 % und 25 %
eingestellt und bei 35 °C für 15 h inkubiert. Nach
einer einmaligen HPH-Passage mit einem Druck
von 120 Mpa, die mit einer Temperaturerhöhung
um 24 °C verbunden war, wurden die Lipide mit
Hexan in zwei Stufen extrahiert und der Überstand
mittels Zentrifuge abgetrennt. Die anschließende
Analyse ergab, dass bei der 30 %-igen Algensuspen-
sion mit Abstand die größte Menge an Lipiden extra-
hiert werden konnte (70 % der insgesamt verfügba-
ren Lipide). Untersuchungen von Yap et al. [141] an
einer Verdünnungsreihe lipidhaltiger Algen (Nan-
nochloropsis sp. mit einem Triacylglyceringehalt
(TAG) von 30 %) mit Biomassekonzentrationen von
0,1 g/L bis 25 g/L und Drücken bis 150 MPa ergaben
im Labormaßstab, dass sowohl die Durchflussrate,
als auch der Anteil an desintegrierten Mikroalgen
zwar vom Druck aber nur unwesentlich von der Bio-
massekonzentration abhängt. Das bedeutet, dass ein
HPH pro Zeiteinheit bei einer Biomassekonzentra-
tion von 25 % ca. 10-mal mehr Zellen aufschließt,
als bei einer Suspension von 2,5 %. Es ist daher aus
wirtschaftlichen Erwägungen sinnvoll, möglichst
an die technische Grenze des HPH zu gehen. Mit
zunehmendem Arbeitsdruck steigt allerdings auch
die mechanische Beanspruchung und die damit ver-
bundene Abnutzung des Ventils des HDH. Selbst
Ventile aus Wolframcarbid zeigen nach kurzer Zeit
einen Verschleiß an den Flächen, an denen die Zell-
suspension auftrifft.
Zu einem anderen Ergebnis kamen Uhlmann
et al. [125] für die sogenannte zellfreie Biosynthese
(CFPS), ein biotechnologisches Produktionssystem,
das es ermöglicht, in vitro, unabhängig von leben-
den Zellen, Proteine schnell, sicher und rein herzu-
stellen, die mit herkömmlichen Systemen schwie-
rig oder gar nicht exprimiert werden können. Dazu
zählen Toxine, rekombinante Antikörper und Mem-
branproteine. Ausgangspunkt der zellfreien Synthese
ist die Herstellung eines Lysats. Für das prokaryoti-
sche System setzt man meistens einen Zellextrakt aus
Escherichia coli (E. coli), das sogenannte S30 Lysat
ein. Dabei bestimmt die Qualität des Lysats maß-
geblich die Ausbeute der zellfreien Proteinsynthese.
Im S30 Lysat müssen alle wesentlichen Faktoren für
die Proteinexpression vorhanden sein. Dem einfa-
chen CFPS System werden lediglich Nucleotid-tri-
phosphate, Aminosäuren und ggf. tRNA zugesetzt.
Bei der Herstellung der zellfreien Produktionssys-
teme mittels Hochdruckhomogenisatoren fanden
Uhlmann et al. [125] bezüglich der Ausbeute ein
Optimum bei ca. 400 bar und einer einmaligen
Passage des HPH. Höhere Drücke und mehrfache
Passage des HPH reduzierten die Ausbeute in der
zellfreien Synthese.
Bei der Übertragung der Ergebnisse vom Labor-
in den Pilot- und technischen Maßstab beobachte-
ten Yap et al. [141] eine beträchtliche Abnahme der
Durchflussrate mit steigendem Homogenisierungs-
druck, was sie einer geänderten Fördercharakte-
ristik der größeren Kolbenpumpen zuschrieben.
Daraus resultiert auch, dass Druckoptima zur Frei-
setzung scherempfindlicher Zellinhaltsstoffe (z. B.
Enzyme) bei der HPH im Labor-, Pilot- und techni-
schen Maßstab weit auseinander liegen können, da
die Zellaufschlussmechanismen (Anteil von Scher-,
Normal-und Dehnbeanspruchungen sowie Kavita-
tion) sich unterscheiden. Diese Optima müssen also
für jede Größe und konstruktive Änderung des HPH
experimentell neu bestimmt werden.
Middelberg [88] gibt einen guten Überblick über
Hochdruckhomogenisatoren.
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
Hydrodynamische
Kavitationsverfahren
Es war bereits darauf hingewiesen worden, dass
sowohl beim Rotor-Stator-Homogenisator als auch
dem Hochdruck-Homogenisator neben Scher-,
Normal- und Dehnspannungen bei entsprechen-
den Betriebsbedingungen auch Kavitation auftritt.
Gogate und Pandit [41] haben sehr anschaulich das
Prinzip der hydrodynamischen Kavitation und deren
technische Anwendung erläutert (. Abb. 9.17).
Durchströmt eine Flüssigkeit ein Rohr mit dem
Druck p1 und der mittleren Geschwindigkeit v1 eine
Verengung (. Abb. 9.17a), so kommt es gemäß Ber-
noulli unmittelbar nach der Verengung auf Grund
der Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit auf
v0 zu einem drastischen Druckabfall (. Abb. 9.17b).
Unterschreitet der Druck dabei den Verdampfungs-
druck pv der Flüssigkeit, so bilden sich Kavitations-
blasen, die durch anschließende Druckerhöhung auf
p2 kollabieren. Ein Maß für die Kavitationsintensität
ist die dimensionslose Kavitationszahl Cv
Cv = 2 ⋅
( p2 − pv )  Gl. 9.10
ρ ⋅ v02
. Abb. 9.17  Strömungsverlauf (a) a
und Druckverlauf (b) in einem Rohr mit
plötzlicher Verengung mit dem Ziel
einer hydrodynamischen Kavitation
(nach Gogate und Pandit [41])
mittlere
Strömungs- v1
geschwindigkeit
P1
Druck
P2
PV
315 9
Im Idealfall entsteht Kavitation bei Cvi = 1, jedoch
wird sie auf Grund von gelösten Gasen oder Ver-
unreinigungen auch bereits bei Cv > 1 beobachtet.
Gogate und Pandit [40] schlagen vor, Cv im Bereich
von 0,1–1,0 zu wählen. Ziel sollte es sein die Größe
der kavitationsgenerierenden Nuclei (Blasen) so
klein wie möglich zu halten. Bei der Übertragung in
den technischen Maßstab wird empfohlen, statt einer
einzelnen großen Verengung lieber eine Drossel
mit einer Vielzahl von kleinen Bohrungen gemäß
. Abb. 9.18 zu benutzen.
Dies vereinfacht das scale-up und erhöht die Fle-
xibilität. Lee et al. [75] beschreiben eine solche Ver-
suchsanordnung für den Aufschluss der Mikroalge
Tetraselmis suecica und die anschließende Extrak-
tion der Lipide mit dem Ziel der Produktion von
Biotreibstoffen. In . Abb. 9.18 ist die Versuchsan-
lage schematisch dargestellt. Der thermostatisier-
bare Tank T wurde für jeden batch-Versuch mit 40
L Algensuspension gefüllt. Die Zentrifugalpumpe
C wurde von einem 11 kW-Motor angetrieben.
Die Durchflussmessung in den Edelstahlrohren
(Innendurchmesser 30 mm) erfolgte elektromag-
netisch. Als Drossel (Strömungsverengung) wurde
die in . Abb. 9.18 rechts dargestellte Platte mit 33
1 V 2
vV v2 = v1
Strömungsblende Vena contracta
Distanz in Strömungsrichtung
 316 H. Chmiel
Bypass-Linie
V2
V1
Zentrifugal-Pumpe
. Abb. 9.18  Schematische Darstellung des Experimentalaufbaus für einen hydrodynamischen Kavitationsreaktor (nach
Gogate und Pandit [41])
9
Bohrungen von je 1 mm Durchmesser verwendet.
Die zentrifugierten Algen wurden mit gefiltertem
Meerwasser auf eine Suspension von 1,5–2,0 % Bio-
trockenmasse eingestellt. Als Maß für den Zellauf-
schluss wurden sowohl die freigesetzten Lipide als
auch das Chlorophyll bestimmt. Es zeigte sich, dass
zur Extraktion der Lipide offensichtlich ein vollstän-
diger Zellaufschluss nicht erforderlich ist. Während
der spezifische Energieaufwand zur vollständigen
Extraktion der Lipide 3 MJ/kg Biotrockenmasse
betrug, lag der analoge Wert für Chlorophyll bei
15 MJ/kg. Mit 3 MJ/kg ist der Energieverbrauch um
Größenordnungen kleiner als bisher in der Litera-
tur beschrieben. Er entspricht aber immer noch ca.
13 % der insgesamt aus der Biomasse gewinnbaren
Energie und ist damit für einen wirtschaftlichen
Prozess zu hoch.
Aus den Optimierungsempfehlungen von
Gogate und Pandit [41] ließen sich noch anbringen:
55 Optimierung des Durchmessers der
Bohrungen und des Verhältnisses der freien
Fläche aller Bohrungen zu derjenigen nach der
Verengung,
55 Gelöstes Gas oder Lösungsmittel senken den
Kavitationsdruck,
55 Turbulenz hinter der Verengung unterstützt die
Zellruptur,
P2
Drosselplatte
V3
P1
55 Zunehmende Zellkonzentration (und damit
Viskosität) reduziert die Effektivität der
Kavitation.
Die letztgenannte Empfehlung steht leider im Wider-
spruch zur Forderung von Yap et al. [141] nach mög-
lichst hoher Zellkonzentration zum wirtschaftlichen
Aufschluss von Zellen.
9.2.3 Physiko-chemische und
enzymatische Zelllyse
Über einen verbesserten mechanischen Aufschluss
von Mikroorganismen nach Vorbehandlung mit
lytischen Enzymen berichten mehrere Autoren [8,
127]. Auch die Vorbehandlung mit einer Mischung
von EDTA und Lysozym erleichtert den mechani-
schen Aufschluss [82]. Man muss sich aber dessen
bewusst sein, dass jede zugesetzte Komponente die
anschließende Produktreinigung kompliziert. Ande-
rerseits kann ein Bioprodukt, das empfindlich für
thermische oder mechanische Beanspruchung ist,
durch physiko-chemische oder enzymatische Lyse
mit geringerem Aktivitätsverlust freigesetzt werden.
Fonseca und Cabral [34] haben die Gewinnung
von Penicillin-Acylase aus Escherichia coli mittels
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
Hochdruckhomogenisation und osmotischem
Schock miteinander verglichen.
Die Zelllyse durch osmotischen Schock erfolgt
in drei Schritten:
55 Zentrifugation und Waschen in 0,1 mol/L Tris-
HCl-Puffer bei pH 8,0 und 0,05 mol/L NaCl für
15 Minuten.
55 Equilibrierung in hypertoner Lösung
(0,25 mol/L Tris-HCl-Puffer, pH 8,0;
0,0125 mol/L EDTA und 20 g/L Sucrose) für
20 Minuten.
55 osmotischer Schock; die Zellsuspension wird
für 15 Minuten bei 5 °C mit 11 300 g zentri-
fugiert. Das Zellkonzentrat wird anschließend
für 10 Minuten in destilliertem Wasser
resuspendiert.
Die so gewonnene Penicillin-Acylase hatte eine um
ein Vielfaches höhere spezifische Aktivität, vergli-
chen mit derjenigen mittels Hochdruckhomogenisa-
tion. Ähnlich erfolgreich waren Wahlund et al. [130]
bei der Gewinnung von Plasmid-DNA und Chae
et al. [27] bei der Freisetzung sogenannter inclusion
bodies (große Proteinaggregate) jeweils aus Escheri-
chia coli mit einer leicht abgewandelten Methode des
osmotischen Schocks.
9.2.4 Wahl des geeigneten
Zellaufschlussverfahrens
Beim Vergleich der oben vorgestellten Zellauf-
schlussverfahren stellt man fest, dass für die Gewin-
nung von Zellinhaltsstoffen auf Experimente nicht
verzichtet werden kann. Eine grobe Vorauswahl ist
aber möglich. Will man Zellwand-assoziierte und
zytoplasmatische Produkte getrennt voneinander
gewinnen, so empfiehlt sich nach Balasundaram [7]
die konventionelle Kugelmühle.
Mikroorganismen mit kleinem Zelldurchmes-
ser (z. B. Brevibacterium, Micrococcus und Nocar-
dia) wurden nach Kula und Schütte [71] am besten
mit der Rührwerkskugelmühle unter Benutzung
von Zirkonoxid-Kugeln (ca. 0,5 mm Durchmesser)
aufgeschlossen.
Für den Einsatz des Rotor-Stator-Homogenisa-
tors gibt es noch zu wenige Erfahrungen. Hier besteht
noch Entwicklungsbedarf.
317 9
Der Hochdruckhomogenisator ist derzeit der
am häufigsten eingesetzte Zellaufschluss-Apparat.
Bei der Freisetzung scherempfindlicher Produkte
muss der Druck optimiert werden. Hier ist darauf
zu achten, dass im Labormaßstab bestimmte opti-
male Drücke bei der Maßstabsübertragung nicht
übernommen werden können. Wegen konstrukti-
ver Unterschiede der Kolbenpumpen und Ventile
gibt es offensichtlich auch Unterschiede in den
Zellaufschluss-Mechanismen. Aus wirtschaftli-
chen Erwägungen sollte bei der Gewinnung von
Lipiden für die Produktion von Biokraftstoffen
zum Aufschluss der Mikroalgen ein möglichst
hoher Druck (bis 150 MPa) gewählt werden. Die
Biomassekonzentration und der Gehalt an Tri-
acylglycerin (TAG) sollten so hoch wie möglich
sein und das gewünschte Ergebnis mit einer ein-
maligen Passage des HPH erzielt werden [141].
Speiden et al. [116] empfehlen auf Grund von Ver-
gleichsuntersuchungen an Nannochlorepsis sp. und
Teraselmis suecica auf letztere überzugehen, weil
der Energieaufwand zum Aufschluss der letztge-
nannten Mikroalgen ca. 40 % geringer ist, wobei
möglichst ein TAG-Gehalt von 30 % angestrebt
werden sollte.
Die hydrodynamische Kavitation ist immer dann
interessant, wenn das intrazelluläre Produkt weder
Temperatur- noch scherempfindlich ist. Ideal ist,
wenn Lösungsmittel zugegeben werden können,
weil dann die Kavitation früher einsetzt. Beson-
ders empfohlen wird die HC von Lee et al. [75]
für den Aufschluss von Algen zur Produktion von
Biokraftstoffen.
9.3 Produktisolation,
-konzentrierung und
-reinigung
Die bisher beschriebenen Schritte der Aufarbei-
tung beschränkten sich auf solche Produkte, die
intrazellulär anfallen (der Sonderfall, bei dem die
Zelle selbst das Produkt darstellt, soll nicht verfolgt
werden).
Nach dem Freisetzen des Produktes und der
Abtrennung der Zelltrümmer laufen die weiteren
Aufarbeitungsschritte für intra- und extrazelluläre
Produkte analog.
 318 H. Chmiel
9.3.1 Präzipitation
In 7 Abschn. 9.1.1 wurde die Sedimentation als
einfachste Art der Abtrennung von Zellen aus
der Fermentationsbrühe beschrieben. Nach dem
Stokes’schen Gesetz ( Gl. 9.1) wächst die Sinkge-
schwindigkeit proportional mit dem Dichteunter-
schied zwischen Partikel und fluider Phase, aber mit
dem Quadrat des Partikeldurchmessers.
Die Präzipitation nutzt diese Gesetzmäßigkeit.
Sie ist im Folgenden so definiert, dass durch geeig-
nete Maßnahmen Makromoleküle (z. B. Proteine)
aus der Lösung in Partikel (oder Aggregate, Flocken
etc.) überführt werden und dadurch sedimentieren.
Nach dieser Definition unterscheidet sich die Präzi-
pitation von der Kristallisation, bei der sich anstatt
amorpher Präzipitate geordnete Kristalle von Prote-
inmolekülen bilden.
Einige Autoren wie z. B. Harrison et al. [48] spre-
chen auch bei Proteinausfällung von „Kristallisation“,
9 wenn es sich um „reine“ Aggregate handelt.
Für den ersten Schritt der Reinigung von Protei-
nen im großtechnischen Maßstab bietet sich die Prä-
zipitation an. Sie wird bereits seit vielen Jahren zur
Proteinfraktionierung von Blutplasma verwendet.
Die Präzipitation stellt das älteste Verfahren zur
Reinigung und Aufkonzentrierung von Proteinen
dar. Auch heute noch wird sie fast regelmäßig zur
Vorreinigung, vor chromatographischen Schritten
und zur Konzentrierung sowohl im Labor- als auch
im industriellen Maßstab eingesetzt. Hochgereinigte
Proteine lassen sich, abgesehen von wenigen Aus-
nahmen, nur durch mehrstufige Prozesse erreichen,
die eine Kombination von Fällungsschritten mit
chromatographischen Verfahren darstellen.
Die Präzipitation von Proteinen erfolgt durch
Zusatz von Salzen, organischen Lösungsmitteln oder
wasserlöslichen Polymeren, durch Veränderung des
pH-Wertes oder der Temperatur. Dabei wird die Lös-
lichkeit für Proteine vermindert. In der übersättig-
ten Lösung aggregieren Proteine und fungieren als
Keime für das Ausfällen weiterer Proteine. Die Prä-
zipitation kann nur in den wenigsten Fällen so spe-
zifisch gestaltet werden, dass selektiv ein bestimmtes
Protein ausfällt. Vielmehr liegen durch die Zugabe
von Fällungsmitteln in der Lösung Bereiche mit
hoher Übersättigung vor, in denen unterschiedliche
Proteine sehr schnell und unspezifisch aggregieren.
Verunreinigungen der Proteinpräparationen mit
Nucleinsäuren, also DNA und RNA, können insbe-
sondere bei Rohextrakten aus Bakterien Probleme
durch hohe Viskositäten verursachen. Diese Verun-
reinigungen werden ausgefällt oder durch Zusatz von
Nucleasen enzymatisch abgebaut.
Zur Präzipitation werden das Antibiotikum
Streptomycinsulfat, wasserlösliche Polymere wie
Polyethylenimin oder Protaminsulfat (ein Gemisch
natürlicher Polypeptide mit terminalen Argininres-
ten, d. h. positiv geladene Polyelektrolyte, die mit
der negativ geladenen Nucleinsäure unlösliche Salze
bilden), aber auch Mangansalze eingesetzt. Beliebt ist
auch das „Aussalzen“ mit Ammoniumsulfat.
Das Präzipitat stellt in der Regel keine reine Phase
dar, es handelt sich vielmehr um Aggregate verschie-
dener Proteine, die in „frühen“ Reinigungsstufen
häufig noch Nucleinsäuren, Zellwandbruchstücke
und andere Partikel einschließen. Nur noch von his-
torischem Interesse ist die Tatsache, dass Proteine
ursprünglich aufgrund ihrer Löslichkeit charakteri-
siert wurden. So sind Globuline beispielsweise defi-
niert als „unlöslich in schwach ionischen Lösungen“
(bei niedriger Ionenstärke), Albumine als „löslich in
stark verdünnten Lösungen“.
Die Verteilung hydrophiler (polarer) und hyd-
rophober (unpolarer) Seitengruppen der Polypep-
tidstruktur, die Größe und die Nettoladung bestim-
men die Löslichkeit der Proteine. Glykoproteine, die
kovalent gebundene Kohlenhydrate enthalten, sind
in wässrigen Lösungen gut löslich, während bei Lipo-
proteinen – das sind nicht kovalente Proteinkonju-
gate mit Lipiden – die Löslichkeit durch die hydro-
phoben Anteile beeinträchtigt wird.
Native Proteine sind besser wasserlöslich als
denaturierte, bei denen oft hydrophobe Aminosäu-
rereste aus dem Proteininneren an die Oberfläche
und in Kontakt mit dem Wasser kommen.
Negative Ladungen werden in die Polypeptid-
struktur durch die Carboxylgruppen der sauren
Aminosäuren Asparagin- und Glutaminsäure, posi-
tive durch die basischen Aminosäuren Lysin, Arginin
und Histidin eingeführt, während die unpolaren
Aminosäuren Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin,
Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin
dem Protein hydrophobe Eigenschaften verleihen.
Von Bedeutung für die Löslichkeit der Proteine ist
die Faltung und Assoziation der Proteinmoleküle in
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
der wässrigen Lösung, also die Sekundär- und Ter-
tiärstruktur. Die Polypeptidkette wasserlöslicher
Proteine faltet sich so, dass die Seitenketten hydro-
philer Aminosäuren vorwiegend nach außen, hyd-
rophobe nach innen orientiert sind. Die Oberflä-
che eines typischen globulären Proteins ist mit etwa
45 % hydrophoben Aminosäureresten belegt. Für die
Assoziation und Fällung von Proteinen ist zudem die
Hydrathülle (fest gebundenes Wasser) von Bedeu-
tung. Die Wechselwirkungen der Proteine unterein-
ander und mit anderen gelösten Stoffen werden also
durch viele Faktoren bestimmt.
Vereinfacht dargestellt, kann man die Wechsel-
wirkungen zweier voneinander entfernter, gleichsin-
nig geladener Proteinmoleküle auf elektrostatische
(abstoßende) und Van-der-Waals-Kräfte (anzie-
hende) reduzieren. In . Abb. 9.19 sind die Energien
für niedrige (1) und hohe (2) Salzkonzentrationen
qualitativ dargestellt. Man erkennt deutlich, dass bei
hoher Ionenstärke die Reichweite der elektrostati-
schen Abstoßung und dadurch die Aktivierungs-
energie der Assoziation vermindert sind. Das bei der
Kurve 2 zusätzlich vorhandene Minimum führt zur
Bildung lockerer Aggregate.
Auch bei der Präzipitation stellt sich wieder
die Aufgabe für ein vorgegebenes Protein aus den
. Abb. 9.19  Interaktionsenergien zwischen geladenen
Teilchen als Funktion des Abstands für niedrige (1) und hohe
(2) Salzkonzentrationen (Bell et al. [11])
319 9
im Folgenden erläuterten Verfahren das beste aus-
zuwählen und hierfür die optimalen Parameter zu
finden. Es läuft also zwangsläufig wieder auf Hoch-
durchsatzexperimente (engl. high throughput experi-
ments oder high throughput screening, HTS) hinaus,
hier im Hinblick auf Proteinlöslichkeit bzw. Präzi-
pitation. Wiendahl et al. [136]) berichten über Mes-
sungen der Löslichkeit verschiedener Insulin-Va-
rianten zur Bestimmung der Einflussparameter wie
Konzentration, Puffer, pH, Verhalten am isoelektri-
schen Punkt und Ionenstärke sowie die Bedeutung
des Einsalzeffekts (7 Abschn. 9.3.1.2).
Die HTS-Experimente wurden mit einem Tit-
rierroboter mit 96-Well-Mikrotiterplatten und acht
parallelen Nadeln sowie einem Photometer (Streu-
lichtmessungen und UV-Absorptionsmessungen)
durchgeführt. Auf diese Weise konnte für eine große
Zahl von Proteinen die Löslichkeit bei variierenden
Salztypen, Salzkonzentrationen und pH-Werten
bestimmt werden. Diese Technik ist im Prinzip auf
alle nachfolgend vorgestellten Präzipitationsverfah-
ren anwendbar und wird in 7 Abschn. 9.3.4 über die
Solventextraktion im Detail vorgestellt werden.
Methoden der Proteinfällung
Die verschiedenen Methoden der Präzipitation
können in drei Gruppen unterteilt werden:
1. Änderung der Eigenschaften des Solvents
durch Zugabe organischer Lösungsmittel oder
Salze. Verminderung der Wasseraktivität durch
hohe Konzentrationen
2. Änderung der Proteineigenschaften etwa durch
Neutralisation der effektiven Oberflächen-
ladung der Proteine und damit Verminderung
der Löslichkeit durch Zugabe geringer Mengen
Säure oder Basen
3. Affinitätspräzipitation, wobei das Protein
zunächst in Lösung einen spezifischen Affini-
tätskomplex mit einem geeigneten Liganden
bildet, der dann durch Quervernetzung (bifunk-
tioneller Ligand, Affinitätspräzipitation erster
Ordnung) oder durch Aufgabe eines geeigneten
Stimulus (stimuli-responsive materials,
Affinitätspräzipitation zweiter Ordnung) zur
Präzipitation gebracht wird. Im Gegensatz zu
allen anderen Präzipitationsverfahren ist die
Affinitätspräzipitation daher hochspezifisch.
 320 H. Chmiel
Aussalzen
Dies ist die bis heute am häufigsten benutzte Methode
der Enzymreinigung. Man geht davon aus, dass die
Wirkung in hohem Maße von der Hydrophobie des
Proteinmoleküls abhängt. Beim Aussalzen wird das
Kräftegleichgewicht in Richtung der hydrophoben
Wechselwirkungen verschoben.
Die Löslichkeit eines Proteins wird stark durch
die Nettoladung, das ist die Summe der positiven und
negativen Ladungen, beeinflusst. In der Regel ist die
Löslichkeit am isoelektrischen Punkt (IP) minimal
(. Abb. 9.20a), das ist der pH-Wert, bei dem das Pro-
teinmolekül eine Nettoladung von null hat.
Ein weiterer Parameter ist die Ionenstärke
(. Abb. 9.20b). Sie ist definiert als:
1 55 das Salz anschließend wieder entfernt werden
I = Σ ciZi2  Gl. 9.11
2 muss,
ci = Konzentration des Ions i; Zi = Ladung des Ions i
Bei niedriger Ionenstärke beobachtet man häufig,
9 wie auch in . Abb. 9.20b gezeigt, einen sogenann-
ten Einsalzeffekt (salting in), bei hoher Ionenstärke
einen Aussalzeffekt (salting out). Als Fällungsmit-
tel für Proteine wird bevorzugt Ammoniumsulfat
(NH4)2SO4 eingesetzt, da es billig ist und mit hoher
Reinheit als Nebenprodukt organischer Synthesen
anfällt. Zudem hat es einen stabilisierenden Einfluss
auf die Proteinkonformation. Die Präzipitation mit
Ammoniumsulfat kann besonders vorteilhaft mit der
in 7 Abschn. 9.3.7 beschriebenen Hydrophobic-Inter-
action-Chromatographie kombiniert werden. Bei der
Fällung mit Ammoniumsulfat ist zu beachten, dass
bei hohen pH-Werten Ammoniak freigesetzt wird
und dass es in Lebensmitteln und pharmazeutischen
Zubereitungen nicht enthalten sein darf. Zudem ist es
korrosiv und schwierig zu entsorgen. Natriumsulfat
und Phosphate sind dagegen bei Temperaturen unter
40 °C schlecht löslich. . Abb. 9.20b zeigt aber auch,
. Abb. 9.20  Einfluss (a) des
pH-Wertes (IP = isoelektrischer Punkt)
und (b) der Ionenstärke auf die
Löslichkeit von Proteinen
dass in manchen Fällen Salze (hier NaCl) selbst bei
hoher Ionenstärke keinen Aussalzeffekt bewirken.
Für die Löslichkeit eines Proteins gilt, wie
. Abb. 9.20b zeigt, für höhere Ionenstärken in erster
Näherung folgende empirische Beziehung [30]:
log S = β − K ⋅ I  Gl. 9.12
mit S = Löslichkeit des Proteins; β = Konstante (aber
abhängig von Temperatur und pH-Wert, Logarith-
mus der hypothetischen Löslichkeit bei einer Ionen-
stärke von 0); K = Aussalzkonstante; I = Ionenstärke.
In der Regel präzipitieren Proteine mit hoher
Molmasse leichter als solche mit niedriger Mol-
masse. Bei der Art und Menge der zugesetzten Salze
ist darauf zu achten, dass
55 zu viel Salz nicht nur unerwünschte Neben-
produkte mit präzipitiert, sondern auch zu
Konformationsänderungen und damit zu
einem Aktivitätsverlust des betreffenden
Proteins führen kann,
55 Salze nicht nur die Löslichkeit eines Proteins
reduzieren, d. h. eine vollständige Fällung eines
Proteins aus einem Proteingemisch (Fraktio-
nierung) ist nicht möglich, was besonders bei
verdünnten Lösungen dazu führen kann, dass
kein Protein gefällt wird,
55 Salzpräzipitate über lange Zeit stabil sind, d. h.
vor proteolytischer Wirkung und Bakterien-
wachstum geschützt sind (konservierende
Wirkung).
Für den großtechnischen Maßstab ist die Salzpräzi-
pitation allerdings nur noch geeignet, wenn das Salz
in möglichst reiner Form wiedergewonnen und wie-
derverwendet werden kann.
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
Präzipitation mittels
organischer Lösungsmittel
Es gibt eine Reihe von Beispielen für die großtech-
nische Präzipitation von Proteinen mittels Zugabe
wasserlöslicher organischer Lösungsmittel. Hierzu
gehören z. B. die Fraktionierung von Blutplasma-
proteinen durch Ethanol und einige industriell pro-
duzierte Enzyme wie Invertase durch Aceton. Die
Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels hat
eine Verminderung der Löslichkeit zur Folge. Die zur
Fällung benötigte Lösungsmittelmenge ist am iso-
elektrischen Punkt am geringsten. Analog zum Aus-
salzen gilt auch bei der Präzipitation durch Reduk-
tion der Lösungsmittel-Dielektrizitätskonstante, dass
je größer das Proteinmolekül, umso geringer ist die
benötigte Menge an Lösungsmittel. Die wichtigste
Wirkung dürfte in der Erniedrigung der Aktivität des
Wassers liegen. Die sogenannte Lösungsmittel-Prä-
zipitation sollte bei niedrigen Arbeitstemperaturen
erfolgen (unter 10 °C bis –10 °C), um die Proteinde-
naturierung möglichst gering zu halten.
Aus Gründen des Arbeitsschutzes und wegen
Explosionsgefahr müssen geschlossene Anlagen
verwendet werden, was die Anlagekosten erhöht.
Die Auswahl an geeigneten Lösungsmitteln ist
gering. Benutzt werden bevorzugt Ethanol, Iso-
propanol und Aceton, weil sie die Kriterien „unbe-
grenzte Löslichkeit in Wasser“ und „reagieren
nicht mit dem Protein“ erfüllen. Sie sind darüber
hinaus gut verfügbar und können für eine Wieder-
verwendung redestilliert werden. Höhere aliphati-
sche Alkohole sind weniger gut geeignet (Siedelage
über 100 °C) und wirken stärker denaturierend auf
Proteine.
Während der Zugabe organischer Lösungsmit-
tel zu wässrigen Lösungen können beträchtliche
(Lösungs-)Wärmemengen freigesetzt werden. Batch-
Präzipitationen erfordern daher sorgfältiges Rühren
und Kühlen, da mit einer Temperaturerhöhung nicht
nur die Wahrscheinlichkeit einer Proteindenaturie-
rung zunimmt, sondern – wegen der Temperatur-
abhängigkeit der Dielektrizitätskonstante auf die
Löslichkeit – auch die benötigte Menge an Lösungs-
mittel. Wenn die Effekte von Lösungsmittelzugabe
und Änderung von pH, Temperatur und Ionen-
stärke gut aufeinander abgestimmt sind, ist eine frak-
tionierte Präzipitation aus einer Mischung gelöster
Proteine möglich. Schließlich haben Alkohole in den
321 9
Konzentrationen, in denen sie für die Präzipitation
benötigt werden (>10 %) bakterizide Wirkung. Dies
ist einer der Gründe, warum für die Proteinfraktio-
nierung von Blutplasma stark gekühltes Ethanol ver-
wendet wird; man erhofft sich davon die Zerstörung
eventuell vorhandener Hepatitis-Viren. Copräzipi-
tation von Partikeln wie Ribosomen, Membranfrag-
menten und Lipiden führt darüber hinaus zu klaren
Lösungen – eine Voraussetzung für nachfolgende
chromatographische Reinigungsschritte.
Ausfällen am isoelektrischen Punkt
Dies ist eine der einfachsten und billigsten Metho-
den der Präzipitation. Der isoelektrische Punkt
ist, wie bereits erwähnt, der pH-Wert, bei dem das
Protein keine Nettoladung mehr besitzt. Die repulsi-
ven Kräfte verschwinden und die attraktiven Kräfte
überwiegen mit der Folge erhöhter Aggregatbil-
dung und verminderter Löslichkeit der Proteine.
Ein Vorteil der isoelektrischen Präzipitation ist, dass
zur pH-Einstellung Mineralsäuren wie z. B. Phos-
phorsäure verwendet werden können. Sie sind billig,
werden in geringen Konzentrationen verwendet und
sind für die Verwendung in pharmazeutischen und
Lebensmittelprozessen zugelassen. Falls notwendig,
kann das Verfahren durch Zugabe von organischen
Lösungsmitteln bzw. Salzen unterstützt werden. Die
Säurezugabe muss kontrolliert und unter starkem
Rühren erfolgen, um Proteindenaturierung zu ver-
mindern. Außerdem tritt Lösungswärme auf, die
abgeführt werden muss.
Kryopräzipitation und
Hitzebehandlung
Für die Reinigung hitzestabiler Proteine lassen sich
durch eine Hitzebehandlung des Rohextrakts hit-
zelabilere Fremdproteine denaturieren und ausfäl-
len. Die Methode beruht auf den hohen Tempera-
turkoeffizienten der thermischen Denaturierung
und definierten Denaturierungstemperaturen der
Proteine. Zusätze von Substrat und/oder Coenzym
steigern häufig spezifisch die Hitzestabilität und
erlauben dadurch höhere Temperaturen und damit
höhere Anreicherungsfaktoren. Zu beachten ist die
Tatsache, dass durch die erhöhten Temperaturen
vermehrte Proteolyse durch Proteasen beobachtet
 322 H. Chmiel
wird. Aus diesem Grund wird häufig vor dem Hit-
zeschritt Ammoniumsulfat zugesetzt, das Protea-
sen unspezifisch (Ionenstärke) hemmt. Die Kryo-
präzipitation, das ist ein Ausfällen von Proteinen
bei Temperaturen um den Gefrierpunkt, wird heute
praktisch nur noch bei der Fraktionierung von Blut-
proteinen eingesetzt. Sie wird z. B. als erste Stufe bei
der Produktion des Antihaemophilie-Faktors VIII
angewandt.
Präzipitation durch
nicht-­ionogene Polymere
Die Entdeckung, dass nicht-ionogene Polymere die
Löslichkeit von Makromolekülen reduzieren können,
wurde Ende der 1960er-Jahre gemacht, was die noch
seltene großtechnische Anwendung dieses Verfah-
rens erklärt. Große Moleküle vermindern die Lös-
lichkeit der Proteine, indem sie deren solvatisiertes
Wasser reduzieren. Die Beobachtung, dass geringe
9 Konzentrationen an Polyethylenglykol (5–10 % Gew.
PEG) benötigt werden, um hochmolekulare Proteine
(z. B. Viruspartikel) auszufällen, während höhere
Konzentrationen (bis zu 20 %) notwendig sind, um
niedrigmolekulare Proteine zu präzipitieren, stützen
den zur Erklärung benutzten Mechanismus.
Ein Nachteil ist die hohe Viskosität des als
40–50 %ige Lösung benutzten PEG und die damit
verbundenen Schwierigkeiten beim Rühren. PEG-
Fällung wird häufig als konkurrenzfähiges Verfah-
ren bei der Blutfraktionierung und der industriellen
Gewinnung der Asparaginase eingesetzt. Obwohl
in einigen Ländern für die Anwendung bei Human-
proteinen zugelassen, ist bekannt, dass Spuren von
PEG in der Proteinfraktion verbleiben und nachfol-
gende Prozessschritte beeinflussen. Diese Methode
kann mit der wässrigen Zweiphasenextraktion und
mit der Verteilungschromatographie kombiniert
werden. Ein Vorteil gegenüber dem Aussalzen ist die
Möglichkeit, Präzipitat und Überstand direkt – ohne
Entsalzen – an Ionenaustauschern zu fraktionieren.
Damit kann das nicht geladene PEG von den gelade-
nen Proteinen abgetrennt werden.
Präzipitation mittels ­Polyelektrolyten
Die Präzipitation auf der Basis unlöslicher Poly-
elektrolytkomplexe wird in der Literatur als sehr
effektiv bezeichnet. So berichten Wahlund et al.
[130] über den Einsatz des Polykations Poly(N,N′-
dimethyl-diallyl-ammoniumchlorid) (PDMDAAC)
als erstem Schritt zur Entfernung von Verunreini-
gungen von durch Zelllyse gewonnener Plasmid-
DNA (7 Abschn. 9.3.2). Unter optimalen Bedingun-
gen bleiben RNA und Proteine im Überstand und
können entfernt werden.
Eine quasi umgekehrte Reinigung einer Pflan-
zenperoxidase durch Präzipitation mittels Carboxy-
methylcellulose + CaCl2 + PEG beschreiben Aruna
und Lali [5]. Die verunreinigenden Proteine werden
gefällt, während die Peroxidase in Lösung bleibt.
Polyacrylsäure wurde erfolgreich zur Reinigung
einer Reihe von Enzymen wie z. B. Amyloglucosidase
verwendet. Der Mechanismus der Polyelektrolytprä-
zipitation wird teilweise analog dem des Aussalzens,
teilweise dem nichtionogener Polymere erklärt.
Präzipitation mittels Tensiden
Den Einsatz von grenzflächenaktiven Stoffen zur
selektiven Präzipitation schlagen Shin et al. [113]
vor. Mittels Natriumdi(2-ethylhexyl)-sulfosuccinat
(AOT) wird Xylanase selektiv aus einem Gemisch
mit verschiedenen Cellulasen gefällt. Xylanase
kann im großtechnischen Maßstab in der Papier-
produktion zum Bleichen (Delignifizierung) ver-
wendet werden, wobei die Cellulasen – wegen
ihrer schädigenden Wirkung auf die Cellulosefa-
sern – stören.
Die gefällten, d. h. mittels Zentrifuge abgetrenn-
ten, Xylanaseagglomerate werden durch Ethanol (in
einem Natriumacetatpuffer) vom AOT befreit.
Affinitätspräzipitation
Bei den bisher beschriebenen Verfahren zur Präzi-
pitation von Proteinen erfolgte diese recht unspe-
zifisch, ohne die speziellen biologischen Funktio-
nen wie etwa Substrat- und Coenzymspezifität bei
Enzymen oder andere biospezifische Wechselwir-
kungen wie Antikörper – Antigen, Zucker – Lectin,
Hormon – Rezeptor zu nutzen. In jüngster Zeit
konnten zudem durch chemische (kombinatorische
Chemie) oder biologische (Phagen-Display-Techno-
logie) Verfahren spezifische Liganden für viele Pro-
teine gezielt produziert und so die Palette möglicher
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
Affinitätsliganden erweitert werden. Derartige spe-
zifische Wechselwirkungen können, ähnlich wie bei
den später behandelten Trennverfahren Affinitäts-
chromatographie und Affinitätsverteilung, auch bei
der Präzipitation genutzt werden.
Man unterscheidet bei der Affinitätspräzipita-
tion zwei Prinzipien. Die sogenannte Affinitätsprä-
zipitation erster Ordnung stellt einen Spezialfall
dar, der sich unter anderem dadurch auszeichnet,
dass das Zielprotein mindestens zwei spezifische
Bindungsstellen haben muss. Das Zielprotein wird
dann in Kontakt mit einem ebenfalls bifunktionel-
len Affinitätsliganden gebracht, und es kommt zur
Bildung eines quervernetzten Affinitätskomple-
xes, der ab Erreichen einer gewissen Größe präzi-
pitiert. Hilbrig und Freitag [56] beschreiben bei-
spielsweise in einem Übersichtsartikel zum Thema
„Affinitätspräzipitation“ die präparative Isolation
von Lactatdehydrogenase aus einer Rohlösung
mittels bifunktionaler N2,N2′-adipodihydrazido-­
bis(N 6 -carbonylmethyl-NAD) (Bis-NAD). Ein
Beispiel für eine Primäreffektpräzipitation ist auch
die Immunpräzipitation, bei der Proteine durch
ihre Antikörper präzipitiert werden. Das sich bil-
dende Gel wird mittels Zentrifugation, Filtration
oder Flotation abgetrennt. Nachteile der Affinitäts-
präzipitation erster Ordnung ist der eingeschränkte
Anwendungsbereich (die Zielproteine müssen
bifunktionell sein, Zielprotein und Affinitätsligand
müssen in etwa gleichem Molverhältnis eingesetzt
werden) sowie die Schwierigkeit, das Präzipitat
wieder aufzulösen, etwa um das Zielprotein freizu-
setzen. Der Einschluss von Verunreinigungen in das
makromolekulare Netzwerk ist offensichtlich unver-
meidbar und erfordert einen aufwendigen, nach-
geschalteten Waschprozess, wodurch ein Großteil
des Vorteils einer derart selektiven Fällung wieder
verloren geht.
Bei der Affinitätspräzipitation zweiter Ordnung
werden dagegen sogenannte Affinitätsmakroligan-
den (AML) eingesetzt. Das sind Biokonjugate,
die aus dem eigentlichen Affinitätsliganden und
einem stimulierbaren Polymer bestehen. Stimu-
lierbare Polymere zeichnen sich dadurch aus, dass
sie infolge einer relativ geringfügigen Änderung
eines Umgebungsparameters ihr Löslichkeitsver-
halten in Wasser grundlegend ändern. Auslösende
Stimuli können z. B. die Temperatur, der pH-Wert,
323 9
elektrische Felder oder Licht sein. Entsprechende
Polymere sind z. B. bei einer bestimmten Tempe-
ratur gut wasserlöslich, während sie bei einer um
wenige Grad höheren Temperatur quantitativ prä-
zipitieren. Der Vorgang kann durch anschließende
Erniedrigung der Temperatur wieder umgekehrt
werden. Auf stimulierbaren Polymeren beruhende
AML binden in Lösung spezifisch an das Zielprotein
(bei beiden Reaktionspartnern ist in diesem Fall eine
einzige Interaktionsfunktion ausreichend). Der Affi-
nitätskomplex wird anschließend präzipitiert und
das Zielprotein so abgetrennt. Der Komplex kann
durch wiederholtes Auflösen/Wiederpräzipitieren
(Temperaturzyklus) unter bindenden Bedingun-
gen leicht gewaschen und von mitgerissenen Ver-
unreinigungen befreit werden. Das Zielprotein kann
anschließend direkt aus dem Präzipitat oder nach
Wiederauflösen in Elutionspuffer und Abtrennen
des AML freigesetzt werden. Neben der Aufreini-
gung von Proteinen wurde die Affinitätspräzipita-
tion zweiter Ordnung auch erfolgreich für die Iso-
lierung von Plasmid-DNA aus bakteriellen Lysaten
eingesetzt. Gegenüber den konkurrierenden Ver-
fahren der Affinitätschromatographie ist die Affini-
tätspräzipitation leichter in einen größeren Maßstab
zu übertragen. Die Affinitätspräzipitation wurde
zudem mit der Affinitätsextraktion in wässrigen
Zweiphasensystemen kombiniert.
Auswahl des Fällungsmittels
Die Auswahl des geeigneten Fällungsmittels hängt
beim kommerziellen Prozess von einer Reihe von
Faktoren ab:
55 Kosten,
55 Möglichkeiten des Recyclings: Rückgewinnung
und Wiederverwendung des Präzipitanten
ist im industriellen Maßstab eine zwingende
Notwendigkeit,
55 leichte Handhabbarkeit: Organische Lösungs-
mittel erfordern „flammensichere Arbeits-
weise“ und niedrige Arbeitstemperaturen,
55 Zulassung für das Produkt: Ammoniumsulfat
ist beispielsweise für die Anwendung in der
Lebensmittelindustrie zugelassen,
55 Produktstabilität: Manche Präzipitanten
denaturieren Proteine bereits bei geringem
Überschuss,
 324 H. Chmiel
55 Eignung für einen kontinuierlichen Prozess:
Tendenz geht in Richtung kontinuierlicher
Prozess,
55 Eignung für die Kombination mit anderen
Aufarbeitungsprozessen: Bei der Auswahl der
Fällungsmittel muss berücksichtigt werden,
dass Fällungsmittelrückstände nachfolgende
Reinigungsschritte beeinflussen. So können
Salzrückstände in der Proteinpräparation das
Elutionsverhalten bei der Ionenaustauscher-
und der Affinitätschromatographie nachhaltig
verändern.
Obwohl die Präzipitation im großtechnischen
Maßstab hauptsächlich mit dem Ziel der Produkt-
konzentration (Volumenreduzierung) angewendet
wird, besteht die Tendenz, die Wirtschaftlichkeit des
Verfahrens dadurch zu erhöhen, dass Reinigungswir-
kung bzw. Selektivität verbessert werden; denn diese
bestimmen den Aufwand, der für die nachfolgenden
9 Reinigungsschritte betrieben werden muss.
Es gibt aber eine Reihe von Gründen, warum bei
der Präzipitation im industriellen Maßstab schlech-
tere Ergebnisse erzielt werden als im Labormaßstab:
55 Schlechteres Mischen und damit verbundene
längere Mischzeiten führen zu einer Überprä-
zipitation, d. h. Copräzipitation unerwünschter
Proteine.
55 Höherer Wärmeeintrag beim Mischen und
schlechtere Wärmeabfuhr führen zu thermi-
scher Denaturierung.
55 Stärkere Schwankungen beim aufzuarbei-
tenden Rohstoff führen zu nicht optimalen
Bedingungen bei der Präzipitation und damit
schlechter Reproduzierbarkeit.
9.3.2 Kristallisation
Generell versteht man unter Kristallisation das Über-
führen eines oder mehrerer Stoffe aus dem amorph-
festen, flüssigen oder gasförmigen Zustand in den
kristallinen. Da in der Biotechnologie die Kristalli-
sation fast ausschließlich aus dem flüssigen Zustand
nämlich aus der Lösung Bedeutung erlangt hat, sollen
sich die folgenden Ausführungen darauf beschrän-
ken. Darüber hinaus gehende Informationen findet
man bei Mersmann et al. [86].
Kristallisation
niedermolekularer Stoffe
Die Kristallisation niedermolekularer Stoffe ist nicht
neu. Bereits 1933 wurde von Borsook et al. [17] eine
Methode zur Herstellung kristalliner Milchsäure
vorgestellt.
Mit wachsender Bedeutung der biotechnischen
Produktion organischer Säuren werden die Vorteile
der Kristallisation wie z. B. vergleichsweise geringer
Energieverbrauch und die Gewinnung sehr reiner
Produkte bei relativ milden Bedingungen geschätzt.
Willke und Vorlop [137] setzen sie beispielsweise
für die Itaconsäure, Harrison et al. [48] für die Zit-
ronensäure und Wohlgemuth [139] für die Adipin-
säure ein.
z Kristallisationsverfahren
Damit Kristalle entstehen oder vorhandene wachsen
können, muss die Löslichkeitsgrenze überschritten,
d.h. die Lösung übersättigt werden.
Dies kann geschehen durch
55 Kühlung (Kühlungskristallisation),
55 Verdampfung (Verdampfungskristallisation),
55 Zugabe eines Verdrängungsmittels (Verdrän-
gungskristallisation) und
55 Reaktion mehrerer Reaktanden
(Reaktionskristallisation).
In . Abb. 9.21 sind in einem Löslichkeitsdiagramm
(Konzentration der gelösten Komponente als Funk-
tion der Temperatur) für eine Lösung die Löslich-
keitskurve sowie die Verfahren Kühlungskristallisa-
tion (horizontaler Pfeil), Verdampfungskristallisation
(vertikaler Pfeil) und Vakuumkristallisation (roter
Pfeil) dargestellt.
Die Kühlungskristallisation bietet sich immer
dann an, wenn die Löslichkeit des auszukristallisie-
renden Stoffes stark mit der Temperatur ansteigt. Ein
Beispiel hierfür ist die Zitronensäure (s. rote Kurve
in . Abb. 9.22).
Steigt die Löslichkeit nur gering mit der Tem-
peratur an oder nimmt sie sogar ab, so empfiehlt
sich die Verdampfungskristallisation. Ein Beispiel
hierfür ist Natriumchlorid (s. schwarze Kurve in
. Abb. 9.22).
Bei der Vakuumkristallisation wird die Lösung
durch Druck- und Temperaturabsenkung gleichzei-
tig verdampft und gekühlt.
 Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
. Abb. 9.21  Löslichkeitsdiagramm
und Kristallisationsverfahren
.RQ]HQWUDWLRQ
Analog zur Lösungsmittel-Präzipitation wird bei
der Verdrängungskristallisation durch Zugabe eines
wasserlöslichen organischen Lösungsmittels die Lös-
lichkeit des zu kristallisierenden Stoffes im Wasser
vermindert. Sie wird in der Biotech­nologie haupt-
sächlich zur Proteinkristallisation verwendet und
später ausführlich behandelt. Bei der Reaktionskris-
tallisation reagieren ein oder mehrere Reaktanden in
einer flüssigen Phase. Beispiele hierzu findet man in
Mersmann et al. [86].
z Keimbildung und metastabiler Betrieb
Ein wichtiges Ziel bei der Wahl des Aufarbeitungs-
verfahrens ist die Qualität des Produkts. Diese wird
ganz wesentlich von der mittleren Kristallgröße und
der Kristallgrößenverteilung bestimmt. Die Kristal-
lisation setzt eine Übersättigung der Lösung voraus
UH
VlX
Q HQ
.RQ]HQWUDWLRQ
UR
=LW
1DWULXPFKORULG
7HPSHUDWXU
. Abb. 9.22  Qualitativer Verlauf der Löslichkeit von
Zitronensäure (rot) und Natriumchlorid (schwarz) als Funktion
der Temperatur
325 9
/|VOLFKNHLWVNXUYH
.KOXQJVNULVWDOOLVDWLRQ
9DNXXPNULVWDOOLVDWLRQ
9HUGDPSIXQJV
NULVWDOOLVDWLRQ
7HPSHUDWXU
(. Abb. 9.23 und 9.24). Die metastabile Zone kann
durch eine der oben genannten Verfahren erreicht
werden.
Der nächste wichtige Schritt ist die Keimbil-
dung. Sie kann beispielsweise durch Zugabe von
Fremdpartikeln induziert werden. Man spricht
dann von heterogener Keimbildung. Diese ist
aber in der Regel bei Bioprodukten unerwünscht.
Homogene Keimbildung tritt dagegen erst auf,
wenn die metastabile Zone überschritten wird.
Allerdings beobachtet man bei der Anwendung
von Ultraschall bereits Keimbildung innerhalb
der metastabilen Zone. Ein weiteres Verfahren zur
Induktion der Keimbildung stellt Wohlgemuth
[139] vor. Zugeführte Gasblasen wirken als Keim-
bildungszentren. Der Einfluss von Anzahl und
Größe der zugeführten Gasblasen während der
Kühlungskristallisation auf Anzahl der induzier-
ten Keime, Kristallgrößenverteilung und mittlere
Kristallgröße wurde an drei verschiedenen Modell-
stoffsystemen (Adipinsäure/Acetonitril, L-Alanin/
Wasser und Paracetamol/Acetonitril) ermittelt und
mit der reinen Kühlungskristallisation und mit der-
jenigen bei überlagertem Ultraschall verglichen.
Dabei wurde festgestellt, dass es sich bei dem auf
diese Weise induziertem Keimbildungsmechanis-
mus um einen heterogenen Mechanismus handelt,
der einige Vorteile bietet.
z Kristallisationsapparate
Von einem Kristallisator wird gefordert, dass er
die in Lösung entstehenden Kristalle gut durch-
mischt, sodass sie sich nicht absetzen. Soweit
kommen grundsätzlich die in 7 Kap. 6 beschriebenen
 326 H. Chmiel
. Abb. 9.23  Löslichkeitskurve,
Übersättigungskurve, metastabile
Zone und Keimbildung für eine
Kühlungskristallisation
.RQ]HQWUDWLRQ
.HLPELOGXQJ
Apparate wie z. B. Rührwerk mit und ohne Leitrohr
(. Abb. 9.20), Schlaufe und Fließbett in Frage, aller-
dings mit der zusätzlichen Forderung guter Wärme-
tauscher und gegebenenfalls Vakuumpumpe. Bei
der Wahl des Umwälzorgans (Pumpe) muss dessen
Wirkung auf die Korngrößenverteilung (Abrieb)
9 berücksichtigt werden.
Eine Übersicht über heute verwendete Kristalli-
satoren findet man bei Mersmann et al. [86].
Proteinkristallisation*
Dariusch Hekmat
Die Proteinkristallisation kann als Spezialfall der
Proteinfällung angesehen werden, bei der ähnliche
Agenzien zur Proteinlösung hinzugegeben werden
wie bei der Fällung, um Übersättigung zu erzielen.
Allerdings läuft der Kristallisationsvorgang übli-
cherweise langsamer ab als die Fällung. Im Gegen-
satz zu den kleinen Molekülen ist die Kristallisation
von makromolekularen Verbindungen wie Proteine
bisher weniger gut untersucht worden.
z Methoden der Proteinkristallisation
Die Bedingungen für eine erfolgreiche Kristalli-
sation eines Proteins sind oft nicht bekannt. Dies
liegt in der Komplexität der Interaktionen zwi-
schen den Proteinmakromolekülen begründet,
die die Kristallisation herbeiführen [52]. Neben
den elektrostatischen Wechselwirkungen und den
Van-der-Waals-Kräften spielen oft auch hydro-
phobe Wechselwirkungen eine Rolle. Der Einfluss
der einzelnen Interaktionen kann meist nicht defi-
nitiv identifiziert bzw. vorausgesagt werden. Daher
hEHUVlWWLJXQJVNXUYH
/|VOLFKNHLWVNXUYH
QH .KOXQJVNULVWDOOLVDWLRQ
=R
WD ELOH
WDV
PH
7HPSHUDWXU
müssen die Kristallisationsbedingungen für jedes
einzelne Protein individuell ermittelt werden und
diese Bedingungen sind in der Regel nicht auf andere
Proteine übertragbar. Um die Kristallisationsbedin-
gungen zu ermitteln, kann basierend auf experimen-
tellen Daten ein Phasendiagramm erstellt werden.
Ein derartiges Phasendiagramm ist in qualitativer
Form in . Abb. 9.24 wiedergegeben.
In diesem Diagramm ist die Konzentration von
Protein in Lösung aufgetragen über der Konzentration
eines Kristallisationsagenz. Die Bereiche der Untersät-
tigung und der Übersättigung sind durch die Löslich-
keitskurve unterteilt. Die Übersättigungskurve ver-
läuft dieser Kurve in etwa parallel. Rechts oberhalb der
Übersättigungskurve befinden sich die Bereiche für
Keimbildung, Fällung und flüssig-flüssig-Phasentren-
nung. Unterhalb der Übersättigungskurve befindet
sich die metastabile Zone. In der metastabilen Zone
können keine Kristalle gebildet werden, vorhandene
Kristalle können jedoch weiter wachsen. Um Kristalle
bilden zu können, müssen Bedingungen eingestellt
werden, die sich innerhalb der Keimbildungszone
(dem „Kristallisationsfenster“) befinden. Dies kann
durch einen Dampfdiffusionsversuch (rote Trajekto-
rie in . Abb. 9.24) erzielt werden oder durch einen
Satzversuch (gestrichelte Trajektorie in . Abb. 9.24).
Die erste Versuchsstrategie wird bei der Prote-
inkristallisation zur Strukturaufklärung über die
Röntgendiffraktometrie eingesetzt. Die zweite Ver-
suchsstrategie findet bei der präparativen Protein-
kristallisation Anwendung.
Aus Erfahrung ist bekannt, dass sich die verschie-
denen Zonen des Phasendiagramms hinsichtlich
Lage und Ausdehnung signifikant ändern können,
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
. Abb. 9.24  Qualitatives Phasendiagramm für Proteine ([29], modifiziert)
wenn kleine Änderungen von einzelnen Kristal-
lisationsbedingungen auftreten. So z. B. kann die
Keimbildungszone deutlich kleiner ausfallen (roter
Bereich in . Abb. 9.18). In diesem Fall würde entspre-
chend der dargestellten Trajektorien sowohl für den
Dampfdiffusionsversuch als auch für den Satzver-
such keine Kristallisation stattfinden. Ferner können
die Bereiche für Fällung und Phasentrennung nicht
dort lokalisiert sein, wie ursprünglich erwartet. Dies
bedeutet, dass sich in manchen Fällen die Phasen-
trennungszone auch rechts oder oberhalb von der
Fällungszone befinden kann.
Trotz der genannten Defizite bei der Beschrei-
bung der Mechanismen, die zur Kristallisation von
Proteinen führen, wurden aufgrund von Bedarf
seitens der Industrie einzelne Prozesse im präpara-
tiven Maßstab erfolgreich entwickelt. Hierzu werden
im Folgenden Fallbeispiele dargestellt.
z Kristallisation als Aufreinigungsschritt
Die präparative Proteinkristallisation ist als ein
Aufreinigungsschritt denkbar, der eine technisch
und ökonomisch attraktive Alternative zu den übli-
cherweise industriell eingesetzten chromatographi-
schen Trennverfahren (7 Abschn. 9.3.6.1) darstellen
kann. Dies liegt darin begründet, dass die chroma-
tographischen Verfahren wegen ihrer inhärenten
327 9
Massentransportlimitierung in der Kapazität
begrenzt sind und daher bei der Produktion einen
Flaschenhals darstellen können, insbesondere wenn
die Produktkonzentrationen wegen Verbesserungen
beim Upstream-Processing hoch sind. Die Vorteile
der präparativen Proteinkristallisation sind:
55 Die Aufreinigung geht schneller vonstatten, da
keine Massentransportlimitierung auftritt.
55 Es werden keine aufwändigen Apparate und
teure Verbrauchsmaterialien (z. B. Chromato-
graphiemedien) benötigt.
55 Es sind kleinere Mengen von Pufferlösungen
erforderlich.
Im Gegensatz zur Kristallisation zur Strukturauf-
klärung über die Röntgendiffraktometrie fokussiert
die präparative Proteinkristallisation auf hohe Pro-
duktionsraten, hohe Ausbeuten, gute Reproduzier-
barkeiten, robuste Kristallmorphologien und enge
Kristallgrößenverteilungen.
Anhand der aufgereinigten Beispielproteine
Lysozym und einer rekombinanten Lipase aus Ther-
momyces lanuginosus konnte gezeigt werden, dass
eine skalierbare präparative Satzkristallisation im
Rührkessel gut durchführbar ist [49]. Die Versu-
che wurden in geometrisch ähnlichen Rührbehäl-
tern mit Betriebsvolumina von 5 mL, 100 mL und
 328 H. Chmiel
1000 mL durchgeführt. Die Betriebstemperatur
und die Rührerdrehzahl waren regelbar. Sowohl
die Kristallisationskinetik als auch die Kristallisa-
tionsausbeute konnten im Fall von Lysozym durch
die Herabsenkung der Betriebstemperatur während
des Prozessverlaufs deutlich erhöht werden. Im Fall
von Lipase wurde eine vergleichbare Verbesserung
der Kristallisationsleistung durch die stufenweise
Zugabe von PEG als zusätzliches Kristallisations-
agenz erzielt.
In dem o.g. Versuchsaufbau konnte auch ein
aufgereinigtes Fab-Fragment des therapeutischen
monoklonalen Antikörpers IMC-C225 erfolgreich
kristallisiert werden [50]. Hierbei wurde eine Zulauf-
strategie durch stufenweise Zufuhr des Fällungsmit-
tels Ammoniumsulfat angewendet, wodurch erneut
eine schnellere Kinetik und eine höhere Ausbeute
erreicht werden konnte. Ein weiteres aufgereinig-
tes Fab-Fragment des therapeutischen monoklona-
len Antikörpers Canakinumab wurde ebenso kris-
9 tallisiert, wobei in diesem Fall durch die Zugabe
des zusätzlichen Kristallisationsmittels PEG-Mo-
nomethylether die Prozessleistung erhöht werden
konnte [114].
Die präparative Proteinkristallisation ist beson-
ders dann interessant, wenn sie auch aus unreinen
Produktströmen gelingen kann. In diesem Zusam-
menhang wurde bereits in früheren Arbeiten die
Durchführbarkeit der Kristallisation von Ovalbu-
min, Lysozym und einer Lipase aufgezeigt. Ferner
wurde die Kristallisation aus unreinen Lösungen
anhand der Beispielproteine Lysozym, einer rekom-
binanten Lipase aus Thermomyces lanuginosus und
enhanced green fluorescent protein (eGFP) untersucht
[52]. Hierbei kamen erneut die o. g. skalierbaren
Rührbehälter im 5 mL-Maßstab zum Einsatz. Im Fall
von Lysozym und Lipase wurden die jeweiligen auf-
gereinigten Proteinlösungen vor den Kristallisations-
versuchen mit definierten unterschiedlichen Mengen
von mikrobiellen Wirtszellproteinen (HCP) versetzt.
Hierdurch wurde eine unterschiedlich effektive Vor-
behandlung von Proteinrohlösungen simuliert. Der
Konzentrationsbereich der zugegebenen HCP war
5–15 Gew.-% (bezogen auf Gesamtprotein). Es zeigte
sich, dass die Kristallisation quantitativ und reprodu-
zierbar mit schneller Kinetik (95 % der Endausbeute
innerhalb von 2,6–7 h) und hohen Ausbeuten (> ca.
97 %) durchführbar war. Im Fall von eGFP wurde
ausgehend von einer Rohlösung mit 77 Gew.-% HCP
zunächst eine Vorbehandlung mit zwei unterschied-
lichen Methoden durchgeführt. Diese waren Three
Phase Partitioning (TPP), welche eine Kombination
von Lösungsmittelextraktion und Präzipitation dar-
stellt, und immobilisierte Metallaffinitätschroma-
tographie (IMAC) [53]. Im ersten Fall wurde eine
Restkonzentration der HCP von 16 Gew.-% erzielt
und im zweiten 7 Gew.-%. In beiden Fällen gelang
anschließend die Kristallisation ähnlich quantita-
tiv und reproduzierbar wie zuvor bei Lysozym und
Lipase. Alle drei kristallisierten Beispielproteine
enthielten Rest-HCP in den Flüssigkeitskanälen der
Kristalle. Diese konnten jedoch durch einen diffusi-
ven Waschvorgang weitgehend entfernt werden. Die
erhaltene Reinheit aller drei gewaschenen resolubili-
sierten Proteinkristalle war ≥99 %.
Die erfolgreiche präparative Satzkristallisation
eines ganzen therapeutischen monoklonalen Anti-
körpers im skalierbaren Rührkessel konnte erstma-
lig gezeigt werden [115]. In dieser Arbeit wurden
zunächst geeignete Kristallisationsbedingungen
des aufgereinigten Antikörpers in parallelisier-
ten ungerührten Satzversuchen im 10 µL-Maßstab
durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Kristallisation
in Lösungen mit niedrigen Ionenstärken gelingt.
Anschließend wurden Satzversuche im 6 mL-Rühr-
kristallisator durchgeführt und es erfolgte eine Maß-
stabsvergrößerung bis zu einem Flüssigkeitsvolumen
von 1000 mL. Nach Einstellung von geeigneten Kris-
tallisationsbedingungen wurde überraschend festge-
stellt, dass die Kristallisation sehr schnell ablaufen
konnte. Bereits nach nur 3 min (!) wurde eine Aus-
beute von 95,8 % erzielt, wobei die Endausbeute 98,3
% betrug. Die erhaltenen Proteinkristalle hatten eine
robuste monoklinische Morphologie und eine enge
Kristallgrößenverteilung.
Basierend auf den Ergebnissen mit dem auf-
gereinigten Antikörper wurden Kristallisationen
aus einem vorbehandelten geklärten Zellüberstand
durchgeführt. Die Vorbehandlung bestand aus
einem einfachen pH-Shift in den sauren Bereich,
wodurch der Großteil der HCP präzipitierte und
mittels Zentrifugation abgetrennt wurde. Ferner
erfolgte eine Aufkonzentrierung über Querstrom-
Ultrafiltration und ein Pufferaustausch über Quer-
strom-Diafiltration. Nach Vorversuchen im unge-
rührten Mikromaßstab wurde die Kristallisation
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
wieder einer Maßstabsvergrößerung unterzogen.
Es zeigte sich erneut, dass die Zugabe von PEG als
zusätzliches Kristallisationsagenz eine Beschleuni-
gung der Kristallisationskinetik bewirkte. Die durch
Kristallisation erzielte Abreicherung von HCP und
Wirtszell-DNS entsprach der eines Protein A-Chro-
matographieschritts. Die Kristallisation erwies sich
als kompatibel mit anderen Aufreinigungsschrit-
ten wie Virusinaktivierung bei niedrigem pH-Wert,
Ionenaustauschchromatographie und Virusfiltra-
tion. Allerdings konnte auf einen von drei üblicher-
weise eingesetzten präparativen Chromatographie-
schritten nicht verzichtet werden, um die gesetzlich
geforderte Schwelle von HCP < 100 ppm zu erzie-
len. Dieser Schritt war eine Anionenaustauschchro-
matographie im Durchflussmodus. Somit konnten
zwei der drei Chromatographieschritte – die Protein
A-Chromatographie und die Kationenaustausch-
chromatographie – eingespart werden, was einen
deutlichen ökonomischen Vorteil erwarten lässt.
Die biologische Aktivität des Antikörpers konnte
während aller Aufreinigungsschritte auf hohem
Niveau gehalten werden.
Parallel zu den Messungen erfolgten moleku-
lardynamische Simulationen, die hydrophobe und
elektrostatische Wechselwirkungen von sechs unter-
schiedlichen monoklonalen Antikörpern vom Typ
IgG1 berücksichtigten [115]. Hierbei zeigte sich, dass
der gut kristallisierbare Antikörper einen deutlich
stärker negativ geladenen Bereich und mehr hydro-
phobe Reste an der Oberfläche der Fab-Dmäne besaß
. Abb. 9.25  Visualisierung des vorgeschlagenen Kristallisationsmechanismus eines therapeutischen monoklonalen
Antikörpers (a) Fab-Domäne ist negativ geladen (rot) und ist durchsetzt mit hydrophoben Resten (schwarz); (b) Fab-Domäne
lagert sich an positiv geladene Fc-Domäne eines benachbarten Antikörpers an, die ebenfalls mit hydrophoben Resten
durchsetzt ist; (c) Kristalle können sich bilden
329 9
als die übrigen fünf Antikörper. Basierend auf den
Simulationsrechnungen wurde eine Hypothese auf-
gestellt, welche die gute Kristallisierbarkeit dieses
einen Antikörpers erklären konnte. Demnach kann
sich die Fab-Domäne des gut kristallisierbaren Anti-
körpers an die Fc-Domäne eines benachbarten Anti-
körpers vom gleichen Typ anlagern, welche positiv
geladen ist und auch hydrophobe Reste an der Ober-
fläche besitzt. Dadurch werden stabile Kristallisa-
tionskeime gebildet, woraus makroskopische Kris-
talle wachsen können.
Der vorgeschlagene Kristallisationsmechanis-
mus ist in . Abb. 9.25 dargestellt.
Auf der Basis der o. g. Erkenntnisse ist es vorstell-
bar, über Hochdurchsatzversuche einen gut kristalli-
sierbaren generischen Antikörper zu identifizieren.
Aus diesem Antikörper können dann mittels mole-
kularbiologischer Methoden andere gut kristalli-
sierbare Antikörper mit einer gewünschten spezifi-
schen biologischen Aktivität hergestellt werden. Dies
würde es ermöglichen, dass die präparative Kristal-
lisation Teil einer Aufreinigungsplattformtechnolo-
gie wird.
z Kristallisation als Formulierungsschritt
Die präparative Proteinkristallisation ist auch als ein
Formulierungsschritt denkbar, da kristalline Prote-
informulierungen gegenüber den konventionellen
Formulierungen wie wässrige Lösungen, amorphe
Lyophilisate oder sprühgetrocknete Produkte Vor-
teile bieten können.
 330 H. Chmiel
Diese sind:
55 höhere Aktivität und Reinheit der kristallinen
Makromoleküle,
55 reduzierte Lagerkosten,
55 längere Haltbarkeit,
55 Bereitstellung von hochdosierten parenteral
verabreichbaren Kristallsuspensionen von
therapeutischen Proteinen mit niedriger
Viskosität und
55 Bereitstellung von therapeutischen
Produkten mit kontrolliert langsamer
Wirkstofffreisetzung.
Frühe Arbeiten zu diesen Zielsetzungen wurden
anhand des Polypeptids Insulin erfolgreich durch-
geführt. Die konsequente Weiterführung dieser
Arbeiten resultierten schließlich in der Etablierung
der großtechnischen Herstellung von kristallinem
rekombinanten Humaninsulin ([48], S. 349–362).
Die Bereitstellung von hochkonzentrierten Kris-
9 tallsuspensionen von therapeutischen Antikörpern
ist eine attraktive Aufgabenstellung, da diese bei The-
rapien oft hochdosiert eingesetzt werden müssen.
Hierzu wurden in der Vergangenheit Arbeiten
durchgeführt. Es zeigte sich, dass kristalline Anti-
körperformulierungen herstellbar waren, allerdings
mit einer relativ ungeeigneten Morphologie (Nadeln
oder auch Aggregate von Nadeln). Die biologische
Aktivität der Antikörper in vitro blieb jedoch voll-
ständig erhalten und die Viskosität der Kristallsus-
pensionen war vorteilhaft niedrig. Daher wurden mit
einem gut kristallisierbaren Antikörper Versuche
durchgeführt. Es zeigte sich, dass eine hochkonzen-
trierte kristalline Formulierung mit einer robusten
Morphologie herstellbar war [115]. Nach einer Zen-
trifugation (44.000 g, 3 min) wurde ein Kristallpellet
. Abb. 9.26  Vergleich
der Injektionskraft für eine
Flüssigformulierung und
eine Kristallsuspension eines
therapeutischen monoklonalen
Antikörpers für verschiedene
Kanülengrößen
des Antikörpers mit einer Konzentration von 315 g/L
erhalten. Dieses Kristallpellet konnte innerhalb von
ca. 30 min problemlos wieder in Lösung gebracht
werden, wobei eine klare viskose Lösung mit ca.
200 g/L Antikörper erhalten wurde. Messungen
ergaben, dass die Antikörperkristalle ca. 70 Gew.-%
Kristallwasser enthielten. Daher kann zukünftig
erwartet werden, dass durch eine geeignete partielle
Trocknung kristalline Antikörperformulierungen
mit außerordentlich hohen Konzentrationen von
bis zu 400 g/L erzielt werden können.
Die Eignung von kristallinen Antikörperfor-
mulierungen zur subkutanen Verabreichung wurde
anhand von Injektionsversuchen mit unterschiedli-
chen Kanülen ermittelt und mit Flüssigformulierun-
gen verglichen (. Abb. 9.26).
Hierbei zeigte sich, dass die erforderliche Injek-
tionskraft bei den Kristallsuspensionen konsistent
nur etwa halb so hoch war wie bei den Flüssigfor-
mulierungen. Im Fall der 30 G-Kanüle war die Injek-
tionskraft bei der Flüssigformulierung derart hoch,
dass die Kanüle sich von der Spritzenspitze löste.
Hiermit konnte anhand des Fallbeispiels gezeigt
werden, dass die Herstellung von Antikörperkris-
tallsuspensionen möglich war, die für pharmakoki-
netische Untersuchungen geeignet sind.
z Maßstabsvergrößerung der
Proteinkristallisation
Untersuchungen zur Maßstabsvergrößerung der
Proteinkristallisation sind in der Literatur kaum
zu finden. Gemäß Harrison et al. ([48], S. 284) wird
vorgeschlagen, eine der üblichen Kriterien zur Maß-
stabsvergrößerung von kleinen Molekülen zu ver-
wenden, deren Resultate am besten mit experimen-
tellen Daten übereinstimmen.
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
Diese Kriterien sind:
55 Konstanter volumetrischer Leistungs-
eintrag bei geometrisch ähnlichen Behältern
(7 Abschn. 6.3.1.2). Dieses Kriterium gilt nur
bei turbulenter Strömung von newtonschen
Flüssigkeiten mit Reynolds-Zahlen (Gl. 4.35)
Re > 104 für bewehrte Rührkessel und Re > 105
für unbewehrte Rührkessel,
55 konstante Rührerumfanggeschwindigkeit und
55 Einstellung einer minimalen Rührerdrehzahl,
um die Kristalle in Suspension zu erhalten.
Die Eignung dieser Maßstabsvergrößerungskriterien
wurde anhand des Beispielproteins Lysozym unter-
sucht [114]. Hierbei kamen geometrisch ähnliche
Rührkessel mit Rundboden und Schrägblattrüh-
rern zum Einsatz. Diese langsam laufenden Rührer
mit großen Blättern und steilem Anstellwinkel von
40–45° eigneten sich zur schonenden Suspendie-
rung der scherkraftempfindlichen Proteinkristalle.
Die Betriebstemperatur und die Rührerdrehzahl
waren regelbar. Die Drehrichtung der Rührer wurde
so gewählt, dass die Flüssigkeit nahe der Rührerachse
hochströmte und ringförmig in Nähe der Behälter-
wand herabströmte. Hierdurch wurde gewährleistet,
dass sich keine Kristallsedimente am Behälterboden
bilden konnten. Die Dimensionierung der Rührkes-
sel war: Rührerdurchmesser d/D ≈ 0,5, H/D ≈ 1,0 und
Rührerhöhe h/H ≈ 0,33.
Bei den Versuchen zeigte sich, dass das Krite-
rium des konstanten volumetrischen Leistungsein-
trags nicht angewendet werden konnte, da unter
den gewählten Versuchsbedingungen keine tur-
bulente Strömung auftrat. Ferner ergab keines der
anderen beiden Kriterien verwendbare Resultate.
Daher wurde ein geeignetes anderes Kriterium
gesucht. In diesem Zusammenhang wurde das Kri-
terium der konstanten maximalen lokalen Energie-
dissipationsdichte identifiziert. Dieses Kriterium
wurde bereits zur Maßstabsvergrößerung der Kris-
tallisation von kleinen Molekülen in Rührbehäl-
tern angewendet und kam zur Charakterisierung
von hydrodynamischem Stress in Bioreaktoren
zum Einsatz [54]. Das Kriterium wurde erstma-
lig zur Maßstabsvergrößerung der Kristallisation
des Beispielproteins Lysozym angewendet [114].
Hierbei wurde als geeigneter Parameter zum Ver-
gleich der drei Maßstäbe die Dauer bis zum Einsatz
331 9
der Kristallisation gewählt. Dieser Parameter wird
durch die Induktionszeit der Kristallkeimbildung
bestimmt.
Der mittlere volumetrische Leistungseintrag ε
ist definiert als:
P 2π ⋅ n ⋅ M
ε= =  Gl. 9.13
V ⋅ρ V ⋅ρ
Leistungseintrag P, Flüssigkeitsvolumen V, Dichte
der Flüssigkeit ρ, Rührerdrehzahl n, effektives Dreh-
moment an der Rührerachse M (aus Messungen). Die
maximale lokale Energiedissipationsdichte εmax
wurde von Henzler [54] gemäß folgender Funk-
tion mit ε korreliert, die detaillierte geometrische
Angaben zum Rührbehälter enthält:
εmax a
≈ 2 2 / 3⋅ 1.15 −2 / 3
ε ( d /D ) ⋅( h /d ) z 0.6 ⋅(sinα) ⋅ zI 2 / 3 ⋅( H /D )
 Gl. 9.14
Behälterkonstante a (a = 4 für bewehrte Behälter,
a = 16 für unbewehrte Behälter), Rührerdurchmes-
ser d, Behälterinnendurchmesser D, Rührerhöhe h,
Anzahl Rührerblätter z, Rührblattanstellwinkel α,
Anzahl Rührer zI und Füllhöhe H. Die unterschied-
lichen Behälterkonstanten wurden aus der Arbeit
von Henzler [54] abgeleitet und besagen, dass bei
einer konstanten maximalen lokalen Energiedissi-
pationsdichte der mittlere Leistungseintrag in einem
bewehrten Rührbehälter vierfach höher ist als im
unbewehrten.
In den Versuchen im 1 L-Maßstab ergaben sich
für den mittleren Leistungseintrag Werte von 2,4 W/
kg bei 50 1/min bis 67 W/kg bei 310 1/min. Dies kor-
respondierte mit einer maximalen lokalen Ener-
giedissipationsdichte von 0,17 W/kg bis 4,8 W/­kg
(εmax/ ε ≈ 72). Hierbei zeigte sich, dass sich bei
einer maximalen lokalen Energiedissipationsdichte
von 2,2 W/kg die kürzeste Dauer bis zum Einsatz der
Kristallisation konsistent für alle drei Maßstäbe ergab
(s. roter Pfeil in . Abb. 9.27).
Daher erwies sich die konstante maximale
lokale Energiedissipationsdichte als ein geeigne-
ter Parameter für die Maßstabsvergrößerung der
Kristallisation von Lysozym. Der optimale Wert
von 2,2 W/kg korrespondiert mit einem mittleren
Leistungseintrag von ca. 30 mW/kg. Die optimale
Rührerdrehzahl betrug hierbei 200 1/min für den
 332 H. Chmiel
. Abb. 9.27  Vergleich der Zeitdauer bis zum Einsatz
des Kristallwachstums von Lysozym in drei unterschiedlich
großen Rührkristallisatoren als Funktion der maximalen
lokalen Energiedissipation ([114], modifiziert)
1 L-Kristallisator, 290 1/min für den 100 mL-Kris-
tallisator und 375 1/min für den 6 mL-Kristallisa-
tor. Basierend auf den erzielten Ergebnissen ist eine
zuverlässige einfache Maßstabsvergrößerungsstra-
tegie vorstellbar.
Diese läuft wie folgt ab:
9 55 Auslegung eines geometrisch ähnlichen
größeren Rührkessels,
55 Auslegung eines geometrisch ähnlichen
größeren Schrägblattrührers, welcher die
Bedingung εmax/ V ≈ 72 erfüllt und
55 Einstellung einer Rührerdrehzahl, die einem
effektiven mittleren Leistungseintrag von
ca. 30 mW/kg entspricht.
Diese vorgeschlagene Strategie muss in zukünftigen
Arbeiten jedoch für andere Proteine und größere
Maßstäbe verifiziert werden.
. Abb. 9.28  Die verschiedenen
Phasen des Schaums. (a) Schaumsäule
mit den verschiedenen Phasen:
Kugelschaum, Wabenschaum,
Polyederschaum; (b) Plateau-Border
(Manegold [83])
9.3.3 Flotation und Schaumseparation
In 7 Kap. 6 war bereits über den Störfaktor „Schaum“
während der Fermentation und dessen Eliminierung
berichtet worden. Bewegt sich eine Gasblase durch
eine grenzflächenaktive Substanzen enthaltende
wässrige Lösung (also z. B. die Fermentationslö-
sung), so wandern diese Substanzen an die Phasen-
grenzfläche Gas/Flüssigkeit und reichern sich dort
an (adsorbieren). Dabei orientieren sich die Mole-
küle so, dass die hydrophile Gruppe mit dem Wasser
in Kontakt bleibt, die hydrophobe Gruppe hingegen
aus der wässrigen Umgebung in die Gasblase hin-
einragt. Verlässt die Gasblase dann die Flüssigkeit
und passiert die Flüssigkeitsgrenze/oberfläche, die an
grenzflächenaktiven Substanzen angereichert ist, so
umgibt sie sich mit einer zweiten Adsorptionsschicht;
es bildet sich eine Lamellenblase. Unter realen Bedin-
gungen wandern viele Gasblasen durch die Flüssig-
keit (Begasen) und bilden beim Durchtritt durch
die Flüssigkeitsoberfläche einen Schaum. Dieser ist
zunächst, wie . Abb. 9.28a zeigt, kugelförmig. Das
in den Schaumlamellen befindliche Wasser fließt
aber – anfangs überwiegend als Folge der Schwer-
kraft, später zusätzlich durch die sogenannte „Saug-
wirkung der Plateau-Borders“ [76] – nach unten
ab. Diese Drainage führt zu einer Formänderung
des Schaums (. Abb. 9.28a). Der Kugelschaum geht
über Wabenschaum in Polyederschaum über. In der
Vergrößerung des Polyederzwickels (. Abb. 9.28b)
lässt sich auch die durch Grenzflächenspannungen
bedingte und von dem belgischen Forscher Plateau
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
beschriebene Drainage als Folge der Saugwirkung
der Plateau-Borders zumindest erahnen.
Jedenfalls ist in der auf diese Weise entwässerten
Schaumlamelle die Konzentration an grenzflächen-
aktiver Substanz erheblich größer als bei der Entste-
hung. Es liegt daher nahe, diesen Konzentrationsef-
fekt zur Produktgewinnung bzw. -anreicherung zu
nutzen. Das so ausgetragene Produkt kann entweder
selbst eine grenzflächenaktive Substanz sein (man
nennt dies Schaumfraktionierung) oder als partiku-
lärer Stoff so an diese Substanz angelagert sein, dass
er mitgerissen wird (Flotation). Beide Fälle sind für
die Bioproduktaufarbeitung interessant. Im ersten
Fall können dies Proteine (z. B. Enzyme), Polysac-
charide (z. B. Stärke), Nucleinsäuren (z. B. mRNA)
oder Fette sein, im zweiten Fall sind es oftmals Zellen.
Um Schaumfraktionierung bzw. Flotation für die
Aufarbeitung zu nutzen, müssen allerdings die den
Schaum beeinflussenden Parameter bekannt sein.
Dabei ist zwischen fundamentalen Faktoren und
abhängigen Faktoren zu unterscheiden [109]. Zu den
fundamentalen Faktoren gehören beispielsweise Art
und Konzentration der Materialien (Lösungsmittel,
gelöster Stoff, Gas), Temperatur, pH-Wert, Druck
und Anlagedesign. Abhängige Faktoren sind:
55 Löslichkeit,
55 Oberflächenspannung und -viskoelastizität,
55 Viskosität und Viskoelastizität der Flüssigkeit,
. Abb. 9.29  Vorrichtung zur Schaumfraktionierung (a) batch-Betrieb, (b) kontinuierlicher Betrieb im Anreicherungs-Modus,
(c) kontinuierlicher Betrieb im Stripping-Modus [87]
333 9
55 Gleichgewichtsverteilung,
55 Kinetik der Adsorption,
55 Bildung und Struktur des Schaums,
55 Schaumstabilität,
55 Schaumdrainage,
55 Schaumdichte (bzw. Schaumgehalt),
55 Größe, Größenverteilung und Gestalt der Blasen,
55 Verdampfungsenthalpie von Gelöstem und
Lösungsmittel,
55 Fließverhalten des Schaums.
Bei den genannten abhängigen Faktoren Viskoelas-
tizität (der Flüssigkeit) und Oberflächenviskoelas-
tizität ist zu bedenken, dass es sich bei der Blasen-
und Schaumbildung und vor allem der Drainage um
dynamische Vorgänge handelt. Theorie und Modelle,
die diese Vorgänge beschreiben wurden ausführlich
von Stevenson et al. [78] diskutiert. Im Folgenden
soll der Einfluss einiger Parameter auf den Anreiche-
rungsfaktor E = csch/cvor aufgezeigt werden.
[87] hat im Labormaßstab Cutinase, ein esteroly-
tisch aktives Enzym, das vom Pilz Coprinopsis cinerea
sekretiert wird und grenzflächenaktiv ist, aus dem
Kulturüberstand mittels Schaumfraktionierung bat-
chweise und kontinuierlich in verschiedenen Modi
angereichert (. Abb. 9.29a–c).
In . Abb. 9.30a sind die Aktivitätsausbeute, d. h.
der prozentuale Anteil der enzymatischen Aktivität
 334 H. Chmiel

im Schaum zu der in der Vorlage und der Anreiche-
rungsfaktor während einer batch-Schaumfraktionie-
rung als Funktion des Gasdurchsatzes aufgetragen.
Mit steigendem Gasdurchsatz nimmt der Anreiche-
rungsfaktor stetig ab, da die Menge an mitgerisse-
ner Flüssigkeit im Schaum steigt und gleichzeitig –
wegen der verringerten Verweilzeit des Schaums – die
­Drainage abnimmt. Andererseits steigt die Aktivitäts-
ausbeute. Darüber hinaus wurden Aktivitätsausbeute
und Anreicherungsfaktor als Funktion des pH-Werts
der Ausgangslösung bestimmt (. Abb. 9.30b).
Für beide wurde ein Optimum nahe dem iso-
elektrischen Punkt (für Cutinase pI = 6.7) gefunden.
Erklärt wird dies damit, dass bei diesem pH-Wert
die Löslichkeit des Zielproteins am niedrigsten
(s. 7 Abschn. 9.3.1) und somit die Affinität zur Bla-
senoberfläche am größten ist. Generell wurde fest-
gestellt, dass das Enzym Cutinase aus dem Kul-
turüberstand in einem einzigen Schritt mit einer
Ausbeute von bis zu 94 % bei einer 47-fachen Auf-
konzentrierung gewonnen werden konnte. Im kon-
tinuierlichen Betrieb wurden die Betriebsweisen
„Anreicherungs-Modus“ und „Stripping-Modus“
miteinander verglichen. Während beim „Anreiche-
rungs-Modus“ (. Abb. 9.29b) das Feed am Kopf der
flüssigen Phase zugegeben wurde, erfolgte die Zufüh-
rung beim „Stripping-Modus“ (. Abb. 9.29c) in der
darüber liegenden Schaumsäule. In diesem Fall fließt
die Feedlösung also im Gegenstrom zum aufsteigen-
den Schaum. Dadurch erhöht sich zwar die Aktivi-
tätsausbeute, aber der Anreicherungsfaktor sinkt.
Es zeigte sich, dass bei hochverdünnten Lösungen die
stripping Fahrweise zu einem stabileren und effizi-
enteren Prozess führte. Zusätzlich kann ein Teil des
bereits verflüssigten Schaums (Foamat) der Schaum-
säule nochmals zugegeben (recycelt) werden.
Bei der Maßstabsvergrößerung dieses Verfahrens –
allerdings nur im Labormaßstab – ergab sich, dass ein

9 . Abb. 9.30  Aktivitätsausbeute a

und Anreicherungsfaktors nach 100 30
der Schaumfraktionierung des 90
Kulturüberstandes im batch-Modus. 25
80
Kolonnendurchmesser 1,6 cm

Anreicherungsfaktor [-]
Aktivitätsausbeute [%]

und 15 min. Zerschäumung bei 70

20
24 °C. Aktivität im Foamat (rot), 60
Aktivität im Retentat (grau) und 50 15
Anreicherungsfaktor (▴). (a) in
40
Abhängigkeit von der Flussrate (pH 7),
10
(b) in Abhängigkeit vom pH-Wert (40 30
mL Luft/min.) [87] 20
5
10
0 0
15 20 30 40 50
Gasdurchsatz [mL min-1]
b
100 5
90
80 4
Anreicherungsfaktor [-]
Aktivitätsausbeute [%]

70
60 3
50
40 2
30
20 1
10
0 0
3.0 4.0 5.0 6.0 6.3 7.0 8.0 8.5
pH
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
335 9
Scale up bei konstantem Verhältnis Säulenhöhe zu
Durchmesser zu einer verbesserten Trennleistung
bei gleichbleibenden Schaumeigenschaften führte,
während beim Scale up des Säulendurchmessers bei
konstanter Säulenhöhe (analog der in 7 Abschn. 9.3.6
betrachteten Chromatographie) eine schlechtere
Trenneffizienz und eine veränderte Schaumstruktur
zu beobachten war.
Schultze [109] hatte die Schaumseparation bei
der Produktion des Biotensids Rhamnolipid zur
Anreicherung eingesetzt. Die Ergebnisse sind in
. Abb. 9.31 dargestellt. Dabei ist cvor die Konzent-
ration (in g/L) des Tensids in der Vorlageflüssigkeit
(also z. B. in der Fermentationsbrühe oder, wie in
diesem Beispiel, in der reinen Tensidlösung); c sch
ist die entsprechende Tensidkonzentration in der
Schaumlamelle (bzw. der Flüssigkeit, die beim Zer-
stören des Schaums gewonnen wird). . Abb. 9.31a
zeigt den großen Einfluss der Tensidkonzentration
der Vorlage auf den Anreicherungsfaktor. Unter
Berücksichtigung der Tatsache, dass bei jeder Ten- . Abb. 9.31  (a) Anreicherungsfaktor als Funktion der
sidlösung eine Mindestkonzentration cvor erforder- Vorlagekonzentration in einer wässrigen Rhamnolipidlösung
lich ist, um überhaupt einen stabilen Schaum zu für verschiedene Gasdurchsätze (Probenahmehöhe:
145 cm); (b) Anreicherungsfaktor für Tensid und Protein
erzeugen (im Beispiel etwa bei cvor = 0,05 g/L) liegt
in Abhängigkeit vom Gasdurchsatz für das Permeat einer
der interessante Anwendungsbereich der Schaum- Rhamnolipid-Fermentation (nach [109])
fraktionierung hier bei cvor = 0,05 g/L bis 0,25 g/L.
Parameter in . Abb. 9.31a ist der Gasdurchsatz. Die
Daten in . Abb. 9.31a waren mit reinen wässrigen Hier werden die Grenzen des Verfahrens sicht-
Tensidlösungen gefunden worden. Sie wurden aber bar. Aus ökonomischen Gründen sind nachfolgende
analog durch Messungen an realen, d. h. aus der Fer- Reinigungsschritte angezeigt.
mentation mittels Mikrofiltration abgetrennten und Weitere Beispiele zur Schaumseparation siehe Li
damit neben Rhamnolipid auch Proteine enthalten- und Stevenson [78].
den Lösungen qualitativ bestätigt (. Abb. 9.31b).
Auch für dieses System wurde die Abhängigkeit
des Gasdurchsatzes auf die Anreicherung gezeigt. 9.3.4 Membranseparation
Der Anreicherungsfaktor nimmt mit zunehmen-
dem Gasdurchsatz sowohl für das Tensid als auch Die beste Definition einer Membran liefert uns
für die Verunreinigung (das Protein) ab. Gleichzeitig die Natur, wo biologische Membranen ubiquitär
erhöht sich aber das Verhältnis von Verunreinigung sind. Sie ermöglichen den selektiven Transport
zu Tensid. Die Tensidkonzentration wächst über- von Wasser und Gelöstem in die Zelle (Nährstoffe)
proportional mit der Temperatur; offensichtlich ein und aus der Zelle heraus (Endprodukte). In diesem
Ergebnis der sinkenden Viskosität der zu drainie- Kontext ist eine Membran eine dünnwandige Struk-
renden Flüssigkeit. Die maximal erreichbare Rham- tur, die die einzelnen Komponenten einer Flüssig-
nolipidkonzentration betrug 12,5 g/L. Diese wurde keitsmischung (Lösung oder Suspension) selektiv
aber erst bei einer Verweilzeit des Schaums in der passieren lässt. Eine weitere wichtige Forderung ist,
Säule von ca. 40 Minuten erreicht. Bei gleichzeitiger dass dieser Transport – im Gegensatz zur Filtration
Anwesenheit von Proteinen im Schaum reduzierte – kontinuierlich oder quasi kontinuierlich erfolgt.
sich die maximale Rhamnolipidkonzentration und Bedenkt man, dass in der Natur – angefangen
es erhöhte sich die notwendige Verweilzeit. von Mikroorganismen, über Pflanzen, Tiere, bis zum
 336 H. Chmiel
Menschen – bei nahezu jedem Stofftrennprozess
Membranen involviert sind, so fragt man sich, warum
in der Biotechnologie und insbesondere beim Downs-
tream Processing der Einsatz synthetischer Membra-
nen vergleichsweise begrenzt ist. Die Antwort könnte
trivial lauten: weil synthetische Membranen in ihrer
Leistungsfähigkeit noch zu weit von derjenigen biolo-
gischer Membranen entfernt sind und weil sie darüber
hinaus zu teuer sind. Beides mag richtig sein; die Ent-
wicklung ist aber so rasant (Steigerung der Leistungs-
fähigkeit und Senkung der Membrankosten), dass es
sich lohnt, Neuentwicklungen auf ihre Tauglichkeit
für Bioseparationsprozesse zu untersuchen.
Membranmaterialien und -strukturen
Material und Struktur einer synthetischen Membran
bestimmen ganz wesentlich deren Trennverhalten.
Sie sollen daher kurz vorgestellt werden.
Membranen können heute aus nahezu jedem
9 organischen oder anorganischen Werkstoff herge-
stellt werden. Die häufigsten organischen Ausgangs-
materialien sind Cellulose und Cellulose-Derivate,
Polyamid, Polysulfon, Polyethersulfon, Polyether-
keton, Polyetherimid, Polyacrylnitril, Polypropylen,
Polytetrafluorethylen (PTFE), Polyvinylidenfluorid
(PVDF), Polycarbonate und Polysiloxane.
Bei den anorganischen Materialien werden zur
Membranherstellung vor allem Aluminumoxid, Sili-
ciumoxid, Zirkonoxid, Siliciumcarbid, Glas und Zeo-
lithe, aber auch Metalle wie Aluminium, Palladium
und deren Legierungen verwendet.
Die eingangs genannte Definition für eine
Membran würde vermuten lassen, dass sie porös
sein muss. Dies ist aber nicht richtig, wie die in
. Abb. 9.45a dargestellte Pervaporationsmembran
(z. B. auf Basis von PDMS) oder Membranen zur
Gastrennung (Palladium und dessen Legierungen)
beweisen. Dennoch ist die weit überwiegende Zahl
der in der Biotechnologie verwendeten Membranen
mikroporös, weshalb sich die Vorstellung von Mem-
branstrukturen darauf beschränken. . Abb. 9.32a
zeigt eine durch Phaseninversion hergestellte asym-
metrische Hohlfasermembran aus Polyethersulfon.
Die Entstehung der fingerartigen Struktur lässt sich
anhand eines in . Abb. 9.32b dargestellten ternären
Mischungsdiagramms erläutern.
Es besteht grob aus zwei Bereichen. Im Ein-
phasengebiet (weiß) sind alle drei Komponenten,
also Polymer (hier Polyethersulfon), Lösungsmittel
(hier DMF) und Fällungsmittel (Wasser). Der zweite
Bereich (rot) stellt eine Mischungslücke dar. Auf dem
Weg von A nach D gibt die Polymerlösung Lösungs-
mittel an das Fällungsmittel ab. Sie überschreitet bei
B die Binodalkurve und tritt von B nach C in eine
unstabile Phase (hellrot), in der sich ein Gel bildet.
Bei Überschreiten der Spinodalkurve bei C wandelt
sie sich in eine feste, glasartige Phase (dunkelrot) um,
die das Membrangerüst darstellt. In der Praxis geht
man bei der Herstellung der gezeigten Membran so
vor, dass die Polymerlösung über Düsen als Hohlfä-
den in ein Wasserbad „gesponnen“ werden. Die Fest-
phasenbildung findet von außen nach innen statt,
was die Asymmetrie der Poren erklärt.
Eine andere Struktur zeigt die anorganische
Flachmembran in . Abb. 9.32c. Sie besteht aus mehre-
ren Schichten von nach oben hin abnehmendem Par-
tikeldurchmesser (siehe schematische Darstellung,
. Abb. 9.32d). Der Support besteht aus vergleichs-
weise groben Partikeln (Porengröße: 1–10 μm) aus
z. B. Al2O3, TiO2, SiC die durch Extrudieren oder
Schlemmen erzeugt, getrocknet (Grünkörper) und
bei Temperaturen oberhalb 1000 °C kalziniert wird.
Die selektiven Schichten werden als Sol/Gel durch
Tauchen oder Sprühen aufgebracht und nach dem
gleichen Verfahren getrocknet und kalziniert.
Die dritte Membran in . Abb. 9.32e besteht aus
einem kristallinen Polymer wie z. B. Polypropylen
und entsteht durch Recken. Dabei bilden sich feine
Risse, die diese Membran charakterisieren. Es leuch-
tet ein, dass das Separationsverhalten dieser Memb-
ranen völlig unterschiedlich ist.
Wegen des stark asymmetrischen Verhaltens
der Phaseninversionsmembran ist deren Druck-
verlust sehr gering. Dies trifft auch für die kera-
mische Membran zu, jedoch ist wegen der riesi-
gen Oberfläche, die die Partikel bilden, mit starken
Adsorptionsvorgängen zu rechnen. Bei der gereck-
ten Membran kann man im eigentlichen Sinne nicht
von einer Pore sprechen, die man sich üblicherweise
rund vorstellt.
Die mittels Stickstoffadsorption gemessenen
Porengrößenverteilungen von zwei Nanofiltra-
tionsmembranen – einer keramischen und einer
Polymer-Membran – sind in . Abb. 9.33 darge-
stellt. Man erkennt die im Vergleich zur Kera-
mikmembran breite Porengrößenverteilung der
Polymembran.
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
337 9
a b Polymer
Binodalkurve
metastabile
Region
Spinodalkurve
D

A B C

Lösungsmittel Fällungsmittel

c d NF-Lage

UF-Lage

MF-Lage

Support
e

. Abb. 9.32  Membranstrukturen und deren Herstellung. (a) Phaseninversionsmembran; (b) ternäres Mischungsdiagramm;
(c) REM-Aufnahme einer anorganischen, keramischen Flachmembran (mit freundlicher Genehmigung des Fraunhofer IKTS und
der Fa inopor GmbH); (d) schematische Darstellung der anorganischen Flachmembran; NF: Nanofiltration, UF: Ultrafiltration, MF:
Mikrofiltration; (e) gereckte Polypropylenmembran

. Abb. 9.33  Mittels

Stickstoffadsorptionsmessung bestimmte
Porengrößenverteilung für zwei
Nanofiltrationsmembranen:
 338 H. Chmiel

Membrancharakterisierung mischt ein Lösungsmittel (in der Regel Wasser) mit

Es ist zu erwarten, dass die unterschiedlichen Poren-
verteilungen sich im Separationsverhalten der Memb-
ranen niederschlagen. Im Folgenden werden die Para-
meter zur Membrancharakterisierung vorgestellt.
In . Abb. 9.34 ist ein Membrantrennprozess sche-
matisch dargestellt. Daraus lassen sich unmittelbar
folgende Parameter ableiten:
VF = Feedvolumenstrom (der Membran zuge-
führter Volumenstrom)
V R = Retentatvolumenstrom (von Membran
zurückgehaltener Volumenstrom)
VP = Permeatvolumenstrom (die Membran per-
meierender Volumenstrom)
JP = Membranfluss/Flux (auf die Membranfläche
AM bezogener Volumenstrom)
P = Permeabilität (auf die transmembrane
Druckdifferenz bezogener Membranfluss)
VP
P=  Gl. 9.15
9 AM∆p
S = Selektivität (Verhältnis der Konzentrationen in
Permeat und Feed)
cPi / cPj
Sij =  Gl. 9.16
cFi / cFj
R = Rückhalt (Trennschärfe einer Membran bzgl.
einer Komponente i)
cFi,cFj = Feedkonzentration der Komponenten i
und j
cPi,cPj = Permeatkonzentration der Komponen-
ten i und j
c − cPi
Ri = Fi ⋅100 %  Gl. 9.17
cFi
Das Rückhaltevermögen einer Membran kann expe-
rimentell auf folgende Weise bestimmt werden: Man
Partikeln bzw. Molekülen unterschiedlicher, jedoch
bekannter Größe. In Filtrationsversuchen bestimmt
man dann den Anteil der jeweiligen Partikel – bzw.
die Molekülgröße –, der die Membran passiert hat.
. Abb. 9.35 zeigt schematisch das Ergebnis für zwei
verschiedene Membranen. Bei einem Rückhalt von
90 % – Trenngrenze bzw. cut-off genannt – sind beide
nahezu gleich. Sie unterscheiden sich jedoch deutlich
in der Neigung der Kurven, die unmittelbar von der
Porengrößenverteilung abhängen. Eine enge Porengrö-
ßenverteilung bedeutet eine steile Rückhaltekurve und
damit eine (erwünscht) hohe Selektivität. Die flache
Rückhaltekurve ist – wegen ihrer geringen Selektivi-
tät – für die Produktkonzentrierung nicht geeignet.
Wenn man die Highlights der Membranentwick-
lung der letzten zehn Jahre auf einen Nenner bringt,
so sind dies die Verbesserung der thermischen und
chemischen Stabilität, die Erhöhung der Selektivi-
tät durch engere Porengrößenverteilung der Memb-
ranen und schließlich die drastische Reduktion der
Membranpreise.
Weitere wichtige Faktoren für die biotechnolo-
gische Anwendung von Membranen sind Ausbeute
und Aufkonzentrierungsfaktor. Die Ausbeute ist das
Verhältnis von Permeatvolumenstrom zu Feedvolu-
menstrom in Prozent und ist von Bedeutung, wenn das
Permeat das Produkt ist. Der Aufkonzentrierungsfak-
tor ist das Verhältnis der Konzentration der interessie-
renden Komponente in Retentat und Feed. . Abb. 9.36
stellt den Zusammenhang dieser beiden Größen dar.
Treibende Kräfte für den
Stofftransport durch
Membranen
Im vorigen Abschnitt wurden Begriffe wie Fluss,
Selektivität und Rückhaltevermögen definiert. Es
stellt sich nun die Frage, wie sie zum Nutzen der

. Abb. 9.34  Schematische

Darstellung eines Membranprozesses
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
339 9

. Abb. 9.35  Vergleich des Trennverhaltens von zwei unterschiedlichen Membranen (a) breite Porenverteilung, (b) enge
Porenverteilung)

. Abb. 9.36  Zusammenhang zwischen Restvolumen und Ausbeute bzw. Aufkonzentrierungsfaktor

Produktreinigung beeinflusst werden können. Es zusätzlichen Widerstand. Eine gewisse Memb-

gilt zunächst der pauschale Zusammenhang:
 / Σ Widerstande
Fluss = Σ treibendeKrafte 
Betrachtet man nochmals die Keramikmemb-
ran in . Abb. 9.35, so bedeutet jede Schicht einen
randicke ist aber notwendig, um einem angeleg-
ten Differenzdruck – in diesem Fall die treibende
Kraft – mechanisch standzuhalten. Die Selektivi-
tät für unterschiedlich große Partikel ergibt sich aus
dem – möglichst einheitlichen – Porendurchmesser
der aktiven (obersten) Schicht.
 340 H. Chmiel

Aber der Druck ist nur eine der möglichen trei-
benden Kräfte. Die Summe aller treibenden Kräfte ist
das chemische Potenzial. Bezeichnet man die Strö-
mungsrichtung durch die Membran mit x, so gilt für
den Fluss der Komponente i die – etwas vereinfacht
formulierte – Nernst-Planck-Gleichung:
dp dc
J i = −ci ⋅ bki ⋅ − Di ⋅ i − ci ⋅ zi ⋅ ui ⋅
dx dx
Ji = Fluss der Komponente i
ci = Konzentration der Komponente i
bki = konvektive Beweglichkeit von i
p = Druck
Di = Diffusionskoeffizient von i
zi = Ladung eines Ions
ui = Beweglichkeit eines Ions
φ = elektrisches Potenzial
Demnach setzt sich die treibende Kraft aus den
Termen Konvektion mit dem Druckgradienten dp/
dx, der Diffusion mit den Konzentrationsgradienten
dci/dx und dem Gradienten des elektrischen Poten-
dϕ zials dφ/dx zusammen.
 Gl. 9.18
dx In . Tab. 9.2 sind die wichtigsten in der Biotech-
nologie verwendeten Membrantrennverfahren auf-
geführt. Interessant ist, dass jedes von einer trei-
benden Kraft dominiert wird. In der Tabelle sind
noch der Membrantyp und die biotechnologische
Applikation angegeben. Danach unterscheidet man
Druck-, Lösungsdiffusions- und elektrisch getrie-
bene Membrantrennverfahren.

. Tab. 9.2  Druckgetriebene Membrantrennverfahren

Membrantrennverfahren Treibende Kraft für den Trennprinzip biotechnische Applikation

9 Stofftransport

Mikrofiltration Druckdifferenz <2 bar Poren >50 nm Biomasse-Rückhalt, Entfernung

makromolekularer Produkte aus dem
Bioreaktor
Ultrafiltration Druckdifferenz 2–10 bar Poren 50–5 nm Entfernung niedermolekularer Stoffe
aus dem Bioreaktor/Konzentrierung
von makromolekularen Lösungen
Nanofiltration Druckdifferenz 5–30 bar Poren 5–0,5 nm Abtrennung organischer
Komponenten und mehrwertiger von
einwertigen Salzen
Umkehrosmose Druckdifferenz Lösungs-Diffusion Entfernung von niedermolekularen
10–200 bar Stoffen (Salze, Organik)
Pervaporation Partialdruckdifferenz Lösungs-Diffusion Entfernung leicht flüchtiger
Komponenten
Gastrennung Partialdruckdifferenz Lösungs-Diffusion Trennung von Dampfgemischen,
Abreicherung von CO2, Anreicherung
von O2
Flüssigmembrantrennung Konzentrationsdifferenz gekoppelter Trennung racemischer Gemische
Transport
Dialyse Konzentrationsdifferenz Poren-Diffusion, Abtrennung von inhibierenden
beidseits wässrige Stoffen mit niedrigem
Phase Molekulargewicht
Diafiltration Konzentrations- plus Kombination Entfernung niedermolekularer Stoffe
Druckdifferenz von Dialyse und und Zuführung von Medium
Ultrafiltration
Elektrodialyse elektrische Co-Ionenausschluss Konzentrierung organischer
Potentialdifferenz durch Festladungen Säuren, Entfernung von Salzen,
in der Membran Racemattrennung (Aminosäuren)
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
Druckgetriebene
Membrantrennverfahren
In der Biotechnologie sind Membrantrennprozesse,
bei denen der Transport durch die Membran auf-
grund einer Druckdifferenz erfolgt, am meisten
verbreitet.
Bei den oben vorgestellten Kenngrößen Selekti-
vität, Rückhaltevermögen, Trenngrenze und Flux –
häufig auch transmembraner Fluss (TMF) genannt
– ist ein weiterer wichtiger Parameter, der vor allem
die Wirtschaftlichkeit von druckgetriebenen Mem-
branprozessen wesentlich beeinflusst, die Permea-
bilität, das ist der TMF, auf ein bar transmembrane
Druckdifferenz (TMP) bezogen, hat also die Dimen-
sion l/m2h bar.
In . Tab. 9.2 sind die heute verwendeten druckge-
triebene Membrantrennverfahren mit ihren Trenn-
grenzen und ihren biotechnischen Applikationen
zusammengestellt. Mit Ausnahme der Umkehros-
mose stehen für alle druckgetriebenen Verfahren
neben organischen Polymermembranen auch solche
auf anorganischer Basis, insbesondere Aluminium-,
Titan- und Zirkonoxid sowie Siliciumcarbid kom-
merziell zur Verfügung. Neben den bereits erwähn-
ten Vorteilen der chemischen (z. B. Säure, Lauge und
organische Lösungsmittel) und thermischen (Sterili-
sation) Stabilität zeichnen sich anorganische Memb-
ranen durch enge Porenverteilung und damit scharfe
Trenngrenzen aus.
Die Mikrofiltration (MF) – mit Membranporen-
durchmessern >50 nm und transmembranen Druck-
differenzen <2 bar – wird zur Abtrennung von Bio-
masse genutzt. Im Bioreaktor integriert oder im
externen Kreislauf geschaltet dient sie zum Austrag
von sekretierten Produkten bzw. toxischen oder
inhibierenden Substanzen bei gleichzeitigem Zell-
rückhalt (7 Kap. 6). In der aeroben biologischen
Abwasserreinigung ist diese Technik unter dem
Begriff submerser Membran-Bioreaktor (SMBR,
submerged membrane bioreactor) weit verbreitet.
Für Produktionszwecke muss die integrierte
Membran allerdings sterilisierbar sein. Neue kera-
mische und Polymer-Membranen machen dies
möglich.
Auch für Reinigungsschritte wie z. B. das Abfil-
trieren des Überstands nach Zelllyse und Präzipi-
tation und die nachfolgende Elimination der Zell-
Debris mittels keramischer MF-Membran [74], die
341 9
Aufkonzentrierung bei der Schaumseparation oder
die Gewinnung von Exopolysacchariden mit Rück-
führung der retentierten Zellen in den Bioreaktor
wird die Mikrofiltration eingesetzt.
Bei der Ultrafiltration (UF) liegt die transmem-
brane Druckdifferenz bei 2–10 bar. Die asymmet-
rischen Membranporen haben Durchmesser von
5–50 nm. Damit ist die Ultrafiltration vor allem für
die Aufkonzentrierung makromolekularer Lösun-
gen wie z. B. Polysaccharidlösungen oder Prote-
inlösungen geeignet. Aber auch zur Abtrennung
von Antibiotika und anderen niedermolekularen
Komponenten aus dem Bioreaktor und zur Rück-
haltung der Enzyme im Membranreaktor wird die
UF eingesetzt.
Die Nanofiltration (NF) hat eine Besonderheit.
NF-Membranen tragen häufig an ihrer Oberfläche
elektrische Ladungen. Dadurch und durch ihre sehr
kleinen Poren von etwa 1 nm sind sie in der Lage, ver-
schiedene niedermolekulare Stoffe, aber auch mehr-
wertige von einwertigen Ionen zu trennen. Voraus-
setzung dafür ist jedoch eine scharfe Trenngrenze.
In . Abb. 9.37 haben die Membranen Toray-
SU­600 und Film Tec-NF40 die geforderte Trenn-
charakteristik. Beide sind in der Lage, Glucose aus
einer wässrigen Lösung fast vollständig (>85 %)
zurückzuhalten. Negativ geladene NF-Membra-
nen lassen Aminosäuren unterhalb ihres isoelektri-
schen Punktes fast vollständig permeieren, oberhalb
des isoelektrischen Punktes werden sie mehr oder
weniger zurückgehalten (bei pH 12: L-Asparagin-
säure ca. 80 %; L-Isoleucin ca. 50 %). Da die meisten
Proteine in der Nähe von pH 7 negativ geladen sind,
eignen sich negativ geladene NF-Membranen und
insbesondere keramische NF-Membranen gut zu
deren Aufkonzentrierung. Voigt et al. [129] gelang
es, die molekulare Trenngrenze auf 200 Dalton zu
senken und damit den unteren Bereich der Nanofil-
tration zu erschließen. . Abb. 9.32 zeigt das Schema
(d) und eine REM-Aufnahme (c) einer solchen
Membran mit asymmetrischem Schichtenaufbau.
Dadurch kann die (oberste) selektive Schicht extrem
dünn sein (50 nm), eine Voraussetzung für eine hohe
Permeabilität von etwa 10 l/m²hbar. Bei einem zuläs-
sigen TMP von 30 bar erzielt man somit Permeat-
flüsse von 300 L/m2h.
Näheres zur Nanofiltration und zur Model-
lierung der Transportvorgänge durch derartige
 342 H. Chmiel

. Abb. 9.37  Rückhaltevermögen

einer Umkehrosmose(RO)-Membran
(rot) im Vergleich zu verschiedenen
kommerziell verfügbaren NF-
Membranen für verschiedene
organische Komponenten
(Rautenbach und Gröschl [97])

Membranen kann bei Chmiel et al. nachgelesen

werden.
Membranen mit molekularen Trenngrenzen
unter 200 Dalton werden der Umkehrosmose (RO)
9 zugerechnet. Sie halten Salze fast vollständig zurück.
Methanol und Ethanol permeieren aber diese Memb-
ranen weitgehend – wie aus . Abb. 9.37 (rote Kurve)
hervorgeht. RO-Membranen können mit trans-
membranen Druckdifferenzen von mehr als 200 bar
betrieben werden.

Adsorption, Konzentrationspolarisation,
Fouling und ­Scaling
Im Folgenden soll auf ein Phänomen eingegangen
werden, dass bei allen technischen Membrantrenn-
verfahren auftritt und diese in der Vergangenheit
in Misskredit gebracht hat. Unter realen Bedingun-
gen verändern sich die Trenneigenschaften einer
Membran mit der Betriebszeit. Dieser unter den
Begriffen Membran-Fouling und -Scaling subsu- . Abb. 9.38  Ausbildung der Konzentrationspolarisation an
einer Membran (a) vor Beginn der Filtration; (b) im stationären
mierte Effekt gilt für alle Membrantrennverfahren
Filtrationszustand
und soll daher näher untersucht werden.
Anhand der Schemaskizze in . Abb. 9.38 sollen
die Vorgänge Adsorption, Konzentrationspola- Wechselwirkungen zwischen den Bestandteilen der
risation und Membranfouling erläutert werden. Rohlösung und der Membran ein Stofftransport JA.
Hier sind die zu filtrierende Rohlösung mit (1), die Diese Wechselwirkungen sind von den Komponen-
Membran mit (2) und das Filtrat mit (3) bezeich- ten und der Konzentration abhängig. Grenzflächen-
net. Bereits zum Zeitpunkt 0 d. h. dem Augenblick, aktive Stoffe wie z. B. Proteine adsorbieren besonders
in dem die Rohlösung mit der Membran in Kontakt heftig und bilden innerhalb kürzester Zeit auf der
gebracht wird, aber noch keine Filtration stattfin- Membran einen Belag. Beginnt nun der eigentliche
det (. Abb. 9.38a), beginnt aufgrund adsorptiver Filtrationsvorgang, so wandern mit dem diffusiven
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
und konvektiven Stofftransport (JD + JK = J) sowohl
Komponenten, die die Membran permeieren, als
auch solche, die von ihr zurückgehalten werden in
Richtung Membran. Ist J groß genug, so können
die zurückgehaltenen Komponenten nicht schnell
genug zurückdiffundieren (JB). Es kommt an der
Membran zu einer Konzentrationsüberhöhung der
zurückgehaltenen Komponenten der sogenannten
Konzentrationspolarisation. Die erhöhte Konzent-
ration in Membrannähe bedeutet verstärkte Adsorp-
tion. Der Membranbelag wächst übrigens bis in die
Pore hinein. Gleichzeitig verändert sich das Rück-
haltevermögen der Membran hin zu kleineren Teil-
chen bzw. Molekülen. Komponenten, die ursprüng-
lich die Membran passierten, werden nun ebenfalls
zurückgehalten.
Dieser circulus viciosus kann so weit gehen,
dass die Löslichkeitsgrenzen einzelner Komponen-
ten überschritten werden. Es bildet sich dann auf
der Membran eine Gelschicht. Dieser als Fouling
bezeichnete Effekt ist bei Anwesenheit von Mikro-
organismen besonders dramatisch, weil diese dann
auf der Membran aufwachsen (Biofouling). Die Kon-
sequenz ist ein monotoner Abfall des transmemb-
ranen Flusses (TMF) mit der Filtrationszeit analog
. Abb. 9.39.
Folgende Maßnahmen sind zu ergreifen:
55 Die Anströmung der Membran erfolgt
tangential (sogenannter cross-flow) statt ortho-
gonal (dead end).
55 Die Durchströmung der Membran wird
zyklisch umgekehrt (Rückspülung eventuell
. Abb. 9.39  Transmembranfluss (TMF) über der Zeit
für eine 5 %ige Hefesuspension mit einer Ultrafiltrations-
(schwarze Kurve) und einer Mikrofiltrationsmembran (rote
Kurve)
343 9
auch mit reinem Wasser und Reinigungs-
mitteln gemäß . Abb. 9.39).
55 Der transmembrane Fluss wird niedriger
gewählt, um die Konzentrationspolarisation zu
reduzieren.
55 Es wird ein Membranmaterial gewählt, das mit
den Komponenten der Rohlösung möglichst
wenig interagiert.
Neben diesen, für alle Membranverfahren geltenden
Maßnahmen, gibt es spezielle Strategien, die im Ein-
zelnen später erläutert werden. . Abb. 9.39 zeigt für
die druckgetriebenen Membranprozesse Mikrofiltra-
tion und Ultrafitration die Wirkung von zyklischem
Rückspülen auf das Fouling. Wegen der höheren
Porosität, d. h. der größeren Gesamtporenfläche der
MF-Membran ist ihr TMF zu Beginn der Filtration
deutlich höher als bei der UF-Membran. Der TMF
fällt aber bei konstantem TMP mit zunehmender
Filtrationszeit steil ab und unterschreitet nach ca.
2,5 h den der UF-Membran. Selbst nach einer Rück-
spülung erreicht er aber nicht mehr den TMF der
UF-Membran. Die Ursache hierfür soll anhand der
schematischen Darstellung in . Abb. 9.40 erläutert
werden. . Abb. 9.40a zeigt idealisiert den Filtrations-
und Rückspülvorgang für eine poröse Membran
mit einem mittleren Porendurchmesser von 50 nm.
In der Realität wird der Filtrationsvorgang jedoch
durch Adsorption von Makromolekülen überlagert
(. Abb. 9.40b). Dies hat zur Folge, dass der mittlere
Porendurchmesser, die Porosität der Membran und
damit auch die Permeabilität drastisch abnehmen.
Parallel dazu schwächt sich bei gleichem Rückspül-
druck auch die Effektivität der Rückspülung ab.
Ergebnis ist letztlich das Verblocken der Membran
(. Abb. 9.40c).
Da in . Abb. 9.39 der transmembrane Druck
konstant gehalten wurde, könnte man den TMF
durch den TMP dividieren und erhielte – bei glei-
chem Kurvenverlauf – als Skalierung die Permeabi-
lität P. Hält man statt des transmembranen Drucks
den transmembranen Fluss konstant, so erhält man
praktisch den gleichen Permeabilitätsverlauf. Unter
zu Hilfenahme des Hagen-Poiseuille’schen Gesetzes
(7 Kap. 4, Gl. 4.10) lässt sich zeigen, warum die Per-
meabilität so drastisch abnimmt. Wird die Perme-
abilität einer einzelnen Pore PP mit dem mittleren
 344 H. Chmiel

b c

. Abb. 9.40  Schematische Darstellung des Filtrations-, Rückspül- und Foulingvorgangs einer MF/UF-Membran mit einem
mittleren Porendurchmesser von 50 nm, (a) ohne Proteinadsorption, (b) Proteinadsorptions-Vorgang, (c) verblockte Membran

Porenradius RP, der Porenlänge LP und dem Fluss VP
in Gl. 4.10 eingesetzt, so ergibt sich wegen
8 ⋅ η ⋅ L ⋅ V VP π ⋅ RP4
∆p = PP = PP =
π ⋅ R4 ∆p 8 ⋅ η ⋅ LP
 Gl. 9.19
Bei einer Adsorptionsschicht von nur 1 nm reduziert
sich im gewählten Beispiel der mittlere Porenradius
von 25 nm auf 24 nm und damit die Permeabilität
um15 %. Bei 2 nm sind es bereits 28 % und bei 3 nm
40 %. Dieser Vorgang wird noch von den auf der
Oberfläche der Membran zurückgehaltenen Kom-
ponenten überlagert. Letztere können durch zykli-
sche Rückspülung abgetragen werden. Da die Scher-
kräfte bei der Rückspülung in der Pore zu gering sind
wächst die adsorbierte Schicht aber immer weiter an.
Kleinere Poren werden vollständig verschlossen.
Während bei der Ultrafiltration abhängig vom
Porendurchmesser nur kleine Moleküle zur Adsorp-
tion beitragen können, sind es bei der Mikrofiltration
auch Makromoleküle. Daraus resultiert der Unter-
schied zwischen MF und UF in . Abb. 9.39. Übri-
gens adsorbieren alle permeierten Moleküle auch auf
der Rückseite der Membran. Zu einem bestimmten
Zeitpunkt wird der Filtrationsprozess unwirtschaft-
lich. Membran und Modul müssen gereinigt werden.
Je nach Art der Ablagerungen (mikrobielle, organi-
sche oder anorganische) kommen wässrige Lösun-
gen Natriumhypochlorit, Salzsäure, Natronlauge,
Wasserstoffperoxyd, EDTA oder Ozon zum Einsatz.
Welche Reinigungsmedien verwendet werden
können, hängt natürlich auch vom Membran- und
Modulmaterial ab. Werden statt organischer anorga-
nische Ablagerungen auf der Membran festgestellt,
so spricht man von Scaling. Dieses wird vor allem bei
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
der Umkehrosmose und der später beschriebenen
Elektrodialyse beobachtet.
Membran- und Modulgeo-
metrien für druckgetriebene
­Membrantrennprozesse
Die technische Anordnung von Membranen wird als
Modul bezeichnet. Im Modul sollen für die jeweilige
Anwendung optimierte Bedingungen für den Mem-
brantrennprozess realisiert werden. Die Optimie-
rung bei der Entwicklung von Modulen stellt zumeist
einen Kompromiss dar, da einige der im Folgenden
angeführten Anforderungen im Widerspruch zuei-
nander stehen, wie z. B.:
55 gute, gleichmäßige Überströmung der
Membran,
55 geringe Druckverluste,
55 große Packungsdichte,
a b
. Abb. 9.41  UF-PVDF-Hohlfasermodul: (a) Schema des Moduls (b) Schnittbild des Moduls (c) REM-Aufnahme der Hohlfaser
(mit freundlicher Genehmigung der Fa. Pall GmbH)
345 9
55 mechanische, chemische und thermische
Stabilität,
55 kostengünstige Fertigung und
55 gute Reinigungsmöglichkeit.
Im Wesentlichen sind die zurzeit erhältlichen
Module entweder mit Schlauchmembranen oder
mit Flachmembranen bestückt.
. Abb. 9.41 zeigt ein UF-Hohlfasermodul, der
mit einer Membranfläche von bis zu 50 m2 bestückt
werden kann. Der Außendurchmesser, der aus Poly-
vinylidenfluorid (PVDF) bestehenden Hohlfaser
beträgt 1,4 mm, der Innendurchmesser 0,7 mm, die
mittlere Porenweite 20 nm. Die Hohlfaser wird quasi
dead-end von außen nach innen durchströmt und ist
damit für den Rückhalt geringer Mengen von Verun-
reinigungen einzusetzen. Sie kann mit maximal 4 bar
von innen nach außen rückgespült werden. Die Ras-
teraufnahme in c) zeigt den symmetrischen Aufbau
 346 H. Chmiel
der hochkristallinen Membran. PVDF ist bekannt
für seine Beständigkeit gegen eine Vielzahl von in
Wasser verdünnten Reinigungsmitteln wie z. B. Nat-
riumhypochlorit, NaOH, HCl, H2O2, EDTA und
O3. Als Betriebstemperatur wird maximal 40 °C
angegeben.
Keramische Membranen können neben ihrer
chemischen Beständigkeit auf die Vorteile Dampf-
sterilisierbarkeit und eine enge Porenverteilung
verweisen.
. Abb. 9.42 zeigt mehrere von innen nach außen
durchströmbare Mehrkanal-Rohrmembran-Mo-
dule. Der in . Abb. 9.32c und 9.32d gezeigte Multi-
Layer-Aufbau der Keramikmembran gestattet es,
das gleiche Modul im Prinzip mit MF-, UF- oder
NF-Membranen (bis hinunter zu einer Trenngren-
zen von 200 D) auszurüsten. Im Vergleich zum
oben genannten Hohlfasermodul ist die Packungs-
dichte (Membranfläche/Modulvolumen) natür-
lich geringer und die Kosten sind materialbedingt
9 höher.
. Abb. 9.43 gibt Beispiele für Module mit Flach-
membranen, und zwar Einweg-Kassettenmodule
(. Abb. 9.43a), wie sie in der biopharmazeutischen
Arzneimittelherstellung verwendet werden und ein
Wickelmodul (. Abb. 9.43b, schematisch), der bei
der Ultrafiltration und Umkehrosmose Anwen-
dung findet. . Abb. 9.43c zeigt eine asymmetrische
Ultrafiltrations-Flachmembran.
Vor- und Nachteile der verschiedenen Module
und typische Applikationen in der Biotechnologie
sind in . Tab. 9.3 zusammengestellt.
a b
. Abb. 9.42  Keramische Mehrkanal-Membranen (a) und keramisches Membran-Modul (b) (mit freundlicher Genehmigung
der Fa. Inopor GmbH)
Membranen zur Gastrennung und Per-
vaporation
Gastrennung und Pervaporation sind zwei Memb-
ranprozesse mit einigen Gemeinsamkeiten:
55 Die treibende Kraft für den Stofftransport ist
eine Partialdruckdifferenz.
55 Das Produkt wird in gasförmiger Phase
erhalten.
55 Die selektive Schicht der Membran besteht aus
einem porenfreien Polymerfilm.
55 Die die Membran permeierenden Kompo-
nenten werden im gasförmigen Zustand im
Polymerfilm gelöst und verlassen diesen auch
im gasförmigen Zustand.
Aus der letztgenannten Gemeinsamkeit lässt sich
aber auch der Unterschied der beiden Prozesse
ableiten: Während bei der Gastrennung die per-
meierenden Komponenten ihren Aggregatszu-
stand nicht ändern, müssen sie bei der Pervapora-
tion zunächst vom flüssigen in den dampfförmigen
Zustand überführt werden. Dieser Unterschied ist
vom wirtschaftlichen Gesichtspunkt her äußerst
bedeutsam.
Das Polymer der selektiven Schicht ist so zu
wählen, dass die voneinander zu trennenden Kom-
ponenten sich in ihrer Löslichkeit und ihrem Dif-
fusionskoeffizienten möglichst stark voneinan-
der unterscheiden. Die Wunschvorstellung, dass
die daraus resultierende Selektivität für die durch
die Membran hindurchtretende Komponente und
deren Permeabilität beide möglichst groß sind, lässt
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
347 9
a b

. Abb. 9.43  Module mit Flachmembranen. (a) Kassettenmodule (Cadence™); (b) Wickelmodul; (c) UF-Flachmembran aus
Polysulfon (Omega™), mit freundlicher Genehmigung der Fa. Pall GmbH)

sich leider nur sehr unvollkommen realisieren. Die
Erfahrung zeigt vielmehr, dass mit wachsender
Selektivität die Permeabilität immer geringer wird.
In . Abb. 9.44a ist das Konzentrationsprofil der abzu-
trennenden Komponente von der Ausgangslösung
(1) über Eintritt in die Löslichkeitsmembran (2), den
Eintritt in die poröse Stützschicht (3), den Übergang
in die Gasphase (4) und die Permeatkammer bei (5)
stark vereinfacht dargestellt. Man erkennt den Kon-
zentrationssprung von der Feedseite zur aktiven
Schicht der Membran, der eine Folge der hohen Lös-
lichkeit der Komponente i in der aktiven Membran
ist. Die gestrichelten Linien zeigen die Konzentra-
tionen im stationären Zustand für den Fall, dass auf
der Permeatseite nichts abtransportiert wird. Neben
der Löslichkeit ist aber eben auch die Diffusionsge-
schwindigkeit maßgebend für die Permeabilität und
damit auch die Leistungsfähigkeit der Membran.
In . Abb. 9.44b ist die relative Permeabilität von
n-Alkanen in einer Polydimethylsiloxan(PDMS)-
Membran dargestellt.
Nach Blume et al. [14] nimmt die Löslichkeit
von Alkanen mit zunehmender Molmasse in der
Membran zu, der Diffusionskoeffizient jedoch ab.
Weil die beiden Trends jedoch unterschiedlich aus-
geprägt sind, ergibt sich ein Maximum der Permea-
bilität für Pentan.
Wie in . Abb. 9.45 gezeigt, sind Pervaporati-
onsmembranen als Komposit aufgebaut. Auf die
Innenseite einer mikroporösen Hohlfasermemb-
ran wird ein organoselektiver, wenige Mikrometer
dicker Polysiloxan-Film aufgetragen (. Abb. 9.45a).
Ebenfalls organoselektiv ist die Zeolithmembran
des Fraunhofer-Instituts für Keramische Techno-
logien und Systeme in Hermsdorf (. Abb. 9.45b).
Die Stützstruktur besteht aus mehreren Titanoxid-
schichten, die zur obersten, selektiven Schicht aus
Zeolith hin im Porendurchmesser abnehmen. Nach
Weyd et al. [134] würde die aus Silicium/Aluminium
(im Verhältnis 300/1) bestehende Zeolithmemb-
ran an Hydrophobizität verlieren, wenn die Stütz-
struktur aus Aluminiumoxid bestehen würde. Beide
 9
348

. Tab. 9.3  Modulübersicht

H. Chmiel

Beschreibung Vorteile Nachteile Einsatzgebiete

Module mit Schlauchmembranen

Rohrmodule –d  ruckfestes Stützrohr, Membran
innen aufgebracht
– d = 2–24 mm
– i nnen durchströmt, Permeatfluss
von innen nach außen
– Packungsdichte: <80 m2/m3
Kapillar-/ Hohlfasermodule – S elbsttragend, aktive
Membranfläche innen oder außen
– d = 40 µm–2 mm
– innen oder außen durchströmt
– Packungsdichte: <10.000 m2/m3
Module mit Flachmembranen
Platten-/ Kassettenmodule – F lachmembranen mit
innenliegendem Permeatspacer
– Membranfläche außen
– Permeatfluss von außen nach innen
– Packungsdichte: <400 m2/m3
Wickelmodule – F lachmembranen mit
innenliegendem Permeatspacer
– a ufgerollt mit zusätzlichem
Feedspacer
– F eedabführung durch
innenliegendes Stützrohr
– Packungsdichte: <1000 m2/m3
– Geringer Druckverlust
–u nempfindlich gegen
Verstopfung
– einfache Reinigung
– hohe Druckstabilität
– sehr hohe Packungsdichte
– r elativ niedrige
Membrankosten
– wenig verschmutzungsanfällig
– geringer Druckverlust
– hohe Packungsdichte
–g uter Stoffaustausch durch
Feedspacer
– geringe Packungsdichte Mikro-, Ultra- und
–g roßer Feed-Volumenstrom Nanofiltration
pro Membran-fläche
–u
 nempfindlich gegen Mikro-, Ultra- und
Verstopfung Nanofiltration
–h
 oher Druckverlust in den
Fasern
– r elativ geringe Mikro-, Ultra-, Nanofiltration,
Packungsdichte Umkehrosmose
–M  embran muss verschweiß-
oder klebbar sein
– schlechte Reinigungsfähigkeit Nanofiltration,
–M embran muss verschweiß- Umkehrosmose
oder klebbar sein
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
349 9
. Abb. 9.44  a
(a) Konzentrationsprofil in einer
Komposit-Pervaporationsmembran
und (b) relative, auf Pentan bezogene
Permeabilität der homologen Reihe
von n-Alkanen in PDMS (nach [14])

a b

. Abb. 9.45  Als Komposit aufgebaute Pervaporationsmembranen. (a) PDMS auf Polymerhohlfaser; (b) hydrophobe
Zeolithmembran auf Titanoxidschichten (mit freundlicher Genehmigung des FhIKTS, Hermsdorf )
 350 H. Chmiel
Membranen gestatten die Entfernung von Ethanol
aus Fermentationsbrühen.
Alternativ gibt es sowohl Polymer- als auch Zeo-
lithschichten, die hydrophil und damit wasserselek-
tiv sind. Hydrophile Zeolithmembranen werden zur
Entwässerung organischer Lösungsmittel (z. B. Bio-
ethanol, Biobuthanol) verwendet. Hierbei kommt
die Temperaturstabilität der Keramik zum Tragen,
die eine Anwendung bei Temperaturen von 140 °C
mit dampfförmigem Feed (Dämpfepermeation) in
direkter Kopplung mit der Rektifikation ermög-
licht und zu einer deutlichen Energieeinsparung
gegenüber alternativen Entwässerungsverfahren
führt [136].
Die für den Stofftransport erforderliche Partial-
druckdifferenz kann auf drei verschiedene Arten rea-
lisiert werden (. Abb. 9.46):
55 durch Anlegen eines Vakuums;
55 durch Spülen der Permeatseite mit einem Gas;
55 durch den Aufbau einer Temperaturdifferenz.
9
Zur Auslegung von Pervaporationsprozessen wird
auf Baker [6] sowie Melin und Rautenbach [85]
verwiesen.
Lipnizki et al. [81] geben eine Übersicht über den
Einsatz der Pervaporation bei der Bioproduktion von
Lösungsmitteln. Zur Vermeidung einer Inhibierung
ist für die kontinuierliche Fermentation die integ-
rierte Produktentfernung Voraussetzung. Schügerl
[109] sieht den Vorteil der integrierten Produktent-
fernung bei der Fermentation von Lösungsmitteln
wie Ethanol und Aceton-Butanol mittels Pervapo-
ration im Vergleich zu anderen – später vorzustel-
lenden – Verfahren, wie Extraktion und Adsorption,
hauptsächlich in der Energieeinsparung.
. Abb. 9.46  Modi der Pervaporation. (a) Vakuum-
Pervaporation; (b) Spülgas-Pervaporation; (c) Thermo-
Pervaporation
Trägergestützte
Flüssigmembrantrennung
. Abb. 9.47 zeigt das Prinzip der trägergestütz-
ten Flüssigmembrantrennung. Eine hydrophobe
poröse Membran ist mit einer ebenfalls hydro-
phoben flüssigen Phase gefüllt. Diese enthält
den eigentlichen Koppler. Auf der einen Seite der
Membran strömt die Rohlösung (das Feed), auf der
anderen Seite die Aufnehmungsphase. Die beiden
wässrigen Phasen unterscheiden sich deutlich in
pH-Wert und Ionenstärke. Bei geeigneter Wahl
des Kopplers gelingt in einem mehrstufigen Ver-
fahren die sehr reine Trennung (>99,9 %) racemi-
scher Gemische [84].
Allerdings müssen die Strömungsbedingungen
sehr sorgfältig gewählt werden. Zu hohe Strömungs-
geschwindigkeiten (gleiche Strömungsrichtung) oder
Druckdifferenzen führen zum Auswaschen der organi-
schen Phase. Da dies nie vollständig vermieden werden
kann, darf die organische Phase nicht toxisch sein.
Dialyse und Diafiltration
z Dialyse
Die Dialyse war der erste Membrantrennprozess im
technischen Maßstab. Die Produktion von Memb-
ranen für die Dialyse in der Medizin überschreitet
immer noch die sämtlicher sonstiger industriell ein-
gesetzter Membranen. Daraus resultiert ein äußerst
günstiger Preis für ein steriles Dialysemodul.
. Abb. 9.47  Transportmechanismen in einer
trägergestützten Flüssigmembran zur Trennung eines (R)/(S)-
Enantiomerengemisches. Untere Pore: unselektiver Transport
auf Grund der Löslichkeit; obere Pore: selektiver Transport von
R mit Hilfe eines Kopplers (Carrier); nach Maximini [84]
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
Berücksichtigt man, dass beidseits der Membran
eine wässrige Phase strömt und dadurch das Memb-
ranfouling vergleichsweise gering ist, so wird dieses
Verfahren als erster Schritt zur Entfernung nieder-
molekularer Verunreinigungen aus Proteinlösun-
gen sehr attraktiv. Wie in . Abb. 9.48 gezeigt, wird
hierfür ein Membranmodul mit vier Anschlüssen
(Feed-Zufuhr, Retentat-Abfuhr, Dialyseflüssigkeit-
Zufuhr und Dialysat-Abfluss) verwendet.
Der dem Modul zugeführten Proteinlösung
VF mit der Proteinkonzentration cFP und der Kon-
zentration an Verunreinigungen cFV strömt auf der
anderen Seite der Membran eine Dialyseflüssigkeit
VD entgegen, die alle diejenigen niedermolekularen
Komponenten enthält, die nicht aus der Proteinlö-
sung entfernt werden sollen. Über die Wahl von VD
kann der Konzentrationsgradient für die Verunreini-
gung so hoch gehalten werden, dass eine sehr effek-
tive Reinigung der Proteinlösung stattfindet (cFV ≫
cRV). Gleichzeitig ergibt sich die Möglichkeit, durch
Druckerhöhung auf der Feedseite die Proteinkonzen-
tration im Retentat zu erhöhen (cRP > cFP).
z Diafiltration
Legt man im in . Abb. 9.48 dargestellten Dialyse-
modul einen Differenzdruck an, so spricht man bei
diesem Membranprozess von Diafiltration. Während
bei der Dialyse der Stofftransport ausschließlich vom
Konzentrationsgradienten bestimmt wird, erhöht er
sich bei der Diafiltration gemäß der Nernst-Planck-
Gleichung (Gl. 9.17) um den Druckterm. Diese Kom-
bination von Dialyse und Ultrafiltration wurde zuerst
in der Medizin als „künstliche Niere“ (Hämodiafil-
tration) angewandt. Sie ermöglicht die gleichzei-
tige Entfernung von Stoffwechselendprodukten
(Entgiftung) und die Entwässerung des Patienten.
Dieses Verfahren nutzt man in der Biotechnologie
zur integrierten Produktentfernung, dem sog. in
situ product removel (ISPR). Durch geeignete Wahl
. Abb. 9.48  Schema eines
Dialysemoduls
351 9
des Porendurchmessers der Membran kann festge-
legt werden, welche Komponenten aus dem Biore-
aktor entfernt und welche zurückgehalten werden.
Darüber hinaus ermöglicht das Verfahren durch
Strömungsumkehr über das gleiche Modul die
Zuführung von Medien bei gleichzeitiger Entfer-
nung von Membranablagerungen auf der Produkt-
seite [26]. Für Beispiele hierfür wird auf die 7 Kap. 6
und 12 verwiesen.
Elektrisch getriebene Membrantrenn-
prozesse*
Bernd Bauer
Elektrochemische Verfahren haben in den vergange-
nen Jahrzehnten eine große industrielle Bedeutung
in der Herstellung von anorganischen Grundchemi-
kalien erzielt. Hier ist insbesondere die Herstellung
von Chlor und Natronlauge durch Membranelekt-
rolyse zu nennen [13]. In dieser Membranelektro-
lyse stellen die kathodische Reduktion sowie die
anodische Oxidation den wichtigsten Prozessschritt
dar [44]. Die Elektrochemie ist jedoch nicht nur als
Stoffumwandlungsverfahren wie bei der Elektrolyse
sondern auch als Stofftrennverfahren wie bei der
Elektrodialyse oder der Elektrokapazitiven Entsal-
zung von Bedeutung.
Bei elektrochemischen Stofftrennverfahren stellt
das elektrische Feld die Triebkraft für den Stofftrans-
port und die Stoffumwandlung dar. Anionen, wie bei-
spielsweise Sulfat- oder Chlorid-Ionen, bewegen sich
wie in . Abb. 9.49 gezeigt durch Elektromigration
entlang des elektrischen Potentialgefälles zur Anode,
wobei Kationen wie Natrium- oder Calcium-Ionen
unter Beachtung des Prinzips der Elektroneutralität
zur Kathode beschleunigt werden. An den Elektro-
den kann es dann zu einem Elektronenübergang, wie
bei der Elektrolyse unter Bildung von Wasserstoff an
der Kathode und Sauerstoff an der Anode oder zur
 352 H. Chmiel

1D
62±
1D
&O ±
62± &O±
 ±
1D &O
62±
1D  1D
.DWKRGH &O ± $QRGH
62±
1D &O ± &O±

62±
1D
.$0

. Abb. 9.49  Ionentransport durch eine Kationenaustauschermembran unter der treibenden Kraft eines elektrischen Feldes

Ausbildung von elektrochemischen Doppelschichten
wie bei kapazitiven Verfahren kommen.
Ionenaustauschermembranen, also ionense-
lektive, semipermeable Membranen, werden dabei
eingesetzt, um die Elektromigration selektiv zu
steuern. Anionenaustauschermembranen mit posi-
9 tiven Festladungen wie beispielsweise die Benzyltri-
methylammoniumgruppe (P-NR3+), sind permeabel
für Anionen, ihren sogenannten Gegenionen, und
sind undurchlässig für Kationen, ihren sogenannten
Co-Ionen. Umgekehrt ist eine aus negativen Festla-
dungen wie beispielsweise der Sulfonsäuregruppe
(P-SO3–) aufgebaute Kationenaustauschermem-
bran permeabel für Kationen und undurchlässig
für Anionen. Bringt man derartige Kationen- und
Anionenaustauschermembranen alternierend mit
Hilfe von Membranabstandhaltern sowie Dichtrah-
men entsprechend . Abb. 9.50 zwischen Kathode
und Anode, werden hydraulisch getrennte Zell-
kammern gebildet. Bei orthogonal zu den Membra-
nen angelegtem elektrischem Gleichspannungsfeld
werden die sich in einer Elektrolytlösung enthalte-
nen Anionen und Kationen wechselweise zu einem
Diluat abreichern und zu einem Konzentrat anrei-
chern [121].
Dieses Verfahren der Elektrodialyse (ED) kann
beispielsweise in der Trinkwasserbehandlung zur
Entsalzung, aber auch als kapazitives Verfahren in
der Prozesswasserbehandlung zur Konzentrierung
von Salzlösungen eingesetzt werden. Daneben findet
die Elektrodialyse in der chemischen Industrie und
in der Bioprozesstechnik eine Anwendung, bei-
spielsweise bei der Abtrennung ionogener Bestand-
teile einer wässrigen Lösung von nicht geladenen
Inhaltsstoffen dieser Prozesslösung. In technischen
Elektrodialyse-Anlagen werden dazu bis zu 500

. Abb. 9.50  Prinzip der 'LOXDW

Elektrodialyse

&O ±
1D
&O± &O±

&O± 1D 1D

1D
&O±
.DWKRGH $QRGH
&O±
1D &O±

&O± 1D 1D


1D

.$0 $$0 .$0 $$0

.RQ]HQWUDW
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
wiederholende Einheiten von Kationen- und Anio-
nenaustauschermembranen zwischen der Kathode
und Anode in einem sogenannten Membranstapel
wie in . Abb. 9.51 gezeigt angeordnet.
Der Übergang von Elektronentransport auf
Ionentransport erfolgt dabei unter Wasserstoff- und
Sauerstoffentwicklung in separaten Kreisläufen an
den Elektroden. Neben den Elektrodenkreisläufen,
wird eine Rohlösung (Diluat) und eine Aufneh-
merlösung (Konzentrat) durch einen Membransta-
pel geführt. Die Minimierung von Grenzschichten
macht die Verwendung eines geeigneten Gitters als
Abstandshalter und als Turbulenzpromotor sowie
eine typische Überströmungsgeschwindigkeit von
0,1 m/s notwendig. Bei einer effektiven Memb-
ranfläche von beispielhaft 0,5 m × 0,5 m und einer
typischen Kammerhöhe von 0,5 mm ergeben sich
minimale Durchflussgeschwindigkeiten von etwa
80 L/h je Kammer. Bei einer weiter angenommenen
. Abb. 9.51  Bild eines
kommerziellen Membranstapels für
die Elektrodialyse (FUMATECH, Typ
FT_ED-1750-3)
′′
&.0
′
&.%XON
.DWKRGH
.RQ]HQWUDW
δ δ
*UHQ]VFKLFKW
. Abb. 9.52  Konzentrationspolarisation und Grenzstromdichte bei der Elektrodialyse
353 9
typischen Anzahl von 500 wiederholenden Einhei-
ten ergibt sich ein Gesamtvolumenstrom von etwa
40 m3/h für jeden der beiden Kreisläufe, bezogen
auf eine effektive Membranfläche von etwa 30 m2
für dieses Modul. Für Module mit einem größe-
ren Membranabstand oder für Module mit anderen
Konzepten zur Verringerung der Konzentrations-
polarisation können entsprechend höhere Über-
strömungsgeschwindigkeiten von bis zu 3 m/s
notwendig werden. Die Ausbildung einer solchen
laminaren Grenzschicht, wie in . Abb. 9.52 dar-
gestellt, führt zu einer limitierenden maximalen
Stromdichte. Oberhalb dieser sogenannten Grenz-
stromdichte kommt es zu einer Verarmung an
Ionen in der Grenzschicht. In Folge steigt dort der
Widerstand zunächst an um dann unter Dissozia-
tion von Wasser und Elektromigration von Proto-
nen und Hydroxid-Ionen wieder zu sinken. Ober-
halb der Grenzstromdichte wird die Stromausbeute
.DWLRQHQ
VWURP
′
&'%XON $QRGH
′′
&'0
.$0 'LOXDW
*UHQ]VFKLFKW
 354 H. Chmiel
erniedrigt, woraus höhere spezifische Energiekos-
ten resultieren.
Darüber hinaus kann es aber auch zu sekundären
Effekten wie anorganischem Scaling (beispielsweise
durch Härteausfällungen) oder Fouling (Ausbildung
von organischen Deckschichten) als Resultat von
pH-Verschiebungen durch Wasserspaltung oberhalb
der Grenzstromdichte kommen. Speziell bei wenig
leitfähigen Lösungen wie in der Bioprozesstechnik
ist deshalb ein besonderes Augenmerk auf die kor-
rekte Auslegung von Überströmungsgeschwindigkeit
und die Berücksichtigung der Grenzstromdichte zu
legen. Alle elektrisch getriebenen Membrantrenn-
prozesse folgen dem Faraday-Gesetz. Eine Erhöhung
der Stromdichte resultiert damit in einem höheren
spezifischen Stofftransport und reduziert folglich
die notwendige Membranfläche und so die Inves-
titionskosten. Bei kleineren Stromdichten werden
meist bessere Stromausbeuten und Wirkungsgrade
erhalten, wodurch sich kleinere Betriebskosten rea-
9 lisieren lassen. Wie in vielen industriellen Prozessen
sind auch in der Elektrodialyse CAPEX und OPEX
gegenläufig.
In der Bioprozesstechnik findet die Elektrodia-
lyse zunehmende Anwendung wegen ihrer Möglich-
keit zur schonenden und selektiven Abtrennung von
ionogenen Verbindungen aus wässrigen Lösungen
selbst bei kleinen Konzentrationen. Als Beispiel sei
die Entsalzung von Lösungen mit organischen Wert-
stoffen wie bei der Entsalzung von Proteinlösungen
oder der Abtrennung von Salzen aus Prozesslösun-
gen pharmazeutischer Wirkstoffe genannt. So wird
in der Herstellung von Lactulose aus dem Presssaft
der Süßkartoffel die Elektrodialyse zur Abtrennung
von Mineralien wie Nitrat eingesetzt. Als anerkann-
ter Stand der Technik wird heute die Entsalzung von
Molke durch Elektrodialyse betrachtet. Die Elektro-
dialyse wird ebenso bei der Gewinnung von organi-
schen Säuren oder Aminosäuren wie Lysin, Glycin,
Glutamin oder p-Hydroxyphenylglycin erfolgreich
eingesetzt [59]. Typische Beispiele finden sich in der
Konzentrierung von Milchsäure aus Fermentations-
lösungen oder in der Herstellung von Glutaminsäure.
In der Lebensmittelindustrie wird die Elektrodia-
lyse zur Weinstabilisierung durch Abtrennung von
Kaliumtartrat erfolgreich eingesetzt.
In den letzten Jahren wurde die elektrodialyti-
sche Entsalzung um die elektrokapazitiven Verfahren
erweitert. Hier erfolgt die Stofftrennung durch Aus-
bildung von Doppelschichten an hochporösen Koh-
lenstoffelektroden, die in gleicher Weise alternierend
mit Kationen- und Anionenaustauschermembranen
angeordnet werden [95]. Als Vorteil der elektrokapa-
zitiven Verfahren ist der geringere Energieverbrauch,
der einfachere Aufbau des Membranstapels, die Ver-
meidung einer Wasserstoff- und Sauerstoffproduk-
tion an den Elektroden und vor allem die Möglich-
keit zur Behandlung von konzentrierten Lösungen
zu nennen. Eine Anwendung in der Bioprozesstech-
nik ist zu erwarten.
Eine besondere Bedeutung in der Bioprozess-
technik hat die Elektrodialyse mit bipolaren Mem-
branen (EDBM) erlangen können [67]. Sie kombi-
niert den Verfahrensschritt der Entsalzung mit einer
Umwandlung organischer oder anorganischer Salze
in die korrespondierenden Säuren und Laugen. So
kann im einfachsten Fall eine wässrige Natriumchlo-
rid-Lösung in Natronlauge und Salzsäure überführt
werden. Die dem Verfahren zu Grunde liegende elek-
trodialytische Wasserdissoziation in bipolaren Mem-
branen macht sich der bereits oben beschriebenen
Effekte bei Überschreiten der Grenzstromdichte zu
Nutze. Würde man bei der Elektrodialyse das Diluat
so weit entsalzen, dass die Konzentration der mobilen
Ladungsträger auf den Bereich des Ionenproduk-
tes von Wasser absinkt, so würde wie in . Abb. 9.53
gezeigt der Ladungstransport unter Dissoziation von
Wasser durch Protonen und Hydroxid-Ionen über-
nommen. In einem solchen hypothetischen Prozess
würde allerdings gleichzeitig die Leitfähigkeit sinken
und der spezifische Widerstand des Diluats in den
Bereich von ultrareinem Wasser, d. h. auf 18,2 MΩ
cm steigen. Der Widerstand kann in diesem Fall nur
durch eine Verringerung der Kammerhöhe bzw. des
Membranabstandes erreicht werden.
Um einen spezifischen Flächenwiderstand
von weniger als 2 Ω cm2 zu erreichen, muss dazu
der Abstand zwischen der Kationen- und Anio-
nen-selektiven Schicht einer bipolaren Membran
auf etwa 1 nm verringert werden [120]. Der Was-
sertransport in die Zwischenschicht der bipolaren
Membran erfolgt ausschließlich durch Diffusion
aus den angrenzenden Lösungen [9]. Die Bildungs-
geschwindigkeit von Protonen und Hydroxid-Ionen
entspricht bei einer ideal permselektiven Membran
exakt der elektrischen Stromdichte. Somit können
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
. Abb. 9.53  Grundprinzip der
elektrodialytischen Wasserdissoziation
in bipolaren Membranen

1D
+2
+
durch Elektrodialyse mit bipolaren Membranen bei
einer Stromdichte von beispielsweise 50 mA/cm2
eine theoretische Menge von 18,66 mol/(h m2) an
Säure und Lauge produziert werden. Die Stromdichte
ist wiederum von der Zusammensetzung und Leitfä-
higkeit der Rohlösung abhängig. Die Stromausbeute
ist vor allem von den eingesetzten Membranen und
den angestrebten Konzentrationen in den Produkt-
lösungen abhängig.
Somit lassen sich durch bipolare Membrantech-
nik viele anorganische Salze wie Natriumsulfat oder
Lithiumchlorid in ihre korrespondierende Säure
und Lauge spalten. Die wichtigsten Anwendungen
sind jedoch in der Herstellung schwacher Säuren
und Laugen, in der Kreislaufführung niedrig kon-
zentrierter Säuren und Laugen und vor allem in der
pH-Anpassung von wässrigen Lösungen zu finden.
Dies kann bei der Spaltung von Natriumchlorid-Lö-
sungen aus der Ionenaustauscher-Regeneration, bei
der Kreislaufführung von Natriumhydrogencarbo-
nat-Lösungen aus Rauchgaswäschern oder auch bei
der Kohlendioxid-Extraktion aus Meerwasser sein.
355 9
+2
+ 2+ ±
1D &O ±
1D&O
.$0 $$0
+2
&O ±
+ 2+±
.$0 $$0
+2
2+±
%0
Die Vorteile der Elektrodialyse mit bipolaren
Membranen lassen sich besonders vorteilhaft in der
Bioprozesstechnik bei der Gewinnung organischer
Säuren oder Aminosäure nutzen [10]. Man unter-
scheidet dabei die 2- und 3-Kammer EDBM. Bei der
2-Kammer EDBM werden die Module aus wiederho-
lenden Einheiten einer bipolaren Membranen sowie
einer Kationen- oder Anionenaustauschermembran
für die Herstellung entweder einer reinen Lauge oder
einer reinen Säure aufgebaut.
Bei der 3-Kammer EDBM wie in . Abb. 9.54
gezeigt werden die Module aus einer bipolaren
Membran sowie einer Kationenaustauschermemb-
ran mit kleiner Hydroxid-Ionenpermeabilität und
einer Anionenaustauschermembran mit kleiner
Protonen-Permeabilität zur simultanen Herstel-
lung von Säure und Lauge zusammengesetzt. Für
die Herstellung schwacher Säuren ist die 2-Kammer
EDBM wie bei der Aufarbeitung von Zitronensäure
und Ascorbinsäure (Vitamin C) oder bei Aminosäu-
ren häufig wirtschaftlicher. Für organische Säuren
mit höherem Ionenpotential wie bei Essigsäure,
 356 H. Chmiel

)HHG1D&O

ZLHGHUKROHQGH0HPEUDQHLQKHLW
:DVVHURGHU :DVVHURGHU
UFNJHIKUWH6lXUH UFNJHIKUWH6lXUH

&O ±

+ 2+± &O ±

1D
.DWKRGH +2 +2 $QRGH

1D

.$0 $$0 %0 .$0 $$0

9
6lXUH+&O /DXJH1D2+
YHUUGQQWH6DO]O|VXQJ
. Abb. 9.54  Schematischer Aufbau eines Membranstapels für die 3-Kammer-Elektrodialyse mit bipolaren Membranen für die
simultane Herstellung einer Säure und einer Lauge
Ameisensäure, Salicylsäure oder Milchsäure, ist
jedoch die 3-Kammer EDBM besser geeignet. Häufig
kann die produzierte Lauge wie bei der Gewinnung
von Gluconsäure, Ketogulonsäure, γ-Hydroxyb-
uttersäure (GHB) oder Itaconsäure in den Biopro-
zess zurückgeführt werden, wodurch die 3-Kammer-
Anordnung ebenfalls bevorzugt wird.
Daneben findet die Elektrodialyse mit bipola-
ren Membranen beispielsweise Anwendung in der
Lebensmittel- und Getränkeindustrie bei der pH-Ein-
stellung von Wein aber auch bei der Überführung von
Sauermolke in Süssmolke. Alle genannten Anwen-
dungen wurden bereits in technischen Anlagen, wie
beispielhaft in . Abb. 9.55 gezeigt, umgesetzt.
Insbesondere in China findet die bipolare Memb-
rantechnik eine zunehmende Akzeptanz bei der bio-
technologischen Herstellung von organischen Säuren
und anderen Feinchemikalien. Vor allem die fermen-
tative Herstellung von Milchsäure für die Produktion
von biokompatiblen und auch biologisch abbaubaren
Polylactiden (PLA) findet große Beachtung.

Die chemische Industrie wird sich von der Ver-
wendung fossiler Rohstoffe hin zur Verwendung
von biobasierten Rohstoffen wandeln [1]. In einer
solchen Bioraffinerie stellt die Biomasse auf Basis von
Cellulose, Getreide und Korn einen Wertstoff dar.
Z. B. kann Glutaminsäure für die Herstellung von
γ-Aminobuttersäure (GABA), einem Rohstoff bei
der Herstellung von N-Methylpyrrolidon verwen-
det werden [66]. So wurde der Einsatz der EDBM
bei der Produktion von Glutaminsäure erfolgreich
demonstriert. Der Herstellung und Isolierung von
biobasierten Zwischenprodukten, d. h. von mole-
kularen Bausteinen kommt somit eine wichtige
Bedeutung zu. Insbesondere die elektrisch getrie-
benen Membrantrennprozesse sind auf Grund der
zumeist energieminimierten Betriebsweise bevor-
zugt. Dies wurde beispielhaft für die Nutzung von
Lignocellulosen als Rohstoff bei der Herstellung von
Itaconsäure bewertet. Dabei wird die Lignocellulose
zunächst katalytisch in kristalline Cellulose, Oxal-
säure und Zucker aufgeschlossen, die dann in einer
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
. Abb. 9.55  Bild einer Membranstraße für die Elektrodialyse mit bipolaren Membranen mit Ventilblock für die automatische
Reinigung (FUMATECH) (mit freundlicher Genehmigung der Fa. FuMaTech)
nachfolgenden Fermentation in Itaconsäure über-
führt werden [26]. Bei der batch-Fermentation mit
Aspergillus terreus bei pH 3,9 oder besser bei einer
kontinuierlichen Fermentation mit Ustilago maydis
bei pH 6 kann die EDBM wie in . Abb. 9.56 sche-
matisch dargestellt nach Zellabtrennung durch Ult-
rafiltration zur Freisetzung der Itaconsäure und die
produzierte Lauge zur pH-Einstellung im Fermenter
genutzt werden. Die reine Itaconsäure kann aus dem
Konzentrat durch kontinuierliche Kristallisation und
nachfolgende Trocknung gewonnen werden.
In gleicher Weise sind viele Trennaufgaben mit
elektrisch getriebenen Membrantrennverfahren in
der Bioprozesstechnik umgesetzt. Eine Übersicht
ist im Handbook of Membrane Separations [94] zu
finden.
Auslegung und Betrieb von Membran-
anlagen
Wenn man in Labor- und Technikumsversuchen
bezüglich Rückhaltevermögen, Permeabilität, Sta-
bilität, Adsorptionsverhalten und Preis die günstigste
Membran und für die zu filtrierende Rohlösung das
geeignete Modul ausgewählt hat, so ist die Anlage
357 9
auszulegen. Die notwendige Membranfläche ergibt
sich letztlich aus der Betriebsweise. Analog zum
Reaktorbetrieb (7 Kap. 6) unterscheidet man zwi-
schen kontinuierlichem, batch- und halbkontinu-
ierlichem Betrieb (. Abb. 9.57).
Beim kontinuierlichen Betrieb (. Abb. 9.57a)
durchströmt die Rohlösung das Membranmodul
nur einmal. Die zur Vermeidung von Konzentra-
tionspolarisation und Membranfouling notwendige
Anströmgeschwindigkeit ist wegen der geforder-
ten Aufkonzentrierung bzw. Ausbeute nur begrenzt
einstellbar. Beim batch-Betrieb (. Abb. 9.57b) wird
das das Modul verlassende Retentat so lange in den
Vorratsbehälter zurückgeführt, bis die gewünschte
Konzentration erreicht ist. Das Restvolumen wird
aus der Anlage entfernt, die Anlage gereinigt und
der Vorratsbehälter neu gefüllt. Der kontinuierliche
Betrieb mit Rückführung (. Abb. 9.57c) hat wegen
der zusätzlichen Umwälzpumpe die größte Flexibi-
lität. Aufkonzentrierung bzw. Ausbeute und Über-
strömgeschwindigkeit lassen sich unabhängig vonei-
nander einstellen. Hat man sich für die Betriebsweise
entschieden, liegt die Membranfläche aufgrund der
Technikumsversuche fest. Da die Membranmo-
dule mit Standardflächen angeboten werden, stellt
 358 H. Chmiel

9RUODJHWDQN )HUPHQWDWLRQVWDQN 1DQRILOWUDWLRQ (OHNWURO\WHPLW :lUPHWDXVFKHU $EVFKHLGHU

ELSRODUHQ
0HPEUDQHQ

3HQWRVH+H[RVH 8VWLODJRPD\GLVRGHU 1D2+ +$F ,WDFRQVlXUH

$VSHUJLOOXVWHUUHXV

. Abb. 9.56  Verfahrensschema für die Herstellung von Itaconsäure aus nachwachsenden Rohstoffen durch eine
kontinuierliche Fermentation und Produktaufarbeitung mittels Elektrodialyse mit bipolaren Membranen und Kristallisation
9
. Abb. 9.57  Betriebsweisen von
Membrananlagen. (a) Kontinuierlicher
Betrieb; (b) batch-Betrieb; (c)
kontinuierlicher Betrieb
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
359 9
. Abb. 9.58  Grundschaltungen
für Membranmodule. (a)
Reihenschaltung; (b) Parallelschaltung;
(c) sogenannte Tannenbaumstruktur
(nach [85])

sich die Frage, ob man die notwendige Zahl der
Module parallel, in Reihe oder in sogenannter Tan-
nenbaumstruktur ausbildet (. Abb. 9.58). Werden
bei der Reihenschaltung alle Module vom gesam-
ten Feedstrom durchströmt, bewirkt eine parallele
Anordnung eine Aufteilung des Ausgangsstroms. Die
Entscheidung geben Konzentrationspolarisation und
vom Hersteller vorgegebene zulässige Drücke bzw.
Druckverluste.
Näheres zur Auslegung von Membrananlagen
siehe in [85].
9.3.5 Solventextraktion
Als Solventextraktion bezeichnet man den Übergang
eines Stoffes (des Extraktstoffes) von einer flüssigen
Phase (Abgeber genannt) in eine zweite fluide Phase
(dem Aufnehmer, auch Extraktionsmittel, Lösungs-
mittel oder Solvent genannt), die mit der ersten nicht
oder nur gering mischbar ist.
Nach Einstellung eines Gleichgewichts – unter
der Voraussetzung niedriger Konzentrationen sowie
für konstanten Druck, Temperatur und pH – gilt für
die Verteilung des Extraktstoffes in Abgeber (nun
Raffinat genannt) und Aufnehmer (dem Extrakt) der
Nernst’sche Verteilungssatz
cE / cR = K E = const.  Gl. 9.20
d. h. die Konzentrationen des Extraktstoffes im
Extrakt cE und Raffinat cR stehen in einem festen Ver-
hältnis, dem Verteilungskoeffizienten KE.
Sind Abgeber und Aufnehmer merklich inei-
nander löslich, so empfiehlt sich die Darstellung
des Löslichkeitsverhaltens im Dreiecksdiagramm
(. Abb. 9.59a). Daneben wird häufig auch das Gleich-
gewichtsdiagramm mit rechtwinkligen Koordinaten
verwendet (. Abb. 9.59b).
Dreiecksdiagramme geben das Verhalten
von Dreistoffsystemen bei konstantem p, T und
pH wieder. Die reinen Komponenten P (Extrakt-
stoff ), A (Abgeber) und S (Extraktionsmittel
oder Solvent) stellen die Ecken, Zweistoffgemi-
sche Punkte auf den Dreiecksseiten dar. Ternäre
. Abb. 9.59  (a) Dreiecksdiagramm und (b)
Gleichgewichtsdiagramm eines Dreistoffsystems mit
Mischungslücke; K = kritischer Punkt
 360 H. Chmiel
Gemische werden durch Punkte innerhalb der
Dreiecksflächen repräsentiert.
Das homogene Einphasengebiet, in dem
Abgeber, Extraktstoff und Aufnehmer ineinander
löslich sind, wird durch die Binodale (Löslich-
keitskurve) vom heterogenen Zweiphasengebiet
getrennt. Liegt der Zustandspunkt also im Zwei-
phasengebiet, zerfällt die Mischung in die Gleich-
gewichtsphasen R ( Raffinat ) und E ( Extrakt ),
die im Zustandsdiagramm durch eine Konode
verbunden sind. Der kritische Punkt K, der auf
der Binodale liegt und bei dem die Länge der
Konoden gegen null geht, unterteilt die Binodale
in zwei Äste, die in . Abb. 9.59a links die Zusam-
mensetzung des Raffinats und rechts des Extrakts
charakterisieren.
Für weitere Erläuterungen wird auf die Fachlite-
ratur verwiesen (z. B. [105]).
9 Extraktionsmittel
Bei der Wahl des Extraktionsmittels ist eine Reihe
von generellen Forderungen zu beachten, die sich
zum Teil widersprechen:
55 möglichst geringe Mischbarkeit von Abgeber
und Aufnehmer,
55 möglichst hohe Selektivität, d. h. es soll
möglichst nur der Extraktstoff im Extraktions-
mittel gelöst werden,
55 große Kapazität für den aufzunehmenden
Extraktstoff,
55 große Dichtedifferenz zwischen
Aufnehmer und Abgeber erleichtert die
Phasentrennung,
55 hohe Grenzflächenspannungen zwischen
Aufnehmer und Abgeber verhindern die
Bildung stabiler Emulsionen, erschweren aber
auch das Dispergieren der Phasen (Erzeugung
großer Austauschflächen),
55 geringe Viskosität, um die Druckverluste klein
zu halten und guten Wärme- und Stoff-
übergang zu erzielen,
55 niedrige Siedetemperaturen und Verdamp-
fungsenthalpien sowie chemische und
thermische Beständigkeit des Extraktions-
mittels erleichtert die Rückgewinnung,
55 schlechte Brennbarkeit erhöht die
Betriebssicherheit,
55 niedriger Preis des Extraktionsmittels
vermindert die Kosten für die Substitution des
verloren gegangenen Extraktionsmittels,
55 niedriger Dampfdruck bei Arbeitstemperatur
vermindert andererseits die Verluste durch
Verdunstung,
55 geringe Korrosionswirkung des Extraktions-
mittels hält die Anlagekosten gering,
55 geringe Toxizität für Mensch und Umwelt.
Neben diesen generellen Auswahlkriterien gibt es
noch für die Bioproduktaufarbeitung spezifische
Forderungen:
55 Geschieht die Extraktion aus dem zellfreien
Abstrom, so muss das Extraktionsmittel so
gewählt werden, dass es das Produkt nicht
schädigt (z. B. deaktiviert).
55 Erfolgt die Extraktion unmittelbar im Biore-
aktor, so darf das Extraktionsmittel zusätzlich
nicht toxisch für den Biokatalysator sein.
Die meisten organischen Lösungsmittel sind jedoch
toxisch. Schügerl [107] sieht deren Einsatz – nach
Abtrennung der Mikroorganismen – vorteilhaft für
die Gewinnung von Antibiotika. Als Alternative
empfiehlt Weuster-Botz [133] ionische Flüssigkei-
ten. Ionische – also Festladungen t­ ragende – Poly-
mere wurden bereits als Kationen- und Anionen-
austauschermembranen bei der Elektrodialyse
vorgestellt. Im vorliegenden Fall handelt es sich um
bei Raumtemperatur flüssig vorliegende Ionenaus-
tauscher. Trotz ihrer hohen Polarität sind viele ioni-
sche Flüssigkeiten hydrophob und bilden daher mit
Wasser zweiphasige Systeme. Chemische und physi-
kalische Eigenschaften, wie Polarität, Hydrophobi-
zität, Viskosität etc. können durch Modifikation der
Kationen, Anionen und anhängende Substituenten
beeinflusst werden. Das hat den ionischen Flüssig-
keiten auch den Namen „Designer-Solvents“ einge-
bracht. Ihre geringe Volatilität und Entflammbar-
keit, thermische und chemische Stabilität lassen sie
als attraktive Alternative zu organischen Lösungs-
mitteln erscheinen. So berichten Bräutigam et al.
[19] über die integrierte Produktentfernung mittels
ionischer Flüssigkeiten zur Gewinnung prochiraler
Ketone. Hohe Kosten und die vergleichsweise hohe
Viskosität ionischer Flüssigkeiten stellen bisher aber
immer noch Nachteile dar.
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
Reaktivextraktion zur ­Aufarbeitung
hydrophiler ­Produkte*
Tim Zeiner, Christoph Brandenbusch
Bei der direkten Extraktion von hydrophilen Pro-
dukten aus komplexen Fermentationsbrühen
haben die bisher vorgestellten Verfahren deutliche
Nachteile. Nebenprodukte und Verunreinigungen
weisen oft ein ähnliches Verteilungsverhalten wie
das Produkt auf, wodurch dessen selektive Abtren-
nung erschwert ist. Um dies zu vermeiden und eine
selektive und kontinuierliche Trennung zu ermögli-
chen, ist der Einsatz reaktiver Trennverfahren ziel-
führend. Hierbei wird die Extraktion mit einer Reak-
tion gekoppelt, um Synergieeffekte hinsichtlich der
Trennleistung zu erhalten. Durch die Reaktivextrak-
tion wird das Verteilungsverhalten der Produkte
innerhalb einer flüssig-flüssig-Extraktion dahin-
gehend beeinflusst, dass eine selektive Abtrennung
der Produkte von Nebenkomponenten komplexer
Produktionsgemische möglich ist [117]. Indust-
riell erfolgreich angewandt wird das Prinzip einer
reaktionsunterstützten Extraktion seit Mitte des 20.
Jahrhunderts in der bis dahin schwer zu realisie-
renden hochreinen Gewinnung von Schwermetal-
len aus hochverdünnten Lösungen [99]. In der Bio-
technologie wird dieses Verfahren zur Gewinnung
hydrophiler Produkte genutzt. Um eine selektive
Trennung zu erzielen, wird die wässrige Fermenta-
tionsbrühe zunächst mit einer organischen Phase in
Kontakt gebracht. Dabei ist darauf zu achten, dass
das eingesetzte Lösungsmittel eine geringe Quer-
löslichkeit mit Wasser aufweist. Der organischen
Phase wird anschließend ein Reaktant (Extraktant)
zugesetzt, welcher nach Möglichkeit unlöslich in der
wässrigen Phase ist und selektiv einen hydrophoben
. Abb. 9.60  Prinzipskizze einer
Reaktivextraktion vonDicarbonsäuren.
In die organische Phase wird
dabei ein Komplex bestehend aus
Dicarbonsäure und Extraktant (Amin)
extrahiert. Der Extraktant (Amin) wird
in der organischen Phase vorgelegt.
Die Dicarbonsäure befindet sich in der
wässrigen Phase
361 9
Komplex mit dem Zielprodukt bildet. Bei einer zu
hohen Wasserlöslichkeit des eingesetzten Reaktanten
würde sich der entstehende Komplex nicht vollstän-
dig in die organische Phase verteilen. Auf diese Weise
wird bei der Reaktivextraktion sowohl eine selektive
Abtrennung wie auch Anreicherung des Produktes in
der organischen Phase erzielt. Gerade für biokatalyti-
sche Reaktionen in denen stark hydrophile Produkte
in einer komplexen Fermentationsbrühe vorliegen
(z. B. Ganzzellfermentation von Dicarbonsäuren) ist
dieses Verfahren besonders geeignet. Eine Prinzip-
skizze der Reaktivextraktion von Dicarbonsäurenist
in . Abb. 9.60 dargestellt.
Die Fermentationsbrühe enthält neben dem
Produkt, Verunreinigungen, Nebenkomponen-
ten und Nährsalzen, auch noch ganze Zellen. Zur
Reaktivextraktion der Carbonsäuren (nachgeschal-
tet oder in-situ) müssen biokompatible organische
Lösungsmittel wie Ethyloleat genutzt werden. Nur so
kann eine Schädigung der Biokatalysatoren während
der Reaktion/Reaktivextraktion vermieden werden.
Um die stark hydrophile Carbonsäure in die orga-
nische Phase zu extrahieren, werden vornehmlich
Amine als Komplexbildner eingesetzt. Bei der Reak-
tivextraktion von Monocarbonsäuren haben sich
dabei besonders sekundäre und tertiäre Amine als
Komplexbildner bewährt [69], bei Dicarbonsäuren
langkettige sekundäre und tertiäre Amine wie Di-
n-octylamin und Tri-n-octylamin [42]. Die Kom-
plexbildung erfolgt hierbei über die Bildung von
Wasserstoffbrückenbindungen oder Ionenpaarbin-
dungen, wobei die Bildung von Wasserstoffbrücken
die Extraktionseffizienz dominiert [25, 42]. Dies
bedingt eine starke Abhängigkeit der Komplexbil-
dung vom eingestellten pH der wässrigen Phase,
 362 H. Chmiel

wobei fast ausschließlich undissoziierte Dicarbon-
säure extrahiert wird. Für eine erfolgreiche Reak-
tivextraktion muss der pH der wässrigen Phase
unterhalb des pKa der Säure liegen (.  Abb. 9.61).
Neben der Einstellung des pH-Werts der wässrigen
Phase kann die Extraktionseffizienz über die Zugabe
polarer Modifier in die organische Phase gesteuert
werden. Die benötigte Menge ist abhängig von der
eingesetzten Dicarbonsäure sowie dem eingesetzten
Amin. Bei der Extraktion von cis,cis-Muconsäure
hat sich 1-Dodecanol als biokompatibler organi-
scher Modifier bewährt (. Abb. 9.61). Es konnten
hier in einem optimierten System Ausbeuten bis zu
96 % in einer einstufigen batch-Extraktion erzielt
werden [42].
Nach erfolgreicher Reaktivextraktion liegt das
Produkt als gebundener Komplex in der organischen
Phase vor. Um eine finale Feinreinigung des Produk-
tes zu ermöglichen muss dieses in eine reine wässrige
Phase überführt werden. Durch geschickte Kombi-
nation des Extraktions- und RE-Extraktionsschrittes
kann dann anschließend das organische Lösungs-
mittel prozessintern recycelt werden. (. Abb. 9.62).
Zur RE-Extraktion kann dabei sowohl ein pH
Swing (Erhöhung des pH Wertes der reinen wäss-
rigen RE-Extraktionsphase über den pKa Wert der
Säure), wie auch wasserlösliche Monoamine ver-
wendet werden. Letztere Möglichkeit hat sich in
Versuchen mit cis,cis-Muconsäure als besonders
vorteilhaft erwiesen. Wasserlösliche Monoamine
sind stärkere Komplexbildner als die wasserun-
löslichen sekundären und tertiären Amine und
bilden mit der Dicarbonsäure einen wasserlösli-
chen Komplex (im Gegensatz zum hydrophoben
Komplex bei der initialen Reaktivextraktion). Bei
der Verwendung von Propylamin kann ein nahezu
vollständiger Umsatz bei der RE-Extraktion erzielt
werden (. Abb. 9.63).

9
a b

X1-Dodecanol
X1-Dodecanol

. Abb. 9.61  Abhängigkeit der Extraktionseffizient von cis,cis-Muconsäure vom pH-Wert der wässrigen Phase. (a) System
bestehend aus dem Amin Tri-n-octylamin und einer organischen Phase (Ethyloleat- 0,01 kg/kgorg 1-Dodecanol.). (b) System
bestehend aus dem Amin Di-n-octylamin und einer organischen Phase (Ethyloleat- 0,03 kg/kgorg 1-Dodecanol.). Ein
nahezu vollständiger Umsatz an Dicarbonsäure kann nur bei einem pH < pKa erzielt werden. Die grünen Balken geben die
Querlöslichkeit der Säure in den jeweiligen Lösungsmittelgemischen wieder

. Abb. 9.62  Fließbild einer Reaktivextraktion mit angeschlossener RE-Extraktion der Dicarbonsäure in eine reine wässrige
Phase. Nach Rückgewinnung des in der RE-Extraktion verwendeten wasserlöslichen Amins kann eine finale Aufreinigung (z. B.
Kristallisation) nachgeschaltet werden
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
. Abb. 9.63  Abhängigkeit der RE-Extraktionseffizienz aufgetragen gegen das Verhältnis von eingesetztem wasserlöslichen
Amin und während der Reaktivextraktion mit Tri-n-octylamin im Komplex gebundener Dicarbonsäure (ZSäure). Links: RE-
Extraktion durchgeführt mit Tri-n-propylamin. Rechts: RE-Extraktion durchgeführt mit Propylamin
Nach der RE-Extraktion enthält die organische
Phase nur noch die zur Reaktivextraktion notwen-
digen wasserunlöslichen Amine. Die Konzentra-
tion an wasserlöslichen Aminen (Propylamin) ist
vernachlässigbar.
Hierdurch kann die organische Phase prozess-
intern recycelt werden. Nach erfolgter Phasentren-
nung können die wasserlöslichen Monoamine auf
Basis ihres Siedepunktes kosten- und energieeffizi-
ent aus der wässrigen Phase abgetrennt und einem
wiederholten Einsatz als RE-Extraktionsmittel zuge-
führt werden. Als letzter Feinreinigungsschritt biete
sich z. B. eine Kristallisation der Dicarbonsäure an,
welche so in hoher Reinheit gewonnen werden kann.
Der gesamte Prozess zeichnet sich durch hohe Aus-
beuten und Selektivitäten, sowie eine einfache Pro-
zessführung aus. Durch Anwendung des integrierten
Trennverfahrens kann ein kosten- und ressourcen-
effizientes Aufarbeitungskonzept entwickelt werden.
Durch die simple Umsetzbarkeit in einer Mixer-Sett-
ler Kombination ist das Verfahren kontinuierlich
umsetzbar und kann des Weiteren auf verschiedenste
Durchsätze skaliert werden.
Die wässrige Zweiphasenextraktion
(ATPS)*
von Tim Zeiner überarbeitet
Wässrige Zweiphasensysteme können durch die
Lösung zweier hydrophiler, aber inkompatibler Stoffe
bei Überschreiten einer gewissen Grenzkonzentra-
tion gebildet werden. Beispiele für solche Systeme
363 9
sind zwei hydrophile Polymere oder ein Polymer und
ein Salz. Diese Komponenten werden dann phasen-
bildende Komponenten (PBK) genannt. Der hohe
Wasseranteil (>80 Massenprozent) in beiden Phasen
erlaubt eine schonende Extraktion mit Erhalt der
Aktivität der Biomoleküle. Dies ist ein wesentlicher
Vorteil gegenüber der Extraktion mit organischen
Lösungsmitteln, deren Anwendung in der Biotech-
nik, wie oben gezeigt, auf Sonderfälle beschränkt
bleibt.
. Abb. 9.64 zeigt ein schematisches Phasendia-
gramm eines wässrigen Zweiphasensystems. Die rote
Kurve ist die Binodale, welche das einphasige vom
zweiphasigen Gebiet trennt. Die schwarzen Linien
in . Abb. 9.64 verbinden die korrespondierenden
Phasen im wässrigen Zweiphasensystem. Wird eine
Konzentration der PBK eingestellt, welche der des
OP
MP
PBK 2
KP UP
PBK 1
. Abb. 9.64  Schematische Darstellung eines wässrigen
Zweiphasensystems. MP ist der Mischungspunkt, UP ist die
unter Phase, OP ist die obere Phase und KP ist der kritische
Punkt
 364 H. Chmiel
Mischungspunktes MP entspricht, bilden sich die
untere Phase UP und die obere Phase OP mit den
zugehörigen Konzentrationen an Phasenbildnern.
Im Vergleich zu organisch-wässrigen Systemen mit
nur zwei Komponenten als Extraktionssystem ist zu
beachten, dass es notwendig ist zwei PBK in Wasser
zu lösen, um das Extraktionssystem bereitzustellen.
Ein klassisches wässriges Zweiphasensystem
mit zwei Polymeren hat als PBK Polyethylenglykol
(PEG) und Dextran. PEG wird aus Ethylenoxid in
unterschiedlicher Kettenlänge hergestellt, wobei
Molmassen zwischen 1000 und 20.000 eingesetzt
werden. Dextran ist ein biotechnologisch hergestell-
tes Polysaccharid aus Glucoseeinheiten. Aufgrund
des relativ hohen Preises für Dextran wurde schon
früh nach alternativen Polymeren gesucht. Ein Bei-
spiel hierfür ist derivatisierte Stärke. Darüber hinaus
weisen diese Systeme auch relative hohe Viskositäten
auf, was sich nachteilig auf einen kontinuierlichen
Prozess auswirkt.
9 Breitere Anwendung in der Proteinreinigung
haben Polymer/Salz-Systeme gefunden, da sie
niedrigere Viskositäten aufweisen und auf Grund
der unterschiedlichen physikalischen Eigenschaf-
ten auch bessere Reinigungen erzielen. Als Salze
werden vor allem solche mit hoher Aussalzkapazi-
tät verwendet wie Phosphat oder Sulfat. Als Polymer
kann hier auch PEG oder Polyvinylalkohol einge-
setzt werden. Bei der Phasentrennung verteilt sich
PEG überwiegend in die obere Phase (OP), Kalium-
phosphat überwiegend in die untere Phase (UP).
Proteine und andere Biomoleküle verteilen sich auf-
grund spezifischer Wechselwirkungen mit den PBK
in die jeweilige Phase. Diese Wechselwirkungen
sind vor allem ionischer und Van-der-Waals-Wech-
selwirkungen. Zellen oder andere Partikel können
auf Grund ihrer physikalischen Eigenschaften nicht
in Lösung gebracht werden und verteilen sich auf-
grund ihrer Dichte in dem wässrigen Zweiphasen-
system. Aus diesem Grund ist das Zweiphasensystem
auch zur Abtrennung von Zelltrümmern geeignet, da
sich diese leicht quantitativ in die Unterphase ver-
teilen lassen. Für Proteine liegen die Verteilungsko-
effizienten zwischen 0,01 und 100, für niedermole-
kulare Stoffe wie Aminosäuren oder Salze um 1. Das
Ziel der wässrigen Zweiphasenextraktion ist es, das
gewünschte Produkt in eine Phase, die Fremdpro-
teine in die andere Phase zu verteilen.
Bei Verwendung eines PEG-Salz-Systems bringt
die Entsorgung des Salzes, insbesondere des Phos-
phats, allerdings erhebliche Umweltprobleme. Schon
aus diesem Grund sind anschließende Schritte zur
Rückgewinnung des Salzes notwendig [43].
Ein allgemeines Verfahrensschema für die Auf-
arbeitung von Enzymen mit dem wässrigen Zweipha-
sensystem – mit PEG und Phosphat als phasenbil-
dende Komponenten – ist in . Abb. 9.65 gezeigt. Das
Ausgangs-bzw. Produktgemisch – dabei kann es sich
z. B. um Fermentationsbrühe, aufgeschlossene Zellen
oder Proteingemische etc. handeln – wird im ersten
Extraktionsschritt mit Phosphat und PEG versetzt
und nach kurzer Mischzeit in Ober- und Unterphase
bzw. PEG- und Salzphase getrennt. Die Bedingun-
gen werden so gewählt, dass Zellbruchstücke und der
überwiegende Teil der kontaminierenden Proteine
in die Salzphase verteilt werden, das Produkt jedoch
in die PEG-Phase. In dem zweiten Extraktionsschritt
wird dann das Produkt in die Unterphase verteilt und
so vom PEG getrennt. Ein Teil der Fremdproteine und
Farbstoffe verbleiben in der Oberphase.
Nach diesem Verfahrensschema wurde eine
Reihe von Enzymen gereinigt und ohne weitere Auf-
arbeitungsschritte für technische Zwecke eingesetzt
(. Tab. 9.4). In allen Fällen betrug die Ausbeute um
die 80 %, die Anreicherungsfaktoren lagen zwischen
1,9 und 33.
. Abb. 9.65  Verfahrensschema zur extraktiven
Enzymaufarbeitung mit dem wässrigen Zweiphasensystem.
Phasenbildende Komponenten sind PEG und Kaliumphosphat
(modifiziert nach [60])
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
365 9

. Tab. 9.4  Proteine, die durch mehrere Extraktionsschritte gereinigt wurden (nach [60])

Protein Organismus Anzahl der Ex- Gesamt-reinigun- Gesamtausbeute

traktionsschritte gsschritte [%]

L-2-Hydroxyisocaproat- Lactobacillus confusus 2 24 80

Dehydrogenase
D-2-Hydroxyisocaproat- Lactobacillus casei 2 7 85
Dehydrogenase
Fumarase Brevibacterium 2 22 75
ammoniagenes
Aspartase Escherichia coli 3 18 82
Leucin-Dehydrogenase Bacillus sphaericus 2 3,1 87
Formiat- Candida boidinii 3 4,2 78
Dehydrogenase
D-Lactat- Lactobacillus confusus 2 1,9 91
Dehydrogenase
Penicillin Acylase Escherichia coli 2 10 78
Pullulanase Klebsiella pneumoniae 4 6,3 70
Glucose Bacillus species 3 33 83
Dehydrogenase
Glucose-6-Phosphat- Leuconostoc species 2 5 80
Dehydrogenase
Fumarase Saccharomyces cerevisiae 2 13 77
β-Interferon Human-Fibroblasten 1 350 –

Prinz et al. [96] haben die ATPS zur Tren-
nung verschiedener Laccasen in einer mehrstufi-
gen Mixer-Settler-Apparatur untersucht. Abhängig
von der Konzentration an Kochsalz als Verdränger-
salz, konnten die Laccasen von anderen Proteinen
oder verschiedene Laccasen voneinander getrennt
werden. Auch für die Reinigung von Biopharmazeu-
tika können mehrstufige Mixer-Settler-Apparaturen
eingesetzt werden. In . Abb. 9.66 ist das mehrstu-
fige Mixer-Settler-Verfahren schematisch dargestellt.
Hier ist zu beachten, dass zum Start des Extraktions-
prozesses ein Wasser-Vorlagebehälter durch den
Zellüberstand ausgetauscht wird. Der Einlauf des
Zellüberstandes wird so gewählt, dass das Produkt
in die Phase zugegeben wird in die sich das Produkt
hauptsächlich verteilt.
Muendges et al. [91] haben einen mehrstufigen
Prozess für die Gewinnung von monoklonalen Anti-
körper untersucht, wobei ein PEG (OP)-Phosphat-
salz (UP)-System als ATPS genutzt wurde. Hierzu
wurde zunächst ein dreistufiger Prozess mit Zugabe
von Kochsalz angewandt. Die Zugabe von Kochsalz
hat die monoklonalen Antikörper in die OP verscho-
ben. Durch Zugabe von frischer UP wird die Koch-
salzkonzentration in dem Gesamtsystem gesenkt
und der monoklonale Antikörper verteilt sich in
die UP. Diese wird dann wieder in einem dreistu-
figen Waschschritt mit frischer OP in Kontakt
gebracht. Durch die Kombination von Kochsalz-
reichen Extraktionsschritten und Kochsalz-armen
Waschschritten kann eine Reinheit von 95 % erreicht
werden. Neben den experimentellen Untersuchun-
gen haben sie diesen Prozess auch modelliert. Es war
möglich diesen Extraktionsprozess ausgehend von
einstufigen Experimenten [91] vorauszuberechnen.
Erfolgreich wurde die ATPS auch zur Reinigung
von Antibiotika [16], Cutinase [68] und Plasmid-
DNA (Frerix et al. [36]) eingesetzt, um nur einige
Beispiele zu nennen.
Dass dieses robuste und preisgünstige Reini-
gungsverfahren nicht weiter verbreitet ist, hängt mit
der großen Zahl von Parametern zusammen, die für
ein neues Produkt, das mittels ATPS gereinigt werden
soll, bestimmt bzw. optimiert werden müssen.
 366 H. Chmiel

3KRV 83=XODXI
JHUHLQLJWHV
3URGXNW

23 Q±
+2 6WXIHQ

83 Q± 6WXIHQ±

23

83
23  3(*
6WXIH

$XVJDQJ 6WXIH 23=XODXI + 2

9 XQWHUH3KDVH

3URGXNWJHPLVFK

. Abb. 9.66  Schema eines mehrstufigen Mixer-Settler-Verfahrens zur Reinigung von Biomolekülen mit einem wässrigen
Zweiphasensystem bestehend aus PEG und Phosphatsalz

Das Verteilungsverhalten von Biopolymeren
lässt sich generell durch folgende Bedingungen
beeinflussen:
55 Art der PBK,
55 Molmasse und Molmasseverteilung der
Polymere,
55 Entfernung vom kritischen Punkt, d. h.
Konodenlänge,
55 Gegenwart von Ionen,
55 pH-Wer,
55 Einführung spezifischer Liganden: siehe
Affinitätsextraktion.
Es ist bis heute noch nicht möglich, die Verteilung
von Proteinen genau vorherzusagen, um optimale
Verteilungskoeffizienten zu erzielen. Hier lassen sich
lediglich allgemeine Aussagen treffen, wie z. B., dass
sich Proteine besser bei längeren Konoden aufrei-
nigen lassen.
Selbst für ein gewähltes Polymer/Salz-System
müssen zunächst Binodale, Konoden und Phasen-
verhältnisse sowie Proteinverteilungskoeffizienten
bestimmt werden. Variiert man dann noch Salz- und
Polymerkonzentration, ist die Zahl der Experimente
auf manuellem Weg nicht mehr zu bewältigen.
Bensch et al. [12] haben in einer Machbarkeits-
studie (engl. feasibility study) die experimentelle
Strategie für den Einsatz von HTS zur Lösung dieses
Problems entwickelt. Benutzt wird hierzu wieder die
Plattform eines Pipetierroboters mit einer sogenann-
ten 96-deep-well- plate (Mikrotiterplatte mit geeich-
ten Kunststoffröhrchen, hier mit einem Volumen von
je 1,2 mL) mit Greifarm und integrierter Zentrifuge,
einem Magnetschüttler und einem Spektrophotome-
ter. Das Versuchsprogramm ist in . Abb. 9.67 sche-
matisch dargestellt.
Zur Ermittlung der Binodalkurve (. Abb. 9.67)
werden im Labor zunächst wässrige Lösungen von
Polyethylenglykol (PEG 200, PEG 1000, PEG 1540
und PEG 4000) und Phosphatpuffer (K 2HPO4 +
KH2PO4) hergestellt. In die 96 Wells werden unter-
schiedliche Mengen Salzlösung und 10 μl Methyl-
orange gegeben und mit der PEG-Lösung auf 1 mL
aufgefüllt. Das Mischen der Proben erfolgte auf zwei
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
. Abb. 9.67  Schema zur Bestimmung der Binodale und Konoden (rechts) und der Proteinlöslichkeit (links) für die wässrige
Zweiphasenextraktion PEG/Salz (nach [12])
verschiedene Weisen, und zwar durch Schütteln oder
wiederholtes Ansaugen und Ausblasen mit der Pipet-
tierspitze, wobei Letzteres zu einem homogeneren
Mischergebnis führte. Beim anschließenden Zent-
rifugieren bilden sich ggf. zwei Phasen. Da Methyl-
orange sich im Einphasen-System gleichmäßig ver-
teilt, im Zweiphasen-System aber vollständig in die
Oberphase wandert, können durch Probenahme
am Boden der Wells und Absorptionsmessung bei
450 nm Punkte der Binodale und durch deren Ver-
bindung die Binodalkurve ermittelt werden.
Die Bestimmung der Konoden basiert auf einer
Probenahme in der Oberphase und darauf folgender
Konzentrationsbestimmung des verwendeten Farb-
stoffs Methylviolett bei 562 nm. Die Farbstoffkonzen-
tration ist eine Funktion des Oberphasenvolumens
und erlaubt dadurch über das durch den Mischungs-
punkt festgelegte Volumenverhältnis von Ober- und
Unterphase auf die Schnittpunkte der jeweiligen
Konode mit der Binodale zurück zu schließen. Aller-
dings ergab sich bei dieser Methodik eine höhere
Ungenauigkeit in der Nähe des kritischen Punktes,
sodass die gewonnenen Binodal- und Konodenver-
läufe nicht mit der Literatur übereinstimmten.
Analog ging man bei der Bestimmung des Pro-
teinverteilungskoeffizienten vor, jedoch erfolgte hier
die Bestimmung der Proteinkonzentration mittels
UV-Vis-Spektrophotometer bei 280 nm. Der Pro-
teinverteilungskoeffizient ergibt sich dann aus dem
Verhältnis der Proteinkonzentrationen in Ober- und
367 9
Unterphase. Obwohl mit diesem Verfahren bis zu 600
Phasensysteme pro Tag untersucht werden konnten,
ist der Zeitaufwand sehr hoch. Im Hinblick auf eine
große Zahl neuer Produkte (z. B. biopharmazeutisch
gewonnener Generika) und dem Druck möglichst
schnell damit auf den Markt zu kommen, schlagen
Nfor et al. [92] vor, neben Hochdurchsatz-Experi-
menten die Biothermodynamik und Simulationsins-
trumente zu Hilfe zu nehmen.
Affinitätsextraktion
Der in . Tab. 9.4 für β-Interferon erreichte Anrei-
cherungsfaktor von 350 gelang durch Modifikation
des PEG im Sinne der Affinitätsextraktion.
Durch Einführung eines Liganden, der spezifisch
nur das Zielsystem oder eine Enzymgruppe erkennt,
kann die Selektivität und damit der Verteilungskoef-
fizient drastisch erhöht werden.
Die Affinitätsextraktion oder -verteilung ist in
der Wirkung zu vergleichen mit der Affinitätschro-
matographie und der Affinitätspräzipitation. In der
Regel kann die Affinitätsextraktion nur in einem
Polymer-Polymer-System durchgeführt werden, da
hohe Salzkonzentrationen die Interaktion zwischen
Ligand und Protein herabsetzen. Bei Verwendung
von PEG und Dextran wird der Ligand meistens an
die terminale Hydroxylgruppe des PEG gekoppelt, es
gibt jedoch auch Beispiele der Kopplung an Dextran.
Als Liganden können unter anderem Substrate,
 368 H. Chmiel
Inhibitoren oder Cofaktoren eingesetzt werden. In
.  Abb. 9.68 sind die Verteilungskoeffizienten von
verschiedenen Dehydrogenasen in Abhängigkeit des
Anteils an PEG-NADH in einem PEG 4000/Dext-
ran-T-500-System gezeigt. Mit steigender Konzen-
tration des Liganden tragenden PEG ergeben sich
typische Sättigungskurven. Je nach Enzym wird der
Verteilungskoeffizient bis zu 20-fach gesteigert. Da
NADH als Ligand zu teuer ist, wurden schon früh
alternative Liganden gesucht und in den Triazinfarb-
stoffen gefunden, die hohe Affinitäten zu Dehydroge-
nasen zeigen. Für die Phosphofructokinase aus Sac-
charomyces cerevisiae konnte der Δlog K-Wert um
den Faktor 3 gesteigert werden [63].
Diese hohen Verteilungskoeffizienten tragen
jedoch nur zur Reinigung bei, wenn der Verteilungs-
koeffizient der kontaminierenden Proteine nahezu
unverändert bleibt. In den meisten Veröffentlichun-
gen, so auch in dem obigen Beispiel, werden vorge-
reinigte oder homogene Enzymsysteme eingesetzt.
9 Schustolla et al. [110] zeigten, dass die Steigerung
des Δlog K-Wertes bei Einsatz von Zellhomoge-
nat, also direkt aus der aufgeschlossenen Zellbrühe,
. Abb. 9.68  Verteilungskoeffizient KE von verschiedenen
Dehydrogenasen als Funktion der PEG6000-NADH-
Konzentration in einem PEG4000/Dextran-T-500-System.
Systembedingungen: 7 % (w/w) PEG4000; 6 % (w/w)
Dextran T-500; 0,05 M Kaliumphosphat, pH 7,5 und
0,1 mM β-Mercaptoethanol (20 °C) (nach Kula et al. [70].
□: Lactat-Dehydrogenase (Kaninchenmuskel); ∆: Alkohol-
Dehydrogenase (Hefe: Saccharomyces cervisae); ×: Formiat-
Dehydrogenase (Candida boidinii); ×: Formaldehyd-
Dehydrogenase (Candida boidinii)
weit geringer ausfällt. Andere Verbesserungen der
Selektivität sind z. B. die Einführung von geladenen
Gruppen wie quartäres Amin oder eine Sulfonsäu-
regruppe, Phosphatester oder polymergebundene
Fettsäuren.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass
das wässrige Zweiphasensystem sich durch folgende
Punkte auszeichnet:
55 verfahrenstechnische Einfachheit in jedem
Maßstab,
55 einfaches und präzises Scale-up,
55 hohes Potenzial für eine kontinuierliche
Prozessführung,
55 niedrige Investitionskosten,
55 hohe Produktausbeuten.
Von Nachteil sind jedoch die relativ hohen Chemi-
kalienkosten, weswegen ein Recycling der System-
komponenten besonders interessant ist. Hustedt und
Mitarbeiter [60] konnten anhand der Fumarase aus
der Bäckerhefe zeigen, dass das PEG bis zu viermal
wiederverwendet werden kann, ohne dass dadurch
die spezifische Aktivität oder die Ausbeute nennens-
wert absinkt.
Superkritische Fluidextraktion (SFE)
Seit Langem ist bekannt, dass verflüssigte und über-
kritische Gase als Extraktionsmittel im Sinne einer
Solventextraktion benutzt werden können (supercri-
tical fluid extraction, kurz SFE). Die Diffusionskoef-
fizienten liegen für überkritische Gase um ca. zwei
Zehnerpotenzen unter denen der Gasphase und ca.
1,5 Zehnerpotenzen über denen der flüssigen Phase.
Ebenso liegt die Viskosität überkritischer Gase zwi-
schen dem flüssigen und dem gasförmigen Zustand.
Daraus resultieren im Vergleich zur Flüssig-Flüssig-
Extraktion sehr günstige Transporteigenschaften im
überkritischen Zustand.
Die Löslichkeit ist in der Regel in überkritischen
Gasen im Vergleich zu organischen Lösungsmitteln
wesentlich niedriger. Überkritische Gase verhalten
sich wie unpolare Lösungsmittel und eignen sich
aus diesem Grunde bevorzugt für unpolare Subs-
tanzen. Ionisierte Stoffe lösen sich ebenso wenig wie
Polysaccharide und einfache Zucker. Die Löslichkeit
polarer Stoffe – das sind solche, die polare Substitu-
enten wie Hydroxyl-, Amino- oder Carboxylgruppen
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
enthalten – ist wesentlich geringer als die der ver-
gleichbaren Grundkörper. Leicht löslich und damit
für die Extraktion geeignet, sind die völlig unpolaren
Kohlenwasserstoffe, viele Ether, Ester, Lactone und
Triglyceride (Fette).
Eine der wichtigsten technischen Anwendungen
ist die Entasphaltierung von Erdöl. Aber auch in der
Lebensmitteltechnik wird die SFE z. B. zur Gewin-
nung von Aromastoffen oder zur Entkoffeinierung
von grünem Kaffee eingesetzt. Über den Einsatz in
der Biotechnik berichtet Willson [138]. Als Lösungs-
mittel wird überwiegend CO 2 verwendet. Dieses
besitzt zahlreiche Vorteile:
55 Sein kritischer Punkt liegt – wie aus dem
Zustandsdiagramm in . Abb. 9.69 hervorgeht –
mit 31 °C und 73 bar in einem technisch
gut beherrschbaren Bereich. Aufgrund der
niedrigen kritischen Temperatur lassen
sich auch empfindliche Stoffe extrahieren
oder voneinander trennen, die in anderen
Verfahren, wie z. B. der Destillation, thermisch
geschädigt würden. Wegen der niedrigen
Prozesstemperaturen können die Heizkosten
niedrig gehalten werden.
. Abb. 9.69  Zustandsdiagramm für CO2, die dünnen Linien
sind Isochoren (Dichten von 0,1–1,2 g/mL)
369 9
55 Es ist nicht brennbar, im Allgemeinen nicht
korrosiv sowie auch in großen Mengen und
großer Reinheit billig zu beziehen.
55 Es ist physiologisch völlig unbedenklich.
Aufgrund seines hohen Dampfdruckes
verflüchtigt es sich aus den Extrakten
vollkommen rückstandsfrei. Diese Eigen-
schaften machen es insbesondere für die
Nahrungs- und Genussmittelverarbeitung
interessant.
Anhand von . Abb. 9.70 soll am Beispiel der super-
kritischen CO2-Extraktion eines Fischölesters zur
Gewinnung von Ω-3-Fettsäurenester der Prozess
erläutert werden. Das Einsatzgut (1) wird mittels
Hochdruckpumpe (2) bei ca. 100 bar in den oberen
Teil der Extraktionssäule eingespritzt. Das mittels
Hochdruckpumpe (5) und Wärmetauscher (6) auf
überkritische Bedingungen gebrachte Extraktions-
mittel (4) wird im unteren Teil der Extraktionssäule
(3) eingebracht und im Gegenstrom zum Einsatzgut
geführt. Nicht extrahierte Substanzen wie Wasser,
Proteine und Verunreinigungen gelangen in den
Rückstandsbehälter (7) und werden dort ausgetra-
gen. Die im überkritischen CO2 gelösten Fettsäu-
reester passieren die Drossel bei (8). Hier wird das
Extraktionsmittel auf einen unterkritischen Druck
entspannt, verliert seine Lösungseigenschaften
nahezu vollständig, und die gelösten Stoffe fallen aus.
Die Fettsäureester werden im Separator (9) freige-
setzt und verlassen die Anlage bei (10) als Extrakt.
Auf diese Weise können mit einer Anlage bis zu 500
Tonnen pro Jahr Extrakt mit einem Ω-3-Fettsäureest-
ergehalt von 60 % erzeugt werden (. Abb. 9.71). Man
erkennt, dass es sich durchaus um einen interessan-
ten Produktionsmaßstab handelt, der bei anderen
Produkten (Hopfenextraktgewinnung, Entkoffe-
inierung etc.) sogar noch größere Maßstäbe errei-
chen kann.
Das Trägergas wird über einen Wärmetau-
scher (11) gekühlt und als flüssiges CO2 wieder dem
Extraktionsmittelbehälter (4) zugeführt.
Durch eine Drosselung oder Temperaturände-
rung in mehreren Stufen lassen sich die Extraktstoffe
unter Umständen auch fraktionieren. Durch Zugabe
von geringen Mengen eines sogenannten Schlepp-
mittels könnte die Löslichkeit der Extraktsubstanzen
im Trägergas für bestimmte Substanzen um mehrere
 370 H. Chmiel

. Abb. 9.70  Schematische

Darstellung der überkritischen
Fluidextraktion (SFE) (Details siehe
Text)

9 . Abb. 9.71  Anlage zur

überkritischen CO2-Extraktion (mit
freundlicher Genehmigung der KD-
Pharma, Bexbach)

Zehnerpotenzen gesteigert werden. Als Schleppmit-
tel eignen sich nach dem derzeitigen Kenntnisstand
vor allem leichtflüchtige Flüssigkeiten wie Alko-
hole, Aceton oder kurzkettige Alkane, teilweise auch
Wasser. Um beurteilen zu können, welche der zahl-
reichen möglichen, hier nur kurz angeschnittenen
Prozessvarianten für ein gegebenes Trennproblem
am besten geeignet ist, sind detaillierte Kenntnisse
über das Verhalten der beteiligten Gemische nötig.
Diese sind beim derzeitigen Stand der Technik nur
durch Experimente zu gewinnen.
Die Vorteile, die diese Trennmethode gegenüber
den herkömmlichen Verfahren der Destillation und
Extraktion mit organischen Lösungsmitteln aufzu-
weisen hat, sind: große Variabilität im Lösungsbe-
reich des Extraktionsmittels durch Regelung von
Temperaturen und Druck, Trennung auch schwer-
flüchtiger Stoffe bei relativ niedrigen Temperaturen,
lösungsmittelfreie Produkte, nicht toxisch, nicht
entflammbar, hoher Reinheitsgrad, einfache Rege-
nerierung des Lösungsmittels, keine Umweltschutz-
probleme, chemisch reaktionsträge. Dem stehen als
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
Nachteile hohe Investitionskosten durch teure Hoch-
druckapparatur und relativ niedrige Beladung des
Lösungsmittels gegenüber. Dennoch hat sich die
überkritische CO2-Extraktion für die Isolation und
Reinigung hochwertiger Produkte im großtechni-
schen Maßstab durchgesetzt (. Abb. 9.71).
Solventextraktion im
technischen Maßstab
Die Extraktion beginnt mit dem Dispergieren des
Extraktionsmittels in die abgebende Phase. Dabei
sollte eine möglichst große Austauschfläche erzeugt
werden, um den Stoffaustausch zu verbessern.
. Abb. 9.72  Schematische Darstellung einiger Extraktionsapparate: (a) Mischer/Abscheider; (b) Mischer/ Tellerseparator;
(c) Siebbodenkolonne; (d) Füllkörperkolonne
371 9
Anschließend müssen die beiden Phasen wieder
voneinander getrennt werden. Diese beiden Stufen
(. Abb. 9.72a) sind daher in jedem Extraktionspro-
zess in irgendeiner Form vorhanden. Da die Pha-
sentrennung häufig der limitierende Schritt ist, wird
sie, wie in . Abb. 9.72b dargestellt, durch den bereits
früher beschriebenen, kontinuierlich arbeitenden
Tellerseparator beschleunigt. Durch diesen Teller-
separator findet auch die Trennung des wässrigen
Zweiphasensystems statt, insbesondere wenn die
Unterphase mit Zellbruchstücken beladen ist.
Die in . Abb. 9.72c im Ausschnitt schematisch
dargestellte Siebbodenkolonne bedeutet im Grunde
genommen die Aneinanderreihung mehrerer
 372 H. Chmiel
Mischer/Abscheider, allerdings im Gegenstrom
betrieben. In . Abb. 9.72d wird die große Aus-
tauschfläche durch Füllkörper erreicht. Siebboden
und Füllkörperkolonne werden häufig auch pulsie-
rend betrieben. In kontinuierlichen Prozessen wird
das Produkt ständig aus der Extraktphase entfernt
und das Extraktionsmittel wiederverwendet. Neben
den gezeigten Beispielen hat sich in der industriel-
len Anwendung eine Fülle von Varianten etabliert.
Cunha und Aires-Barros [31] haben diese Varianten
an Anwendungsbeispielen und mit einer großen Zahl
von Literaturzitaten diskutiert. Eine dieser Varianten
ist die von Wyss et al. [140] beschriebene Enkapsulie-
rung des Extraktionsmittels in einen Polymerfilm. Im
oben genannten Beispiel wird eine hydrophobe Flüs-
sigkeit (das Extraktionsmittel) so in einen Film aus
vernetztem Acrylamid/Alginat eingeschlossen, dass
sich nahezu monodisperse, mit dem Extraktionsmit-
tel gefüllte Kugeln von ca. 1 mm Durchmesser bilden.
Diese können dann zur in situ-Extraktion des Pro-
9 duktes (z. B. Penicillin G) eingesetzt werden.
9.3.6 Elektrokinetische
Trennverfahren
Bekanntlich wandern elektrisch geladene Teilchen,
wenn sie in einem Elektrolyten suspendiert sind,
beim Anlegen eines elektrischen Feldes zur ent-
gegengesetzt geladenen Elektrode. Dieser Vorgang
wird Elektrophorese genannt (. Abb. 9.73).
. Abb. 9.73  Schema der Elektrophorese; punktierte
Fläche = Grundelektrolyt; S = Wanderungsstrecke eines
Kations in der Zeit t, l = Abstand der Elektroden
Die im stationären Zustand sich einstellende
Geschwindigkeit w± des Teilchens wird im Wesent-
lichen von zwei Kräften bestimmt:
55 der treibenden Kraft, als Produkt aus effektiver
Ladung des Teilchens eeff und elektrischer
Feldstärke E = U/l (Länge auf der der
Spannungsabfall U stattfindet) und
55 der der Bewegung entgegengesetzt gerichteten
Reibungskraft, die sich aus der Relativ-
bewegung des Teilchens zur umgebenden
Flüssigkeit ergibt und für kugelförmige
Teilchen näherungsweise dem Stokes’schen
Gesetz gehorcht, d. h.
eeff ⋅ E
w± =  Gl. 9.21
6⋅π⋅η ⋅ r
mit r = Teilchenradius,
η = dynamische Viskosität der Flüssigkeit.
Statt der Geschwindigkeit des Teilchens wird häufig
auch dessen Beweglichkeit u± = w±/E verwendet.
Aus Gl. 9.21 lassen sich bereits unmittelbar wichtige,
die Wanderungsgeschwindigkeit beeinflussende
Parameter ableiten. Sie nimmt mit zunehmender
Ladung des Teilchens und mit der Feldstärke zu
und verringert sich mit zunehmender Viskosität
und mit der Teilchengröße. Der Einfluss anderer
Parameter, wie z. B. der Ionenstärke oder des pH-
Wertes auf die Teilchenbeweglichkeit, ist komple-
xer (Debye-Hückel-Theorie). Hier wird auf die ein-
schlägige Literatur verwiesen (z. B. [129]). Mithilfe
der Elektrophorese können Komponenten aus fast
allen Stoffklassen, die in Lösung mindestens teil-
weise geladen vorliegen, aufgetrennt werden. Die
Hauptanwendungsgebiete sind in der klinischen
Chemie und der Biochemie zu finden, um Makro-
moleküle (Polypeptide, Proteine, Hormone, Nuc-
leinsäuren, Antikörper, Organellen, Viren oder
Zellen usw.) zu trennen und aufzureinigen. Diag-
nostische Bedeutung für die Medizin hat die Elek-
trophorese zur Aufreinigung von Serumproteinen
erlangt. Die Elektrophorese wird hauptsächlich im
analytischen Maßstab eingesetzt.
Ein präparatives, kontinuierliches Verfahren
stellt die sogenannte Free-Flow-Elektrophorese dar,
wobei in der Grundbauart auf jegliche Einbauten
innerhalb der Trennkammer verzichtet wird.
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
Bei den kontinuierlich arbeitenden präparati-
ven Elektrophoreseprozessen besteht in der Regel
die Elektrophoresekammer aus einem flachen, recht-
winkligen Kanal.
Die Trennkammer wird vom zu trennenden
Flüssigkeitsgemisch (Probe) in Längsachse laminar
durchströmt. Das senkrecht zur Strömungsrichtung
angelegte elektrische Feld (siehe auch . Abb. 9.74)
sorgt für eine unterschiedliche Ablenkung der gela-
denen Teilchen und damit für die Bildung von Frak-
tionen, die am Ende der Kammer in einem Fraktions-
sammler aufgefangen werden.
Über die rückwärtige Platte der Trennkammer
erfolgt, von einem Temperaturfühler kontrolliert,
der Abtransport der durch den elektrischen Strom
erzeugten Wärme. Zur Dosierung der Elektrolyte,
zur Fraktionierung der Proben und zur Umwälzung
der Elektrodenraumelektrolyte dienen Schlauch-
pumpen. Spannungen bis 3000 V sind möglich.
Störfaktoren
Das theoretisch mögliche Trennergebnis wird bei
der Free-Flow-Elektrophorese durch eine Reihe von
Faktoren beeinträchtigt, die von Hannig et al. [46]
analysiert wurden.
So bildet sich an der Grenzfläche des Trennspal-
tes zwischen Kammerwand und der wässrigen Elek-
trolytlösung eine bewegliche diffuse Doppelschicht,
die gemäß . Abb. 9.74a in Richtung Kathode driftet.
. Abb. 9.74  Störfaktoren bei der Free-Flow-Elektrophorese
(nach [129]). (a) Bewegliche, diffuse Doppelschicht; (b)
Umlaufströmung durch Elektroosmose und (c) deren
Wirkung als sichelförmige Bandenverbreiterung; (d)
sichelförmige Bandenverbreiterung durch parabolisches
Geschwindigkeitsprofil, W. P. = wanderndes Profil der Probe
373 9
Sie führt im Trennspalt zwangsläufig zu einer stö-
renden Umlaufströmung. Dieser als Elektroosmose
bezeichnete Effekt führt zu einer sichelförmigen Ban-
denverbreiterung (. Abb. 9.74b und 9.74c).
Eine analoge Wirkung erzeugt das parabolische
Geschwindigkeitsprofil (. Abb. 9.74d). Ein Flüs-
sigkeitselement in Wandnähe hat eine wesentlich
größere Verweilzeit im Trennspalt und legt daher
im elektrischen Feld eine größere Strecke zurück
als ein entsprechendes Flüssigkeitselement in der
Strömungsmitte.
Bei anionischer Wanderung der Probe wirken die
beiden Effekte gegenläufig, sodass sie sich gegensei-
tig im Idealfall aufheben; bei kathodischer Wande-
rung addieren sie sich und führen zu einer verstärk-
ten Bandenverbreiterung.
Schließlich ist zu beachten, dass die in den
Trennspalt eingebrachte elektrische Energie im
Wesentlichen in Wärme umgewandelt wird.
Dies bedeutet eine ausgeprägte Thermokonvek-
tion, d. h. eine Störung der gewünschten ebenen
Schichtenströmung.
Bei der Nutzung der Free-Flow-Elektrophorese
zur präparativen Abtrennung und Aufreinigung von
Bioprodukten differenziert man im Wesentlichen zwi-
schen vier Trennprinzipien (. Abb. 9.75), die jedoch
auch im analytischen Maßstab Gültigkeit haben:
55 Zonenelektrophorese (ZE),
55 Isotachophorese (ITP),
55 Isoelektrische Fokussierung (IEF),
55 Feldsprungelektrophorese (FSE).
Zonenelektrophorese (ZE)
Eine Pufferlösung, der sogenannte Grundelektro-
lyt, durchströmt gleichmäßig die Trennkammer und
dient hier in der Regel auch als Elektrodenlösung.
An einer eng begrenzten Stelle wird die zu fraktio-
nierende Probe ebenfalls kontinuierlich zudosiert
(. Abb. 9.75a). Die Probenkomponenten (im Beispiel
der . Abb. 9.75a sind es zwei) werden im elektrischen
Feld aufgrund ihrer unterschiedlichen Beweglich-
keit um unterschiedliche Winkel abgelenkt. Es ent-
stehen einzelne Zonen, die sich infolge Diffusion mit
zunehmender Weglänge verbreitern. Dies bedeutet
eine starke Verdünnung der Probe und eine – vergli-
chen mit anderen Free-Flow-Elektrophoresetechni-
ken – schlechte Auflösung.
 374 H. Chmiel
9 sche synthetischer Polyamino-polycarbonsäuren
. Abb. 9.75  Verschiedene Free-Flow-
Elektrophoreseverfahren. (a) Zonenelektrophorese; (b)
Isotachophorese; (c) Isoelektrische Fokussierung; (d)
Feldsprungelektrophorese
Die ZE ist daher in erster Linie geeignet für die
Reinigung und Isolierung von Zellen und Zellorga-
nellen, weniger für die Proteinreinigung.
Isotachophorese (ITP)
Am Kopf der Trennkammer werden gemäß
.  Abb. 9.75b drei Lösungen aufgegeben: ein Leit-
elektrolyt (leading electrolyte), die zu trennende
Probe und ein Folgeelektrolyt (terminating electro-
lyte). Das Leit-Ion muss die größte, das Folge-Ion die
kleinste Ionenbeweglichkeit besitzen. Die Beweglich-
keiten der zu trennenden Ionen müssen dazwischen
liegen. Die unterschiedlichen Ionenbeweglichkeiten
haben einen stufenförmigen Verlauf der Leitfähig-
keit und damit der Feldstärken zur Folge. Dadurch
werden die Komponenten derart getrennt, dass sie
diskrete Zonen homogener Konzentration bilden.
Das System erreicht einen stationären Zustand, in
welchem die Zonen sich mit konstanter Geschwin-
digkeit bewegen (daher der Name Isotachophorese).
Wegen ihrer hohen Auflösung ist die ITP als
letzter Schritt der Proteinreinigung geeignet. Sie wird
insbesondere zur Isolierung monoklonaler Antikör-
per eingesetzt.
Isoelektrische Fokussierung (IEF)
Bei der isoelektrischen Fokussierung in pH-Gra-
dienten wandern Ampholyte an diejenige geomet-
rische Stelle, an der ihre Nettoladung verschwindet.
Der pH-Wert an dieser Stelle muss demzufolge iden-
tisch mit dem isoelektrischen Punkt (IP) der Pro-
benkomponente sein (pI-Wert). Es gibt zwei Arten
der IEF.
Bei der IEF im linearen pH-Gradienten
(. Abb. 9.75c) werden als Trägerampholyte Gemi-
bzw. -polysulfonsäuren verwendet, deren pI-Wert
den interessierenden pH-Bereich abdeckt. Unter
Miteinbeziehung der Elektrolyseprodukte an den
Elektroden entsteht bei Stromfluss ein mehr oder
weniger stabiler, monotoner pH-Verlauf. Die andere
Möglichkeit ist die Erzeugung eines stufenförmigen
pH-Verlaufes.
Die IEF eignet sich vor allem für die Trennung
von Aminosäuren, Peptiden und Proteinen.
Feldsprungelektrophorese (FSE)
Bei der FSE wird die Probe als breite Zone zwischen
zwei Randlösungen auf die Trennkammer aufgege-
ben (. Abb. 9.75d). Die Randlösungen müssen im
Vergleich zur Probelösung eine etwa 20-fach höhere
Leitfähigkeit besitzen [57]. Bei angelegter Span-
nung stellt sich ein Feldstärkesprung ein, mit sehr
niedriger Feldstärke im Anoden- und Kathodenbe-
reich und hoher Feldstärke im Probenbereich. Daher
wandern die Probeionen mit hoher Geschwindigkeit
in Richtung Kathode bzw. Anode. An der Grenzflä-
che werden sie wegen des Feldstärkesprungs erheb-
lich abgebremst, sodass sie dort aufkonzentriert
werden. Mit zunehmender Verweilzeit wandern
allerdings die konzentrierten Komponenten in die
Randlösung hinein.
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
Wegen der Möglichkeit hoher Probendurchsätze
eignet sich die FSE für die Vorreinigung biotechni-
scher Produkte (Aminosäuren, Peptide, Proteine,
Viren, Zellen etc.).
Einschlägige Übersichtsartikel (z. B. [28, 62])
zeigen, dass die Fortentwicklung elektrokinetischer
Trennverfahren hauptsächlich im analytischen
Bereich geschieht.
Für die präparativen elektrokinetischen Verfah-
ren muss festgestellt werden, dass sie – nicht zuletzt
wegen der oben genannten Störfaktoren – keine bes-
seren Trennleistungen bieten als die im Folgenden
beschriebenen chromatographischen Trennver-
fahren und sich wegen der vergleichsweise hohen
Kosten und der begrenzten Scale-up-Möglichkei-
ten nicht durchgesetzt haben.
9.3.7 Adsorptive/Chromatographische
Trennverfahren
Bei der Reinigung von Substanzen mittels Adsorp-
tion/Chromatographie nutzt man den Effekt, dass
verschiedene Komponenten einer Lösung, wenn
sie ein Festbett durchströmen, mit der Oberfläche
der Feststoffpartikel verschieden stark interagie-
ren. Die daraus resultierenden unterschiedlichen
Verweilzeiten führen zu einer Komponententren-
nung, d. h. die einzelnen Komponenten verlassen
mit einer zeitlichen Verschiebung gegeneinander
das Festbett analog . Abb. 9.76. In der Regel sind
die Feststoffpartikel in eine Säule gefüllt. Das Bio-
produktmolekül, im Folgenden R-Molekül genannt,
kann verschiedenartige aktive Gruppen besitzen,
die unterschiedliche Interaktionen mit den ent-
sprechenden aktiven Gruppen der Feststoffober-
fläche eingehen können. Bei geeigneter Wahl von
stationärer und mobiler Phase zeichnen sich die
chromatographischen Verfahren nicht nur durch
ihre schonende Trennung (niedrige Scherkräfte,
Raumtemperatur, gepufferte Lösungen), sondern
auch durch ihre hohe Selektivität aus. Damit sind
sie besonders interessant für die Reinigung von
Bioprodukten.
Die chemischen Oberflächeneigenschaften
der Feststoffpartikel – stationäre Phase genannt –
bestimmen, zusammen mit dem durchströmenden
Flüssigkeitsgemisch – mobile Phase genannt – das
375 9
spezifische chromatographische Trennverfahren.
Während niedermolekulare Substanzen sich unter
solchen Bedingungen oft genügend stark in ihrem
Wechselwirkungsverhalten unterscheiden und so
„isokratisch“, d. h. ohne Wechsel der mobilen Phase
aufgetrennt werden können, ist dies bei Biomakro-
molekülen wie Proteinen oft nicht der Fall. Proteine
zeichnen sich für eine bestimmte Kombination von
stationärer und mobiler Phase oft durch ein „Alles-
oder-nichts“-Bindungsverhalten aus. In solchen
Fällen ist es üblich, die Stärke der mobilen Phase
während der chromatographischen Trennung gra-
duell zu erhöhen, um so zunächst die schwach bin-
denden und dann die stärker bindenden Moleküle
zu eluieren (Gradientenelution). Neben den linea-
ren sind in der präparativen Chromatographie vor
allem Stufengradienten üblich. Die unten aufgeführ-
ten theoretischen Grundlagen beziehen sich auf den
isokratischen Fall.
Theoretische Grundlagen der Chroma-
tographie
Um den chromatographischen Trennprozess zu
beschreiben, werden im Folgenden einige grundle-
gende Definitionen eingeführt. In einem idealisier-
ten Chromatogramm (. Abb. 9.76) wird der zeit-
bzw. volumenabhängige Austritt der Substanzen
. Abb. 9.76  Das Chromatogramm und seine Kenngrößen.
V0 = Totvolumen (definiert als Volumen der mobilen Phase
in der Säule); w = Basisbreite eines Peaks (in diesem Fall
Volumen des durch seine Wendetangenten begrenzten
Peaks); VRi = Retentionsvolumen der Substanz i; VRi′ =
Nettoretentionsvolumen der Substanz i, VRi′ = VRi − V0
 376 H. Chmiel

aus der Säule gezeigt. Dabei ist als y-Achse ein
substanzabhängiges (hier konzentrationsabhän-
giges) Signal (Peak) wie etwa die UV-Absorption,
als x-Achse die Zeit ( Elutionszeiten ) oder das
Volumen der mobilen Phase (Elutionsvolumen)
aufgetragen.
Daraus wird als reduzierte, von der Säulendi-
mension unabhängige Größe der Kapazitätsfaktor
K′ berechnet:
VR′ VR − V0
K′ = =  Gl. 9.22
V0 V0
Zwei Komponenten einer Mischung werden nur
dann getrennt, wenn sie unterschiedliche Elutions-
volumina und damit unterschiedliche Kapazitätsfak-
toren haben. Ein Maß dafür ist die relative Retention
α, die auch Trennfaktor oder Selektivität genannt
wird, wodurch die Trennfähigkeit einer Chromato-
graphiesäule beschrieben wird
Zu beachten ist die Konsequenz, dass die Auflösung
proportional zur Wurzel der Bodenzahl und damit
proportional zur Wurzel aus der Säulenlänge ist. Die
Anzahl an theoretischen Böden (N) ist gleich dem
Quotienten aus Säulenlänge und der Höhenäquiva-
lenz eines theoretischen Bodens H oder Trennstufen-
höhe und damit proportional zur Säulenlänge. Damit
berechnet sich H als
H = L /N  Gl. 9.27
Die Höhenäquivalenz eines theoretischen Bodens
wird von drei Parametern bestimmt, die in der van-
Deemter-Gleichung zusammengefasst sind:
H = A + B /v + C ⋅ v  Gl. 9.28
Die van-Deemter-Gleichung wird in der Regel in der
reduzierten Form dargestellt,

9 α=
K 2′ VR 2 − V0
=  Gl. 9.23 H /d p
K1′ VR − V0
1
Um eine gute Trennung der Stoffe zu gewährleis- wobei dp der Partikeldurchmesser ist.
ten, müssen sich aber nicht nur die Kapazitätsfakto- A = Säulenqualitätsfaktor(Eddy-Diffusion);
ren unterscheiden. Wesentlich ist auch, in welchem unabhängig von der Flussrate. Hier kommen
Volumen die Substanzen eluieren, d. h. die Breite Faktoren hinein wie Säulenpackung, Partikel-
der Elutionspeaks, die sich möglichst nicht überlap- größe und -form. Bei einer gut gepackten Säule
pen sollen. Aus der Breite der Peaks und dem Elu- sollte A nicht viel größer als das Dreifache des
tionsvolumen wird die dimensionslose Trennstufen- Partikeldurchmessers dp betragen.
oder Bodenzahl (von einigen Autoren auch Leistung B = Axialdiffusion. Da die Diffusion der Substanz
genannt) nach folgender Gleichung berechnet: der Trennung entgegenwirkt, d. h. zur Banden-
V 2 verbreiterung führt, ist eine genügend schnelle
N = 16 ⋅  R   Gl. 9.24 Trennung wichtig, um diese Diffusion so klein
 w 
wie möglich zu halten. Wegen der geringen Dif-
Häufig wird zur Berechnung nicht die Basisbreite, fusionsgeschwindigkeit von Proteinen spielt der
sondern die Peakbreite w auf halber Höhe (w1/2) zur B-Term bei der Proteinchromatographie norma-
Berechnung herangezogen. lerweise keine Rolle.
 V 2 C = Non-Equilibrium-Term (Massentransfer zur
N = 5, 54 ⋅  R   Gl. 9.25 stationären Phase). Dieser Term steigt mit zuneh-
 w1/ 2 
mender Flussrate, da die Zeit zur Gleichgewichts-
Werden Leistung und Selektivität miteinander ver- einstellung kürzer wird. Um C gering zu halten,
knüpft, so erhält man die Auflösung (Rs) einer Chro- muss eine langsame Flussrate gewählt werden.
matographiesäule. Diese drei Begriffe sind in der v = Flussrate.
nächsten Gleichung miteinander verknüpft.
In . Abb. 9.77 ist die van-Deemter-Gleichung
 α −1  K 2′ 
Rs = N  ⋅  Gl. 9.26 grafisch für kleine ( . Abb. 9.77a) und für große
 α  1 + K1′ 
Moleküle ( . Abb. 9.77b ) dargestellt, und zwar
die Abhängigkeit der Höhenäquivalenz eines
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
theoretischen Bodens (H) in Millimeter von der
Flussrate und der Anteil der drei oben genannten
Parameter. Die Axialdiffusion trägt vor allem bei
kleinen Molekülen (. Abb. 9.77a) zur Bandenver-
breiterung bei, deshalb sind für die Trennung klei-
nerer Moleküle schnelle Flussraten zu empfehlen.
Bei großen Molekülen (. Abb. 9.77b) ist diese Dif-
fusion dagegen fast vernachlässigbar. Hier spielt der
C-Term die wichtigste Rolle, da aufgrund der lang-
samen Diffusion das Erreichen des Gleichgewichts
zum entscheidenden Parameter wird. Aus der Abbil-
dung ist zu erkennen, dass es für jedes Molekül eine
optimale Flussrate gibt.
Wegen der Dominanz des C-Terms bei typi-
schen chromatographischen Trennungen von Pro-
teinen und anderen Biomakromolekülen spricht
man in diesem Zusammenhang auch vom Dilemma
der Biochromatographie, d. h. der Schwierigkeit
bei solchen Trennungen Kapazität, Geschwindig-
keit und Auflösung zu vereinen. Eine hohe Kapa-
zität setzt eine poröse stationäre Phase voraus. In
diese Poren müssen die Proteine durch Diffusion
gelangen, eine schnelle Trennung bedingt dann
einen hohen C-Term und damit eine geringe Säu-
leneffizienz bzw. schlechte Auflösung. Eine Lösung
stellen sogenannte monolithische stationäre Phasen
dar. Derartige Säulen bestehen nicht aus Partikeln,
sondern aus einem hochporösen Polymerblock, der
von der mobilen Phase durchströmt wird. In solchen
Säulen erfolgt der Massentransport bis auf die Grenz-
schichtdiffusion rein konvektiv, der C-Term, d. h. der
Anstieg der Bodenhöhe zu hohen Flussraten hin, ist
auch bei großen Flussraten gering. Leider lassen sich
solche Monolithe derzeit noch nicht im Maßstab
typischer präparativer Säulen in der Biochromato-
graphie herstellen.
. Abb. 9.77  Abhängigkeit der
Höhe H eines theoretischen Bodens
(als Summe von A, B und C) von
der Durchflussrate (a) für kleinere
Moleküle; (b) für große Moleküle
377 9
Chromatographische
Trenntechniken
An die Feststoffpartikel, das Trägermaterial oder sta-
tionäre Phase genannt, sind folgende Anforderun-
gen zu stellen:
55 Das Grundgerüst der Matrix sollte möglichst
wenig unspezifische Interaktionen mit dem
zurückzuhaltenden Molekül R eingehen. Dieses
und damit die Spezifität des Adsorbens soll
durch eingebaute Gruppen gegeben sein.
55 Gute mechanische und chemische Eigen-
schaften, in der Biochromatographie sind auch
die Eignung für Reinigungsprozeduren (CIP/
SIP, clean/sanitize in place) wichtig.
55 Kleine Partikelgröße (mit enger Größen-
verteilung), was einen kleinen A-Term
in der van-Deemter-Gleichung zur Folge
hat. Diese kleine Partikelgröße und große,
definierte Porosität erlauben einen schnellen
Massentransfer.
55 Bei zu kleinen Partikeln kann allerdings
der notwendige Druck zum Problem in der
Produktion werden (Hochdruckanlagen sind
dort z. B. nur schwierig einzusetzen).
Für die einzelnen Chromatographie-Verfahren
werden darüber hinaus noch spezifische Anforde-
rungen an das Trägermaterial gestellt.
Normalphasenchromatographie (ADC)
Adsorbentien können aus organischen Materia-
lien bestehen, wie z. B. Aktivkohle, Polymere, oder
es sind anorganische Substanzen, wie z. B. Kieselgel
(Silicagel), Aluminium- oder Magnesiumoxid. Ihre
adsorptive Wirkung beruht auf aktiven Stellen. Diese
 378 H. Chmiel
sind z. B. im Falle des Kieselgels die Silanolgruppen
(SiOH), beim Aluminiumoxid die Al3+-Zentren,
aber auch die verbindenden O2−-Ionen. Sie gehen
mit in der Nähe befindlichen Molekülen schwache
Wechselwirkungen ein. Das „Knüpfen“ der schwa-
chen Bindung nennt man Adsorption, das Lösen der-
selben Desorption.
Daraus lassen sich folgende Schlüsse ziehen:
55 Das Lösungsmittel (die mobile Phase) besetzt
alle aktiven Stellen mehr oder weniger stark.
Das Molekül, welches zurückgehalten werden
soll (R-Molekül), kann nur dann adsorbiert
werden, wenn seine Wechselwirkung mit
dem Adsorbens stärker ist als diejenige des
Lösungsmittels.
55 Die Stärke der Wechselwirkung hängt nicht
nur von den funktionellen Gruppen der
R-Moleküle, sondern auch von räumlichen
Gegebenheiten ab. Moleküle, die sich in
ihrer sterischen Struktur unterscheiden, d. h.
9 Isomere, lassen sich gut mit Adsorptions-Chro-
matographie trennen.
In der Regel verwendet man in der ADC als statio-
näre Phase polare Materialien mit möglichst großer
Oberfläche. Die mobile Phase ist unpolar. Eluieren,
d. h. von der Adsorbensoberfläche verdrängen, lässt
sich dann das R-Molekül durch polare Elutionsmit-
tel wie z. B. Wasser. Die ADC ist hauptsächlich für
niedermolekulare Produkte geeignet, da höhermo-
lekulare Substanzen wie z. B. Proteine häufig irre-
versibel binden.
Reversed-Phase-Chromatographie (RPC,
Umkehrphasenchromatographie)
Von RPC spricht man immer dann, wenn die statio-
näre Phase weniger polar ist als die mobile. Dabei
werden die hydrophoben Wechselwirkungen zwi-
schen dem R-Molekül und der stationären Phase
genutzt. Das Grundgerüst für die RPC ist vorwie-
gend Kieselgel, eine stark hydrophile Matrix. Die
OH-Gruppen werden durch Alkylgruppen ausge-
tauscht (Si-R). Durch diese Derivatisierung erhält
die zuvor stark polare Matrix einen stark hydropho-
ben Charakter. Proteine binden meistens sehr fest
an diese stationäre Phase und können nur durch
hohe Konzentrationen an organischen Lösungsmit-
teln (z. B. Acetonitril oder Methanol) eluiert werden.
Diese Elutionsbedingungen führen oft zur Denatu-
rierung der Proteine. Das Einsatzgebiet für die RPC
ist deshalb auf folgende Anwendungen beschränkt:
55 analytische Qualitätskontrolle
55 Fraktionierung von synthetischen oder physio-
logischen Peptiden oder Hormonen
55 Trennung von Aminosäuren und Nucleotiden
Bei Biomolekülen, insbesondere solchen mit
höheren Molmassen, sind isokratische Trennsys-
teme (konstante Laufmittelzusammensetzung) in
der RPC unpraktikabel, da die Unterschiede in der
Hydrophobizität der Moleküle zu ausgeprägt sind.
In diesen Fällen wird die Zusammensetzung des
Laufmittels verändert (Gradientenelution), um die
Retentionszeiten für sehr hydrophobe Substanzen
herabzusetzen.
Hydrophobic-Interaction-­
Chromatographie (HIC)
Im Gegensatz zur RPC stellt die Hydrophobe Interak-
tionschromatographie (HIC) eine beliebte Methode
zur präparativen Aufreinigung von Proteinen dar. Die
Methode beruht ebenfalls auf hydrophoben Wechsel-
wirkungen. Im Gegensatz zur RPC sind diese jedoch
nicht stark genug, um eine Denaturierung der Pro-
teine zu bewirken. Die Matrix des Adsorbens besteht
bei dieser Methode aus einem hydrophilen Material,
in das lediglich schwach hydrophob interagierende
Liganden eingebaut werden. Die hydrophoben Wech-
selwirkungen werden durch eine hohe Salzkonzent-
ration in der mobilen Phase erzwungen, die Elution
erfolgt in der HIC daher in einem Gradienten abneh-
mender Salzkonzentration. Aus diesem Grund ist die
HIC auch eine gern eingesetzte (orthogonale) Trenn-
operation nach einer Salzpräzipitation oder einer auf
elektrostatischen Wechselwirkungen beruhenden
Ionenaustauschchromatographie (Elution im Gra-
dienten steigender Salzkonzentration). Neben der
Salzkonzentration sind aber auch die Salzart (Stel-
lung in der Hofmeister-Serie), der pH-Wert der
mobilen Phase sowie die Kettenlänge und die Dichte
der Liganden der stationären Phase von Einfluss auf
die Selektivität.
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
Ionenaustauschchromatographie (IEC)
Bei den bisher behandelten (Adsorptions-) chro-
matographischen Verfahren wechselwirken die ver-
schiedenen „aktiven Stellen“ mit den in der Nähe
befindlichen Molekülen. Dabei konkurrieren R-Mo-
leküle und Lösungsmittelmoleküle untereinander
um die Adsorption.
Bei der IEC trägt dagegen die stationäre Phase
elektrische Ladungen an der Oberfläche. In das
Harz oder Gel sind ionische Gruppen eingebaut. Die
Ladungen sind durch bewegliche Gegenionen neu-
tralisiert. Ionen dieser mobilen Phase und ionische
R-Moleküle konkurrieren miteinander um einen
Platz auf der stationären Phase.
Man unterscheidet zwischen Kationen (sauren)
und Anionen (basischen) Austauschern. Beide
kommen in schwacher und starker Form vor. Schwa-
che Ionenaustauscher haben eine pH-abhängige
Ladungsdichte, starke Ionenaustauscher sind prak-
tisch pH-unabhängig.
. Abb. 9.78 zeigt einen Kationenaustauscher, wie
er mit Kationen eine elektrostatische Bindung eingeht.
Ein Harz mit SO3–-Gruppen ist ein stark saurer Katio-
nenaustauscher, ein COO−-Harz dagegen ein schwach
saurer. Ein Anionenaustauscher trägt beispielsweise
NR3+- (stark basisch) oder NH3+-Gruppen (schwach
basisch). Er geht mit den negativ geladenen Anionen
elektrostatische Wechselwirkungen ein.
Die Ionenaustauschreaktion, bei der das positiv
geladene Gegenion A+ gegen das ebenfalls positiv
. Abb. 9.78  Funktion eines Kationenaustauschers
379 9
geladene Proteinmolekül P+ ausgetauscht wird, läuft
nach folgendem Schema ab:
M– A+ + P+ ⇄ M– P+ + A+
Ionenaustauscher Protein in Lösung Protein
adsorbiert Ion in Lösung
Bei diesem Schema muss allerdings berücksichtigt
werden, dass Proteine wegen ihrer Größe neben einem
stöchiometrischen Austausch mit einer ihrer Ladung
entsprechenden Zahl niedermolekularer Gegenionen
(charakteristische Ladung) auch eine gewisse Zahl von
Ladungen auf der Oberfläche der stationären Phase
überdecken (sterischer Faktor), die dann nicht mehr
für den Austausch zur Verfügung stehen. Sowohl die
charakteristische Ladung als auch der sterische Faktor
sind charakteristische Größen eines Proteinmoleküls.
Brooks und Cramer [22] haben mit dem steric mass-
action model einen Formalismus zur Beschreibung der
Protein-Ionenaustauschchromatographie entwickelt,
der diese Phänomene berücksichtigt.
Der Unterschied in den Ladungseigenschaf-
ten verschiedener Proteine und anderer biologi-
scher Substanzen in gleicher physiko-chemischer
Umgebung (gleicher pH, gleiche Ionenstärke etc.)
bestimmt, welches Protein und wie stark es am
Ionenaustauscher adsorbiert wird. Die Elution
erfolgt anschließend durch kontinuierliche Erhö-
hung von A+ im Eluenten, also Erhöhung der Salz-
konzentration (unspezifische Verdrängung), kann
aber auch durch Änderung des pH-Wertes (Ände-
rung der Nettoladung des Proteins) erfolgen. Die IEC
ist die am häufigsten eingesetzte Chromatographie-
Art zur Reinigung von Proteinen und findet sich fast
in jedem Reinigungsschema wieder.
Affinitätschromatographie (AFC)
Die AFC ist die Trennmethode mit der größten Spe-
zifität. Die Wechselwirkung ist spezifischer Art, z. B.
Antigen ↔ Antikörper; Enzym ↔ Inhibitor/Cofak-
tor/Substrat oder Substratanaloges; Nucleinsäure ↔
komplementäres Oligonucleotid. Die hohe Spezifität
dieser Wechselwirkung kommt dadurch zustande,
dass die beiden beteiligten Stoffe räumlich genau
zueinander passen. Die eine Komponente (Ligand)
ist dabei an den Träger gebunden, die andere (das
R-Molekül) wird aus der Lösung reversibel adsor-
biert (. Abb. 9.79). Vom Träger (Matrix oder Grund-
material) muss entsprechend gefordert werden:
 380 H. Chmiel
. Abb. 9.79  Hochspezifische Reinigung von Proteinen
mittels Affinitätschromatographie
55 keine Wechselwirkungen mit dem R-Molekül
(Proteinmolekül), d. h. unspezifische
Adsorption muss verhindert werden,
9 55 ausreichende Zahl aktiver Gruppen, damit eine
nennenswerte Kapazität zustande kommt,
55 alle übrigen Eigenschaften chromatogra-
phischer Träger wie gute mechanische und
chemische Eigenschaften, hohe Porosität,
kleine Partikelgröße etc.
Als Trägermaterial für die AFC werden derivati-
sierte Kieselgele, Cellulose, Agarose, Dextrane und
Polyacrylamide verwendet. Gelegentlich werden
poröse Glaskugeln eingesetzt. Sie besitzen neben
der großen Porosität eine hohe Festigkeit, sind
aber im alkalischen Medium chemisch nicht stabil,
haben eine geringere Bindungskapazität als bei-
spielsweise Agarose und erzeugen unspezifische
Proteinadsorption.
Neben den allgemein gültigen Kriterien für ein
gutes Trägermaterial ist auch an den Liganden eine
Reihe von Forderungen zu stellen:
55 Dissoziationskonstante <10−3 M bzw.
Bindungskonstante >103 M−1.
55 Bifunktionalität, d. h. er muss sowohl an das
Trägermaterial als auch an den Liganden
binden.
55 Er sollte über einen Spacer-Arm (auch Koppler
genannt) an den Träger gebunden sein. Dies
erhöht die Flexibilität und Mobilität des
Liganden, der dadurch weiter in die mobile
Phase hineinreichen kann und den ungehin-
derten Zugang zum R-Molekül ermöglicht.
55 Mehr und mehr werden auch „biospezifische“
niedermolekulare Liganden chemisch (kombi-
natorische Chemie) oder biologisch (Phagen-
Display) erzeugt.
55 Ein Problem bei der Affinitätschromatographie
stellt die Elution dar. Da die starke Wechsel-
wirkung auf dem räumlichen Zusammen-
passen von Ligand und Zielmolekül beruht,
ist für die Elution fast immer eine (leichte)
Denaturierung eines oder beider Partner
erforderlich, was zu Verlusten an biologischer
Aktivität von Ligand und/oder Zielmolekül
führen kann.
55 Die Regeneration von biologischen Affinitäts-
liganden ist ebenfalls problematisch (CIP/SIP).
Es werden auch sogenannte „generelle Liganden“
verwendet, die für eine funktionelle Klasse von z. B.
Enzymmolekülen wirksam sind wie etwa die Triazin-
farbstoffe oder Protein A (für Antikörper).
Besondere Beachtung muss bei der AFC der
Elution geschenkt werden. Wegen der starken Bin-
dungskräfte sind oft drastische Desorptionsbedin-
gungen erforderlich. Dabei kann das zu gewinnende
biologische Material leicht deaktiviert werden. Nach
der Ionenaustauschchromatographie ist die AFC die
am häufigsten angewendete Chromatographie-Art.
Metall-Chelat-Chromatographie (MCC);
immobilised metal affinity chromato-
graphy (IMAC)
In der MCC (auch Ligand-exchange-
Chromatographie genannt) werden di- oder tri-
valente Metall-Ionen (Zn2+, B3+, Al3+, Ga3+, In3+
oder Ti3+), die an einen Kationenaustauscher (oft
auch chelatisierende Gruppen) gebunden wurden,
benutzt, um wiederum Liganden wie z. B. Amine,
Aminosäuren, Proteine, Nucleoside, Nucleotide
oder Phenolverbindungen zu binden. Diese bilden
mit dem Metall Komplexe. Bei einem pH von 7 und
darüber zeigen sie einen hohen Grad an Selektivität,
jedoch mit variierendem Affinitätsprofil.
Besondere Bedeutung hat in diesem Zusammen-
hang die Interaktion mit immobilisierten Nickel-
Ionen. Die Aminosäure Histidin (His) zeigt eine
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
besonders hohe Affinität zu solchen stationären
Phasen. Ein weit verbreiteter gentechnischer Ansatz
zur Erleichterung der Aufreinigung rekombinanter
(gentechnisch produzierter) Proteine besteht darin,
das Protein gleich mit einem Histidinschwanz zu
produzieren (häufig ein (His)6-Tag, also sechs Histi-
dinreste in Folge). Ein solches Protein hat eine höhere
Affinität zu einer Nickelsäule als die meisten natür-
lichen Proteine und kann daher leicht abgetrennt
und angereichert werden. Die Elution erfolgt z. B. in
einem Imidazolgradienten. Falls gewünscht, kann
der His-Tag über eine spezifische Protease (Schnitt-
stelle wird ebenfalls in das rekombinante Protein ein-
gebaut) anschließend wieder vom Produkt abgespal-
ten werden.
Verteilungschromatographie (liquid-li-
quid partition chromatography, LLPC)
Bei der LLPC ist die stationäre Phase ein dünner
Flüssigkeitsfilm auf einem porösen Träger. Dieser
Flüssigkeitsfilm besteht aus der einen Phase eines
flüssigen Zweiphasensystems. Die mobile Phase
besteht aus der zweiten Phase des gleichen Systems.
Die Trennwirkung, die beim Durchwandern einer
Probe durch eine solche Säulenpackung erzielt
wird, hängt in erster Linie von den Unterschie-
den in den Verteilungskoeffizienten der einzelnen
Komponenten in der Probe sowie von der Menge an
stationärer Phase in der Säule ab. Im Wesentlichen
gelten bei dieser chromatographischen Methode
die Gesetzmäßigkeiten der Gegenstromvertei-
lung. Sollen Biopolymere durch LLPC getrennt
werden, so lassen sich nur wässrige Zweiphasen-
Polymersysteme als Phasenpaare verwenden. Die
große Ähnlichkeit der beiden Phasen hinsichtlich
der Polarität erfordert besondere Trägermateria-
lien, deren Oberfläche durch gezielte Modifikation
inkompatibel zu einem der beiden Phasenpolyme-
ren gemacht wurde. Der Träger wird dann nur von
der zweiten Phase benetzt und hält diese Phase stets
als Abschirmung gegen erstere fest. Die besten Auf-
lösungen erhält man beim Verhältnis von stationä-
rer zu mobiler Phase um 1 bei einem Verteilungs-
koeffizienten der Zielkomponente um 3 zugunsten
der stationären Phase. Die Löslichkeit der Kom-
ponenten soll in beiden Phasen ausreichend hoch
sein (>3 mg/mL), damit keine Störeffekte durch
381 9
Aggregationen (Tailing oder multiple Banden)
auftreten. Die meist beträchtliche Viskosität der
Phasen erfordert meist kleine Flussraten, erhöhte
Temperaturen (zur Viskositätssenkung und Erhö-
hung des Massentransfers) sowie kleine Partikel-
durchmesser des Trägermaterials. Letzteres sollte
so frei wie möglich von unspezifischen Adsorp-
tionseigenschaften sein.
Gelchromatographie (size-exclusion
chromatography, SEC)
Die size-exclusion chromatography (SEC; auch
Größenausschlusschromatographie, Molekular-
siebchromatographie oder Gelfiltration genannt)
unterscheidet sich grundsätzlich von allen übrigen
chromatographischen Verfahren darin, dass die
Trennung nicht durch Wechselwirkungen zwischen
der stationären Phase und dem R-Molekül bzw. der
mobilen Phase erfolgt, sondern einfach durch Klas-
sierung nach der Molekülgröße.
Die stationäre Phase besteht aus mikroporö-
sen Partikeln (Gelen), deren Porendurchmesser
bestimmt, welche Moleküle per Diffusion in die
Poren „eindringen“ können und damit gegenüber
den „ausgeschlossenen“ Molekülen eine verlän-
gerte Verweilzeit im durchströmten Festbett haben
(. Abb. 9.80).
Eine wesentliche Bedingung für das Trennver-
fahren ist eine Gelstruktur der stationären Phase.
Daraus resultierte in der Vergangenheit eine starke
. Abb. 9.80  Schema der Gelchromatographie
 382 H. Chmiel
Kompressibilität des Festbetts und damit eine
limitierte Anwendung für technische Prozesse.
Moderne Polymerträger für die SEC zeigen diesen
Nachteil nicht mehr. Es wird heute eine Fülle von
Gelen aus verschiedenen organischen Materialien
angeboten, wie z. B. Polyacrylamid, Agarose, Dex-
trane, Vinylpolymere etc., mit denen auch Proteine
bis zu einem Molekulargewicht von ca. 500.000 und
größer getrennt werden können. Als weiterer Nach-
teil ist die geringe Selektivität zu nennen; denn die
Poren haben herstellungsbedingt eine Porenvertei-
lung, die die Trennschärfe reduziert. Die SEC wird
wegen der geringen Durchsätze [30 mL/(h cm2)]
derzeit überwiegend im Labormaßstab und vor-
zugsweise für die letzte Reinigungsstufe eingesetzt,
aber auch zum Entsalzen von Proteinlösungen, z. B.
nach Ionenaustausch. Ein Beispiel für den techni-
schen Einsatz ist die Produktion von Insulin, wo
die Gelfiltration als letzter Reinigungsschritt ein-
gesetzt wird.
9 Entscheidungshilfen zur Auswahl der geeigne-
ten chromatographischen Trennmethode findet man
bei Harris [47].
Hochdurchsatzexperimente (HTS)
zur Auslegung und O
­ ptimierung von
­Chromatographie-Verfahren*
Jürgen Friedle, Tim Schroeder
Für jedes neue Bioprodukt ist neben der Wahl eines
der oben vorgestellten Chromatographie-Verfah-
ren eine Vielzahl von Parametern festzulegen. Dazu
zählen insbesondere Art und Größe der Partikel,
Liganden, mobile Phase, Eluent etc. Daraus folgen
Betriebsparameter wie Produktkapazität, Bindungs-
kinetik, Wechselwirkungen Produkt/Oberfläche,
Auflösung, volumetrischer Durchsatz und nicht
zuletzt Produkt-recovery und -reinheit. Es ist nahe-
liegend, dass man bei der Lösung des Problems –
wie bei Präzipitation und Extraktion – auf die Platt-
formtechnologie der Pipettierroboter stößt [12].
Hier kommt aber erschwerend hinzu, dass durch
die vorgeschalteten Reinigungsschritte das Pro-
duktvolumen eingeengt und die Verluste zu mini-
mieren sind. Es kommt daher darauf an, miniaturi-
sierte Chromatographiesäulen höchster Präzision zu
haben, die bei Parallelbetrieb minimale Abweichun-
gen garantieren. Friedle [37] und Britsch et al. [20]
haben solche Säulen mit Atoll GmbH entwickelt und
kommerzialisiert.
Wiendahl et al. [136] stellen eine solche
HTS(high throughput screening)-Station vor.
.  Abb. 9.81a zeigt die Mikrosäule im Schnitt. Sie
hat eine Betthöhe von 1,0 cm, einen Bettdurch-
messer von 0,5 cm und ein daraus resultieren-
des Bettvolumen von 0,2 mL, das zwischen zwei
Fritten durch einen eingeschobenen Hohlzylin-
der für die Zentrifugenanwendung oder einen
Stempel mit Kapillare für die Roboternadel fixiert
ist. Um eine dichte Verbindung der Pipettiernadel
mit der Säule und damit einen konstanten Druck
bzw. Volumenstrom beim Einspritzen der Probe zu
garantieren, besitzt der Stempel oben einen koni-
schen Einlass und eine O-Ring-Dichtung. Die
dichte Verbindung von Säule und Nadel ist nicht
trivial, weil Letztere unmittelbar nach dem Ein-
spritzvorgang die Nadel wieder freigeben muss,
um weitere Flüssigkeit (Probe, Waschflüssigkeit
oder Elutionspuffer) aus einem Reservoir zu holen
und auf die Säule zu dosieren. Dies gilt für die acht
der 96 Säulen, in die die acht Nadeln gleichzei-
tig eintauchen. Unterhalb der mit den 96 Säulen
bestückten Platte befindet sich auf einem fahrba-
ren Tisch eine Mikrotiterplatte, die die Proben für
die UV-Analyse sammelt (. Abb. 9.81b). Je nach
Programm können alle 96 Säulen mit unterschied-
lichem Chromatographie-Material bestückt sein,
oder identisches Säulenmaterial wird mit unter-
schiedlichen Durchflussraten und/oder Elutions-
bedingungen beaufschlagt.
In . Abb. 9.82 werden nach dem Equilibrie-
rungsschritt zwei verschiedene Programme durch-
geführt. Oben werden Beladungsversuche ein-
schließlich Bestimmung der Durchbruchskurven
und unten Elutionsversuche durchgeführt. Trotz
der hohen Zahl von möglichen Versuchen pro
Zeiteinheit könnte eine komplette Optimierung
der Chromatographie für ein neues Bioprodukt
zu zeitaufwendig sein. Deshalb schlagen Susanto
et al. [122] die Nutzung von Modellparametern
bzw. eine automatisierte Optimierung vor (Susanto
et al. [123].
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
383 9
a b

. Abb. 9.81  (a) Schematische Zeichnung einer Pipettierroboter-kompatiblen Mikrosäule und der Pipettiernadel. (b)
Aufbau für die automatische Parallel-Chromatographie mit einem Pipettierroboter: (1) Pipettenspitzen des Roboters; (2)
96er-Säulenformat von Atoll (Weingarten, Deutschland); (3) Säulenplattenhalterung; (4) Te-Link-Modul (TECAN Crailsheim,
Deutschland); (5) Mikrotiterplatte zum Auffangen der Fraktionen, seitlich verschiebbar

Präparative Chromatographie im techni- die meisten präparativen chromatographischen

schen Maßstab
Schon aus Kostengründen ist die Festbettchromato-
graphie normalerweise der letzte Reinigungsschritt
für Bioprodukte.
Für ein Scale-up sind die mittels Labor- und
Pilotversuchen ermittelten Prozessparameter so
wenig wie möglich zu ändern. Entscheidende Fak-
toren wie Chromatographie-Material, Partikel-
größe, lineare Flussrate, Betthöhe und Pufferzu-
sammensetzung sollten gleich bleiben. Konstant
gehalten werden sollten ferner bei den adsorpti-
ven Chromatographie-Techniken das Verhältnis
von Produktmasse zu Adsorbermasse und bei der
Gelfiltration die Zonenbreite (des Produktes beim
Auftrag) zur Säulenlänge. Dies bedeutet, dass ein
Scale-up bevorzugt durch eine Verbreiterung des
Säulendurchmessers erreicht wird. Diese Säulen-
verbreiterung ist gerade mit nicht druckstabilen
Materialien jedoch nicht unproblematisch, da die
mechanische Stütze durch die „Säulenwand“ mit
zunehmendem Durchmesser vernachlässigbar ist.
Durch Bettinstabilitäten kann es zu Inhomogeni-
täten kommen. Ab einer gewissen Größe werden
Säulen daher radial oder axial und so zusätzlich
stabilisiert.
Ein weiterer Unterschied ist, dass in technischem
Maßstab vorwiegend Stufengradienten zur Elution
der Substanzen eingesetzt werden, da dies technisch
viel einfacher durchführbar ist. Die Auflösung ist
jedoch geringer als bei der in analytischem Maßstab
eingesetzten linearen Gradientenelution.
Die übliche Chromatographie im technischen
Maßstab erfolgt batch-weise und setzt eine gründli-
che Vorreinigung (insbesondere die Entfernung von
Schwebstoffen) voraus. Es gibt aber Neuentwicklun-
gen, die von diesem Standardverfahren abweichen.
Sie sollen im Folgenden vorgestellt werden.
Die superkritische Fluidchromatographie
(SFC) ist ein Hybridprozess bestehend aus einer
superkritischen Fluidextraktion (SFE, . Abb. 9.83a,
linker Teil ist identisch mit . Abb. 9.70) und einer
Chromatographie. Es handelt sich dabei um einen
batch-Prozess. Die SFC bietet im Vergleich zur Flüs-
sigkeitschromatographie wegen der größeren Dif-
fusionskoeffizienten der gelösten Stoffe eine höhere
Arbeitsgeschwindigkeit und bessere Trennung. Im
 384 H. Chmiel
. Abb. 9.82  Schematische Darstellung von Chromatographie-Experimenten mit einem Pipettierroboter (nach [136])
Unterschied zu Gasen können superkritische Fluide
auch nichtflüchtige Stoffe lösen.
Das Einsatzgut ist in der Regel ein bereits durch
SFE vorgereinigtes Produkt, also der Extrakt aus dem
Extraktionsprozess gemäß . Abb. 9.70. Dies ist ein
Gemisch, in dem alle Komponenten, die in die Säule
eingespritzt werden, vom Extraktionsmittel – hier
überkritisches CO2 – gelöst werden. Im vorliegenden
Beispiel handelt es sich bei dem Einsatzgut um den
Extrakt aus der SFE, ein Fischölethylester mit einer
Ω-3-Konzentration von 60 %. Das Gemisch samt
Lösemittel wird über einen Wärmetauscher (12) auf
die für die Chromatographie optimale Temperatur
gebracht und auf die Säule (13) aufgegeben. Dort
wird es aufgrund der unterschiedlichen Geschwin-
digkeiten der Komponenten in Fraktionen zerlegt,
über eine Drossel (8) im Separator (9) vom Lösemit-
tel freigesetzt und über ein Steuerventil in die zuge-
hörigen Kompartimente des Fraktionskollektors (10)
geleitet. Die reinste Fraktion nach der Chromatogra-
phie im Kollektor hat eine Konzentration von 99 %
Ω-3-Fettsäureester, sodass eine Produktpalette ver-
schiedener Konzentrationen (z. B. 90 %) konfektio-
niert werden kann. . Abb. 9.83b zeigt eine Anlage,
die jährlich 200 Tonnen Ω-3-Fettsäureester mit einer
Reinheit von über 90 % erzeugen kann.
Bei der Fließbettadsorption (expanded bed
adsorption) ist die Strömungsrichtung der Schwer-
kraft der Adsorberpartikel entgegengerichtet und die
Geschwindigkeit so gewählt, dass diese schweben.
Dies ermöglicht die Applikation für Rohlösungen,
also z. B. die Produktisolation aus der Zellsuspension
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
385 9
a b

. Abb. 9.83  (a) Schematische Darstellung der superkritischen Fluidchromatographie (Zahlen siehe Abb. 9.70 und Text).
(b) Foto einer technischen SFC-Anlage (mit freundlicher Genehmigung der KD-Pharma, Bexbach)

oder dem Zellhomogenat. Wichtig dabei ist, dass nur
das Bioprodukt (Zielprotein), nicht aber die Zellen
oder Zell-Debris vom Adsorbermaterial zurück-
gehalten werden; d. h. die Interaktionen zwischen
Adsorberpartikeln und Zellen bzw. Zell-Debris
sollten so gering wie möglich sein. Lin et al. [80]
weisen darauf hin, dass wegen der Dominanz elekt-
rostatischer Interaktionen und der Tatsache, dass die
überwiegende Zahl der Biomoleküle, intakter Zellen
und Zell-Debris bei einem neutralen pH eine nega-
tive Ladung tragen, sowohl das Zielprotein als auch
Zellen bzw. Zell-Debris mit einem negativ geladenen
Adsorbermaterial stark interagieren. Anhand von
detaillierten Zetapotenzialmessungen konnten sie
zeigen, dass für den Rückhalt von Biomasse in einem
negativ geladenen Fließbettadsorber drei Parameter
von Bedeutung sind: Zetapotenzialadsorber, Zetapo-
tenzialbiomasse und Partikeldurchmesser der Bio-
masse (siehe auch 7 Abschn. 9.1.2). Hier gibt es einen
Grenzwert, unterhalb dessen die Fließbettadsorption
für die Produktisolation Biomasse enthaltender Roh-
lösung angewendet werden kann. Zur technischen
Auslegung (Zusammenhang zwischen Betthöhe und
Fließgeschwindigkeit und der daraus resultierenden
Limitierung) wird auf 7 Abschn. 6.6 (fluidized bed
reactor) verwiesen.
Aus den Bemühungen, die Chromatographie
kontinuierlich zu betreiben, resultiert die simulated
moving bed chromatography (SMB). Zugrunde liegt
das Konzept, die stationäre Phase einer Chromato-
graphiesäule im Gegenstrom zur Flüssigphase zu
führen. Dies soll zunächst in einem Gedankenexpe-
riment erklärt werden.
Getrennt werden soll ein Zwei-Komponen-
ten-Gemisch AB (z. B. Stereoisomere), bei dem die
Komponente A eine höhere Affinität zur stationä-
ren Phase hat als die Komponente B. In einem Fest-
bett würde also die Komponente B schneller wandern
als die Komponente A und demgemäß früher am
Ausgang der Säule erscheinen. Unterteilt man die
Säule gemäß . Abb. 9.84a in vier Zonen, führt das
Gemisch (Feed) zwischen Zone 2 und 3 zu, lässt den
Eluenten von links nach rechts und die stationäre
Phase (das Chromatographie-Material) von rechts
nach links wandern, so stellen sich in der Säule die
in . Abb. 9.84a eingezeichneten Konzentrationspro-
file der Komponenten A (rot) und B (grau) ein. Ein
Austrag der reinen Komponenten A (Extrakt, rot)
 386 H. Chmiel

. Abb. 9.84  Prinzip der SMB-Chromatographie. (a) Trennwirkung einer sich bewegenden stationären Phase; (b) realer
Vorgang durch Ventilschaltung in Richtung der mobilen Phase (mit freundlicher Genehmigung der Bayer Technology Services
GmbH)

zwischen Zone 1 und 2 und B (Raffinat, grau) zwi-
schen Zone 3 und 4 wäre dadurch gewährleistet.
Da die Bewegung der stationären Phase aber
aus technischen Gründen nicht praktikabel ist, wird
dieser Vorgang simuliert. Eine große Zahl von Chro-
matographiesäulen (4–24) sind in einer Kreisschal-
tung gemäß . Abb. 9.84b angeordnet.
Das Feed wird zunächst zwischen Zone 2 und
3 eingegeben und wandert gemeinsam mit der
mobilen Phase in Zone 3. Die schwächer adsorbie-
rende Komponente B (grau) verlässt am Ende der
Zone 3 als Raffinat den Kreislauf, die stärker adsor-
bierende Komponente A (rot) reichert sich in Rich-
tung des Extraktabzugs an. Durch die periodischen
Schaltvorgänge in Richtung des Gesamtträgerstroms
wird der Austritt von Raffinat im nächsten Schaltzy-
klus um eine Position im Uhrzeigersinn weiterwan-
dern. Zum Zeitpunkt der Zugabe des Eluenten ist
kein Raffinat mehr vorhanden und das bisher noch
adsorbierte Extrakt (rot) wird zunehmend eluiert.
Das Schalten der Ventile in Richtung der Flüssig-
keitsbewegung hat also die gleiche Wirkung, wie die
gegenläufige Bewegung der stationären Phase im
obigen Gedankenexperiment.
Imamoglu [61] gibt einen guten Überblick über
die Anwendung dieses Verfahrens, das bereits seit 30
Jahren in sehr großem Maßstab in der petrochemi-
schen Industrie angewandt wird, erläutert den theo-
retischen Hintergrund und gibt Beispiele für die bio-
technologische Anwendung.
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
Großindustrielle biotechnologische SMB-An-
lagen finden sich heute vorwiegend bei der Gewin-
nung von (Hydroxy-)Carbonsäuren (z. B. Bernstein-
säure) sowie im Bereich der Stärkeverarbeitung. Die
Trennung von Glucose und Fructose aus Isoglucose
mittels SMB ist heute Stand der Technik und kann
für kleine und mittlere Anlagen auch im Einsäulen-
Modus betrieben werden (. Abb. 9.85).
Im Einsäulen-Modus sind alle 4 Zonen in einer
Trennsäule vereint und können durch interne Ver-
teiler direkt angesprochen werden. Dadurch verrin-
gert sich die mechanische Belastung der stationären
Phase [45].
Für Großanlagen (Trennsäulendurchmesser von
4 m und mehr) eignet sich die Einsäulen-Schaltung
nicht mehr, da eine homogene Flüssigkeitsaufgabe
bzw. -entnahme durch interne Verteiler sehr schwer
zu realisieren ist. In diesem Fall wird, wie bei pet-
rochemischen Anlagen, jede Zone als Einzelsäule
realisiert.
SMB Verfahren werden aufgrund der geringen
Flexibilität der Anlagen vorwiegend im Bereich der
Massenchemikalien eingesetzt, finden jedoch auch
Anwendung in der Herstellung von hochwertigen
biotechnologischen Produkten.
Wekenborg et al. [132] wenden die SMB als
Ionenaustauschchromatographie für die Trennung
der beiden β-Lactoglobuline A und B an. Statt mit
konstanter Zusammensetzung der fluiden Träger-
phase (d. h. isokratisch) schlagen sie die Solvent-Gra-
dienten-SMB-Technologie vor, d. h. das Lösungs-
mittel wird mit unterschiedlicher Elutionsstärke
(nicht-isokratisch) zugeführt.
Die SMB-Chromatographie hat gegenüber der
batch-Chromatographie die folgenden Vorteile:
geringerer Eluentenverbrauch, maximale Produk-
tivität der Chromatographie und Vereinfachung des
Equipments. Dem steht der Nachteil der strikten
Prozesskontrolle bei verminderter Prozessflexibili-
tät gegenüber.
Wirklich kontinuierlich trennt die präparative
annulare Chromatographie (P-CAC). In . Abb. 9.86
sind der Aufbau und das Trennprinzip schematisch
dargestellt [56, 106].
Das Chromatographie-Material ist nicht – wie
sonst üblich – in eine Zylinderform, sondern in einen
konzentrischen Ringspalt gepackt. Selbst bei relativ
großen Säulenvolumina ist so die Bettstabilität durch
387 9
den Wandeffekt gesichert. Das Säulenbett im Ring-
spalt wird ständig von mobiler Phase durchströmt.
Gleichzeitig rotiert es langsam (<1 h−1) an verschie-
denen fest stehenden Einlässen vorbei, über die die
Säule mit Feed und weiteren Elementen (Stufengra-
dienten, Verdränger, Regenerierungs- und Reini-
gungslösungen) beaufschlagt werden. Die Trennung
der Substanzmischung erfolgt wie bei der konven-
tionellen Chromatographie entlang der Flussrich-
tung der mobilen Phase und damit orthogonal zur
Bewegungsrichtung der festen Phase (Kreuzstrom-
chromatographie). Je nach Retentionszeit benötigen
die Substanzen unterschiedlich lang, um das untere
Ende des Säulenbetts zu erreichen. Die zeitliche Auf-
lösung der Satzchromatographie wird in der konti-
nuierlichen annularen Chromatographie somit zu
einer räumlichen Auflösung entlang des Ringspaltes.
Am unteren Ende ist der rotierende Ringspalt – über
eine Gleitringdichtung – mit einer Vielzahl statio-
närer Auslässe verbunden, die die austretende Flüs-
sigkeit in einen Fraktionssammler leiten. Sobald der
stationäre Zustand erreicht ist – in der Regel nach
einer Umdrehung – kann das Produkt kontinuier-
lich an einem fixen Auslass gewonnen werden. Mit
Ausnahme der Elutionschromatographie im linearen
Gradienten wurden fast alle Modi der präparativen
Chromatographie auf die annulare Chromatogra-
phie übertragen, so die Gelfiltration, die Affinitäts-
chromatographie, die Elutionschromatographie im
Stufengradienten und die Verdrängungschromato-
graphie (siehe unten). In jedem Fall war die direkte
Übertragung einer auf einer kleinen Milliliter-Säule
entwickelten Trennung auf eine um Größenord-
nungen größere annulare Säule (Liter-Volumen)
möglich. Bei der Übertragung hat sich das Loading-
Faktor(LF)-Konzept bewährt, wobei gilt:
Satzsäule:
Q T cm3 min−1 ⋅ t1[ min ]
LF [−] =  Gl. 9.29
H [ cm ] ⋅ S cm 2 
und annulare Säule:
Q T cm3 min−1 ⋅ 360[°]
LF [−] =   Gl. 9.30
H [ cm ] ⋅ S cm 2  * ω °min−1
Q T = Volumenstrom des zu trennenden Flüssig-
keitsgemisches.
 9
388

a
H. Chmiel

. Abb. 9.85  (a) Fließschema Einsäulen-SMB für die Trennung von Fructose und Glucose aus Isoglucose (die Feed-/Eluenten-Entgasung ist im hier vereinfachten Schema nicht
gezeigt), (b) Einsäulen-SMB-Pilotanlage (mit freundlicher Genehmigung von Vogelbusch Biocommodities GmbH, Wien)
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
b Schleifringdichtung und fehlende Sterilisierbar-
. Abb. 9.85  (Fortsetzung)
Schmidt et al. [106] haben eine erste Pilot-
anlage (144 L/Tag) für die Aufkonzentrierung
von kontinuierlich produziertem rekombinanten
Faktor VIII getestet. Als Chromatographie-Mate-
rial diente Fractogel, das hinsichtlich Packtechnik
und Quellung vergleichsweise gute Eigenschaften
hat. Als Eluent wurde eine konzentrierte Salzlö-
sung verwendet. Neben technischen Problemen,
wie – im Vergleich zur üblichen Säule – ungleich-
mäßiger Packungsdichte, Undichtigkeit an der
. Abb. 9.86  Auftrennung eines Stoffgemisches im
annularen Ringspalt
389 9
keit, stellten sie fest, dass die interessierende Kom-
ponente über sechs Ausläufe verteilt austrat, wobei
gewisse Schwankungen im Austrittsbereich zu
beobachten waren (peak wobbling). Diese Technik
ist also noch verbesserungsfähig, aber durchaus
vielversprechend.
Im Gegensatz zu den bislang aufgeführten
Methoden stellt die Verdrängungschromatographie
ein rein präparatives und in hohem Maße nicht-li-
neares Verfahren dar (. Abb. 9.87). Bei diesem Ver-
fahren wird die Säule zunächst unter guten Bin-
dungsbedingungen bis fast zum Erreichen der
Kapazität mit der zu trennenden Substanzmischung
beladen. Anschließend wird die Säule mit der Ver-
drängerlösung beaufschlagt.
Ein geeigneter Verdränger ist dabei eine Subs-
tanz, die besser als die Feedkomponenten an die
stationäre Phase bindet. Dieser Verdränger redu-
ziert daher die für die Adsorption zur Verfügung
stehenden Bindungsplätze; das Resultat ist eine
Konkurrenz der Feedkomponenten um die ver-
bleibenden Plätze, wobei die stärker bindenden
Komponenten die schwächer bindenden zuneh-
mend verdrängen. Das Resultat ist eine Auftren-
nung der Komponenten in aufeinanderfolgende
Zonen der reinen Substanzen, den sogenannten
displacement train.
Die Konzentration in den einzelnen Substanz-
zonen wird dabei von der Verdrängerkonzentration
und der Verdrängerisothermen bestimmt. Für die
Geschwindigkeit einer durch eine chromatographi-
sche Säule wandernden Front – hier die des Verdrän-
gers V – gilt:
uo
uV =
1 + φ ⋅ (∂qV / ∂cV )  Gl. 9.31
mit uo = Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase;
ϕ = Phasenverhältnis; q = adsorbierte Menge; c =
Konzentration in Lösung.
Da die Geschwindigkeit der Verdrängerfront die
Geschwindigkeit des displacement train bestimmt,
gilt uD = uS1 = uS2 = …
Damit lässt sich die Konzentration der Einzel-
substanzen aus dem Schnittpunkt der Einzelsubs-
tanzisothermen mit einer durch den Nullpunkt und
den durch die Verdrängerkonzentration bestimmten
 390 H. Chmiel
. Abb. 9.87  Schematische
Darstellung einer
Verdrängungschromatographie
Schnittpunkt mit der Verdrängerisothermen gegebe-
nen Operationslinie bestimmen (. Abb. 9.88a). Subs-
tanzen, deren Isothermen von der Operationslinie
nicht geschnitten werden, eluieren vor dem displa-
9 cement train (. Abb. 9.88b)
In Abschn. 9.3.4 wurde auf die negativen Folgen
der Proteinadsorption bei der Membranfiltration
eingegangen. Es ist daher nicht naheliegend, diesen
Effekt für die Proteinreinigung zu nutzen. Der Mem-
branadsorber hat aber genau dieses Ziel. Allerdings
ist bereits im Zusammenhang mit den Anforde-
rungen an das Chromatographie-Material auf den
Unterschied zwischen unspezifischer und spezifi-
scher Adsorption hingewiesen worden.
Der Membranadsorber (MA) stellt eine Kombi-
nation von Chromatographie bzw. besser Adsorp-
tion und Membranfiltration dar. Zu diesem
Zweck sollen spezifische Wechselwirkungen an
der Porenoberfläche der Membran induziert und
. Abb. 9.88  (a) Adsorptionsisothermen für vier verschiedene Substanzen (A–D) eines Gemisches und derjenigen des
Verdrängers; (b) displacement train
unspezifische vermieden werden. Daher sind an
die Porenoberflächen die gleichen Forderungen,
wie an die Oberfläche des Chromatographie-Ma-
terials zu stellen. Es handelt sich überwiegend um
Flachmembranen aus regenerierter Cellulose, Poly-
ethersulfon (PES) und PVDF. An die Porenoberflä-
che können prinzipiell alle Arten von Austauscher-
gruppen fixiert werden. Fraud et al. [35] schlagen
beispielsweise den Membranadsorber zur Trennung
von Proteingemischen mittels hydrophober Interak-
tionschromatographie (HIC) vor. Eine hydrophile,
regenerierte Cellulosemembran wird in ihren Poren
durch kovalente Bindung hydrophober Phenylgrup-
pen hydrophobisiert. Sie kann auf diese Weise zur
Trennung von Proteinen unterschiedlicher Hydro-
phobizität nach dem Prinzip der Chromatogra-
phie (beladen und anschließend eluieren) genutzt
werden. Reis und Zydney [98] schätzen allerdings
die vorhandene Kapazität hierfür als zu gering ein.
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
. Abb. 9.89  Membranadsorber schematisch. (a) Ausschnitt einer IEC-Adsorbermembran, (b) gestapelte Membranschichten,
(c) gewickeltes Modul, (d) gefaltetes Modul (mit freundlicher Genehmigung der Pall GmbH)
Giovannoni et al. [39] sehen die Anwendung des
HIC-Membranadsorbers eher in der Reinigung,
z. B. zur Entfernung von Viren, HCP (Wirtszell-
proteinen, host cell proteins), rekombinanter DNA,
Endotoxinen und anderen Verunreinigungen bei
der Gewinnung von monoklonalen Antikörpern
(mAb). Zhou et al. [142] schlagen für den gleichen
Anwendungsfall vor, den IEC-Membranadsorber
einzusetzen.
In der biopharmazeutischen Arzneimittelherstel-
lung werden solche IEC-Membranadsorber, die als
Anionentauscher mit positiv geladenen quartären
Ammoniumgruppen modifiziert wurden, vermehrt
zur finalen Abtrennung von Spurenverunreinigun-
gen (DNA, HCP, Endotoxine, Viren) eingesetzt.
In der Regel kommen dabei Einwegkapsulen zur
Anwendung, die im Flow-Through-Modus betrie-
ben werden (. Abb. 9.89).
Die negativ geladenen Verunreinigungen
lagern sich an der positiven Porenoberfläche an
(.  Abb. 9.89a) während die Wertstoffe, beispiels-
weise die bei neutralem pH positiv geladenen
391 9
monoklonalen Antikörper, den Membranadsor-
ber ohne nennenswerte Wechselwirkungen durch-
strömen. Zur Vergrößerung der Kapazität, die einen
Durchbruch dieser Verunreinigungen vermeiden soll,
werden üblicherweise mehrere Membranlagen über-
einander gestapelt (. Abb. 9.89b und . Abb. 9.89c)
bzw. ähnlich der von Sterilfiltern (vgl. 7 Abschn. 8.6)
bekannten Vorgehensweise gefaltet (. Abb. 9.89d).
Die Poren der Membranadsorber sind generell
größer als die Poren konventioneller Chromatogra-
phie-Adsorbentien. Auf diese Weise lassen sich selbst
bei hohen Flussraten deutlich höhere Bindungskapa-
zitäten für Makromoleküle mit hohem Molekular-
gewicht, das die abzutrennenden Verunreinigungen
auszeichnet, gewährleisten.
Wichtige Parameter für die Leistungsfähigkeit
des Membranadsorbers sind unter anderem die
Porenverteilung, Porenoberfläche, Dichte der elekt-
rischen Ladungen, pH, Ionenstärke, Zahl der Mem-
branschichten und Art des Moduls.
Wie aus . Abb. 9.90 ersichtlich, ist der Membra-
nadsorber bereits im technischen Maßstab verfügbar.
 392 H. Chmiel
. Abb. 9.90  Membranadsorber im technischen Maßstab
(mit freundlicher Genehmigung der Fa. Pall GmbH)
9 nung sind im Folgenden dargestellt.
Als ergänzende Literatur zur Chromatographie
wird das Kapitel Hochleistungsflüssigkeitschroma-
tographie in Harris [47] empfohlen.
9.4 Trocknungsverfahren in der
Bioprozesstechnik*
A. Baier und C. Rauh
In vielen Fällen werden Stoffe aus biotechnologischer
Produktion einem Trocknungsprozess unterzogen,
um eine längerfristige Stabilität der Produktqualität
. Abb. 9.91  Einfluss des aW-Wertes
auf die Reaktionsgeschwindigkeit
in biotechnologischen Produkten
(angelehnt an [15])
zu erreichen. Auch getrocknete, biologisch aktive
Mikroorganismen finden als Starterkulturen, Pro-
biotika oder Pflanzenschutzmittel in der Industrie
breiten Absatz [38]. Ziel der Trocknung ist es, die
Wasseraktivität soweit herabzusetzen, dass mikro-
bielles Wachstum sowie enzymatische und chemi-
sche Reaktionen nicht oder nur noch mit sehr gerin-
ger Geschwindigkeit stattfinden (. Abb. 9.91). Für
die meisten Produkte bedeutet dies eine Reduzie-
rung des Aktivitätswertes aW unter 0.5 [15]. Vor-
teile gegenüber der Konservierung im gefrorenen
Zustand liegen in dem reduzierten Produktgewicht
und -volumen sowie der Möglichkeit bei Umge-
bungstemperatur zu lagern und zu transportieren,
was die Kosten für diese Schritte erheblich senkt und
den Vertrieb über größere Distanzen möglich macht.
Die Grundlagen der Trocknungstechnologie, die für
die Bioprozesstechnik relevanten Trocknerbauarten
sowie die wichtigsten Einflussgrößen zum Erhalt der
biologischen Aktivität während und nach der Trock-
9.4.1 Grundlagen der
Trocknungstechnologie
Trocknen beinhaltet das Entfernen von Feuchtigkeit
in Form von Dampf aus einem festen, flüssigen oder
gasförmigen Trägermaterial. In der bio- und lebens-
mitteltechnologischen Prozessierung soll in den
meisten Fällen Wasser von einem Feststoff getrennt
werden. Um die Desorption des Wassers von einem
festen Trägermaterial zu ermöglichen, muss der
Partialdruck des Wassers an der Materialoberfläche
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
höher sein als der Partialdruck in der Umgebung.
Um die Differenz zu vergrößern und die Desorption
zu beschleunigen, muss entweder die Temperatur des
Produktes erhöht oder der Partialdruck des Wassers
in der Umgebung des Produktes erniedrigt werden
[86]. Ersteres erreicht man durch die Zufuhr thermi-
scher Energie in Form von direktem Kontakt (Kon-
duktion), Konvektion oder Strahlung (z. B. Infrarot,
Mikrowelle), letzteres durch den Anlagenbetrieb
unter Vakuum und das kontinuierliche Entfernen des
gebildeten Dampfes aus der Produktumgebung. Zur
Erhöhung der Temperatur lässt sich unter anderem
auch elektrische Energie (Ohmsche Erhitzung durch
direkten Stromfluss durch das Produkt) nutzen, was
im Folgenden jedoch außer Betracht bleibt. In allen
Fällen muss ausreichend Energie zur Verfügung
gestellt werden, um den endothermen Übergang auf-
grund der Phasenänderungssenthalpie in die gasför-
mige Phase zu ermöglichen.
Trocknungsprozesse werden somit durch den
gleichzeitigen Ablauf von Wärme- und Stofftransport
. Abb. 9.92  Trocknungsabschnitte
bei der Trocknung biotechnologischer
Produkte
393 9
bestimmt, wobei sich deren treibende Kräfte im
Verlauf der Trocknung ändern. In den meisten
Fällen lassen sich zwei charakteristische Trock-
nungsabschnitte erkennen (. Abb. 9.92). In Mate-
rialien mit hoher Ausgangsfeuchte ist der Massen-
transport an die Partikeloberfläche ausreichend, um
ein konstantes Verdampfen, Verdunsten oder Subli-
mieren von Feuchte an der Oberfläche zu gewähr-
leisten. Die Trocknungsgeschwindigkeit wird in
diesem Abschnitt nur durch den Wärme- und Stoff-
transport an der Materialoberfläche bestimmt. Fällt
der Feuchtegehalt unter einen kritischen Wert, kann
nicht mehr ausreichend Feuchte durch die Kapilla-
ren an die Produktoberfläche transportiert werden.
In diesem Trocknungsabschnitt wird die Geschwin-
digkeit zusätzlich vom Wärme- und Stofftransport
innerhalb des Produktes bestimmt. Mit sinkender
Produktfeuchte sinkt auch die Trocknungsgeschwin-
digkeit, da die Triebkraft für die Diffusion, der Feuch-
tegradient und der Diffusionskoeffizient geringer
werden. Der kritische Feuchtegehalt, der die beiden
 394 H. Chmiel
Trocknungsabschnitte teilt, ist abhängig von der
Trocknungsgeschwindigkeit und von der Schichtdi-
cke des Trocknungsgutes. Die meisten biologischen
Materialien sind hygroskopisch und ihre Trocknung
endet sobald sich ein temperaturabhängiges Gleich-
gewicht zwischen Produktfeuchte und der Feuchte in
der Umgebung einstellt. Die Bindung dieser Feuchte
erfolgt über verschiedene Kräfte, unter ihnen Kapil-
larkräfte und chemische Bindungen [86].
9.4.2 Wichtige Trocknungsverfahren
in der Bioprozesstechnik
Bei der Auswahl eines geeigneten Trocknungsver-
fahrens und der entsprechenden Prozessparame-
ter spielt, neben pragmatischen und ökonomischen
Gesichtspunkten, die Produktsensitivität gegenüber
hohen Temperaturen, Oxidation und osmotischem
Stress eine entscheidende Rolle. Insbesondere bei
9 der Trocknung biologisch aktiver Materialien ist die
Minimierung dieser Einflüsse von großer Bedeutung.
Eine hohe Prozesstemperatur bewirkt eine Denatu-
rierung von Proteinen, Ribosomen und Nukleinsäu-
ren Nuceinsäuren und eine Zerstörung der Zellmem-
branlipide. Die thermische Belastung des Produktes
ist abhängig von der Temperatur, welche die Reak-
tionsgeschwindigkeit bestimmt, und der Zeit, die das
Produkt dieser Temperatur ausgesetzt ist. Der ver-
mehrte Kontakt mit Luftsauerstoff während einer
Konvektionstrocknung führt zu verstärkten Oxida-
tionsreaktionen. Die Entfernung von Wassermole-
külen kann zur Erhöhung der Phasenübergangstem-
peratur der Zytoplasmamembran führen und so ihre
Stabilität beeinträchtigen. Mikroorgansimen sind
in der Lage, ihren Stoffwechsel an Änderungen der
Temperatur oder des osmotischen Drucks anzupas-
sen. Rapide Änderungen von Temperatur und Was-
sergehalt wirken sich somit oft negativ auf die Zell-
vitalität aus, sehr lange Trocknungszeiten hingegen
senken die Prozesseffizienz [38].
Gefriertrocknung
Die Gefriertrocknung stellt eine schonende Mög-
lichkeit der Materialtrocknung dar, bei der die Guts-
feuchte durch Sublimation direkt vom festen in den
gasförmigen Zustand überführt wird. Durch die aus-
bleibenden Konzentrationseffekte und die niedrigen
Prozesstemperaturen wird eine Produktschädigung
durch thermische oder osmotische Effekte vermie-
den [131]. Folglich ist diese Trocknungstechnik
die bevorzugte Methode zur langfristigen Stabili-
sierung mikrobieller Kulturen weltweit [90], wird
aber auch zur Konservierung von Enzymen, Impf-
stoffen und anderen Arzneimitteln, bei denen der
Erhalt einer hohen biologischen Aktivität erforder-
lich ist, eingesetzt. Die Gefriertrocknung pharma-
zeutischer Produkte erfolgt in der Regel diskonti-
nuierlich in Phiolen, Ampullen oder Fläschchen auf
temperierbaren Platten. Der schematische Aufbau
einer entsprechenden Gefriertrocknungsanlage ist
in . Abb. 9.93 dargestellt. Industrielle Anlagen mit
einer Trocknungsfläche von 20 m² ermöglichen die
Trocknung von etwa 400 kg feuchtem Material. Die
derzeit größten Anlagen, die für die Pharmaindust-
rie genutzt werden, besitzen eine Trocknungsfläche
von etwa 100 m² [126]. Dem zu trocknenden Gut
wird zunächst Wärme entzogen, sodass die enthal-
tene Feuchte kristallisiert. Die ursprünglich gelös-
ten Produktbestandteile sowie das daran gebundene
Wasser erstarren im Glaszustand. Die Temperaturab-
senkung kann entweder außerhalb der Trocknungs-
anlage erfolgen oder indem die Trocknungsflächen
von einem passenden Kühlmittel mit Temperaturen
bis zu –75 °C durchströmt werden [126]. Die Inakti-
vierung von Mikroorganismen während der Gefrier-
trocknung lässt sich zu großen Teilen auf den Kälte-
schock und die Zellwandpermeabilisierung während
des Gefriervorganges zurückführen [18]. Langsame
Gefriergeschwindigkeiten sind für den Erhalt der
Zellvitalität von Vorteil [90]. Nach dem Gefrierpro-
zess muss der Druck in der Trocknungskammer unter
den Tripelpunktdruck von Wasser abgesenkt werden.
Üblich sind Prozessdrücke von etwa 0,5 mbar. Die für
den Phasenübergang erforderliche Energie wird dem
Trocknungsgut entzogen. Damit es nicht zu einem
Absinken der Gutstemperatur und somit der Trock-
nungsgeschwindigkeit kommt, muss kontinuierlich
Wärme über die Trocknungsflächen oder eine Strah-
lungsquelle zugeführt werden. Üblicherweise wird
der Prozessdruck im letzten Viertel der Trocknung
weiter gesenkt oder die Temperatur erhöht, um das
restliche, schwer entfernbare Wasser (siehe weiter
oben: Hygroskopie) zu entfernen und eine finale
Gutsfeuchte von 2–3 % zu erreichen [126]. Die Trock-
nungszeiten unter diesen Bedingungen liegen übli-
cherweise bei 24–48 h. Die langen Trocknungszeiten
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
395 9

. Abb. 9.93  Schematischer Aufbau einer Gefriertrocknungsanlage

sowie die niedrigen Prozessdrücke und -temperatu-

ren führen zu relativ hohen Betriebskosten [4].
Des Weiteren besteht die Möglichkeit, eine Vaku-
umtrocknung ohne vorherige Kristallisation des
Wassers durchzuführen. Durch Herabsetzen des
Druckes auf bis zu 10 mbar kann der Siedepunkt des
Wassers auf bis zu 8 °C reduziert und eine thermische
Belastung vermieden werden. Auch oxidative Ver-
änderungen können durch das Vakuum minimiert
werden, weswegen sich diese Trocknungsvariante gut
für sauerstoffempfindliche Produkte wie Lactobacil-
len oder Vitamine eignet [101]. Die Trocknung kann
kontinuierlich auf umlaufenden Bändern oder dis-
kontinuierlich in Trommel-, Horden oder konischen
Trocknern erfolgen [126]. Die Prozesskosten sind etwa
halb so hoch wie die einer Gefriertrocknung. Nach-
teilig sind die langen Prozesszeiten von 20 bis zu über
100 h bei diskontinuierlicher Trocknungsweise [101].

Sprühtrocknung
Die Sprühtrocknung ist eine Variante der Konvek-
tionstrocknung, bei der eine Lösung, Suspension
oder Paste in einem heißen Medium, in der Regel . Abb. 9.94  Schematischer Aufbau einer
Luft, zerstäubt und getrocknet wird (. Abb. 9.94). Sprühtrocknungsanlage
 396 H. Chmiel
Die Zerstäubung kann mittels Einstoffdüse, bei der
das Produkt durch Drücke von 20–100 bar durch eine
schmale Öffnung getrieben wird, mittels Zweistoff-
düse, in der ein Gas durch seinen um das Hundert-
fache größeren Volumenstrom zu einer Zerteilung
des Produktes führt, oder in Rotationsdüsen durch
Rotationsgeschwindigkeiten von 100–150 m s–1 erfol-
gen. Der pneumatische Transport der Partikel durch
die Trockenkammer kann im Gegen-, Gleich- oder
Kreuzstrom erfolgen und die Transportgeschwin-
digkeit wird durch das Verhältnis Produkt- zu Luft-
strom bestimmt. Üblich ist hier ein Massenverhält-
nis von 4. Aerozyklone, Schlauch- oder Elektrofilter
ermöglichen die Trennung von Luftstrom und tro-
ckenem Produkt. Die hohen Lufttemperaturen von
bis zu über 200 °C und die geringen Partikelgrößen
von 30–400 µm führen zu einer hohen Prozessef-
fektivität und kurzen Trocknungszeiten von unge-
fähr 25 s [126]. Trotz der hohen Lufttemperaturen
ist die thermische Belastung währen des 1. Trock-
9 nungsabschnittes gering, da die hohe Verdamp-
fungsrate der Erwärmung des Produktes entgegen-
wirkt. Im 2. Trocknungsabschnitt kann es abhängig
von der Trocknerkonfiguration und den verwen-
deten Prozessparametern zu einer Produktschädi-
gung kommen. Die Austrittstemperatur des Gutes,
üblicherweise zwischen 70–120 °C, erwies sich als
. Abb. 9.95  Schematischer Aufbau von Wirbelschichttrocknungsanlagen
geeigneter Indikator für die thermische Belastung
während der Trocknung, wobei niedrigere Austritts-
temperaturen zu einer höheren Zellvitalität führen
[3].
Wirbelschichttrocknung
Bei einer Wirbelschichttrocknung werden partikuläre
Güter durch die Durchströmung mit Gas in Bewe-
gung gesetzt, was eine gleichzeitige Durchmischung
und Konvektionstrocknung möglich macht. Die zwei
gängigen Bauformen von Wirbelschichttrocknern
zeigt . Abb. 9.95. Die Trocknungsdauer erstreckt sich
je nach Schichtdicke von wenigen Minuten bis zu 2 h,
wobei die thermische Belastung aufgrund der niedri-
gen Lufttemperaturen gering gehalten werden kann.
Die Kosten für eine Wirbelschichttrocknung liegen
leicht unter denen der Sprühtrocknung und betra-
gen nur etwa 18 % der Betriebskosten einer Gefrier-
trocknung [101]. Die Wirbelschichttrocknung wird
zur industriellen Herstellung von Trockenhefe ein-
gesetzt. Übliche Prozessparameter sind hierbei eine
Trocknungsdauer von 20 Minuten bei einer Maxi-
maltemperatur von 40 °C [2]. Vorherige Extrusion
liefert die für die Wirbelschicht erforderlichen Zell-
pellets und reduziert die Ausgangsfeuchte zur Erhö-
hung der Trocknungseffizienz [38].
Kapitel 9 · Aufarbeitung (Downstream Processing)
Walzentrocknung
Die Walzentrocknung ist ein Kontakttrocknungs-
verfahren, bei der ein dünner Materialfilm auf die
Oberfläche einer rotierenden, dampfbeheizten
Walze aufgetragen und nach einer Trocknungszeit
von wenigen Sekunden mit einem Messer abgeschabt
wird [131]. Durch die hohen Prozesstemperaturen
von über 100 °C ist diese Trocknervariante für die
Konservierung aktiver Zellen ungeeignet, wird aber
unter anderem für die Trocknung von Hefen zum
Futtermitteleinsatz verwendet.
9.4.3 Weitere Einflussfaktoren
bei der Trocknung von
Mikroorganismen
Neben den zuvor beschriebenen Prozessgrößen
spielen viele weitere extrinsische und intrinsische
Faktoren sowie die generelle Stresstoleranz des Orga-
nismus eine Rolle für den Vitalitätserhalt bei der
Trocknung. Die Toleranz gegenüber äußeren Ein-
flussfaktoren variiert stark für verschiedene Spezies
und Stämme. Die Sensitivität gegenüber thermischer
und mechanischer Belastung ist aufgrund der dünne-
ren Zellwand in gramnegativen Bakterien am höchs-
ten, gefolgt von Hefen und grampositiven Bakterien
mit der höchsten Stresstoleranz [38]. Der Rück-
gang der Nährstoffverfügbarkeit und die Ansamm-
lung toxischer Stoffwechselprodukte in der stationä-
ren Wachstumsphase rufen eine Stressreaktion des
Organismus hervor, die auch die Toleranz gegenüber
anderen Stressfaktoren erhöht [38, 90]. Eine solche
Stressantwort und die damit verbundene Produktion
bestimmter Proteine lassen sich auch durch die Kul-
tivierung bei niedrigeren Temperaturen, niedrige-
rem pH-Wert oder durch die Einwirkung höherer
Temperaturen gezielt induzieren [90]. Die rich-
tige Zusammensetzung des Mediums während des
Wachstums kann zur Akkumulation von Stoffen in
der Zelle führen, die osmotische Unterschiede zwi-
schen Zellinnerem und -äußerem ausgleichen und
so den osmotischen Stress für den Organismus ver-
ringern können. Zu diesen kompatiblen Soluten
gehören Aminosäuren, nichtreduzierende Zucker
wie Trehalose, Glycerin und Betain [38].
Eine hohe Biomassekonzentration während
der Trocknung erhöht die Überlebensrate durch
397 9
Abschirmung der Zellen vom Medium [18]. Die opti-
male Zellkonzentration kann jedoch in Abhängigkeit
von verwendeten Schutzstoffen variieren. Schutz-
stoffe wie Trehalose und Saccharose wirken indem
sie Wassermolekülen an polaren Gruppen ersetzen
und so die Struktur von Proteinen und Membranen
während der Trocknung stabilisieren [77]. Eine sehr
gute Schutzwirkung zeigte sich auch bei der Ver-
wendung von rekonstituierter Magermilch [3]. Als
Schutzstoffe bei der Gefriertrocknung eignen sich
Kohlenhydrate, Proteine und Polymere, da sie im
Glaszustand Abfallprodukte der Zelle aufnehmen
und ihre Mobilität auf ein Minimum einschränken
können [90]. Trägermaterialien, die während der
Trocknung zu einer Verkapselung von Mikroorga-
nismen führen, werden überwiegend bei der Sprüh-
trocknung eingesetzt [38] und bieten zusätzlich einen
Schutz gegenüber Magensäure oder Gallensaft, was
einen Vorteil beim Einsatz von Probiotika darstellt.
Faktoren, die biochemische Reaktionen begüns-
tigen, wie eine höhere Produktfeuchte und eine
höhere Temperatur, verringern die Überlebensrate
der Mikroorganismen währen der Lagerung [38].
Im getrockneten Zustand können die Zellen Sauer-
stoff nicht verstoffwechseln oder aus der Zelle trans-
portieren, sodass eine Lagerung unter Stickstoff
oder Vakuum von Vorteil ist [18]. Auch eine lang-
same Rehydratation der Zellen in einem komplexen
Medium, das eine kontrollierte Änderung der osmo-
tischen Bedingungen sowie ausreichend Nährstoffe
zur Reparatur von Zellschäden bietet, führt am Ende
zu einer höheren biologischen Aktivität [90].
Mit geeigneten Prozessparametern und unter
Berücksichtigung der vielen weiteren Einflussfakto-
ren, lassen sich durch Trocknung biotechnologische
Produkte von hoher Qualität und langer Haltbarkeit
herstellen.
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9
 403 10

Enzymatische Prozesse
Kathrin Castiglione und Dirk Weuster-Botz

10.1 Quervernetzte Enzymaggregate – 409

10.1.1 Herstellung von quervernetzten Enzymaggregaten – 411
10.1.2 Herstellung von Ampicillin mit Penicillin-Amidase-CLEAs – 412

10.2 Trägerfixierte Enzyme – 414

10.2.1 Trägermaterialien und Fixierung von Enzymen – 414
10.2.2 Biokatalytische Glucoseisomerisierung zur Herstellung von High
Fructose Corn Sirup (HFCS) – 416
10.2.3 Enzymatische Umesterung – 418
10.2.4 Herstellung von 6-Aminopenicillansäure – 420

10.3 Enzymeinschluss – 421

10.3.1 Mikroverkapselung und Membranen – 421
10.3.2 Asymmetrische Synthese von (R)-2-Hydroxy-4-phenylbuttersäure im
Enzymmembranreaktor – 423
10.3.3 Herstellung von L-Methionin im Enzymmembranreaktor – 424

10.4 Ganze Zellen – 425

10.4.1 Biokatalytische Herstellung von Acrylamid – 426
10.4.2 Herstellung von optisch reinem L-Carnitin – 427
10.4.3 Biotransformation von 2,5-Di-Methylpyrazin zu 5-Methyl-2-pyrazin-
carbonsäure (MPCA) – 431
10.4.4 Chemo-enzymatische Synthese von Ursodesoxycholsäure
(UDCA) – 433

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2018

H. Chmiel, R. Takors, D. Weuster-Botz (Hrsg.), Bioprozesstechnik,
https://doi.org/10.1007/978-3-662-54042-8_10
10.5 Mehrphasensysteme – 435
10.5.1 In-situ Substratbereitstellung und Produktentfernung – 436
10.5.2 Asymmetrische Synthese von (S)-4-Chlor-3-
Hydroxybuttersäureethylester (S-CHBE) – 441
10.5.3 Asymmetrische Synthese von (S)-(3,4-Methylendioxyphenyl)-2-
Propanol – 443

Literatur – 445
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
Bei enzymatischen Produktionsprozessen geht es um
biokatalytische Stoffumwandlungen, an denen sehr
häufig nur ein einzelnes Enzym (Einschrittreaktion)
oder eine überschaubare Kaskade mehrerer Enzyme
beteiligt ist. Diese Stoffumwandlungen werden auch
als Biotransformationen bezeichnet. Im Gegensatz
dazu werden bei mikrobiellen Prozessen, die Gegen-
stand von 7 Kap. 11 sind, ganze Stoffwechselnetz-
werke von Zellen dazu genutzt, gewünschte Produkte
in der Regel ausgehend von natürlichen Kohlenstoff-
und gegebenenfalls Stickstoffquellen herzustellen.
Die Anzahl industrieller Biotransformatio-
nen nimmt stetig zu. Vor allem auf dem Gebiet der
organischen Synthese ist diese Entwicklung darauf
zurückzuführen, dass viele Enzyme in der Lage sind,
Reaktionen äußerst chemo-, regio- und stereoselek-
tiv zu katalysieren. Hierbei sind Enzyme oft nicht an
das natürliche Substratspektrum gebunden, sondern
katalysieren auch die Umsetzung nicht-natürlicher
Verbindungen mit hoher Selektivität. Eine mögliche
Konsequenz der hohen Selektivität ist eine geringere
Anzahl an Syntheseschritten im Vergleich zur kor-
respondierenden chemischen Katalyse, wodurch
ein Prozess effizienter und aufgrund verminderter
Mengen an Abfallstoffen auch umweltfreundlicher
werden kann. So erreichen Enzyme eine hohe Regio-
selektivität ohne mit den Nachteilen der aufwändi-
gen Schutzgruppenchemie konfrontiert zu sein. Die
Biokatalyse ermöglicht darüber hinaus Zugang zu
Reaktionen, die schwierig mit den Methoden der
klassischen organischen Chemie zu realisieren sind
[21]. Beispiele hierfür sind verschiedene regio- und
enantioselektive Oxidationen durch Baeyer-Villi-
ger-Monooxygenasen (EC 1.14.13.x) [33]. Enzyme
sind zudem sehr effiziente Katalysatoren. Häufig
beschleunigen sie Reaktionen deutlich stärker als die
korrespondierenden chemischen Katalysatoren bei
gleichem Stoffmengenanteil (Mol-%). Enzymatisch
katalysierte Reaktionen unterscheiden sich von der
klassischen chemischen Katalyse auch dadurch, dass
Enzyme ihre Aktivität meist unter milden Bedin-
gungen entfalten: in einem wässrigen Medium bei
Atmosphärendruck, Temperaturen zwischen 20 und
40 °C und einem neutralen pH. Hierdurch werden
unerwünschte Nebenreaktionen, wie beispielsweise
Zerfallsreaktionen oder Isomerisierungen, verhin-
dert und Einsparungen im Bereich der Energiekos-
ten erzielt. Reaktionen hingegen, die durch Zugabe
405 10
von üblichen chemischen Katalysatoren beschleunigt
werden, laufen meist bei hohem Druck in Kombi-
nation mit einer deutlich erhöhten Temperatur im
nicht pH-neutralen Bereich ab. Ferner erfordern che-
mische Katalysen oftmals den Einsatz von umwelt-
unverträglichen Stoffen wie beispielsweise Schwer-
metallkatalysatoren. Da die meisten Enzyme unter
ähnlichen Bedingungen arbeiten, was im Gegensatz
zur großen Bandbreite der Reaktionsbedingungen
von chemischen Katalysatoren steht, sind Multien-
zymreaktionen im Eintopfverfahren häufig leich-
ter zu realisieren als kombinierte chemische Kata-
lyseschritte. Werden sequentielle enzymkatalysierte
Reaktionen in einem Ansatz durchgeführt, müssen
zudem keine Intermediate isoliert und ein ungüns-
tiges Reaktionsgleichgewicht kann in Richtung des
gewünschten Produktes verschoben werden [21, 6].
Betrachtet man die Katalysatorkosten eines enzy-
matischen Prozesses, so variieren sie vor allem in
Abhängigkeit des benötigten Aufreinigungsgrads der
Enzyme sehr stark. Für viele Reaktionen sind Ganz-
zellansätze oder wenig aufgereinigte Enzympräpa-
rate ausreichend, was sich in moderaten Preisen für
den Biokatalysator niederschlägt. In Anbetracht der
hohen katalytischen Effizienz vieler Enzyme im Ver-
gleich zu klassischen chemischen Katalysatoren kann
jedoch auch der Einsatz von teuren Biokatalysato-
ren ökonomisch sinnvoll sein [21]. Die Katalysator-
kosten können zudem weiter gesenkt werden, wenn
Enzyme immobilisiert werden und dadurch wieder-
verwendbar sind.
Neben der Kostenreduktion gibt es noch weitere
Gründe, die für eine Enzymimmobilisierung spre-
chen, wie . Tab. 10.1 zeigt. Mögliche Nachteile im
Zusammenhang mit immobilisierten Enzymen sind
dabei sehr stark von dem jeweiligen Enzym, der zu
katalysierenden Reaktion und der gewählten Immo-
bilisierungsmethode abhängig. Soll beispielsweise
ein Feststoff, wie kristalline Cellulose, umgesetzt
werden, kann dieser aufgrund seiner Größe nur von
Enzymen auf der Oberfläche von Immobilisaten
umgesetzt werden, weshalb hier beispielsweise eine
Enzymimmobilisierung in einem porösen Träger
nicht sinnvoll ist.
Immobilisierungsmethoden isolierter Enzyme
lassen sich prinzipiell in zwei Gruppen einteilen, je
nachdem ob ein Enzym durch chemische Bindungen
fixiert oder in löslicher Form eingeschlossen wird
 406 K. Castiglione und D. Weuster-Botz
. Tab. 10.1  Gründe für und mögliche Limitierungen von Enzymimmobilisierungen
Gründe
Kostenreduktion durch Wiederverwendung der Enzyme
Kontinuierliche Prozessführung möglich
(Verweilzeitentkopplung)
Leichte Produktabtrennung
Stabilisierender Effekt der Immobilisierung
.  Abb. 10.1). Bei der Immobilisierung durch che-
mische Bindungen wechselt man aus dem Bereich
der homogenen Katalyse, bei der Katalysator und
Reaktanden in der gleichen Phase vorliegen, in den
Bereich der heterogenen Katalyse, da die immo-
bilisierten Enzyme in der Regel als Feststoffe und
die Substrate flüssig oder mitunter auch gasförmig
vorliegen. Im Gegensatz dazu gibt es bei der Ein-
schlussimmobilisierung auch Formen der homo-
genen Katalyse, beispielsweise wenn die Enzyme in
10 Enzymmembranreaktoren eingeschlossen werden
(7 Abschn. 10.3). Bei der heterogenen Biokatalyse
müssen grundsätzlich der Stofftransport aus der
Kernströmung zur Oberfläche des Biokatalysatorträ-
gers und der diffusive Stofftransport in den porösen
. Abb. 10.1  Methoden zur Immobilisierung isolierter Enzyme
Mögliche Limitierungen
Kosten der Immobilisierung (Material und Arbeitsaufwand)
Stofftransportlimitierungen
Nur für gelöste Substrate möglich
Veränderung der Enzymeigenschaften, z. B.
Aktivitätsverlust
Biokatalysatorträger hinein berücksichtigt werden
(siehe 7 Abschn. 3.7 und 6.3.1). Im Folgenden wird
vereinfachend von einem Wirkungsgrad η = 1 und
hohen Sherwoodzahlen ausgegangen.
Die Verwendung von ganzen Zellen als Biokata-
lysatoren kann per se auch als Form der Immobili-
sierung betrachtet werden. Einige der Immobilisie-
rungsmethoden, die auf physikalischem Einschluss
basieren, werden häufig auch auf ganze Zellen über-
tragen. Dies gilt zum einen für die Verweilzeitent-
kopplung von ganzen Zellen durch die Verwendung
von Mikrofiltrationsmembranen, wie es bereits
in 7   Abschn. 6.3.2 beschrieben wurde, und zum
anderen für die Mikroverkapselung in Gelmatrices
(7 Abschn. 10.3.1).
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
407 10
Ein wesentlicher Vorteil von immobilisierten ein Enzym beispielsweise einer klassischen Michae-
Enzymen ist die Möglichkeit einer kontinuierli- lis-Menten-Kinetik (Sättigungskinetik) nach Gl.
chen Prozessführung. Dabei können immobilisierte 1.28, ergibt sich folgende Gleichung:
Enzyme in verschiedenen Reaktortypen eingesetzt
cSF − cS (c − c ) ⋅ (cS + K m)
werden. Welcher Reaktortyp für eine gegebene enzy- τ= = SF S Gl. 10.3
vmax ⋅ cS vmax ⋅ cS
matische Reaktion am besten geeignet ist, wird ent-
scheidend von der betrachteten Reaktion beein- cS + K m
flusst. Dies wird im Folgenden an den Beispielen Unter Berücksichtigung der Definition des Umsatzes
des idealen kontinuierlich betriebenen Rührkessel-
cSF − cS
reaktors und des idealen Rohrreaktors ohne axiale X=  Gl. 10.4
cSF
Rückvermischung erläutert. Die grundlegenden
Betrachtungen sind auch für andere Reaktortypen kann Gl. 10.3 auch wie folgt formuliert werden:
relevant, da ihre Charakteristik in Abhängigkeit der
Betriebsweise meist zwischen den Extremen des kon- 1  X 
τ= ⋅  K m ⋅ + cSF ⋅ X   Gl. 10.5
tinuierlich betriebenen Rührkesselreaktors und des vmax  1− X 
idealen Rohrreaktors liegen. Beispielsweise kann ein
Festbettreaktor, der sehr häufig bei immobilisierten Auf gleiche Weise erfolgt die Herleitung der Glei-
Enzymen Verwendung findet (7 Abschn. 6.3.1), bei chungen für Enzyme, die anderen Geschwindigkeits-
geringen Strömungsgeschwindigkeiten und ohne gesetzen folgen. Die resultierenden Gleichungen für
Stofftransportlimitierungen wie ein idealer Rohrre- die erweiterte Michaelis-Menten-Kinetik mit Subst-
aktor betrachtet werden. ratinhibierung (Gl. 1.70) oder kompetitiver Produkt-
Um einen Vergleich zwischen diesen beiden inhibierung (Gl. 1.66) sind beispielhaft in . Tab. 10.2
Reaktortypen zu ermöglichen, werden zunächst die zusammengestellt.
Gleichungen für die Berechnung der hydraulischen Für einen Rohrreaktor mit idealer Pfropfen-
Verweilzeit in Abhängigkeit des Umsatzes hergelei- strömung ( 7 Abschn. 3.5 ) kann das Konzentra-
tet. Die Bilanzierung eines idealen kontinuierlich tionsprofil des Substrats entlang der z-Achse im
betriebenen Rührkesselreaktors wurde ausführlich Fließgleichgewicht nach Gl. 3.78 wie folgt formu-
in 7 Abschn. 3.2.3 vorgestellt. Analog zu Gl. 3.17 kann liert werden:
die Bilanzgleichung für das Substrat einer enzymati-
schen Reaktion im Fließgleichgewicht wie folgt for- dcS L
0=− − ⋅r  Gl. 10.6
muliert werden: dz uz S
dcS
0= = D (cSF − cS) − rS  Gl. 10.1 Hierbei steht L für die Reaktorlänge und uz für die Strö-
dt
mungsgeschwindigkeit. z̃ ist eine dimensionslose Länge
Dabei bezeichnen cS und cSF die Substratkonzentra- (z̃ = z/L). Am Reaktorausgang (z = L) folgt daraus unter
tion im Reaktor beziehungsweise die Eintrittskon- Berücksichtigung des Zusammenhangs L/uz = τ:
zentration in den Reaktor, D die Verdünnungsrate
und rS die Umsetzungsgeschwindigkeit des Subs- cS, z = L c +K
cS, z = L dcS
trats. Löst man Gl. 10.1 nach der Verdünnungsrate τ = −∫ = −∫ S m ⋅ dc
S
auf und ersetzt diese durch ihren Kehrwert, die mitt-
cSF rS c
SF
v max ⋅ c S
lere hydraulische Verweilzeit τ, ergibt sich folgender Km  c 

Zusammenhang: = ⋅ ln  SF  + (cSF − cS, z= L )
vmax  cS, z= L 
cSF − cS 
τ=  Gl. 10.2  Gl. 10.7
rS

Gl. 10.2 kann nun an die betrachtete enzymatische Diese Gleichung kann ebenfalls in Abhängigkeit vom
Reaktion angepasst werden, indem rS durch die pas- Umsatz
sende Geschwindigkeitsgleichung ersetzt wird. Folgt
 408 K. Castiglione und D. Weuster-Botz

cSF − cS, z = L Enzymmenge cE0. Bei einer gegebenen Verweilzeit

X=  Gl. 10.8
cSF
formuliert werden:
1 tor (eCSTR) mit dem des idealen Rohrreaktors (ePFR)
τ= ⋅ (−K m ⋅ ln (1 − X ) + cSF ⋅ X )  Gl. 10.9
vmax
Die korrespondieren Gleichungen für die erweiterte
Michaelis-Menten-Kinetik mit Substratinhibierung
(Gl. 1.70) oder kompetitiver Produktinhibierung
(Gl. 1.66) sind auch in . Tab. 10.2 zusammengestellt.
Mit Hilfe dieser Gleichungen kann nun die erfor-
derliche Verweilzeit für das Erreichen eines bestimm-
ten Umsatzes in Abhängigkeit des Geschwindig-
keitsgesetzes des verwendeten Enzyms berechnet
werden. Vergleicht man zwei Reaktortypen, so ist
der Reaktor vorzuziehen, der bei gegebenem Umsatz
die kürzere hydraulische Verweilzeit erfordert. Da
die Verweilzeit umgekehrt proportional zur maxi-
malen Reaktionsgeschwindigkeit vmax und demnach
auch zur eingesetzten Enzymmenge cE0 ist (Gl. 1.27),
10 führt eine Verdoppelung der Verweilzeit zum glei-
chen Effekt wie eine Verdoppelung der eingesetzten
und gegebenem Umsatz ist folglich der Reaktor vor-
zuziehen, der den geringeren Enzymbedarf hat.
. Abb. 10.2 zeigt einen Vergleich des Enzymbe-
darfs im kontinuierlich betriebenen Rührkesselreak-
für eine enzymatische Reaktion, die einer Michae-
lis-Menten-Kinetik folgt. Der relative Enzymbedarf
ist dabei zum einen vom Umsatz und zum anderen
vom Verhältnis der anfänglichen Substratkonzent-
ration cSF zur Michaeliskonstante (Halbsättigungs-
konzentration) Km abhängig. Betrachtet man den
Verlauf für eine niedrige Substrateingangskonzent-
ration (cSF = Km), so ist ersichtlich, dass der kontinu-
ierlich betriebene Rührkesselreaktor schon bei nied-
rigen Umsätzen einen höheren Enzymbedarf aufweist
als der Rohrreaktor. Der relative Enzymbedarf steigt
umso mehr, je näher sich die Reaktion dem vollstän-
digen Umsatz nähert. Dies ist dadurch zu erklären,
dass der kontinuierlich betriebene Rührkesselreaktor
unter Auslaufbedingungen arbeitet und die Substrat-
eingangskonzentration beim Eintritt in den Reaktor
einer idealisierten Sprungfunktion folgt und sofort
auf die Substratkonzentration beim Austritt aus dem

. Tab. 10.2  Gleichungen zur Berechnung der mittleren hydraulischen Verweilzeit in Abhängigkeit des Umsatzes für
den idealen kontinuierlich betriebenen Rührkesselreaktor und den idealen Rohrreaktor. Beispielhaft dargestellt sind
die Gleichungen für Enzyme mit unterschiedlichen Geschwindigkeitsgesetzen

Geschwindigkeitsgleichung des Idealer kontinuierlich betriebe- Idealer Rohrreaktor (PFR)

eingesetzten Enzyms ner Rührkesselreaktor (CSTR)

Michaelis-Menten-Kinetik (Gl. 1.28) 1  X  1

τ= ⋅  K m ⋅ + cSF ⋅ X  τ= ⋅ (−K m ⋅ ln (1 − X ) + cSF ⋅ X )
vmax  1− X  vmax

Michaelis-Menten-Kinetik mit  X  −K ⋅ ln (1 − X ) 

Substratinhibierung (Gl. 1.70)  K m ⋅ 1 − X + cSF ⋅ X   m 
1    c 2 
1 
τ=
vmax
⋅
 2
cSF

 τ= ⋅ + cSF ⋅ X + SF ⋅ X ⋅
+ X ⋅ (1 − X ) ⋅  vmax  2 ⋅ K5 
K5  
  
(2 − X ) 

Michaelis-Menten-Kinetik mit  X   
kompetitiver Produktinhibierung (Gl. 1.66)  K m ⋅ 1 − X + cSF ⋅ X   

1   −K m ⋅ ln (1 − X )
τ= ⋅    
vmax +c ⋅ K m ⋅ X 2   
 SF K3 (1 − X )  1   cSF 
 + cSF ⋅ X ⋅

τ= ⋅ ⋅1 + 
vmax   K3  
 
  
 K m  
1 − K  
 3
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
409 10

H&675  H&675 

H3)5 H3)5
 

 

 

 

 

 
     
     
8PVDW]
8PVDW]

. Abb. 10.2  Enzymbedarf des kontinuierlich betriebenen
Rührkesselreaktors (eCSTR) im Vergleich zum idealen
Rohrreaktor (ePFR) für eine enzymatische Reaktion, die
einer Michaelis-Menten-Kinetik folgt. Dargestellt ist der
relative Enzymbedarf in Abhängigkeit des Umsatzes bei
verschiedenen Eingangssubstratkonzentrationen. Schwarze,
durchgezogene Linie: cSF = Km; rote durchgezogene Linie:
cSF = 10 · Km; gestrichelte Linie: cSF = 100 · Km
. Abb. 10.3  Enzymbedarf des kontinuierlich betriebenen
Rührkesselreaktors (eCSTR) im Vergleich zum Rohrreaktor (ePFR)
für eine enzymatische Reaktion mit Substratinhibierung.
Dargestellt ist der relative Enzymbedarf in Abhängigkeit des
Umsatzes für unterschiedlich starke Inhibierungen. Schwarze,
durchgezogene Linie: sehr starke Inhibierung (K5 = 0,1 · Km);
rote, durchgezogene Linie: starke Inhibierung (K5 = Km);
gestrichelte Linie: schwache Inhibierung (K5 = 10 · Km). In
allen Fällen gilt: cSF = 10 · Km

Reaktor fällt. Dadurch ist die mittlere Substratkonzen-
tration, bei der das Enzym arbeitet, deutlich niedriger
als beim Rohrreaktor, bei dem die Substratkonzent-
ration erst während der Passage durch den Reaktor
sinkt. Wie in 7 Abschn. 1.4.1 erläutert wurde, liegt bei
Substratkonzentrationen, die sich deutlich unterhalb
des Km befinden, eine Reaktion erster Ordnung vor,
bei der die Reaktionsgeschwindigkeit linear von der
Substratkonzentration abhängt. Bei hohen Substrat-
konzentrationen (cSF = 100 · Km) hingegen liegt über
weite Umsatzbereiche näherungsweise eine Reaktion
nullter Ordnung vor, bei der die Reaktionsgeschwin-
digkeit unabhängig von der Substratkonzentration ist,
da stets alle aktiven Zentren der Enzyme besetzt sind.
Daher ist auch der Enzymbedarf in beiden Reaktoren
über weite Umsatzbereiche identisch.
Anders sehen die Verhältnisse aus, wenn
ein substratinhibiertes Enzym eingesetzt wird
(. Abb. 10.3). Bei sehr starker Substratinhibierung
ist ein kontinuierlich betriebener Rührkesselre-
aktor dem Rohrreaktor bis zu sehr hohen Umsät-
zen überlegen, da die mittlere Substratkonzentra-
tion im Reaktionsgemisch deutlich geringer ist. Im
gewählten Beispiel, bei dem das Substrat 10-mal
besser an den Enzym-Substrat-Komplex bindet als
an das freie Enzym (K5 = 0,1 · Km), ist die Verwen-
dung eines Rührkesselreaktors bis zu einem Umsatz
von 99,8 % von Vorteil. Je schwächer die Substrat-
inhibierung ausgeprägt ist, desto mehr nähern sich
die Kurven dem Verlauf für Enzyme mit klassischer
Michaelis-Menten-Kinetik an und bei umso nied-
rigeren Umsätzen lohnt sich die Verwendung eines
Rohrreaktors.
In . Abb. 10.4 sind die Kurvenverläufe für ein
Enzym mit kompetitiver Produktinhibierung dar-
gestellt. Unabhängig vom Umsatz und der Stärke der
Inhibierung ist der Rohrreaktor die bessere Wahl,
da sich hier die negativen Effekte der gleichbleibend
niedrigen Substrat- und hohen Produktkonzentra-
tion im Reaktionsgemisch des kontinuierlich betrie-
benen Rührkesselreaktors addieren.
10.1 Quervernetzte Enzymaggregate
Die Quervernetzung von Enzymaggregaten gehört
zu den Immobilisierungsmethoden durch chemische
Fixierung (. Abb. 10.1). Im Gegensatz zur Bindung
 410 K. Castiglione und D. Weuster-Botz
H&675 
H3)5


 bracht wird [21].
 von Enzymen liegen in den 60er Jahren, in denen lös-



     
8PVDW]
. Abb. 10.4  Enzymbedarf des kontinuierlich betriebenen
Rührkesselreaktors (eCSTR) im Vergleich zum Rohrreaktor (ePFR)
für eine enzymatische Reaktion mit Produktinhibierung.
Dargestellt ist der relative Enzymbedarf in Abhängigkeit des
Umsatzes für unterschiedlich starke Inhibierungen. Schwarze,
durchgezogene Linie: sehr starke Inhibierung (K3 = 0,1 · Km);
rote, durchgezogene Linie: starke Inhibierung (K3 = Km);
gestrichelte Linie: schwache Inhibierung (K3 = 10 · Km). In allen
Fällen gilt: (cSF = 10 · Km)
10
an vorgefertigte Trägermaterialien erfolgt diese
Immobilisierung trägerfrei, da die Proteine unmit-
telbar untereinander mit Hilfe von bifunktionellen
Reagenzien quervernetzt werden. Hierfür wird am
häufigsten Glutardialdehyd verwendet, das reaktive
NH2-Gruppen auf Proteinoberflächen miteinander
verbindet, wie . Abb. 10.5 zeigt. Die NH2-Gruppen
. Abb. 10.5  Quervernetzung von Proteinen mit Hilfe von Glutardialdehyd
stammen dabei zumeist von exponierten Lysinres-
ten. Interessant sind trägerfreie Immobilisierungs-
strategien vor allem deswegen, da durch den Verzicht
auf ein zusätzliches Trägermaterial kein katalytisch
inaktiver Ballast in eine Synthesereaktion einge-
Die Anfänge der kovalenten Quervernetzung
liche Enzyme zu sogenannten cross-linked enzymes
(CLEs) verbunden wurden [57]. CLEs wiesen jedoch
einige Nachteile auf, wie beispielsweise eine geringe
mechanische Stabilität, einen geringen Aktivitätser-
halt und eine schwierige Handhabung aufgrund der
gelartigen Konsistenz [13].
Die Herstellung von quervernetzten Enzym-
kristallen (cross-linked enzyme crystals (CLECs))
stellte eine Weiterentwicklung dar, mit der viele
Nachteile der CLEs überwunden werden konnten.
Hierbei werden Enzyme zunächst zur Kristallisa-
tion gebracht und anschließend in ihrer kompak-
ten, kristallinen Form quervernetzt. Die resultieren-
den Immobilisate sind aufgrund ihrer mechanischen
Stabilität einfach zu handhaben und haben häufig
eine sehr hohe katalytische Aktivität. Darüber hinaus
zeigen die Enzyme eine erhöhte Stabilität gegenüber
Hitzedenaturierung und organischen Lösemitteln
[66]. Dies ist eine Folge der Fixierung des Enzyms
im Proteinkristall sowie der zusätzlichen kovalen-
ten Quervernetzung, die eine Entfaltung des Proteins
erschweren. Auch eine verbesserte Resistenz gegen-
über Proteolyse wurde festgestellt. Diese liegt darin
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
begründet, dass die Enzymkristalle von dünnen
Kanälen mit einem typischen Durchmesser von
2.5 nm durchzogen sind, in die Proteasen aufgrund
ihrer Größe nicht eindringen können. Substrate für
enzymatische Reaktionen mit molekularen Massen
unter 3000 g mol–1 können jedoch in das Kristall-
innere diffundieren [76, 51]. Um starke Diffusions-
limitierungen zu vermeiden, werden daher Mikro-
kristalle mit typischen Größen im Bereich zwischen
1 und 100 µm quervernetzt.
Wesentliche Nachteile der Herstellung von
CLECs sind die Notwendigkeit der Identifikation
von Kristallisationsbedingungen und die dafür benö-
tigte hohe Reinheit des zugrundeliegenden Enzyms.
Beide Aspekte können jedoch bei der Herstellung
von quervernetzten Enzymaggregaten (cross-linked
enzyme aggregates (CLEAs)) vernachlässigt werden,
welche die neueste Generation an trägerfreien
Enzymimmobilisaten darstellen.
10.1.1 Herstellung von quervernetzten
Enzymaggregaten
Die Präzipitation von Proteinen in Lösung kann
durch die Zugabe von Salzen, mit Wasser misch-
baren organischen Lösemitteln oder (nicht)-io-
nischen Polymeren hervorgerufen werden. Dabei
. Abb. 10.6  Auszug aus der Hofmeister-Serie [27]. Anion und Kation von Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4) sind rot markiert
411 10
präzipitieren die Enzyme in ihrer nativen Konfor-
mation zu unlöslichen Aggregaten, die dann ebenso
wie CLEs und CLECs durch die Zugabe von Glutar-
dialdehyd quervernetzt werden können.
Die Fällung von Proteinen wird schon seit
langem als ein früher Schritt in der Proteinreini-
gung eingesetzt (siehe 7 Abschn. 9.3.1.1). Bei intra-
zellulär produzierten Proteinen ist dieses Verfahren
beispielsweise direkt im Anschluss an Zellaufschluss
und Abtrennung der Zellbruchstücke ideal und wird
in der Regel in Form einer Ammoniumsulfatfällung
durchgeführt. Da verschiedene Proteine bei unter-
schiedlichen Salzkonzentrationen ausfallen, kann
durch eine schrittweise Erhöhung der Ammo-
niumsulfatkonzentration eine fraktionierte Fällung
erzielt werden, die zur einer partiellen Reinigung und
Konzentrierung des Zielproteins führt. Aus diesen
Gründen kann die Herstellung von CLEAs auch mit
sehr unreinen Enzymlösungen erfolgen.
Einer der wichtigsten Aspekte bei der CLEA-
Herstellung ist der Aktivitätserhalt des präzipitierten
Enzyms. Wird ein Salz verwendet, sollte es anti-chao-
trop (kosmotrop) und am linken Ende der sogenann-
ten Hofmeister-Serie zu finden sein (. Abb. 10.6).
Kosmotrope Salze, wie das bereits erwähnte Ammo-
niumsulfat, verstärken hydrophobe Wechselwirkun-
gen und fördern das Aussalzen eines Proteins in der
nativen Konformation. Im Gegensatz dazu wirken
 412 K. Castiglione und D. Weuster-Botz

chaotrope Salze solubilisierend und denaturierend,
was für die Herstellung von CLEAs unerwünscht ist.
Zahlreiche Beispiele in der Literatur zeigen
jedoch, dass auch mit Hilfe von wassermischbaren
organischen Lösemitteln wie Aceton, Ethanol und
Dimethoxyethan oder verschiedenen Polymeren wie
Polyethylenglykol oder Polyethylenimin sehr aktive
CLEAs erhalten werden können. Da die Eignung
eines Fällungsmittels für ein bestimmtes Enzym
nach dem momentanen Stand der Technik nicht
vorhersagbar ist, werden in der Regel verschiedene
Fällungsmittel getestet [70]. Wie am Beispiel zweier
Lipasen (EC 3.1.1.3) in . Tab. 10.3 ersichtlich wird,
kann das optimale Fällungsmittel selbst für Enzyme
aus der gleichen Enzymklasse unterschiedlich sein.
Die Quervernetzung hat einen zusätzlichen Ein-
fluss auf die Enzymaktivität und nicht immer hat
die CLEA-Präparation, die mit der optimalen Fäl-
lungsmethode hergestellt wurde, auch die höchste
Aktivität nach der Quervernetzung, sodass es sich
häufig lohnt, verschiedene Präzipitate zu vernetzen
und die Aktivitäten der resultierenden CLEAs zu
10 vergleichen.
Vor allem bei der Herstellung von Lipase-
CLEAs kommt es mitunter zu dem Phänomen der
Hyperaktivierung, wodurch die Enzyme im Immo-
bilisat eine deutlich höhere Aktivität als im löslichen
Zustand zeigen (. Tab. 10.3). Die Zugabe verschie-
dener Additive kann bei Enzymen eine konforma-
tionelle Änderung bewirken, die anschließend im
CLEA fixiert wird [43].
Ein weiterer interessanter Aspekt der CLEA-
Technologie ist die Möglichkeit zur Herstellung soge-
nannter Kombi-CLEAs, die durch Co-Präzipitation
und Quervernetzung mehrerer Enzyme entstehen.
Hierdurch können Enzyme, die beispielsweise ver-
schiedene konsekutive Reaktionen katalysieren, in
einem Schritt immobilisiert werden [70].
10.1.2 Herstellung von Ampicillin mit
Penicillin-Amidase-CLEAs
Obwohl das Potential von CLEAs für den Einsatz in
industriellen Biotransformationen von verschiede-
nen Firmen als sehr hoch eingestuft wird [59], gibt
es bislang noch keine veröffentlichten Daten über
einen industriellen Prozess, der sich dieser Technolo-
gie bedient. Gründe hierfür könnten in der mitunter
schwierigen Abtrennbarkeit kleiner CLEAs [13] und

. Tab. 10.3  Relative Aktivität verschiedener Enzyme nach Präzipitation durch Zugabe von 90 Volumenprozent des
angegebenen Fällungsmittels und erneuter Solubilisierung durch Verdünnung (1:10). Alle Werte beziehen sich auf
die Aktivität vor der Fällung, die in reinem Puffer gemessen wurde. Die höchste Aktivität ist rot hervorgehoben. In
Klammern ist zusätzlich die Aktivität der resultierenden CLEAs nach Quervernetzung mit Glutardialdehyd angegeben.
Daten aus [62]

Fällungsmittel

Enzym Puffer tert-Butanol DME g Ethyllactat (NH4)2SO4 h PEG i

Alkoholdehydrogenasea 100 13 7 4 100 (20) 44

Glucoseoxidaseb 100 116 113 127 (100) 101 114
Laccasec 100 139 78 108 139 186 (50)
Lipase RmLd 100 934 (934) 561 14 133 102
Lipase CaLAe 100 142 231 (263) 86 101 115
Phytaseb 100 88 95 123 (100) 52 80
Trypsinf 100 148 142 142 186 (51) 153

Enzyme aus aRhodococcus erhythropolis, bAspergillus niger, cCoriolus versicolor; dRhizomucor miehei, eCandida
antarctica, fSchwein.
gDimethoxyethan; hgesättigte Ammoniumsulfatlösung; iPolyethylenglykol.
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
. Abb. 10.7  Enzymatische Ampicillinsynthese
ihrer Neigung zur Verklumpung nach Filtration oder
Zentrifugation liegen, was sich negativ auf ihre kata-
lytische Aktivität auswirkt [17].
Ein im Labormaßstab untersuchtes Anwen-
dungsbeispiel für quervernetze Enzymaggregate ist
die Herstellung des ß-Lactam-Antibiotikums Ampi-
cillin mit immobilisierter Penicillin-Amidase (EC
3.5.1.11) [12]. Ein wesentliches Problem bei der
Ampicillinherstellung ist die Konkurrenz zwischen
der Synthesereaktion (. Abb. 10.7) und der Hydro-
lyse des D-Phenylglycinamids sowie des gebildeten
Antibiotikums.
. Tab. 10.4 zeigt einen Vergleich der Ampicillin-
synthese im wässrigen Medium mit freiem Enzym,
quervernetzten Enzymkristallen, quervernetzten
Enzymaggregaten und auf einem Träger immobi-
lisierter Penicillin-Amidase. Während der erzielte
maximale Umsatz jeweils in einem ähnlichen Bereich
liegt, gibt es deutliche Unterschiede bei dem Verhält-
nis von Synthese zu Hydrolyse und der spezifischen
. Tab. 10.4  Ampicillinsynthese im wässrigen Medium mit verschiedenen Penicillin-Amidase-Immobilisaten im
Vergleich zum freien Enzym. Daten aus [12]
Biokatalysator Maximaler Umsatz (%)
Freies Enzym 88
CLEC 72
CLEAb 85
Trägerfixiertes Enzymc 86
a Bestimmt als kg –1 –1
Produkt kgBiokatalysator h im Verhältnis zum freien Enzym berechnet zum Zeitpunkt des maximalen
Umsatzes
b Mit tert-Butanol präzipitiert und mit Glutardialdehyd quervernetzt
c Auf Polyacrylamid immobilisiert
413 10
Produktivität. Das Verhältnis von Synthese zu Hyd-
rolyse des Produkts ist bei den CLECs am gerings-
ten, was auf eine Diffusionslimitierung innerhalb
der Enzymkristalle hinweisen kann [64]. Während
sich das trägerfixierte Enzym und das quervernetzte
Enzymaggregat in diesem Punkt kaum unterschei-
den, ist die spezifische Produktivität erwartungsge-
mäß bei dem trägerfixierten Enzym am geringsten,
da ein großer Anteil katalytisch inaktiver Ballast in
die Synthese eingebracht wird. Die Penicillin-Ami-
dase-CLEAs produzierten in vergleichbarer Zeit
am meisten Produkt pro eingesetztem Biokatalysa-
tor (kg kg–1 h–1) und konnten auch erfolgreich für
die Synthese weiterer ß-Lactam-Antibiotika ein-
gesetzt werden, wie beispielsweise für die Herstel-
lung des Cephalosporins Cefalexin [29]. Bei der Syn-
these von Cefalexin zeigte das trägerfixierte Enzym
zwar eine fünffach höhere Raum-Zeit-Ausbeute,
was hauptsächlich einer geringeren Diffusionsli-
mitierung zugeschrieben wurde, jedoch hatte das
Verhältnis von Synthese Relative spezifische Pro-
zu Hydrolyse duktivität (%)a
2,0 100
0,71 39
1,58 151
1,56 0.8
 414 K. Castiglione und D. Weuster-Botz
CLEA-Präparat eine bedeutend höhere Stabilität
unter Prozessbedingungen, die in einer 3,4-fach län-
geren Halbwertszeit resultierte.
10.2 Trägerfixierte Enzyme
Die Bindung von Enzymen an vorgefertigte Träger-
materialien gilt als klassischste Methode der Immo-
bilisierung. Erste Berichte über die Adsorption von
Proteinen an Materialien wie Aktivkohle datieren
auf den Beginn des letzten Jahrhunderts [49]. Ver-
stärkte Forschungsaktivitäten zur Entwicklung und
Nutzung von trägergebundenen Enzymen setzten
dann in der zweiten Hälfte des letzten Jahrhunderts
ein [11]. Seitdem ist eine große Vielfalt an verschie-
denen Trägermaterialien und Bindungsstrategien
untersucht worden, deren wichtigste Vertreter im
folgenden Kapitel näher dargestellt werden.
10.2.1 Trägermaterialien und Fixierung
10 von Enzymen
Für Immobilisierungen geeignete Trägermateria-
lien müssen einige Anforderungen erfüllen. Sie
sollten eine hohe chemische Stabilität und eine
geringe Quellung aufweisen. Wesentliche mecha-
nische Eigenschaften sind eine hohe Druckstabilität
und geringe Kompressibilität. Soll ein Immobilisat
in einem Rührkesselreaktor verwendet werden, ist
zudem ein gewisses Maß an Elastizität von Vorteil,
um Abrieb durch das Rührorgan zu vermeiden. Das
Trägermaterial sollte darüber hinaus nicht teuer sein,
um die Kosten der Immobilisierung möglichst gering
zu halten [9].
Besondere Bedeutung kommt den morpholo-
gischen Eigenschaften des Trägermaterials zu. Die
Partikel sollten eine einheitliche Form und eine
enge Größenverteilung haben, da beispielsweise
der Druckabfall in Festbettreaktoren mit der Breite
der Partikelgrößenverteilung deutlich zunimmt. In
der Regel werden kugelförmige, poröse Träger mit
typischen Durchmessern im Bereich zwischen 0,2
und 1,0 mm verwendet [9]. Um Immobilisate mit
hoher spezifischer Aktivität zu erhalten, muss eine
große innere Oberfläche vorhanden sein, die idea-
lerweise mehr als 100 m2 g–1 beträgt [10]. Bei einem
gegebenen Partikeldurchmesser wird die innere
Oberfläche durch die Porosität, also durch das Ver-
hältnis von Hohlraumvolumen zu Gesamtvolumen
des Partikels, und den Porendurchmesser bestimmt.
Bei der Wahl eines geeigneten Porendurchmessers
müssen zwei Faktoren berücksichtigt werden: Zum
einen nimmt die innere Oberfläche mit zunehmen-
dem Porendurchmesser ab. Zum anderen dürfen
die Poren jedoch nicht zu klein werden, damit die
Enzyme effizient in das Partikelinnere gelangen und
dort immobilisiert werden können und geringe Dif-
fusionslimitierungen von Substraten und Produk-
ten auftreten. Da der Durchmesser von Enzymen
mit technischer Anwendung meist im Bereich zwi-
schen 4–8 nm liegt, sollte der Porendurchmesser aus
den genannten Gründen nicht kleiner als 20 nm sein.
Typische Porengrößen liegen im Bereich zwischen
30 und 60 nm [9].
Es gibt eine große Vielzahl an verschiedenen Trä-
germaterialien für Enzymimmobilisierungen, die
sich im Wesentlichen in drei verschiedene Klassen
einteilen lassen: anorganische Trägermaterialien und
natürliche oder synthetische Polymere. Beispiele für
häufig verwendete Trägermaterialien sind [9, 65]:
55 Anorganische Trägermaterialien
44Glas
44Keramik
44Kieselgur (Celite)
44Silica-Materialien
44Titandioxid (TiO2)
55 Natürliche Polymere
44Polysaccharide (und ihre Derivate):
Cellulose, Dextran, Agarose
44Proteine: Kollagen, Albumin
55 Synthetische Polymere
44Polystyrol
44Polyacrylate
44Polymethacrylate
44Polyacrylamid
44Polyamide
44Polypropylen
Neuere Entwicklungen auf dem Gebiet der Träger-
materialien sind Nanopartikel aus Magnetit (Fe3O4),
die aufgrund ihrer magnetischen Eigenschaften sehr
einfach abzutrennen sind [52], und sogenannte Sti-
mulus-responsive Polymere, die mit großen kon-
formationellen Änderungen auf vergleichsweise
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
geringe Änderungen der Umgebungsbedingungen
(wie beispielsweise pH, Ionenstärke oder Tempera-
tur) reagieren. Das bekannteste Beispiel ist das ther-
moresponsive Polymer Poly-N-isopropylacrylamid
(Poly-NIPAM), das eine kritische Entmischungstem-
peratur von 32 °C aufweist. Enzymatische Reaktio-
nen mit an Poly-NIPAM immobilisierten Enzymen
werden bei niedrigeren Temperaturen durchgeführt,
bei denen sich das Polymer im löslichen Zustand
befindet. Dadurch werden Effekte, die durch den
Träger hervorgerufen werden, wie beispielsweise
Diffusionslimitierungen oder Aktivitätsverluste,
minimiert. Durch die Erhöhung der Temperatur auf
Werte über 32 °C am Ende des Prozesses präzipitiert
das Polymer und kann einfach abgetrennt und wie-
derverwendet werden [65].
Die Fixierung von Enzymen an Trägermateria-
lien kann auf der Basis verschiedener physikalischer
Wechselwirkungen (Adsorption, ionische Wechsel-
wirkung oder Komplexbildung) oder durch kova-
lente Bindung erfolgen (. Abb. 10.8).
Für die adsorptive Bindung von Enzymen
können sowohl hydrophile als auch hydrophobe
Träger verwendet werden. Bei hydrophilen Trägern
werden Wasserstoffbrückenbindungen zwischen
hydrophilen Oberflächenbereichen des Enzyms und
dem Trägermaterial ausgebildet. Da Zuckerreste die
Hydrophilizität von Enzymen erhöhen, sind Gly-
kosylierungen für die Interaktion von Vorteil. Ein
. Abb. 10.8  Verschiedene
Methoden zur Enzymbindung an
Trägermaterialien
415 10
besonders häufig verwendetes hydrophiles Träger-
material ist Kieselgur (Celite), das aus den Silicium-
dioxidschalen fossiler Kieselalgen, sogenannter Dia-
tomeen, besteht [23].
Die Adsorption auf hydrophoben Trägern erfolgt
aufgrund von Van-der-Waals-Kräften und hydro-
phober Interaktion. Die wesentliche thermodyna-
mische Triebkraft ist der Entropiegewinn, der aus der
Verdrängung von Wassermolekülen aus dem Bereich
zwischen zwei lipophilen Grenzflächen resultiert.
Typische Trägermaterialien sind unter anderem
Octyl-Agarose oder Polypropylen. Während die
meisten Enzyme eine sehr hydrophile Oberfläche
aufweisen, sind hydrophobe Oberflächenbereiche
ein typisches Merkmal von Lipasen, da diese Enzym-
klasse an Öl/Wasser-Grenzflächen aktiv ist. Ein wei-
terer Grund, warum Lipasen häufig durch Adsorp-
tion immobilisiert werden, ist ihre mitunter hohe
Toleranz gegenüber organischen Lösemitteln. Das
Auswaschen von Enzymen aus dem Träger in wäss-
rigen Medien stellt einen wesentlichen Nachteil der
adsorptiven Immobilisierung dar und kann durch
die Verwendung der Immobilisate in organischen
Lösemitteln verhindert werden [23].
Für die Immobilisierung von Enzymen durch
ionische Wechselwirkungen spielt der isoelektrische
Punkt (pI) des Proteins eine entscheidende Rolle, da
Proteine oberhalb ihres pI eine negative und unter-
halb eine positive Nettoladung tragen. Als Faustregel
 416 K. Castiglione und D. Weuster-Botz
gilt bei einer Immobilisierung an einem Anionen-
tauscher, dass der vorherrschende pH höher als pI
+1 sein sollte. Analog dazu sollte der pH bei einem
Kationentauscher mehr als eine Einheit unter dem pI
des Enzyms liegen. Ein Beispiel für ein häufig verwen-
detes Ionenaustauschmaterial ist der schwache Anio-
nentauscher Diethylaminoethyl (DEAE)-Cellulose.
Bindungen durch Komplexbildung werden in
den meisten Fällen durch Metallchelate vermittelt.
Hierfür wird ein Chelatligand, in der Regel Nitrilo-
triessigsäure (NTA) oder Imidodiessigsäure (IDA),
am Träger immobilisiert. Divalente Ionen von Über-
gangsmetallen (z.B. Ni2+, Cu2+, Zn2+ oder Co2+)
werden von den Liganden so gebunden, dass noch
eine oder mehrere Koordinationsstellen für eine
Wechselwirkung mit den Imidazolringen von His-
tidinresten zur Verfügung stehen und Enzyme mit
exponierten Histidinen oder artifiziellen Polyhis-
tidin-Ankern immobilisiert werden können. Die
Nutzung von sehr spezifischen Interaktionen zwi-
schen Enzymen und geeigneten Affinitätsliganden
kann prinzipiell auch zur gleichzeitigen Reinigung
10 und Immobilisierung genutzt werden, jedoch stehen
die hohen Kosten der Materialien einer breiten
Anwendung entgegen [28, 63].
Die kovalente Immobilisierung führt zur stärks-
ten Bindung eines Enzyms an einen Träger. Das
Verfahren ist vergleichsweise aufwändig und teuer,
da eine Funktionalisierung der Trägermaterialien
nötig ist. Meistens werden exponierte Aminogrup-
pen der Enzyme, beispielsweise von Lysinresten, für
die Kopplung genutzt. In diesem Zusammenhang
. Abb. 10.9  Beispiele für die kovalente Bindung eines Enzyms an ein Trägermaterial. (oben) Bindung eines Enzyms mit einer
exponierten Aminogruppe an einen epoxy-aktivierten Träger. (unten) Bindung eines Enzyms mit exponierter Carboxygruppe
mit Hilfe eines Carbodiimids an einen amino-funktionalisierten Träger
werden häufig epoxy-funktionalisierte Acrylate
(Eupergit C) als Träger verwendet (. Abb. 10.9a).
Andere funktionelle Gruppen auf der Enzymober-
fläche, wie Carboxygruppen (. Abb. 10.9b) oder
Zuckerreste, können jedoch auch für die Kopplung
an einen Träger genutzt werden. [23].
Im Vergleich zu den Immobilisierungsmethoden
auf Basis physikalischer Wechselwirkungen kann es
bei der kovalenten Bindung zu größeren Konforma-
tionsänderungen der Proteine kommen, die Aktivi-
tätsverluste der Enzyme nach sich ziehen. Zudem ist
die kovalente Immobilisierung in der Regel ungerich-
tet, was ebenfalls zu inaktiven Enzymen führen kann,
wie . Abb. 10.10 zeigt. Wesentliche Vorteile sind hin-
gegen, dass es zu keinem Biokatalysatorverlust durch
Auswaschen kommen kann und dass multiple kova-
lente Bindungen zu einer Rigidifizierung (Verstei-
fung) des Proteinmoleküls führen und somit einen
stabilisierenden Effekt haben können [5].
10.2.2 Biokatalytische
Glucoseisomerisierung zur
Herstellung von High Fructose
Corn Sirup (HFCS)
High Fructose Corn Sirup (HFCS) ist eine flüssige
Süßungsmittelalternative zu Saccharose, die seit
1967 auf dem Lebensmittelmarkt ist [14]. Heutzutage
wird HFCS in großem Umfang für die Produktion
von Getränken, Backwaren, Milchprodukten und
anderen verarbeiteten Lebensmitteln verwendet. Dies
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
DNWLYHV (Q]\P
NRQIRUPDWLRQHOO YHU]HUUWHV
WHLODNWLYHV (Q]\P
VFKOHFKW ]XJ¦QJOLFKHV (Q]\P
LQDNWLYHV (Q]\P
. Abb. 10.10  Effekte der ungerichteten kovalenten
Immobilisierung auf die enzymatische Aktivität
liegt unter anderem daran, dass HFCS günstiger ist als
Saccharose und einige vorteilhafte Eigenschaften hat,
da der Sirup unter anderem geschmacksverstärkend,
gefrierpunktserniedrigend und haltbarkeitsverlän-
gernd wirkt [24]. Das momentane Marktvolumen
übersteigt 107 Tonnen pro Jahr und wird ausschließ-
lich biokatalytisch mit Hilfe immobilisierter D-Xylo-
se-Isomerase (EC 5.3.1.5) hergestellt [19].
D-Xylose-Isomerase hat eine breite Substratspe-
zifität und katalysiert die reversible Aldose-Ketose-
Isomerisierung verschiedener Monosaccharide mit
fünf oder sechs Kohlenstoffatomen. Da die höchste
katalytische Effizienz typischerweise bei der Kon-
version von D-Xylose zu D-Xylulose erzielt wird, ist
diese Reaktion entscheidend für den systematischen
Namen des Enzyms. Viel häufiger wird jedoch der
Name Glucoseisomerase verwendet, da das Enzym
bei der industriellen Herstellung von HFCS die Iso-
merisierung von D-Glucose zu D-Fructose kataly-
siert (. Abb. 10.11) [2].
Der Großteil der HFCS-Produktion nutzt Mais-
stärke als Ausgangsmaterial, jedoch kann auch Stärke
anderer Herkunft wie Reis- oder Weizenstärke ver-
wendet werden. Die Stärkehydrolyse zu Glucose-
monomeren erfolgt in zwei getrennten enzymati-
schen Schritten: Verflüssigung und Verzuckerung.
Bei der Verflüssigung wird die Stärke bei hohen
417 10
. Abb. 10.11  Wichtige Reaktionen, die von der D-Xylose-
Isomerase (D-XI) katalysiert werden
Temperaturen (~95 °C) durch thermostabile α-­
Amylasen (EC 3.2.1.1) in lösliche Oligosaccharide
gespalten, die dann in der Verzuckerung durch Glu-
coamylasen (EC 3.2.1.3) bei ~ 60 °C zu Glucose hyd-
rolysiert werden [2].
Bei gleicher Masse besitzt Glucose eine 25 %
geringere Süßkraft als Saccharose. Da Fructose
hingegen 1,6-mal so süß ist wie Saccharose, wird
immobilisierte D-Xylose-Isomerase dazu verwen-
det, Glucose in Fructose umzuwandeln [19]. Die
Isomerisierungsreaktion ist leicht endotherm (ΔH
= 3 kJ mol–1) und reversibel. Daher bestimmt das
thermodynamische Gleichgewicht zwischen Glucose
und Fructose bei einer gegebenen Reaktionstempe-
ratur die höchste erzielbare Fructosekonzentration
im Sirup. In momentanen industriellen Prozessen
werden Temperaturen bis zu 60 °C für die Isome-
risierungsreaktion verwendet. Dies entspricht der
oberen Grenze der Temperaturstabilität der ver-
wendeten D-Xylose-Isomerasen, die unter diesen
Bedingungen Halbwertszeiten von mehr als 100
Tagen haben [40]. Daraus resultiert ein HFCS mit
42 % Fructose, der hauptsächlich für die Produk-
tion von Backwaren und Milchprodukten verwen-
det wird. Für die meisten Anwendungsbereiche von
HFCS, wie beispielsweise die Herstellung von Soft-
drinks, wird eine Fructosekonzentration von 55 %
benötigt, um bei äquivalenter Stoffmenge die Süße
 418 K. Castiglione und D. Weuster-Botz

. Tab. 10.5  Momentan kommerziell erhältliche D-Xylose-Isomerase-Produkte [19]

Handelsname Ursprungsorganismus der Hersteller Beschreibung

Isomerase
Sweetzyme® Bacillus coagulans Novozymes Mit Glutardialdehyd
Streptomyces murinus quervernetztes
Zellhomogenat
mit zusätzlichem
anorganischen
Trägermaterial
GENSWEET® SGI Streptomyces rubiginosis Genencor/DuPont Lösliche Enzyme für
die Bindung an den
Anionentauscher
Diethylaminoethyl (DEAE)-
Cellulose
GENSWEET® IGI Streptomyces rubiginosis Genencor/DuPont Mit Polyethylenimin/
Glutardialdehyd
quervernetzte ganze
Zellen, gemischt
mit anorganischem
trägermaterial
(Tonmineralien, Kieselgur)

10
von Saccharose zu erreichen. Die Erhöhung der Fruc-
tosekonzentration wird durch chromatographische
Anreicherung erzielt.
Im Laufe der Jahre wurden einige verschiedene
D-Xylose-Isomerase-Immobilisate kommerziell
vertrieben. In den letzten Jahren kam es zu einer
Marktkonsolidierung, sodass momentan die Pro-
dukte GENSWEET® und Sweetzyme® den Markt
beherrschen (. Tab. 10.5) [19].
Die immobilisierten Enzyme werden in paral-
lelen Festbettreaktoren eingesetzt, die aufgrund der
fortschreitenden Deaktivierung der Enzyme indi-
viduell erneuert werden. . Abb. 10.12 zeigt einen
Überblick über die HFCS-Produktion. Vor der
Isomerisierung muss der Glucosesirup in mehre-
ren Schritten gereinigt werden, um ein Zusetzen
der Festbettreaktoren zu verhindern und Substan-
zen zu entfernen, die inhibierend auf die Isomerase
wirken. Da D-Xylose-Isomerasen divalente Katio-
nen für maximale Stabilität und Aktivität benöti-
gen, wird vor dem Eintritt in die Festbettreaktoren
MgSO4 zugegeben. Mit Hilfe von Natriumcarbonat
wird der pH der Lösung auf Werte zwischen pH 7,5
und pH 8,0 eingestellt.
10.2.3 Enzymatische Umesterung
Fette und Öle sind Esterverbindungen zwischen dem
dreiwertigen Alkohol Glycerin und drei langkettigen,
gesättigten und/oder ungesättigten Monocarbonsäu-
ren, den Fettsäuren. Die physikalischen Eigenschaften
eines Triglycerids werden durch die Kettenlängen und
durch die Häufigkeit von C=C-Doppelbindungen in
den Fettsäureresten beeinflusst. Doppelbindungen in
natürlichen Fetten und Ölen besitzen fast ausschließ-
lich cis-Konfiguration. Ungesättigte Fettsäuren mit
Doppelbindungen in der trans-Konfiguration treten
hingegen in besonderem Maße in industriell gefertig-
ten Lebensmitteln auf. Gesundheitlich bedenkliche
trans-Fette entstehen vor allem bei der Herstellung
(halb)fester Fette mit bestimmten Schmelzeigenschaf-
ten, wie Margarine oder Backfette. Hauptursache ist
dabei die Fetthärtung durch katalytische Hydrierung
mit Hilfe von Nickelkatalysatoren. Aus diesem Grund
werden teilgehärtete Fette in zunehmendem Umfang
durch umgeesterte Fette ersetzt [56].
Im Vergleich zur chemischen Umesterung mit
Hilfe von Natriummethylat erlaubt die enzymati-
sche Umesterung mit Hilfe von sn-1,3-spezifischen
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
419 10
. Abb. 10.12  Prozessschema
zur Herstellung von High
Fructose Corn Sirup (HFCS): Nach
der Stärkeverzuckerung und
Konditionierung der Glucoselösung
(400–500 g L–1) erfolgt die teilweise
Glucoseisomerisierung mit Hilfe
immobilisierter D-Xylose-Isomerase
in parallelen Festbettreaktoren
(rot). Um eine gleichbleibende
Produktqualität mit 42 % Fructose
trotz kontinuierlicher Deaktivierung
der Enzymimmobilisate (Halbwertzeit
~ 100 Tage) zu erzielen, werden
die parallel angeordneten
Festbettreaktoren (Höhe 4–8 m,
Druckverlust bis 3 bar) zeitlich versetzt
in Betrieb genommen. Nach jeweils
rund 3 Monaten Betrieb müssen
die Festbettreaktoren mit neuem
D-Xylose-Isomerase-Immobilisat
beladen werden

Lipasen eine deutlich bessere Kontrolle über die
Produktzusammensetzung, wie . Abb. 10.13 zeigt.
Im Gegensatz zu unspezifischen Lipasen tauschen
sn-1,3-spezifische Lipasen die Fettsäure an der sn-2
Position aufgrund sterischer Hinderung nicht aus.
Bei langen Reaktionszeiten kann es jedoch durch int-
ramolekulare Umlagerungsreaktionen von Diglyce-
rid-Intermediaten auch zu Modifikationen an der sn-
2-Position kommen [73].
Es gibt mittlerweile verschiedene industrielle
Produktionsprozesse, die enzymatische Umeste-
rungen mit sn-1,3-spezifischen Lipasen zur Her-
stellung trans-freier Fette durchführen. Insgesamt
werden zurzeit 10 5 Tonnen Speisefette pro Jahr
durch enzymatische Umesterung hergestellt [19].
Ein häufig verwendeter Biokatalysator ist die Lipase
aus dem thermophilen Pilz Thermomyces lanugino-
sus, die durch eine Kombination aus Adsorption auf
 420 K. Castiglione und D. Weuster-Botz

3 6 Silica-Partikeln und Granulierung mit Hilfe eines

2  2 organischen Binders immobilisiert wird (Lipozyme®
3 6 TL IM von Novozymes) [16]. Dieses immobilisierte
Enzym wird unter anderem von der Archer Daniels
1DWULXPPHWK\ODW Midland Company (ADM) in Festbettreaktoren zur
VQVSH]LILVFKH RGHU
/LSDVH XQVSH]LILVFKH
Herstellung von trans-freien Fetten für Margarine
/LSDVH und Backfette eingesetzt [19].

3 6 3 3 6 2 10.2.4 Herstellung von

2 2 2 3 6 2 6-Aminopenicillansäure
3 6 6 3 6 2
3 6 2
Antibiotisch wirksame Substanzen, die sich struk-
3 6 2
turell von der 6-Aminopenicillansäure ableiten,
2 2 3 werden als Penicilline bezeichnet. Neben natürli-
3 6 2
chen Penicillinen, wie beispielsweise dem 1928 von
2 2 3
Alexander Fleming entdeckten Penicillin G aus dem
3 6 2 Schimmelpilz Penicillium chrysogenum, sind teilsyn-
3 6 2
thetische Penicilline, wie unter anderem Ampicil-
3 6 2
lin und Amoxicillin, von großer Bedeutung für die
6 3 6 Behandlung verschiedener bakterieller Infektionen.
3 6 2
Die Synthese erfolgt ausgehend von der 6-Amino-
10 6 3 6
penicillansäure, die durch die enzymatische Hydro-
3 6 2 lyse von Penicillin G durch eine Penicillin-Amidase
3 6 2
(EC 3.5.1.11) gewonnen werden kann (. Abb. 10.14).
2 3 6
In der Regel wird eine kovalent immobilisierte
6 2 3 Penicillin-Amidase aus Alcanigenes faecalis, Bacil-
lus megaterium oder Escherichia coli verwendet. Es
. Abb. 10.13  Produkte der Umesterung zweier können unterschiedliche Trägermaterialien zum
verschiedener Triglyceride mit Hilfe von chemischer Katalyse Einsatz kommen [9]. Ein Beispiel sind epoxy-funk-
oder einer unspezifischen Lipase im Vergleich zu einer
tionalisierte Acrylate (Eupergit C) [40]. Der Prozess
sn-1,3-spezifischen Lipase. S: Stearinsäure, O: Ölsäure, P:
Palmitinsäure. Modifizierte Abbildung nach [73]
wird von verschiedenen Firmen unter anderem in
repetitiven Satzverfahren durchgeführt, wobei die
immobilisierten Enzyme durch geeignete Siebe
zurückgehalten werden [40]. Aufgrund der ent-
stehenden Säuren ist die Kontrolle des pH durch

. Abb. 10.14  Herstellung von 6-Aminopenicillansäure

Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
Basenzugabe wichtig, da der Gleichgewichtsumsatz
bei einem pH < 7,5 niedrig ist. Bei einem pH > 9 hin-
gegen sind die Substrate und Produkte nicht stabil.
Der Umsatz liegt im Bereich von 98–99 %, die Aus-
beute bei 86–93 % [9].
10.3 Enzymeinschluss
Bei der Einschlussimmobilisierung erfolgt die
Verweilzeitentkopplung löslicher Enzyme entwe-
der durch Mikroverkapselung oder mit Hilfe von
Enzymmembranreaktoren. Der Begriff „Mikrokap-
sel“ ist definiert als „hohles Mikropartikel, bestehend
aus einer festen Hülle, die einen Kern-bildenden
Raum umgibt, der dauerhaft oder temporär einge-
schlossenen Substanzen zur Verfügung steht“ [71].
Die Techniken zur Mikroverkapselung können noch
weiter unterteilt werden in solche, bei denen eine
wirkliche Kern-Hülle-Verkapselung erfolgt, wie bei-
spielsweise beim Einschluss in Liposomen, und in
Matrixverkapselungen, bei denen der Einschluss
durch die Ausbildung von polymeren Netzwerken
realisiert wird. Für Anwendungen in enzymatischen
Prozessen sind Matrixverkapselungen wesentlich
bedeutender als Kern-Hülle-Verkapselungen, wes-
wegen im Folgenden nur auf den ersten Aspekt ein-
gegangen wird.
10.3.1 Mikroverkapselung und
Membranen
Es wurden verschiedene Methoden für die Mikrover-
kapselung von Enzymen in organischen oder anorga-
nischen Polymernetzwerken entwickelt, jedoch ist die
Verwendung von Hydrogelen und Silica-Sol-Gelen
am weitesten verbreitet. Gerade bei der Verwendung
von polymeren Netzwerken ist die Abgrenzung zur
Trägerfixierung (7 Abschn. 10.2) häufig nicht scharf.
Der wesentliche Unterschied ist, dass bei der Trägerfi-
xierung vorgefertigte Materialien verwendet werden,
während sich das Polymernetzwerk beim Enzymein-
schluss erst in Gegenwart des Enzyms bildet [64].
Hydrogele sind Netzwerke aus quervernetzten
Polymeren, die sehr stark hydrophile Polymerkom-
ponenten enthalten, weswegen sie in Wasser unter
421 10
beträchtlicher Volumenzunahme quellen. Verwen-
dete Materialien umfassen sowohl synthetische Poly-
mere wie Polyvinylalkohol (PVA) und Polyethylen
imin (PEI) als auch natürliche Polymere wie Chi-
tosan oder Alginat. Die synthetischen Polymere
zeichnen sich dabei durch eine höhere chemische
und mechanische Stabilität sowie eine höhere Resis-
tenz gegenüber mikrobiellem Abbau aus [61]. Für
die Synthese von PVA-Hydrogelen unter milden
Bedingungen wird häufig eine Mischung aus PVA
und Polyethylenglykol verwendet, mit der soge-
nannte LentiKats, linsenförmige Hydrogelpartikel
mit Durchmessern zwischen 3 und 4 mm und einer
Dicke zwischen 200 und 400 µm, hergestellt werden
können [36]. Starke Diffusionslimitierungen von
hydrophilen Substraten spielen bei Hydrogelen nur
in Ausnahmenfällen eine Rolle [61]. Während Hyd-
rogele häufig für die Immobilisierung von Zellen ver-
wendet werden, werden sie seltener für die Immo-
bilisierung von Enzymen eingesetzt. Das liegt vor
allem daran, dass die meisten Enzyme zu klein
sind, um effektiv zurückgehalten zu werden. Um
dem Katalysatorverlust entgegenzuwirken, werden
Enzyme entweder vor der Verkapselung quervernetzt
(7 Abschn. 10.1) oder die Hydrogele werden in orga-
nischen Lösemitteln verwendet, was die Vergröße-
rung der Gelporen durch Schwellung verhindert
[61].
Der Einschluss von Enzymen in hochporö-
sen Silica-Sol-Gelen erfolgt meist durch die hyd-
rolytische Polymerisierung von Tetraalkoxysilanen
(Si(OR)4), wie Tetramethylorthosilicat (TMOS) oder
Tetraethylorthosilicat (TEOS) (.Abb. 10.15). Zur
Erzeugung hydrophober Gele werden Alkoxysilane
der Form XSi(OR)3 verwendet, wobei X für einen
hydrophoben organischen Rest steht.
Die erhaltenen Silica-Sol-Gele können vor der
Verwendung getrocknet werden. Die Trocknungs-
methode hat einen entscheidenden Einfluss auf die
Gel-Morphologie. Man unterscheidet dabei Xero-
gele, Aerogele und Ambigele [61]:
55 Xerogele: Trocknung hydrophiler Gele durch
Evaporation (Raumtemperatur), Kontraktion
der Poren (typischerweise um 70 %)
55 Aerogele: Trocknung hydrophober oder
hydrophiler Gele durch überkritisches CO2,
unveränderte Porenstruktur
 422 K. Castiglione und D. Weuster-Botz
. Abb. 10.15  Für die Herstellung
von hydrophilen Silica-Sol-Gelen
häufig verwendete Tetraalkoxysilane
55 Ambigele: Trocknung hydrophober Gele durch
Evaporation (Raumtemperatur), unveränderte
Porenstruktur
Eine alternative Methode für die Enzymimmobilisie-
rung durch Einschluss in Polymernetzwerken ist die
Verwendung von semipermeablen Membransyste-
men. Im Gegensatz zu den beschriebenen Hydroge-
10 len und Sol-Gelen haben Enzymmembranreaktoren
auch schon breitere Anwendung in industriellen Pro-
zessen gefunden. Enzymmembranreaktoren werden
dabei in der Regel konvektiv betrieben, da der diffu-
sive Betrieb aufgrund der Langsamkeit von Diffu-
sionsprozessen zu deutlich niedrigeren Produktivi-
täten führt (. Abb. 10.16).
Es gibt unterschiedliche Konfigurationen kon-
vektiv betriebener Membranreaktoren. Bei der
Verwendung von Rührkesselreaktoren können die
Enzyme entweder innerhalb des Reaktors durch eine
Membran zurückgehalten oder in einem externen
. Abb. 10.16  Prinzipskizzen der konvektiven (a) und diffusiven (b) Betriebsweise von Enzymmembranreaktoren (EMR). Die
Membran ist jeweils rot gekennzeichnet. S: Substrat, E: Enzym, P: Produkt
Membranmodul von der Reaktionslösung abge-
trennt und in den Reaktor zurückgeführt werden, wie
. Abb. 10.17 zeigt. Externe Membranmodule sind
wegen der bedeutend größeren Membranfläche
meist vorzuziehen und können auch mit anderen
Reaktortypen kombiniert werden, wie beispielsweise
mit Rohrreaktoren oder Rührkesselreaktorkaskaden.
Membranmodule sind prinzipiell in unterschied-
lichen Konfigurationen erhältlich, bei isolierten
Enzymen werden jedoch zumeist Hohlfasermodule
verwendet [9].
Für die effiziente Rückhaltung von Enzymen
kommen Ultrafiltrationsmembranen zum Einsatz,
die durch die jeweilige Größenausschlussgrenze cha-
rakterisiert sind. Bei den meisten Membranherstel-
lern ist sie definiert als die molekulare Masse, bei
der mindestens 90 % eines gelösten Stoffes von der
Membran zurückgehalten werden. Das Rückhalte-
vermögen, die sogenannte Retention, wird wie folgt
berechnet (siehe auch 7 Abschn. 9.3.1):
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
cRetentat/c5HWHQWDW
. Abb. 10.17  Rührkesselreaktoren mit integrierter
Membran (a) oder externem Membranmodul (b). Die
Membran ist jeweils rot gekennzeichnet. S: Substrat, E: Enzym,
P: Produkt
c − cPermeat
R = Retentat  Gl. 10.10
cRetentat
Hierbei stehen cRetentat und cPermeat für die Konzen-
trationen des zurückzuhaltenden Stoffes im Reten-
tat beziehungsweise Permeat. Der Katalysatorverlust
in einem kontinuierlichen Prozess in einem Mem-
branreaktor kann mit Hilfe von Gl. 10.11 berechnet
werden:
cRetentat
= e−(1−R)⋅ N  Gl. 10.11
cRetentat,0
cRetentat,0 entspricht der anfänglichen Katalysator-
konzentration und N der Anzahl an mittleren hyd-
raulischen Verweilzeiten, die man durch Division der
Prozesszeit t durch die mittlere hydraulische Verweil-
zeit τ erhält:
t
N=  Gl. 10.12
τ
. Abb. 10.18 zeigt den Katalysatorverlust über die
Membran in Abhängigkeit des Rückhaltevermö-
gens der Membran und der Anzahl der Verweilzei-
ten. Würde man für die Rückhaltung eines Enzyms
eine Membran einsetzen, deren Größenausschluss-
grenze der molekularen Masse des Proteins ent-
spricht (R = 0,900), wäre nach sieben Verweilzei-
ten die Hälfte des Biokatalysators ausgewaschen.
Um eine effektive Rückhaltung des Biokatalysators
423 10

5 


5 

5 

5 

      
1
. Abb. 10.18  Relative Katalysatorkonzentration im
Retentat in Abhängigkeit vom Rückhaltevermögen R und der
Anzahl der Verweilzeiten N
zu gewährleisten sollte die Retention deutlich über
99 % liegen.
10.3.2 Asymmetrische Synthese
von (R)-2-Hydroxy-4-
phenylbuttersäure im
Enzymmembranreaktor
(R)-2-Hydroxy-4-phenylbuttersäure ist ein wichti-
ges Intermediat in der Synthese von Inhibitoren des
Angiotensin-konvertierenden Enzyms (Angioten-
sin Converting Enzyme, ACE). Dieses Enzym ist Teil
des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems, das den
Blutdruck im menschlichen Körper reguliert. ACE-
Hemmer werden daher als Therapeutika zur Behand-
lung von Bluthochdruck, chronischer Herzinsuffi-
zienz und koronaren Herzerkrankungen eingesetzt.
(R)-2-Hydroxy-4-phenylbuttersäure kann durch
enantioselektive Reduktion von 2-Oxo-4-phenylbut-
tersäure mit Hilfe einer NADH-abhängigen D-Lac-
tatdehydrogenase (EC 1.1.1.28) aus Staphylococcus
epidermis hergestellt werden. Da eine stöchiomet-
rische Zugabe des teuren Cofaktors NADH unwirt-
schaftlich wäre, wird eine Formiatdehydrogenase
(EC 1.2.1.2) aus Candida boidinii zur Cofaktorrege-
nerierung eingesetzt, die das kostengünstige Cosubs-
trat Formiat zu Kohlendioxid umsetzt. . Abb. 10.19
gibt einen Überblick über das Reaktionssystem.
 424 K. Castiglione und D. Weuster-Botz

2 2+
2+ '/'+ 2+

2 2

2[RSKHQ\OEXWWHUV¦XUH 1$'+
&2
)'+
. Abb. 10.19  Zwei-Enzym-System zur biokatalytischen Produktion von (R)-2-Hydroxy-4-phenylbuttersäure. D-LDH:
D-Lactatdehydrogenase, FDH: Formiatdehydrogenase
Die Ciba Spezialitätenchemie AG (heute BASF
Schweiz AG) hat diesen Biotransformationsprozess
unter Nutzung eines Enzymmembranreaktors indus-
trialisiert. Hierbei ist ein kontinuierlich betriebener
Rührkesselreaktor mit einem externen Membran-
modul im Einsatz. Eine Ultrafiltrationsmembran mit
10 einer Größenausschlussgrenze von 10.000 Dalton
sorgt für die Rückhaltung der Enzyme, während der
Cofaktor (665 Dalton) die Membran passieren kann
und folglich aus dem Reaktor ausgetragen wird. Bei
einer mittleren Verweilzeit von 4,6 h wird jedoch eine
total turnover number (Mol Produkt pro Mol Cofak-
tor) von TTN = 103 erreicht, was die Voraussetzung
für einen ökonomischen Cofaktoreinsatz ist. Bei chi-
ralen Produkten ist der erzielte Enantiomerenüber-
schuss (ee) ein besonders wichtiges Gütekriterium
für einen Prozess. Er ist wie folgt definiert:
nE1 − nE2
ee = ⋅100 %  Gl. 10.13
nE1 + nE2
wobei nE1 und nE2 für die Stoffmengen der beiden
Enantiomere (mol) stehen. Bei einem racemischen
Gemisch liegt ein Enantiomerenüberschuss von 0 %
vor, während eine enantiomerenreine Verbindung
einen Enantiomerenüberschuss von 100 % aufweist.
Industrielle Biotransformationen sollten als generelle
Richtlinie einen Produkt-Enantiomerenüberschuss
von mindestens 99 % erzielen. Bei der enzymati-
schen Synthese von (R)-2-Hydroxy-4-phenylbut-
tersäure liegt der Enantiomerenüberschuss des Pro-
dukts bei 99,9 % (R) bei einem Umsatz von 91 % und
einer Raum-Zeit-Ausbeute von 165 g L–1 d–1. Durch
1$' 5+\GUR[\SKHQ\OEXWWHUVlXUH
+&22ದ
weitere (unveröffentlichte) Prozessoptimierungen
konnte die Raum-Zeit-Ausbeute noch weiter auf
400 g L–1 d–1 gesteigert werden [40, 22].
10.3.3 Herstellung von L-Methionin im
Enzymmembranreaktor
L-Methionin ist eine essentielle, proteinogene Ami-
nosäure, die in enantiomerenreiner Form unter
anderem für Infusionen und als Nahrungsergän-
zungsmittel bei bestimmten Erkrankungen wie
Leberstörungen oder Harnwegsinfekten benötigt
wird. Obwohl der Großteil der proteinogenen Ami-
nosäuren heutzutage fermentativ produziert wird, ist
die Herstellung von L-Methionin im Enzymmem-
branreaktor unter Nutzung einer Aminoacylase
(N-Acyl-aliphatische-L-Aminosäureamidhydrolase,
EC 3.5.1.14) aus Aspergillus oryzae kosteneffizienter
[39]. Ausgangsstoff ist N-Acetyl-D,L-Methionin,
das durch Acetylierung des Aminosäureracemats
in einer Schotten-Baumann-Reaktion gewonnen
werden kann (. Abb. 10.20a). Die Aminoacylase
spaltet selektiv das N-Acetyl-L-Methionin, während
das D-Enantiomer unangetastet bleibt. Ein derartiges
Trennverfahren, das auf der unterschiedlichen Reak-
tivität eines Enzyms gegenüber zweier Enantiomere
basiert, wird als kinetische Racematspaltung bezeich-
net. Für die Rückhaltung des Enzyms wird eine Ult-
rafiltrationsmembran aus Polyamid mit einer Grö-
ßenausschlussgrenze von 10.000 Dalton verwendet.
Die freie Aminosäure kann durch Kristallisation
(siehe 7 Abschn. 9.3.2) abgetrennt werden, da sie eine
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
425 10
D
2
2 2
 1D2+ 6
6  2+
2+ &O ದ 1D&O
+1 2
1+ ದ +2

'/0HWKLRQLQ $FHW\OFKORULG 1$FHW\O'/0HWKLRQLQ

E
2 LPPRELOLVLHUWH 2
$PLQRDF\ODVH 2
6 6 2
2+ (05 2+ 6
2+ 
+1 2 +1 2 2+
1+

N-Acetyl-D,L-Methionin 1$FHW\O'0HWKLRQLQ /-Methionin Essigsäure

5DFHPLVLHUXQJ
$EWUHQQXQJ GXUFK
.ULVWDOOLVDWLRQ

. Abb. 10.20  Herstellung von L-Methionin. (a) Synthese des Ausgangsmaterials durch eine Schotten-Baumann-Reaktion.
Als Alternative zum Acetylchlorid kann auch Essigsäureanhydrid verwendet werden. Die Reaktion ist nur unter Basenzugabe
(hier: NaOH) möglich. (b) Kinetische Racematspaltung des N-Acetyl-D,L-Methionins zur Gewinnung von enantiomerenreinem
L-Methionin

signifikant geringere Löslichkeit besitzt als das Subs-
trat. Im Anschluss wird das verbleibende N-­Acetyl-
D-Methionin mit Hilfe einer Racemase oder che-
misch isomerisiert und erneut als Substrat eingesetzt
(. Abb. 10.20b).
Das beschriebene Verfahren wurde von der
Degussa AG (heute Evonik) etabliert und wird zur
Synthese von mehreren hundert Tonnen L-Methio-
nin pro Jahr verwendet. Das Produkt wird mit einem
Enantiomerenüberschuss von 99,5 % bei einer Aus-
beute von 80 % und einer Raum-Zeit-Ausbeute von
592 g L–1 d–1 erhalten [40, 39].
10.4 Ganze Zellen
Die Verwendung von integralen Zellen (ganzen
Zellen) mit im Zytosol überexprimiertem Synthese-
enzym kann eine sehr effiziente Strategie zur Enzym-
immobilisierung sein. Kosten für die Isolierung, Auf-
reinigung und Immobilisierung des Syntheseenzyms
entfallen bis gegebenenfalls auf eine Fest-Flüssig
Trennung nach der Herstellung der Zellen im Bio-
reaktor völlig. Diese Kostenvorteile werden noch
weitaus bedeutender, wenn mehrere Syntheseen-
zyme gleichzeitig im Zytosol einer Zelle bereitge-
stellt werden können. Der Einsatz von Ganzzellbio-
katalysatoren ist darüber hinaus von Vorteil, wenn
Teile des natürlichen Stoffwechsels für die Synthe-
sereaktionen mitgenutzt werden können. Ein Bei-
spiel ist die Nutzung von in der Zelle vorhandenen
Transportmetaboliten wie beispielsweise NAD(P)H,
sodass diese nicht mehr zum Reaktionsansatz hinzu-
gefügt werden müssen.
Grundsätzlich ist zu unterscheiden zwischen
ruhenden und metabolisierenden Zellen bei einer
Biotransformation. Bei ersteren handelt es sich im
Grunde genommen um mikrobielle „Enzymsäcke“,
bei denen der Stoffwechsel der Ganzzellbiokatalysa-
toren inaktiv ist. Der Reaktionsansatz ist in der Regel
sehr einfach zusammengesetzt: Puffer und Subst-
rat. Meist ist noch nicht einmal ein sterilisierbarer
 426 K. Castiglione und D. Weuster-Botz
Bioreaktor für die Biotransformation erforderlich.
Damit können ruhende Zellen in der Regel zeitlich
und örtlich unabhängig von der Ganzzellbiokataly-
satorproduktion zum industriellen Einsatz kommen.
Metabolisierende Zellen im Biotransformations-
ansatz stellen dagegen sehr viel höhere Anforderun-
gen an das Reaktionssystem. Neben dem eigentlichen
enzymatisch umzusetzenden Substrat müssen alle
Substratkomponenten für die gewünschten Stoff-
wechsel(teil)reaktionen – beispielsweise auch Sauer-
stoff bei atmenden Zellen – bereitgestellt werden.
Häufig findet daher die Biotransformation gleich-
zeitig oder direkt im Anschluss an die Herstellung
der Ganzzellbiokatalysatoren in demselben Biore-
aktor statt, der für die Herstellung der Ganzzellbio-
katalysatoren genutzt wurde.
Nachteile bei der Verwendung von Ganzzell-
biokatalysatoren sind zum einen konkurrierende
Enzymaktivitäten nativer Enzyme in den Zellen
oder unerwünschte enzymkatalysierte Folgereak-
tionen. Hier kann in der Regel einfach durch Dele-
tion der entsprechenden nativen Enzyme Abhilfe
10 geschaffen werden. Zum anderen kann der Stoff-
transport von Substrat und/oder Produkt über die
Zellmembran geschwindigkeitslimitierend werden.
Eine Teilpermeabilisierung von Zellmembranen mit
Tensiden oder mit Wasser mischbaren organischen
Lösemitteln kann hier helfen. Dies führt jedoch auch
zur Freisetzung und damit Verdünnung zellinterner
Transportmetabolite. Ein gezielterer Ansatz ist die
Expression von spezifischen Transportproteinen bei
der Herstellung von Ganzzellbiokatalysatoren.
Im Folgenden werden beispielhaft zwei Pro-
zessbeispiele mit ruhenden Ganzzellbiokatalysato-
ren (7 Abschn. 10.4.1 und 10.4.4) und zwei Beispiele
mit metabolisierenden Zellen (7 Abschn. 10.4.2 und
10.4.3) dargestellt.
10.4.1 Biokatalytische Herstellung von
Acrylamid
Acrylamid ist eine Grundchemikalie, die zur Her-
stellung verschiedener wasserlöslicher Polymere
mit Anwendungen beispielsweise in der Erdöl-
förderung, Abwasserreinigung oder Papierher-
stellung und zur Herstellung verschiedener nicht
wasserlöslicher Polymere mit Anwendungen als
Superabsorber (Windeln) oder als Trägermate-
rial (Gelelektrophorese) verwendet wird. Acryl-
amid lässt sich durch Wasseranlagerung an Acryl-
nitril darstellen. Diese C-O-Knüpfung kann
entweder chemisch mit Hilfe von Kupferionen
als Katalysator oder enzymatisch mit einer Nitril-
hydratase erfolgen. Die Bildung verschiedener
Nebenprodukte, unerwünschte Teilpolymerisa-
tionen von Substrat und Produkt und der unvoll-
ständige Umsatz bei der chemischen Katalyse
führten zur Entwicklung und industriellen Rea-
lisierung verschiedener biokatalytischer Prozesse
zunächst bei Nitto Chemical Industry in Japan
[74]. Heute wird Acrylamid über Ganzzellbioka-
talyse mit Rhodococcus rhodochrous-Stämmen im
mehrere 100.000 Jahrestonnenmaßstab hergestellt
(siehe . Abb. 10.21), die eine Kobalt-abhängige
Acrylnitrilhydratase (H-NHase, EC 4.2.1.84) in
hohen Mengen enthalten (>50 % des zellinternen
löslichen Proteins). Um eine hohe Expression des
Nitrilhydratasegens zu erreichen, werden Harnstoff
als Induktor und Kobaltsalze zur Herstellung der
Rhodococcus rhodochrous Ganzzellbiokatalysatoren
im Zulaufverfahren mit Glucose als Kohlenstoff-
quelle eingesetzt [74, 35]. Die mit der Kobalt-abhän-
gigen Nitrilhydratase gefüllten Ganzzellbiokataly-
satoren werden nach der fermentativen Herstellung
über Fest-Flüssig-Trennung vom Medium abge-
trennt. Vor dem biokatalytischen Einsatz hat sich
eine Stabilisierung der ganzen Zellen in Polyacryl-
amid als sinnvoll erwiesen, um die Produktqualität
bei der Biotransformation mit ruhenden Zellen zu
verbessern (Reduktion der Färbung, der Trübung
und der Leitfähigkeit) [34].
Die biokatalytische Umsetzung von Acrylnitril
und Wasser findet im Zulaufverfahren mit den sta-
bilisierten Ganzzellbiokatalysatoren im Rührkessel-
reaktor bei niedrigen Temperaturen (<10 °C) statt,
da das gebildete Acrylamid bei höheren Tempera-
turen zur Polymerisation neigt. 400 g L–1 Acrylamid
lassen sich so innerhalb von 5 h mit einem Acryl-
nitril-Umsatz von über 99,99 % und einer Acryl-
amid-Ausbeute von ebenfalls über 99,99 % bei einer
Raum-Zeit-Ausbeute von fast 2000 g L–1 d–1 im
Rührkesselreaktor produzieren [74]. Nach Abtren-
nung der Ganzzellbiokatalysatoren kann die wässrige
Acrylamid-Produktlösung direkt ohne weitere Auf-
arbeitungsschritte (wie Entsalzung, Ultrafiltration
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
427 10

. Abb. 10.21  Schema zur biokatalytischen Herstellung von Acrylamid aus Wasser und Acrylnitril. Rhodococcus rhodochrous‑
Ganzzellbiokatalysatoren werden im Zulaufverfahren unter Expression von Nitrilhydratase hergestellt, durch Einschluss in
Polyacrylamid stabilisiert und als ruhende Zellimmobilisate zur Acrylamidsynthese bei niedrigen Reaktionstemperaturen im
Rührkesselreaktor eingesetzt. Die Produktlösung mit 400 g L–1 Acrylamid kann ohne weitere Aufreinigungsschritte direkt zur
Polyacrylamid-Herstellung genutzt werden

und Entfärbung) zur kommerziellen Polyacrylamid-
Herstellung eingesetzt werden [34].
In den letzten Jahren wurde vielfach versucht,
Nitrilhydratasen mit verschiedenen etablierten und
effizienten Expressionssystemen (Escherichia coli,
Pichia pastoris oder Corynebacterium glutamicum)
im Hochzelldichteverfahren rekombinant bereit-
zustellen, da die Ganzzellbiokatalysatorproduk-
tion mit Rhodococcus rhodochrous 3–5 Tage dauert
und dabei nur Zelldichten von 20–30 g L–1 Bio-
trockenmasse erreicht werden. Die biomassespe-
zifischen Nitrilhydrataseaktivitäten waren jedoch
bisher deutlich geringer als bei Rhodococcus rho-
dochrous [31].
10.4.2 Herstellung von optisch reinem
L-Carnitin
Marco Antonio Mirata und Diego Schmidhalter
L-Carnitin ist eine natürliche Verbindung, die aus
den Aminosäuren L-Lysin und L-Methionin in der
Leber synthetisiert wird. Die Verbindung spielt eine
essentielle Rolle beim Energiestoffwechsel im Mus-
kelgewebe von menschlichen und tierischen Zellen.
Langkettige Fettsäuren können die mitochondriale
Membran nicht direkt durchdringen. Verschiedene
Carnitin-Acyltransferasen aktivieren die Fettsäu-
ren durch kovalentes Binden an L-Carnitin. Die
Acyl-Carnitin Derivate werden anschließend mit-
hilfe von weiteren Enzymen in die mitochondriale
Matrix transportiert, wo die Fettsäure wieder freige-
setzt wird. In der Mitochondrienmatrix durchlau-
fen die Fettsäuren eine ß-Oxidation und erzeugen
Energie in Form von ATP [3]. Die zwei natürlichen
Quellen von L-Carnitin bei Menschen sind endo-
gene Synthese und Nahrungsaufnahme [47]. Im
Ernährungskontext wird L-Carnitin als vitamin-
ähnlicher Nährstoff eingestuft. Zudem wird L-Car-
nitin in der Kosmetik, Pharmazie und Medizin ein-
gesetzt [32].
In den 80er Jahren entwickelte Lonza einen vier-
stufigen chemischen Prozess für die Synthese von
L-Carnitin auf der Grundlage von billigen Rohstof-
fen wie Epichlorhydrin (. Abb. 10.22) [58].
Im ersten Schritt wird in einer Reaktion von Epi-
chlorhydrin mit Trimethylamin und L-Weinsäure in
Methanol rohes (S)-Bis[(3-Chlor-2-hydroxypropyl)-
trimethylammoniumchlorid] L-tartrat hergestellt,
das aus diesem Gemisch durch Zugabe von Aceton
kristallisiert wird. Umkristallisation mit Methanol
und Aceton liefert das reine Diastereomeren salz.
Durch Zugabe von wässerigem Natrium-Cyanid
 428 K. Castiglione und D. Weuster-Botz
. Abb. 10.22  Chemische Synthese von L-Carnitin ausgehend von Epichlorhydrin. DSP: down stream processing
entsteht das lösliche (R)-(3-Cyano-2-hydroxypropyl)
trimethylammoniumchlorid. Die Abtrennung des
L-Tartrats erfolgt mittels Calciumchlorid, wobei das
in Wasser unlösliche Calciumtartrat gebildet wird.
Abtrennung des Calciumtartrats, Einengen der lös-
lichen Fraktion, Trocknung des Rückstandes und
10 Umkristallisation aus Ethanol liefert (R)-(3-Cyano-
2-hydroxypropyl)-trimethylammoniumchlorid,
welches durch saure Hydrolyse mit Salzsäure in
L-Carnitin ((R)-3-Hydroxy-(trimethylammonium)-
butanoat) umgewandelt wird. Ein Aktivkohle- und
Anionenaustauschschritt reinigt das Produkt weiter
auf. Das Ionentauschereluat wird konzentriert und
in Isobutanol umkristallisiert. Die Gesamtausbeute
liegt bei 22 %.
Die Nachteile dieses Prozesses sind eine niedrige
Ausbeute, die Notwendigkeit die Weinsäure (2,3 kg/
kg L-Carnitin) zu rezyklieren, Lösungsmittelabfälle
im Umfang von 4,5 kg/kg L-Carnitin und ein D-Car-
nitin-Verunreinigungsanteil von 0,5 %. Es ist wün-
schenswert, L-Carnitin frei von D-Carnitin zu pro-
duzieren, da es mit L-Carnitin im aktiven Transport
konkurriert [58].
Obige Nachteile gaben den Anstoß zur Entwick-
lung des heutigen Biotransformationsprozesses, der
das prochirale 4-Butyrobetain in L-Carnitin umwan-
delt, dies bei hoher Konzentration und einem hohen
Enantiomerenüberschuss (ee). Die hohe Ausbeute,
völlig frei von D-Carnitin, vereinfacht die anschlie-
ßende Isolierung.
Chemisch gesehen wird γ-Butyrobetain in einer
Ein-Topf multi-biokatalytischen Kaskade, unter
milden Bedingungen (Temperatur, Druck) und
mit Wasser als Lösungsmittel, mit hoher Ausbeute
und hohem Enantiomerenüberschuss zu L-Carni-
tin umgewandelt. Hierbei handelt es sich um ein
Zulaufverfahren unter Verwendung von Agrobac-
terium/Rhizobium HK1349 als Ganzzellbiokataly-
sator. Dieser Stamm enthält vier Enzyme, die diese
Umwandlung katalysieren ( . Abb. 10.23 ). Nach
Aufnahme des γ-Butyrobetains durch die Zellen,
wird es durch das Enzym γ-Butyrobetain-CoA
Synthetase unter Bildung von γ-Butyrobetainyl-
CoA aktiviert. In einem zweiten Schritt führt die
γ-Butyrobetainyl-CoA Dehydrogenase eine Dop-
pelbindung in das Zwischenprodukt ein, wobei
Crotonyl-betainyl-CoA entsteht. Die zwei nachfol-
genden Schritte resultieren in einer regio- und ste-
reospezifischen Einführung einer Hydroxylgruppe
und der Freisetzung von L-Carnitin aus L-Carnitin-
CoA [37]. L-Carnitin wird mit einem Enantiome-
renüberschuss von mehr als 99,9 % gebildet und ins
Medium ausgeschieden. Dies ist ein sehr Energie-
und Cofaktor-intensiver Prozess, der lebende Ganz-
zellbiokatalysatoren benötigt, um den Energiebe-
darf für die Reaktionen und das Cofaktor-Recycling
sicherzustellen.
Nach der biokatalytischen Umsetzung werden
die Ganzzellbiokatalysatoren durch Ultrafiltra-
tion entfernt. Anschließend werden die Salze durch
Elektrodialyse (siehe 7 Abschn. 9.3.4.1) abgetrennt
und farbige Bestandteile und organische Verbin-
dungen mittels Aktivkohle abgereichert. Aufkon-
zentrieren und Trocknung liefert L-Carnitin für
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
429 10
. Abb. 10.23  Der Abbau von
Butyrobetain und Crotonobetain
durch den Wildtyp stamm
Agrobacterium/Rhizobium HK4. Im
Produktionsstamm ist die L-Carnitin-
Dehydrogenase deaktiviert, was
zur Anreicherung von L-Carnitin im
Medium führt [58]

Tierfutteranwendungen. Ein zusätzlicher Umkris-
tallisationsschritt in einem Isobutanol/Methanol
Gemisch liefert L-Carnitin für Lebensmittel- und
pharmazeutische Anwendungen. Die Umkristal-
lisation ist notwendig, um die Spezifikation für γ-­
Butyrobetain zu erreichen [25]. . Abb. 10.24 zeigt
alle Verfahrensschritte von γ-Butyrobetain bis zum
isolierten L-Carnitin.
Die Entwicklung dieses biokatalytischen Pro-
zesses begann mit der erfolgreichen Isolierung des
Stamms Agrobacterium/Rhizobium HK4. Hans
Kulla und seinem Lonza-Team gelang das Kunst-
stück, einen Mikroorganismus aus Bodenproben zu
isolieren und zu kultivieren, der die notwendigen
Enzyme enthält, die am Abbau von γ-Butyrobetain
über L-Carnitin-CoA und den Tricarbonsäurezy-
klus beteiligt sind. Logischerweise produziert der
Wildtyp nur Spuren von L-Carnitin. Eine Muta-
tion war erforderlich, um die L-Carnitin Dehydro-
genase zu inaktivieren, die das gebildete L-Carni-
tin in der Zelle weiter metabolisiert (. Abb. 10.23).
Diese Veränderung allein erlaubt aber noch keine
 430 K. Castiglione und D. Weuster-Botz
10
. Abb. 10.24  Verfahrensschritte zur Produktion von
L-Carnitin aus γ-Butyrobetain [46]
hohe Produkt-Anreicherung in der biokatalyti-
schen Umsetzung. Der Stamm wurde einem wei-
teren Stammentwicklungsprogramm unterzogen
mit dem Ziel eine hohe Produktkonzentrations-
Toleranz bei gleichzeitig hoher γ-Butyrobetain-
-Affinität zu gewährleisten. Dies erlaubt eine
. Tab. 10.6  Vergleich des kontinuierlichen Prozesses mit Zell-Rezyklierung mit dem Zulaufverfahren für die
Konvertierung von γ-Butyrobetain zu L-Carnitin [58]
Parameter
Volumetrische Produktivität (g/(L · d))
Ausbeute der Biokonversion (mol %)
Enantiomerenüberschuss (ee)
D-Carnitin
Kosten der Ganzzellbiotransformation und Isolierung von
L-Carnitin (Kennzahl ohne Einheit)
quantitative Umwandlung von großen Mengen von
γ-Butyrobetain und resultiert in einem wirtschaftlich
tragfähigen Prozess [37].
Ursprünglich wurde ein kontinuierlicher Prozess
mit Zellrezyklierung entwickelt, der eine hohe volu-
metrische Produktivität (Raum-Zeit-Ausbeute) unter
Ausnutzung des Erhaltungsstoffwechsels ermöglichte.
Hohe metabolische Aktivität bei niedriger Wachs-
tumsrate stellt sicher, dass die Energie, die für den
eigentlichen biokatalytischen Prozess erforderlich
ist, nicht zur Produktion von Biomasse verschwen-
det wird [58]. Der Nachteil dieses kontinuierlichen
Verfahrens ist die unvollständige Umsetzung von γ-
Butyrobetain (Ausbeute 92 %). Da L-Carnitin und γ-
Butyrobetain ähnliche physio-chemische Eigenschaf-
ten haben, beeinträchtigt die notwendige Trennung
von L-Carnitin und γ-Butyrobetain die Prozessöko-
nomie erheblich (. Tab. 10.6).
Als wirtschaftlichere Alternative erwies sich die
Entwicklung des Zulaufverfahrens, das zwar eine
viermal geringere volumetrische Produktivität,
dafür aber eine Ausbeute von >99 % aufweist [25,
46, 75]. Das entwickelte Zulaufverfahren integriert
darüber hinaus upstream- und downstream-Aspekte
optimal. Dies war ein weiterer wichtiger Aspekt, um
einen wirtschaftlichen und umweltfreundlichen Pro-
duktionsprozess zu erreichen. Beispielsweise resul-
tierte der Austausch der für die pH-Kontrolle im bio-
katalytischen Prozess verwendeten Phosphorsäure
durch Schwefelsäure in einer höheren Effizienz des
Elektrodialyse-Schritts, da für die Entfernung der
Sulfatsalze 30 % weniger Zeit aufgewendet werden
muss als für Phosphatsalze. Der Austausch von γ-
Butyrobetain und Glycerin (Kohlenstoffquelle)
technischer Qualität durch reinere Substrate im
Kontinuierlicher Prozess mit Zulaufverfahren
Zell-Rezyklierung
130 30
92 99,5
>99.9 % >99.9 %
Nicht nachweisbar Nicht nachweisbar
100 60
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
Reaktionsmedium reduziert gefärbte Komponen-
ten und führt zu Kosteneinsparungen bei der Ent-
färbung im Aktivkohleschritt.
Die im Zulaufverfahren erreichte Zunahme der
Ausbeute und die Änderungen in der Qualität der
Rohstoffe hatten zur Folge, dass auf einen Kristal-
lisationsschritt, der vorher auch für L-Carnitin für
Futtermittel-Anwendungen notwendig war, ver-
zichtet werden konnte. All diese Verbesserungen
führten konsequenterweise auch zu deutlich redu-
zierteren Produktionskosten [25, 46, 75] (siehe
. Tab. 10.6).
Von großer Bedeutung war die ganzheitliche
(holistische) Vorgehensweise bei der Prozessent-
wicklung und -optimierung, die Verbesserungen
bei der chemischen Synthese von γ-Butyrobetain,
Verbesserung der Stammeigenschaften (Ganzzell-
biokatalysator), Verbesserung der Qualität der kri-
tischen Mediumskomponenten, Änderungen in der
biokatalytischen Prozessführung von kontinuierli-
cher Betriebsweise zu einem Zulaufverfahren und
Optimierungen in der Produktisolierung umfasste.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Lonza-Pro-
zessentwicklungsexperten hier ein Biotransforma-
tionsverfahren entwickelt haben, das vier Biotrans-
formationsschritte mit einem Ganzzellbiokatalysator
in einem Bioreaktor bei hoher Raum-Zeit-Ausbeute
erlaubt. Die Reduktion von Verfahrensschritten
(engl. unit operations) bei der Produktisolierung bei
gleichzeitiger Reduktion von Abfallströmen wirkt
sich sehr positiv auf Prozessökologie und Prozess-
ökonomie aus.
10.4.3 Biotransformation von
2,5-Di-Methylpyrazin zu
5-Methyl-2-pyrazincarbonsäure
(MPCA)
Diego Schmidhalter und Marco Antonio Mirata
Voraussetzung für eine erfolgreiche Prozessent-
wicklung ist ein gutes Verständnis der metaboli-
schen Abläufe und der Zusammenhänge zwischen
prozessrelevanten Parametern, wobei sowohl Pro-
duktivitätsaspekte als auch Produktqualitätsaspekte
im Auge behalten werden müssen. Aufbauend auf
diesem Wissen kann dann ein Prozessmodell erstellt
431 10
werden, das wiederum die Grundlage für die Ent-
wicklung einer spezifischen Prozesskontrollstrate-
gie liefert (siehe 7 Kap. 8). Teil der Kontrollstrategie
sind unter anderem auch die on-line-Bestimmung
relevanter Prozessgrößen in Kombination mit
at-line-Bestimmungen der Konzentrationen des
Eduktes, von Zwischenprodukten, Metaboliten und
des Produkts.
Dies soll am Beispiel der selektiven Oxidation
einer Alkylgruppe an einem Heteroaromaten zur
entsprechenden Monocarboxylsäure aufgezeigt
werden [4]. Das Produkt 5-Methyl-2-pyrazincar-
bonsäure (MPCA) dient als chemischer Baustein
für die Herstellung von Pharmazeutika wie das blut-
zuckersenkende Glipizid zur Behandlung von Dia-
betes mellitus Typ 2. Die Ganzellbiotransforma-
tion von 2,5-Dimethylpyrazin (DMPy) zu MPCA
nutzt die auf dem TOL-Plasmid kodierten Oxida-
tionseigenschaften von Pseudomonas putida mt-2
(. Abb. 10.25). Das Edukt DMPy wird durch die glei-
chen katabolen Enzyme transformiert, wie die ein-
gesetzte Kohlenstoffquelle Xylol.
Ein Prozessmodell für die Ganzzellbiotransfor-
mation von DMPy zu MPCA durch P. putida muss
nachfolgende Elemente berücksichtigen:
A. Xylol ist notwendig für die Induktion der
gewünschten Enzyme und wird im beschrie-
benen Verfahren als einzige Kohlenstoff- und
Energiequelle eingesetzt.
B. Die Biotransformation funktioniert nur mit
physiologisch aktiven, wachsenden Zellen.
Wachstum und Biotransformation sind
gekoppelt und müssen kontrolliert parallel
verlaufen, wobei die Kohlenstoff- und Energie-
quelle Xylol und das Edukt DMPy kompetitiv
die Bindungsstellen der ersten drei Enzyme
des oberen Toluol-Abbauweges besetzen
(. Abb. 10.25). Im Gegensatz zu p-Toluylsäure
[48] ist MPCA kein Substrat für das erste
Enzym des weiteren Abbaus, dessen Gene
ebenfalls auf dem TOL-Plasmid lokalisiert sind.
C. Xylol ist in wässrigen Medien kaum löslich.
Bei Ausbildung einer zweiten Phase (im
100 mg/L Bereich) zeigt Xylol toxische Wirkung
auf die Zellen. Auch das Edukt DMPy mit
einer Inhibierungskonstante KI,DMPy im g
L–1-Bereich und das Produkt MPCA mit
einer Inhibierungskonstante KI,MPCA im
 432 K. Castiglione und D. Weuster-Botz

. Abb. 10.25  (a) Xylol/Toluol-Abbauweg von Pseudomonas putida mt-2. Xylol wird über p-Toluylalkohol
(4-Methylbenzylalkohol) und p-Toluylaldehyd (4-Methylbenzaldehyd) zur p-Toluylsäure (4-Methylbenzoesäure) oxidiert.
XMO, Xylolmonooxygenase; BADH, Benzylalkoholdehydrogenase; BZDH, Benzaldehyddehydrogenase. (b) Biotransformation
des substituierten aromatischen N-Heterozyklus 2,5-Dimethylpyrazin (DMPy). Im Gegensatz zu p-Toluylsäure ist 5-Methyl-2-
pyrazincarbonsäure (MPCA) kein Substrat für das erste Enzym des weiteren Abbaus

zweistelligen g L–1-Bereich beeinträchtigen die

physiologischen Funktionen von Pseudomonas
10 putida. Dies zeigt sich darin, dass die Biotrans-
formation bei Überschreitung der kritischen
Konzentrationen insbesondere von Xylol abrupt
zusammenbricht. Sequentielle MPCA-Zugaben
zeigten eine Beeinträchtigung der Biotrans-
formationsaktivität bei Konzentrationen um
20 g L–1. Werden die Zellen langsam an eine
zunehmende MPCA-Konzentration herange-
führt, wie das während der Biotransformation
der Fall ist, dann adaptieren sich die Zellen auch
an weitaus höhere Konzentrationen.
Diese Erkenntnisse führen zu zwei Schlussfolge-
rungen: (1) Biomasseproduktion und Ganzzellbio-
transformation müssen simultan verlaufen und (2)
die Konzentrationen von Xylol und DMPy müssen
sorgfältig kontrolliert werden. Rohner und Meyer
zeigten auf, wie diese Kenntnisse in ein numeri-
sches Prozessmodell, als Voraussetzung für eine
in-silico-Prozessmodellierung, umgesetzt werden
können [60].
Als Induktor, Kohlenstoff- und Energiequelle
ist Xylol eine notwendige Mediumskomponente.
Aufgrund ihrer inhibierenden Wirkung müssen
sowohl Xylol als auch DMPy kontrolliert in einem
Zulaufverfahren zudosiert werden. Als Leitpara-
meter bietet sich die Gelöstsauerstoffkonzentra-
tion gemessen als Sauerstoffpartialdruck pO 2
an, da sowohl die Metabolisierung von Xylol und
als auch die Transformation von DMPy Sauer-
stoff verbrauchen. Sobald genügend Biomasse
im Rührkesselreaktor vorhanden ist, wird Xylol
über eine spezielle „PID ein/aus“-Regelung (siehe
7 Kap. 8) mit dem pO2 als Eingangssignal kontrol-
liert zudosiert (. Abb. 10.26). Übersteigt der pO2
einen oberen Grenzwert, wird die Dosierung von
Xylol gestartet, was Sauerstoffverbrauch und eine
Erniedrigung des pO2 zur Folge hat. Bei Unterschrei-
ten eines unteren Grenzwertes stoppt die Xylolzu-
fuhr und der Zyklus beginnt von neuem. Da eine zu
hohe Xylolkonzentration im Medium die Zellen irre-
versibel schädigt, wird Xylol als schwerlösliche, aber
leicht flüchtige Komponente im Abgasstrom mittels
Infrarotmessung gemessen und damit übergeordnet
überwacht. Letzterer Kontrollmechanismus ist vor
allem in der Anfangsphase des Zulaufverfahrens bei
geringer Biomassekonzentration wichtig.
Die DMPy (Edukt)-Konzentration wird voll
automatisiert mittels at-line-HPLC (siehe 7 Kap. 8)
gemessen und zudosiert, sodass der Sollwert kont-
rolliert wird (. Abb. 10.26). Mit einer Abtastzeit von
8 Minuten wird über HPLC kontinuierlich filtrierte,
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
433 10

. Abb.10.26  Prozesskontrollbild des Leitsystems bei der Produktion von MPCA im 15 m3 Maßstab. pXylol: Xylolkonzentration
im Abgas, Infrarotsignal; pO2: Gelöstsauerstoffkonzentration im Medium (gestrichelte Linie: oberer und unterer Grenzwert);
.
Ṁ Xylol: Massenstrom der Xylol-Zudosierung; cDMPy: DMPy-Konzentration im Medium, HPLC-Signal (Sollwert in grau); M DMPyl:
Massenstrom der DMPy-Zudosierung. Übersteigt der pO2 den oberen Grenzwert (a), wird die Dosierung von Xylol gestartet. Bei
Unterschreiten des unteren Grenzwertes des pO2 (b) wird die Xylolzufuhr beendet

zellfreie Fermentationslösung auf ihre DMPy-Kon- behördlicher Vorschriften durchgeführt werden

zentration hin analysiert. Die so bestimmte DMPy-
Konzentration ist das Ist-Signal für einen PID-Reg-
ler, der die DMPy-Dosierung so regelt, dass der
Sollwert (Sättigungskonzentration KS,DMPy < Soll-
wert < Inhibierungskonstante K I,DMPy) im Rühr-
kesselreaktor eingehalten wird. Der Verfahrenser-
folg beruht darauf, dass Xylol und DMPy auf der
Grundlage von on-line- und at-line-Messsignalen
kontrolliert und geregelt zudosiert werden. Dies
ermöglicht die Aufrechterhaltung der Lebensfähig-
keit und die maximale Biotransformationsaktivität
von Pseudomonas putida-Ganzzellbiokatalysatoren
im Produktionsreaktor.
Bei der Bioverfahrensentwicklung wurden der
mittlere pO2, die Belüftungsrate, der Leistungs-
eintrag (Rührgeschwindigkeit) und der Druck
im Rührkesselreaktor – dieser beeinflusst unter
anderem auch die Xylol-Löslichkeit –, die Tem-
peratur, der Edukt-Sollwert (DMPy) und andere
Prozessparameter so optimiert, dass die Produk-
tion von MPCA im 15 m 3 Maßstab robust (ohne
Ausfälle), bei hoher spezifischer und volumetri-
scher Produktivität und bei minimalem Austrag des
aromatischen Kohlenwasserstoffs unter Einhaltung
kann.
10.4.4 Chemo-enzymatische Synthese
von Ursodesoxycholsäure
(UDCA)
Ursodesoxycholsäure (UDCA) ist ein Wirkstoff für
die Behandlung von einer Vielzahl von Leber- und
Gallenerkrankungen. Zur chemischen Synthese von
UDCA ist ausgehend von Cholsäure ein siebenstu-
figer Prozess erforderlich [26]. Die große Anzahl an
Prozessschritten wird bei der chemischen Synthese
durch die schwierige Stereochemie verursacht, was
zu geringen Gesamtausbeuten von rund 30 % UDCA
ausgehend von Cholsäure führt [15].
Die Einbindung von biokatalytischen Schritten
in den Syntheseprozess stellt aufgrund der hohen Ste-
reoselektivität von Enzymen einen prinzipiell inter-
essanten Ansatz dar Synthesewege zu verkürzen und
damit Ausbeuten und Produktionskosten zu redu-
zieren. Ein chemo-enzymatischer Ansatz wurde
hierfür bereits 1992 vorgeschlagen [15]: Hierbei wird
Cholsäure zunächst chemisch zu Dehydrocholsäure
 434 K. Castiglione und D. Weuster-Botz

2+ 2+
2+

 2  2
&KHPLVFKH 6\QWKHVH

 
+2 2+ +2 2+

&KROV¦XUH 8UVRGHR[\FKROV¦XUH
2+ 2+
2 2
&U2
 2  2 :ROII.LVFKQHU
5HGXNWLRQ
˞+6'+ ˟+6'+
   
2 2 +2 2+

'HK\GURFKROV¦XUH .HWR8UVRGHR[\FKROV¦XUH

. Abb. 10.27  Herstellung von Ursodesoxycholsäure (UDCA) aus Cholsäure: Chemische Synthese (nur angedeutet)
im Vergleich zur chemo-enzymatischen Synthese mit einer 3α-Hydroxysteroiddehydrogenase (3α-HSDH) und einer 7β-
Hydroxysteroiddehydrogenase (7β-HSDH)

oxidiert, wobei sämtliche Hydroxygruppen zu Keto-
gruppen umgewandelt werden (siehe . Abb. 10.27).
Anschließend erfolgen zwei enzymatische regio-
und stereoselektive Reduktionsschritte mit einer
10 3α-Hydroxysteroiddehydrogenase (3α-HSDH) und
einer 7β-Hydroxysteroiddehydrogenase (7β-HSDH)
zu 12-Keto-UDCA, das wiederum durch eine che-
mische Reduktion (Wolff-Kishner-Reduktion) in
UDCA umgesetzt werden kann. Hierdurch lässt
sich zwar die Gesamtsynthese auf vier Schritte ver-
kürzen, allerdings ist neben dem Einsatz der beiden
Syntheseenzyme 3α-HSDH und 7β-HSDH jeweils
ein zusätzliches Enzym für die Regenerierung der
beiden Elektronentransportmetabolite NADH und
NADPH erforderlich. Um die Biokatalysatorkosten
zu reduzieren bietet sich der Einsatz eines Ganzzell-
biokatalysators an, der alle für die biokatalytischen
Schritte erforderlichen Enzyme und Transportme-
tabolite enthält.
Durch die intrazelluläre lösliche Expression
geeigneter Enzyme in Escherichia coli gelang die
Konstruktion eines solchen Ganzzellbiokataly-
sators [7, 68]. Um die Regenerierung der unter-
schiedlichen Transportmetabolite NADH und
NADPH der ausgewählten Hydroxysteroidde-
hydrogenasen (3α-HSDH aus Comamonas tes-
tosteroni und einer neuen 7β-HSDH aus Col-
linsella aerofaciens [41] mit einem einzigen
Regenerierungsenzym zu ermöglichen, wurde
die Glucosedehydrogenase aus Bacillus subtilis
exprimiert, da dieses Enzym beide Transportme-
tabolite mit vergleichbarer Geschwindigkeit bei
Vorlage von Glucose als Cosubstrat regenerieren
kann (siehe . Abb. 10.28). Die Herstellung dieses
Ganzzellbiokatalysators erfolgt effizient im Hoch-
zelldichteverfahren (siehe 7 Kap. 3 und 11). Die
Aufarbeitungskosten sind gering, da lediglich eine
Zellabtrennung erfolgen muss, bevor der Ganzzell-
biokatalysator als ruhende Zelle im Biotransfor-
mationsprozess in einem einfachen Satzverfahren
genutzt werden kann.
Sowohl die Einstellung der Enzymaktivitäten
im Ganzzellbiokatalysator als auch die Identifika-
tion geeigneter Reaktionsbedingungen für die voll-
ständige biokatalytische Umsetzung von Dehydro-
cholsäure zu 12-Keto-UDCA erfolgte auf der Basis
eines mechanistischen Modells des vorliegenden
Dreienzymsystems, bei dem jedes der beteiligten
Enzyme über zwei konkurrierende Substrate verfügt,
die sich darüber hinaus gegenseitig kompetitiv inhi-
bieren (siehe . Abb. 10.28). Nach Aufklärung der
Enzymmechanismen und Herleitung der zugehöri-
gen Geschwindigkeitsgleichungen (King-Altmann-
Verfahren, siehe 7 Kap. 1) erfolgte für jedes der betei-
ligten Enzyme die individuelle Identifikation der
kinetischen Modellparameter über Verlaufskurven-
analysen. Die mechanistischen Einzelenzymkine-
tiken wurden nachfolgend zu einem Prozessmodel
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
435 10

. Abb. 10.28  Vereinfachtes Reaktionsschema (Prinzipskizze) für einen Ganzzellbiokatalysator zur Herstellung von
12-Keto-Ursodeoxycholsäure aus Dehydrocholsäure mit den überexprimierten Enzymen 3α-Hydroxysteroiddehydrogenase
(3α-HSDH) aus Comamonas testosteroni, 7β-Hydroxysteroiddehydrogenase (7β-HSDH) aus Collinsella aerofaciens
und Glucosedehydrogenase (GDH) aus Bacillus subtilis. Glucose wird als Cosubstrat eingesetzt. Edukt, Produkt und
Zwischenprodukte werden über die Zellmembran transportiert. Die notwendigen Produktausbeuten von über 99 % sind
nur möglich, wenn die Zwischenprodukte 3,12-Diketoursodeoxycholsäure und 7,12- Diketoursodeoxycholsäure von den
rekombinanten E. coli-Zellen wieder vollständig aufgenommen und stöchiometrisch umgesetzt werden

vereint und das Gesamtmodell experimentell vali-
diert, bevor dieses für Simulationsstudien zum Auf-
finden geeigneter Expressionsverhältnisse und Reak-
tionsbedingungen eingesetzt werden konnte [67].
Im Vergleich zur Literatur konnten damit die
12-Keto-UDCA-Konzentration um bis zu Faktor
8 und die Raum-Zeit-Ausbeute der zweistufigen
Reduktion von DHCA um bis zu Faktor 27 erhöht
werden. Die Gesamtausbeute der jetzt dreistufi-
gen chemo-biokatalytischen Umsetzung von Chol-
säure zum Wirkstoff UDCA (chemische Oxidation
von Cholsäure, biokatalytische regio- und stereose-
lektive Doppelreduktion mit einem Ganzzellbioka-
talysator und chemische Wolff-Kishner-Reduktion)
wurde damit gegenüber dem etablierten, siebenstufi-
gen, chemischen Syntheseprozesses nahezu verdop-
pelt. 2015 wurde dieses neue chemo-biokatalytische
Produktionsverfahren in den industriellen Maßstab
übertragen.
10.5 Mehrphasensysteme
Enzyme, Enzymimmobilisate oder Ganzzellbiokata-
lysatoren entfalten in der Regel nur im Lösungsmittel
Wasser ihre katalytische Aktivität. Ausnahmen bilden
Lipasen, die auch im organischen Lösemittel kataly-
tisch aktiv sein können, wenn sie dort in hydratisierter
 436 K. Castiglione und D. Weuster-Botz
Form, also umgeben von einer Wasserhülle vorlie-
gen. Die Anwendung biokatalytischer Umsetzungen
in rein wässrigen Reaktionsmedien – im Folgenden
auch als „erste Phase“ bezeichnet – ist in vielen Fällen
jedoch nur eingeschränkt möglich, wenn
55 höhere Substrat- und/oder Produktkonzentra-
tionen inhibierend wirken,
55 Substrat und/oder Produkt schlecht wasser-
löslich sind,
55 Konkurrenz- beziehungsweise Folgereaktionen
insbesondere bei höheren Substrat- und/oder
Produktkonzentrationen in der wässrigen
Phase auftreten oder
55 das thermodynamische Gleichgewicht nicht
weit genug auf der Produktseite liegt.
Teilweise können diese Einschränkungen durch
verfahrenstechnische Maßnahmen wie beispiels-
weise die Anwendung von Zulaufverfahren bei
Vorliegen einer Substratüberschussinhibierung
oder dem Einsatz von kontinuierlich betriebenen
Rohrreaktoren bei Vorliegen einer Produktinhi-
10 bierung angegangen werden. Eingeschränkte Was-
serlöslichkeiten von Substrat oder Produkt können
in gewissem Maße auch durch Löslichkeitsver-
mittler wie beispielsweise wasserlösliche organi-
sche Lösemittel oder Tenside überwunden werden,
wenn diese Löslichkeitsvermittler selbst die bio-
katalytische Reaktion nicht negativ beeinflussen.
10.5.1 In-situ Substratbereitstellung
und Produktentfernung
Mehrphasensysteme, also der disperse Einsatz geeig-
neter nicht mit Wasser mischbarer Lösemittel oder
fester Phasen (Adsorbentien) – im Folgenden auch als
„zweite Phase“ bezeichnet – haben den Vorteil, dass
die oben genannten Einschränkungen selbst im ein-
fachen Satzbetrieb im Rührkesselreaktor überwunden
werden können. Die zweite, nicht mit Wasser misch-
bare Phase kann dabei sowohl zur in-situ-Substratbe-
reitstellung dienen, als auch zur in-situ-Produktext-
raktion genutzt werden (Prinzipskizze siehe . Abb.
10.29). Zur Dispergierung der zweiten Phase (nicht
wassermischbares Lösemittel oder Adsorbentien)
im wässrigen Reaktionsmedium oder der wässrigen
Phase mit dem Biokatalysator im organischen Löse-
mittel muss hierbei genügend mechanische Leistung
eingetragen werden. Bei Zusatz von Tensiden kann es
zur Ausbildung von stabilen Mikroemulsionen oder
reversen Micellen kommen, wodurch hohe volu-
menbezogene Phasengrenzflächen erreicht werden
können. Dem Bioreaktor muss zusätzlich eine Pha-
sentrennung (flüssig-flüssig oder fest-flüssig) nach-
geschaltet werden, um beide Phasen voneinander zu
trennen und das Produkt aus der zweiten Phase (nicht
wassermischbares Lösemittel oder Adsorbentien) zu
gewinnen.
Kriterien zur Auswahl geeigneter nicht mit
Wasser mischbarer Phasen für die in-situ-Substratbe-
reitstellung und/oder in-situ-Produktextraktion sind:
55 geeignete Verteilungskoeffizienten von Substrat
und/oder Produkt zwischen den beiden
flüssigen Phasen oder geeignete Sorptionsiso-
thermen bei fest-flüssig-Systemen,
55 keine oder nur geringfügige Beeinflussung des
Biokatalysators durch die zweite Phase und
55 einfache Phasentrennung nach Abschluss der
biokatalytischen Umsetzung.
Verteilungskoeffizienten von Substrat
und/oder Produkt
Der Verteilungskoeffizient Ki* beschreibt die Vertei-
lung von Substrat oder Produkt zwischen den beiden
flüssigen Phasen und ist definiert als
xiII ⋅ γiII
Ki* =  Gl. 10.14
xiI ⋅ γiI
wobei xi den Molanteil von Substrat oder Produkt
in der ersten (I) oder zweiten Phase (II) darstellen
und γi die zugehörigen Aktivitätskoeffizienten von
Substrat oder Produkt in den jeweiligen Phasen. Der
Verteilungskoeffizient Ki* ist von Temperatur und
Druck abhängig. Bei starker Verdünnung von Subs-
trat oder Produkt nähern sich die Aktivitätskoeffizi-
enten 1 an, und der Verteilungskoeffizient kann über
die molaren Substrat- oder Produktkonzentrationen
ci in den beiden Phasen bestimmt werden:
ciII
Ki =  Gl. 10.15
ciI
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
437 10

. Abb. 10.29  Flüssig-flüssig-Zweiphasensystem zur in-situ-Substratbereitstellung und Produktextraktion: Substrat und

Produkt lösen sich besser in der zweiten, nicht mit Wasser mischbaren (organischen) Phase, sodass die Konzentrationen
von Substrat und Produkt in der biokatalytischen Wasserphase so niedrig sind, dass keine Inhibierungen auftreten können.
Um einen guten Stofftransport über die Phasengrenzen zu erreichen, muss eine der beiden Phasen durch genügenden
mechanischen Leistungseintrag in der anderen Phase fein dispergiert werden

Bei Vorliegen einer starken Substrat- und/oder V II

Produktinhibierung, wie sie häufig bei der bioka-
talytischen Umsetzung insbesondere von nicht-na-
türlichen Chemikalien auftreten können, stellen
hohe Verteilungskoeffizienten ein wichtiges Aus-
wahlkriterium für die zweite, nicht mit Waser
mischbare Phase dar (Ki > 100–1000). Dadurch
können Substrat- und/oder Produktkonzentratio-
nen auch im einfachen Satzverfahren bei Vorlage
hoher Substratkonzentrationen in der zweiten
Phase (üblicherweise mehrere 100 mM bis über
1 M) in der wässrigen Phase niedrig gehalten
werden. Analoges gilt für die Produktkonzentra-
tion zum Prozessende.
Die Möglichkeiten zur Verschiebung des Reak-
tionsgleichgewichts durch in-situ-Produktextraktion
lassen sich anschaulich darstellen, wenn die ther-
modynamische Gleichgewichtskonstante Keq einer
1-Substrat/1-Produktreaktion für ein Zweiphasen-
system definiert wird:
eq cPI ⋅ V I + cPII ⋅ V II
K total =  Gl. 10.16
cSI ⋅ V I + cSII ⋅ V II
Neben den molaren Konzentrationen von Substrat cS
und Produkt cP in den beiden Phasen spielt hierbei auch
das Volumenverhältnis der beiden Phasen eine Rolle:
α=  Gl. 10.17
VI
Bei Berücksichtigung der thermodynamischen
Gleichgewichtskonstante für das rein wässrige System
cPI
K eq =  Gl. 10.18
cSI
lässt sich Gl. 10.16 umformen zu:
1 + KP ⋅ α
eq
K total = K eq ⋅  Gl. 10.19
1 + KS ⋅ α
Die relative Verschiebung des Reaktionsgleichge-
wichts im Zweiphasensystem ist in . Abb. 10.30 als
Funktion des Phasenverhältnisses α für verschiedene
Verteilungskoeffizienten Ki gezeigt.
Ist das Produkt in der zweiten Phase sehr viel
besser löslich als in der Wasserphase, verschiebt sich
mit zunehmendem Phasenverhältnis α das Reak-
tionsgleichgewicht im Gesamtsystem Gl. 10.6 immer
mehr auf die Produktseite (rote Linie in . Abb. 10.30
bei KP = 200 und KS = 2). Dies ist jedoch nur möglich,
wenn das Produkt möglichst selektiv extrahiert wird.
Steigt auch die Löslichkeit des Substrates in der
zweiten Phase, verringert sich die Verschiebung des
 438 K. Castiglione und D. Weuster-Botz
. Abb. 10.30  Verschiebung
des Reaktionsgleichgewichts im
Zweiphasensystem bei in-situ-
Produktextraktion: Verhältnis
von Gl. 10.19 zu Keq als Funktion
des Phasenverhältnisses α im
Zweiphasensystem mit den
Verteilungskoeffizienten KP = 200 und
KS = 2 (rot), sowie KP = 200 und KS = 20
bei einer 1-Substrat/1-Produktreaktion
Reaktionsgleichgewichts deutlich (schwarze Linie in
. Abb. 10.30 bei KP = 200 und KS = 20).
10 Beeinflussung des Biokatalysators
durch die zweite Phase
Neben der Auswahl einer zweiten nicht mit Wasser
mischbaren Phase mit geeigneten Verteilungskoef-
fizienten für Substrat und/oder Produkt müssen die
Wechselwirkungen zwischen der zweiten Phase und
dem Biokatalysator bekannt sein. Häufig kommt es
zum einen zu Veränderungen von spezifischer Akti-
vität und gegebenenfalls zu Veränderungen in der Ste-
reospezifität. Zum anderen wird oftmals eine verstärkte
irreversible Inaktivierung des Biokatalysators beobach-
tet. Das bedeutet, die Halbwertzeit des Biokatalysators
wird in Gegenwart der zweiten Phase geringer.
Wechselwirkungen der zweiten, nicht mit Wasser
mischbaren Phase mit dem Biokatalysator können
mit der Restlöslichkeit der organischen Phase im
Lösemittel Wasser zusammenhängen. Auch wenige
in Wasser gelöste Lösemittelmoleküle können wie
andere Inhibitoren die Enzymaktivität auf moleku-
larer Ebene in vielfältiger Weise beeinflussen (siehe
7  Abschn. 1.6.3). Im Zweiphasensystem bleibt die
Konzentration des organischen Lösemittels in der
Wasserphase konstant, sodass sich nach Zugabe und
Dispersion der nicht mit Wasser mischbaren zweiten
Phase unmittelbar die spezifische Enzymaktivität
ändert und auch bei Veränderung der Phasenver-
hältnisse konstant bleibt.
In vielen Fällen wird beobachtet, dass sich bei
Erhöhung des Phasenverhältnisses zwischen der
zweiten, nicht mit Wasser mischbaren (organi-
schen) Phase und der biokatalytischen Wasserphase
die Halbwertzeit des Biokatalysators verschlech-
tert, also eine verstärkte irreversible Inaktivierung
auftritt (siehe 7 Abschn. 1.7). Dies ist auf die soge-
nannte „Phasentoxizität“ zurückzuführen. Die
Tertiär- und Quartärstrukturen von Proteinen,
die sich an den Phasengrenzflächen flüssig-flüs-
sig anreichern, können durch Grenzflächenkräfte
irreversibel zerstört werden. Die betroffenen Pro-
teine denaturieren. Da bei Zunahme der sich im
Rührkesselreaktor ausbildenden Phasengrenzflä-
chen flüssig-flüssig, beispielsweise durch Erhöhung
des Phasenanteils der zweiten organischen Phase
im Reaktor bei konstantem Leistungseintrag, die
Wahrscheinlichkeit der Kontakte der Biokatalysa-
toren mit der Phasengrenzfläche ansteigt, wird auch
deren Halbwertzeit absinken. Beide Effekte – rever-
sible Inhibierung durch molekulare Wechselwir-
kungen der in Wasser gelösten Lösemittelmoleküle
und irreversible Denaturierung aufgrund der Pha-
sentoxizität – sind in . Abb. 10.31 für zwei unter-
schiedliche Phasenverhältnisse gezeigt. Bei Erhö-
hung der Phasengrenzfläche im Rührkesselreaktor
verringert sich die Halbwertzeit des Biokatalysators,
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
439 10
. Abb. 10.31  Aktivitätsänderung eines
Biokatalysators in einem Flüssig-Flüssig
Zweiphasensystem bei unterschiedlichem
Phasenanteil: Die reversible Inhibierung
erfolgt unmittelbar nach Dispergierung der
zweiten Phase. Die durch „Phasentoxizität“
hervorgerufene irreversible Denaturierung
des Biokatalysators an der Phasengrenze
steigt mit zunehmendem Phasenanteil der
zweiten (organischen) Phase (schwarze
Linie: Halbwertzeit 100 h; rote Linie:
Halbwertzeit 50 h)

die Abnahme der relativen Enzymaktivität erfolgt
schneller.
Beide Effekte sind auch beim Einsatz von Ganz-
zellbiokatalysatoren in Zweiphasensystemen zu beob-
achten. In Wasser gelöste (hydrophobe) Lösemittelmo-
leküle werden in der Regel diffusiv über Zellmembran
transportiert und zeigen dieselben molekularen Wech-
selwirkungen mit den bei der Ganzellbiokatalyse int-
razellulär bereitgestellten Syntheseenzymen. Die
Phasentoxizität wird bei Ganzzellbiokatalysatoren
wahrscheinlich durch eine starke Anreicherung der
organischen zweiten Phase in der hydrophoben Zell-
membran verursacht, die zur (partiellen) Auflösung
der Zellmembran und damit zur Permeabilisierung
der Ganzzellbiokatalysatoren und dem Verlust insbe-
sondere von Cofaktoren führen kann.
Neben nicht oder schlecht mit Wasser mischba-
ren organischen Lösemitteln wie beispielsweise Cyc-
lohexan, Hexan, Heptan, n-Butylacetat, Ethylace-
tat, Ethyldecanoat, Ethyloleat, 1-Octanol, 1-Octen,

. Abb. 10.32  Beispiele für Kationen

(schwarz) und Anion (rot) zur Bildung von
biokompatiblen, hydrophoben ionischen
Flüssigkeiten (IL) zum Einsatz bei der
Biokatalyse
 440 K. Castiglione und D. Weuster-Botz
Methyl-tert-Butylether (MTBE), Diisopropylether
und vielen anderen mehr wird auch die Verwen-
dung von nicht mit Wasser mischbaren flüssigen
organischen Salzen (ionische Flüssigkeiten) vorge-
schlagen. Die Eigenschaften ionischer Flüssigkeiten
(IL) können durch die Wahl von Kation und Anion
über weite Bereiche gezielt eingestellt werden. Daher
werden diese auch als ‚designer solvents‘ bezeichnet.
Beispiele für Kationen und Anion mit denen biokom-
patible und nicht-wassermischbare ionische Flüssig-
keiten gebildet werden können, sind in . Abb. 10.32
dargestellt.
Nicht mit Wasser mischbare ionische Flüs-
sigkeiten wie [BMIM][NTF], [HMIM][NTF],
[BMPL][NTF] oder [HMPL][NTF] zeigen in der
Ganzzellbiokatalyse bei Phasenanteilen von 20–40
Volumenprozent (IL/Wasser) keine Veränderun-
gen der Membranintegrität im Vergleich zum Ver-
halten der Zellen im Lösemittel Wasser – ganz im
Gegensatz zu vielen klassischen, nicht mit Wasser
mischbaren organischen Lösemitteln [55, 72]. Viele
organische Substrate und Produkte lösen sich sehr
10 gut in diesen ionischen Flüssigkeiten, sodass Ver-
teilungskoeffizienten Ki von über 100–1000 gemes-
sen werden [8]. Dies macht auch die Umsetzung
von stark inhibierenden Substraten und Produk-
ten im einfachen Satzverfahren möglich. Beispiels-
weise können so mit einem Phasenanteil von 20 %
IL Ausbeuten und Raum-Zeit-Ausbeuten um mehr
als den Faktor 10 gegenüber dem rein wässrigen
Ansatz bei der asymmetrischen Synthese von (S)-
4-Chlor-3-hydroxybuttersäureethylester (S-CHBE)
aus 4-Chlor-3-oxobuttersäureethylester (COBE)
mit rekombinanten Escherichia coli-Zellen im ein-
fachen Satzverfahren im Rührkesselreaktor gestei-
gert werden [72]. Wesentlicher Nachteil ionischer
Flüssigkeiten ist der im Vergleich zu klassischen
organischen Lösemitteln um 1–2 Zehnerpotenzen
höhere Preis.
Phasentrennung nach Abschluss der
biokatalytischen Umsetzung
Neben geeigneten Verteilungskoeffizienten bei flüs-
sig-flüssig-Phasensystemen oder geeigneten Sorp-
tionseigenschaften beim Einsatz von Adsorbern
im biokatalytischen Prozess, sowie ausreichender
Biokompatibilität der zweiten Phase ist eine effizi-
ente Phasentrennung nach Abschluss der biokata-
lytischen Umsetzung essentiell.
Fest-flüssig-Zweiphasensysteme lassen sich
in der Regel einfach durch Größenausschlussver-
fahren (Filtration) oder Sedimentationsverfahren
voneinander trennen. Die flüssig-flüssig-Phasen-
separation erfolgt in der Regel über Sedimenta-
tion im Schwere- oder Zentrifugalfeld. Wichtig ist
eine ausreichende Dichtedifferenz zwischen den
beiden Phasen. Problematisch ist die Ausbildung
von stabilen Emulsionen während der biokatalyti-
schen Umsetzung. Diese Stabilisierung der disper-
sen Phase wird oftmals als Folge von Proteindena-
turierungen an den Phasengrenzflächen oder durch
Moleküle mit Tensidwirkung, wie sie beim Einsatz
von Ganzzellbiokatalysatoren auftreten können,
beobachtet. Zur Emulsionsspaltung müssen die
Abstoßungskräfte zwischen der stabilisierten dis-
persen Phase beispielsweise durch Zugabe von
Demulgatoren verringert werden, sodass im Zen-
trifugalfeld eine schnelle Phasentrennung ermög-
licht werden kann.
Die Zugabe von Demulgatoren ist nicht sinn-
voll, wenn die zweite disperse Phase wiederverwen-
det werden muss, wie es bei teuren Lösemitteln wie
hydrophoben ionischen Flüssigkeiten (IL) der Fall
ist. Diese ionischen Flüssigkeiten bilden, wenn sie
entsprechend biokompatibel sind, auch im Ganz-
zellansatz in der Regel keine stabilen Emulsionen
aus. Bei ausreichend großer Dichtedifferenz zur
wässrigen Phase ist eine Phasenseparation damit
sowohl im Schwerefeld, als auch schneller im Zen-
trifugalfeld einfach möglich. Bei Ganzzellbio-
transformationen bildet sich zwischen der schwe-
ren IL-Phase mit dem darin gelösten Produkt und
der leichteren Wasserphase eine wässrige Zwi-
schenphase mit den Ganzzellbiokatalysatoren aus
(. Abb. 10.33). Die hohe thermische Stabilität dieser
hydrophoben ionischen Flüssigkeiten und deren
nicht messbarer Dampfdruck erlauben die rück-
wirkungsfreie Verdampfung der extrahierten Pro-
dukte, sodass die ionischen Flüssigkeiten einfach
wiederverwendet werden können. Dies wurde am
Beispiel der asymmetrischen Synthese von (R)-2-
Octanol aus 2-Octanon mit Hilfe rekombinanter
Escherichia coli-Ganzzellbiokatalysatoren gezeigt
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
. Abb. 10.33  Prinzipskizze zur Wiederverwendung hydrophober ionischer Flüssigkeiten bei Biotransformationen
am Beispiel der asymmetrischen Synthese von (R)-2-Octanol aus 2-Octanon mit Hilfe rekombinanter Escherichia coli
Ganzzellbiokatalysatoren (Details siehe [18])
[18]. Auch nach 25-fachen Einsatz von [HMPL]
[NTF] konnten im einfachen Satzverfahren diesel-
ben Umsätze und Produktausbeuten von durch-
schnittlich 98,5 % bei einem gleichbleibendem
Enantiomerenüberschuss von über 99,5 % erzielt
werden (Verfahrensschema siehe . Abb. 10.33).
Im Folgenden werden stellvertretend zwei
industrielle Prozessbeispiele zum Einsatz von Flüs-
sig-Flüssig ( 7 Abschn. 10.5.2 ) und Flüssig-Fest
Zweiphasensystemen (7 Abschn. 10.5.3) zur Prozess-
intensivierung bei der Biokatalyse dargestellt.
10.5.2 Asymmetrische Synthese
von (S)-4-Chlor-3-
Hydroxybuttersäureethylester
(S-CHBE)
Der enantiomerenreine chirale Alkohol (S)-4-
Chlor-3-hydroxybuttersäureethylester (S-CHBE)
wird als chiraler Baustein zur Synthese des Cho-
lesterinsenkers Atorvastatin und verschiedener
441 10
Blutdrucksenker (β-Blocker) verwendet [42]. Die
industrielle Herstellung von S-CHBE erfolgt über
die asymmetrische Reduktion der prochiralen
Verbindung 4-Chlor-3-oxobuttersäureethylester
(COBE) mit Hilfe geeigneter Carbonylreduktasen.
Carbonylreduktasen ermöglichen die Herstellung
verschiedenster chiraler Intermediate, die zur Syn-
these von unterschiedlichen Pharmazeutika benö-
tigt werden (neben Cholesterin- und Blutdrucksen-
kern auch Antidepressiva, β-Lactam-Antibiotika
und weitere [42]).
Zur asymmetrischen Reduktion von COBE
eignet sich besonders eine Alkoholdehydrogenase
aus dem Milchsäurebakterium Lactobacillus brevis
(LBADH) [45], da die Regeneration des Elektronen-
transportmetaboliten NADPH (Cofaktorregenerie-
rung) hier mit demselben Enzym durch Oxidation
von kostengünstigen Isopropanol (Cosubstrat) zu
Aceton möglich ist.
Um die Kosten für den Biokatalysator gering zu
halten, bietet sich die Verwendung von Ganzzellbio-
katalysatoren (7 Abschn. 10.4) mit hoch exprimierter
 442 K. Castiglione und D. Weuster-Botz
. Abb. 10.34  Prinzipskizze zur asymmetrischen Ganzzellreduktion von 4-Chlor-3-oxobuttersäureethylester (COBE) mit Hilfe
einer in Escherichia coli exprimierten Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis (LBADH) zur biokatalytischen Herstellung
des chiralen Alkohols (S)-4-Chlor-3-hydroxybuttersäureethylester (S-CHBE) mit Isopropanol als Cosubstrat zur Regenerierung
von NADPH. Als organische Phase wird n-Butylacetat verwendet
löslicher LBADH an. Dies ist mit Escherichia coli
10 einfach, schnell und kostengünstig möglich.
Um die Hydrolyseinstabiltät des prochiralen
Substrats COBE in wässriger Phase [20] auch im ein-
fachen Satzverfahren überwinden zu können, ist die
Anwendung eines Zweiphasensystems erforderlich.
Hier hat sich ein flüssig-flüssig-Zweiphasensystem
mit n-Butylacetat als organische, nicht mit Wasser
mischbare Phase als besonders geeignet erwiesen.
Das organische Lösemittel dient im Satzverfahren
somit als Substratreservoir (und in-situ-Extraktions-
mittel), sodass bei geeignetem Phasenverhältnis und
Reduktionsaktivität die Verweilzeit von COBE in der
wässrigen Phase minimiert werden kann (Prinzip-
skizze siehe . Abb. 10.34).
Bei 40 % organischer Phase (n-Butylacetat
mit COBE) und 60 % Wasser/Isopropanol-Phase
(Puffer mit hohem Isopropanolanteil) lassen sich
selbst bei geringen Ganzzellbiokatalysatorkon-
zentrationen von 1 g L –1 Biotrockenmasse im
einfachen Satzverfahren im Rührkesselreaktor
innerhalb von 24 Stunden bei Raumtemperatur
Ausbeuten von >99 % bei einem Enantiomeren-
überschuss von ebenfalls >99 % des chiralen Pro-
duktes S-CHBE herstellen, wenn das Filterhilfsmit-
tel (20 g L–1 Diatomeenerde) von Anfang an zum
Biotransformationsansatz hinzugegeben wird [54].
Ohne Filterhilfsmittel wird innerhalb von 24 h nur
ein Umsatz von knapp über 50 % erreicht. Das Fil-
terhilfsmittel stabilisiert den Ganzzellbiokataly-
sator während der Biotransformation und erhöht
die Raum-Zeit-Ausbeute. Die Produktisolierung
ist denkbar einfach: Nach Zellabtrennung über
Filtration, Waschen der Zellen mit weiterem n-
Butylacetat und direkter Destillation des erhalte-
nen Filtrats lässt sich der chirale Alkohol in hoher
Reinheit gewinnen.
Die wesentlichen Erfolgsfaktoren zur industriel-
len Realisierung asymmetrischer Synthesen mit Car-
bonylreduktasen sind [53]:
55 Verwendung von kostengünstigen Ganzzellbio-
katalysatoren mit Carbonylreduktasen, die ein
breites Substratspektrum besitzen
55 hohe Enantioselektivität (ee >99 %)
55 hohe chemische Stabilität der Ganzzellbio-
katalysatoren (50–80 % des Reaktorvolumens
stehen für Edukt, organisches Lösemittel und
Cosubstrat Isopropanol zur Verfügung)
55 hohe Edukt-/Produktanteile von bis zu 500 g L–1
bei Umsätzen von über 90 % innerhalb von 24
Stunden in einfachen Satzverfahren und damit
hohe Raum-Zeit-Ausbeuten im biokatalyti-
schen Prozess und einfache Produktisolierung
nach Zellabtrennung durch direkte Destillation
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
55 geringer Einsatz von kostengünstigen Ganzzell-
biokatalysatoren im einfachen Satzverfahren
(Reduktion der Katalysatorkosten)
55 Verwendung von Isopropanol als kostengüns-
tigem Reduktionsmittel
55 Nutzung einfachster Standard-Rührkesselre-
aktoren wie sie in der chemischen Produktion
gebräuchlich sind (Umgebungsdruck,
Umgebungstemperaturen, keine pH-Kontrolle)
55 einfache Wiederverwendung des Ganzzellbio-
katalysators nach Filtration/Sedimentation als
zusätzliche verfahrenstechnische Option, um
die Biokatalysatorkosten weiter zu reduzieren
55 Acetonstripping bei reduziertem Druck
während der biokatalytischen Umsetzung
als weitere verfahrenstechnische Option, um
gegebenenfalls das thermodynamische Gleich-
gewicht zur Produktseite (chiraler Alkohol) zu
verschieben und damit den Umsatz zu erhöhen.
10.5.3 Asymmetrische Synthese von
(S)-(3,4-Methylendioxyphenyl)-
2-Propanol
Talampanel ist eine pharmakologisch aktive Subs-
tanz aus der Familie der Benzodiazepine, die in ver-
schiedenen klinischen Studien als Wirkstoffkandi-
dat zur Behandlung von Epilepsie [44], bösartigen
Hirntumoren [30] und Amyothropher Lateralskle-
rose (ALS) [50] untersucht wurde. Talampanel kann
in einer sechsstufigen chemischen Synthese aus (S)-
(3,4-Methylendioxyphenyl)-2-propanol ((S)-MDPP)
hergestellt werden. Der chirale Synthesebaustein
. Abb. 10.35  Asymmetrische Synthese von (S)-3,4-Methylendioxyphenyl-2-propanol durch ganze Zellen von
Zygosaccharomyces rouxii (Z. rouxii) unter Zuhilfenahme des Adsorberharzes XAD-7. Das entstehende Produkt ist ein
Synthesebaustein bei der Herstellung von Talampanel [1]
443 10
MDPP wiederum wird durch Reduktion der prochi-
ralen Carbonylverbindung 3,4-Methylendioxypheny-
laceton (MDPA) durch ganze Zellen der Hefe Zygo-
saccharomyces rouxii (Z. rouxii) nebenproduktfrei
produziert [1] (. Abb. 10.35). Die Hefezellen besit-
zen eine äußerst enantioselektive NADPH-abhängige
Alkoholdehydrogenase, welche die Reaktion kataly-
siert [38].
Eine besondere Schwierigkeit bei der Synthese
von (S)-MDPP ist die Toxizität von Substrat und
Produkt. Obwohl sich Z. rouxii bei einem Vergleich
verschiedener Mikroorganismen schon als sehr tole-
rant gegenüber diesen Stoffen erwiesen hat [77], liegt
die maximal einsetzbare Substratkonzentration bei
6 g L–1. Bei höheren Konzentrationen scheint der
Biokatalysator nicht mehr zur zellinternen Cofak-
torregenerierung fähig zu sein, die durch die Zugabe
von Glucose zum Biotransformationsansatz ange-
regt wird. Während der toxische Effekt des Substrats
vergleichsweise einfach durch ein geeignetes Zudo-
sierungsprofil umgangen werden könnte, kann die
Toxizität des Produktes nur durch in-situ-Produkt-
entfernung vermieden werden.
Das Pharmaunternehmen Eli Lilly hat einen
Prozess entwickelt, bei dem das Adsorberharz
XAD-7 als Substratreservoir und in-situ-Produk-
textraktionsmittel eingesetzt wird [69]. XAD-7 ist
ein Polymethacrylat-Granulat mit mittlerer Polari-
tät, das für MDPA und MDPP eine ähnliche Affini-
tät aufweist. Durch die Adsorption von 80 g Substrat
pro Liter XAD-7 kann eine Substratkonzentration
von bis zu 40 g L–1 im gesamten Reaktionsvolumen
erreicht werden, wobei sich maximal 2 g L–1 in der
wässrigen Phase befinden.
 444 K. Castiglione und D. Weuster-Botz

10

. Abb. 10.36  Prozesschema der asymmetrischen Synthese von (S)-3,4-Methylendioxyphenyl-2-propanol durch ganze Zellen
von Zygosaccharomyces rouxii (Z. rouxii) unter Zuhilfenahme des Adsorberharzes XAD-7 [69]

. Abb. 10.36 gibt einen schematischen Überblick
über den Biotransformationsprozess. Die Z. rouxii-
Zellen, die zuvor in einem unabhängigen Satzver-
fahren hergestellt wurden, werden für die Biotrans-
formationen im 300-L-Satzverfahren eingesetzt. Als
Reaktor dient ein Filter/Trockner-System mit einem
eingebauten Rührorgan, das normalerweise für die
Filtration und Trocknung kristalliner Materialien
verwendet wird. Auf diese Weise können die Bio-
transformation und die anschließende Produktauf-
arbeitung im gleichen Behälter durchgeführt werden.
Nach einer Reaktionszeit von 8–12 h bei 33–35 °C
wird das Produkt mit einer Ausbeute von >99 % und
einem Enantiomerenüberschuss von >99.9 % erhal-
ten. Da sich die Zellen aus nicht eindeutig geklärten
Gründen als empfindlich gegenüber hohen Rührer-
drehzahlen während der Biotransformation erwie-
sen haben, kann der Reaktionsansatz nur bei gerin-
gem Leistungseintrag homogenisiert werden. Die
wahrscheinlichste Ursache für diese Sensitivität
liegt darin, dass die Zellen durch den hohen Anteil
an suspendiertem Feststoff wie in einer Art Kugel-
mühle aufgeschlossen werden. Es konnten jedoch
nur sehr geringe Mengen an Zellbruchstücken detek-
tiert werden, was zumindest gegen eine vollständige
Desintegration der Zellen spricht [69]. Am Ende
der Reaktion sind 85–90 % des Produkts an XAD-7
adsorbiert, während die Gleichgewichtskonzentra-
tion in der wässrigen Phase bei zusätzlichen 2–3 g L–1
liegt. Für die Produktisolation werden die Hefezellen
Kapitel 10 · Enzymatische Prozesse
zunächst durch Filtration unter leichtem Rühren
vom Adsorberharz getrennt. Da die Hefezellen mit
einem Durchmesser von 5 µm um zwei Größenord-
nungen kleiner sind als die sphärischen Adsorber­
harzpartikel, die einen mittleren Durchmesser von
500 µm aufweisen, können sie sehr effektiv durch
einen Edelstahlfilter mit einem Porendurchmesser
von 150 µm abgetrennt werden. Die Desorption des
Produktes vom Adsorberharz erfolgt durch Waschen
mit Aceton. Durch die zusätzliche Gewinnung des
nicht-adsorbierten Produktes aus der abfiltrierten
wässrigen Zellmasse mittels einer mit einem ähn-
lichen Adsorberharz gepackten Chromatographie-
säule beträgt die isolierte Ausbeute des Produkts am
Ende des Prozesses 95–97 %.
Literatur
  [1] Anderson BA, Hansen MM, Harkness AR, Henry CL,
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 449 11

Mikrobielle Prozesse
Christoph Syldatk, Rudolf Hausmann und Horst Chmiel

11.1 Mikrobielle Produktionsprozesse – 450

11.2 Mikrobielle Stoffproduktion – 453

11.2.1 Biomasse – 453
11.2.2 Primärmetabolite – 455
11.2.3 Spezielle Produkte – 462
11.2.4 Rekombinante Proteine – 471
11.2.5 Ausblick – 476

11.3 Mikrobielle Abwasserreinigung – 478

11.3.1 Biologische Abwasserreinigung – 478

Literatur – 487

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2018

H. Chmiel, R. Takors, D. Weuster-Botz (Hrsg.), Bioprozesstechnik,
https://doi.org/10.1007/978-3-662-54042-8_11
 450 C. Syldatk et al.
Mikrobielle Prozesse spielen seit langer Zeit in vielen
Bereichen des täglichen Lebens eine wesentliche
Rolle. Sowohl im Bereich der Lebensmittelherstel-
lung als auch in der Umwelttechnik werden biolo-
gische Prozesse traditionell genutzt. Seit Mitte des
20. Jahrhunderts haben mikrobielle Verfahren eine
Schlüsselstellung bei der Herstellung von pharma-
zeutischen Produkten erlangt.
11.1 Mikrobielle Produktionsprozesse
In der Stoffproduktion werden mikrobielle Verfah-
ren bereits seit Anbeginn der Menschheit traditio-
nell bei der Produktion von Lebensmitteln (Brot,
Milchprodukten und Speiseessig), alkoholischen
Getränken (Wein und Bier) und Tierfutter (Silage)
eingesetzt. In der Umwelttechnik werden diese zur
Behandlung von Abfällen (Vergärung und Biogas-
herstellung) und Behandlung von Abwasser (tradi-
tionelle Pflanzenkläranlage) verwendet.
Mit dem wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn
in der zweiten Hälfte des 19. und im 20. Jahrhundert
wurden mikrobielle Prozesse zunehmend unter defi-
11 nierten, reproduzierbaren und kontrollierten Bedin-
gungen durchgeführt, in den großen Maßstab über-
tragen und industriell genutzt.
Das heutige Anwendungsspektrum von mit bio-
technischen Prozessen mikrobiell hergestellten Pro-
dukten reicht derzeitig von der Verwendung als preis-
werte Energieträger und Lösungsmittel (Bioethanol)
über Grundchemikalien (Succinat), Haushaltsche-
mikalien (Speiseessig, Zitronensäure), Feinchemika-
lien (chirale Verbindungen), Futtermittel (Phytasen,
L-Aminosäuren), Lebensmittel (Backhefe, L-Gluta-
mat) bis hin zu Aromastoffen, Vitaminen (Ribofla-
vin, Vitamin B12), Antibiotika (Penicillin) und bio-
pharmazeutischen Peptiden und Proteinen (Insulin,
menschlicher Wachstumsfaktor). Die wichtigsten
derzeit in einer Menge über 1000 t jährlich mikrobi-
ell hergestellten Produkte sind in . Tab. 11.1 klassi-
fiziert nach ihrer geschätzten Weltjahresproduktion
aufgeführt. [36]
Die Weltmarktpreise für mikrobiell herge-
stellte Produkte variieren dabei stark in Abhän-
gigkeit der jeweiligen Anwendung und des
Herstellungsverfahrens.
Bei den in der . Tab. 11.1 aufgeführten Massen-
chemikalien hängt der Produktpreis insbesondere
ab von
55 den Kosten für das verwendete Kulturmedium
und Substrat,
55 der maximal erreichbaren
Produktkonzentration,
55 der maximal erreichbaren Produktausbeute,
55 der Zeit, in der die Produktbildung erfolgt (die
so genannte „Raum-Zeit-Ausbeute“),
55 dem Vorliegen des Produktes in extrazellulärer
oder intrazellulärer Form, und
55 der Zahl und Art der Verfahrensschritte, die zu
seiner Aufarbeitung notwendig sind.
Zur Kultivierung der Mikroorganismen im indust-
riellen Maßstab werden bevorzugt preiswerte Roh-
stoffe und wenn möglich Reststoffe verwendet.
Als gut verwertbare Kohlenstoffquellen werden
Glucose aus Stärkehydrolysaten, Saccharose und
Stärke eingesetzt. Daneben finden Reststoffe wie
Glycerin, Zuckerrohr- oder Zuckerrübenmelassen
Verwendung. Als Stickstoffquellen werden neben
den kostengünstigen Verbindungen Ammoniak,
Nitrat und Harnstoff auch komplexe Substanzge-
mische wie Maisquellwasser oder Proteinhydro-
lysate verwendet. Diese Praxis steht im Gegensatz
zu der in der Forschung üblichen Verwendung von
Reinchemikalien.
Um Inhibierungen und „Overflow“-Stoffwechsel
durch zu hohe Substratkonzentrationen zu verhin-
dern sowie um Sauerstofflimitierungen zu vermeiden
und trotzdem hohe Zell- und Produktkonzentratio-
nen im Bioreaktor erreichen zu können, werden die
Substrate häufig während der Kultivierung zugefüt-
tert („feed-batch“- oder „fed-batch“- Verfahren). Oft
ist es notwendig, für ein optimales Wachstum der
Mikroorganismen noch vitamin- und aminosäure-
haltige Mediumskomponenten wie z. B. Hefeextrakt
zuzusetzen. Bei der Herstellung spezieller Produkte
wie z. B. Antibiotika werden zusätzlich oft gezielt
chemisch hergestellte Vorstufen („Precursor“) zum
Medium dazugegeben.
Die klassischen und bereits schon zum Ende des
19. bzw. zu Beginn des 20. Jahrhunderts etablierten
Herstellungsverfahren (Backhefe, Bioethanol, Essig-
säure, Zitronensäure) wurden anfangs noch nicht als
Kapitel 11 · Mikrobielle Prozesse
451 11

. Tab. 11.1  Weltjahresproduktion wichtiger mikrobiell in Mengen über 1000 t/a hergestellter Produkte
[Quellenangaben im Text bzw. nach nach Straathof (2014)]

Produkt Weltjahresproduktion Anwendungsbereich

(geschätzte Menge)

Bioethanol 100 Mio. t Kraftstoff, Lösungsmittel, chemische Industrie

Futterhefe 3 Mio. t Futtermittel
Backhefe 2 Mio. t Lebensmittel
L-Glutamat 2,5 Mio. t Lebensmittel, chemische Industrie
Zitronensäure 1,7 Mio. t Lebensmittel, Waschmittel
L-Lysin 1,4 Mio. t Lebensmittel, Futtermittel, chemische
Industrie
n-Butanol 500.000 t Lösungsmittel, chemische Industrie
Milchsäure 370.000 t Lebensmittel, Leder- und Textilindustrie
Polyhydroxybuttersäure (PHB) 300.000 t chemische Industrie
L-Threonin 230.000 t Futtermittel
Essigsäure 190.000 t Lebensmittel, Reinigungsmittel
Aceton 150.000 t Lösungsmittel, chemische Industrie
1,2-Propandiol 150.000 t chemische Industrie
Gluconsäure 100.000 t Lebensmittel, Textil-, Metall- und Bauindustrie
Waschmittelenzyme 100.000 t Waschmittel
Ascorbinsäure (Vitamin C) 100.000 t Lebensmittel, Pharma
Itaconsäure 80.000 t Kunststoff- und Klebstoffherstellung,
Papierindustrie
β-Lactam-Antibiotika 75.000 t Pharma
Bernsteinsäure 50.000 t chemische Industrie
Xanthan 50.000 t Lebensmittel
1,3-Propandiol 45.000 t chemische Industrie
Vitamin B2 (Riboflavin) 30.000 t Lebensmittel
1,4-Butandiol 20.000 t chemische Industrie
L-Asparaginsäure 15.000 t Lebensmittel (Aspartam), chemische
Industrie
L-Phenylalanin 15.000 t Lebensmittel (Aspartam), Pharma
Erythritol 10.000 t Zuckerersatz und Kosmetik
Antibiotika (Spezialitäten) 5000 t Pharma
L-Tryptophan 4500 t Futtermittel, Lebensmittel, Pharma
Antibiotika (Tetracycline) 4500 t Pharma
L-Arginin 3000 t Pharma
L-Valin 1100 t chemische Industrie
 452 C. Syldatk et al.
Reinkulturen und ohne entsprechende Steriltechnik
durchgeführt. Dieses änderte sich erst ab Mitte der
1940er Jahre mit der Etablierung industrieller Ver-
fahren zur Herstellung von Antibiotika. Für diese
Verfahren waren hygienische Bedingungen und der
Ausschluss von unerwünschten Fremdkeimen unbe-
dingt erforderlich, womit die Entwicklung der ent-
sprechenden und heute für alle industriellen Ver-
fahren im großen Maßstab bis zu mehreren 100 m3
Volumen üblichen Steriltechnik begann.
In den 1960er-Jahren kamen vor allem durch
japanische Arbeiten mit der erstmaligen Herstellung
von Aminosäuren für den Lebensmittel- (L-Gluta-
mat), Futtermittel- (L-Lysin) und Pharmabereich
(L-Tryptophan) sowie von verschiedenen Vitami-
nen neue wichtige Stoffklassen dazu. Durch gezielte
Beeinflussung der hierzu verwendeten Mikroorga-
nismen gelang die Überproduktion und Sekretion
von intrazellulär und nur in niedrigen Konzentra-
tionen vorliegenden Primärmetaboliten als Produkte
in das Medium, was ein entscheidender Fortschritt
für die Produktaufarbeitung war. Für die anschlie-
ßende Produktisolierung und Aufarbeitung ist es
von großer Bedeutung, ob ein mikrobielles Produkt
11 extra- oder intrazellulär vorliegt: Bei einem extrazel-
lulär vorliegenden Produkt kann dieses nämlich nach
zuvor erfolgter Abtrennung der Zellen durch Zen-
trifugations- oder Filtrationsverfahren meist bereits
in wenigen Schritten durch Fällung oder Extrak-
tion aus dem zellfreien Kulturüberstand isoliert und
weiter aufgereinigt werden, während bei intrazellu-
lär vorliegenden Produkten ein Zellaufschluss und
. Tab. 11.2  Die Klassifizierung mikrobiell durch Fermentation hergestellter Produkte
Produktgruppe
Rekombinante Peptide und Proteine
Technische Enzyme
Primärmetabolite (als Intermediär-Produkte des
Stoffwechsels)
Primärmetabolite (als Endprodukte des Stoffwechsels)
Spezielle Produkte
Mikrobielle Biomasse
anschließend eine meist aufwändige Reinigung zum
Entfernen von Zelltrümmern und anderen Zellbe-
standteilen erforderlich ist (siehe 7 Abschn. 9.2).
Die Entwicklung immer besserer Produktions-
und Hochleistungsstämme, die heutzutage gezielt
mit gentechnischen Methoden durchgeführt wird,
erfolgte bis in die 1980er Jahre hinein noch mit tra-
ditionellen Methoden („Mutation“ durch UV-Licht
oder Chemikalien und anschließende „Selektion“
von Mutanten mit verbesserten Eigenschaften).
Die heute mikrobiell hergestellten Produkte
lassen sich dabei in mehrere Gruppen einteilen, wie
. Tab. 11.2 zeigt.
Eine wichtige Produktgruppe ist dabei mikrobi-
elle Biomasse, wobei damit sowohl lebende Zellen
(Backhefe, Starterkulturen für die Milch- und
Fleischverarbeitung) als auch abgetötete Biomasse
(Futterhefe) gemeint sein kann. Die so genannten
klassischen mikrobiellen Produkte wie Bioethanol,
Milchsäure und Essigsäure, aber auch Gluconsäure,
Aceton und Butanol sind Primärmetabolite und
Endprodukte des Energiestoffwechsels der jeweili-
gen Mikroorganismen. Sie werden von diesen meist
zur Entgiftung in das Medium ausgeschieden und
liegen also bereits natürlicherweise extrazellulär vor.
Ebenso liegen auch viele technische Enzyme, die z.
B. in Waschmitteln verwendet werden wie Amyla-
sen, Cellulasen, Proteasen und Lipasen, extrazellu-
lär vor, da sie von den jeweiligen Mikroorganismen
als sogenannte „Exoenzyme“ ausgeschieden werden,
um damit komplexe und ungelöst vorliegende Subs-
trate zunächst außerhalb der Zelle zu hydrolysieren
Beispiele
Humaninsulin, Interferon
Waschmittelenzyme
Vitamin B12, Vitamin B2, Aminosäuren, Zitronensäure,
Itaconsäure
Bioethanol, Milchsäure, Essigsäure, Gluconsäure
Speicherstoffe (Dextran), Exopolysaccharide (Xanthan),
Biotenside (Rhamnolipide), Farbstoffe (Carotinoide),
Aromastoffe (2-Phenylethanol), Sekundärmetaboliten, (β-
Lactamantibiotika)
Backhefe, Futterhefe, Starterkulturen
Kapitel 11 · Mikrobielle Prozesse
und vorzuverdauen. Intermediärprodukte sind Zwi-
schenprodukte des Stoffwechsels. Diese liegen in der
Regel intrazellulär und nur in niedrigen Konzentra-
tionen vor (z. B. Metaboliten des Citratzyklus, Ami-
nosäuren, Vitamine). Zu ihrer Überproduktion ist es
notwendig, entsprechende Hochleistungsstämme zu
verwenden, deren Stoffwechsel gezielt zuvor beein-
flusst wurde. Als spezielle Produkte werden tradi-
tionell solche Verbindungen bezeichnet, die nur bei
bestimmten Mikroorganismen vorkommen und
häufig auch nur unter speziellen Kultivierungs-
bedingungen gebildet werden. Dazu gehören z. B.
mikrobiell hergestellte Exopolysaccharide wie etwa
das Xanthan, das von den produzierenden Mikro-
organismen ausgeschieden wird, um sich vor pH-,
Salz- oder Temperaturstress zu schützen, oder die
mikrobiellen Biotenside, die von bestimmten Mik-
roorganismen gebildet werden, um wasserunlösliche
Substrate zu emulgieren und diese so leichter in die
Zelle aufnehmen zu können. Die meisten Antibio-
tika liegen ebenfalls extrazellulär vor, hier ist jedoch
unklar, ob der Grund dafür z. B. in einer Entgiftung
für den jeweiligen Produzentenstamm oder in einer
Abwehr von Nahrungskonkurrenten liegt. Ist keine
direkte Funktion für den betreffenden Produzenten-
stamm erkennbar, wie bei bestimmten Antibiotika
oder Alkaloiden, spricht man häufig von sekundä-
ren Stoffwechselprodukten. Als Beispiele für int-
razellulär vorliegende spezielle Produkte können
mikrobielle Speicherstoffe wie die Polyhydroxybut-
tersäure oder die so genannten Single cell oils genannt
werden, intrazellulär gebildete Triglyceride, die bei
bestimmten Hefen und Pilzen unter Stickstofflimi-
tierung gebildet werden. Die in . Tab. 11.2 genannten
rekombinanten heterologen Produkte liegen in der
Regel ebenfalls intrazellulär, häufig sogar in unlösli-
cher Form als so genannte Inclusion Bodies vor. Auch
hier sind zur Isolierung zunächst ein Zellaufschluss
und je nach gewünschter Produktreinheit eine Reihe
von mehr oder weniger aufwendigen Aufreinigungs-
schritten erforderlich, die in die späteren Produkt-
kosten eingehen. Angestrebt wird heute daher die
Entwicklung von Produktionsstämmen und -verfah-
ren, die eine Sekretion der rekombinanten Produkte
in das umgebende Medium erlauben bzw. mit der
Modifizierung der rekombinanten Produkte durch
hochspezifische „Tags“ am C- oder N-Terminus der
betreffenden Peptide und Proteine, um diese einfach
453 11
aus dem Zellaufschluss abtrennen und hochrein dar-
stellen zu können.
Bezüglich der Mechanismen zur Bildung mik-
robieller Produkte erkannte Gaden [12] Gesetzmä-
ßigkeiten und formulierte aus der Beobachtung der
klassischen mikrobiellen Produktionsverfahren drei
grundsätzliche Fermentationstypen, die heute immer
noch weitgehend Geltung haben und für die jeweilige
Prozessführung von Bedeutung sind.
Man unterscheidet demnach folgende mikrobi-
elle Produktbildungstypen: Typ I, bei dem sich das
Produkt direkt aus dem Primär- und Energiestoff-
wechsel ableitet und bei dem Substratverbrauchs-,
Wachstums- und Produktbildungsrate prak-
tisch parallel zueinander verlaufen und ein direk-
ter stöchiometrischer Zusammenhang zwischen
dem Substratverbrauch und der Produktbildung
besteht, Typ II, bei dem sich das Produkt zwar auch
aus dem Primärstoffwechsel ableitet, die biochemi-
sche Bildung jedoch über Seiten- bzw. Nebenwege
des Stoffwechsels erfolgt, was dazu führt, dass in ver-
schiedenen Zeitphasen des Prozesses unterschied-
liche Maxima für Substratverbrauchs-, Wachstums-
und Produktbildungsrate zu beobachten sind. Bei
Typ III schließlich sind Wachstum und Primärstoff-
wechsel zeitlich eindeutig von der Produktbildung
entkoppelt.
11.2 Mikrobielle Stoffproduktion
Exemplarisch werden in den folgenden Abschnitten
an Beispielen industrielle Verfahren zur mikrobiel-
len Stoffproduktion vorgestellt.
11.2.1 Biomasse
Mikrobielle Biomasse wird für eine Vielzahl von
Anwendungen im Pharma-, Lebensmittel- und Fut-
termittelbereich sowie in der Umwelttechnik und
Landwirtschaft produziert. Dieses reicht von speziel-
len Kulturen für die Regenerierung der Darmflora
nach einer Antibiotikabehandlung über die Herstel-
lung von Backhefe, Hefen für die Bier- und Weinher-
stellung, Starterkulturen für die Käse-, Jogurt- und
Kefirproduktion, für die Fleischverarbeitung bis
hin zur Herstellung von Bioinsektiziden (Bacillus
 454 C. Syldatk et al.

5RKPDWHULDOLHQ

$QVHW]HQXQG0LVFKHQ
GHU.XOWXUPHGLHQ S+.RUUHNWXUPLWWHO 1lKUVWRII]XGRVDJH

,PSINXOWXU %HOIWXQJ
)HVWVWRIIDEWUHQQXQJ

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GHU.XOWXUEUKH

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6WDQGDUGLVLHUXQJGHU%LRPDVVH

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11 JHNKOWH/DJHUXQJ
GHU%LRPDVVH3XOYHU
JHNKOWH/DJHUXQJ
GHU%LRPDVVH3XOYHU
7LHIWHPSHUDWXUODJHUXQJ
. Abb. 11.1  Schematischer Ablauf der Produktion von Starterkulturen
thuringiensis) und Starterkulturen für Kompost- und
Silageherstellung, um nur einige Beispiele zu nennen.
Mit großem Abstand Hauptprodukt ist weltweit die
Produktion der Backhefe Saccharomyces cerevisiae
in unterschiedlichen Varianten mit geschätzten
1,8 Mio. t/a. Während für die genannten Anwendun-
gen lebende und aktive mikrobielle Kulturen erfor-
derlich sind, wird abgetötete bzw. pasteurisierte und
ggf. getrocknete Biomasse häufig als vitaminreiches
Lebens- und Futtermittel oder nach Aufschluss der
Mikroorganismen als komplexe vitamin- und ami-
nosäurereiche Mediumskomponente angeboten
(Hefeextrakt, Bacto-Pepton).
Die Herstellung von mikrobieller Biomasse
erfolgt in der Regel unter aeroben Bedingungen in
Bioreaktoren bis zu 500 m3 Volumen. Zielsetzung ist
GHU%LRPDVVH3DVWH
die möglichst schnelle Bereitstellung hoher Biomas-
sekonzentrationen in gleichbleibender Qualität. Als
Stammkulturen werden dafür in der Regel als Lebens-
mittel und Futtermittel zugelassene „GRAS“-Mikro-
organismen verwendet (= Generally regarded as safe),
von denen keinerlei schädliche Effekte auf Mensch,
Tiere und Pflanzen bekannt sind und die keine toxi-
schen oder unerwünschten Nebenprodukte bilden
sollten. Sie sollten weiterhin tolerant gegen pH-
und Temperaturschwankungen sein, nicht lysieren
und während der Kultivierung möglichst nicht zur
Schaumbildung neigen, so dass auf die Zugabe von
Antischaummitteln weitgehend verzichtet werden
kann. Für ihre Kultivierung werden Minimal- oder
Komplexmedien mit definierter Zusammenset-
zung meist mit Kohlenhydraten wie Glucose oder
Kapitel 11 · Mikrobielle Prozesse
Saccharose als C-Quelle verwendet. Diese müssen im
Lebensmittelbereich jedoch für die spätere Verwen-
dung der mikrobiellen Kulturen ebenfalls bestimm-
ten Anforderungen genügen und sind daher häufig
zertifiziert (z. B. für Starterkulturen zur Milch- und
Fleischverarbeitung). Um in kurzer Zeit hohe Zell-
konzentrationen erreichen zu können und gleichzei-
tig Wachstumsinhibierungen durch zu hohe Subst-
ratkonzentrationen oder Sauerstofflimitierungen zu
vermeiden, wird die C-Quelle während der Kultivie-
rung häufig im „fed-batch“-Verfahren zugefüttert.
Nach Erreichen der maximalen Zellkonzentration
werden die Kulturen dann meist in der Übergangs-
phase des Wachstums beendet und die Zellmassen,
ggf. nach Kühlen und Zwischenlagern, entsprechend
weiter aufgearbeitet. Je nach Eigenschaften der ver-
wendeten Mikroorganismen können diese unter
Erhalt der Lebensfähigkeit und Aktivität durch Zen-
trifugation oder Filtration abgetrennt und nach Ein-
dickung gekühlt gelagert werden (Backhefe). Es
kann eine schonende Trocknung erfolgen oder eine
Gefriertrocknung durchgeführt werden (bei vielen
Milchsäurebakterien). . Abb. 11.1 zeigt den schema-
tischen Ablauf der Produktion von Starterkulturen.
11.2.2 Primärmetabolite
Primärmetabolite sind niedermolekulare Substan-
zen, die für die Produktionsorganismen als Zwi-
schen- oder Endprodukt des Metabolismus eine
wichtige Rolle spielen. Während Endprodukte wie
Ethanol, Milchsäure und Essigsäure natürlicherweise
bereits extrazellulär in ausreichenden Konzentratio-
nen vorliegen ist das bei Intermediärprodukten wie
Bernsteinsäure, Zitronensäure und den proteinoge-
nen L-Aminosäuren nicht der Fall. Normalerweise
liegen diese intrazellulär und in geringen Konzentra-
tionen vor. Deren Überproduktion erfordert die Ver-
wendung ausgewählter Mikroorganismen. Aufgrund
der in der Regel geringen Wertschöpfung dieser Pro-
dukte ist bei den Produktionsverfahren auf kosten-
günstige Substrate wie Glucose und Stärke sowie
preiswerte Reststoffe (Melasse, Maisquellwasser, etc.)
zurückzugreifen. Außerdem sind die Aufarbeitungs-
kosten niedrig zu halten.
455 11
Bioethanol
Hans-Jörg Menger
Die mikrobielle Herstellung von Ethanol (Bioetha-
nol) hat in den letzten Jahren eine große Bedeutung
als Kraftstoffkomponente durch die Erneuerbare-
Energien-Richtlinie der EU gewonnen, wodurch die
Mineralölindustrie verpflichtet ist, einen festen und
anwachsenden Mindestanteil von Biokraftstoffen in
den Verkehr zu bringen.
In 2014 war in Europa eine Produktionskapazität
für Bioethanol von ~ 3.600.000 t installiert, davon ca.
20 % in Deutschland. Mehr als 98 % der installier-
ten europäischen Kapazität sind Anlagen, die sich
der Technologie der sogenannten ersten Genera-
tion bedienen, also der Verarbeitung von raffinier-
ten Zucker und zuckerhaltigen Rohstoffen.
Als Rohstoffe wurden 2014 in diesen Bioraf-
finerien Mais (42 %), Weizen (33 %), Zuckerrü-
ben (18 %) und weitere Getreidearten wie Gerste,
Roggen, Triticale (7 %) verarbeitet. Dies entspricht
ca. 2 % des europäischen Getreideanbaues und 8 %
der Zuckerproduktion.
Ein wichtiger ökonomischer Bestandteil dieser
Bioethanol-Anlagen, ist die Ausnutzung aller entste-
henden Prozessströme (s. . Abb. 11.2). Die Anlagen
sind daher als Bioraffinerien zu verstehen, welche
neben Bioethanol große Mengen an Lebens- und
Futtermitteln wie Kleie, Gluten, Trockenschlempe
(Distillers Dried Grains with Solubles = DDGS) und
CO2 produzieren. Im Prinzip findet hier eine Ver-
edlung von minderwertigen Getreideprodukten in
hochwertige Lebens- und Futtermittel statt.
Die viel diskutierte zweite Generation von Bio-
ethanol aus Lignocellulose-haltiger Biomasse oder
weiterführend die Technologie der dritten und
vierten Generation ist aktuell in nur wenigen groß-
technischen Produktionsanlagen vertreten. Haupt-
gründe hierfür sind noch zu hohe Produktionskosten
und die Sicherstellung einer kontinuierlichen Versor-
gung mit den nötigen Rohstoffen.
Die aktuelle Herstellung von Bioethanol mit Sac-
charomyces cerevisiae (Backhefe) auf Basis von Stärke
ist in . Abb. 11.2 dargestellt. Sie beginnt mit dem
Mahlen des Getreides. Die mechanische Zerkleine-
rung der Getreidekörner dient zur Herauslösung des
 456 C. Syldatk et al.
=XFNHU
VLUXSH
9HUPDKOXQJ 9HU]XFNHUXQJ
)HUPHQWDWLRQ
 :DVVHU  +HIH
*HWUHLGH  (Q]\PH
7URFNQXQJ
(LQGLFNXQJ
)OVVLJVFKOHPSH
. Abb. 11.2  Schematische Darstellung der Herstellung von Bioethanol und von DDGS aus Getreide und Zuckersirupen
Stärkeanteils und stellt somit den ersten Prozess-
schritt da. Einerseits kommt hier die Vermahlung
mit klassischen Hammermühlen zur Anwendung,
11 bei denen das zermahlene Korn mit all seinen
Bestandteilen eingemischt wird. Der Einsatz erfolgt
in Anlagen, die nach der Destillation die nicht fer-
mentierbaren Inhaltsstoffe entweder trocknen und
als DDGS und/oder als flüssiges Futtermittel auf
den Markt bringen. Alternativ wird die aus der Mül-
lereitechnologie bekannte Technik der Vermahlung
mit Walzenmühlen eingesetzt. Diese Vermahlung
erlaubt ein Abtrennen von Spelzen/Schalenteilen,
welche separat verkauft werden können. Die Tech-
nologie wird meist in Anlagen eingesetzt, welche
eine Stärkemilch für die Fermentation produzieren,
sowie Gluten, das in den Lebens- oder Futtermittel-
markt geht.
In dem nächsten Prozessschritt, der nahezu
anaeroben Fermentation, die auch in nicht sterilen
Medien erfolgen kann, wird die zuvor enzymatisch
zu Glucose verzuckerte Stärke durch Hefe in Ethanol,
CO2 und Wärme umgewandelt. Man unterschei-
det in der Praxis die klassische batch-Fermentation
und die kontinuierliche Fermentationstechnologie.
Je nach anfänglicher Zuckerkonzentration können
Titer bis zu 15 % Ethanol erreicht werden. Die Hefe
erfüllt in diesem Prozessschritt nicht nur die Aufgabe
ELRJHQHV 'HVWLOODWLRQ
&2 5HNWLILNDWLRQ
'HK\GUDWDWLRQ
0DLVFKH (QWZlVVHUXQJ
 9RO
%LRHWKDQRO
3HOOHWLHUXQJ
:HL]HQVFKURW
=XFNHU
''*6 +HIH
%LRHWKDQRO
&2
als Gärungsumsetzer, sondern reichert auch den
Proteingehalt dieses Produktstromes an, was für die
erzeugten Futtermittel sehr wertgebend ist.
Die Reingewinnung des Ethanols aus der wäss-
rigen Fermentationsbrühe erfolgt durch Destillation
über mehrere Prozesskolonnen bis zur gewünsch-
ten Produktqualität. Die erforderliche Trocknung des
Ethanols wird mittels Molekularsieb-Dehydrierung
durchgeführt. Das Endprodukt erreicht eine Reinheit
von bis zu 99,95 % w/w.
Die verbleibende Schlempe wird zwecks Ener-
gierückgewinnung teilweise im Prozess rezykliert,
der Rest wird in der Eindampfung aufkonzentriert.
Feste Rückstände aus der Getreidealkoholerzeugung
werden zu Trockenschlempe (DDGS) verarbeitet, die
als Tierfutter Verwendung findet. Die konzentrierte
Melasse aus der Zuckerverarbeitung wird eben-
falls als Tierfutterzusatz eingesetzt oder als Dünger
ausgebracht.
Da es sich bei der Herstellung von Bioethanol,
Futter- und Lebensmittel in einer Bioraffinerie um
einen sehr energieintensiven Prozess handelt, ist es
für die Ökonomie eines Werkes unabdingbar, dass
die energetische Integration und die Maßnahmen zur
Energierückgewinnung auf einem maximal mögli-
chen Niveau sind um hier Ressourcen schonend zu
produzieren. [31]
Kapitel 11 · Mikrobielle Prozesse
Organische Säuren
Jochen Büchs und Dirk Kreyenschulte
Organische Säuren gehören zu den klassischen mik-
robiellen Produkten. Sie haben bereits seit langem in
verschiedenen Bereichen des täglichen Lebens eine
wichtige Bedeutung, insbesondere in Lebensmit-
teln und Haushaltsprodukten. Zu den biotechnolo-
gisch hergestellten organischen Säuren gehören Zit-
ronensäure, Milchsäure, Gluconsäure, Itaconsäure
und Bernsteinsäure sowie Essigsäure, die in diesem
Buch an anderer Stelle behandelt ist. Das mit Abstand
wichtigste Produkt mit einer geschätzten Weltjahres-
produktion von 1,7 Millionen Tonnen ist dabei die
Zitronensäure, die hauptsächlich als Säuerungsmit-
tel in der Lebensmittelherstellung und als Komplex-
bildner in Waschmitteln eingesetzt wird.
Die traditionelle Verwendung mikrobiell herge-
stellter organischer Säuren liegt im Lebensmittelbe-
reich. Diese Produkte haben seit längerem zuneh-
mend eine wichtige Bedeutung als Bestandteile
von Waschmitteln, Reinigungsmitteln, in der Bau-
industrie oder sogar als umweltfreundliches Streu-
salz gewonnen. Itaconsäure wird ausschließlich in
der Kunststoff-, Papier- und Klebstoffindustrie ver-
wendet. Inzwischen hat auch die chemische Industrie
mikrobiell hergestellte organische Säuren als mög-
liche alternative Ausgangsmaterialien zur Synthese
von Plattformchemikalien und Polymeren iden-
tifiziert. Die Europäische Union zählt diese neben
anderen Verbindungen zu den wichtigsten 13 Platt-
formchemikalien, die zukünftig auf Basis nachwach-
sender Rohstoffe hergestellt werden können. Bei-
spielhaft dafür ist die Etablierung neuer Verfahrens
zur Herstellung von Bernsteinsäure.
Die Verfahren zur industriellen Produktion orga-
nischer Säuren im großen Maßstab wurden überwie-
gend erst im 20. Jahrhundert erarbeitet und standen
bzw. stehen dabei zum Teil immer noch in Konkur-
renz zur chemischen Herstellung dieser Verbin-
dungen auf Erdölbasis wie z. B. Bernsteinsäure. Der
Vorteil der biotechnologischen Produktion besteht
jedoch zunehmend in der Unabhängigkeit von
Erdölprodukten.
Entscheidend für die Herstellungskosten sind
dabei neben den jeweiligen erreichbaren Endpro-
duktkonzentrationen und den Raum-Zeit-Aus-
beuten vor allem die Kosten für die verwendeten
457 11
Kulturmedien. Als preiswerte Substrate werden hier
vor allem Abfallsubstrate wie Stärkehydrolysate, Sac-
charose sowie Zuckerrüben- und Zuckerrohrmelasse
verwendet.
Die Produktion der organischen Säuren leitet
sich direkt aus dem mikrobiellen Primärstoffwech-
sel ab und zwar in der Regel entweder aus der Glyko-
lyse oder dem Citratzyklus. In der Regel werden die
organischen Säuren in das Medium ausgeschieden
und liegen extrazellulär vor. Während die Milchsäure
ein Endprodukt ist, das als Resultat einer Gärung
mit verschiedenen Lactobacillus species durch die
Reduktion von Pyruvat am Ende der Glykolyse ent-
steht, ist im Gegensatz dazu die Gluconsäure ein
Endprodukt einer unvollständigen Oxidation von
Glucose.
Zitronensäure als Intermediärprodukt liegt nor-
malerweise intrazellulär und nur in geringen Kon-
zentrationen vor, kann aber durch Wahl geeigneter
Prozessbedingungen mit verschiedenen Aspergillus
species und Hefe-Stämmen unter aeroben Bedin-
gungen überproduziert und in das Kulturmedium
sekretiert werden. Itaconsäure entsteht als ein
Nebenprodukt des Citratzyklus. Bei der Herstellung
beider Verbindungen spielen anaplerotische Reak-
tionen eine wichtige Rolle. Bernsteinsäure als weite-
rer Metabolit des Citratzyklus schließlich wird mit
einem rekombinanten Escherichia coli- bzw. einem
mit gentechnisch bearbeiteten Saccharomyces cere-
visiae-Stamm in speziellen Verfahren ebenfalls unter
Nutzung der anaplerotischen Reaktionsequenzen
unter anaeroben Bedingungen produziert [4].
Als Beispiel einer mit Pilzen hergestellten orga-
nischen Säure wird die Herstellung der Itaconsäure
hier detailliert beschrieben. Die Itaconsäure oder
Methylenbernsteinsäure ist eine ungesättigte C5-
Säure mit konjugierten Doppelbindungen und zwei
Carboxylgruppen. Die Itaconsäure wurde erstma-
lig 1836 als thermisches Zerfallsprodukt der Zit-
ronensäure bei trockener Destillation beschrieben
(BAUP). Als Nebenprodukt des Citratzyklus wurde
sie erstmals 1931 als Stoffwechselprodukt von Asper-
gillus itaconicus nachgewiesen. In den Jahren 1939
bis 1946 wurde gezeigt, dass auch einige Stämme von
Aspergillus terreus Itaconsäure ausscheiden. Che-
misch eng mit Methacrylsäure verwandt findet die
Itaconsäure vielfältige Anwendungsmöglichkeiten,
etwa in Harzen, Fasern, Kunststoffen und Tensiden.
 458 C. Syldatk et al.
Hauptanwendungsgebiet ist derzeit die Produktion
von Styrol-Butadien-Kautschuk. Die Produktion von
Itaconsäure ist seit 2000 von 15.000 auf ca. 40.000
Tonnen pro Jahr in 2011 gestiegen, wobei der Preis
von ca. 3,8 €/kg auf 1,6–1,8 €/kg gesunken ist.
Die Biosynthese der Itaconsäure ist sehr ähnlich
der Zitronensäure und erfolgt zunächst über Glyko-
lyse und den Tricarbonsäurezyklus. Ein spezielles
Enzym, die cis-Aconitsäure-Decarboxylase, ist für
die Decarboxylierung der cis-Aconitsäure verant-
wortlich. Dieses Enzym ist im Zytoplasma lokalisiert.
Als Vorstufe von Itaconsäure wird cis-Aconitsäure
durch den putativen mitochondrialen Transporter
MttA aus den Mitochondrien in das Zytoplasma
transportiert. Als unerwünschtes Nebenprodukt
kann bei geringen pH-Werten neben Bernsteinsäure
Itaweinsäure gebildet werden. Durch Calciumzugabe
kann die dafür verantwortliche Itaconsäureoxidase
jedoch gehemmt werden.
In den modernen Produktionsverfahren werden
heute ausschließlich Aspergillus terreus-Stämme ver-
wendet, die sich von einem einzigen Stamm ablei-
ten, der bereits 1939 in einer gezielten Suche isoliert
wurde. Nach anfänglicher Herstellung im Oberflä-
11 chenverfahren war ein entscheidender Schritt zur
industriellen Herstellung von Itaconsäure die Ent-
wicklung eines Submersverfahrens mit frei suspen-
dierter Biomasse. In dieser Verfahrensweise wird seit
1955 Itaconsäure industriell mit Aspergillus terreus-
Stämmen in 100 m3-Bioreaktoren hergestellt. Die
Produktionsverfahren zur Herstellung von Itacon-
säure arbeiten wie bei der Herstellung von Zitronen-
säure mit Komplexmedien und kohlenhydrathaltigen
Substraten. Auch hier werden verschiedene Aus-
gangsmaterialien wie Stärkehydrolysate, Saccharose
in verschiedenen Reinheitsstufen, Zuckerrohr-Sirup
mit bis zu zwei Dritteln in Invertzucker überführter
Saccharose, Zuckerrohr-Melasse oder Rübenzucker-
Melasse als Substrate verwendet. Werden Hydroly-
sate oder Sirupe eingesetzt, wird zur Entfernung von
inhibierenden Metall-Ionen eine Vorbehandlung mit
Fällungsmitteln wie Kaliumhexacyanoferrat oder mit
Kationenaustauschern durchgeführt. Ebenso kann
mit 39–42 °C bei deutlich höheren und für Pilze
ungewöhnlichen Temperaturen gearbeitet werden,
wodurch Kühlkosten gespart werden können. Die
Temperaturtoleranz der Produktionsstämme wurde
durch Mutageneseprogramme erreicht.
Optimal für die Itaconsäurefermentation sind
hohe Glucosekonzentrationen zwischen 120 und
180 g/L. Ähnlich der Zitronensäureproduktion
führen bereits kurze Phasen unzureichender Sauer-
stoffversorgung dazu, dass keine Itaconsäure mehr
produziert wird. Nach dem Auskeimen der Sporen
und einer Ansäuerung des Mediums auf pH-Werte
von ca. 2 wird Itaconsäure gebildet. 180 g/L Glucose
werden innerhalb von 7 Tagen zu ca. 86 g/L Itacon-
säure umgesetzt. Eine anfängliche Phase mit gerin-
gem pH wird dabei benötigt, um das zur Itaconsäu-
reproduktion benötigte Enzymsystem zu bilden.
Im weiteren Verlauf der Kultivierung kann der pH
jedoch ohne negative Effekte auf höhere Werte ein-
gestellt werden. Diese Strategie wurde 1962 durch
Pfizer in einem Prozess umgesetzt, in dem der pH
nach 24 Stunden durch die Zugabe von Calcium-
carbonat von 3,1 auf 3,8 erhöht wurde. Im Jahr
2014 konnte durch diesen pH-Shift in einem opti-
mierten Medium eine maximale Produktkonzentra-
tion von 146 g/L erreicht werden, wobei zusätzliche
Glucose zugefüttert wurde.
Die Aufarbeitung der Itaconsäure besteht aus
fünf Schritten. Die Kultur wird zunächst filtriert, um
das Pilzmycel zu entfernen. Anschließend wird das
Filtrat durch Verdampfen auf etwa 350 g/L Itacon-
säure aufkonzentriert. Aus diesem Konzentrat wird
die Itaconsäure durch Kristallisation bei 15 °C gewon-
nen. Der nach der ersten Kristallisation verbleibende
Überstand wird ein weiteres Mal eingedampft und
kristallisiert, um die Ausbeute zu erhöhen. Diese
Kristalle können anschließend wieder gelöst und
durch Behandlung mit Aktivkohle entfärbt werden.
Nach Rekristallisierung aus dem wiederum konzen-
trierten Überstand wird die Itaconsäure getrocknet
und anschließend abgepackt. Die Ausbeuten liegen
bei 95 % für den Filtrationsschritt, bei 98 % für den
Konzentrationsschritt, 95 % für die Kristallisations-
schritte, so dass eine Gesamtausbeute bei der Auf-
arbeitung von etwa 80 % erreicht wird. Die erzielte
Reinheit liegt dabei zwischen 97 % und 99 %. Werden
höhere Reinheiten benötigt können sich weitere Auf-
reinigungsschritte anschließen. Während Verdamp-
fungskristallisation und Fällung zur Itaconsäureauf-
reinigung somit bereits etabliert sind, gibt es noch
diverse andere potentiell geeignete Methoden, die
noch nicht in industriellen Prozessen angewandt
werden. Neben Umkehrosmose und Elektrodialyse
Kapitel 11 · Mikrobielle Prozesse
(s. 7 Abschn. 9.3.4) stellt die Reaktivextraktion von
Itaconsäure mittels aliphatischer Aminverbindungen
oder Phosphorsäureestern wie Tri-n-butyl-phosphat
hier eine mögliche Alternative dar. [24]
Aminosäuren
Lothar Eggeling
Aminosäuren sind die Bausteine der Proteine und
damit für alle Lebewesen lebensnotwendig. Aller-
dings besitzen Mensch und Tier nur begrenzte Syn-
thesemöglichkeiten dafür. So kann der Mensch acht
der 20 proteinbildenden Aminosäuren nicht syn-
thetisieren. Diese essentiellen Aminosäuren sind
die drei verzweigtkettigen Aminosäuren L-Leucin,
L-Isoleucin und L-Valin, zusammen mit L-Threonin,
L-Lysin, L-Methionin, L-Phenylalanin und L-Tryp-
tophan. Von herausragender wirtschaftlicher Bedeu-
tung sind Aminosäuren in der Futtermittelindustrie.
Die Zugabe von Aminosäuren zu Futtermitteln führt
zu einer ausgewogenen Aminosäurezusammenset-
zung, die dem tatsächlichen Bedarf angepasst ist.
Weizen als Futtermittel hat z. B. einen niedri-
gen L-Lysinanteil, sodass die anderen Aminosäuren
nicht vollständig genutzt werden können. Zugabe
von L-Lysin erhöht den Anteil der Verwertung der
anderen Aminosäuren. Aufgrund zunehmenden
Fleischkonsums werden vermehrt Aminosäuren
für die Bereitstellung als Futtermittelzusatz benötigt.
Insbesondere sind dies L-Lysin, D,L-Methionin und
L-Threonin, deren Bedarf jährlich um 5–7 % steigt.
Mit Ausnahme von Glycin, D,L-Methionin und
L-Aspartat werden Aminosäuren mikrobiell herge-
stellt. Als Aminosäureproduzenten werden Coryne-
bacterium glutamicum oder Escherichia coli-Stämme
benutzt. E. coli hat den Vorteil, dass sein Tempera-
turoptimum von 37 °C geringere Kühlungskosten bei
der Fermentation erfordert als bei der Kultivierung
von C. glutamicum, dessen Temperaturoptimum bei
etwa 30 °C liegt. Demgegenüber sind Fermentationen
mit C. glutamicum unempfindlich gegenüber Phagen-
infektionen was bei E. coli, besonders in tropischen
Ländern, ein großes Problem sein kann. Die Wildty-
pisolate von E. coli und C. glutamicum bilden jeweils
nur die Mengen an Aminosäure die sie selbst zum
Wachstum benötigen. Dies bewirken effiziente Kon-
trollmechanismen, wie die allosterische Kontrolle von
459 11
Syntheseenzymen durch die entsprechenden Ami-
nosäuren oder die Kontrolle der Transkriptionsini-
tiation durch den Beladungszustand der tRNA oder
auch globale Regulationsmechanismen. Deswegen
werden Mutantenstämme gewonnen, die die Ami-
nosäure verstärkt synthetisieren. In der klassischen
Stammentwicklung werden die Zellen dazu ungerich-
tet, z. B. durch UV-Bestrahlung, mutagenisiert, und in
großangelegten Screenings wird der Stamm mit der
besten Aminosäureausscheidung ausgewählt.
Heutzutage bieten molekulare rekombinante
Techniken die Möglichkeit, gezielt Mutationen in
das Chromosom einzuführen oder Gene überzuex-
primieren. Dies zielt darauf ab, den gesamten Stoff-
fluss einschließlich der Transportvorgänge in Rich-
tung der gewünschten Aminosäure zu erhöhen, die
Bildung unerwünschter Nebenprodukte zu verrin-
gern und globale Kontrollmechanismen zu überwin-
den. Dies setzt natürlich Kenntnisse zu den jeweili-
gen molekularen Mechanismen voraus, die erforscht
werden müssen. Zusätzlich verwenden molekulare
Techniken oft Gene, die, wie erwähnt, aus klassisch
gewonnenen Stämmen stammen. Darüber hinaus
können klassisch gewonnene Stämme auch die Basis
bilden, um durch molekulare rekombinante Techni-
ken eine Produksteigerung zu erreichen.
L-Lysin ist nach L-Glutamat die wichtigste fer-
mentativ hergestellte Aminosäure auf dem Welt-
markt. Es wird hauptsächlich für Schweine- und
Hühnerfutter-Formulierungen benutzt. Die Ami-
nosäure wird mit C. glutamicum, z. T. aber auch mit
E. coli produziert. Bausteine des Kohlenstoffskeletts
von L-Lysin sind Oxalacetat und Pyruvat die im Zen-
tralstoffwechsel bereitgestellt werden. Oxalacetat
wird zunächst durch Transaminierung zu L-Aspar-
tat umgewandelt (. Abb. 11.3). Aspartat ist Substrat
der Aspartatkinase, die ein sehr wichtiges Kontroll-
element der Synthese darstellt. Im Wildtyp von C.
glutamicum ist die Aspartatkinaseaktivität bei gleich-
zeitiger Anwesenheit von L-Lysin plus L-Threonin
in einer Konzentration von je etwa 1 mM nahezu
vollständig gehemmt. Eine weitere wichtige Kont-
rolle innerhalb des verzweigten Synthesewegs findet
auf der Stufe des Aspartatsemialdehyds statt. Aspar-
tatsemialdehyd wird einerseits mit Pyruvat durch
die Dihydrodipicolinatsynthase in den spezifischen
L-Lysinsyntheseweg eingeschleust, andererseits für
die Synthese von L-Threonin, L-Methionin und
 460 C. Syldatk et al.
. Abb. 11.3  Schema zur L-Lysin-
Synthese
11
L-Isoleucin verwendet. An dieser Verzweigung wird
der Fluss in die Lysinsynthese durch eine begren-
zende Dihydrodipicolinatsynthase Aktivität limi-
tiert. Der Fluss in Richtung Threoninsynthese wird
durch Hemmung der Homoserindehydrogenaseak-
tivität durch L-Threonin kontrolliert, und zusätzlich
noch durch Repression des entsprechenden hom-
Gens durch L-Methionin. Ausgehend von Piperidin-
dicaboxylat erfolgt in der weiteren L-Lysinsynthese
der Einbau der zweiten Aminogruppe. Dies geschieht
entweder über den Dehydrogenase- oder den Trans-
aminaseweg. Im Dehydrogenaseweg wird in einer
Einschrittreaktion die Aminogruppe direkt über
die Dehydrogenase eingebaut. Im Transaminaseweg
dagegen wird Glutamat als Aminodonor benutzt,
und der Weg erfolgt insgesamt über 4 Schritte und ist
deswegen aufwändiger. Die parallelen Wege ermög-
lichen C. glutamicum eine sehr flexible Anpassung
an unterschiedliche Stickstoffverfügbarkeit wie es
z. B. im Boden der Fall ist, da die Dehydrogenase nur
eine geringe Affinität zu Ammonium hat. Bei hoher
Ammoniumkonzentration erfolgt die Lysinsynthese
über den Dehydrogenaseweg, wogegen bei niedriger
Ammoniumkonzentration der aufwändigere Trans-
aminaseweg benutzt wird.
Das in der Zelle synthetisierte L-Lysin wird
durch das Exportprotein LysE aktiv ausgeschieden.
Da L-Lysin positiv geladen ist, ist eine passive Diffu-
sion von L-Lysin über die Zytoplasmamembran nicht
möglich. Das Exportprotein ist mit einem Moleku-
largewicht von 25081 relativ klein und besitzt sechs
transmembrane Helices. Höchstwahrscheinlich ist
der Exporter als Dimer aktiv, da bekannt ist, dass
Transporter zur Funktion mindestens 10 transmem-
brane Helices besitzen müssen, und für verwandte
Proteine von LysE der Aufbau als Dimer nachgewie-
sen ist. Die Synthese von LysE wird durch den Regu-
lator LysG kontrolliert. Erst bei erhöhter zellinterner
Kapitel 11 · Mikrobielle Prozesse
L-Lysinkonzentration von über 20 mM bewirkt dieser
Regulator die Transkription des Exportergens und
damit die Synthese des Exportproteins. Wie weiterge-
hende Untersuchungen zeigten, dient dieses System
im Wildtyp dazu, eine Akkumulation von L-Lysin
in der Zelle zu verhindern, wenn L-Lysin aus extern
verfügbaren Peptiden stammt. Wie viele Bakterien
nimmt C. glutamicum Peptide auf und hydrolysiert
sie zu ihren Aminosäurebausteinen. Ist aber zu viel
L-Lysin aus solchen Quellen vorhanden, kann es zell-
intern zu hohen wachstumshemmenden Konzentra-
tionen von über 1 M L-Lysin kommen, da C. glutami-
cum diese Aminosäure nicht abbauen kann. Folglich
trägt LysE zur Regulation der zytosolischen L-Lysin-
konzentration unter natürlichen Bedingungen bei,
wenn Peptide verwertet werden, wogegen andere
Bakterien dies durch Abbau von L-Lysin erreichen.
Eine signifikante L-Lysinbildung von etwa 20 g/L
wurde schon vor vielen Jahren mit Mutanten von C.
glutamicum erhalten, die Homoserin-auxotroph
sind. In diesen Stämmen kann das Zwischenprodukt
Aspartatsemialdehyd nur noch zu Lysin umgesetzt
werden. Bei Zugabe niedriger Threoninkonzentra-
tionen zum Medium wird dann die Aspartatkinase
trotz hoher Lysinkonzentration nicht gehemmt. Eine
Überproduktion von Lysin erhält man außerdem mit
Mutanten von C. glutamicum, bei denen die Aspar-
tatkinase nicht mehr gehemmt wird. Solche Mutan-
ten kann man unter Nutzung des Lysin-Antime-
taboliten (S)-Aminoethylcystein (AEC) isolieren.
AEC bindet im Wildtyp wie Lysin an das allosteri-
sche Zentrum der Aspartatkinase, wodurch es zur
Wachstumshemmung kommt. In AEC-resistenten
Mutanten ist dagegen das allosterische Zentrum der
Aspartatkinase so verändert, dass weder AEC noch
Lysin binden. Eine so veränderte Aspartatkinase
unterliegt somit keiner Feedback-Hemmung mehr,
und entsprechend scheiden diese Mutanten von C.
glutamicum unter optimalen Kulturbedingungen bis
zu 50 g/L Lysin ins Medium aus.
In der großtechnischen Produktion von L-Lysin
mit Mutanten von C. glutamicum wurde in der
Vergangenheit hauptsächlich Melasse als Kohlen-
stoff- und Energiequelle eingesetzt. Melasse aus der
Zuckerindustrie enthält aber neben dem Zucker
auch Abfallprodukte und variiert saisonal stark,
sodass keine gute Reproduzierbarkeit des Prozesses
gegeben ist. Deswegen wird heute vornehmlich reine
Glucose oder Saccharose als Substrat benutzt. Als
461 11
Stickstoffquelle dient Ammoniumsulfat oder wäss-
riges Ammoniumhydroxyd. Zusätzlich wird Biotin
zugefügt, da C. glutamicum dieses Coenzym nicht
selbst synthetisieren kann, sowie Glycinbetain zur
osmotischen Stabilisierung der Zellen. Ausgehend
von einem Schüttelkolben erfolgen Vorkultivierun-
gen in Bioreaktoren zunehmender Größe bis hin
zum für die Produktion benutzten Reaktor, der bis
zu 750 m3 umfassen kann. Dabei liegt die Animpf-
dichte über 0,1 g Zellmasse pro Liter, da andernfalls
die lag-Phase des Prozesses zu lang ist. Die Stämme
zeigen eine hohe spezifische Produktionsrate, die die
bei entsprechenden Biomassekonzentrationen 4 g L-1
h-1 Raum-Zeit Ausbeute erreichen kann.
Ferner haben sie eine hohe Toleranz bezüglich
der hydrostatischen Druckunterschiede und der
Scherkräfte im Fermenter, sodass im Allgemeinen
eher die technischen Möglichkeiten des Reaktor-
systems wie z. B. Kühlung und Sauerstoffversor-
gung limitierend sind, als die des Produktionsstam-
mes. Nach Verbrauch des anfänglich vorgelegten
Zuckers wird dieser kontinuierlich zugefügt und
L-Lysin akkumuliert in Konzentrationen bis weit
über 170 g/L. Durch Verwendung von Ammonium-
sulfat als Stickstoffquelle wird die ausgeschiedene
Aminosäure im Verlauf der Fermentation neutrali-
siert, sodass L-Lysin als Sulfatsalz vorliegt. Die Pro-
duktivität der gesamten Anlage kann weiter erhöht
werden, wenn nach Erreichen der gewünschten End-
konzentration, oder auch des maximalen Füllstan-
des des Reaktors, dieser nicht vollständig entleert
wird, sondern 10–20 % des Volumens verbleiben,
was dann direkt als Inokulum für einen erneuten
fed-batch-Prozess dient. Dadurch fällt die Anwachs-
phase weg. Diese Effizienz steigernde Verfahren wird
als repeated fed-batch bezeichnet, setzt aber voraus,
dass der benutzte Produktionsstamm stabil ist. Auf-
grund des hohen Kostenanteils für den Zucker, sind
die Ausbeuten für die Effizienz des Gesamtprozesses
ganz wesentlich. Sie liegen deutlich höher als 55 g
L-Lysin pro 100 g Glucose. Theoretisch sind bis zu
75 g L-Lysin pro 100 g Glucose möglich. Aufgrund
des hohen Kostendrucks ist eine sehr gute Repro-
duzierbarkeit erwünscht, sodass trotz der großen
Volumina und der verschiedenen Flüssigkeitsströme
beim Gesamtprozess Schwankungen üblicherweise
unter 5 % liegen.
Zur Aufarbeitung des L-Lysins sind zwei Ver-
fahren etabliert (. Abb. 11.4). Die Gewinnung von
 462 C. Syldatk et al.
. Abb. 11.4  Schema zur
Aufarbeitung der Aminosäure L-Lysin
und dem als Futtermittel verwendeten
Produkt Biolys
11
kristallinem L-Lysin erfolgt nach dem Abtren-
nen der Zellen durch Ionenchromatographie, mit
anschließender Einengung und Kristallisation sowie
abschließender Verpackung. L-Lysin wird dabei als
L-Lysin HCl Salz gewonnen und vertrieben, weil
es weniger hygroskopisch ist als (L-Lysin)2SO4. Im
konkurrierenden Verfahren wird das gesamte Fer-
mentationsmedium, einschließlich der Zellen, durch
Sprühtrocknung eingeengt und durch Granulie-
rung und Trocknung verkaufsfertig aufbereitet. Da
C. glutamicum ein GRAS Organismus ist (Generally
Recognized As Safe), ist der Organismus selbst als
Futtermittel verwendbar, wodurch ein zusätzlicher
Gewinn für die Futtermittelformulierung entsteht.
Der Prozess ist sehr kostengünstig bezüglich der
Investitionskosten, da z. B. keine Chromatographie-
säulen benötigt werden, keine Abfallprodukte anfal-
len und geringe Verluste garantiert sind (. Abb. 11.4).
Das gewonnene Produkt wird als Biolys gehandelt.
Die Produktion von L-Aminosäuren ist ein klas-
sischer Prozess in der mikrobiellen Biotechnologie.
Anfangs wurden nur bescheidene Konzentrationen
erreicht und nur geringe Mengen produziert. Der
Bedarf steigt allerdings immens. Es ist deswegen
verständlich, dass die Produktionsverfahren ständig
verbessert werden müssen. Hier werden hohe Anfor-
derungen gestellt, die molekulare, bioinformatische
und prozesstechnische Aspekte vereinen. Dadurch
wird die optimale Nutzung nachwachsender Roh-
stoffe zur konkurrenzfähigen Aminosäuregewin-
nung gewährleistet. [18]
11.2.3 Spezielle Produkte
Als „spezielle Produkte“ von Mikroorganismen
werden Verbindungen bezeichnet, die nicht direkt
dem Energiestoffwechsel angehören und in der Regel
gattungs- oder sogar artspezifisch gebildet werden.
Diese werden von Wildtypstämmen in der Regel
nur in geringen Konzentrationen gebildet. Hierzu
gehören zum Beispiel Speicherstoffe wie Dextran,
Kapitel 11 · Mikrobielle Prozesse
Polyhydroxybuttersäure (PHB), Exopolysaccharide
wie Xanthan und Schizophyllan, Biotenside wie
Rhamnolipid und Sophoroselipide und Farbstoffe
wie mikrobielle Carotinoide.
Als „sekundäre Stoffwechselprodukte“ oder
„Sekundärmetaboliten“ von Mikroorganismen
wird eine Gruppe spezieller Produkte bezeich-
net, bei denen für die Produzenten die Funktion
häufig unklar ist, und die für diese nicht lebens-
notwendig sind. Eine Bildung erfolgt häufig erst in
der stationären Phase des Wachstums. „Antibio-
tika“ sind Sekundärmetaboliten, die bereits in nied-
rigen Konzentrationen das Wachstum von Mikro-
organismen hemmen oder diese sogar abtöten. Die
bekanntesten Beispiele hierfür sind Penicilline und
Cephalosporine.
Biotenside am Beispiel der mikrobiellen
Produktion von Sophorolipiden
Martin Schilling, Moniec Van-Logchem und
Hans Henning Wenk
Tenside sind grenzflächenaktive Verbindungen
mit einem hydrophilen und hydrophoben Teil. Sie
lagern sich an Grenzflächen an und erniedrigen
dadurch die Grenzflächenspannung. So tragen sie
463 11
z. B. zur Solubilisierung von Schmutz, zur Schaum-
bildung und zum Emulgieren von nicht mischba-
ren Flüssigkeiten bei. Aufgrund dieser Eigenschaf-
ten kommen sie in vielen Bereichen des täglichen
Lebens zur Anwendung. Wasch-, Reinigungs- und
kosmetische Mittel enthalten beispielsweise einen
großen Anteil an Tensiden. Die über Jahrhunderte
genutzten Seifen (Salze von Fettsäuren) wurden im
20. Jahrhundert zum Großteil durch petrochemisch
basierte Tenside abgelöst. In den vergangenen Jahr-
zehnten wurden ehemals petrochemische Kompo-
nenten der chemisch-synthetischen Tenside wieder
zunehmend durch biobasierte Komponenten, haupt-
sächlich Fettsäuren und Derivate, ersetzt. Aufgrund
der in den letzten Jahren stark gestiegenen Nachfrage
nach vollständig biobasierten und bioprozessierten
Produkten, die alle Anforderungen an eine nachhal-
tige Kreislaufwirtschaft erfüllen, erfolgte in letzter
Zeit zunehmend die Entwicklung und Vermarktung
von Biotensiden. Biotenside werden mittels mikro-
bieller Fermentation gewonnen.
Sophorolipide . Abb. 11.5) sind Glycolipide, die
mittels mikrobieller Fermentation mit der Hefe Star-
merella bombicola (früher Candida bombicola) her-
gestellt werden. Bei den auf dem Markt verfügbaren
Produkten handelt es sich um Mischungen aus struk-
turell ähnlichen Molekülen, die sich jedoch in ihren

. Abb. 11.5  Struktur der Sophorolipid-Säureform (links) und des acetylierten Lactons (rechts). Die auf Ölsäure basierenden
Hauptformen sind dargestellt, es können aber auch andere Fettsäuren eingebaut werden. Die nicht acetylierte Säureform wird
durch die vollständige Hydrolyse des acetylierten Lactons erhalten. Wird lediglich eine Teilhydrolyse durchgeführt, wird eine
komplexe Produktmischung aus teilweise acetylierter und vollständig acetylierter Lacton- und Säureform erhalten
 464 C. Syldatk et al.

physikochemischen Eigenschaften teilweise stark

unterscheiden. Der Grundkörper besteht immer
aus einer Sophoroseeinheit, an die eine Hydroxyfett-
säure (hauptsächlich Hydroxyölsäure) glykosidisch
gebunden ist. Die Sophorose kann teilweise acety-
liert sein, und das gesamte Sophorolipid liegt entwe-
der in zyklischer Form als Lacton oder als die freie
Säure vor. Sophorolipide schäumen als Einzeltenside
relativ schwach, können aber als Schaumbooster für
andere Tenside agieren und haben hervorragende
Solubilisierungseigenschaften für Schmutz.
Starmerella bombicola ist in der Lage, aus Glucose
und Triglyceriden (z. B. Pflanzenölen) in einem fer-
mentativen Verfahren hohe Sophorolipidtiter zu pro-
duzieren (>100 g/L). In der Literatur sind sogar Titer
>400 g/L beschrieben. Es können auch andere Zucker
und hydrophobe Komponenten umgesetzt werden, die
Struktur und Zusammensetzung des Produktes lässt
sich dadurch aber nur in geringem Maße verändern.
Die zentralen Schritte der Biosynthese sind die Frei-
setzung von Fettsäuren aus den Triglyceriden durch
extrazelluläre Lipasen, die intrazelluläre Hydroxylie-
rung der Fettsäuren durch eine P450-Monooxyge- . Abb. 11.6  Bioreaktorkultivierung mit der Hefe
nase und die anschließende, zweifache Glykosylierung Starmerella bombicola. Bei niedrigem pH-Wert setzen
sich die gebildeten Sophoroselipide nach Beendigung der
11 durch Glykosyltransferasen, wodurch die Sophorose-
einheit auf der Hydroxyfettsäure aufgebaut wird. Es
Kultivierung ab und können einfach von der Kulturbrühe
abgetrennt werden
folgt die Acetylierung und die Sekretion ins Medium.
Schließlich wird durch eine extrazelluläre Lipase das
Lacton gebildet, wodurch das Produkt unlöslich wird Produkt nach dem Ende der Fermentation mit
und in der Brühe ausfällt. Die aerobe Fermentation dem Abschalten des Rührers als untere, ölige Phase
erfolgt über mehrere Tage, meist in einem Komplex- abscheidet. Bei einem nahezu vollständigen Umsatz
medium. Sie wird in eine Wachstums- und eine Pro- des hydrophoben Substrates und einem besonders
duktbildungsphase unterteilt. Die Wachstums- bzw. hohen Lactonanteil kann das Produkt auch als Fest-
Biomassebildungsphase endet, wenn Stickstoff limi- stoff ausfallen. Die Biomasse bildet eine Interphase
tierend wird, wodurch gleichzeitig die Produktbil- zwischen Produktphase und der Fermentationsbrühe
dungsphase eingeleitet wird. Das hydrophobe Subst- als oberer Phase. Die Phasentrennung kann entwe-
rat wird, ebenso wie die Glucose, zugefüttert, wodurch der im Schwerefeld erfolgen oder durch den Einsatz
ein Mehrphasensystem erhalten wird. Der pH-Wert eines Separators beschleunigt werden. Anschlie-
des Mediums sinkt auf einen Bereich zwischen 3,5 ßend wird die Produktphase abgetrennt und optio-
und 4. Während der Fermentation wird hauptsäch- nal filtriert, um Zellreste abzutrennen. Dann wird das
lich das zweifach acetylierte Lacton gebildet, welches Zwischenprodukt in einen Hydrolysetank überführt.
schlecht wasserlöslich ist und nicht schäumt. Aus Hier erfolgt die teilweise oder vollständige Hydro-
diesem Grund, kann bei der Herstellung von Sopho- lyse des Lactons und der Acetylreste durch Zugabe
rolipiden, im Gegensatz zur Herstellung anderer Bio- von Lauge, z. B. NaOH. Es wird eine wasserlösliche,
tenside, auf den Einsatz von Entschäumern bzw. Anti- stärker schäumende Mischung an Produkten erhal-
foam verzichtet werden (. Abb. 11.6). ten, die über das Sophorolipid-Säure/Lacton Verhält-
Die schlechte Wasserlöslichkeit des Produk- nis beschrieben werden kann und die sich einfach in
tes erleichtert auch die Aufarbeitung, da sich das Formulierungen einarbeiten lässt. [35, 40]
Kapitel 11 · Mikrobielle Prozesse
Biotechnologische Aromastoff-
Herstellung
Jens-Michael Hilmer
In den vergangenen fast 150 Jahren ist die Aromen-
und Riechstoffindustrie zu einem global agierenden
Wirtschaftszweig gewachsen mit jährlichen Umsät-
zen in der Größenordnung von über 22 Mrd. €. Sie
nimmt neben den Bereichen Pharma, Pflanzen(bio)
technologie und Agrochemie eine zunehmend
bedeutende Rolle im Rahmen derjenigen Industrie-
zweige ein, die auch mithilfe moderner biotechno-
logischer Verfahren Produkte entwickeln und pro-
duzieren. Die Gründe hierfür sind vielfältig. Zum
einen bieten die Methoden der modernen Biotech-
nologie und synthetischen Biologie ein großes Poten-
tial an technologischen Möglichkeiten, um Roh-
stoffe und Produkte zu generieren, die üblicherweise
nur schwer zugänglich sind und damit nur synthe-
tisch sehr aufwändig und kostenintensiv hergestellt
werden können. Zum anderen ist die Verfügbarkeit
von natürlichen Ressourcen zunehmend beschränkt
bzw. aus Nachhaltigkeitsgründen und Naturschutz
die Nutzung von Rohstoffen aus seltenen Tier- und
Pflanzenarten nicht mehr möglich. Dafür müssen
(biotechnologische) Alternativen entwickelt werden.
Prominente Beispiele für die Nutzung biotechnolo-
gischer Verfahren sind die Herstellung der pflanzli-
chen Produkte Vanillin und Nootkaton sowie Safran
und Stevia.
Ein weiterer Beweggrund, biotechnologische
Methoden im Bereich der Lebensmittelherstellung
einzusetzen, ergibt sich aus der Gesetzgebung in
diesem Bereich sowie ethnischen Anforderungen.
So ist zum einen der Bereich der Aromastoffe und
Aromen der einzige Bereich, zu dem es eine gesetz-
mäßige Definition zum Begriff der „Natürlichkeit“
gibt (Verordnung EG 1334/2008). In diesem Zusam-
menhang sind explizit enzymatische und fermenta-
tive Verfahren als zulässige Verfahren benannt, um
natürliche Aromastoffe und Aromen herzustel-
len („herkömmliche Lebensmittel-Zubereitungs-
verfahren“). Ferner spielen im Lebensmittelumfeld
ethnische Anforderungen wie „koscher“ und „halal“
eine zunehmend wichtige Rolle, gerade im globalen
Wettbewerb. Dies ist auch bei der Auswahl geeigne-
ter Enzyme zu berücksichtigen.
465 11
Biotechnologische Verfahren im Aromen- und
Parfümeriebereich sind sehr vielfältig; relevante
Anwendungsbeispiele finden sich in folgender Über-
sicht (. Tab. 11.3).
Im Folgenden werden beispielhaft zwei biotech-
nologische Verfahren beschrieben, die die Entwick-
lung in der industriellen Biotechnologie zur Her-
stellung von Aromastoffen aufzeigen: Vanillin und
Nootkaton. [34, 37]
Produktion von Vanillin
Vanillin gehört neben Menthol nicht nur zu den
bekanntesten, sondern auch zu den bedeutendsten
und meist eingesetzten Aromastoffen. Der jährliche
Bedarf liegt bei etwa 15.000 t (Menthol: ca. 20.000 t).
Der größte Anteil des Vanillins wird zwar synthetisch
hergestellt, aber der Bedarf an natürlichem Vanil-
lin steigt stetig mit dem Verbraucherwunsch nach
natürlichen Lebensmitteln. Neben der Herstellung
von Vanillin aus Vanilleschoten spielt die biotech-
nologische Produktion dabei eine bedeutende Rolle.
Diese ist seit Mitte der 1990er Jahre im industriellen
Maßstab relevant.
Es sind in der Literatur etliche Verfahren zur bio-
technologischen Herstellung von Vanillin beschrie-
ben, ausgehend von Rohstoffen wie Ferulasäure,
Eugenol, Isoeugenol, Lignin. Die meisten dieser Ver-
fahren einschließlich der Produktion mit Hilfe von
Pflanzenzellen haben sich als nicht wirtschaftlich her-
ausgestellt. Wichtige Aspekte und Herausforderun-
gen diesbezüglich sind im Folgenden aufgeführt und
stellen eine zu überwindende Hürde dar, die über den
wirtschaftlichen Erfolg des Prozesses entscheiden:
55 Zytotoxizität der Edukte und des Vanillins
55 Bildung unerwünschter Nebenkomponenten
55 (zunächst unerwartete) weitere
Metabolismuswege
55 Effektivität des Downstream Processing (DSP)
Das am meisten verbreitete mikrobielle Verfahren
zur Herstellung von (natürlichem) Vanillin besteht
in der Biotransformation von Ferulasäure zu Vanil-
lin in einem einzigen Fermentationsschritt (s. bei-
spielsweise EP 0761817). Die dafür eingesetzte Feru-
lasäure wird zumeist aus Reisspelzen gewonnen, die
bei der Reisverarbeitung als Nebenprodukt anfallen.
Die Umsetzung von Ferulasäure zu Vanillin gelingt
 466 C. Syldatk et al.

. Tab. 11.3  Wirtschaftlich bedeutende Aromastoffe und Aromen aus biotechnologischer Produktion (modifiziert
nach: Klein und Hilmer [23])

Aromastoff Rohstoffe Biokatalysatoren (Beispiele)

Vanillin Ferulasäure Amycolatopsis species

Carbonsäuren,
z. B. 2-Methylbuttersäure,
Buttersäure, Isobuttersäure,
Propionsäure, Essigsäure
Carbonsäureester
Gamma-Decalacton
Ketone,
z. B. Methylketone
Streptomyces setonii
Pseudomonas putida
Escherichia coli
Saccharomyces cerevisiae
Die analogen Alkohole Gluconobacter species
(diese fallen beispielsweise als
Nebenprodukte bei der Ethanol-
Fermentation an; sogenannte
Fuselalkohole)
Carbonsäure + Alkohol oder Lipasen,
Ester + Alkohol oder Ester + Carbonsäure z. B. aus Candida antarctica
Ricinolsäure, Rizinusöl Yarrowia lipolytica
Fettsäuren Fermentation von Fettsäuren mit
Penicillium roqueforti Kulturen

t-2-Hexanal Leinsaatöl, Pflanzenöl Lipoxygenase

Hydroperoxid Lyase
cis-3-Hexenol Leinsaatöl, Pflanzenöl Lipoxygenase

11 Hydroperoxid Lyase
Diacetyl-(2,3-Butandion) Milch, Molke Fermentation mit Streptococcus
diacetilactis, Streptococcus lactis
Phenylethanol Phenylalanin Saccharomyces cerevisiae
Ethyldecadienoat Pflanzenöl Lipasen, z. B. aus Candida antarctica
Pyrazine Melasse; Pyrazine entstehen bei der Saccharomyces cerevisiae
Alkoholfermentation aus Aminosäuren
Menthol Menthylbenzoat Lipase (racemische Spaltung)
Nootkaton Valencen Pleurotus sapidus
Pichia pastoris

in besonders hohen Ausbeuten mit Bakterien der
Gattung Amycolatopsis, die zu den Actinomyceten
zählen.
Zunächst wird aus Ferulasäure unter Katalyse
der Feruloyl-CoA Synthetase (fcs) mit Coenzym
A der entsprechende Thioester gebildet. Die Enoyl
CoA Hydratase/Aldolase (ech) katalysiert im fol-
genden Schritt die Oxidation unter Abspaltung von
Acetyl-CoA zum Vanillin (. Abb. 11.7). Dies erfolgt
in Analogie zur β-Oxidation der Fettsäuren, bei
der ebenfalls unter Bildung von Acetyl-CoA eine
um 2 Kohlenstoffatome verkürzte Fettsäure gebil-
det wird. Eine weitere Verstoffwechselung führt zur
Vanillinsäure.
Demgegenüber erfolgt die Bildung des Vanillins
ausgehend von Ferulasäure in der Vanillepflanze in
einem einzigen Schritt, katalysiert von der Vanillin-
synthase (VpVAN). Eine aktuelle Alternative stellt
die de novo-Biosynthese von Vanillin ausgehend von
Glucose dar. Seit 2009 wurden entsprechende in vivo
Stoffwechselwege für Bakterien wie E. coli beschrieben
sowie auch in Hefen wie S. cerevisiae und S. pombe.
Kapitel 11 · Mikrobielle Prozesse
. Abb. 11.7  Reaktionskaskade von Ferulasäure über Vanillin zu Vanillinsäure (in Amycolatopsis species HR 197) (modifiziert
nach: [30] Overhage)
Aufgrund der Toxizität des gebildeten Vanillins
wird dieses zunächst glucosyliert zum Vanillin-β-
D-Glucosid („Glucovanillin“). In einem Folgeschritt
wird dieses dann wieder in das Vanillin überführt
Nootkaton
Das Sesquiterpenoid Nootkaton kommt typischer-
weise in Grapefruit und Pomelo vor und gibt deren
charakteristischen Geruch. Nootkaton kann aus
Grapefruit isoliert oder durch Oxidation des struk-
turell verwandten Valencen gewonnen werden
(. Abb. 11.8). Valencen wird aus Orangen gewon-
nen und ist preiswert verfügbar, allerdings ist das
chemische Verfahren aufwändig und die Regiose-
lektivität der Oxidation teilweise sehr gering. Aus
diesem Grund bieten sich enzymatische Verfah-
ren mit einer hinreichenden Selektivität an. Dafür
kommen Laccasen, Lipoxygenasen oder P450-Mo-
nooxygenasen infrage oder die entsprechenden
Mikroorganismen.
Beispielsweise wurde ein Prozess auf Basis von
Enzymaktivitäten aus Basidiomyceten entwickelt,
die als hochentwickelte Pilze eine vielfältige Quelle
. Abb. 11.8  Oxidation von Valencen zu Nootkaton
467 11
von Enzymen darstellen. Das Verfahren wurde mit
Enzymen des Speisepilzes Pleurotus sapidus entwi-
ckelt (EP 2352814).
Eine weitere Alternative der mikrobiellen Trans-
formation von Valencen zu Nootkaton gelingt mit
Pichia pastoris, denen eine Cytochrom-P450-Reduk-
tase (CPR) aus Arabidopsis thaliana integriert wurde.
Bei den biotechnologischen Prozessen zur geziel-
ten Herstellung von Riech- und Aromastoffen han-
delte es sich bisher im Wesentlichen um Biotrans-
formationen, ausgehend von strukturell ähnlichen
Naturstoffen (beispielsweise Vanillin aus Ferula-
säure, Nootkaton aus Valencen, Carbonsäuren aus
den entsprechenden Alkoholen). Diese wichtigen
Rohstoffe werden vor allem von Firmen der Aromen-
und Riechstoffindustrie produziert und eingesetzt,
wie beispielsweise den Firmen Symrise, Givaudan,
Firmenich oder IFF. Die dafür verwendeten Mikro-
organismen sind in der Regel Isolate aus der Natur,
die nicht gentechnisch modifiziert wurden. Damit ist
sichergestellt, dass die damit hergestellten Produkte
nicht als „gentechnisch modifiziert“ oder „mit gen-
technisch modifizierten Organismen hergestellt“ zu
 468 C. Syldatk et al.
kennzeichnen sind, sofern bei der Rohstoffauswahl
ebenfalls darauf geachtet wird.
Mit der rasanten Entwicklung in der synthe-
tischen Biologie haben sich die technologischen
Möglichkeiten in letzter Zeit erheblich erweitert.
Mittlerweile ist es möglich, recht komplexe Biosyn-
thesewege vornehmlich aus dem pflanzlichen Ana-
bolismus in Organismen wie Hefen zu integrieren.
Damit wird die Möglichkeit eröffnet, aus einfachen,
preiswerten Substraten wie Zuckern (beispielsweise
Glucose) zielgerichtet komplexe Moleküle wie bei-
spielsweise Farnesol, Vanillin (über Glucovanil-
lin) oder Valencen in einem einzigen Fermenta-
tionsschritt aufzubauen. Der wirtschaftliche Erfolg
dieser Prozesse steht und fällt dabei mit der erreich-
baren Ausbeute im Fermentationsschritt sowie der
Komplexität der notwendigen Aufarbeitungsschritte
(Downstream-Processing).
Auf Basis dieser Technologie der synthetischen
Biologie speziell auch für den Einsatz zur Herstel-
lung von Produkten der Aromen- und Riechstoffin-
dustrie haben sich in den vergangenen Jahren etliche
Biotechnologie-Firmen gegründet wie Amyris (USA,
gegründet 2003), Evolva (Schweiz, 2004), Ginkgo
11 BioWorks (USA, 2008) und Isobionics (Nieder-
lande, 2008).
Konsequenterweise wird die Entwicklung bio-
technologischer Verfahren zur Herstellung von
zunehmend komplexer aufgebauten Naturstoffen
rasant weitergehen.
Antibiotika
Guido Melzer und Michèle Delbé
Antibiotika sind mikrobiell gebildete Wirkstoffe, die
andere Mikroorganismen am Wachstum hindern
oder gar abtöten. Sie werden seit den 1940er Jahren
medizinisch erfolgreich zur Bekämpfung von Infek-
tionskrankheiten eingesetzt. Als metabolische
Vorstufen dienen Zwischenprodukte des Primär-
stoffwechsels, die über komplexe und regulierte
Biosynthesesequenzen gebildet werden. Antibio-
tika werden meist artspezifisch in der stationären
Wachstumsphase gebildet und ausgeschieden. Mit
einer Produktion von mehr als 75.000 Tonnen pro
Jahr sind die β-Lactam-Antibiotika die wichtigste
2
+
1 6
+2
1+ 2 1 2
2
2
2 2+
. Abb. 11.9  Chemische Struktur des Cephalosporin C
Gruppe. Der weitverbreitete Einsatz von Antibio-
tika als Leistungsförderer in der Tiermast ist umstrit-
ten, da diese Praxis zur Verbreitung multiresistenter
Keime beiträgt.
Cephalosporine (. Abb. 11.9) bilden eine Gruppe
von Breitband-Antibiotika und gehören, wie Penicil-
lin, zu den β-Lactam-Antibiotika die sich durch den
typischen, viergliedrigen Lactamring, sowie einen
sechsgliedrigen Thiazinring auszeichnen.
Die Cephalosporine wirken wie Penicilline bak-
teriostatisch, indem sie bei sich teilenden Bakterien
den Neuaufbau der Zellwände, durch Inhibierung
der hierfür notwendigen Enzyme, unterbinden.
Giuseppe Brotzu, zu seiner Zeit als Medizi-
ner und Politiker beschäftigt, entdeckte und iso-
lierte 1945 aus Wasserproben an der sardischen
Küste den Schimmelpilz Acremonium chrysogenum
und erkannte dessen Eigenschaften zur Bildung
eines Antibiotikums, das später in Cephalosporin
C umbenannt wurde. Die Entdeckung erwies sich,
über 15 Jahre nach der Entdeckung des Penicillins
durch Alexander Fleming, als weiterer großer Mei-
lenstein in der Medizin, denn hatte man doch neben
dem bis dato bereits auf dem Markt etablierten Peni-
cillin G, dessen pharmakologische Wirkungsspek-
trum sich ausschließlich auf gram-positive Bakte-
rien beschränkte, nun ein weiteres Antibiotikum
im Repertoire, das auch gram-negative Bakterien
wie beispielsweise Salmonellen bekämpfen konnte.
Zudem zeichnete sich das Cephalosporin C durch
eine höhere Säureresistenz sowie eine erhöhte Sta-
bilität gegenüber β-Lactamasen aus [6].
Die chemische Struktur von Cephalosporin C
wurde 1961 aufgeklärt. Die Cephalosporine haben
eine nur schwache pharmakologische Wirkung und
sind zwar in ihrer natürlichen Struktur unbedeutend,
Kapitel 11 · Mikrobielle Prozesse
+ 1 6 Der Gehalt an essentiellen Spurenelementen, Vitami-
1 2
2 In den ersten zwei Stufen des Fermentations-
2 prozesses wird vor allem Biomasse gebildet. Dabei
2 2+
. Abb. 11.10  Chemische Struktur der
7-Aminocephalosporinsäure
erlangten aber großes pharmakologisches und wirt-
schaftliches Interesse, da sie als Grundsubstanz zur
Synthese weiterer semi-synthetischer Cephalospo-
rine dienen. Die wichtigste Grundsubstanz bildet
die 7-Aminocephalosporinsäure (7-ACA), die aus
der Abspaltung der Seitenkette Amino-Adipin-
säure des Cephalosporin C gewonnen werden kann
(. Abb. 11.10). Die erste Markteinführung erfolgte
in den sechziger Jahren. [6, 11]
Biotechnologische Produktion der 7-ACA
Der Herstellungsprozess der Grundsubstanz 7-ACA
setzt sich im Wesentlichen aus zwei großen Prozess-
schritten zusammen. Im ersten Schritt erfolgt die fer-
mentative Herstellung des Cephalosporin C (CPC)
im industriellen Maßstab durch den filamentösen
Pilz Acremonium chrysogenum (Upstream-Proces-
sing), gefolgt von der Aufreinigung des Cephalospo-
rin C aus dem Kulturbrei sowie der enzymatischen/
chemischen Umsetzung und anschließenden Kristal-
lisation zu 7-ACA (Downstream-Processing).
Die Fermentation erfolgt typischerweise in Rühr-
kesselreaktoren (stirred tank reactors, STR) mit nicht
selten Maßstäben von über 100 m³. Der Produktions-
organismus Acremonium chrysogenum wird hierzu
erst in einem zweistufigen Prozess im Labor in Schüt-
telkolben, dann in einem dreistufigen Produktions-
verfahren in Rührkesselreaktoren in komplexen
Nährstoffmedien produziert.
Im Nährlösungsansatz kommt unter anderem
der Verwendung von Maisquellwasser eine beson-
dere Bedeutung zu, da in frühen Arbeiten gezeigt
werden konnte, dass dieser Rohstoff zu einer signifi-
kanten Steigerung der Produktausbeute, neben der
469 11
klassischen Stammentwicklung, beitragen konnte.
nen, Mineralien, aber auch diversen Aminosäuren,
macht diesen Rohstoff so unentbehrlich und zugleich
aber auch so geheimnisvoll.
dient unter anderem Glycerin, als günstiger Roh-
stoff mit positiven Eigenschaften auf das Wachstum,
als wesentliche Kohlenstoffquelle für den Produk-
tionsorganismus. In der Hauptstufen-Fermentation
(dritte Prozessstufe) werden des Weiteren Glucose-
lösung und pflanzliche Öle wie Raps- oder Sojaöl als
wichtige Kohlenstoffquellen, semi-kontinuierlich
im fed-batch-Betrieb zugegeben. Zusätzlich werden
Stickstoff- und Schwefelquellen benötigt, die meist in
Form von einer Ammoniumsulfatlösung zugegeben
werden. Im Ansatz liegen zudem Harnstoff und freie
Aminosäuren vor, die als weitere wichtige Stickstoff-
quellen dienen. Wichtig hierbei ist die Vermeidung
einer Kataboliten-Repression durch die schnelle Auf-
nahme und Umsetzung von leicht verstoffwechselba-
ren Metaboliten wie Glucose und Ammoniumionen.
Aus diesen Gründen ist der Einsatz von komplexeren
Rohstoffen wie Sojaöl oder Stärke, die zuerst enzyma-
tisch abgebaut werden müssen, von Vorteil.
Eine große Besonderheit in der verfahrenstech-
nischen Betrachtung liegt in der morphologischen
Gestalt des Produktionsorganismus. So ist bekannt,
dass der Pilz während des Prozessverlaufs in den
Vorstufen sowie in den ersten Stunden der Haupt-
stufe anfangs vor allem in hyphenartigen Myzelien
vorliegt, dann mit der Aufnahme und Verstoffwech-
selung von pflanzlichen Ölen, die Arthrosporenbil-
dung initiiert und damit gleichzeitig die Cephalospo-
rin C-Synthese beschleunigt. Arthrosporenbildung
und Cephalosporinsynthese stehen somit im engen
Zusammenhang.
Der gesamte Prozess zeichnet sich durch einen
hohen Bedarf an Sauerstoff aus. Dieser ist zum
einen für das Wachstum und den Energiestoffwech-
sel notwendig, zugleich aber auch zur Reoxidation
großer Mengen an Reduktionsäquivalenten wie
NADH, die infolge der der β-Oxidation der aufge-
nommenen Fettsäuren anfallen. Dieser biochemi-
sche Prozess ist dabei hochkomplex und interessan-
terweise von der ATP-Synthese abgekoppelt. Denn
 470 C. Syldatk et al.
würden sonst NADH und ATP intrazellulär in zu
hoher Konzentration vorliegen, käme es auch dann
zur Kataboliten-Repression mit der Folge des Erlah-
mens des zentralen Stoffwechsels und somit auch
der Cephalosporinproduktion. Somit ist während
der Fermentation die Regelung eines Sauerstoffge-
haltes mit einem pO2-Wert von 40–50 % der maxi-
malen Sättigung im Kulturmedium wünschenswert,
welcher durch technische Maßnahmen wie der Stei-
gerung des Leistungseintrages durch Drehzahlerhö-
hung (Zerkleinerung der Blasen und Erhöhung der
Stoffaustauschfläche), Erhöhung der Belüftungsrate
(Erhöhung des Gasanteils/Durchsatzes) oder durch
Erhöhung des Fermenter-Innendruckes (Erhöhung
11
. Abb. 11.11  Schematische Darstellung der 7-ACA Herstellung
des Sauerstoffpartialdruckes bzw. der Gelöstkonzen-
tration) gesteuert werden kann.
Nach Fermentationsende erfolgt die Herstellung
der 7-ACA im sogenannten Downstream-Prozess.
Dieser beinhaltet alle Prozessschritte von der Abtren-
nung des Biomasseanteils aus dem Fermentations-
brei über die Aufreinigung der CPC-Lösung und die
chemische Reinigung oder, alternativ, die enzyma-
tische Spaltreaktion zu 7-ACA bis hin zur Kristal-
lisation, Trocknung und Abfüllung des Wirkstoffes
mit Reinheiten von über 95 %. Die Prozessschritte
werden kontinuierlich durchlaufen und sind sche-
matisch in . Abb. 11.11 dargestellt. Zur Abtrennung
der Biomasse können tangentiale Mikrofiltration
Kapitel 11 · Mikrobielle Prozesse
oder klassische Filterpressen (Dead end filtration)
zum Einsatz kommen. Die Tangentialfiltration
ermöglicht eine kontinuierliche Fahrweise und ver-
hindert eine frühzeitige Verblockung der Membran
durch den Filterkuchen. Zur Aufreinigung des Klar-
laufs kommen verschiedene Chromatographiever-
fahren zum Einsatz, sodass nach Abtrennung der
Nebenprodukte aus dem Fermentationsprozess
eine konzentrierte CPC-Lösung vorliegt. Dabei
ist ein wichtiger Aspekt die initiale Konzentration
an Nebenprodukte aus dem Fermentationsbrei. In
den sich anschließenden enzymatisch katalysierten
Reaktionen wird durch die finale Abspaltung der Sei-
tenkette CPC zu 7-ACA umgesetzt. Nach Kristalli-
sation, Waschen und Trocknen wird am Ende des
Downstream-Prozesses kristalline 7-ACA als Zwi-
schenprodukt für die Weiterverarbeitung zu semi-
synthetischen Cephalosporinen abgefüllt und für
den Verkauf verpackt.
11.2.4 Rekombinante Proteine
Technische Enzyme
Karl-Heinz Maurer
Unter dem Begriff technische Enzyme werden
Enzyme für technische Anwendungen zusammen-
gefasst. Typische Anwendungen erfolgen in Wasch-
und Reinigungsmitteln, in der Textil und Papier-
industrie und als Biokatalysatoren in der chemischen
Industrie. Technische Enzyme werden inzwischen
nahezu ausschließlich mit rekombinanten Produk-
tionsorganismen hergestellt. Im Vergleich mit nicht
rekombinanten, sogenannten klassischen Produk-
tionsstämmen erlauben diese die Herstellung von
Monokomponenten-Enzymen, bei denen relevante
Nebenaktivitäten ausgeschaltet oder vernachläs-
sigbar gering sind. Diese Produktionsstämme sind
dadurch gekennzeichnet, dass die Zielenzyme aktiv
sekretiert werden, was die technische Aufarbeitung
ungemein erleichtert.
Typische Produktionsorganismen rekrutie-
ren sich aus den Familien Bacillus (Bacillus sub-
tilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefa-
ciens), Aspergillus (Aspergillus oryzae, Aspergillus
niger) und Trichoderma (Trichoderma reesei). Als
471 11
Faustregel kann davon ausgegangen werden, dass
bakterielle Enzyme am besten in Bacillus und pilz-
liche Enzyme am besten in Aspergillus und Tri-
choderma exprimiert werden. Dementsprechend
werden bakterielle Proteasen und Amylasen mit
Bacillus hergestellt und pilzliche Cellulasen, Amy-
lasen, Lipasen und Laccasen mit Aspergillus und
Trichoderma. Während die ersten Produktions-
stämme noch mit Plasmiden und Antibiotika-Re-
sistenzmarkern arbeiteten, setzten sich nachfolgend
immer mehr die Verfahren durch, die auf Integra-
tion des Zielgens ins mikrobielle Genom basier-
ten. Die gentechnischen Konstruktionen umfassen
heute nicht nur Promotoren, die die gezielte Über-
expression der Zielgene gewährleisten, sondern
auch den knock out von unerwünschten Nebenak-
tivitäten oder der Verstärkung oder Einführung von
Aktivitäten, die die optimale Nutzung der techni-
schen Medien sichern.
Die Fermentation erfolgt in der Regel in Sub-
mersverfahren. Das Medium setzt sich aus Kohlen-
hydratquellen, Stickstoffquellen und Mineralsalzen
zusammen, die einerseits kostengünstig, ande-
rerseits von geprüfter Qualität aus nachwachsen-
den Rohstoffen sein müssen. Damit verbunden ist
meist eine mehr oder weniger komplexe chemische
Zusammensetzung vor allem der Stickstoffquellen.
Als C- Quellen kommen Weizenmehl, Maismehl,
Stärke, Glucose und andere Zucker zum Einsatz.
Als N-Quellen Sojamehl, Gluten, Maisquellwasser,
Casein, Kartoffelprotein und Ammoniumsalze. Die
Fermentation erfolgt in der Regel in großen Fer-
mentern, die ein Nennvolumen von 60 bis 150 m3
haben, aber auch größer sein können. Die Wachs-
tumsgeschwindigkeit ist am höchsten bei Bakterien
wie z. B. Bacillus species, die teilweise nur 36 bis 48
Stunden kultiviert werden. Pilze wie Aspergillus
species (A. niger, A. oryzae) und Trichoderma reesei
wachsen deutlich langsamer und werden zwischen 6
und 14 Tagen fermentiert. Auch die Zusammenset-
zung der Medien, die Art von fed-batch-Fermenta-
tion, die Art der Verfahrensführung richtet sich nach
den verwendeten Mikroorganismen. Bei fed-batch-
Fermentationen wird eine oder mehrere Rohstoff-
quellen im Verlauf der Fermentation zugefüttert,
falls gleichzeitig auch Volumen entnommen wird
(fill and draw) kann dabei auch über das normale
Arbeitsvolumen des Fermenters hinausgegangen
 472 C. Syldatk et al.
werden. Damit kann aus einer Fermentation für
den Preis einer mäßigen Verdünnung entspre-
chend mehr Produkt gewonnen werden. Die Kon-
zentration des Zielenzyms im Fermenterbrei einer
Fermentation liegt bei Bakterien im Bereich bis zu
25 g/L und bei pilzlichen Produktionssystemen bis
zu 100 g/L.
Eine typische Aufarbeitung von techni-
schen Enzymen erfolgt in folgenden Schritten
(s. 7 Abschn. 9.1): Zunächst wird die Biomasse abge-
trennt. Dies erfolgt durch Separatoren, durch Rota-
tionstrommelfilter oder geschlossenen Kammerfil-
terpressen. Zur Unterstützung der Zellabtrennung
können Flockungs- oder Fällungshilfsmittel oder Fil-
terhilfsmittel hinzugefügt werden. Mikrofiltration
wird eingesetzt, um die vollständige Entfernung der
rekombinanten Mikroorganismen zu gewährleisten.
Dies geschieht nicht nur unter dem Aspekt der Abwe-
senheit von Produktionsorganismen, sondern dient
auch dem Schutz des geistigen Eigentums, das die
Produktionsorganismen darstellen.
Der zellfreie Überstand wird in der Regel auf-
konzentriert. Dies kann durch Dünnschichtver-
dampfer oder durch Ultrafiltration erfolgen. Ein
11 alternatives Verfahren besteht in der Aufkonzentrie-
rung durch Kristallisation der Enzyme. Die Kristalle
werden von der Mutterlauge abgetrennt und später
wieder gelöst. Hierdurch können Produkte erzielt
werden, die nahezu farblos sind. Andere Verfahren
zur Abtrennung der gelben bis braunen Farbkompo-
nenten können mit hohem technischem Aufwand
verbunden sein.
Die konzentrierte Enzymlösung kann entwe-
der durch Sprühtrocknung (s. 7 Abschn. 9.4) oder
durch Granulierung in pulverförmige Produkte
umgewandelt werden. Für die Bereitstellung flüssi-
ger Enzymprodukte wird in der Regel der Zusatz von
Stabilisatoren und Konservierungsmitteln gegenüber
enzymatischem oder mikrobiellem Abbau notwen-
dig. Die Konzentration des Enzyms in technischen
Produkten liegt häufig bei 4–5 %, sie kann aber auch
deutlich niedriger (1 %) und bis zu 20 % eingestellt
werden. Für Haushaltsprodukte dürfen beim Ver-
braucher keine Enzymstäube auftreten, die zu all-
ergischen Reaktionen führen können. Daher wird
das Enzym-Pellet mit einer Wachsschicht überzogen
(Coating). [26]
Pharmazeutische Proteine
Christoph Kiziak
Die Produktion von heterologen pharmazeutischen
Proteinen dient der Bereitstellung des rekombinan-
ten Produkts in ausreichender Menge und Qualität,
jedoch auch in einer für den weiteren Prozess geeig-
neter Form und Weise zu einem für den Gesamtpro-
zess tragfähigen Preis. Dazu werden in der Mehr-
zahl Gram-negative oder Gram-positive Bakterien,
eukaryotische Hefen oder Säugertierzellen verwen-
det. Diese Systeme sollen im Nachfolgenden an Hand
des in der jeweiligen Gruppe dominierenden Wirts-
organismus E. coli, Bacillus subtilis, Pichia pastoris
und CHO (Chinese Hamster Ovary) Zellen näher
beschrieben und vergleichend diskutiert werden. Die
Produktionsprozesse unterscheiden sich dabei maß-
geblich und sollen an Hand der drei typischen Prozess-
entwicklungsschritte, Stammentwicklung, Fermen-
tation und Aufreinigung näher beschrieben werden.
Das wichtigste Entscheidungskriterium für die
Verwendung eines dieser Systeme ist jedoch das Ziel-
protein selbst. Dessen generelle Eigenschaften wie
das Vorhandensein von Disulfidbrücken oder einer
erwünschten oder unerwünschten Glykosylierung,
die Art der N-terminalen Aminosäure, die pH-Sta-
bilität oder auch die intrinsische Faltungskapazität
haben einen maßgeblichen Einfluss auf die Auswahl
des Wirtsorganismus und des zur Produktion ver-
wendeten Zellkompartiments bzw. einer intrazellu-
lären oder sekretierten Produktion. Hierbei ist eben-
falls zu beachten, dass es auch umgekehrt durch die
Verwendung eines Produktionssystems zu einer
Modifikation am Zielprotein kommen kann. Bei-
spielsweise kann die Glykosylierung zwar für die
Funktion eines Proteins irrelevant sein und daher
die bakterielle Produktion prinzipiell möglich sein,
jedoch kann das Fehlen solcher Zuckerstrukturen die
Löslichkeit eines in der Natur glykosylierten Proteins
stark negativ beeinflussen und zur Inclusion body-
Bildung führen.
Eine essentielle Voraussetzung für die Gene-
rierung eines hochproduzierenden Stammes ist
neben der Verwendung eines geeigneten Promo-
ters / Induktionssystems die Bereitstellung einer
hohen Kopienzahl eines gene of interest (GOI) im
Wirtszellhintergrund.
Kapitel 11 · Mikrobielle Prozesse
Die kann einerseits durch Transformation
einer Wirtszelle mit einem autonom replizieren-
den Plasmid oder durch die (multiple) Integration
des GOI in das Chromosom der Wirtszelle erfol-
gen. Plasmid-basierte Systeme sind typisch für E.
coli, während für Bacillus beide Vorgehensweisen
beschrieben sind. Bei eukaryotischen Systemen
dominiert mit Ausnahme des 2-Micron-Plasmids für
Saccharomyces die chromosomale Integration, wobei
Kleinmengenproduktion mit transienten Zelllinien
immer stärkeres Interesse erlangt.
Diese beiden prinzipiellen Möglichkeiten der
Einbringung des Zielgens haben weitreichende Kon-
sequenzen, nicht nur für das Prozedere der Stamm-
herstellung und die Selektion eines hochproduzie-
renden Stammes, sondern beispielsweise auch auf die
genetische Stabilität und damit die Robustheit eines
Prozesses. Ebenso ist die Stabilität eines Stammkons-
trukts eine unabdingbare Voraussetzung für die Ent-
wicklung kontinuierlicher Fermentationsverfahren.
Beide Möglichkeiten sollen daher an Hand einer
typischen Vorgehensweise einer chromosomalen
Integration für Pichia pastoris und eines plasmid-ba-
sierten Produktionsstamms für E. coli näher beleuch-
tet werden.
Die Zielgene müssen in Pichia chromosomal ein-
gebracht werden und im Regelfall muss nach einem
Stamm mit einer idealen Genkopienzahl (gene copy
number, GCN) gescreent werden. Für Säugertierzel-
len ist zudem der Integrationsort von großer Bedeu-
tung. Die Genkopienzahl liegt dabei für intrazelluläre
Produkte in der Regel höher als für sekretierte Pro-
teine, da die Prozessierung über ER und Golgi eine
Limitierung (bottleneck) darstellen kann. Da nach
einer Transformation von Pichia geschätzt nur 1-10%
der Klone eine höhere Kopienzahl tragen, muss ent-
weder schrittweise die Konzentration des Selektions-
markers erhöht werden oder direkt mit höheren Kon-
zentrationen selektioniert werden. Ebenso kommt
es immer wieder zum Auffinden sogenannter „Joker
Klone“ mit unerwartet höherer Produktivität, was
beispielsweise durch nicht-homologe Integration
des Zielgens bedingt sein kann. Dies macht den
Prozess der Stammherstellung aufwändiger und
eine höhere Anzahl gescreenter Klone erhöht die
Erfolgswahrscheinlichkeit für einen hochproduzie-
renden Stamm. Als Richtwert sollten für einen guten
473 11
Produktionsstamm mindestens eine niedrige vier-
stellige Zahl von Klonen gescreent werden. Daher ist
im Gegensatz zu bakteriellen Systemen eine einfache
Analytik für das Zielprotein für das Screening unab-
dingbar. Ein großer Vorteil ist, dass die Mehrzahl der
Produkte im Kulturüberstand produziert wird, da der
Zellaufschluss im Hochdurchsatz eine nicht zu unter-
schätzende Hürde ist. Neben den analytischen Anfor-
derungen bedingt die hohe Zahl zu analysierender
Klone ein reproduzierbares Screeningverfahren dem
– neben der generellen Fragestellung der Übertrag-
barkeit der Ergebnisse eines im batch-Modus durch-
geführten Screenings auf eine fed-batch-Fermenta-
tion – bei Pichia die schwierigere Handhabung des
weithin verwendeten Methanol-induzierten AOX1
System entgegensteht. Entsprechend gibt es hier
inzwischen auch induzierbare Systeme, die auf die
Verwendung von Methanol verzichten.
Bei plasmid-basierten Produktionsorganismen
wie E. coli werden durch die Kombination eines
bestimmten Wirts mit einem bestimmten Plasmid
Klone generiert, die identische Eigenschaften besit-
zen sollten. Variabilität wird im Wesentlichen durch
die Variation von Wirtszelle und Plasmid erzeugt.
Daher übersteigt die Zahl der zu testenden Kombi-
nationen selten den zweistelligen Bereich. Trotz des
Nachteils des nötigen Zellaufschlusses ist also auch
die Verwendung aufwändigerer Analysemethoden
für ein Primärscreening möglich.
Typische Variationen sind die Verwendung von
verschiedenen Wirtszellen wie den E. coli K12-Isola-
ten W3110 oder RV308 und den B-Isolaten wie BL21,
wobei oft auch Derivate dieser Stämme mit Protea-
sedeletionen oder auch überexprimierten Helferfak-
toren wie Chaperonen und Disulfid-Isomerasen ein-
gesetzt werden.
Bezüglich Variation der verwendeten E. coli-
Plasmide und der Kombination von Faktoren wie
Kopienzahl, Promotoren und verschiedener Helfer-
faktoren gibt es inzwischen eine fast unerschöpfli-
che Anzahl von Möglichkeiten. Allen gemeinsam ist
jedoch die im Vergleich zu chromosomalen Systemen
schlechtere Stabilität. Während dies in einer frühen
Phase eine oft untergeordnete Rolle spielt, kann es
bei einem hohen Selektionsdruck des Zielproteins
kombiniert mit einer Hochzelldichtefermentation im
Prozess zu einem Plasmidverlust kommen. Dabei ist
 474 C. Syldatk et al.
der Titerverlust selbst oftmals weniger ein Problem.
Vielmehr ist die Aufrechterhaltung einer idealer-
weise 100-%igen Plasmidstabilität ein wesentlicher
Faktor für eine konsistente Fermentationsausbeute
ohne Streuung (batch-to-batch variation) und damit
eines robusten Prozesses. Daher sollten Plasmide mit
einer hohen segregationellen Stabilität oder eventuell
sogar spezielle Elemente zur Plasmidstabilisierung
wie Toxin-Antitoxin Konstrukte oder Auxotrophien
eingesetzt werden. Ein Vorteil kann auch die Ver-
wendung eines geeigneten Induktionssystems bieten.
Für E. coli werden fast ausschließlich induzierbare
Promotoren verwendet, wobei lac-Derivate und T7
immer noch eine maßgebliche Rolle spielen. Inzwi-
schen gibt es unzählige Varianten dieser Promotoren,
bei denen insbesondere die ungünstige Basalexpre-
sion und die schlechte Regulierbarkeit deutlich ver-
bessert wurden. Daneben spielen positiv regulierte
Systeme wie Arabinose oder insbesondere L-Rham-
nose eine immer größere Rolle. Diese zeichnen sich
durch eine geringe Basalexpression und ein sanfteres
Induktionsprofil aus, was einem Plasmidverlust oder
auch einer möglichen Bildung von inclusion bodies
entgegenwirken kann.
Im Weiteren soll der Einfluss unterschiedlicher
11 Zellkompartimente bzw. der Sekretion beschrieben
werden, die wiederum auf den Qualitätsaspekt einer
Proteinproduktion einen wesentlichen Einfluss haben.
Die Wahl des zellulären Kompartiments ist dabei eine
in der Regel vom Zielprotein vorgegebene Entschei-
dung. Hier weisen Zytosol und Periplasma bzw. sekre-
tierte Produktion verschiedene Vor- und Nachteile
auf. Im reduzierenden Milieu des Zytoplasmas findet
keine Ausbildung von Disulfidbrücken statt, gleich-
zeitig werden jedoch oxidationsempfindliche Proteine
geschützt. Ebenso gibt es Proteine mit hoher intrin-
sischer Faltungskapazität, die sich für die Sekretion
nur sehr bedingt eignen. Ein Nachteil der bakteriel-
len zytoplasmatischen Produktion kann die fehlende
oder unvollständige Abspaltung des aminoterminalen
(Formyl-) Methionins in Abhängigkeit von der zweiten
Aminosäure und dem erzielten Produkttiter sein, so
dass in diesen Fällen keine Aminosäuren-genaue Pro-
duktion erfolgen kann oder produktverwandte Verun-
reinigungen auftreten, was in Abhängigkeit von der
angestrebten Verwendung des Zielproteins einen kri-
tischen Qualitätsfaktor darstellen kann.
Für Zielproteine mit Disulfidbrücken gibt es
mit Ausnahme von Inclusion body-Prozessen oder
speziellen Stämmen wie CyDisCo (cytoplasmic disul-
fide bond formation in E. coli) nur die Möglichkeit
der Sekretion. Bei Gram-negativen Bakterien und
Eukaryoten existieren Kompartimente wie der peri-
plasmatische Raum oder das endoplasmatische Reti-
kulum mit Helferfaktoren, die für die Faltung von
Proteinen unter oxidierenden Bedingungen oder
auch für die Assemblierung von heteromultimeren
Proteinen geeignet sind. Bei Gram-positiven Bakte-
rien wie Bacillus ist das Zusammenwirken von Sekre-
tion, Faltung und Ausbildung von Disulfidbrücken
noch sehr viel weniger verstanden. Das mag auch
ein Grund dafür sein, dass Gram-positive Bakterien
trotz hoher Produktivität und sehr guten Wachs-
tumseigenschaften und der prinzipiellen Möglich-
keit zur Sekretion bisher nicht für biopharmazeuti-
sche Produktionen mit typischerweise komplexeren
Proteinen verwendet werden.
Für die periplasmatische oder sekretierte Pro-
duktion wird dem gene of interest die Sequenz eines
Signalpeptids vorgeschaltet. Beim Übertritt ins bak-
terielle Periplasma oder der eukaryotischen Prozes-
sierung im Endoplasmatischen Retikulum und Golgi
findet eine Abspaltung des Signalpeptids statt, so dass
jede gewünschte N-terminale Aminosäure erzeugt
werden kann. Diese Abspaltung ist in der Regel sehr
effizient und exakt, wobei Pichia mit dem meistver-
wendeten alpha-mating-Faktor-Signalpeptid eine
Ausnahme bilden kann. Im Gegensatz zu beispiels-
weise einer bakteriellen Signalpeptidase, die nach der
in der Primärstruktur verankerten Erkennungsse-
quenz Ala-x-Ala schneidet, kann es bei Pichia bei
Spaltung mit der Preprotein Konvertase Kex2 zu
N-terminaler Variabilität und damit zu Qualitäts-
einbußen beim Zielprotein kommen.
Diese Ausführungen zeigen, dass es ein fast
unbegrenztes Spektrum an Möglichkeiten und Facet-
ten gibt, um Proteine in löslicher Form oder größe-
ren Mengen produzieren zu können. Ein häufiges
Dilemma besteht daher in einem unzureichenden
Stammscreening, so dass kritische Stämme in auf-
wändigen Fermentationsentwicklungen optimiert
werden ohne dass vorab die ganze Palette mögli-
cher Optimierungen des Produktionsstamms aus-
geschöpft wurden.
Zentraler Punkt für die Fermentation ist die Pro-
duktlokalisation. Ganz generell ist bei Systemen wie
E. coli durch die intrazelluläre Produktion im Zyto-
plasma oder Periplasma die Produktivität an die
Kapitel 11 · Mikrobielle Prozesse
Biomasse gekoppelt, so dass eine höhere Biomasse
in der Regel auch zu einem höheren Produkttiter
führt. Typische fed-batch-Fermentationen von E.
coli erreichen Biotrockenmassen von 35-60 g/L in
2–3 Tagen Gesamtfermentationszeit; bei Bacillus
können diese Werte noch höher liegen. Bei bakte-
riellen Systemen werden bei der zytoplasmatischen
Produktion im Extremfall sehr hohe Ausbeuten von
über 20 g/L erzielt. Dagegen ist die Produktivität im
periplasmatischen Raum von Gram-negativen Bak-
terien insgesamt geringer und es werden nur Titer im
niedrigen einstelligen g/L-Bereich erreicht. Unklar
ist, ob es sich hier um eine physikalische Limitierung
des Periplasmas handelt. Als Sonderfall der periplas-
matischen Produktion bei E. coli wird in vielen Fällen
die Freisetzung des Zielproteins in den Kulturüber-
stand beschrieben. Dies basiert auf einem nicht voll-
ständig verstandenen Prozess der Vesikulierung der
äußeren Membran, wobei ein hoher Titer des Ziel-
proteins eine wichtige Rolle für die Freisetzung spielt.
Ebenso gibt es Stämme die eine solche Freisetzung in
den Überstand begünstigen, wobei in beiden Fällen
zu beachten ist, dass die Qualität des Zielproteins
durch eine lange Verweilzeit im Kulturüberstand
beeinflusst werden kann. Auch sind in der Regel
angepasste Fermentationsregimes von Nöten, um der
Instabilität dieser Wirtszellen Rechnung zu tragen.
Die Hefe Pichia nimmt eine interessante Zwi-
schenstellung zwischen bakteriellen und Säugetier-
zellsystemen ein. Hier scheint die metabolische und
sekretorische Leistung an das Zellwachstum gekop-
pelt zu sein. Dies führt generell zu Prozessen mit sehr
hohen Biomasseausbeuten, deren Abtrennung tech-
nisch anspruchsvoll ist. Die Produkttiter im Kultur-
überstand können inzwischen auch mehrere Gramm
pro Liter erreichen, wobei der hohe volumetrische
Anteil der Biomasse am Gesamtvolumen beach-
tet werden muss. Die Fermentationsdauer mit dem
oftmals verwendeten AOX1 Induktionssystem mit
Methanol beträgt 5-7 Tage.
Säugetierzellsysteme dagegen haben sehr hohe
Sekretionsleistungen trotz niedrigem Zellwachstum.
Dadurch entstehen Prozesse mit hohen Produkt-
ausbeuten von mehreren Gramm pro Liter, jedoch
einer typischen Fermentationsdauer im Bereich von
2 Wochen. Die trotzdem niedrigen Biomassen und
damit verbundenen niedrigen Transferraten machen
diese Systeme so zu Vorreitern bei der Verwendung
von Einwegbioreaktoren.
475 11
Die Aufreinigung der Zielproteine hängt im
Wesentlichen von deren späterer Anwendung ab.
Für viele Anwendungen wie der Biokatalyse ist es
zudem möglich, die Zielproteine mit einem Affini-
täts-tag zu versehen, um die Aufreinigung wesent-
lich zu vereinfachen. Ebenso können hier Verunrei-
nigungen durch Wirtszellproteine problemlos sein,
während bei der biopharmazeutischen Produktion
nicht nur die Abreinigung der Wirtszellproteine,
sondern auch die Aminosäuren-genaue Reinheit
des Produkts gefordert ist. Entsprechend sind dort
Produkt-verwandte Verunreinigungen durch bei-
spielsweise N-terminale Modifikation oder Falsch-
einbau nicht-proteinogener Aminosäuren wie Nor-
leucin kritische Parameter und müssen innerhalb der
Aufreinigung betrachtet werden. Ebenso kann es vor
oder im Aufreinigungsprozess selber zu Modifikatio-
nen wie Oxidation, Deamidierung oder Carbamoy-
lierung kommen.
Wegen der unterschiedlichen Anforderungen
an die Reinheit soll an dieser Stelle nur kurz auf die
wesentlichen Unterschiede für die Aufreinigung
basierend auf der Wahl des Produktionsorganismus
eingegangen werden. Unabhängig von periplasmati-
scher und zytoplasmatischer Produktion bei Gram-
negativen Bakterien muss auf Grund der fehlenden
großtechnischen Umsetzbarkeit eines selektiven
periplasmatischen Aufschlusses in beiden Fällen
die Wirtszelle vollständig aufgeschlossen werden.
Dadurch ist das Zielprotein immer stark durch
potentiell immunogene Wirtszellproteine und auch
Endotoxin verunreinigt bzw. es können für bioka-
talytische Anwendungen Nebenaktivitäten vorhan-
den sein. Daher ist die Aufreinigung hier beson-
ders anspruchsvoll und es sollte immer überprüft
werden, ob das Zielprotein eventuell stark unter-
schiedliche physikochemische Eigenschaften zum
Wirtszellhintergrund aufweist. Beispielsweise kann
bei einer erhöhten Temperatur- oder pH-Stabilität
bereits ein großer Teil der Wirtszellproteine durch
einfache Grundoperationen wie Präzipitation abge-
trennt werden.
Durch den Zellaufschluss kommt es zum Kontakt
des Zielproteins mit Proteasen, wobei hier oftmals
ompT als sehr stabile Protease der äußeren Membran
eine Rolle spielt und daher viele Produktionsstämme
ompT-negativ sind.
Gram-positive Organismen wie Bacillus sekre-
tieren oft eine Vielzahl von Proteasen und es ist auch
 476 C. Syldatk et al.
oft nicht möglich, die Gene aller diese Proteasen im
Wirtsorganismus zu deletieren, ohne die Leistungs-
fähigkeit des Stamms zu vermindern. Daher kann es
zu Deletionen am Zielprotein kommen. Durch das
Fehlen von Endotoxinen kann Bacillus in den Fällen
eine Lösung sein, in denen das Zielprotein an Endo-
toxin bindet.
Bei Pichia führen die hohen Biomassekonzent-
rationen zu technischen Limitationen hinsichtlich
deren Abtrennung. Dagegen ist die Degradation des
Zielproteins im Überstand die Ausnahme und die
Sekretion in Pichia kann bei geeigneter Fermenta-
tionsführung bereits zu Reinheiten des Zielproteins
von 60-70% führen. Allerdings kann es neben der
durch eine Änderung der Aminosäuresequenz ver-
meidbaren N-Glykosylierung auch zu einer nicht
vorhersagbaren O-Glykosylierung des Zielproteins
kommen. Eine Abreinigung ist hier sehr schwierig
und neben der potentiellen Immunogenität können
auch funktionell wichtige Epitope betroffen sein.
Neben der bereits erwähnten inakkuraten Prozes-
sierung des N-Terminus kann es durch die lange Ver-
weilzeit des Zielproteins im sauren Kulturüberstand
zu chemischen Modifikationen kommen.
11 Säugetierzellen kommen in der Regel nur für
hochpreisige und human glykosylierte Proteine für
den biopharmazeutischen Sektor zur Anwendung.
Daher ist hier die Virusinaktivierung als besondere
Grundoperation innerhalb der Aufreinigung zu
nennen.
Abschließend soll . Tab. 11.4 nochmals einen
Gesamtüberblick über die wesentlichen Eigenschaf-
ten und Parameter für die Produktion rekombinanter
Proteine mit unterschiedlichen Produktionsorganis-
men geben. [42]
11.2.5 Ausblick
Bis zum Ende des 19. Jahrhunderts wurden aus-
schließlich nachwachsende Rohstoffe als Ausgangs-
stoffe in der chemischen Industrie verwendet, um
Plattformchemikalien, Zwischenprodukte, Indus-
trie- und Konsumprodukte zu synthetisieren, bis
sie Mitte des 20. Jahrhunderts fast vollständig von
fossilen Ausgangsmaterialien ersetzt wurden. Im
Moment werden nach Schätzungen ca. 95% der
Grundbausteine in der chemischen Industrie aus
fossilen Ressourcen hergestellt. Mit der drohen-
den Verknappung und dem daraus resultierenden
Anstieg der Rohstoffpreise, den zunehmenden Pro-
blemen durch die hohen anthropogenen CO2-Emiss-
ionen und dem damit verbundenen Treibhauseffekt
findet inzwischen jedoch ein Umdenken in Politik
und Wirtschaft in Richtung einer biobasierten Wirt-
schaft statt.
In technologiepolitischen Programmen und in
der gesellschaftspolitischen Diskussion wird dabei
mit dem Begriff „Bioökonomie“ in jüngerer Zeit
die Entwicklung einer biobasierten, nachhaltigen
und hocheffizienten Wirtschaft und Landwirtschaft
bezeichnet, die erneuerbare biologische Ressourcen
zur Herstellung von Produkten nutzt.
Als Ergebnis wurden mit dem Beginn des 21.
Jahrhunderts zunächst intensive Anstrengungen
unternommen, flüssige fossile Brennstoffe durch
Kraftstoffe aus erneuerbaren Rohstoffen wie Bio-
diesel und Bioethanol zu ersetzen, was jedoch auf
Grund der wachsenden Nutzung von Zuckern
sowie Stärke- oder Triglycerid-haltigen pflanzli-
chen Rohstoffen zu einer „Tank oder Teller“-De-
batte führte, die noch nicht abgeschlossen ist und
zu Bestrebungen geführt hat, Lignocellulose oder
sogar CO und CO2 zur Produktion von Biokraft-
stoffen zu nutzen.
Neben diesen Bestrebungen zu einer Energie-
wende gibt es in der chemischen Industrie zuneh-
mend auch ernst zu nehmende Bestrebungen für
eine Rohstoffwende von fossilen hin zu nachwach-
senden Rohstoffen. In beiden Fällen bestehen die
größten Herausforderungen bei der Entwicklung
von grünen und nachhaltigeren Produktionsprozes-
sen darin nicht mehr in der Lebensmittelkonkurrenz
zu stehen und CO2-neutral oder sogar CO2-reduzi-
erend zu arbeiten.
Aus biotechnologischer Sicht arbeiten alle bisher
etablierten Verfahren, wie oben beschrieben, mit
Zucker- und Stärke-basierten Medien. Diese wurden
z.T. über Jahrzehnte bezüglich mikrobiellem Wachs-
tum, Produktausbeute und Kosten optimiert. Die
Verfügbarkeit dieser Substrate ist jedoch nur ausrei-
chend für die heutigen mikrobiellen Fermentations-
verfahren (Tab. 11.1), wodurch die Notwendigkeit
für neue Rohstoffe für die Herstellung von Biokraft-
stoffen und Chemikalien besteht, um dem Bedarf in
Zukunft gerecht zu werden.
Kapitel 11 · Mikrobielle Prozesse
477 11

. Tab. 11.4  Vergleich der typischen Eigenschaften und Parameter für die Produktion rekombinanter Proteine mit
unterschiedlichen Produktionsorganismen (zytopl. = zytoplasmatisch; perpl. = periplasmatisch)

Gram-negativ Gram-positiv Hefen Säugetierzellen

(E. coli) (Bacillus) (Pichia pastoris) (CHO)

Induktion Induziert Induziert Induziert/ Konstitutiv Konstitutiv

Lokalisation des GOI Plasmid Plasmid/ Chromosomal Chromosomal
Chromosomal
Genetische Stabilität Mittel Niedrig/Hoch Hoch Hoch
Screeningaufwand Niedrig Niedrig Hoch Sehr hoch
Stammentwicklung 4–6 6–8 8–12 16–24
incl. Screening
(Wochen)
Fermentationsdauer 2–3 2–3 4–7 14
fed-batch (Tage)
Biotrockenmassen 35–50 40–60 100–150 10
(g/L) im Fermenter
Typische 1–10 (zytopl.), 1–10 0,5–5 0,5–5
Fermentationstiter 0,5-2 (peripl.)
(g/L)
pH Neutral Neutral 4–6 Neutral
Typische Lokalisation Intrazellulär Kulturüberstand Kulturüberstand Kulturüberstand
des Zielproteins
Ausbildung von Nein (zytopl.), Ja (Ja) Ja Ja
Disulfidbrücken (peripl.)
Glykosylierung Nein Nein Ja, potentiell Ja
immunogen
Weitere kritische (Formyl-) Sekretion, Proteasen N-terminale Virusinaktivierung
Parameter Methionin im Überstand Prozessierung,
(zytopl.), Biomasseabtrennung
Endotoxin

Bislang ist Lignocellulose die einzige erneuerbare
organische Kohlenstoffquelle, die nicht in Lebens-
mittelkonkurrenz steht. Sie hat damit das Poten-
zial, als nachhaltige Energie- und Kohlenstoffquelle
zu dienen, wobei jedoch die Lignocellulose-Vor-
behandlung ein wichtiges Thema ist, das nicht ver-
nachlässigt werden kann. Dies erfordert zusätzliche
Prozessschritte, wie z. B. die erfolgreiche Hydrolyse
und Fraktionierung in Cellulose, Hemicellulose und
Lignin und deren anschließende Hydrolyse in die
entsprechenden Monomere. Ein Meilenstein könnte
daher die mikrobielle Nutzung von CO2, CO und H2
als Substrat sein. Hier gibt es bereits erste erfolgreiche
Ansätze zur biotechnologischen Produktion von Bio-
ethanol auf dieser Basis.
Große Bedeutung gewinnt auch die Konstruk-
tion von Produktionsstämmen mit neuen Biosynthe-
sewegen mit Methoden der Synthetischen Biologie.
Im Gegensatz zur Herstellung rekombinanter Pro-
teine, die jeweils als einziges Genprodukt produziert
werden, ist die heterologe Etablierung kompletter
Biosynthesewege, mit zahlreichen Biosynthesegenen,
noch eine große Herausforderung. Erste Produkte,
wie etwa Propan-1,3-Diol sind jedoch schon seit
einer Dekade auf dem Markt. In allen Fällen erfor-
dert die zukünftige Entwicklung von neuen und
 478 C. Syldatk et al.
innovativen Verfahren, eine immer stärkere inter-
disziplinäre Zusammenarbeit von Ingenieuren, Che-
mikern, Biologen und Informatikern.
11.3 Mikrobielle Abwasserreinigung
Martin Denecke und Leon Steuernagel
Neben der Stoffproduktion ist ein weiteres Einsatz-
gebiet mikrobieller Prozesse die Behandlung von
Abfällen, Abluft und Abwässern. Historisch gesehen
ist in Verbindung mit der Agglomeration von Men-
schen in Siedlungen neben der Aufgabe der Versor-
gung mit Nahrung und Wasser auch die Notwendig-
keit der Fäkalienentsorgung und Wasserreinhaltung
entstanden. Verstärkt wurde der Problemlösungs-
druck seiner Zeit durch das massenhafte Auftreten
von Infektionskrankheiten, die als direkte Folge der
Unterlassung von Entsorgungsmaßnahmen, insbe-
sondere der Wasserreinigung, entstanden sind.
Diese Probleme sind in den Industriestaaten
durch die biotechnologisch basierte Reinigung von
Zivilisationsabwasser und -abfällen weitgehend
11 gelöst, sodass Flüsse und Seen Stück um Stück ihren
Gleichgewichtszustand wieder erreichen konnten.
Demgegenüber erhöht sich in den Schwellen- und
Entwicklungsländern der Verschmutzungsgrad von
Wasser, Boden und Luft drastisch.
11.3.1 Biologische Abwasserreinigung
Historisch gesehen war die Hygiene der wichtigste
Motor für die Abwasserreinigung. Heute spielt die
Erhaltung der Gewässergüte durch die Entfernung
Sauerstoff-zehrender und eutrophierender Stoffe die
wichtigste Rolle. Die Hauptziele der Abwasserreini-
gung liegen in der Erhaltung des Wasserangebotes
und der Gewässergüte.
Anders als bei produzierenden Bioprozessen
verfolgt die Abwasserreinigung das Ziel, umwelt-
belastende und unerwünschte Stoffe zu entfer-
nen oder in unbedenkliche Stoffe umzuwandeln
[15]. Des Weiteren unterscheidet sich die biologi-
sche Abwasserreinigung von anderen Bioprozes-
sen durch zwei wesentliche Kriterien: Zum einen
besteht das Substrat der Mikroorganismen aus einer
Mischung vieler verschiedener Inhaltsstoffe mit
wechselnden Konzentrationsverhältnissen. Zum
anderen ist die Biozönose der Anlage eine Misch-
kultur mit einer großen mikrobiellen Diversität,
was aus der Zusammensetzung des Substrats und
den Prozessbedingungen resultiert. In Deutschland
werden zurzeit ca. 10,1 Mrd. m³/a Abwasser (kom-
munal) in über 9600 Kläranlagen (KA) gereinigt.
Der Anteil der industriellen Abwasserreinigung ist
mit ca. 3000 Anlagen und ca. 920 Mio. m³/a deut-
lich geringer.
Die zu entfernenden Inhaltsstoffe lassen sich in
drei übergeordnete Gruppen einteilen: organische
Verbindungen, gemessen als CSB oder BSB, Stick-
stoff (N) in Form von Ammonium, Nitrit, Nitrat
und Norg, sowie Phosphate (P) wie z. B. Ortho-
phosphat und Porg . Grundsätzlich müssen ein-
geleitete Abwässer bezüglich ihrer Herkunft zwi-
schen „kommunal“ und „industriell“ differenziert
werden. Kommunale Abwässer weisen die genann-
ten Inhaltsstoffe größtenteils in konstanten Konzen-
trationen von ca. 5–300 mg/L auf. Bei industriellen
Abwässern hingegen können die Konzentrationen
zwischen wenigen mg/L bis hin zu einigen g/L vari-
ieren. Zukünftig wird die Entfernung von Spuren-
stoffen (Xenobiotika) wie z. B. Pharmazeutika, etc.
(Konzentrationen im ng/L- bis µg/L-Bereich) eben-
falls als Kriterium einer erfolgreichen Abwasser-
reinigung herangezogen werden. Die Einleitwerte
für kommunale und industrielle KA werden in der
Abwasserverordnung (AbwV) in den entsprechen-
den Anhängen geregelt.
Stufen der Abwasserreinigung
Die Abwasserreinigung hat sich während der letzten
150 Jahre entwickelt und begann zunächst mit der
1. Stufe, der Mechanischen Reinigung. Hier werden
durch mechanische Prozesse wie Sedimentation,
Flotation oder Siebung feste Bestandteile oder auf-
schwimmende Flüssigkeiten entfernt. Alle Kläranla-
gen haben eine 1. Reinigungsstufe.
Die 2. Stufe dient dem Abbau von organischen
Kohlenstoffverbindungen und der teilweisen Oxi-
dation von Ammonium über Nitrit zu Nitrat (Nitri-
fikation). Da dieser Schritt durch Mikroorganismen
katalysiert wird, spricht man von einer biologischen
Reinigung.
Kapitel 11 · Mikrobielle Prozesse
Vollbiologische KA verfügen über eine 3. Stufe,
bei der eine vollständige Nitrifikation und eine nach-
folgende Denitrifikation für den Abbau von Stick-
stoffverbindungen sorgen. Des Weiteren wird hier
die Entfernung von Phosphorverbindungen durch
die Fällung mit Metallsalzen und/oder einer bio-
logischen Phosphorelimination (Bio-P-Verfahren)
erreicht. In Deutschland ist die 3. Stufe Stand der
Technik. Sowohl die Kohlenstoff-, Stickstoff- als auch
Phosphorelimination wird hauptsächlich durch Bak-
terien katalysiert.
Die 4. Stufe dient der Entfernung von Spuren-
stoffen, die auf KA nur unzureichend abgebaut oder
zurückgehalten werden. Durch die Heterogenität der
vielen tausend Stoffe ist ein einheitliches Verfahren
nicht möglich. Im Rahmen von Forschungs- und
Pilotvorhaben haben sich die folgenden Verfahren
bzw. Kombinationen davon als vorteilhaft erwie-
sen: Oxidationsverfahren (meist Ozon), Adsorption
mit Aktivkohle und Membranverfahren. Weiterhin
kann man den biologischen Abbau durch ein hohes
Schlammalter unterstützen.
Für die biologische Reinigung hat sich das
Belebtschlammverfahren (BSV) durchgesetzt,
bei dem ein flockulärer Schlamm (3–5 g TS/L) in
einem System aus Belebungs- und Nachklärbecken
im Kreislauf gepumpt wird. Der Begriff „Belebt-
schlamm“ wird in der Abwassertechnik genutzt,
um die am Prozess beteiligten Mikroorganis-
men zu bezeichnen. Das BSV ist ein kontinuier-
licher Prozess. Durch die Kreislaufführung wird
der Belebtschlamm etwa 10 Tage (Schlammalter)
im Gesamtsystem gehalten. Die hydraulische Ver-
weilzeit des Abwassers beläuft sich dagegen nur auf
ca. einen Tag. BSV sind robust und sehr gut steuer-
und regelbar. Sie verfügen fast immer über aerobe
Zonen für die Nitrifikation/C-Abbau und über
anoxische Zonen für die Denitrifikation. Durch den
Abbau von C, N und P entsteht Biomasse. In der
Nachklärung wird eine physikalische Trennung des
gereinigten Abwassers vom Belebtschlamm durch
Sedimentation – oder seltener – durch Membran-
filtration erreicht (. Abb. 11.12). Beim Einsatz von
Membranen spricht man vom sogenannten Memb-
ranbelebungsreaktor (MBR), in dem die Biomasse
mithilfe von Mikro- bzw. Ultrafiltrationsmembra-
nen in Hohlfaser- oder Plattenbauweise abgeschie-
den wird. Die Membranmodule werden entweder
479 11
räumlich vom Belebungsbecken als sidestream
MBR (sMBR) getrennt oder direkt in das Becken
als immersed MBR (iMBR) eingehängt. Je nach
Bauform und Einbauort werden die Membranen
schlammseitig mit Überdruck (sMBR) oder ablauf-
seitig mit Unterdruck (iMBR) beaufschlagt [20]. Das
behandelte Abwasser fließt ab, der aufkonzentrierte
Belebtschlamm (ca. 10 g TS/L) wird zurück in das
Belebungsbecken gepumpt. Um die Biomassekon-
zentration im Prozess konstant zu halten, muss ein
Teil des Belebtschlamms kontinuierlich aus dem
System abgezogen werden (Überschussschlamm
ÜS). Der ÜS wird aufkonzentriert (ca. 25 g TS/L)
und für ca. 3 Wochen anaerob bei ca. 35 °C gerührt.
Aus einer Tonne ÜS entstehen ca. 150 m³ Biogas (ca.
40 Vol.-% CO2 und 60 Vol.-% CH4), die meist in
Blockheizkraftwerken genutzt werden. Nach dem
Anaerobprozess wird entwässert, das Endprodukt
ist Klärschlamm mit ca. 350 g TS/L. Dieser wird ver-
brannt oder landwirtschaftlich genutzt.
Neben dem BSV gibt es Biofilmverfahren, bei
denen die abbauenden Bakterien als Biofilm auf einer
Oberfläche fixiert sind. Dazu gehören z. B. die Tropf-
körper (TK). TK haben keine anoxischen Zonen,
können also nicht denitrifizieren und sind nicht
besonders gut steuer- und regelbar. Da das Abwas-
ser durch die TK rieselt, muss nicht belüftet werden,
wodurch sich Energie einsparen lässt. Weiterhin
haben TK-Verfahren ein sehr hohes Schlammal-
ter, was den Abbau schwer abbaubarer Substanzen
begünstigen kann.
Aerober Abbau von BSB
Organische Verbindungen machen die dominante
Fraktion aller Abwasserinhaltsstoffe aus, was deren
Entfernung zum Primärziel jeder Abwasserreini-
gungsanlage macht. Der biologische Sauerstoff-
bedarf (BSB) ist ein Summenparameter, der als
Maß für die Konzentration an biologisch abbau-
baren organischen Abwasserinhaltsstoffen dient.
Ein Großteil des ungelösten BSBs wird durch die
mechanische Reinigung des Abwassers vor Ein-
tritt in die biologischen Stufen entfernt. Der gelöste
BSB wird von fakultativ aeroben chemoorganohe-
terotrophen Mikroorganismen vieler verschiedener
Spezies im Abschnitt der biologischen Reinigung
zu CO2 und Biomasse abgebaut. Vollbiologische
 480 C. Syldatk et al.
. Abb. 11.12  Verfahrensschema des Belebtschlammverfahrens mit Biomasseabtrennung durch (a) Sedimentationsverfahren
11 oder (b) Membranfiltration
Abwasserreinigungsanlagen erreichen dabei durch
ihren Verfahrensaufbau eine BSB-Eliminationsrate
von über 95 %. Der abgebaute Kohlenstoff wird von
den Mikroorganismen sowohl für Katabolismus als
auch Anabolismus genutzt. Der heterotrophe Anteil
der Belebtschlammbiozönose ist hochdivers und
kann mehrere tausend Spezies aufweisen. Im Allge-
meinen gilt der aerobe Abbau von organischen Koh-
lenstoffverbindungen als der stabilste Prozessschritt
bei der biologischen Reinigung, da er die gerings-
ten Einschränkungen gegenüber Schwankungen
von pH-Wert, Temperatur, Redox-Potenzial und
Gelöstsauerstoffgehalt sowie potenziellen Hemm-
stoffen aufweist.
Katabolismus:
C18H19O9N + 17, 5 O 2 + H+
heterotropheBakterien
 18 CO + 8 H O + NH+ 
2 2 4 eine Reihe von mikrobiellen Reaktionen in der Bele-
(C18H19O9N: Allgemein verwendete Summenformel
für Abwasser)
Anabolismus:

C6H12O6 + O 2 + NH3 + Nahrstoffe
heterotropheBakterien
 C5H 7O 2N + CO 2 + H 2O

Bei optimaler Temperatur und pH-Werten können
Wachstumsraten von µmax = 4–8 d–1 erreicht werden.
Diese kontinuierlich neu gebildete Biomasse muss
durch den Abzug von Überschussschlamm aus dem
Prozess entfernt werden.
Stickstoffelimination
Stickstoff ist sowohl in organischen als auch anorga-
nischen Verbindungen im Abwasser vertreten, deren
Entfernung eine wichtige Aufgabe des Belebtschlamm-
prozesses ist. Die Stickstoffelimination wird durch
bungsstufe der Kläranlage erreicht. Bereits im Zulauf-
kanal werden die meisten organischen Stickstoffver-
bindungen in anorganischen Ammonium-Stickstoff
Kapitel 11 · Mikrobielle Prozesse
umgewandelt (Ammonifikation). Im aeroben Teil des
Prozesses wird der Ammoniumstickstoff zu Nitrat
oxidiert (Nitrifikation). Der Nitratstickstoff wird
anschließend zu elementarem Stickstoff reduziert
(Denitrifikation). Die Stickstoffelimination findet
parallel zum BSB-Abbau statt. Die beiden folgenden
Abschnitte erläutern den konventionellen Abbau der
anorganischen Stickstoffspezies genauer.
Nitrifikation
Ein Großteil des während der Ammonifikation
gebildeten Ammoniums wird bei der Nitrifikation
durch fakultativ aerobe chemolithoautotrophe Mik-
roorganismen in zwei Schritten biologisch oxidiert.
Im ersten Schritt („Nitritation“) wird Ammonium
durch ammoniumoxidierende Bakterien (AOB) wie
z. B. Nitrosomonas und Nitrosococcus in Nitrit umge-
wandelt, welches im zweiten Schritt („Nitratation“)
durch nitritoxidierende Bakterien (NOB) wie z. B.
Nitrococcus und Nitrospira zu Nitrat umgewandelt
wird.
Nitritation durch AOB
Nitrosomonas
2 NH 4+ + 3 O 2  2 NO 2− + 4 H+
+ 2 H 2O ∆G0 : 240 −350kJ/mol
Nitratation durch NOB
Nitrobacter
2 NO 2− + O 2 2 NO3−
∆G0 : 65 −90 kJ/mol [19]
AOB und NOB nutzen diese Reaktionen als Energie-
quelle für die Fixierung von CO2 über den Calvin-
Benson-Bassham-Zyklus um Zellsubstanz zu synthe-
tisieren [8, 32]. Diese Art der Kohlenstofffixierung
erfordert verglichen mit heterotrophem Anabolis-
mus deutlich mehr Energie, was eine geringe Wachs-
tumsrate der Nitrifikanten zur Folge hat.
AOB: [d–1]
µ max = 0, 47 * 1,103(T −15)
NOB: [d–1] [22]
µ max = 0, 78 * 1, 06(T −15)
Prozesstechnisch gesehen ist die Nitrifikation
empfindlich gegenüber pH-Wert- und Tem-
p eraturs chwan kungen s ow ie hemmenden
481 11
Abwasserinhaltsstoffen [14]. Des Weiteren kann
eine erhöhte Konzentration des AOB-Substrats den
NOB-Stoffwechsel hemmen und umgekehrt [1, 39].
Denitrifikation
Unter biologischer Denitrifikation versteht man den
dissimilatorischen, reduktiven Abbau von Nitrat über
Nitrit zu elementarem, gasförmigem Stickstoff. Unter
anoxischen Bedingungen nutzen fakultativ aerobe
chemoorganoheterotrophe Mikroorganismen Nitrat
und Nitrit – an Stelle von molekularem Sauerstoff
– als Elektronenakzeptor um leicht abbaubare orga-
nische Verbindungen zu oxidieren. Dieser Eigen-
schaft bedient man sich im Belebtschlammprozess
um zugleich die Konzentration an Nitrat, Nitrit und
organischen Verbindungen im Abwasser zu redu-
zieren, ohne zusätzlichen Sauerstoff bereitstellen zu
müssen [13]. In den unten aufgeführten Reaktions-
gleichungen werden sowohl der Gesamtreaktions-
weg der Nitratreduktion zu elementarem Stickstoff
als auch die beiden wichtigsten Schritte der Denitri-
fikation anhand der Oxidation von Acetat dargestellt.
Nar Nir Nor Nos
2 NO3− → 2 NO 2− → 2( NO) → N 2O → N 2 
5 CH3COOH + 8 NO3− → 4 N 2 + 10 CO 2
+ 6 H 2O + 8 OH− 
3 CH3COOH + 8 NO 2− → 4 N 2 + 6 CO 2
+ 2 H 2O + 8 OH− [28] 
Eine aerobe Oxidation von 5 Mol Acetat würde
12 Mol Sauerstoff erfordern, die durch die Nutzung
des Nitrats als Elektronenakzeptor eingespart
werden. Dies kann zur Senkung von Betriebskosten
durch verringerte Belüftungsleistung führen.
Der Prozessschritt „Denitrifikation“ wird abhän-
gig vom Anforderungsprofil der Anlage an unter-
schiedlichen Stellen im Anlagenverlauf eingesetzt.
In . Abb. 11.13 sind die beiden gängigsten Varianten
für einstufige Belebungsanlagen dargestellt.
In . Tab. 11.5 sind die Prozessbedingungen
zusammengefasst, die für die oben beschriebenen
Teilprozesse des Belebtschlammverfahrens vorteil-
haft sind und die entsprechende mikrobielle Biozö-
nonse stabilisieren.
 482 C. Syldatk et al.

. Abb. 11.13  Verfahrensvarianten zur Stickstoffelimination: (a) vorgeschaltete Denitrifikation (b) kaskadierte Denitrifikation
11
Anaerober Abbau von BSB möglich. Anaerobe Verfahren eignen sich insbe-
Alternativ zur aeroben Abwasserbehandlung, welche sondere für Abwässer mit einem großen C/N-Ver-
einen hohen Energiebedarf aufgrund belüfteter Pro- hältnis, vorausgesetzt der Kohlenstoff ist biologisch
zessstufen hat, ist ein biologischer Abbau von BSB leicht abbaubar. Dies trifft vor allem auf die Abwäs-
auch bei der Abwesenheit von sowohl molekula- ser der Getränke- und Lebensmittelindustrie [3]
rem als auch gebundenem Sauerstoff (anaerob) sowie die der Papier- und Zellstoffhersteller zu, die

. Tab. 11.5  Vorteilhafte Prozessbedingungen für den Belebtschlammprozess

Parameter Aerober Nitrifikation Denitrifika- Bio-P-elimi- Einheit Quelle

Abbau tion nation
org. Verb.

DO 1,5–2 3–4 <0,5 1. anaerob mg/L [22, 38]

2. aerob >1
pH 6,5–7,5 7,2–7,8 7–8,5 <6,5 –/– [5, 17, 41]
Temperatur 20–42 30–35 20–42 20 °C [16, 22]
Redox-Potenzial > +200 > +300 –100 bis +150 –150 bis –300 mV [19]
Trockensubstanzgehalt 2,5–4,5 2,5–4,5 2,5–4,5 – g/L [22]
Schlammalter 1–5 8–15 10–20 2,5 d [10, 15, 38]
Schlammbelastung 0,3 0,15 0,15 – kgBSB5/ [15]
kgTS
Kapitel 11 · Mikrobielle Prozesse
sich durch einen CSB von mehr als 1500 mg/L aus-
zeichnen [2]. Weiterhin werden Anaerobreaktoren
auf fast allen größeren Kläranlagen zur Stabilisie-
rung von Überschussschlamm eingesetzt. Größter
Vorteil des Verfahrens ist die Gewinnung von
Energie in Form von Methangas. Die Gasausbeute
ist abhängig vom eingesetzten Substrat. Bezogen auf
das Edukt „Kohlenhydrate“ liegt die mittlere spe-
zifische Gasausbeute bei 800 L/kg Substrat [29]. In
der Praxis ist die Ausbeute meist wesentlich geringer.
Der Methangehalt liegt zwischen 50 und 60 Vol.-%.
Der mikrobielle anaerobe Abbau kann grob in vier
Phasen eingeteilt werden: I Hydrolyse, II Acido-
genese, III Acetogenese und IV Methanbildung
. Abb. 11.14). Grundsätzlich können Anaerobver-
fahren ein- oder zweistufig konzipiert werden. Zwei-
stufige Verfahren trennen die Säurebildung von der
Methanbildung und sind deshalb etwas stabiler, aber
aufwändiger.
. Tab. 11.6 zeigt beispielhaft die Stöchiometrie
des Abbaus von Glucose der Reaktionen R1 bis R4.
Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist
die Hydrolyse (Teil I in . Abb. 11.14), der sensibelste
die Methanogenese (Teil IV in . Abb. 11.14). Ver-
fahrensstörungen in einstufigen Verfahren treten
meist durch zu schnelle Säurebildung und damit
einhergehendem pH-Abfall ein (Teil II und III in
. Abb. 11.14) [25]. Bei der anaeroben Schlammsta-
bilisierung geht der größte Teil des im System vor-
handenen Kohlenstoffs in die Gasphase über und
wird nicht für den mikrobiellen Anabolismus ver-
wendet, sodass kaum Überschussschlamm anfällt.
Der Betrieb ist meist kontinuierlich bei Temperatu-
ren um 35 °C. Da nicht belüftet werden muss, ist es
möglich, erhöhte Biomassekonzentrationen mit TS-
Gehalten bis zu 30 g/L im Prozess zu verwenden. Die
. Abb. 11.14  Schematische Darstellung der Abbauschritte bei anaeroben Prozessen (nach Schattauer und Weiland, 2004 [33])
483 11
hydraulische Verweilzeit liegt bei Abwasser mit leicht
abbaubarem CSB (Lebensmittelindustrie) bei einigen
Tagen, während bei der anaeroben Schlammbehand-
lung auf Kläranlagen drei bis vier Wochen üblich
sind. Der pH-Wert liegt meist im neutralen Bereich,
kann aber bei einer Hemmung der Methanogenese
durch die Akkumulation der Säuren auf ungefähr pH
5 absinken. Die Schlammbelastung (BTS) liegt zwi-
schen 0,1 und 0,5 (kg CSB/kg TS/d).
Anaerobe Deammonifikation
Alternativ zum konventionellen Nitrifikations/
Denitrifikations-Verfahren wird mit zuneh-
mender Häufigkeit der Anammox-Prozess zur
Stickstoffelimination eingesetzt (Anammox =
Anaerobe Ammonium-Oxidation). Hierbei
wird ein Teil des zu entsorgenden Ammoniums
lediglich zu Nitrit oxidiert und mit dem übrigen
Ammonium unter anaeroben Bedingungen durch
chemolithoautotrophe Anammox-Bakterien bei
Temperaturen über 20 °C zu molekularem Stick-
stoff synproportioniert.
1 NH 4+ + 1, 32 NO 2− + 0, 066 HCO3− + 0,13 H+
Anammox − Bakterien
 1, 02 N + 0, 26 NO −
2 3
+ 0, 66 CH 2O0,5N 0,15 + 2, 03 H 2O
Die Vorteile des Anammox-Prozesses liegen im
reduzierten Bedarf an Sauerstoff für die Stickstoffe-
limination, was im Vergleich zum klassischen Ver-
fahren eine mögliche Betriebskosteneinsparung
bei der Beckenbelüftung bedeuten kann. Nachteile
des Prozesses sind das langsame Wachstum und die
Bildung von 0,26 mol NO3- pro mol NH4+ (siehe
 484 C. Syldatk et al.
. Tab. 11.6  Beispielreaktionen für den anaeroben Abbau von Glucose (nach Denac et al [7])
R1 C6H12O6 → CH3(CH2)2COOH
C6H12O6 + 2H2 → 2CH3CH2COOH
C6H12O6 + 2H2O → 2CH3COOH
R2 CH3(CH2)2COOH + 2H2O → 2CH3COOH
CH3CH2COOH + 2H2O → CH3COOH
R3 CH3COOH → CH4 + CO2
R4 4H2 + CO2 → CH4 + 2H2O
Gleichung oben). Das heißt, dass der Prozess selber
keinen vollständigen N-Abbau realisieren kann.
Nitrat entsteht im Rahmen der Fixierung von CO2
im autotrophen Metabolismus. Nitrit wird zu Nitrat
oxidiert und CO2 wird zu organischem Kohlenstoff
reduziert. Durch die Symbiose von Anammox-Bak-
terien mit heterotrophen Bakterien kann das entstan-
dene Nitrat denitrifiziert werden.
Schlammbelastung und Schlammalter
11 Damit der Belebtschlammprozess die geforderte
Aufgabe erfüllt, müssen neben den konventionellen
Prozessparametern wie z. B. pH, T und O2 zusätz-
liche, unmittelbar auf die Mikroorganismen bezo-
gene Prozessparameter kontrolliert und gesteuert
werden.
Schlammbelastung
Um eine Überlastung der Biozönose und eine damit
einhergehende reduzierte Eliminationsrate der
Abwasserinhaltsstoffe zu vermeiden, ist die Kont-
rolle der Schlammbelastung im Prozess von großer
Wichtigkeit (. Abb. 11.15). Sie ist das Maß für die
täglich zu entsorgende Masse an biologisch abbau-
baren Abwasserinhaltsstoffen, die pro kg zur Verfü-
gung stehender Biomasse (TS) in den Prozess ein-
geleitet wird.
Schlammalter
Als Schlammalter bezeichnet man die durchschnitt-
liche Verweilzeit der in der Anlage befindlichen
Belebtschlammbakterien. Es beschreibt das Ver-
hältnis der Masse an Bakterien im Belebungsbecken
+ 2 CO2 + 2 H2
+ 2 H2O
+ 4 H2 + 4 H2 + CO2
+ 2 H2
+ CO2 + 3 H2
zum Massenstrom an Bakterien, der aus dem Prozess
abgeführt wird.
VBB ⋅ xTS
θx ≈  BB

Q ⋅ xTS + Q ⋅ xTS
e 
US
Durch seine Variation kann die Zusammen-
setzung der Biozönose beeinflusst werden und
somit bestimmte Bioreaktionen begünstigen oder
hemmen. Bei einem geringen Schlammalter (1–3
Tage) kann es beispielsweise zu einer unvollständi-
gen Nitrifikation kommen, da die Nitrifikanten bei
hoher Überschussschlammabfuhr aufgrund ihrer
geringen Wachstumsraten aus dem Prozess ausge-
waschen werden. Dies wird begünstigt durch eine
hohe Schlammbelastung, da mit einem erhöhten
Nährstoffangebot entsprechend mehr Überschuss-
schlamm abgeführt werden muss und somit das
Schlammalter sinkt [27]. Bei kontinuierlichen Pro-
zessen ohne Schlammrückführung entspricht die
hydraulische Verweilzeit dem Schlammalter.
Industrielle Abwasserreinigung
Im Gegensatz zur kommunalen Abwasserreinigung
ändert sich die Menge und Zusammensetzung des
industriellen Abwassers in Abhängigkeit von den
jeweiligen Produktionsprozessen. Industrielle Klär-
anlagen werden z. T. als Verbundanlagen (z. B. in
Chemieparks) oder als Anlagen für einen Prozess
(z. B. Brauerei) eingesetzt. Meist sind sowohl die
CSB- als auch die Nges.-Konzentrationen um eine bis
zwei Größenordnungen höher als im kommunalen
Bereich. Des Weiteren weicht das Substratverhältnis
Kapitel 11 · Mikrobielle Prozesse
. Abb. 11.15  Abhängigkeit
der BSB5-Eliminationsrate von der
Schlammbelastung
C/N häufig von dem häuslicher Abwässer ab. Viele
Industriebetriebe reinigen ihr Abwasser selber, um
es dann entweder als Indirekteinleiter in den öffent-
lichen Kanal abzugeben oder als Direkteinleiter in
ein Gewässer. Die Anforderungen für Direkteinlei-
ter sind in den Anhängen der Abwasserverordung
(AbwV, 1997) festgelegt. Industrielle Abwasserreini-
gung ist zum einen Bedingung für die Wasserwieder-
verwendung und zum anderen Erfüllung gesetzli-
cher Vorgaben (AbwV) zum Einleiten von Abwasser
in ein Gewässer. Weiterhin fordert der Gesetzgeber
immer eine Abwasserabgabe, die sich durch die
Reduktion der Schadstofffrachten entsprechend
mindert (AbwAG, 1976). Drei Beispiele für indust-
rielle Abwasserreinigung zeigen im Prinzip, welche
biologischen Prozesse eingesetzt werden können.
In der Lebensmittelindustrie (z. B. Schlacht-
höfe, Brauereien, Molkereien, Fruchtsafthersteller)
fallen immer große Mengen leicht abbaubarer orga-
nischer Kohlenstoffe an, so dass sich hier Anaerob-
verfahren anbieten. Beispielhaft wird im Folgenden
die Kläranlage einer Brauerei vorgestellt. Abwässer
fallen hier im Wesentlichen durch Brüdenkonden-
sate (Sudhaus) und Spülwässer an. Weiterhin fällt aus
der Reinigung mit Natronlauge verschmutze CIP-
Lauge an (cleaning in place, CIP). CIP-Lauge eignet
sich zur Neutralisierung der Säuren, die beim anae-
roben Abbau in der ersten Stufe des Prozesses ent-
stehen (siehe . Abb. 11.16).
485 11
In der chemischen Industrie (Anhang 22 AbwV)
fallen im Rahmen von chemischen, biochemischen
und physikalischen Prozessen große Mengen hoch-
belasteter Abwässer an. Aufgrund der Abwasser-
zusammensetzung sind Anlagen mit getrennten
Schlammkreisläufen sinnvoll, um hohe Frachten
an organischem Kohlenstoff und Stickstoff adäquat
zu behandeln [9] (siehe . Abb. 11.17). Getrennte
Schlammkreisläufe führen zu spezialisierten Biozö-
nosen z. B. für den Kohlenstoffabbau und die Nitri-
fikation. Dadurch werden in beiden Stufen optimale
Abbauraten erzielt.
Es wird deutlich, dass für zwei Schlammkreis-
läufe auch zwei Nachklärstufen notwendig sind.
Aufgrund der Strippung potenziell gefährlicher
Abwasserinhaltsstoffe ist eine Abluftentsorgung für
industrielle Kläranlagen typisch.
Abwasser fällt auch bei allen Deponien in Form
von Deponiesickerwasser an und ist nach Anhang
51 (AbwV) zu reinigen. Typischerweise ist das
C/N-Verhältnis ungünstig für eine klassische Nit-
rifikation mit Denitrifikation, so dass entweder mit
externen C-Quellen oder mit anaerober Deammo-
nifikation gearbeitet werden muss. Viele Anlagen
sind inzwischen von der klassischen Nitrifikation/
Denitrifikation ( . Abb. 11.18) auf die anaerobe
Deammonifikation umgestiegen. Eine Nachreini-
gung mit Aktivkohle hält einen Großteil von AOX
und nicht abgebautem CSB zurück. Weiterhin kann
 486 C. Syldatk et al.
. Abb. 11.16  Verfahren zur Reinigung eines Brauereiabwassers. Vermerk: Abwasser- und Laugenströme einer Brauerei nach
Kaschek et al [21]
11
. Abb. 11.17  Verfahren zur Reinigung eines Abwassers aus der chemischen Industrie
auf der Aktivkohle eine weitere Stufe mit anaerober
Deammonifikation mittels granulärem Anammox-
Schlamm etabliert werden, so dass die Stickstoffver-
bindungen fast vollständig abgebaut werden.
Entfernung von Spurenstoffen
Neben den oben beschriebenen Schadstoffen
kommen im Abwasser auch sogenannte Spuren-
stoffe vor. Definiert werden Spurenstoffe als anthro-
pogene organische Schadstoffe (DWA, 2008), wie z.
B. Human- und Veterinärpharmaka, Industrieche-
mikalien, polyzyklisch aromatisierte Kohlenwas-
serstoffe (PAK), Körperpflegemittel und Duftstoffe,
Waschmittel, Nahrungsmittelzusatzstoffe sowie
Fungizide, Herbizide und Pestizide. Die primäre
Wirkung dieser Stoffe ist meist zu vernachlässigen.
Durch Akkumulation in der Umwelt oder in Orga-
nismen können jedoch Probleme entstehen. Deshalb
ist die Entfernung der Stoffe zurzeit Gegenstand
intensiver Forschung. Auf einigen KA existieren
bereits Pilotanlagen zur Entfernung der Stoffe. Spu-
renstoffe, die in relativ hohen Konzentrationen vor-
kommen, sind neben besonders umweltrelevanten
Stoffen in einer Liste zu prioritären Stoffen zusam-
mengefasst (WRRL 2000/60/EG, 2000). Die Entfer-
nung von Spurenstoffen erfolgt durch oxidativen
Abbau (advanced oxidation processes, AOP), Adsorp-
tion an Aktivkohle, Rückhalt durch Membranen oder
entsprechenden Kombinationen. Viele Stoffe werden
biologisch nicht oder wenig abgebaut. Der biologi-
sche Abbau kann im Einzelfall aber durch Vorbe-
handlung mit AOP in Kombination mit einem hohen
Schlammalter eine Rolle spielen. Aktivkohle kann
pulverförmig oder granuliert verwendet werden. Die
Kombination von Pulveraktivkohle mit Membran-
verfahren sorgt für den ganzheitlichen Rückhalt der
beladenen Aktivkohle.
Kapitel 11 · Mikrobielle Prozesse
. Abb. 11.18  Verfahren zur Reinigung von Deponiesickerwasser
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 489 12

Kultivierung von
­Säugetierzellen
Ralph Kempken, Franz Walz und Michael Howaldt

12.1 Eigenschaften von Tierzellen – 491

12.1.1 Kultur von Primärzellen – 491
12.1.2 Etablierung von Zelllinien – 493

12.2 Zellcharakterisierung – 499

12.2.1 Herstellung von Zellbanken – 499
12.2.2 Freigabe und Charakterisierung von Zellbanken – 500
12.2.3 Wirtszelllinien – 501

12.3 Die Umgebung von Zellen in Kultur – 506

12.3.1 Zellkulturmedien – 507

12.4 Zellkultivierungsmethoden – 510

12.4.1 Rührkesselreaktoren (stirred tank reactor, STR) – 512
12.4.2 Weitere Reaktoren – 514
12.4.3 Systeme zur Zellrückhaltung – 514

12.5 Prozessführung bei Säugerzellkulturen – 515

12.5.1 Sterilisation – 515
12.5.2 Medienfiltration – 515
12.5.3 Zellkultivierungsverfahren – 515
12.5.4 Prozessparameter und Prozessmonitoring – 516
12.5.5 Methoden der Zellabtrennung – 518

12.6 Prozessentwicklung und Scale-up – 520

12.6.1 Aufgaben der Prozessentwicklung – 520
12.6.2 Quality by design-Konzept bei der Prozessentwicklung – 521
12.6.3 Entwicklung und Optimierung von Zellkulturverfahren – 521
12.6.4 Charakterisierung von Zellkulturverfahren – 522

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2018

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https://doi.org/10.1007/978-3-662-54042-8_12
12.6.5 Methoden zur Prozessentwicklung – 524
12.6.6 Prozesstransfer und Maßstabsvergrößerung – 528

12.7 Großtechnische biopharmazeutische Produktion – 529

12.7.1 Aufbau und Organisation einer großtechnischen biotechnischen
Produktionsanlage – 529
12.7.2 Prozessvalidierung und Lebenszyklus biopharmazeutischer Prozesse
und Produkte – 532
12.7.3 Good Manufacturing Practice bei biopharmazeutischen
Prozessen – 536
12.7.4 Betrieb einer großtechnischen Produktionsanlage – Wechselwirkun-
gen zwischen Prozessformat und Anlagendesign – 537
12.7.5 Entwicklung eines Folgeprozesses und daraus resultierender Ände-
rungsaufwand – 539

Literatur – 540
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
Die Kultivierung von Säugetierzellen hat in Verbin-
dung mit der industriellen Anwendung der Gen-
und Biotechnik eine enorme medizinische und
wirtschaftliche Bedeutung erlangt. Eine stetig stei-
gende Zahl von Proteinen, die in tierischen Zellen
exprimiert werden, ist bereits für die Anwendung am
Menschen zugelassen bzw. wird für ihre Eignung als
Arzneimittel geprüft. Im Jahr 1987 wurde Actilyse®
für die Therapie des Herzinfarktes in den Markt ein-
geführt, als eines der ersten Medikamente dieser
Art, das aus Säugetierzellkulturen gewonnen wurde.
Seitdem wurden viele weitere Proteine als Medika-
mente zur Therapie von Krankheiten aus Zellkul-
turen hergestellt, die inzwischen eine große wirt-
schaftliche Relevanz erreicht haben. Vier der fünf
umsatzstärksten Medikamente im Jahr 2014 wurden
auf Basis der Säugetier-Zellkulturtechnologie herge-
stellt (. Tab. 12.1). Auch die Diagnose-Möglichkei-
ten konnten durch gentechnische Verfahren erheb-
lich erweitert werden. Viele Substanzen, die zuvor
aufwendig und meist unwirtschaftlich aus tieri-
schen und menschlichen Geweben extrahiert werden
mussten, können inzwischen gezielt und sicher aus
Säugetierzellkulturen hergestellt werden. Gentech-
nisch erzeugte Impfstoffe ermöglichen zunehmend
die maßgeschneiderte Herstellung ausschließlich der
für die Immunisierung erforderlichen Substanzen
(Antigene), sodass Nebenwirkungen der Impfung
verringert werden. Für zahlreiche Krankheiten, bei
denen es noch keine kausale Therapiemöglichkeiten
gibt, können mithilfe der Tierzellkultur die Schlüs-
selmoleküle, die Krankheiten auslösen oder steuern,
isoliert und auf ihre Wirksamkeit getestet werden.
In jüngster Zeit gewinnt auch die Zelltherapie für
unterschiedliche Indikationsgebiete immer mehr an
Bedeutung. In diesem Kapitel wird im Wesentlichen
nur auf die Herstellung therapeutischer Wirkstoffe
aus Säugetierzellkulturen eingegangen. Der Fokus
liegt dabei auf einer qualitativen Darstellung. Zur
Vertiefung einzelner Themen wird auf andere Kapitel
dieses Buches bzw. auf Fachliteratur verwiesen.
12.1 Eigenschaften von Tierzellen
Die meisten Bakterien und Pilze, die in der Bio-
technologie verwendet werden, kommen in vitro,
d. h. im Reagenzglas bzw. im Bioreaktor, als Einzel-
zellen vor und durchlaufen keine Differenzierung.
491 12
Im Gegensatz hierzu haben die Keimzellen von
Tieren und Pflanzen die Fähigkeit, aus einer ein-
zigen Zelle einen differenzierten Organismus zu
bilden. Im lebenden System (in vivo) kommen Tier-
zellen bzw. Pflanzenzellen in Gemeinschaft vor und
bilden Gewebe, d. h. größere abgegrenzte Verbände
von gleichartig differenzierten Zellen mit gleicher
Funktion. Tierzellen sind meistens hoch speziali-
siert: Nervenzellen übertragen elektrische Impulse,
Leberzellen können Proteine, Fette und Zucker
umbauen, Muskelzellen können sich zusammenzie-
hen und ausdehnen, Knochenzellen scheiden eine
Knochensubstanz aus Collagen und Calciumsalzen
aus. Tierzellen der Haut, des Herzmuskels, der Leber,
des Rückenmarks unterscheiden sich stark in ihrem
Aufbau und ihrer Funktion. Werden ausdifferen-
zierte Gewebezellen aus Pflanzen entnommen und
auf geeigneten Nährböden kultiviert, können sie sich
wieder zu embryonalen (totipotenten) Zellen entdif-
ferenzieren. Dagegen behalten ausdifferenzierte tie-
rische Zellen auch in der Zellkultur ihren Differen-
zierungsstatus bei. Tierzellkulturen entstehen also in
den meisten Fällen aus Einzelzellen von bestimmten
Geweben.
12.1.1 Kultur von Primärzellen
Primärzellkulturen sind in vitro-Züchtungen von
Organen, Geweben oder Zellen, die direkt aus einem
Organismus entnommen wurden.
Bei der Organkultur sollen die Struktur und
Organisation der einzelnen Zellen und Gewebe des
Organs möglichst gut beibehalten werden. Organ-
kulturen in vitro können zur Prüfung pharmako-
logischer, physiologischer oder toxikologischer
Fragestellungen angewendet werden. Sie werden
hauptsächlich für Kurzzeit-Experimente eingesetzt
und bilden meistens einen Kompromiss zwischen der
hohen Komplexität eines Organismus und der ver-
gleichsweise geringen Komplexität einer Zellkultur.
Besonders schwierig ist jedoch die Aufrechterhal-
tung von geeigneten Umgebungsbedingungen. Der
Zustand des kultivierten Organs kann fast nur mit
indirekten Methoden nachverfolgt werden. Je nach
Organ bzw. Tierspezies können die Verbrauchs- und
Bildungsraten von Nährstoffen bzw. Stoffwechselpro-
dukten im Medium gemessen und zur Abschätzung
des Organzustands verwendet werden. Beispiele für
 492 R. Kempken et al.
. Tab. 12.1  Top 5 Biopharma-Produkte [95]
Produkte (Handelsnamen) Firmen
Humira AbbVie
Enbrel Amgen, Pfizer
Rituxan/MabThera Roche, Biogen
Remicade Johnson & Johnson, Merck & Co
Avastin Roche
Stoffwechselprodukte sind Glucose, Lactat, Ammo-
nium, Harnstoff, Lactat-Dehydrogenase (LDH).
Für eine erfolgreiche Kultivierung von Organen ist
es in der Regel notwendig, von Zeit zu Zeit einen
Mediumwechsel vorzunehmen oder eine Perfusion
durchzuführen, d. h. eine kontinuierliche Entnahme
von verbrauchtem Medium und Ersatz des entnom-
menen Volumens durch frisches Nährmedium
(7 Abschn. 12.5.3). Dadurch werden auch Stoffwech-
selprodukte entfernt, ehe sie im Medium stark ange-
reichert und somit zu Schadstoffen werden. Solche
Wechsel des Mediums sollten aber nicht zu häufig
erfolgen, weil aus dem Organ oder dem Gewebe oder
den Zellen auch Substanzen mit fördernden Eigen-
schaften für Zellwachstum und Überlebensfähigkeit
12 in das umgebende Medium ausgeschieden werden
können (konditioniertes Medium).
Bei der Gewebekultur wird ein Teil oder eine
Probe eines Organs entnommen (Biopsie) und kleine
Stücke der Gewebeprobe in sterilen Kulturmedien
gezüchtet.
Bei Primärzellkulturen wird die entnommene
Gewebeprobe durch mechanische oder enzyma-
tische Einwirkung in Einzelzellen dissoziiert. Fol-
gende Enzyme sind gebräuchlich: Trypsin, Colla-
genase, Dispase, Pronase, Elastase, Hyaluronidase
und DNAse [75]. Zum Ende der enzymatischen
Dissoziierung sollten die Primärzellen gewaschen,
d. h. Zentrifugieren der Zellen und Aufnahme der
sedimentierten Zellen in frisches Medium, und die
Kultivierung bei wesentlich höherer Einsaatdichte
begonnen werden, als dies bei normaler Subkultur
von etablierten Zelllinien üblich ist.
Primärzellkulturen, die nicht aus Tumor-
gewebe oder aus Blutzellen stammen, benöti-
gen geeignete feste Substrate für ihre Anheftung
Umsatz im Jahr 2016 (in Mrd. US $)
16,08
8,87
8,58
7,83
6,75
(adhärente Kultivierung). Diese vermehren sich in
der Regel nur nach ihrer Spreitung auf Oberflächen
(7 Abschn. 12.4).
Die Kultivierung von Hautgewebe in vitro
wurde für medizinische Anwendungen, vor allem
zur Transplantation nach großflächigen Verbren-
nungen und zur Beschleunigung der Wundheilung,
aus Primärgewebe erfolgreich durchgeführt. Je nach
Herkunft bezeichnet man das transplantierte Haut-
gewebe als homolog (= vom gleichen Organismus),
als allogen (= von einem anderen Individuum der
gleichen Spezies) oder als heterolog (= von einer
anderen Spezies). Die Erwartungen an die Regenera-
tive Medizin sind groß; einige davon konnten bisher
erfüllt werden [102].
Die Kultivierung von Bindegewebszellen (Fib-
roblasten) in vitro ist aufgrund ihres geringen Diffe-
renzierungsgrades relativ einfach möglich. Mensch-
liche Fibroblasten können als Primärzellkulturen in
vitro etwa bis zu 50 Zellteilungen vollziehen, ehe sie
dann absterben.
Die Kultivierung von Leberzellen (Hepatozy-
ten) in vitro ist aufgrund ihres komplexen bipola-
ren Aufbaus dagegen schwierig. In Suspensionskul-
tur verlieren Hepatozyten ihre natürliche Funktion
innerhalb weniger Stunden [44]. Bei Oberflächen-
kulturen, z. B. in Hohlfaser-Ultrafiltrationsmodulen
bzw. Dialyse-Modulen, wird die natürliche metaboli-
sche Funktion der Hepatozyten erheblich verlängert
und die Zellen leben länger. Noch geeigneter ist die
Kultivierung der Leberzellen in sogenannten Kapil-
larmembranreaktoren [43]. Hier bilden die Hepato-
zyten kleine Zellaggregate (Spheroide) und werden
zum Teil an den Kapillarmembranen immobilisiert.
Infolgedessen reorganisieren sie sich zu dreidimen-
sionalen Gruppen, die in Struktur und Funktion den
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
Hepatozyten in vivo ähneln. Elektronenmikroskopi-
sche Untersuchungen haben gezeigt, dass Monolayer-
Kulturen von Leberzellen ihre Polarität verlieren und
dass Leberzellen in Multilayer-Kulturen eine Selbstag-
gregation vollziehen, die zu einer dreidimensionalen
Zellstruktur, einer Rekonstitution der Gallenkanäle
und der Polarität der Zellen sowie zu einer Reorien-
tierung der Zellorganellen führt [72]. Für präklini-
sche Sicherheits- und Effektivitäts-Prüfungen werden
aktuell human-on-a-chip-Systeme entwickelt und als
Alternative für Tierversuche getestet. Hierbei werden
Proben von verschiedenen menschlichen Geweben als
„miniaturisierte Organe“ (etwa im Maßstab 1:100.000
zum menschlichen Körper) mit einem künstlichen
Blutkreislauf verbunden. Mit diesem System könnten
Stoffwechselvorgänge und Krankheitsabläufe authen-
tisch nachgestellt werden [80].
Differenzierung von Zellen
Ein Beispiel für die vielfältigen Entwicklungs-
möglichkeiten und das Verhalten normaler Säu-
getierzellen ist die Differenzierung der Zellen des
Immunsystems. Diese Zellen sind darauf speziali-
siert, körperfremde Antigene und Mikroorganis-
men zu erkennen und zu eliminieren. Alle Zellen
des tierischen und des menschlichen Immunsys-
tems stammen von pluripotenten haematopoeti-
schen Stammzellen aus dem Knochenmark ab. Das
bedeutet, dass sich diese Stammzellen zu vielen ver-
schiedenen Blutzellen entwickeln können, wenn sie
geeigneten Bedingungen ausgesetzt werden [104].
Die Differenzierung erfolgt zunächst in die myelo-
tischen und die lymphoiden Vorläuferzellen. Aus
den myelotischen Zellen entwickeln sich Zellen, die
körperfremde Zellen oder Teile davon einschließen,
verdauen oder anderweitig eliminieren können
(Monozyten, Thrombozyten, Makrophagen, Mast-
zellen, Neutrophile, Basophile, Eosinophile). Aus
den lymphoiden Zellen entwickeln sich die T-Zel-
len (im Thymus) und die B-Zellen (in der Leber bzw.
bei Säugetieren im reifen Knochenmark). In diesen
Organen erwerben die T- und B-Zellen ihre Fähig-
keit zur Erkennung von Antigenen, und infolgedes-
sen vermögen sie eine enorme Vielfalt spezifischer
Antikörper gegen diese Antigene auszubilden. Die
Antikörper erkennen körperfremde Zellen und Anti-
gene, binden an die spezifischen Rezeptoren an der
493 12
Oberfläche dieser fremden Strukturen und sorgen,
ggf. mit Unterstützung anderer Zellen des Immun-
systems, für deren Eliminierung. Die genetische
Unterschiedlichkeit der lymphoiden Zellen wird
durch ein hohes Maß an somatischer Genrekombi-
nation und Mutation während der Differenzierung
der Zellen und ihrer Antigen-erkennenden Moleküle
erreicht [110].
Die Transplantation von Knochenmarkzellen
wird bereits erfolgreich für die Therapie von Leu-
kämie-Patienten angewendet. Hierbei wird dem
Patienten Knochenmark-Substanz entnommen
und von leukämischen Zellen gereinigt. Durch eine
Ganzkörperbestrahlung, teilweise in Kombination
mit einer Chemotherapie, werden dann alle leuk-
ämischen Zellen im Körper des Patienten zerstört.
Weil außer den Krebszellen auch die Stammzellen
und Zellen des Blutsystems empfindlich auf radio-
aktive Strahlung reagieren, ist eine Transfusion der
entnommenen Knochenmarkzellen in den Patien-
ten notwendig, damit die Entwicklung von Blutzel-
len (Hämatopoese) weiterhin stattfinden kann. Für
Forschungszwecke zur Krebstherapie und für mög-
liche Anwendungen zur Gentherapie wird die Kulti-
vierbarkeit von pluripotenten Stammzellen und die
Erforschung und Steuerung der Differenzierungs-
vorgänge dieser Zellen untersucht [73, 77, 114].
Im Gegensatz zu Primärzellkulturen aus anderen
Geweben können Blutzellen in Suspension, d. h.
ohne ein festes Substrat zur Anheftung der Zellen,
kultiviert werden. Prinzipiell sterben Blutzellen in
Kultur relativ schnell ab. Um diese in vitro norma-
lerweise nicht proliferierenden Zellen zur Teilung
anzuregen, werden die Blutzellen mit sogenannten
Mitogenen, z. B. Lectine oder Lipopolysaccharide,
stimuliert. Nach Zugabe der Mitogene teilen sich
Blutzellen einige Male und sterben danach meist ab.
Die erfolgreiche Kurzzeit-Kultivierung primärer tie-
rischer Zellen ist fast nur in serumhaltigen Vollme-
dien möglich (7 Abschn. 12.3).
12.1.2 Etablierung von Zelllinien
Normale Zellen in Kultur haben eine begrenzte
Lebensdauer [54]. Manchmal erhalten Zellen in
Kultur die Fähigkeit zu permanenter Zellprolife-
ration, insbesondere wenn sie aus Tumorzellen
 494 R. Kempken et al.
stammen. Daraus können Zelllinien mit relativ
homogener Zellpopulation entstehen, die sich per-
manent vermehren und bei geeigneten Umgebungs-
bedingungen potenziell unbegrenzt lange in vitro
subkultiviert werden können. Etablierte Zelllinien
mit homogener Zellpopulation, möglichst ausge-
hend von einem Zellklon, sind für die industrielle
Anwendung der Zellkulturtechnik von essenzieller
Bedeutung.
Transformation von Säugetierzellen
Zellen, die der homöostatischen Kontrolle (Feed-
back-Regulation) dauerhaft nicht mehr folgen,
werden als „abnorme“ Zellen (Tumor- oder Krebs-
zellen) bezeichnet. Den Übergang von einer norma-
len Zelle in eine abnorme Zelle nennt man Trans-
formation. Die Zelle verliert ihr zellkooperatives
Verhalten im Zellverband, unterliegt nicht mehr der
Kontaktinhibition und den Feedback-Regulations-
mechanismen, sondern sie wächst in vivo über die
Gewebegrenzen und in vitro über die Monolayer-An-
ordnung der statischen Kultur hinaus.
Die Transformation einer Zelle ist kein einstufi-
ger Prozess. Sie ist eine Abfolge zellulärer Verände-
rungen, die den Phänotyp und auch den Genotyp
betreffen können. Verschiedene Phasen der Trans-
12 formation ähneln Reaktionen, die auch normale
Zellen bei der Differenzierung und Reifung durch-
laufen. Die Zelldifferenzierung ist ein Vorgang, bei
dem Veränderungen von Zellstrukturen und -funk-
tionen durch das An- und Abschalten von Genen
entstehen. Unter Zellreifung versteht man Verände-
rungen des Phänotyps der Zelle im Laufe ihrer ohne
Zellteilung erfolgenden Alterung. Die Transforma-
tion wird mit einer „Entdifferenzierung“ der Zelle
verglichen: Die tierische Zelle wird pluripotent, d. h.
sie erlangt die Fähigkeit, vielfältige Funktionen aus-
zuüben, und sie entwickelt bioaktive Strukturen, die
denen normaler embryonaler Zellen gleichen oder
ähnlich sind.
Zellfusion und Hybridomazellen
Abnorme Zellen sind für die Zellkulturtechnik
wegen ihrer potenziellen Immortalität, ihrer relativ
problemlosen Handhabbarkeit und ihrer vielfältigen
Verwendungsmöglichkeiten von großer Bedeutung.
Ein klassisches Beispiel ist die Herstellung von Hyb-
ridzellen zur Produktion von Antikörpern.
z z Hybridoma-Technik
Dies ist ein Zellfusionsverfahren zur Gewinnung von
Hybridzellen, die Eigenschaften beider Elternzellen
aufweisen (. Abb. 12.1). Dabei wird eine normale
Zelle von begrenzter Lebensdauer und Teilungsfähig-
keit, aber mit der besonderen Eigenschaft der Expres-
sion z. B. eines Antikörpers, mit einer Tumorzelle
fusioniert, z. B. durch Zugabe von Polyethylengly-
kol, PEG 1500. Die Tumorzelle besitzt als potenziell
immortale Zelle eine ständige Proliferationsaktivität.
Durch die Fusion entsteht zunächst eine Zelle mit
zwei Zellkernen (Heterokaryon), die dann in eine
einkernige Zelle mit zwei verschiedenen Chromo-
somensätzen übergeht (Synkaryon). Bei den folgen-
den Zellteilungen verlieren die Hybridzellen einzelne
Chromosomen, bis sie von jedem ein Chromosom
nur noch eines aus einer der elterlichen Zellen ent-
halten. Es entsteht eine Population verschiede-
ner Hybridzellen, die sich dadurch unterscheiden,
welche Chromosomen von welcher Elternzelle in
der Zelle verblieben sind. Diejenigen Zellen, die die
gewünschten Eigenschaften der normalen Produk-
tionszelle, nämlich die Expression eines Antikörpers
mit der dauerhaften Proliferation der Tumorzelle, in
sich vereinigen, werden vereinzelt heraussortiert
(selektioniert). Sie werden dann als Zellklon, d. h.
als genetisch identische Zellen, weiter gezüchtet und
können als Zellbank eingefroren werden (7 Abschn.
12.2). Diese Zellen werden als Hybridomazellen (hyb-
ridoma) bezeichnet, mit deren Hilfe monoklonale
Antikörper (monoclonal antibodies) erzeugt werden.
z z HAT-Selektion
Eine bewährte Vorgehensweise für die Selektion
von Zellhybriden bzw. Hybridoma-Zelllinien ist
die HAT-Selektion [105]. Man verwendet ein Selek-
tionsmedium, das Hypoxanthin, Aminopterin und
Thymidin enthält (HAT-Medium). Das enthaltene
Aminopterin verhindert die Synthese von Purinen
und somit die Bildung von Bausteinen für DNA und
RNA in den Zellen. Wenn bei der einen Elternzelle
1 für die Hybridzelle die Fähigkeit zur Bildung von
Thymidinkinase fehlt (TK−) und bei der anderen
Elternzelle 2 die Fähigkeit zur Bildung des Enzyms
Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
495 12

. Abb. 12.1  Hybridoma-Technik und HAT-Selektion

 496 R. Kempken et al.
(HGPRT) fehlt (HGPRT−), dann können im HAT-
Medium die fusionierten Zellen vom gleichen Typ
sowie die nicht-fusionierten Zellen nicht überle-
ben. Es überleben jedoch diejenigen fusionierten
Zellen, die aus den zwei verschiedenen Chromoso-
mensätzen das HGPRT-Gen der Elternzelle 1 und
das TK-Gen der Elternzelle 2 übernommen haben.
Das Enzym HGPRT ermöglicht tierischen Zellen die
Nutzung der im HAT-Medium enthaltenen Purin-
base Hypoxanthin für den Nucleinsäure-Stoffwech-
sel. Bei Zellen ohne HGPRT ist daher im HAT-Me-
dium keine ausreichende Bildung von Nucleinsäuren
zur DNA-Synthese möglich, wodurch die Zellteilung
dieser Zellen selektiv gehemmt wird. Infolgedessen
sterben diese Zellen ab. Das im HAT-Medium enthal-
tene Thymidin bietet die Möglichkeit, die Blockade
der Umwandlung von dUMP zu dTMP, die von
Aminopterin hervorgerufenen wird, zu umgehen.
Das Enzym Thymidin-Kinase (TK) kann Thymi-
din aus dem HAT-Medium direkt phosphorylieren
und somit für die DNA-Synthese verfügbar machen.
Durch Kultivierung der HGPRT- bzw. TK-Zellen in
HAT-Medium können daher nur die Zellen überle-
ben, die ein aktives Gen mit Hilfe der Fremd-DNA
erhalten haben. Die HAT-Selektion ist somit gut
geeignet, die Transformation von eukaryotischen
Zellen mit fremder DNA zu verfolgen und entspre-
12 chende Klone zu selektieren.
Rekombinante DNA-Technologie
Die Grundlage für viele gentechnische Verfahren ist
der Einbau eines fremden Gens in einen Expressions-
vektor sowie die stabile Integration dieser Expres-
sionsvektoren in die tierischen Zellen (Wirtszelllinie)
und die Optimierung der Kulturbedingungen dieser
Zellen zur Herstellung des Produktes, für das das
„fremde“ (heterologe) Gen codiert. Dieses Produkt
kann z. B. ein therapeutisch wirksames Protein sein.
Auf diese Weise können wertvolle biologische Subs-
tanzen relativ kostengünstig und bis zu viele Hundert
Kilogramm pro Jahr produziert werden.
Die DNA-Sequenz für das gewünschte Produkt
wird zuerst in eine dazu passende, komplemen-
täre mRNA (messenger RNA) umgeschrieben
(. Abb. 12.2). Diese mRNA wird extrahiert und in
vitro wieder zurück in komplementäre cDNA-Stü-
cke (complementary DNA) geschrieben. Die cDNA
wird dann in Vektoren eingebaut, die sich in Bakte-
rienzellen vermehren können. Eine cDNA lässt sich
so beliebig vervielfältigen (klonieren).
Diese klonierten Kopien der cDNA werden dann
in vitro in einen Expressionsvektor eingebaut. Vek-
toren sind Nucleinsäuren, die als Träger von Fremd-
DNA dienen. Mit dem Vektor wird diese Fremd-
DNA in das Genom der Wirtszellen eingebracht, wo
sie dann exprimiert wird. Ein solcher Vektor enthält
vor allem die folgenden genetischen Elemente: Repli-
kations-Origin, Enhancer, Promotor, Restriktions-
schnittstellen zum Einbau der Fremd-DNA durch
Rekombination, Terminator sowie ein oder mehrere
Selektionsmarkergene. Der Vektor ermöglicht die
Rekombination fremder DNA an einer Restriktions-
schnittstelle, die den Vektor so schneidet, dass seine
Replikation nicht beeinflusst wird.
Anschließend wird der Expressionsvektor in den
Wirtsorganismus eingeführt (Transformation). Die
Übertragung (Transfer) von Expressionsvektoren
in die aufnehmende Wirtszelllinie kann ausgelöst
werden durch:
55 chemische Hilfssubstanzen, wie z. B. Calcium-
phosphatpräzipitation, DEAE-Dextrane,
Polyethylenglykol-Schock;
55 Mikrokapseln (vesicles), z. B. rekonstituierte
Virushüllen (envelopes), Liposomen;
55 Zellfusion;
55 virale oder bakterielle Vektoren (Retroviren,
Ti-Plasmid von Agrobacterium);
55 physikalische Kräfte (Elektroporation, direkte
Mikroinjektion).
Auf diese Weise können DNA-Abschnitte, ein
Expressionsvektor oder auch andere Makromole-
küle in Tierzellen eingeschleust und ihre Wirkun-
gen auf definierte Bereiche der inneren Zellstruktu-
ren untersucht werden.
Schließlich muss der aufgenommene Expres-
sionsvektor in das Genom der Wirtszelllinie stabil
eingebaut werden, vorzugsweise an Stellen, die eine
hohe Transkriptionsaktivität aufweisen. Dies bewirkt
eine intensive Ablesung der genetischen Information
zu mRNA, die dann nach den Regeln des genetischen
Codes in die Aminosäuresequenz des Proteins umge-
setzt wird. Die Stabilität des Vektors, die Anzahl der
Kopien der rekombinanten DNA pro Zelle und die
Transkriptionsaktivität sind entscheidend für die
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
497 12

mRNA (mit Zielgen)

Isolierung des Zielgens

Plasmid (Klonierungsvektor) mit eingebauter Fremd-

DNA (rekombinante DNA mit dem Zielgen)

Einbau (Transformation) des Plasmids in Bakterien

zur Vervielfältigung des Zielgens

Vermehrung des Plasmids in Bakterien, dann

Isolierung des Zielgens und Einbau in einen
eukaryotischen Expressionsvektor

wachsenden Zellen. Anlage einer Master-Zellbank.

. Abb. 12.2  Rekombinante DNA-Technologie

 498 R. Kempken et al.
Expression des gewünschten Proteins. Ein geziel-
ter Einbau des Vektors in vordefinierte Stellen in
bestimmten Chromosomen der Wirtszellen (targe-
ted integration, 7 Abschn. 12.2.3) ist noch nicht ver-
lässlich etabliert, sodass in der Regel eine Population
von transfizierten Zellen entsteht, die unterschied-
liche Eigenschaften aufweisen können.
Durch Selektion müssen aus der großen Zahl
der transfizierten Zellen diejenigen herausgesucht
werden, die eine hohe Transkriptionsaktivität auf-
weisen, die eine große Anzahl an Kopien der rekom-
binanten DNA im Genom der Wirtszellen integriert
haben, an Orten, an denen dieser Eingriff keine nega-
tiven Folgen für die Wirtszell-Funktionen hat, und
die diese Kopien stabil integriert besitzen. Für die
Isolierung der bestgeeigneten Zellen und zur Auf-
rechterhaltung des Selektionsdruckes bei Langzeit-
Kultivierungen können geeignete Selektionsme-
chanismen eingesetzt werden (. Abb. 12.2). Zwei
bekannte Mechanismen zur Selektion und Amp-
lifikation, d. h. Vervielfachung der Kopienzahl
der rekombinanten DNA, werden im Folgenden
vorgestellt.
z z Selektion mithilfe von DHFR und Methotrexat
Dies ist die am häufigsten angewendete Methode
zur Selektion und Genamplifikation bei CHO-Zell-
12 linien (7 Abschn. 12.2.3). Das Enzym Dihydrofola-
treduktase (DHFR) katalysiert die Umwandlung von
Folat zu Tetrahydrofolat, einem Katalysator für die
Synthese von Glycin, Thymidinmonophosphat und
Purinen. Wenn CHO-Zellen durch chemische Muta-
genese die Fähigkeit zur Expression von DHFR ver-
lieren [119], dann können sie nicht mehr in Zellkul-
turmedien wachsen, die keine Nucleoside enthalten.
Wenn sie ein funktionelles DHFR-Gen durch Trans-
fektion erwerben, erlangen sie diese Fähigkeit wieder.
In dieser Weise transfizierte Zellen können weiter
selektioniert werden auf Amplifikation (Vervielfäl-
tigung) des DHFR-Gens durch schrittweise Erhö-
hung der Konzentration von Methotrexat (MTX)
im Medium.
MTX ist ein Folsäure-Analogon. Es bindet an
das Enzym DHFR und inhibiert es dadurch stöchio-
metrisch. Deswegen zwingt MTX die transfizierten
Zellen zu Gen-Rearrangements und Amplifika-
tion, damit diese in Gegenwart von MTX überle-
ben können. Durch mehrere Stufen der Selektion
mit steigender MTX-Konzentration kann man Zell-
populationen erhalten, die bis zu mehrere Hundert
Kopien des DHFR-Gens besitzen.
Eine gemeinsame Transfektion und Integration
von Plasmiden, die den DHFR-Marker bzw. das Gen
für das gewünschte Produkt (Zielgen, gene of inter-
est) tragen, an der gleichen Stelle im Genom führt
zur Co-Amplifikation beider Gene. Dies führt in
der Regel zur Produktion einer großen Menge des
andersartigen (heterologen) Proteins in der co-trans-
fizierten Zelllinie [67]. Ob der hohe Expressions-
grad dann auch ohne MTX, d. h. in Abwesenheit
des Selektionsdruckes, beibehalten werden kann, ist
durchaus unterschiedlich für jede transfizierte Zelle
und ist vor allem abhängig von der Klonalität der
Zellpopulation und vom Integrationsort der ampli-
fizierten heterologen Gensequenzen [70, 89]. Daher
ist eine sorgfältige Auswahl, Prüfung und Charak-
terisierung der Produktionszelle aus den Pools der
transfizierten und amplifizierten Zellen sehr wichtig,
um eine stabile und hochproduzierende Zelllinie zu
etablieren.
Die Häufigkeit und die Konsistenz der Expres-
sion kann gesteigert werden, indem das DHFR-Gen
gemeinsam mit dem Zielgen in die gleiche Expres-
sions-Kassette ‒ d. h. in dasselbe Genfragment ‒
eingebaut wird, anstatt zwei einzelne Plasmide zu
co-transfizieren. Wenn nach erfolgreicher Integra-
tion ein solcher Expressionsvektor abgelesen wird
(Transkription), wird eine bicistronische mRNA
erzeugt und daher die Produktion des gewünsch-
ten Proteinproduktes eng an die MTX-Resistenz
gekoppelt [66].
Eine hoch exprimierende Zelllinie wird von
transfizierten und anschließend amplifizierten
Zellpools erhalten. Wenn die maximale Stufe der
Amplifikation erreicht ist, d. h. wenn der Produkt-
titer durch weitere Erhöhung der MTX-Konzentra-
tion nicht mehr gesteigert werden kann, werden die
Zellen rekloniert. Bei der Reklonierung werden aus
der Mischung der genetisch nicht identischen Zell-
population einzelne Zellen isoliert. Methoden für
diese Isolation sind:
55 Picken von Klonen mit einer fein ausgezogenen
Pipette;
55 starke Verdünnung der Zellen und Verteilung
auf 96-Loch-Mikrotiterplatten, sodass sich mit
hoher Wahrscheinlichkeit in jeder Vertiefung
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
der Platte maximal eine Zelle befindet (limiting
dilution);
55 maschinelle Sortierung über Durchfluss-
zytometrie (FACS, fluorescence activated cell
sorting).
Die isolierten Einzelzellen werden dann separat von
den anderen Zellen und meistens unter geringem
Selektionsdruck, z. B. ein Zehntel der beim Amplifi-
zieren verwendeten MTX-Konzentration, vermehrt.
So entsteht ein Zellklon (cell clone), eine Zellpopula-
tion mit genetisch identischen Zellen. Die vermehr-
ten klonalen Zellen werden dann als Master-Zell-
bank (MCB) angelegt (7 Abschn. 12.2.1) und dienen
so als reproduzierbarer Startpunkt für Forschungs-
und Produktionszwecke mit diesen Zellen.
z z Selektion mithilfe von Glutamin-Synthetase
Dies ist eine elegante und häufig angewendete
Methode zur Selektion und Genamplifikation bei
NS0-und CHO-Zelllinien (7 Abschn. 12.2.3). Das
Enzym Glutamin-Synthetase (GS) katalysiert die
Bildung von Glutamin aus Glutaminsäure und
Ammonium. Dies ist für tierische Zellen der einzige
Stoffwechselweg für die Synthese von Glutamin. Wenn
also Glutamin im Zellkulturmedium fehlt, dann ist GS
ein essenzielles Enzym für das Überleben der Zelle.
Einige tierische Zelllinien, z. B. Maus-Myelom-
Zelllinien wie NS0, exprimieren nicht genügend GS,
um ohne Glutamin im Zellkulturmedium überle-
ben zu können. Für diese Zelllinien kann ein trans-
fiziertes GS-Gen als ein selektiver Marker verwendet
werden, weil damit ein Wachstum in glutaminfreien
Medien ermöglicht wird [6].
Andere tierische Zelllinien, wie z. B. CHO-Zell-
linien, besitzen genügend aktive GS, um in gluta-
minfreien Zellkulturmedien überleben zu können.
Für diese Zellen kann ein spezifischer GS-Inhibitor
‒ Methionin-Sulphoximin (MSX) ‒ dem Zellkultur-
medium zugegeben werden. MSX inhibiert die zell-
eigene GS-Aktivität, sodass nur die transfizierten
Zellen mit zusätzlicher GS-Aktivität in glutamin-
freien Medien überleben können [7].
Dieses System hat seine Effizienz und Eignung
bereits im industriellen Maßstab bewiesen. Bei
einem gemeinsamen Einbau des GS-Gens mit dem
Zielgen in die gleiche Expressions-Kassette sind
bereits wenige erfolgreich integrierte Kopien des
499 12
GS-Expressionsvektors im Genom der Wirtszellli-
nie ausreichend für eine hohe Expression des hete-
rologen Produktes. Das bedeutet auch, dass wenig
Aufwand für die Amplifizierung erforderlich ist, um
hohe Produkttiter zu erreichen.
12.2 Zellcharakterisierung
Im Folgenden wird auf die Herstellung von Zellban-
ken und auf deren Charakterisierung eingegangen.
In Forschung und Entwicklung ist es vorteilhaft, dass
ein reproduzierbarer Startpunkt für die verwendete
tierische Zelllinie in Form einer Zellbank etabliert
wird. Für die Produktion von Biopharmazeutika mit
Zellkulturen ist dies ausdrücklich vorgeschrieben.
Die anschließende Charakterisierung der Zellbanken
dient dem Nachweis von Sicherheitsmerkmalen, z.
B. Identität und Abwesenheit von infektiösen Orga-
nismen, sowie der phänotypischen und genetischen
Stabilität der Zellen.
12.2.1 Herstellung von Zellbanken
Zellbanken für tierische Zellen werden meist aus
selektionierten und reklonierten Zelllinien ange-
legt, d. h. ausgehend von einem Zellklon. Man unter-
scheidet verschiedene Arten von Zellbanken: SCBs
(Safety Cell Banks), MCBs (Master Cell Banks), WCBs
(Working Cell Banks) und PPCBs (Post-Production
Cell Banks). Zellklone mit guten Wachstums- und
Produktbildungseigenschaften können als SCBs
angelegt werden. Wenn einer der besten Zellklone als
Kandidat für die MCB ausgewählt wird, dann wird
aus dessen SCB eine Kultivierung begonnen, um die
Zellen zu vermehren, und meist schon nach wenigen
Passagen eine MCB mit etwa 100 bis 300 Vials oder
Ampullen angelegt. Aus einem oder wenigen Vial(s)
der MCB wird jeweils eine WCB mit wiederum meh-
reren Hundert Vials angelegt. Die Produktion von
biopharmazeutischen Wirkstoffen startet jeweils von
einer WCB ausgehend.
Zum Einfrieren werden die herangewachsenen
Zellen meist gepoolt, durch Zentrifugation vom Kul-
turmedium getrennt und die sedimentierten Zellen
in einem Einfriermedium resuspendiert, sodass
die Zelldichte meist bei etwa zehn bis 40 Millionen
 500 R. Kempken et al.
Zellen pro Milliliter liegt. Diesem Einfriermedium
wird etwa 10 % DMSO (Dimethylsulfoxid) als cryo-
protektives Agens zugegeben. DMSO erniedrigt den
Gefrierpunkt, bewirkt eine langsamere Abkühlung
der Zellsuspension, schützt die Zellen vor Schäden
durch Eiskristalle, Dehydrierung, zu hoher Kon-
zentration von Elektrolyten, pH-Änderungen und
Denaturierung der Proteine. Früher wurde zusätz-
lich Serum oder BSA (bovine serum albumin, Rin-
derserumalbumin) zugegeben. Inzwischen ist es bei
vielen Zelllinien möglich, nicht-bovine Substanzen
wie Glycerin, Methylcellulose oder auch konditio-
niertes Medium als Ersatz für Serum oder BSA zu
verwenden. Die Zellen werden dann in spezielle
sterile Einfriergefäße (cryo-vials) oder Ampul-
len pipettiert, meist etwa 1‒2 mL Zellsuspension je
Gefäß, und eingefroren. DMSO ist toxisch für tieri-
sche Zellen, daher müssen die Arbeitsschritte von
der DMSO-Zugabe bis zum Einfriervorgang relativ
rasch ablaufen. Zum Einfrieren können die Einfrier-
gefäße in einem Styroporbehälter bei −70 °C einge-
froren und nach etwa einem Tag in einen Zellbank-
Lagerbehälter überführt werden. Alternativ werden
die Einfriergefäße mit einem Einfriergerät eingefro-
ren, wobei die Cryo-Vials bzw. Ampullen um etwa
1 °C je Minute abgekühlt werden. Wenn die Gefäße
auf etwa −40 °C abgekühlt sind, werden sie in einen
12 Zellbank-Lagerbehälter überführt. Hier können die
Zellen praktisch unbegrenzt in der Gasphase über
flüssigem Stickstoff, d. h. bei ca. −130 °C bis −196 °C,
aufbewahrt werden.
Weiterentwicklungen zu der hier beschriebe-
nen Herstellung von Zellbanken zielen auf eine Ver-
kürzung der Zellanzucht-Zeit vom Auftauen einer
Bank bis zur Einsaat großer Bioreaktoren. Hierbei
wird mehr Zellmasse in die Einfriergefäße verpackt,
sodass nach dem Auftauen der Zellbank die erste
Passage der Zellkultivierung in größeren Volumina
erfolgen kann. Im Erfolgsfall werden dann mehrere
Passagen der Zellanzucht, mit etwa zwei bis vier
Tagen Kulturdauer pro Passage, übersprungen. Zur
Umsetzung der größeren Zellmasse pro Einfrierge-
fäß wird entweder die einzufrierende Zellsuspen-
sion noch höher konzentriert als oben beschrie-
ben, oder man verwendet größere Einfriergefäße
mit mehr Volumen. Hochzelldichte-Zellbanken mit
ca. 100 Mio. Zellen pro mL wurden von mehreren
Gruppen erfolgreich hergestellt [115, 125].
12.2.2 Freigabe und Charakterisierung
von Zellbanken
Master- (MCB) und Working Cell Banks (WCB)
werden umfangreich geprüft und charakterisiert.
Hierzu gehören Prüfungen zur Identität der Zell-
linie, zur Abwesenheit von Kontaminanten wie z.
B. Mikroorganismen oder Viren, zur Kultivierbar-
keit, sogenannte „Auftaukontrollen“, und zur Lang-
zeit-Stabilität (phenotypic stability) z. B. für vier oder
16 Wochen, je nachdem wie lange man die Zellen
nach dem Auftauen eines Zellbank-Gefäßes stabil in
vitro kultivieren möchte. Die Tests und die erwarte-
ten Resultate für eine Freigabe der Zellbank sind in
. Tab. 12.2 aufgeführt.
Wenn eine Zellbank als Ausgangspunkt zur Her-
stellung biopharmazeutischer Produkte verwendet
werden soll, dann wird im Rahmen der Zulassungs-
dokumentation (7 Abschn. 12.7.3) eine genetische
Charakterisierung (genetic stability) der Zellbank
gefordert. Hierbei wird mit molekularbiologischen
Methoden nachgewiesen, ob der Expressionsvektor
korrekt in das Wirtszell-Genom integriert wurde
(mittels Nucleotidsequenzanalyse), ob das RNA-
Transkript die erwartete Größe besitzt (mit Nort-
hern-Blot-Analyse), welche ungefähre Kopienanzahl
der rekombinanten Gene pro Wirtszelle auftreten
(mit Southern-Blot-Analyse) und ob die Anzahl
der Genkopien sowie die Integrationsorte bei unter-
schiedlichem Zellalter stabil bleiben (ebenfalls mit
Southern-Blot-Analyse).
Für die genetische Charakterisierung von
MCBs, die für biopharmazeutische Produktions-
prozesse eingesetzt werden, müssen in der Regel
sogenannte PPCBs angelegt werden. Hierfür wird
am Ende der Produktionsstufe eine kleine Menge
Zellsuspension entnommen, die ggf. noch einige
Male weiter passagiert werden muss, bis eine aus-
reichend hohe Zellvitalität erreicht ist, um erfolg-
reich eine Zellbank anlegen zu können und um
schließlich als PPCB eingefroren zu werden. Die
Einfriermethode ist die gleiche wie für MCBs und
WCBs (7 Abschn. 12.2.1). Mithilfe der PPCB lässt
sich nachweisen, ob die genetische Information
und die Kopienzahl des heterologen Gens sowie
die Integrationsorte im Genom der Wirtszelle am
Ende der Produktionsphase noch die gleichen sind
wie in der MCB.
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
501 12

. Tab. 12.2  Tests für Zellbanken (am Beispiel für MCBs)

Parameter Testergebnisse

Identität Isoenzym-Muster entspricht der Referenz-Zelle (z. B. Hamster oder Maus);

Sicherheitsprüfung
erweiterte Sicherheitsprüfung
Stabilität (phenotypic stability)
zusätzliche Untersuchungen für die
Produktionsverfahren
alternativ: DNA-Fingerprinting
Sterilität (Test gemäß Arzneibuch)
–  keine Mycoplasmen nachweisbar,
–  keine Viren gemäß Adventitious Virus Test (AVA) in vitro
HAP = Hamster-Antikörper-Test oder
MAP = Maus-Antikörper-Test
–  keine Viren gemäß Adventitious Virus Test (AVA) in vivo
–  keine infektiösen Viren gemäß S+L-Test sowie XC-Plaque-Test
–  keine RT(Reverse Transcriptase)-Aktivität
– keine Kontaminanten (außer VLP = virus-like particles) sichtbar gemäß
Elektronenmikroskopie
Zellwachstum, Zellvitalität, Produktbildung
Langzeit-Stabilität: phänotypische Stabilität über längere Zeit, genetische
Stabilität (siehe 7 Abschn. 12.2.2)

12.2.3 Wirtszelllinien CHO-Zellen (Chinese hamster ovary). Diese Zell-

Als Wirtsorganismen für rekombinante Produkte
sollten Säugetierzellen folgende Eigenschaften
haben: schnelles Zellwachstum, Wachstum in preis-
werten und möglichst chemisch definierten Kul-
turmedien, effiziente Aufnahme von Expressions-
vektoren und deren Beibehaltung in Kultur sowie
keine schädlichen oder pathogenen Eigenschaften.
Ein Vorteil der eukaryotischen Zellen besteht darin,
dass sie schon die komplexen RNA- und posttransla-
tionalen Prozessierungssysteme besitzen, die an der
Synthese von Genprodukten in höheren Organismen
beteiligt sind. Beispiele hierfür sind die Glykosylie-
rung, das ist der Kohlenhydratanteil an der Amino-
säurekette des Proteins, der vor allem für die Wirk-
samkeit und Verweilzeit vieler Proteinwirkstoffe in
vivo wichtig ist, und die Phosphorylierung. Für die
industrielle Herstellung biopharmazeutischer Wirk-
stoffe haben sich vor allem die Zelllinien CHO, NS0,
SP2/0 sowie BHK bewährt.
Säugetier-Zelllinien
Alle nachstehend beschriebenen Zelllinien sind
transformierte Zelllinien, die sich permanent teilen
und vermehren.
linie ist im Jahr 1957 durch Biopsie (Gewebeent-
nahme) aus dem Ovar eines Chinesischen Hams-
ters entstanden. Sie wurde als CHO-K1-Zelllinie
etabliert. Aus der CHO-K1-Zelllinie entstand die
CHO-dhfr–-Zelllinie, die durch Mutagenese etabliert
wurde [119]. Bei dieser Zelllinie sind beide Allele
des Gens für das Enzym Dihydrofolatreduktase
(DHFR) inaktiviert. Die CHO-dhfr–-Zelllinie ist bis
heute die wichtigste und am häufigsten verwendete
Wirtszelllinie für die Produktion rekombinanter Pro-
teine. Mit einem Expressionsplasmid, das ein funk-
tionelles DHFR-Gen enthält, und einem Selektions-
medium, das Guanidin, Hypoxanthin und Thymidin
(GHT) enthält, steht ein effizientes Selektionssystem
zur Verfügung (7 Abschn. 12.1.2). Für viele rekombi-
nante Proteine aus CHO-Zellen wurde gezeigt, dass
ihre Glykosylierung derjenigen des humanen Pro-
teins entspricht bzw. sehr nahekommt. CHO-Zellen
haben deshalb eine hohe Akzeptanz für die Produk-
tion rekombinanter Glykoproteine zur Anwendung
am Menschen.
NS0-Zellen und SP2/0-Zellen sind Myelomzellen
der Maus. Myelome sind Krebszellen, die aus B-Lym-
phozyten entstanden sind. B-Lymphozyten vermö-
gen Antikörper in großen Mengen ins Kulturme-
dium auszuscheiden. Maus-Myelom-Zelllinien sind
 502 R. Kempken et al.
daher als „professionelle“ sekretorische Zellen für die
Expression von monoklonalen Antikörpern und
auch von Glykoproteinen gut geeignet. Die Glyko-
sylierung von Produkten aus Maus-Zelllinien unter-
scheidet sich allerdings meist wesentlich von der Gly-
kosylierung von Produkten aus Hamster-Zelllinien.
BHK-Zellen (baby hamster kidney) sind aus den
Nieren eintägiger Goldhamster abgeleitet. Es wurde
ein Zellklon mit kontinuierlicher Proliferationsak-
tivität isoliert und als Zelllinie BHK-21 C13 ange-
legt. Mit BHK-Zellen begann die Kultivierung von
Säuger-Zelllinien im industriellen Maßstab. Seit
1967 wird sie vor allem für die Herstellung von Impf-
stoffen gegen Maul- und Klauenseuche (MKS) ver-
wendet. Die BHK-21-Zelllinie ist auch eine wichtige
Wirtszelle für die Produktion rekombinanter Pro-
teine, denn sie ist effizient transfizierbar und gestat-
tet eine hohe Expression.
HEK-293-Zellen (human embryonic kidney). Die
HEK-293-Zelllinie wurde aus transformierten emb-
ryonalen menschlichen Nierenzellen gewonnen und
als Zellklon etabliert [48, 52]. HEK-293-Zelllinien
werden häufig für die transiente Expression von Gly-
koproteinen verwendet, d. h. der Expressionsvek-
tor wird nicht stabil in die Wirtszelllinie eingebaut,
sondern der Vorgang der Transfektion bzw. Auf-
nahme des Expressionsvektors in die Wirtszelle erfolgt
12 bei jeder Fermentation von Neuem. Auf diese Weise
können sehr schnell und mit geringem Aufwand
kleine bis mittlere Mengen von Proteinen für For-
schungs- und Entwicklungszwecke erzeugt werden.
Diese Vorgehensweise wurde in Bioreaktoren bis zum
100-Liter-Maßstab erfolgreich eingesetzt [45].
COS-Zellen (CV1 Origin SV40). Die COS-Zellli-
nie ist aus der Affennieren-Zelllinie CV1 hervorge-
gangen. Sie besitzt einen SV40-Provirus mit defek-
tem Replikationsursprung (Origin). SV40 (Simian
Virus 40) ist ein DNA-Tumorvirus, das in Hams-
tern Tumoren induziert. Modifizierte SV40-Viren
werden häufig als Vektoren in der Gentechnik ein-
gesetzt. COS-Zellen sind empfindlich für Infektio-
nen mit SV40 und ermöglichen Vermehrungszyk-
len für SV40-Viren mit früher Genexpression und
anschließender Lyse der Zellen. COS-Zellen sind
daher Wirtszellen für SV40-Vektoren, deren frühe
Region ‒ d. h. die Genabschnitte, die nach der Virus-
infektion zuerst abgelesen und exprimiert werden ‒
durch heterologe DNA ersetzt ist [13, 27]. Es handelt
sich also um eine transiente Expression (siehe oben).
HeLa-Zellen. Die HeLa-Zelllinie ist eine mensch-
liche Tumorzelle, die aus einem Cervix-Karzinom, d.
h. aus Gebärmutterhals-Krebszellen, isoliert und als
Zelllinie etabliert wurde. Sie wurde für viele Arbei-
ten in der Tumorforschung verwendet, wofür eine
Vielzahl von Zellstämmen mit speziellen Eigen-
schaften erzeugt wurde. Für die Herstellung rekom-
binanter Proteine hat diese Zelllinie allerdings keine
Bedeutung.
Insekten-Zelllinien
Die Insekten-Zelllinien können ebenso wie Säuger-
Zelllinien in vitro kultiviert werden. Die Kultivie-
rungsbedingungen sind allerdings aufgrund ihrer
Herkunft anders als bei den Säugetier-Zelllinien.
Die optimale Kultivierungstemperatur für Insekten-
Zelllinien liegt bei etwa 28 °C und das pH-Optimum
bei ca. 6,2. Die Kulturmedien sind der Insektenhä-
molymphe nachempfunden. Sie enthalten eine etwa
zehnfach höhere Konzentration der Aminosäuren
gegenüber Medien für Säugerzellkulturen, das Ver-
hältnis der Natrium- und Kalium-Ionen ist nahezu
ausgeglichen, und für die Pufferung der Medien
wird Phosphatpuffer anstelle des Kohlendioxid/
Bicarbonatpuffers verwendet. Ein weit verbreitetes
Medium für Insektenzellen ist das Grace-Medium
(7 Abschn. 12.3).
Häufig verwendete Insekten-Zelllinien sind die
Sf9-Zellen und die Sf21-Zellen. Beide Zelllinien
wurden aus Ovarien des Puppenstadiums des Insek-
tes Spodoptera frugiperda gewonnen und als Zellklon
etabliert.
Insekten-Zelllinien werden am häufigsten in Ver-
bindung mit dem Baculovirus-Expressionssystem
zur Gewinnung von rekombinanten Proteinen ver-
wendet. Dabei werden zunächst die Insektenzellen
als Suspensionskulturen in Bioreaktoren vermehrt.
Die Produktion des rekombinanten Proteins wird
erst dadurch begonnen, dass der Insektenzellkultur
noch während der logarithmischen Wachstumsphase
der Zellen ein rekombinanter Baculovirus zugege-
ben wird in einer Konzentration von etwa 1‒5 mg
Virus pro Liter Insektenzellsuspension. Im Virus-
Genom wurde das Gen für das gewünschte Protein
integriert. Die Viren befallen die Insektenzellen und
lassen diese eine große Menge des rekombinanten
Proteins produzieren. Es handelt sich also um eine
transiente Expression. Viele der posttranslationalen
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
Modifizierungsmechanismen für Glykoproteine aus
Säugetierzellen gibt es auch bei den Insektenzellen,
sodass die Produkte aus Insektenzellen den nativen
humanen Proteinen ähnlich sind [109], im Detail
aber durchaus Unterschiede aufweisen [60]. Die
immer wiederkehrende, ebenfalls transiente Erzeu-
gung der rekombinanten Viren und deren Lagerung
bedeuten einen erheblichen Aufwand für industrielle
Anwendungen. Beides kann zu einer höheren Hete-
rogenität der Herstellverfahren mit Insektenzellen
führen.
Die rekombinanten Viren entstehen durch
Einbau eines Vektors, der das Zielgen enthält, in die
lineare DNA des Baculovirus-Genoms, die anschlie-
ßende Transfektion von Insektenzellen (Sf9, Sf21
u. Ä.) mit diesem Genkonstrukt und die Ernte der
rekombinanten Baculoviren aus den Zellen.
Design neuer Wirtszelllinien
Es gibt nach wie vor eine starke Tendenz, auf den
bisher etablierten Wirtszelllinien zu beharren, denn
aus den letzten Jahrzehnten liegen viele Kenntnisse
und Erfahrungen vor, dass diese Zelllinien keine
besonderen Risiken für Mensch, Umwelt oder Pro-
dukte bergen. Dennoch wird daran gearbeitet, neue
Wirtszelllinien und modifizierte Expressionssys-
teme zu entwickeln. Diese reichen von ganz neuen,
nicht aus Tumorgewebe stammenden Zelllinien bis
zu verbesserten Möglichkeiten der Transformation
und Integration von Expressionsvektoren in tieri-
schen Zelllinien.
Neue permanente Zelllinien wurden aus anderen
Tierspezies als Hamster oder Maus gewonnen und
für die Entwicklung biopharmazeutischer Wirk-
stoffe, z. B. für Impfstoffe und für therapeutische
Proteine einschließlich Antikörper und Genthe-
rapie-Produkte, eingesetzt. Ein erfolgreiches Bei-
spiel hierfür ist die sogenannte PER.C6®-Zelllinie.
Sie wurde von einer einzelnen menschlichen Reti-
nazelle abgeleitet und mithilfe der rekombinanten
DNA-Technologie immortalisiert [63]. Der gesamte
Weg der Entstehung dieser Zelllinie wurde vom Her-
steller umfassend dokumentiert, sodass eine Nach-
vollziehbarkeit der Herkunft, Entstehung, Identität
und Sicherheitsmerkmale dieser Zelllinie gegeben
ist. PER.C6® kann, wie die oben genannten perma-
nenten Zelllinien aus Hamster und Maus, als Einzel-
zellen in Suspension unter serumfreien Bedingungen
503 12
kultiviert und für industrielle Zwecke verwendet
werden.
Auch für die Herstellung human- und tiermedi-
zinischer Impfstoffe werden zunehmend neue tieri-
sche Zelllinien eingesetzt. Diese sollen die traditio-
nelle Herstellweise mithilfe befruchteter Hühnereier
möglichst ablösen. Bisher werden viele Millionen von
Hühnereiern, die von hygienisch streng überwachten
Tieren gelegt werden, einzeln mit dem Erreger, z. B.
einem Grippevirus, beimpft. Für viele Anwendungen
liefert jedes Ei am Ende nur eine einzige Impfdosis.
Die Herstellung mithilfe tierischer Zellkulturen ver-
kürzt die Herstelldauer um bis zu 50 % und ermög-
licht kürzere Reaktionszeiten auf neue Varianten von
Krankheitserregern [10, 42, 87].
Bei der Verwendung der tierischen Zelllinien als
Hersteller-Organismus für Biopharmazeutika wird
ein optimales Zusammenwirken von Wirtszellen
und Expressionsvektoren angestrebt. Ein vorrangi-
ges Ziel hierbei ist der gezielte, ortsspezifische Einbau
der rekombinanten DNA im Genom der Wirtszelle
(targeted integration). Hierbei wird der Expressions-
vektor an definierten Stellen im Genom eingebaut
(7 Abschn. 12.1.2). Diese Stellen sollen sich für eine
stabile Integration fremder DNA als geeignet erwie-
sen haben und außerdem leicht und häufig abgelesen
werden können. Gegenüber dem zufälligen Einbau
(random integration) der DNA verspricht ein orts-
spezifischer Einbau höhere und verlässlichere Pro-
duktausbeuten sowie stabilere und einheitlichere
Produktqualitäten [3, 17, 83].
Die gezielte Einfügung oder Entfernung von
Genen durch Mutation (indel: induced targeted
insertion/deletion mutation) ist möglich durch maß-
geschneiderte, künstlich hergestellte Endonucleasen
mit bestimmbarer Erkennungssequenz, z. B. Zink-
finger-Nucleasen (ZFNs), Transcription Activator-
like Effector Nucleasen (TALENs) und das CRISPR/
Cas-System (CRISPR: clustered regularly interspa-
ced short palindromic repeats, Cas: CRISPR-asso-
ciated endonuclease) [18]. Endonucleasen sind Res-
triktionsenzyme, die DNA an bestimmten Positionen
erkennen und sie dort durch Spaltung einer Phos-
phodiesterbindung schneiden können. Zinkfinger-
Nukleasen enthalten eine Zinkfinger-Domäne, die an
DNA bindet, und eine Nuklease-Domäne, die DNA
schneidet. Die Zinkfingerdomäne kann so gebaut
werden, dass sie eine bestimmte DNA-Sequenz
erkennt. Infolgedessen wird mit ZFN ein komplexes
 504 R. Kempken et al.
Genom an einer ganz bestimmten Stelle geschnit-
ten und somit ein zielgerichteter Einbau von fremder
DNA ermöglicht. TALENs sind Fusionsproteine aus
einer DNA-bindenden TAL-effector-Domäne und
einer Endonuclease. Die TAL-effector-Domäne
ermöglicht eine sequenzspezifische Bindung, die
Endonuclease das Schneiden der DNA. Für die Ver-
wendung in tierischen Zellen sind einige TAL-effec-
tor-Domänen nicht spezifisch genug, sodass Doppel-
strangbrüche an anderen DNA-Sequenzen entstehen
können. Beim CRISPR/Cas-System wird durch Cas
sequenzspezifisch doppelsträngige komplementäre
DNA geschnitten, sodass gezielte Deletionen oder
Insertionen erzeugt werden können.
Anstelle der gezielten Integration rekombinan-
ter DNA in natürliche Chromosomen der Wirtszel-
len ist auch die Verwendung künstlicher Chromoso-
men vorstellbar. Diese Chromosomen könnten ohne
Selektion stabil in den Wirtszellen repliziert und die
dort eingebauten Gene regulierbar transkribiert
werden. Die künstlichen Chromosomen müssen
Centromere besitzen, sodass sie bei jeder Zellteilung
stabil mitotisch an die Tochterzellen weitergegeben
werden und damit autonom in den Zellen existie-
ren. Ihre Enden sollten mit Telomeren versehen sein,
damit sie von den Wirtszellen nicht als DNA-Bruch-
stücke angesehen und infolgedessen abgebaut oder
12 an irgendeiner Stelle im eigenen Genom eingebaut
werden. Ein großer Vorteil der künstlichen Chro-
mosomen ist ihre enorme Kapazität. Es können voll-
ständige Gene oder Gendomänen in das künstliche
Chromosom integriert werden, d. h. die codieren-
den Bereiche des Gens (Exons) sowie die ggf. regu-
latorisch wirksamen Bereiche dazwischen (Introns).
Dies ermöglicht eine kontrollierte Genexpression.
Prinzipielle Herausforderungen bei der Entwick-
lung künstlicher Chromosomen sind die schwierige
Handhabung der sehr langen DNA, die repetitiven
Sequenzen der Centromere und der Telomere und
die Einschleusung der Chromosomen in die tieri-
schen Zellen [76].
Alternative Wirtszellen und Organismen
In Ergänzung, teilweise auch als Konkurrenz, zur
klassischen Produktion aus der Kultur von Säuge-
tierzellen können Wirkstoffe auch aus alternativen
Quellen bzw. durch alternative Technologien erzeugt
werden, wie z. B. aus Prokaryoten (Bakterien), Hefen,
transgenen Pflanzen, Pflanzenzellkulturen oder
transgenen Tieren.
Mithilfe von Bakterien können rekombinante
Wirkstoffe gewonnen werden, falls die Wirkstoffe
relativ klein und einfach aufgebaut sind und keine
posttranslationalen Prozessierungen, wie z. B. Gly-
kosylierung, erforderlich sind. Beispielsweise wird
rekombinantes Insulin mit einem Molekulargewicht
von 11,5 kDa als Zink-Komplex, bestehend aus zwei
Peptidketten mit 30 bzw. 20 Aminosäuren, drei Disul-
fidbrücken, aber ohne Glykosylierung aus Bakterien
und aus Hefen gewonnen. Interferon- α, Interfe-
ron- β, Interferon- γ und der humane Wachstumsfak-
tor sind weitere bekannte rekombinante Wirkstoffe
aus Bakterien, wobei meist Escherichia coli (kurz E.
coli) als Produktionsorganismus eingesetzt wird.
Hefen als Produktionsorganismen bieten eine
weitere Alternative zu tierischen Zellen und Bak-
terien. Hefen stellen, ähnlich wie Bakterien, relativ
geringe Ansprüche an die Kultivierung und die
Nährstoffe. Sie sind aber als eukaryotische Orga-
nismen prinzipiell befähigt, Proteine zu glykosy-
lieren. Die Hefeart Pichia pastoris wird bevorzugt
als Wirtszelle für die Herstellung rekombinanter
Proteine eingesetzt aufgrund ihrer Befähigung,
die erzeugten rekombinanten Proteine zu sezer-
nieren, d. h. in das Kulturmedium auszuscheiden.
Für Pichia, Hansenula, Saccharomyces und andere
Hefegattungen muss jedoch noch ein entscheiden-
der Nachteil überwunden werden: Hefen glykosy-
lieren Proteine mit extrem vielen mannosereichen
Glykanen (Hyperglykosylierung). Diese Produkte
entsprechen daher nicht den „nativen“ menschli-
chen Proteinen und würden beim Menschen mögli-
cherweise eine Immunantwort hervorrufen. Erheb-
liche Änderungen des Glykosylierungsstoffwechsels
sind erforderlich, um Glykoproteine aus Hefen mit
vergleichbarer Glykanstruktur wie beim Menschen
herzustellen.
Transgene Pflanzen bieten prinzipiell eine kos-
tengünstige und leicht skalierbare Quelle zur Herstel-
lung rekombinanter Produkte [117]. Bisher werden
folgende Quellen betrachtet: die Blätter von Tabak-
pflanze, Sojabohne und Salat; die Samen von Reis,
Weizen, Mais, Erbse und Sojabohne; die Früchte
von Tomaten, Bananen und Raps. Es gibt allerdings
noch erhebliche Schwierigkeiten zu überwinden, bis
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
Produkte aus transgenen Pflanzen als Alternative zu
entsprechenden Produkten aus Zellkulturen kon-
kurrenzfähig sind. Dies sind unter anderem Unter-
schiede bei den posttranslationalen Modifikationen
von Glykoproteinen, z. B. in den Glykanstrukturen,
gegenüber den Glykoproteinen aus tierischer Quelle,
die unzureichende oder unvollständige Sekretion in
die Speicherorgane, der Abbau oder Teilverdau der
gebildeten Produkte noch in den Pflanzen und die
Variabilitäten aufgrund schwankender Umweltein-
flüsse, insbesondere Bodenbeschaffenheit, Feuch-
tigkeit, Klima, Jahreszeiten, Einfluss von Pflanzen-
krankheiten und -schädlingen.
Prinzipiell können biotechnische Produkte auch
mit Pflanzenzellkulturen hergestellt werden. Aus
Pflanzen im Feldanbau oder z. B. in Gewächshäu-
sern werden natürliche Wirkstoffe gewonnen. Durch
Züchtung, Infektion oder gentechnische Eingriffe
(transiente oder stabile Expression) können art-
fremde Produkte in Pflanzengeweben hergestellt
werden, z. B. in den Blättern von Tabakpflanzen. Dies
wird bereits für Impfstoffe und für Antikörper durch-
geführt. Therapeutische Proteine aus Pflanzen zur
Anwendung am Menschen werden am ehesten mit
Hilfe von Pflanzenzellkulturen produziert, aufgrund
der Kompatibilität zu den Methoden und Systemen
für tierische Zellkulturen sowie zu den bestehenden
behördlichen Rahmenbedingungen (regulatory fra-
mework) Die industrielle Produktion rekombinan-
ter Proteine in Pflanzenzell-Bioreaktoren wird insbe-
sondere mit Disposable Bioreaktoren durchgeführt.
Hierfür werden beispielsweise Zellen von Karotten,
Tabakpflanzen, Wasserlinsen oder Moosen verwen-
det [92].
Transgene Tiere sind Tiere, deren Genom in der
frühen Embryonalentwicklung verändert wurde,
indem entweder ein heterologes Gen hinzugefügt
(additiver Gentransfer) oder ausgeschaltet wurde,
z. B. bei Knock-out-Mäusen. Transgene Tiere mit
additivem Gentransfer sind prinzipiell eine effizi-
ente Quelle zur Herstellung rekombinanter Produkte
[127]. Das gewünschte Produkt, z. B. ein monoklo-
naler Antikörper für therapeutische oder diagnosti-
sche Zwecke, wird in der Milch der transgenen Tiere
ausgeschieden. Diese Technik wurde bei den Labor-
tierarten Maus, Ratte, Kaninchen und bei den land-
wirtschaftlichen Nutztieren Schaf, Ziege und Rind
erfolgreich angewendet.
505 12
Transgene Tiere, die ein heterologes Protein in
ihrer Milch herstellen, werden erzeugt durch Mik-
roinjektion des rekombinanten Genkonstrukts
(Transgen) in befruchtete, reife Oozyten. Das Trans-
gen ist ein Genabschnitt mit der genetischen Infor-
mation für das gewünschte Protein, gekoppelt mit
einem Milch-Promotor-Gen, welches die Bildung
und Ausschleusung des Proteins in die Milchdrü-
sen vermittelt. Der einzellige transgene Embryo wird
dann in ein weibliches Empfänger-Tier (recipient
female) implantiert und von dieser „Leihmutter“ bis
zur Geburt ausgetragen. Wenn das Transgen in das
Genom des Embryos integriert wurde, was bei etwa
5‒10 % der mikroinjizierten Oozyten geschieht, dann
wird es zu einem dominant vererbten Gen, das von
dem ursprünglichen transgenen Tier an seine Nach-
kommenschaft weitergegeben wird. Infolgedessen
produzieren das herangewachsene transgene Tier
und seine weibliche Nachkommenschaft, welche
das Transgen besitzen, das rekombinante Protein in
Mengen von mehreren Gramm pro Liter Milch.
Ziegen und Kühe sind aus folgenden Gründen
besonders effiziente transgene „Produktionssysteme“:
55 hoher Proteingehalt ihrer Milch;
55 große und konstante Milchproduktion;
55 gut etablierte Techniken zur Milchgewinnung;
55 einfache Tierhaltung in Herden.
Nachteile der transgenen Tiere sind:
55 die lange „Entwicklungszeit“ von mehreren
Jahren von der Mikroinjektion bis zur fertigen
Etablierung einer gesunden Herde reifer, d. h.
Muttermilch mit Produkt produzierender,
transgener Tiere;
55 regulatorische Herausforderungen zum
gesamten Konzept, wenn cGMP-Anforderungen
(7 Abschn. 12.7.3) aus der Zellkultivierung in
Bioreaktoren in analoger Weise für transgene
Tiere gelten und angewendet werden sollen.
Das Potenzial transgener Pflanzen und Tiere zur
Senkung der Herstellkosten rekombinanter Pro-
dukte scheint begrenzt zu sein. Nach Erzeugung des
Proteins bleiben die Schritte für die weitere Prozes-
sierung des Rohproduktes, nämlich die proteinche-
mische Reinigung, Formulierung, Abfüllung, Verpa-
ckung und die hiermit verbundenen Aufwendungen
und Kosten bestehen.
 506 R. Kempken et al.
Sehr komplexe Wirkstoffe können ex vivo nur
mithilfe tierischer Zellkulturen hergestellt werden.
Bekannte Beispiele sind das Glykoprotein Faktor
VIII der Blutgerinnung mit 2332 Aminosäuren
und einer relativ instabilen Konsistenz [120] sowie
rekombinantes t-PA (tissue Plasminogen Activator)
mit 527 Aminosäuren, 17 Disulfidbrücken und drei
Bindungsstellen für Oligosaccharidketten [123]. Eine
nicht glykosylierte Variante des human-identischen
t-PA wird in E. coli hergestellt [107].
Bei Antikörpern besteht die Möglichkeit, Anti-
körper-Fragmente mit den variablen Bereichen der
schweren Kette VH und der leichten Kette VL, also
den kleinsten Antigen-bindenden Einheiten der
Antikörper, in Bakterien zu exprimieren. Dies ist
interessant für Anwendungen, für die nur die Anti-
gen-bindende Aktivität benötigt wird. Dann kann
nämlich auf den Fc(fragment crystallizable)-Teil des
Antikörpers verzichtet werden.
Durch proteolytischen Verdau von Antikörpern
mit dem Enzym Papain sind Fab-Fragmente herstell-
bar (Fab steht für fragment antigen binding). Ein Fab-
Fragment besteht aus einer vollständigen leichten
Kette (VL und CL) sowie einer VH- und einer CH1-
Domäne der schweren Kette des Antikörpers. Noch
kleinere Fragmente mit Antigen-bindenden Eigen-
schaften können mithilfe der Gentechnik rekombi-
12 nant erzeugt werden, z. B. das scFv-Fragment (single
chain fragment variable) mit einem Molekularge-
wicht von etwa 30‒40 kDa. Beim scFv-Fragment sind
eine VH-Domäne und eine VL-Domäne mittels Pep-
tid-Linker miteinander kovalent verbunden [55, 56].
Die kleinstmöglichen Einheiten mit vollständi-
ger variabler Domäne sind die sogenannten Nanobo-
dies, auch single domain antibodies oder VHH anti-
bodies genannt. VHH steht für variable domain of
the heavy-chains of heavy-chain-only antibodies. Die
variable Domäne der schweren Kette wird also als
Antigen-bindende Einheit verwendet. Mit einem
Molekulargewicht von etwa 12‒15 kDa haben Nano-
bodies nur ungefähr ein Zehntel der Größe vollstän-
diger IgG-Antikörper (150‒160 kDa).
Nanobodies eröffnen die Chance, Vorteile voll-
ständiger Antikörper, wie die hohe Spezifität und
Affinität für das Ziel-Antigen mit wesentlichen
Eigenschaften kleiner Pharmawirkstoffe zu kombi-
nieren. Im Einzelnen sind das die größere struktu-
relle Flexibilität, das Potenzial, durch die geringere
Größe weiter in Gewebe vordringen zu können, die
relativ hohe Stabilität, die einfachere Administration
in Patienten sowie die weniger komplexe Herstell-
weise [51].
Es gibt jedoch zahlreiche Anwendungen, die
vollständige Antikörper benötigen, vor allem wenn
infolge der Antigenbindung an der Domäne VH und
VL eine durch den Fc-Teil des Antikörpers vermit-
telte Effektorfunktion ausgelöst wird. Prominentes
Beispiel ist die Antikörper-abhängige zelluläre Zyto-
toxizität (antibody-dependent cellular cytotoxicity,
ADCC), die eine wichtige Rolle bei der Vernichtung
von zellulären Infektionserregern, Virus-infizierten
Zellen und Tumorzellen einnimmt [111].
Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs, Anti-
body Drug Conjugates) sind prinzipiell geeignet, die
Wirksamkeit am spezifischen Bindungsort zu stei-
gern. Ein ADC ist ein monoklonaler Antikörper,
der über einen chemischen Linker an ein zytoto-
xisches Molekül gekoppelt wurde. Der Antikörper
bindet spezifisch an eine Zielzelle, beispielsweise eine
Krebszelle, das ADC wird durch Endozytose ins Zell-
innere aufgenommen und dort das Toxin abgespal-
ten. Durch die Freisetzung wird das Toxin wirksam
und verursacht das Absterben der Zelle [94]. Dieser
therapeutische Ansatz verspricht eine bessere Kont-
rolle der Pharmakokinetik durch exakte Anlieferung
des Toxins an die Zielzelle bei minimiertem Kontakt
zu gesunden Zellen.
12.3 Die Umgebung von Zellen in
Kultur
Tierzellen in Kultur sind von vielen äußeren Fak-
toren abhängig, die wichtig sind für die Erhaltung
ihrer Lebensfunktionen, ihrer spezifischen geneti-
schen, morphologischen und physiologischen Eigen-
schaften sowie für die Expression von eigenen und
ggf. transgenen Substanzen. Die wichtigsten dieser
Faktoren sind: Temperatur, osmotischer Druck,
pH-Wert, Nähr- und Puffersalze, essenzielle Nähr-
stoffe und Stoffwechsel-Zwischenprodukte, wie z. B.
Kohlenhydrate, Aminosäuren, Peptide, Proteine,
Fette, Fettsäuren, Coenzyme, Nucleoside, Nucleo-
tide, gelöste Gase, Hormone, Wachstumsfaktoren,
Spurenelemente sowie ggf. eine Matrix, auf der die
Zellen wachsen.
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
Die meisten dieser Faktoren werden in den
Eigenschaften des Zellkulturmediums festgelegt.
Das Zellkulturmedium hat daher eine entscheidende
Bedeutung für den Zellkulturprozess.
12.3.1 Zellkulturmedien
Ein gutes Kulturmedium (Nährmedium, Züchtungs-
medium) soll die wesentlichen Rohstoffe und die
Umgebungsbedingungen für die kultivierten Zellen
in einer Art zur Verfügung stellen, die den natür-
lichen Zellen im Körperverband möglichst ähnlich
sind. Die Verhältnisse in vivo können von Zelle zu
Zelle sehr verschieden sein und sich auch zeitab-
hängig verändern, z. B. beim pH-Wert oder beim
Hormonspiegel in der Zellumgebung. Verständli-
cherweise gibt es daher kein universelles oder „gene-
risches“ Kulturmedium für Säugetierzellen, sondern
eine Vielfalt von Kulturmedien.
Das Medium muss, in Verbindung mit Zugaben
(feeds) während der Kultivierung, trotz seiner kons-
tanten und möglichst definierten Zusammensetzung
eine ausreichende Anpassungs- bzw. Pufferungsfä-
higkeit haben gegenüber Änderungen infolge der
andauernden Kultivierung der Zellen, z. B. infolge
von Vermehrung, Induktion, Alterung und Differen-
zierung der Zellen sowie Expression und Sezernie-
rung von Metaboliten und Produkten.
Bei der Herstellung rekombinanter Produkte kann
es nützlich sein, für die Anzuchtstufen ein gutes Wachs-
tumsmedium zu wählen, aber in der Produktionsstufe
ein Medium mit anderen Eigenschaften einzusetzen,
das die Zellen z. B. durch osmotischen Stress, Tempera-
tur- oder pH-Wechsel oder durch die Zugabe bestimm-
ter Substanzen zu vermehrter Produktbildung anregt.
Dabei kann durchaus akzeptiert werden, dass die
Zellen unter diesen Bedingungen an Vitalität verlieren
und nicht lange kultivierbar oder subkultivierbar sind.
Serumhaltige Zellkulturmedien
Die ersten Kulturmedien ähnelten noch weitgehend
dem Blutserum. Ab Ende der 1950er-Jahre gab es
etliche Basalmedien; die bekanntesten davon sind:
55 MEM = Minimum Essential Medium [25],
55 DMEM = Dulbeccos modifiziertes Eagle-
Medium [24],
507 12
55 Glasgow-MEM [78],
55 Grace-Medium [47],
55 NCTC-135 [32],
55 BME = Basal Medium Eagle [26],
55 Ham’s F-12 Nutrient Mixture [49],
55 RPMI 1640 [82],
55 IMDM = Iscoves modifiziertes Dulbecco-
Medium [59].
In . Tab. 12.3 ist die Zusammensetzung des Basalme-
diums DMEM/Ham’s F12 (1:1) wiedergegeben, das
für die Kultivierung einer ganzen Reihe von Tierzel-
len erfolgreich eingesetzt wurde. Diese verschiedenen
Basalmedien enthalten bereits etwa 30 bis 80 Kom-
ponenten, vor allem anorganische Salze, Aminosäu-
ren, Peptide, Vitamine, Coenzyme, Fettsäuren, eine
Zucker- und Eisenquelle, Spurenelemente, Puffer-
substanzen und ggf. weitere Komponenten.
Die unterschiedlichen Basalmedien benötigten
allerdings noch einen hohen Anteil von ca. 10 bis
20 % an Blutserum, um eine gute Zellkultivierung
in vitro zu ermöglichen. Hierfür können folgende
Arten von Seren eingesetzt werden: fötales Kälber-
serum (fetal calf serum = FCS), Serum aus neugebo-
renen Kälbern (newborn calf serum = NCS, stammt
von Tieren bis zu einem Alter von wenigen Wochen),
Rinderserum, Pferdeserum und Serum von anderen
Tierarten (Ziegen, Hühner, Schweine, Lämmer,
Kaninchen). Alle enthalten wertvolle Wachstumsfak-
toren für Zellen in Kultur. Aufgrund der biologischen
Variabilität der Spendertiere, ihrer Ursprungs- und
Ernährungsbedingungen, ihrer Gesundheits- und
Umwelteinflüsse ist es nahezu unmöglich, eine stan-
dardisierte Qualität und Zusammensetzung von
Seren zu erhalten. Daher werden Seren für Zellkul-
turmedien meist von ausgewählten Herden gesun-
der Spendertiere und aus wenigen geographischen
Regionen gewonnen. Dies ist sowohl für eine gleich
bleibende Qualität der Serum-Chargen als auch als
Vorsichtsmaßnahme gegenüber potenziell in tieri-
schen Komponenten enthaltenen Krankheitserre-
gern wie z. B. BSE (bovine spongiforme encephalo-
pathie) und anderen vorteilhaft. Anwender, die auf
eine sehr gute Vergleichbarkeit der Zellkultur-Er-
gebnisse mit serumhaltiger Kultivierung angewie-
sen sind, können sich große Mengen von Serum aus
einer Charge reservieren lassen. Es ist auch möglich,
sich vor einem Chargen-Wechsel vorab Muster von
 508 R. Kempken et al.

. Tab. 12.3  Zusammensetzung des Mediums . Tab. 12.3  Fortsetzung

DMEM/F12 (1:1)
Bestandteil Konzentration [mg/L]
Bestandteil Konzentration [mg/L]
D-Ca-Pantothenat 2,24
Aminosäuren Cholinchlorid 8,98
L-Alanin 4,45 Folsäure 2,65
L-Arginin · HCl 147,5 i-Inositol 12,6
L-Asparagin · H2O 7,5 Niacinamid 2,02
L-Asparaginsäure 6,65 Pyridoxal · HCl 2,031
L-Cystein · HCl · H2O 17,56 Riboflavin 0,219
L-Cystin · 2HCl 31,29 Thiamin · HCl 2,17
L-Glutaminsäure 7,35 Thymidin 0,365
L-Glutamin 365,0 Vitamin B12 0,68
Glycin 18,75 Weitere Bestandteile
L-Histidin · HCl · H2O 31,48 D-Glucose 3151,0
L-Isoleucin 54,47 Na-Hypoxanthin 2,39
L-Leucin 59,05 Linolsäure 0,042
L-Lysin · HCl 91,25 DL-68-Thiocitinsäure 0,105
L-Methionin 17,24 Phenolrot 8,1
L-Phenylalanin 35,48 Na-Putrescin · H2O 0,081
L-Prolin 17,25 Natriumpyruvat 55,0
L-Serin 26,25
L-Threonin 53,45
12 L-Tryptophan 9,02 neuen Serum-Chargen für vergleichende Prüfungen
L-Tyrosin · 2Na · 2H2O 55,79 mit Zellkulturen liefern zu lassen. Für viele Anwen-
dungen ist es üblich, jede Serum-Charge vor Einsatz
L-Valin 52,85
auf ihre Eignung zu testen.
Salze
Auf Verlangen der biopharmazeutischen Indust-
CaCl2 116,6 rie und der Gesundheitsbehörden führen die Serum-
CuSO4 · 5H2O 0,0013 Hersteller eine lückenlose Dokumentation über den
Fe(NO3)3 · 9H2O 0,05 Ursprung des Serums (serum audit trail), mit vete-
FeSO4 · 7H2O 0,417 rinärärztlichem Zertifikat über die Tiergesundheit
und den Ursprung des Rohserums, mit den Schrit-
KCl 311,8
ten der Prozessierung des Rohserums bis zum End-
MgCl2 28,64
produkt, der Vergabe der Chargennummer und der
MgSO4 48,84 Freigabe der Chargen.
NaCl 6995,5 Die Gewinnung von FCS beginnt mit der Ent-
NaH2PO4 · H2O 62,5 nahme des Blutes durch Herzpunktion. Man lässt das
Blut gerinnen und trennt dann durch Zentrifugation
Na2HPO4 71,02
das Blutplasma vom Blutserum. Die Blutserum-Por-
ZnSO4 · 7H2O 0,432
tionen werden zu einer Charge vereinigt, sterilfilt-
Vitamine riert und in kleinen Portionen, z. B. 500-mL-Gebin-
Biotin 0,0035 den, abgefüllt und tiefgefroren.
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
Für besondere Anforderungen kann das Serum
weiterbehandelt werden. Beispielsweise kann Serum
mithilfe von Membranen mit Ausschlussgrößen von
ca. 10‒50 kDa gegen Salzlösungen dialysiert werden,
um niedermolekulare Substanzen aus dem Serum zu
entfernen. Wenn Serum von jungen oder erwachse-
nen Tieren für die Produktion von Antikörpern ein-
gesetzt wird, kann die Anwesenheit von Immunglo-
bulinen, vor allem IgG, im Serum Probleme bei der
Aufarbeitung hervorrufen. Mithilfe chromatographi-
scher Verfahren können Immunglobuline aus dem
Serum entfernt werden.
Zur Inaktivierung von möglichen Krankheits-
erregern, die als Verunreinigungen (Kontaminanten)
im Serum enthalten sein könnten, werden viele Seren
zusätzlich zur Sterilfiltration mit Hitze oder Bestrah-
lung behandelt. Eine Hitze-Inaktivierung wird meist
für ca. 30 Minuten bei über 50 °C durchgeführt. Zur
Inaktivierung potenziell vorhandener Viren ist vor
allem die Gammabestrahlung des Serums geeignet.
Mit Virus-Spike-Experimenten wurde nachgewie-
sen, dass eine Dosis von etwa 25 bis 35 kGy für eine
verlässliche Inaktivierung einer großen Vielfalt von
Viren um bis zu sechs Log-Stufen ausreicht [99].
Die komplexe und variable Zusammenset-
zung, das Restrisiko von Krankheitserregern, die
begrenzte Verfügbarkeit und der hohe Preis führten
zu Anstrengungen, Serum zu ersetzen. Eine einfa-
che, aber zeitraubende und nicht immer ausreichend
reproduzierbare Möglichkeit war die Adaptation der
kultivierten Zelltypen an serumreduzierte Medien.
Hierdurch konnten viele Zellen durch schrittweise
Ausdünnung von Serum in Medien mit 2 % bis zu
0,1 % Serumgehalt stabil kultiviert werden.
509 12
Serumfreie Zellkulturmedien
Eine wesentliche Weiterentwicklung wurde erst
möglich durch die Verwendung von Serum-Ersatz-
stoffen wie Rinder-Transferrin, Rinderserumalbu-
min (bovine serum albumin, BSA), Rinder-Insulin
und Rinder-Lipoproteinen. Transferrin dient als
Transportprotein für Eisen [1]. Serumalbumin ist ein
Transportprotein für Fettsäuren, Lipide, Peptide, Ste-
roide, Hormone und Spurenelemente [126]. Zusätz-
lich wirkt es auf die Zellen durch Bindung von Deter-
genzien und Endotoxinen. Insulin stimuliert die
Glucoseaufnahme, die Fettsäure-und DNA-Syn-
these. Insulin und IGF-1 (insulin-like growth factor
1) binden an IGF-1-Rezeptoren auf der Zelloberflä-
che und stimulieren die DNA-Synthese [103]. Lipo-
proteine dienen als Transportproteine für Phospholi-
pide und Cholesterin [112] und erfüllen eine Vielzahl
von regulatorischen Funktionen [88].
Durch die Substitution des Serumanteils im Zell-
kulturmedium durch definierte Substanzen konnte
der Proteinanteil von etwa 20 g/L auf etwa 0,5 g/L
reduziert werden (. Tab. 12.4). Die Entwicklung der
serumfreien Medien in den 1980er-Jahren wurde
dann in den 1990er-Jahren erfolgreich in Forschung
und Industrie für die Kultivierung von Säugetierzel-
len angewendet.
Es gelang sogar, das gebrauchte Medium von
Säugerzellkulturen nach Analyse und Supplemen-
tierung der verbrauchten Nährstoffe zu rezyklieren,
d. h. für dieselbe Bioreaktor-Kultivierung wiederzu-
verwenden [69]. Dies wurde zum Recycling wert-
voller Serum-Substitute und Medienkomponen-
ten und damit zur Reduktion der Kosten für das
Medium angestrebt. Aufgrund der im Folgenden

. Tab. 12.4  Entwicklung von Zellkulturmedien für Suspensionskulturen

Zeitraum Produkt-Konzentration Typische Bestandteile dieser Proteingehalt der Medien

Zellkulturmedien

1985 bis 1990 20 bis 200 mg/L serumhaltige Medien 20 g/L

1990 bis 1995 50 bis 500 mg/L Proteine aus tierischer Quelle 0,5 g/L
1995 bis 2000 300 bis 1000 mg/L Proteinhydrolysate 0,01 g/L
2000 bis 2005 1000 bis 5000 mg/L chemisch definierte Substanzen <0,01 g/L
nach 2005 1000 bis >10.000 mg/L keine oder gut charakterisierte <0,01 g/L
Proteinhydrolysate
 510 R. Kempken et al.
beschriebenen Weiterentwicklung der Medien sind
solche Maßnahmen nicht mehr nötig. Das Medium-
recycling-Konzept bietet jedoch eine gute Möglich-
keit, die Effekte von Zellwachstumsfaktoren, Zellrei-
fungsfaktoren und Stoffwechselprodukten, die von
den Zellen selbst gebildet und in das Kulturmedium
abgegeben werden, zu untersuchen [15].
Chemisch definierte Zellkulturmedien
Der entscheidende Schritt auf dem Weg zu Medien,
die chemisch definiert sind und keine direkt aus tie-
rischer Quelle enthaltenen Substanzen mehr auf-
weisen, wurde durch folgende Weiterentwicklun-
gen erreicht:
55 Substitution von Transferrin durch Eisensalze
oder Eisenkomplexe;
55 Substitution von Insulin durch rekombinant-
humanes Insulin oder IGF-1;
55 Substitution der Lipoproteine durch chemisch
definierte Lipidkonzentrate;
55 gezielte Zugabe von Vorstufen (precursors) oder
stimulierenden Substanzen wie Fettsäuren,
Biotin, Cholin, Glycerin, Ethanolamin, Thiole,
Hormone, Vitamine.
Für viele Zelllinien ist der Zusatz von Substanzmi-
12 schungen aus definierter und nicht-tierischer Quelle
hilfreich, z. B. Peptonhydrolysate oder Hefeextrakte.
Deren Zusammensetzung ist jedoch komplex und
kann je nach Herkunft der Rohstoffe und ihrer Ver-
arbeitung von Charge zu Charge variieren. Durch
sorgfältige Auswahl der Rohstoffe und Standar-
disierung der Herstellweise gelang es, ein engeres
Spektrum der Inhaltsstoffe dieser Hydrolysate und
Extrakte zu erzielen. Eine zusätzliche Veredelung
dieser Substanzen erreichte man mit der Abtrennung
von Inhaltsstoffen durch Ultrafiltration oder Erhit-
zen. Diese relativ unspezifischen Methoden führten
zur Abreicherung hochmolekularer Rohstoffanteile
und Verunreinigungen ‒ z. B. Endotoxine ‒ bzw.
zur thermischen Denaturierung von Verunreini-
gungen ‒ z. B. Enzyme. Inzwischen wurden Inhalts-
stoffe von Hydrolysaten und Extrakten identifiziert
und bestimmte Fraktionen in Zellkulturtests auf ihre
förderlichen Eigenschaften für Zellwachstum und
Produktbildung geprüft. Die nächste Stufe der Wei-
terentwicklung könnte von den „charakterisierten“
Hydrolysaten und Extrakten zur Reinigung von
bevorzugten Fraktionen oder zur de novo-Synthese
der wichtigsten Komponenten, z. B. Oligopeptide,
führen [22, 40].
Am Ende dieser Entwicklung stehen aktuell die
chemisch definierten Zellkulturmedien. Sie enthal-
ten gar keine oder nur sehr geringe Proteinanteile
(<0,01 g/L). Anstelle der nur teilweise bekannten und
in ihrer Konzentration chargenabhängigen Serum-
bestandteile werden definierte, hochreine, in ihrer
Art und Qualität reproduzierbare, seitens Ursprung
und Stoffklasse unproblematische Rohstoffe als Ein-
zelsubstanzen eingesetzt.
Inzwischen ist eine Vielzahl von käuflichen Stan-
dardmedien und von individuell auf spezifische For-
schungs- oder Produktionszelllinien optimierten Kul-
turmedien für Säugetierzellen etabliert, welche aus
den Katalogen der Medienhersteller bezogen werden
können [39]. Die meisten Medien sind in Pulverform
erhältlich und werden in hochreinem, entionisiertem
Wasser gelöst. Eine Weiterentwicklung der klassischen
Pulvermedien sind Granulate [38, 100]. Für Labora-
torien, die nicht über eigene Ressourcen zur Medien-
Einwaage, -Herstellung und -Sterilfiltration verfügen,
sind auch Flüssigmedien in Medienbeuteln (bags) in
Größen von ca. 5 bis 1000 L lieferbar. . Tab. 12.4 zeigt
die Entwicklung von Zellkulturmedien für Suspen-
sionskulturen von serumhaltigen bis zu chemisch
definierten bzw. charakterisierten Medien.
Für die Kultivierung von Primärzellen, für
Grundlagenforschung mit Zellkulturen und für die
Herstellung von Impfstoffen sind noch immer relativ
komplexe Kulturmedien üblich bzw. bisher nicht
ersetzbar. Für die Kultivierung von Zelllinien und
für die biopharmazeutische Produktion mit Zell-
kulturen hat sich jedoch der Trend zu serumfreien,
bovinfreien und chemisch definierten Kulturmedien
eindeutig durchgesetzt.
12.4 Zellkultivierungsmethoden
Die Auswahl der geeigneten Methode für die Kul-
tivierung von Säugerzellen richtet sich nach der
Art der Zelle und dem Zweck der Kultivierung.
Grundsätzlich werden die Zellarten unterschie-
den in adhärent oder in Suspension wachsend. Ent-
sprechend ihres Verwendungszwecks werden sie in
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
ganz unterschiedlichen Maßstäben gezüchtet, von
der Mikrotiterplatte für biologische Tests bis zu
20.000-Liter-Reaktoren zur Herstellung von thera-
peutischen Proteinen für die Humananwendung.
Adhärent wachsende Kulturen (anchorage-de-
pendent cells) haften und vermehren sich nur auf
geeigneten Oberflächen (Oberflächenkulturen),
die den natürlichen Oberflächen im Zellgewebe (in
vivo) möglichst ähnlich sein sollten. Dabei werden
die Zellen von dem jeweils spezifischen flüssigen
Nährmedium umspült. Die Zellen aller Wirbeltiere
tragen auf ihrer Oberfläche ungleichmäßig verteilte
negative Ladungen.
Geeignete Oberflächen sind beispielsweise Dex-
trane, Glas, Kunststoffe und Metall, die häufig noch
spezifisch modifiziert sind. Sie dürfen keine toxi-
schen Gruppen wie z. B. Schwermetalle enthalten,
müssen eine verteilte, aber nicht zu dichte elektri-
sche Ladung aufweisen und hydrophil sein. Um
eine effiziente Anhaftung zu gewährleisten, können
die Oberflächen mit Anhaftungsfaktoren (adhesion
factors) wie z. B. Kollagen, Fibronectin, Globulinen,
Glykoproteinen oder Serum vorbehandelt werden.
Die Anhaftung adhärenter Zellen ist ein komple-
xer Prozess und erfolgt über die Stufen Adsorption,
Kontakt, Anhaftung und Spreitung (spreading).
Unter geeigneten Kultivierungsbedingungen ver-
mehren sich die Zellen je nach Zelltyp als Monolayer
(bei Kontaktinhibition) oder als Polylayer.
Zur Kultivierung adhärenter Zellkulturen werden
je nach Zweck und Zelltyp verschiedene Kultivie-
rungssysteme verwendet. Werden die Zellen z. B. für
die Herstellung von Proteinen oder Viren eingesetzt,
a b
. Abb. 12.3  Zellen, die auf (a) Mikrocarriern bzw. (b) in Suspension wachsen
511 12
kommen im kleinen Maßstab häufig T-Flaschen
(t-flasks) oder Rollerflaschen (roller bottles) zum
Einsatz. Die normalerweise hydrophobe Oberflä-
che wird durch Vorbehandlung polar und hydrophi-
ler. Gebräuchlich sind Plastikgefäße aus Polystyrol,
Polycarbonat, Polyethylen, Polypropylen, Polytetra-
fluorethylen und Polyacrylamid als Einmal-Artikel.
Im größeren Maßstab erfolgt die Zellzüchtung auf
Mikrocarriern (dies sind massive oder poröse Kugeln
von etwa 50 bis 300 µm Durchmesser) in Suspen-
sion bzw. als fluidized bed oder in Festbettreaktoren
in kontinuierlicher Kultur (.  Abb. 12.3a). Auf der
Oberfläche der Mikrocarrier, bei porösen Mikro-
carriern auch in den Poren, können die adhärenten
Zellen zu beinahe gewebeähnlichen Zelldichten her-
anwachsen. Für Festbettreaktoren kommen je nach
Maßstab vor allem Hohlfaser- oder auch Keramik-
module infrage. Ist die Zelle das Produkt, wie z. B.
bei der Züchtung von Hautzellen zur Behandlung
von Brandverletzungen, werden diese auf speziellen
Trägern in geeigneten Kunststoffschalen vermehrt.
Meistens muss vor der Subkultivierung der Zell-
verband durch die Zugabe von Trypsin aufgelöst
werden. Die Züchtung adhärenter Zellen ist daher
prozesstechnisch aufwändig und vom Scale-up her
begrenzt. Dieser Zelltyp wird daher im Allgemeinen
nur für spezifische Anwendungen eingesetzt.
Industriell von derzeit wesentlich größerer
Bedeutung sind die Suspensionskulturen, die als
Einzelzellen oder in kleinen Aggregaten direkt im
Nährmedium gezüchtet werden (. Abb. 12.3b). Für
die Herstellung von Glykoproteinen werden fast aus-
schließlich Suspensionszellen eingesetzt, es sei denn
 512 R. Kempken et al.
das Produkt ist wie z. B. bei Faktor VIII sehr empfind-
lich gegenüber einem proteolytischen Abbau. In den
meisten Fällen kommen rekombinante Zellen wie die
CHO- oder NS0-Zellen zum Einsatz, die „unsterb-
lich“ sind und unbegrenzt vermehrt werden können,
soweit es deren genetische Stabilität zulässt. Für die
Vermehrung von Volumen unter 10 L kommen
neben Spinnerflaschen und zunehmend Schüttel-
kolben vor allem Rührkesselreaktoren (stirred tank
reactor, STR) zum Einsatz. Im Maßstab über 1000 L
werden fast ausschließlich STR eingesetzt, weil sie
die vielfältigen Anforderungen, die sich aus den
verschiedenen industriellen Anwendungen ergeben
hinsichtlich Flexibilität, Anforderungen ans Steril-
design, Maßstabsvergrößerung (upscaling), variable
Prozessführung und schnelle Entwicklungszeiten,
immer noch am besten erfüllen.
12.4.1 Rührkesselreaktoren (stirred
tank reactor, STR)
Obwohl die Zellkultivierung in STR im Wesentli-
chen mit der Fermentation von Mikroorganismen
vergleichbar ist, gibt es doch spezifische Anforde-
rungen für den Einsatz bei Säugerzellen. Sie unter-
scheiden sich von Mikroorganismen vor allem durch
12 ihr vergleichsweise langsames Wachstum (12 bis 24
Stunden Verdopplungszeiten) bei normalerweise
relativ geringen maximal erreichbaren Zelldichten,
durch die hohen Ansprüche an das Nährmedium
(7 Abschn. 12.3.1) und die Empfindlichkeit gegen-
über äußeren Einflüssen. Details zu Bioreaktoren
sind in 7 Kap. 6 beschrieben.
Begasung und Rührung
Obwohl der Sauerstoffbedarf der Säugerzellkultu-
ren mindestens um den Faktor 10 geringer ist als
beispielsweise der einer Hefekultur, werden beson-
dere Anforderungen an die Rührung und Begasung
gestellt. Dabei müssen folgende Faktoren berücksich-
tigt werden [79]:
55 Faktoren, die eine physikalische Schädigung
der Zellen verursachen können;
55 Konzentrationsgefälle aufgrund ungenügender
Durchmischung;
55 Probleme im Zusammenhang mit einem
unzureichenden Gas-Flüssig-Stoffübergang.
Da Säugerzellen keine feste Zellwand besitzen, sind
sie relativ scherempfindlich gegenüber der hydrody-
namischen Scherung und Schädigungen durch Luft-
blasen. Dieser Eigenschaft lässt sich durch eine für
jede Zelllinie spezifische Medienzusammensetzung
und Prozessführung in den verschiedenen Maßstä-
ben begegnen. Das Ausmaß einer potenziellen Zell-
schädigung hängt ab vom Reaktordesign, der Bega-
sungsart und auch vom physiologischen Status der
Zellen.
Durch die Zugabe eines nicht-ionischen, ober-
flächenaktiven Copolymers, wie z. B. Pluronic F68,
lassen sich Zellschädigungen durch Blasen minimie-
ren, was besonders unter serumfreien Bedingungen
von Bedeutung ist. Durch Zugabe von Serum lässt
sich eine ähnliche Schutzwirkung erzielen. Obwohl
die Zellrespiration von Säugerzellen gering ist und sie
deshalb im STR mit im Vergleich zu Mikroorganis-
men geringen Luftmengen begast werden, ist trotz-
dem eine ausreichende Begasung unter anderem zum
Austreiben des von den Zellen gebildeten Kohlendi-
oxids erforderlich (CO2 stripping). In kleinen Reak-
toren kann unter Umständen der Gasstrom durch
die Luftbegasung zu gering sein, um genügend CO2
auszutreiben, sodass eine zusätzliche Begasung mit
Stickstoff erforderlich wird. Durch die Zuführung
von reinem Sauerstoff zur Luftbegasung wird die
Versorgung bei großen Reaktoren oder bei Hoch-
dichte-Zellkulturen wesentlich verbessert bei noch
tolerierbaren Begasungsraten.
In den industriell eingesetzten STR werden für
die Gasverteilung Begasungsrohre (point- oder open
tube sparger) oder Begasungsringe eingesetzt, zum
Teil auch Fritten aus gesintertem Edelstahl. Der
Stoffübergang mittels Frittenbegasung ist durch die
sehr kleinen Blasen zwar hervorragend, und das
Optimum zwischen Sauerstofftransfer und CO 2
stripping kann über die Porengröße im Bereich von
2‒5 µm eingestellt werden. Nachteilig können aber
die schwierigere Reinigbarkeit unter GMP-Bedin-
gungen (7 Abschn. 12.7.3) und das Risiko einer stär-
keren Schaumbildung sein. Weit verbreitet sind das
Begasungsrohr und der Begasungsring, weil sie am
besten zu reinigen und zu sterilisieren sind, obwohl
die Blasengröße kaum zu steuern und der Sauerstoff-
eintrag relativ ineffizienter ist.
Die Rührung in Bioreaktoren ist von erhebli-
cher Bedeutung und mit zunehmender Reaktor-
größe schwieriger optimal zu bewerkstelligen. Es
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
werden im Allgemeinen schonende Rührorgane ver-
wendet, um die Scherbeanspruchung und den Ener-
gieeintrag möglichst klein zu halten. Dazu eignen
sich Marine- und Rushtonimpeller sowie spezielle
Schrägblattrührer („Elefantenohr“) die je nach Reak-
tortyp und -größe einzeln oder in Kombination ein-
gesetzt werden (. Abb. 12.4). In der Regel beträgt
der Rührerdurchmesser ein Drittel bis die Hälfte des
Reaktordurchmessers.
Mit diesen Rührern können lokale turbulente Strö-
mungen und Mikrowirbel, die bevorzugt an den Rühr-
blättern entstehen und potenziell zellschädigend sind,
minimiert werden (7 Kap. 6, . Abb. 6.7). Allerdings
muss die Durchmischung effektiv genug sein, um
möglichst keine Nährstoff-, pH- und Sauerstoffgra-
dienten entstehen zu lassen. Dies ist zwar mit zuneh-
mendem Reaktorvolumen und hohen Zelldichten
immer schwieriger zu erreichen; Studien mit indus-
triell verwendeten Zelllinien haben jedoch gezeigt,
dass die Zellen doch nicht so empfindlich gegenüber
Scherstress sind wie ursprünglich angenommen [19].
Die Durchmischung kann verbessert werden durch
55 die Erhöhung der Rührerdrehzahl,
55 die Verwendung von zusätzlichen
Rührorganen,
55 die Vergrößerung des Rührerdurchmessers und
55 den Einbau von Strömungsbrechern.
Stoffübergang
Außer der beschriebenen Submersbegasung kann
der Stoffübergang in STR auch durch Oberflächen-
begasung oder die Verwendung von gaspermeablen
Membranen zur blasenfreien Begasung erreicht
. Abb. 12.4  Beispiel für (a) einen
typischen Schrägblattrührer
(„Elefantenohr“) und (b) einen
Rushton-Marineimpeller
513 12
werden, wodurch blasenbedingte Zellschädigungen
vermieden werden. Die Oberflächenbegasung beruht
auf der Diffusion an der Grenzfläche zwischen der
Luft im Kopfraum des Reaktors und der Flüssigkeit.
Der Stoffübergang ist proportional zur Grenzfläche
Luft-Flüssigkeit und wird mit zunehmendem Reak-
torvolumen ineffizienter. Daher ist die Oberflächen-
begasung nur in kleinen Kultivierungssystemen wie
T-Flaschen, Rollerflaschen, Spinnerflaschen (<1 L)
oder Schüttelkolben ausreichend. Obwohl die Mem-
branbegasung bis zu einem Maßstab von 150 L nach-
weislich möglich ist [122], konnte sie sich wegen der
Schwierigkeiten einer weiteren Maßstabsvergröße-
rung und des hohen technischen Aufwands für die
industrielle Anwendung nicht durchsetzen.
Rührkesselreaktoren müssen so ausgelegt sein, dass
sie mindestens die Sauerstofftransferrate (oxygen
transfer rate, OTR) erreichen, die erforderlich ist,
um die Sauerstoffaufnahmerate (oxygen uptake rate,
OUR) bei maximaler Zellmasse abzudecken. Die
OTR ist direkt proportional zum Stoffübergangsko-
effizient kLa und abhängig von der Reaktorgeomet-
rie, Gasverteilung, Rührung, dem Reaktordruck und
der Nährmedienzusammensetzung. Die physikali-
schen Grundlagen sind ausführlich in 7 Abschn. 5.3
beschrieben.
Aufgrund der spezifischen Eigenschaften und
Anforderungen von Säugerzellen haben sich beim
industriell eingesetzten STR vor allem die erwähn-
ten Marineimpeller und/oder auch Schrägblattrüh-
rer sowie Rushtonimpeller als Rührorgane durch-
gesetzt. Gleichzeitig wird die Begasungsrate relativ
gering gehalten und bei Bedarf mit Sauerstoff ange-
reichert. Damit lässt sich auch die Schaumbildung
 514 R. Kempken et al.
in Grenzen halten, die bei Bedarf noch mit geringen
Mengen an Antischaummittel, meist auf Silikon-Ba-
sis, beseitigt werden kann.
12.4.2 Weitere Reaktoren
In jüngster Vergangenheit hat die Entwicklung und
der Einsatz von Einweg-Bioreaktoren (disposible/
single use bag bioreactors) für die Kultivierung von
tierischen Zellkulturen stark zugenommen. Details
hierzu sind in 7 Abschn. 6.6.1 beschrieben.
Daneben gibt es noch eine Reihe anderer Reak-
tortypen, die aber meist nur für spezifische Anwen-
dungen eingesetzt werden. Hier sind Airlift-Fer-
menter, Membranreaktoren, Wirbelschichtreaktoren
(fluidized bed reactor) oder verschiedene Varianten
von Festbettreaktoren zu nennen.
Beim Wirbelschichtreaktor werden die Zellen, die
entweder in Form von Aggregaten wachsen oder an
Oberflächen bzw. in porösen Partikeln haften, durch
die Anströmung mit der Nährlösung in Schwebe
gehalten ( 7 Abschn. 6.3.1 ). Bei Einsatz poröser
Träger muss das Trägermaterial eine hohe Porosität
mit genügend großen Poren aufweisen, um die innen
wachsenden Zellen ausreichend mit Nährstoffen und
Sauerstoff zu versorgen und die Stoffwechselendpro-
12 dukte zu entfernen. Hierfür eignen sich Materialien
aus Kollagen, Keramik, offenporigem Glas oder ver-
schiedenen Polymeren. Sie müssen eine möglichst
große Oberfläche bieten und eine solche spezifische
Dichte besitzen, dass sie leicht in Schwebe zu halten
sind. Kommerzialisiert wurde das Verax®-System, bei
dem die Zellen in sogenannten Microspheres aus Rin-
der-Kollagen gezüchtet werden [106].
Zellen, die in Festbettreaktoren kultiviert
werden, sind auf einem Trägermaterial fixiert und
werden durch das vorbeiströmende Nährmedium
versorgt. Damit können zwar hohe Zelldichten pro
Volumen erreicht werden, allerdings ist die Versor-
gung der innenliegenden Zellen aufgrund von Kon-
zentrationsgradienten und Inhomogenitäten stark
limitiert. Neben keramischen Matrices [8] und Edel-
stahlspiralen [124] kommen vor allem Hohlfaser-
module aus Membranfasern mit einem cut-off von
10‒100 kDa zum Einsatz (. Abb.  6.47). Während bei
Oberflächenreaktoren die Zellen direkt mit Medium
überströmt werden, wachsen die Zellen bei Hohlfa-
sermodulen auf der Außenseite und sind durch die
semipermeable Membran vom mit Sauerstoff ange-
reicherten Nährmedium getrennt.
Sowohl Wirbelschicht- als auch Festbettreakto-
ren werden meist im kontinuierlichen Betrieb gefah-
ren. Beiden Reaktortypen ist gemeinsam, dass ein
upscaling nur in einem begrenzten Umfang möglich
ist und die Prozessführung aufgrund der Gradien-
ten, der Inhomogenitäten und der nur eingeschränkt
möglichen Prozesskontrolle schwierig ist.
12.4.3 Systeme zur Zellrückhaltung
Um die Zelldichten von Suspensionskulturen auf
mehr als 10 und bis zu 100 Millionen Zellen pro Mil-
liliter zu erhöhen, können verschiedene Systeme zur
Zellrückhaltung eingesetzt werden. Hierbei werden
die Zellen permanent mit frischem Nährmedium
versorgt und im Gegenzug die gleiche Menge an
Zellkulturüberstand abgenommen (Perfusionskul-
tur, perfusion culture). Dieser enthält neben dem
Produkt zum Teil toxische Metabolite und ist verarmt
an Nährstoffen. Hierbei werden ausschließlich Tech-
nologien verwendet, die nach Größe bzw. Dichte
trennen, wobei das geeignete Verfahren in Abhän-
gigkeit vom Maßstab und der spezifischen Anwen-
dung ausgewählt werden muss [121].
Verbreitet eingesetzt werden externe, an den
Reaktor angeschlossene Membranmodule (Hohlfa-
ser- oder Flachbettmembranen), die als cross-flow-
oder Tangential-Fluss-Filtration (TFF) betrieben
werden. Dabei wird die Zellkultur mittels Pumpe
permanent rezirkuliert und die Zellkulturflüssigkeit
im Membransystem abgetrennt. Vereinzelt werden
auch Spinfilter eingesetzt.
Andere Entwicklungen basieren auf der Zellre-
tention mittels Dichte. Hierfür eignen sich prinzipiell
statische bzw. Ultraschall-Settler, aber auch Zentri-
fugen und Hydrozyklone. Das derzeit auf dem Markt
befindliche BioSep®-System nutzt z. B. Ultraschall-
wellen im Megahertz-Bereich zur Sedimentation
(„akustischer Filter“) und hat je nach Modell eine
Leistung von 1‒150 L pro Tag [128].
Eine andere, relativ neue Technologie zur Zell-
und Produktzurückhaltung ist die „Alternierende
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
Tangentiale Fluss-Technologie“ (alternating tangen-
tial flow filtration, ATF). Diese Technologie basiert auf
einer alternierenden Filtration mithilfe einer scher-
kraftarmen Diaphragmapumpe, wobei zellhaltiges
Medium aus dem Reaktor durch ein Hohlfasermo-
dul abgezogen und auf gleichem Wege wieder in den
Reaktor zurückgedrückt wird. Hierbei variiert die
Flussrichtung des Mediums durch die Filtermembran
des Hohlfasermoduls in beide Richtungen, wodurch
zellfreies Medium abgezogen wird und gleichzeitig
Zellen, die sich an der Membran absetzen, abgespült
werden [68]. Diese Technologie ist robust, scher-
stressarm und außerdem gut skalierbar. Es werden
Zelldichten bis zu 200 Mio. Zellen/mL erreicht. Auf-
grund dieser positiven Eigenschaften wird die ATF
derzeit kommerziell bis zu einem Maßstab in der
Größenordnung von 1000 L eingesetzt [98].
12.5 Prozessführung bei
Säugerzellkulturen
Um Säugerzellen optimal kultivieren zu können,
müssen bestimmte Rahmenbedingungen hinsicht-
lich des Reaktors und der Prozessführung ein-
gehalten werden. Dies gilt im besonderen Maße
für die großtechnische Herstellung von Protei-
nen oder Impfstoffen unter cGMP-Bedingungen
(7 Abschn. 12.7.3) für die Anwendung am Menschen.
12.5.1 Sterilisation
Da Säugerzellen langsam wachsen und nährstoff-
reiche Medien benötigen, besteht immer das Risiko
der Kontamination mit Mikroorganismen. Daher
kommt der sterilen Prozessführung eine große
Bedeutung zu. Bei der Zellzüchtung im Labormaß-
stab sind vor allem das sterile Arbeiten unter der
Sterilwerkbank sowie die Verwendung steriler oder
autoklavierter Materialien essenziell. Im Großmaß-
stab (large scale) sind das aseptische Design der Bio-
reaktoren einschließlich der gesamten Peripherie
sowie die angewandten Verfahren zur Reinigung,
Sterilisation und Prozessführung entscheidend. In
7 Kap. 7 sind die Grundlagen der Sterilisation und
Steriltechnik ausführlich beschrieben.
515 12
12.5.2 Medienfiltration
Die üblichen Zellkulturnährlösungen müssen ste-
rilfiltriert werden, da einige Komponenten wie Vit-
amine, bestimmte Aminosäuren oder Proteine ther-
molabil sind und nicht mit Hitze sterilisiert oder
autoklaviert werden können. Hierzu werden ste-
rilisierte Membranfilter mit einer Porenweite von
maximal 0,2 µm verwendet, die in verschiedenen
Filtergrößen, Membrantypen und -materialien wie
Polyethersulfon (PES), Nylon, Polyvinyldifluorid
(PVDF) und Celluloseacetat erhältlich sind. Mitt-
lerweile werden zunehmend 0,1-µm-Sterilfilter ein-
gesetzt, um auch das Risiko einer Mycoplasmenkon-
tamination zu minimieren. Die Filterkonfiguration
muss für die jeweilige Filtration angepasst sein, um
sicherzustellen, dass die Filter nicht verblocken,
keine Nährstoffe adsorbiert werden und die Filtration
auch von Medienvolumina bis zu 20.000 L innerhalb
weniger Stunden durchführbar ist. Vereinzelt werden
angesetzte Nährlösungen in der kommerziellen Pro-
duktion auch noch zusätzlich für 10–15 Sekunden
auf ca. 102 °C erhitzt (high-temperature short-time,
HTST), um potentiellen Kontaminationen zusätz-
lich vorzubeugen, die sich nicht sicher über Filtra-
tion entfernen lassen [97]. Dabei liegt der Fokus vor
allem auf der Vermeidung potentieller Kontami-
nationen mit exogenen Viren. Für die Anwendung
einer HTST-Behandlung müssen die Nährlösungen
spezifisch entwickelt werden, da nicht alle Kompo-
nenten hitzestabil sind bzw. einzelne Komponenten
präzipitieren können.
12.5.3 Zellkultivierungsverfahren
Säugerzellen werden sowohl im batch-, fed-batch-
als auch im kontinuierlichen Betrieb gezüchtet. Im
batch-Verfahren werden zu Beginn Nährmedium
und Zellen in ein Kultivierungssystem gegeben und
unter geeigneten Bedingungen ohne weitere Mani-
pulationen bis zum Ende der Kultivierung inkubiert.
Diese Verfahrensweise ist relativ einfach und risiko-
arm und wird deswegen in vielen Fällen als Standard-
verfahren bei der großtechnischen Vermehrung von
Suspensionszellen eingesetzt. Dabei durchlaufen die
Zellen die typischen Wachstumsphasen: lag-, log-,
 516 R. Kempken et al.
stationäre- und Absterbephase. Die Kultivierungs-
zeit beträgt bei batch-Verfahren mit den industriell
verwendeten Zelllinien in der Regel zwei bis vier
Tage. Wegen der systembedingten Beschränkun-
gen aufgrund von Nährstofflimitierungen und/oder
Anreicherung von toxischen Stoffwechselproduk-
ten sind die zu erreichenden Zelldichten und Pro-
duktkonzentrationen (Titer) beschränkt. Sie liegen
im Bereich von etwa ein bis fünf Millionen Zellen
pro Milliliter und erreichen in der Regel einen Titer
unter 200 mg/L.
Eine bessere Kontrolle der Kulturführung
erreicht man über fed-batch-Verfahren, bei denen
während der Kultivierung zusätzlich Nährstoffe,
Wachstumsfaktoren oder die Produktbildung stei-
gernde Substanzen aseptisch zugegeben werden.
Damit lassen sich z. B. die Bildung von wachstums-
hemmenden Metaboliten wie Lactat oder Ammo-
nium minimieren, indem z. B. die Anfangskonzen-
tration von Glucose bzw. Glutamin verringert und
diese Substanzen im Laufe der Kultivierung nach
Bedarf zugegeben werden. Außerdem kann die
Nährstofflimitierung durch Zugabe von Glucose und
Aminosäuren vermieden werden und damit besse-
res Wachstum, höhere Zelldichten und eine Verlän-
gerung der Kultivierungszeit erreicht werden. Durch
Zugabe von Buttersäure kann die spezifische Produk-
12 tivität der Zellen (Menge an Produkt pro Zelle und
Tag) signifikant gesteigert werden. Mit optimierten
fed-batch-Verfahren für die Herstellung monoklona-
ler Antikörper lassen sich Zelldichten von weit über
zehn Millionen Zellen pro Milliliter und in Einzel-
fällen Titer von 10 g/L und mehr erreichen bei Kul-
tivierungszeiten von bis zu drei Wochen. Fed-batch-
Verfahren sind dementsprechend weit verbreitet bei
der Produktion von Proteinen.
Im Gegensatz zur fed-batch-Kultivierung wird
bei den kontinuierlichen Verfahren permanent
oder periodisch in dem Maße Zellkulturlösung ent-
nommen, wie frische Nährlösung zugegeben wird,
wobei das Reaktorvolumen konstant bleibt und die
Zellen im Reaktor verbleiben. Diese als Perfusion
bezeichnete Betriebsweise ermöglicht optimale
und weitgehend konstante Kultivierungsbedingun-
gen über die gesamte Laufzeit, die bis zu mehrere
Monate betragen kann [113]. Mit Perfusionskul-
turen können die höchsten Zelldichten (bis über
100 Millionen Zellen pro Milliliter) und Produkt-
mengen pro Volumen und Zeit erreicht werden. Sie
sind die Regel bei Produktionsverfahren mit adhä-
renten Zellen (7 Abschn. 12.4). Suspensionskultu-
ren können nur mithilfe von geeigneten Verfahren
der Zellzurückhaltung im Perfusionsmodus betrie-
ben werden (7 Abschn. 12.4.3). Aufgrund der hohen
Zelldichten können die Reaktoren kleiner dimen-
sioniert werden. Perfusionskulturen kommen zum
Einsatz bei der Produktion von labilen Proteinen
(z. B. Faktor VIII) oder wenn hohe Zelldichten
benötigt werden. Sie kann aber auch als unmittel-
bare Vorstufe für eine fed-batch-Produktionskultur
eingesetzt werden, um diese mit einer viel höheren
Einsaatdichte zu starten und damit die Produktivi-
tät zu erhöhen.
Bei den meisten Verfahren, die heute in der Her-
stellung von rekombinanten Proteinen Anwendung
finden, hat sich das fed-batch-Verfahren durchge-
setzt. Die Vorteile sind:
55 Es ist schnell zu entwickeln (time to market ist
ökonomisch bedeutend);
55 eine flexible Produktion ist möglich, vor allem
in einer Mehrproduktanlage;
55 eine hohe Produktkonzentration ist erreichbar
(relativ teure Medien werden genutzt, und die
initiale Aufarbeitung ist effizient);
55 die Prozessvalidierung ist vergleichsweise
einfach und schnell;
55 die Verfahren sind auch im großtechnischen
Maßstab robust genug.
Die Grundlagen der Kultivierung und Prozessfüh-
rung sind ausführlich in 7 Kap. 3 beschrieben.
12.5.4 Prozessparameter und
Prozessmonitoring
Säugerzellen sind ein äußerst komplexes biologisches
System und werden dementsprechend von vielen
Faktoren beeinflusst. Die Grundvoraussetzung für
die Vermehrung von Säugerzellen sind geeignete
Nährmedien (7 Abschn. 12.3.1) und biophysikalische
Umgebungsbedingungen, deren Einhaltung beson-
ders wichtig ist, wenn serum- oder gar proteinfreie
Nährmedien eingesetzt werden.
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
Prozessparameter
Zu Beginn einer Kultur muss im Gegensatz zu Mik-
roorganismen mit einer relativ hohen Einsaat-
dichte ‒ in der Regel mindestens 105 Zellen pro
Milliliter ‒ inokuliert werden, um vor allem unter
serumfreien Bedingungen ein sicheres Anwachsen
der Kultur zu gewährleisten. Es wird angenommen,
dass hier die von den Zellen selbst gebildeten Wachs-
tumsfaktoren eine Rolle spielen und deshalb eine
Mindestmenge an konditioniertem Medium mitge-
führt werden muss.
Da Säugerzellen keine stabile Zellwand, sondern
nur eine empfindliche Zellmembran besitzen, ist der
osmotische Druck des Mediums ein wichtiger Para-
meter. Ohne spezielle osmo-protektive Substanzen
liegt die Osmolalität meist im Bereich von 250 bis
400 mOsm. Eine Erhöhung der Osmolalität vermin-
dert häufig das Wachstum, kann aber bei bestimmten
Zellen die Produktivität steigern.
Zellen wachsen in der Regel bei einer Tempera-
tur von 37 °C am besten. In manchen Produktions-
verfahren wird die Temperatur zu Beginn oder im
Verlauf um mehrere Grad Celsius gesenkt (Tem-
peraturshift). Damit wird das Wachstum verlang-
samt bzw. gestoppt und der Metabolismus in Rich-
tung Produktbildung verlagert. Schon geringfügige
Abweichungen von weniger als 1 °C von der Soll-
temperatur können einen erheblichen Effekt auf das
Wachstum und die Produktivität haben.
Der pH-Wert muss sich ebenfalls in einem
relativ engen Band von ca. 6,7 bis 7,4 bewegen, um
ein akzeptables Zellwachstum zu ermöglichen. Das
von den Zellen während der Kultivierung in unter-
schiedlichen Phasen und Konzentrationen gebildete
Kohlendioxid, Lactat und Ammonium beeinflussen
den pH-Wert entsprechend. Bei Kulturen, die nicht
pH-kontrolliert werden, muss die Pufferkapazität
des Mediums ausreichend sein oder aber die Inku-
bation bei einem Luft/CO2-Gemisch von 90:10 bzw.
95:5 erfolgen. Dies ist in der Regel im small scale bei
T-Flaschen, Schüttel- und Spinnerkulturen der Fall.
In geregelten Bioreaktoren wird der pH-Wert durch
die Zugabe von meist Kohlendioxid und Carbonat
in den vorgegebenen Grenzen gehalten. Die exakte
Einhaltung eines engen pH-Bandes kann entschei-
dend sein für die konsistente Produktqualität von
Glykoproteinen.
517 12
Ohne eine ausreichende Versorgung mit Sauer-
stoff können die Zellen nicht wachsen. Obwohl
sie nur eine relativ niedrige Sauerstoffaufnahme-
rate (OUR) haben, ist die ausreichende Versorgung
mit Sauerstoff wegen der Scherempfindlichkeit vor
allem bei large scale-Bioreaktoren nicht trivial. Der
Sauerstoffgehalt in den Kulturen kann variieren und
wird je nach Maßstab und Reaktor mittels Oberflä-
chen- oder Submersbegasung mit Luft oder zusätz-
lichem Sauerstoff sichergestellt (7 Abschn. 12.4.1).
Wie beim pH wird auch die Sauerstoffkonzentra-
tion normalerweise in geregelten Systemen kons-
tant gehalten.
Alle hier aufgeführten Parameter beeinflussen
sich gegenseitig und müssen bei der Prozessentwick-
lung möglichst optimal austariert werden.
Prozessmonitoring
Um die Kultivierung von Säugerzellen konsistent
bewerkstelligen zu können, kommt der Prozess-
überwachung (Monitoring) und Prozesskontrolle
eine entscheidende Bedeutung zu. Dabei gilt es, die
in 7 Abschn. 12.5.4 beschriebenen Parameter zuver-
lässig zu messen und in definierten Grenzen (process
operating ranges) zu halten.
Am besten gelingt dies mit on-line zu messenden
Parametern wie Temperatur, pH und pO2. Während
die Temperaturmessung über Pt100 ausreichend
präzise und zuverlässig unter den erforderlichen Ste-
rilbedingungen ist, haben die pH- und pO2-Sonden
ein gewisses Ausfallsrisiko bzw. können im Verlauf
der Fermentation driften und falsche Messwerte
anzeigen. Deshalb werden diese Sonden vor allem
in large scale-Reaktoren entweder redundant oder
mit Wechselarmaturen eingesetzt. Es sind auch aus-
gereifte Sonden für die Messung des pCO2 verfügbar,
die vor allem im Rahmen der Entwicklung und des
Scale-up wertvoll sein können.
Für die on-line-Messung der Parameter pH und
pO2 gibt es inzwischen auch optische Sensoren, die
z. B. für Screening-Assays interessant sind [21, 62].
Spezifische Fluorophore werden am Boden von
transparenten Kulturgefäßen fixiert, die in Abhän-
gigkeit vom jeweils zu bestimmenden Parameter
ihre Fluoreszenz ändern und damit on-line bestimmt
werden können.
 518 R. Kempken et al.
Der Einsatz von Trübungs- und Kapazitätsson-
den zur indirekten Bestimmung der Zellmasse bzw.
des Zellvolumens hat den Eingang in die Routine
bisher nur vereinzelt gefunden, weil die Korrelation
zur Zellzählung oft nicht im gesamten Messbereich
gegeben ist und die Messung von Partikeln oder Luft-
blasen gestört wird.
Da die verfügbare on-line-Messtechnik nach
wie vor ungenügend ist, um einen Zellkulturprozess
ausreichend genau und zeitnah zu analysieren, wird
an der Entwicklung neuer Biosensoren gearbeitet
[118]. Vor allem im Bereich der UV-, Fluoreszenz-
und NIR-Spektroskopie gibt es interessante Ansätze.
Zum Beispiel könnten mit der NIR-Spektroskopie
(7 Abschn. 8.2.6), gleichzeitig Metabolite wie Glucose,
Lactat, Ammonium und Glutamin sowie die Zell-
dichte und Produktbildung bestimmt werden. Vor-
aussetzung ist allerdings eine aufwendige mathema-
tische Modellierung der spezifischen Spektren zur
Kalibrierung der zu messenden Parameter [108].
Der Einsatz der Massenspektrometrie ist für die
Bestimmung der Sauerstoffaufnahmerate (OUR)
und Kohlendioxidproduktionsrate (carbon dioxide
production rate – CPR), sowie für metabolische Flux-
Analysen beschrieben [14, 86], hat sich aber noch
nicht für das Routine-Monitoring etabliert, weil
häufig die Zelldichten zu niedrig sind. Da inzwi-
12 schen deutlich höhere Zelldichten erreichbar sind,
wird auch der Einsatz der Massenspektrometrie
zunehmend interessanter. Das sich in der Entwick-
lung befindliche in situ-Mikroskop kann in einen
Reaktorstutzen eingebaut werden und soll es ermög-
lichen, on-line die Zellzahl, Zellgröße und den Aggre-
gationsgrad der Zellkultur zu bestimmen [61].
Beim Einsatz von Sonden zur on-line-Messung
muss allerdings der Nutzen für die Prozesskontrolle
gegen das damit verbundene höhere Kontamina-
tionsrisiko und den Aufwand abgewogen werden.
Andere Parameter können derzeit nur off-line
sicher gemessen werden. Die Bestimmung der Zell-
dichte und Vitalität erfolgt mittels mikroskopischer
Zählung in einer Zählkammer bei entsprechen-
der Verdünnung, wobei die Zugabe eines Farb-
stoffes (z. B. Trypanblau) die Unterscheidung zwi-
schen lebenden und toten Zellen ermöglicht. Diese
Messung ist entsprechend ungenau und kann im
Einzelfall bis zu ± 20 % variieren. Inzwischen haben
sich automatisierte bildgestützte Zellzählsysteme
wie z. B. CEDEX durchgesetzt, weil damit präzisere
Ergebnisse erzielt werden. Um Informationen zum
Grad der Apoptose oder der Zellzyklusverteilung zu
erhalten, kann die Durchflusszytometrie (flow cyto-
metry) eingesetzt werden [29, 50]. Durch entspre-
chende Probenaufbereitung kann mit dieser vielsei-
tigen Methode unter anderem auch der intrazelluläre
pH-Wert, die Proteinsekretion, der Ionenfluss und
die Chromosomenzahl bestimmt werden. Diese
Messtechnik ist jedoch relativ aufwendig und damit
für ein Routine-Monitoring nur bedingt geeignet.
Die für das Prozessmonitoring bzw. die Kultur-
führung relevanten Nährstoffe und Stoffwechselpro-
dukte können ausreichend genau und zuverlässig
off-line mittels enzymatischer und photometrischer
Methoden bestimmt werden. Dazu können Analy-
senautomaten eingesetzt werden, die für klinisch-
chemische Routinetests entwickelt wurden, wie z. B.
Blutgasanalysatoren für CO2, O2 und Analysengeräte
für Glucose, Lactat, Glutamin, Ammonium, Amino-
säuren und andere Metabolite.
Die Bestimmung der Produktkonzentration
(Titer) erfolgt mit spezifischen immunologischen
Methoden wie ELISA (enzyme-linked immunosor-
bent assay), Oberflächenplasmonenresonanzspek-
troskopie (surface plasmon resonance spectroscopy,
SPR-Spektroskopie) [46] und chromatographischen
Methoden wie HPLC.
Auf die Mess- und Regeltechnik wird in 7 Kap. 8
vertieft eingegangen.
12.5.5 Methoden der Zellabtrennung
Für die Abtrennung der Zellen von der produkthal-
tigen Zellkulturflüssigkeit werden bei Suspensions-
kulturen die Filtration und die Zentrifugation einge-
setzt. Je nach Kultivierungsmaßstab werden einmal
verwendbare Membran- oder Tiefenfilter (bis ca.
1000 L) oder mehrfach verwendbare Querstrom-Mi-
krofiltrationssysteme eingesetzt. Dabei kommen ver-
schiedene Membrantypen aus Polymeren, wie z. B.
Propylen, PVDF, oder aus Keramik (7 Kap. 9) zum
Einsatz. Die Produktausbeuten sollten bei allen Ver-
fahren bei über 90 % liegen.
Die Tiefenfilter werden im dead-end-Filtrations-
modus betrieben, wobei die Filtertypen hinsichtlich
Abscheiderate und Filterfläche prozessspezifisch
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
. Abb. 12.5  Large scale-
Mikrofiltrationsanlage zur
Zellabtrennung
ausgewählt werden müssen. Bei den Mikrofiltersys-
temen werden sowohl Hohlfasermodule als auch
Flachbettkassetten im Tangential-Fluss-Modus mit
Porenweiten zwischen 0,2 und 0,65 µm eingesetzt
(. Abb. 12.5). Die Filterfläche richtet sich nach dem
Erntevolumen und liegt im Bereich von ca. 10‒15 m2
pro m3 Kulturvolumen. Meist folgt noch eine Klärfil-
tration mit Tiefen- und Membranfiltern, um die Par-
tikellast für den initialen Aufarbeitungsschritt weiter
zu minimieren.
. Abb. 12.6  Großtechnischer
Zellseparator (mit freundlicher
Genehmigung der Fa. Westfalia)
519 12
Die Zellabtrennung bei Hochzelldichtekultu-
ren oder bei Kulturen mit geringer Vitalität stößt
zunehmend an die Grenzen der Leistungsfähigkeit
der Mikrofiltration und kann zu Ausbeuteverlusten
führen. Deshalb wird inzwischen weitgehend die
Zentrifugation eingesetzt. Dies wurde möglich durch
die Entwicklung von speziellen und besonders zell-
schonenden Zentrifugen, die inzwischen für alle rele-
vanten Maßstäbe erhältlich sind (. Abb. 12.6). Neben
der größeren Leistungsfähigkeit bietet die Zentrifuge
 520 R. Kempken et al.
den Vorteil, dass sie besser zu reinigen ist, sterilisiert
werden kann und die Zellen im once-through-Modus
nur einmal die Zentrifuge durchlaufen und damit das
Risiko der Zellschädigung und Verkeimung geringer
ist. Bevor das produkthaltige Zentrifugat aufgerei-
nigt werden kann, muss auch hier die Partikelfracht
mittels Klärfilter reduziert werden.
Aufgrund des Feststoffgehalts von Säugerzellkul-
turen, der etwa 1‒10 % beträgt, verwendet man vor-
zugsweise Tellerseparatoren für die Zentrifugation.
Die Funktionsweise der Tellerseparatoren, deren sca-
le-up z. B. über die Kennzahl Q/Σ (das Verhältnis
von Durchflussrate zur äquivalenten Klärfläche) und
die Herleitung der Formel für Σ sind ausführlich in
7 Abschn. 9.1 beschrieben.
Durch die wesentlich höheren Zelldichten, die
inzwischen erreicht werden, stößt auch die Zentri-
fugation plus Klärfiltration an ihre Grenzen. Deshalb
werden zunehmend Filtrationshilfen wie z. B. syn-
thetische Polymere eingesetzt, die die Zellabtren-
nung und Klärfiltration effizienter machen.
Eine spezielle Technologie ist die EBA-Chroma-
tographie (expanded bed adsorption chromatogra-
phy; 7 Abschn. 9.3.7). Sie vereinigt die Zellabtren-
nung und initiale Proteinreinigung in einem einzigen
Prozessschritt. Dabei wird die Zellkultur von unten
durch eine mit einem spezifischen Adsorber gefüllte
12 Chromatographiesäule im fluidized bed-Modus gelei-
tet. Während das Produkt an den Adsorber bindet,
werden die Zellen ausgewaschen. Anschließend wird
der Adsorber sedimentiert und das Produkt eluiert
[12]. Diese Methode hat sich im Großmaßstab nicht
durchgesetzt.
12.6 Prozessentwicklung und
Scale-up
Für eine erfolgreiche großtechnische Produktion
von Biopharmazeutika mit Säugetierzellkulturen
(7 Abschn. 12.7) ist die Entwicklung eines geeigne-
ten Herstellverfahrens erforderlich.
Diese Entwicklung verläuft in der Regel in fol-
genden Schritten:
55 Entwicklung eines Basis-Verfahrens im
Labormaßstab;
55 Bestätigung (consolidation) des Verfahrens in
kleinem technischen Maßstab (z. B. 80 L);
55 Maßstabsvergrößerung (Scale-up) des
Verfahrens und Herstellung von Produkt für
klinische Studien im technischen Maßstab
(z. B. 2000 L);
55 bei Bedarf Optimierung des Verfahrens im
Labormaßstab, im Hinblick auf die kommer-
zielle Produktion;
55 Übertragung (transfer) des optimierten
kommerziellen Verfahrens in eine Produk-
tionsanlage (z. B. 10.000 L) sowie Charakte-
risierung des Verfahrens (hauptsächlich im
Labormaßstab);
55 Festlegung der Betriebsbedingungen für das
kommerzielle Verfahren.
Weitere Arbeiten und Anforderungen für die kom-
merzielle Nutzung von Herstellverfahren mit Säuge-
tierzellkulturen sind in 7 Abschn. 12.7.2 beschrieben.
Im Folgenden wird auf die einzelnen Elemente
der Entwicklung eingegangen: Aufgaben und Kon-
zepte der Prozessentwicklung, Charakterisierung
der Zellkulturverfahren, Klassifizierung von Pro-
zessparametern und Festlegung der Betriebsbedin-
gungen sowie Prozesstransfer und Maßstabsvergrö-
ßerung. Außerdem werden verschiedene Methoden
für die Prozessentwicklung vorgestellt.
12.6.1 Aufgaben der
Prozessentwicklung
Die Entwicklung von Herstellprozessen für tierische
Zellkulturen ist eine komplexe Aufgabe, die nur im
Zusammenwirken vieler Fachdisziplinen gelingen
kann. Im Folgenden werden die Herstellschritte mit
Beteiligung tierischer Zellkulturen betrachtet, die
häufig mit dem Begriff upstream bezeichnet werden
(7 Abschn. 12.7.1).
Für die Prozessentwicklung im upstream müssen
die Elemente Expressionssystem, Wirtszelllinie,
Medienoptimierung, Zellkultivierungsmethode,
Betriebsbedingungen der Fermentation und Pro-
zessführung (z. B. Zugabe von Nährstoffen, pH-Än-
derungen) gut aufeinander abgestimmt werden. Das
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
entwickelte Zellkulturverfahren bildet wiederum die
Basis für die Entwicklung der Ernte-, Aufarbeitungs-,
Formulierungs- und Abfüllverfahren sowie der benö-
tigten analytischen Methoden zur Charakterisierung,
Freigabe- und Stabilitätsprüfung des Produktes. Je nach
Anforderungen an Zeit, Kosten und Qualität werden
die arbeitsintensiven Teile der Entwicklung entweder
in frühen oder späten Stadien des Lebenszyklus eines
Produktes durchgeführt. Grundlegende Prozessände-
rungen im upstream sollten in späten Entwicklungs-
phasen mit Sorgfalt und Augenmaß umgesetzt werden,
denn die nachfolgenden Einheiten Wirkstoffaufarbei-
tung, Endproduktherstellung und Qualitätskontrolle
benötigen für die Entwicklung und Charakterisierung
ihrer eigenen Herstellschritte bzw. der Analytik sowie
Produktcharakterisierung ein repräsentatives und
reproduzierbares Material aus dem upstream.
12.6.2 Quality by design-Konzept bei
der Prozessentwicklung
Die Prozessentwicklung wird aktuell bevorzugt nach
dem Prinzip QbD (quality by design) geplant, durch-
geführt und dokumentiert. Quality by design ent-
stand aus dem Verständnis, dass die Qualität eines
Produktes in das Verfahren hinein entwickelt werden
muss. Schon in frühen Phasen der Entwicklung neuer
Arzneimittel wird ein hinreichendes Verständnis der
Herstell- und Kontrollprozesse gefordert [116]. Ein
Herstellverfahren baut demnach auf einem tiefge-
henden Prozessverständnis (process understanding)
und auf einem risikobasierten Ansatz (risk-based
approach; 7 Abschn. 12.6.5) auf. Mit diesen beiden
Komponenten sollen die Untersuchungen auf die
Einflussgrößen ausgerichtet werden, die relevant für
die Produktqualität und Prozessleistung sind, und
dadurch eine solide Grundlage für einen gut kon-
trollierbaren und robusten Prozess gelegt werden.
QbD wird von der amerikanischen Gesund-
heitsbehörde FDA (U.S. Food and Drug Administra-
tion) [33] nachhaltig gefördert und in ihrem Bericht
„Pharmaceutical cGMPs for the 21st Century: A
Risk-Based Approach“ beschrieben [36].
Das Prozessverständnis wird im Laufe der Pro-
zessentwicklung und -charakterisierung ständig
521 12
durch neue Ergebnisse und Erkenntnisse aufgebaut
und ergänzt. Am Ende der Entwicklung und Cha-
rakterisierung des Herstellverfahrens wird ein mul-
tidimensionaler Versuchsraum oder Rahmen (design
space) definiert. Solange der Prozess in diesem design
space betrieben wird, sollen Produkt- und Prozess-
qualität den festgelegten Anforderungen entspre-
chen [28].
Während der kommerziellen Nutzung des Pro-
zesses wird das Prozessverständnis kontinuierlich
erweitert und kann gleichzeitig bereits zur Über-
prüfung (monitoring) der Prozessrobustheit (process
robustness) dienen. Damit ist eine wertvolle Wissens-
basis für den gesamten Lebenszyklus (life cycle) eines
Produktes 7 Abschn. 12.7.2) entstanden.
12.6.3 Entwicklung und Optimierung
von Zellkulturverfahren
Die Prozessentwicklung umfasst alle Bereiche, die
einen Einfluss auf die Erzeugung des Produktes,
z. B. eines therapeutischen Wirkstoffes, haben. Dies
beginnt bei den Expressionssystemen und Nährme-
dien und reicht bis zum Abschluss der Zellkultivie-
rungen einschließlich Zellernte.
Expressionssysteme
Die Eigenschaften und Leistungen der Expressions-
systeme und Wirtszelllinien wurden bereits in den
7 Abschn. 12.1 und 12.2 beschrieben und verglichen.
Beiträge der Molekularbiologie und der Zellbiolo-
gie für die Prozessentwicklung sind unter anderem:
55 Entwicklung leistungsfähiger Vektoren zur
Expression des Produktes;
55 Modifizierung genetischer Elemente, z. B. zur
Verbesserung der Transkription;
55 Optimierung von Methoden zur Transfektion
(7 Abschn. 12.1.2);
55 Targeted integration (7 Abschn. 12.1.2);
55 Optimierung der molekularen Stoffwech-
selwege zur Regulierung von Wachstum,
Transportvorgängen und Zelltod;
55 Screening-Methoden zur schnellen Auswahl
von gut produzierenden Zellklonen;
 522 R. Kempken et al.
55 Auswahl von Zellklonen mit guter phäno- und
genotypischer Stabilität;
55 Auswahl von Zellklonen, die Produkt mit
akzeptabler Qualität erzeugen;
55 Optimierung der Ausschleusung des Produktes
in das umgebende Kulturmedium.
Zellkulturmedien
Für verschiedene Zelllinien können die Ansprüche
an Zusammensetzung und Verfügbarkeit von Medien
und Zugaben sehr unterschiedlich sein (z. B. Feed-
Zugaben bei fed-batch-Verfahren; 7 Abschn. 12.5.3).
Eine Medienentwicklung, die spezifische Ansprü-
che der Produktionszelllinie erfüllt und die Limi-
tierung wesentlicher Nährstoffe und Cofaktoren
vermeidet, bietet einen wertvollen Beitrag zur Pro-
zessoptimierung und zur weitgehenden Ausschöp-
fung des Potenzials von Zelle und Herstellverfahren
(7 Abschn. 12.3.1).
Zellkulturverfahren
Ein leistungsfähiges, reproduzierbares und robustes
Zellkulturverfahren stellt ein weiteres Element für
die erfolgreiche Entwicklung eines Biopharma-Pro-
duktes dar. Die anwendbaren Zellkultivierungsme-
12 thoden und dafür geeignete Bioreaktoren wurden
bereits in 7 Abschn. 12.4 beschrieben. Für Hoch-
zelldichte-Kultivierungen mit hoher Produktivität
haben sich vor allem die fed-batch-Verfahren und die
Perfusionsverfahren (7 Abschn. 12.5.3) durchgesetzt.
Neben der Hardware, also Bioreaktoren und
ihre Peripherie, werden ihre Betriebsbedingungen
(z. B. pH-Wert, Regler-Eigenschaften der Prozess-
steuerung) und die Prozessführung (z. B. Tempera-
turprofile, Zugaben) entwickelt und optimiert. Die
Möglichkeiten der Prozessführung, -steuerung und
-überwachung sind in 7 Abschn. 12.5 beschrieben.
Die Entwicklungsarbeiten für Herstellverfahren
mit tierischen Zellkulturen werden hauptsächlich im
Labormaßstab durchgeführt. Für viele Screening-
Arbeiten sind einfache Kultursysteme ausreichend,
z. B. statische Zellkulturflaschen (T-flasks), Schüttel-
kolben (shake flasks), gerührte Kulturflaschen (spinner
flasks), wave bags (7 Abschn. 6.6.1 und 12.4.2) oder
AMBR (ein automatisiertes, miniaturisiertes Bioreak-
torsystem (z. B. 15 mL oder 250 mL Volumen), das die
Arbeitsweise klassischer Bioreaktoren im Labormaß-
stab abbildet). Zur Entwicklung und Optimierung
des Fermentationsverfahrens werden Bioreaktoren
im Labormaßstab eingesetzt, die analog zu den Bio-
reaktoren zur großtechnischen Produktion über die
Regelung und das Monitoring wichtiger Führungs-
größen und Prozessparameter verfügen.
Bei der Prozessentwicklung und -optimierung
wird unter anderem der Einfluss folgender Parame-
ter untersucht:
55 Zellparameter (z. B. Zelldichte);
55 physikalische Parameter (z. B. pH-Wert);
55 biochemische Parameter (z. B. Gehalt an
Nährstoffen und Stoffwechselprodukten);
55 prozesstechnische Parameter (z. B.
Rührerdrehzahl);
55 Zusammensetzungen, Mengen und Zeitpunkte
von Zugaben (z. B. Nährstoffkonzentrate,
Puffersubstanzen);
55 Maßnahmen zur Stimulierung und Steigerung
der gewünschten Leistung der tierischen Zelle
(z. B. Produktbildung).
Einzelheiten zur Maßstabsvergrößerung (Scale-up)
und zur Übertragung von Herstellverfahren aus der
Entwicklung in die kommerzielle Produktion werden
in 7 Abschn. 12.6.6 angegeben.
12.6.4 Charakterisierung von
Zellkulturverfahren
Eine Charakterisierung von Zellkulturverfahren
für die biopharmazeutische Wirkstoffherstellung
sollte als Grundlage für die Prozessvalidierung
(7 Abschn. 12.7.2) vor Markteinführung des Produk-
tes bzw. Herstellverfahrens durchgeführt werden. Sie
dient der Prozessrobustheit und sichert die Grenzen
ab, in denen der künftige Produktionsprozess ver-
laufen soll. Die Prozesscharakterisierung wird im
Labormaßstab mithilfe eines geeigneten Scale-down-
Modells durchgeführt.
Scale-down-Modell
Vor Beginn der eigentlichen Charakterisierungs-
experimente wird das Scale-down-Modell etabliert
und verifiziert [101]. Hierfür wird geprüft, ob das im
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
Großmaßstab definierte Verfahren in den wesent-
lichen die Prozessleistung und die Produktqualität
maßgeblich beeinflussenden Parametern im Labor-
maßstab abgebildet werden kann (7 Abschn. 6.3.1.5).
Das Scale-down-Modell sollte auch auf wesentliche
Änderungen der „normalen“ (erwarteten) Prozess-
parameter ähnlich reagieren wie der Prozess im kom-
merziellen Maßstab. Einflüsse von vorangehenden
und unterstützenden Prozessschritten, wie z. B. Roh-
stoffe und Medien, Vorkulturführung und Prozess-
technik, auf die zu untersuchende Produktionsstufe
sollten minimiert werden.
Experimente zur
Prozesscharakterisierung
Auf Basis einer Risikoanalyse (7 Abschn. 12.6.5) werden
im Scale-down-System die Studien zur Prozesscharak-
terisierung und Prozessrobustheit durchgeführt. Sie
finden als einzelne Experimente oder als DoE-Ansätze
statt (7 Abschn. 12.6.5). Die Prozessparameter (input
parameter) werden mit Absicht unterhalb und ober-
halb der normalen Betriebsbedingungen eingestellt.
Als Kontrollen dienen Läufe unter normalen Betriebs-
bedingungen [74].
Nach Auswertung der Ergebnisse können die
getesteten Betriebsbedingungen jeweils von der
Untergrenze (lower limit) über den Sollwert (set
point) bis zur Obergrenze (upper limit) als PAR
(proven acceptable ranges) bezeichnet werden,
sofern bei den zugehörigen Experimenten die Pro-
zessleistung und vor allem die Produktqualität in
einem akzeptablen Bereich lagen. Bei Ergebnissen
mit nicht akzeptabler Prozessleistung und/oder
Produktqualität war die Akzeptanzgrenze (edge of
. Abb. 12.7  Klassifizierung der
523 12
failure) überschritten (. Abb. 12.7). In diesem Fall
müssen die betroffenen Experimente mit engeren
Betriebsbedingungen (Untergrenze, Obergrenze)
wiederholt werden, um Prozessgrenzen zu finden,
die zu einer akzeptablen Prozessleistung und Pro-
duktqualität führen.
Innerhalb der PAR liegen die NOR (normal ope-
rating ranges). Das kommerzielle Herstellverfahren
sollte unter normalen Bedingungen innerhalb der
NOR durchgeführt werden können. Im Falle von
Abweichungen, d. h. Unterschreitung einer Unter-
grenze, Überschreitung einer Obergrenze) können
die Studien zur Prozesscharakterisierung und Pro-
zessrobustheit eine wertvolle Hilfe zur Beurteilung
der Konsequenzen solcher Abweichungen sein.
Klassifizierung der Prozessparameter
Nach Auswertung der Studien zur Prozesscharak-
terisierung werden die Input-Parameter eingeteilt
in kritische Parameter (critical process parameter,
CPP) und nicht-kritische Parameter (non-critical
process parameter). CPP bedeutet hierbei, dass bei
Nichteinhaltung des PAR für diesen Input-Parameter
die kritischen Qualitätsattribute eines Produkts (cri-
tical quality attribute, cQA) gefährdet sein können.
Die non-critical process Parameter können wiede-
rum eingeteilt werden in wesentliche Parameter (key
process parameter, KPP) und nicht-wesentliche Para-
meter (non-key process parameter, non- KPP). KPP
bedeutet hierbei, dass bei Nichteinhaltung des PAR
für diesen Input-Parameter zwar kein Einfluss auf die
Produktqualität gegeben, aber ein negativer Einfluss
auf die Prozessleistung möglich ist. Die non-KPP-
Parameter haben innerhalb der getesteten PAR weder
Prozessparameter: Sollwert (set point, 3URYHQ $FFHSWDEOH5DQJH3$5
target), Bereiche (ranges) und Grenzen
(limits). LL = Untergrenze (lower limit);
UL = Obergrenze (upper limit) 1RUPDO2SHUDWLQJ5DQJH125

6HW 3RLQW
IRULQSXWV
7DUJHW
(GJHRI IRURXWSXWV (GJHRI
)DLOXUH(R) // // 8/ 8/ )DLOXUH(R)
 524 R. Kempken et al.
negativen Einfluss auf die Produktqualität noch auf
die Prozessleistung.
Die Klassen CPP, non-CPP, KPP, non-KPP bezie-
hen sich auf Input-Parameter, d. h. auf Variable oder
Betriebsbedingungen des Herstellverfahrens, die
direkt eingestellt bzw. gesteuert und kontrolliert
werden können. Output-Parameter sind Variable
oder Ausgabewerte des Herstellverfahrens, die nicht
direkt eingestellt, gesteuert oder kontrolliert werden
können, sondern aus der gewählten Prozessfüh-
rung resultieren. Sie zeigen an, dass der Prozess wie
gewünscht abgelaufen ist. Entsprechend gibt es auch
für die Output-Parameter eine Einteilung in kriti-
sche Parameter (critical process indicators, CPI) sowie
wesentliche Parameter (key process indicators, KPI)
und nicht-wesentliche Parameter (non-key process
indicators, non-KPI).
Festlegung der Betriebsbedingungen
Wenn die Studien zur Prozesscharakterisierung
ausgewertet sind und die Einteilung der Parame-
ter betreffend Auswirkung auf Produktqualität und
Prozessleistung erfolgt ist, werden das Prozessformat
und die Betriebsbedingungen für das kommerzielle
Herstellverfahren festgelegt. Die hierbei festgelegten
Sollwerte (set points), NOR und PAR für die jeweili-
12 gen Input-Parameter bilden eine wichtige Grundlage
zur Prozessvalidierung des Zellkulturverfahrens für
die Produktion von Marktware [90].
Überprüfung der Produktqualität
Die upstream-Arbeiten zur Entwicklung und Cha-
rakterisierung von Herstellverfahren sind durch
aussagekräftige Untersuchungen der Produktqua-
lität zu begleiten. Hierfür wird eine Vielzahl analy-
tischer Methoden entwickelt und angewendet. Die
Charakterisierung des Produktes beinhaltet auch
die Analyse und Quantifizierung von Varianten,
Aggregaten und Fragmenten des Produktes sowie
das Verhältnis zwischen seiner Struktur und seiner
biologischen Wirkung. Letztere wird sowohl mit ana-
lytischen Methoden als auch mithilfe nicht-klini-
scher und klinischer Studien untersucht. Zusätzlich
ist die Stabilität des Produktes in der entwickelten
Formulierung unter den vorgesehenen Lagerbedin-
gungen analytisch zu bestätigen. Für die Routine-
produktion und die Freigabe von Produktchargen
wird ein Methodenspektrum verwendet, das einem
Ausschnitt aus dem Spektrum für die Produktcha-
rakterisierung entspricht [23]. . Tab. 12.5 zeigt bei-
spielhaft das umfangreiche Methodenspektrum zur
Qualitätskontrolle und Charakterisierung eines mit-
hilfe tierischer Zellkulturen hergestellten Produktes.
12.6.5 Methoden zur
Prozessentwicklung
Dieses Kapitel erläutert Methoden, die für eine effek-
tive Prozessentwicklung angewendet werden.
Konventionelle Versuchsplanung
Bei der konventionellen Versuchsplanung für Zell-
kultur-Entwicklungsarbeiten wird eine konserva-
tive Strategie verfolgt und hierfür eine Vielzahl von
Experimenten angesetzt. Oft werden jeweils nur ein
bzw. wenige Parameter gleichzeitig geändert, sodass
eine eindeutige Wirkung dieser Änderung(en) auf
die Zellkultur erkannt werden kann. Bei tierischen
Zellen bewegen wir uns allerdings in einem kom-
plexen Netzwerk vieler einander beeinflussender
Faktoren. Dies zeigt schon ein Blick in die Zusam-
menhänge des Zellstoffwechsels [81]. Infolgedessen
führt diese empirische Vorgehensweise zu sehr vielen
Experimenten, die jedoch nur einen beschränkten
Informationsgewinn bringen und vor allem keine
Quantifizierung der Wechselwirkungen verschie-
dener Parameter untereinander gestatten.
Design of Experiments (DoE)
Eine wesentliche Verbesserung gegenüber der kon-
ventionellen Prozessentwicklung wurde mit dem
Prinzip DoE (design of experiments) erzielt, das
weit verbreitet in vielen Industrien genutzt wird
und auf Entwicklungsarbeiten mit Säugetierzellen
übertragen wurde. Während bei der konventionel-
len Versuchsplanung jeweils nur ein Faktor vari-
iert und damit eine direkte Korrelation zwischen
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
525 12

. Tab. 12.5  Analytische Methoden zur Qualitätskontrolle und Charakterisierung von Glykoproteinen, die mithilfe
tierischer Zellkulturen hergestellt wurden

Art der Prüfung Methode

Gehalt/Konzentration UV-Absorption
Proteinbestimmung
Immuno-Quantifizierung
quantitative Aminosäurenanalyse
Aktivität Bioassay in vivo, in vitro
spezifischer Bindungstest
Enzymaktivitätsmessung
Reinheit RP-HPLC
Gelpermeationschromatographie
SDS-Gelelektrophorese
Wirtszellprotein-ELISA
Immunoblot-Verfahren
DNA-Bestimmung
Endotoxin-Bestimmung
Pharmazeutische Qualität Aussehen
Klarheit
Partikelzählung
Rekonstitution
pH, Osmolarität
Kalorimetrie
mikrobiologische Prüfungen
Virus-Prüfungen
Größe/Form Elektrophorese
Gelpermeationschromatographie
Laser-Lichtstreuung
Massenspektrometrie
Form Zirkularer Dichroismus
Epitop-Kartierung
Fluoreszenzspektroskopie
Oberflächenladung Isoelektrische Fokussierung
Kapillargelelektrophorese
Ionenaustauschchromatographie
Struktur/Identität N- und C-terminale Sequenzanalyse
Aminosäurenanalyse
Peptidkartierung
Oligosaccharidkartierung
Massenspektrometrie
 526 R. Kempken et al.
Veränderung der Input-Variablen und dem Einfluss
auf die Output-Variable(n) nachgewiesen wurde,
nutzt der DoE-Ansatz die statistische Versuchspla-
nung, indem mehr als eine Input-Variable gleich-
zeitig verändert wird. Dadurch wird zum einen die
Anzahl der erforderlichen Versuche signifikant redu-
ziert, zum anderen können multivariate Analysen
durchgeführt und damit auch Wechselwirkungen
zwischen verschiedenen Input-Parametern erkannt
werden.
Bei der praktischen Durchführung von DoE-
Studien wird eine Sammlung (set) von Experimen-
ten in wohlgeordneten Abständen um die Ausgangs-
situation, d. h. Standard-Bedingung bzw. Kontrolle,
gruppiert und dieses Set gemeinsam mit den Kon-
trollen durchgeführt. Diese strukturierte und sys-
tematische Vorgehensweise hilft, Wechselwirkun-
gen der untersuchten Faktoren zu erkennen und zu
bewerten [71].
Je nach Anzahl und Art der Faktoren können
die DoE-Ansätze in die drei Kategorien „Screening“,
„Optimierung“ und „Robustheitsprüfung“ eingeteilt
werden. Nach Auswertung des ersten experimentel-
len Sets kann um das beste erhaltene Ergebnis herum
ein neues Set festgelegt und experimentell geprüft
werden. In dieser Weise gelangt man relativ zügig zu
einem Optimum für den jeweils aufgespannten Ver-
12 suchsraum [31].
Bei großer Anzahl von Faktoren kann es erfor-
derlich werden, eine unvollständige Matrix von Fak-
toren zu untersuchen (fractional factorial design), um
die Anzahl der Experimente gering zu halten. Diese
elegante Variante hat allerdings den Nachteil, dass
die Ergebnisse der Experimente nicht mehr einzel-
nen Ursachen (factors) eindeutig zugeordnet werden
können. Es gibt dann eine Vergesellschaftung mehre-
rer Faktoren (confounding) für die meisten der expe-
rimentellen Ergebnisse (effects). Um dieses „confoun-
ding of effects“ aufzulösen, sind weitere Experimente
nötig. Dennoch ist diese Vorgehensweise für die
Prüfung vieler Faktoren effektiver als eine experi-
mentelle Untersuchung der vollständigen Matrix
(full factorial design).
Um die Erkenntnisse aus der Prozessoptimie-
rung abzusichern, ist eine Überprüfung der opti-
mierten Parameter im Labormaßstab wichtig. Diese
Maßnahme wird oft als Prozessfixierung oder Kon-
solidierung bezeichnet.
Proteomanalyse
Für einige Arbeiten zur Prozessentwicklung ist die
Proteomanalyse (Proteomik, proteomics) anwend-
bar. Dabei geht es um eine möglichst vollständige
und systematische Erfassung von Genprodukten,
d. h. Proteinen und Peptiden, mit der Absicht, ihre
Eigenschaften, ihre Funktion und ihre Regulierung
in komplexen biologischen Systemen zu erfassen
und zu verstehen [91]. Diese Systeme können Zellen,
Organe oder ganze Organismen sein. Durch geeig-
nete analytische Techniken, z. B. eine Kapillarelekt-
rophorese zur Trennung der Substanzen der Probe
mit nachfolgender Massenspektroskopie zur Iden-
tifizierung der Molekülgröße, können die Konzen-
tration und die Masse von mehr als 1000 Peptiden
und Proteinen gleichzeitig in einer einzigen Analyse
bestimmt werden [53]. Durch Vergleiche mit Mar-
ker-Substanzen oder durch Interpretation der Mole-
kulargewichte sind manche Substanzen sogar ein-
deutig identifizierbar. Für die Interpretation der
Proteomanalyse-Daten ist eine umfangreiche statis-
tische Auswertung nötig.
Die Proteomanalyse wird beispielsweise zur
Diagnose von Erkrankungen oder von Krank-
heitsverläufen verwendet [53]. Sie kann ebenfalls
für Prozessoptimierungen mit tierischen Zellkul-
turen eingesetzt werden. Auch bei noch komple-
xeren Aufgaben wie der Systembiologie ( 7 Kap.
13), die sich um das vollständige und quantitative
Verständnis ganzer biologischer Systeme bemüht,
findet sie Anwendung. Hierfür werden Ergebnisse
der Proteomanalyse und ergänzender Techniken
wie Genomik (genomics; Analyse der DNA-Struk-
tur, DNA-Funktion und Genaktivität), Transkripto-
mik (transcriptomics; Analyse der Genexpression),
Metabolomik (metabolomics; Analyse der Stoff-
wechselaktivität) in Verbindung mit aufwendigen
statistischen Auswerteverfahren und Simulationen
angewendet [91].
Für die Prozessentwicklungen sind zeitabhän-
gige Verläufe und Änderungen sowie induzierbare
und regulierbare Vorgänge besonders interessant.
Wenn also Proben im zeitlichen Verlauf einer Kul-
tivierung gemessen werden, können Änderungen
der Genexpression (upregulation, downregulation)
oder die Bildung und der Verbrauch von Genpro-
dukten (Proteine, Peptide, Zwischenprodukte) ver-
folgt werden. Üblicherweise werden Ergebnisse der
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
Proteomanalyse als zweidimensionale Polypep-
tidkarten dargestellt. Beim oben genannten Bei-
spiel der Kombination von Kapillarelektropho-
rese (CE) und Massenspektroskopie (MS) wird auf
der x-Achse die Laufzeit der CE-Analyse und auf
der y-Achse das Molekulargewicht der MS-Ana-
lyse aufgetragen. Durch diese Art der Darstellung
werden Muster (screens) von Genprodukten in
Feldern (Arrays) erzeugt. Im Idealfall wird jedes
einzelne Genprodukt durch einen spezifischen
Punkt (dot) in der Matrix, definiert durch seine
Position im Array, gekennzeichnet und identifi-
zierbar. Durch den Vergleich verschiedener Mes-
sungen mit Proben aus verschiedenen Stadien der
Zellkultivierung, Proben bei verschiedenen Kultur-
bedingungen sowie Proben aus unterschiedlichen
Kampagnen lassen sich Änderungen bei den Gen-
produkten erkennen, quantifizieren und manch-
mal sogar einem phänotypisch sichtbaren Effekt
zuordnen.
Die Verstärkung oder Verminderung der Intensi-
tät von dots und das Auftreten neuer bzw. Verschwin-
den bisher vorhandener dots gibt Auskunft über
Änderungen (profiling) auf molekularer bzw. zellbio-
logischer Ebene infolge der absichtlichen Änderung
von Prozessbedingungen oder infolge unbeabsichtig-
ter Auslöser durch prozesstechnische Veränderun-
gen. Diese Veränderungen geben wertvolle Hinweise
auf Effekte bei Versuchen zu Screening und Optimie-
rung von Zellkulturprozessen.
Risk-based Approach, Risikoanalyse
Der risikobasierte Ansatz ist ein wesentliches
Element des QbD-Prinzips (7 Abschn. 12.6.2). Die
Risiken für den vorgesehenen Prozess werden iden-
tifiziert und bewertet. Zunächst sollen alle Parameter
erkannt werden, die kritisch für die Produktqualität
sind (7 Abschn. 12.6.4). Für die kritischen Parame-
ter ist dann sicherzustellen, dass ihre Variabilität im
Prozess beherrscht werden kann. Schließlich wird die
erforderliche Produktqualität im design space zuver-
lässig eingestellt. Die Risikoanalyse ist im folgenden
Abschnitt erklärt. Sie kann sich sowohl auf den anzu-
wendenden Prozess als auch auf die Gegebenhei-
ten der Herstellanlage beziehen, in der der Prozess
durchgeführt werden soll. Mithilfe der Risikoana-
lyse können die Bemühungen zur Entwicklung und
527 12
Charakterisierung von Herstellverfahren auf diejeni-
gen Themen und Bereiche gelenkt und konzentriert
werden, die am ehesten Einfluss auf die Produkt- und
Prozessqualität haben.
z z Risikoanalyse (FMEA, HACCP, HAZOP)
Vor Beginn der eigentlichen Charakterisierungs-
experimente sollte vorab eine Risikoanalyse bzw.
Fehleranalyse für das Verfahren durchgeführt
werden. Es gibt verschiedene Methodiken, z. B.
FMEA (failure mode and effects analysis), HACCP
(hazard analysis and critical control points), HAZOP
(hazard and operability study). Alle diese Metho-
den dienen dem Ziel, die Auswirkung der Ver-
änderung von Parametern auf das Verhalten des
Prozesses und letztlich auf die Produktqualität zu
bewerten. Für Zellkulturprozesse wird häufig die
FMEA angewendet und für eine Risikoabschätzung
(risk assessment) der Robustheit des Herstellver-
fahrens genutzt. Die FMEA soll offenlegen, welche
Prozessparameter (Input-Parameter) bei erhebli-
cher Abweichung vom Sollwert ein Risiko für die
Prozess- und/oder Produktqualität darstellen. Sie
bildet außerdem einen systematischen und doku-
mentierten Nachweis, welche Input-Parameter in
Studien zur Prozesscharakterisierung untersucht
werden sollen.
Bei der FMEA wird bewertet, wie schwerwie-
gend sich die Abweichung vom Sollwert voraus-
sichtlich auf die Produkt- oder Prozessqualität aus-
wirkt (severity, S), wie häufig diese Abweichung
voraussichtlich auftreten kann (occurence, O) und
wie gut und zuverlässig diese Abweichung vorab
erkannt werden kann (detection, D). Das Produkt
S · O · D wird als RPN (risk priority number) bezeich-
net und dient zur Gewichtung der betrachteten
Input-Parameter.
Wenn jeweils ein großes Arbeitspaket der Pro-
zessentwicklung bzw. -optimierung abgeschlossen
und das Prozessverständnis erweitert wurde, emp-
fiehlt es sich, die Risikoanalyse zu wiederholen.
Damit wird die weitere Arbeit zur Prozessverbes-
serung auf diejenigen Aspekte gelenkt, die für Pro-
duktqualität und Prozessqualität besonders wichtig
sind. Durch mehrere Phasen von Untersuchungen
und Risikoanalysen kann die Prozessentwicklung
und -charakterisierung effizient und im Sinne von
QbD gestaltet werden.
 528 R. Kempken et al.
Plattform-Technologien
Für die frühen Phasen der Prozessentwicklung ist
es vorteilhaft, bei den Technologien und Metho-
den auf Plattformen aufzubauen [16, 20]. Idealer-
weise werden viele verschiedene Produktkandida-
ten mit der gleichen Wirtszelllinie und dem gleichen
Expressionsvektor als Plattform entwickelt. Bei-
spiele sind das GS-Expressionssystem [5] und das
BI-HEX-Expressionssystem [65]. Für die jeweilige
Expressions-Plattform kann eine passende Medium-
Plattform entwickelt werden. Sie kann auf kommer-
ziellen Medien aufbauen oder maßgeschneidert für
die betreffende Zelllinie und den Zellkulturprozess
abgestimmt sein. Der Zellkulturprozess ist ebenfalls
als Plattform-Prozess entwickelbar.
Die Nutzung dieser Plattform-Elemente ermög-
licht ein gutes Zusammenwirken der einzelnen Kom-
ponenten, etwa in der Art, wie Stücke eines Puzzles
sich zu einem Gesamtbild zusammenfügen. In vielen
Fällen funktioniert die Anwendung der Plattformen
zufriedenstellend bis gut. Dies verkürzt die Arbei-
ten für frühe Entwicklungsstufen und reduziert die
Kosten. Wenn anhand präklinischer und erster kli-
nischer Studien die Verträglichkeit und Wirksam-
keit des Wirkstoffmoleküls (proof of concept) abseh-
bar ist, erfolgt in der Regel eine Prozessoptimierung
des Basisverfahrens mit dem Ziel, ein leistungsfähi-
12 ges und robustes kommerzielles Herstellverfahren
zu entwickeln [23].
12.6.6 Prozesstransfer und
Maßstabsvergrößerung
Mit Prozesstransfer wird die Übertragung eines
Prozesses von einer Anlage in eine andere Anlage
bezeichnet. In vielen Fällen ist damit auch eine Ver-
änderung des Maßstabs verbunden, teilweise auch
eine Änderung der Technologie, wie z. B. der Wechsel
von flexiblen wave-Fermentern auf Edelstahlfer-
menter oder von Filtration als Erntetechnologie auf
die Zentrifugen-Technologie. Während des Lebens-
zyklus eines Prozesses ( 7 Abschn. 12.7.2) finden
diverse Prozesstransfers statt:
55 Transfer vom Kleinmaßstab, in dem die
ersten Versuche stattfinden (z. B. Klein-
fermenter im Maßstab bis zu ca. 5 L), in den
80-Liter-Maßstab;
55 der Transfer vom 80-Liter-Maßstab in den
Pilotmaßstab (hier der 2000-Liter-Maßstab);
55 der Transfer in den Produktionsmaßstab (hier
der 10.000-Liter-Maßstab).
Insbesondere Prozesstransfers, die mit einer Maß-
stabsvergrößerung (Scale-up) einhergehen oder bei
denen sich die Anlagen unterscheiden, sind poten-
ziell kritisch und mit entsprechender Sorgfalt zu
planen. Die 7 Kap. 5 und 6 beschreiben die grundle-
gende physikalische Problematik der Maßstabsver-
änderung sowie die Lösungsansätze. Bei der Kulti-
vierung von Säugetierzellen kommt als zusätzliche
Komplexität das Verhalten der Zellen hinzu, die auf
die in unterschiedlichen Maßstäben vorherrschen-
den Bedingungen unterschiedlich reagieren können.
Ein Beispiel ist die Durchmischung: Mit zuneh-
mender Größe des Fermenters erhöht sich bei gleich
bleibendem Leistungseintrag auch die Mischzeit;
dies ergibt sich aus den in 7 Kap. 6 gezeigten Korre-
lationen (siehe auch . Abb.  6.11). Wenn Reynolds-
zahl Re bzw. Leistungseintrag P in den verschiede-
nen Maßstäben gleich gehalten werden, so ist doch
der Rührerdurchmesser d in den größeren Reakto-
ren größer und damit die Drehzahlen n kleiner. Bei
gleich bleibender Mischzeitkennzahl NM bedeutet
dies, dass sich wegen · n = NM die Mischzeit · erhöht.
Damit halten sich die Zellen in großen Fermentern
längere Zeit in schlechter durchmischten Zonen auf
als in kleinen Fermentern (7 Abschn. 6.1.5). In diesen
schlechter durchmischten Zonen treten eher Sauer-
stoffverarmungen bzw. CO2-Anreicherungen auf als
in den gut durchmischten Zonen, und diese unter-
schiedlichen Umgebungsbedingungen können auch
die Funktion des Minireaktors „Zelle“ beeinflussen.
In 7 Kap. 5 sind diese Transportvorgänge ausführ-
lich dargestellt.
Für jeden Prozesstransfer sind die Prozessbedin-
gungen in der neuen Anlage im Detail zu fixieren.
Prozessspezifische Parameter werden nach Möglich-
keit konstant gehalten, während reaktorspezifische
Parameter in der Regel angepasst werden müssen.
Wenn Parameter verändert werden, muss hierfür
eine Rationale vorliegen. Beim oben angeführten
Beispiel der Rührung werden unter anderem der
Leistungseintrag oder die Rührerspitzengeschwin-
digkeit als Scale-up-Kriterien verwendet. Für den
Fall, dass der spezifische Leistungseintrag konstant
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
gehalten wird, muss in Abhängigkeit vom Rührer-
durchmesser und der Begasungsrate die Drehzahl
angepasst werden.
Neben der physikalischen Bewertung ist eben-
falls eine Bewertung des biologischen Systems
erforderlich. Es wird geprüft, ob bereits Transfer-
erfahrungen mit der verwendeten Zelle bzw. dem
verwendeten Vektor vorliegen oder ob dies der erste
Fall ist, in dem ein solcher Transfer erfolgt; des Wei-
teren, ob die Zelle empfindlich auf Veränderungen
ihres Umfelds reagiert, was sich in einem veränder-
ten Prozessverhalten oder veränderter Produktqua-
lität niederschlagen kann. Abhängig von der Bewer-
tung all dieser Parameter kann ein Transfer mit wenig
Absicherung erfolgen, während bei Änderungen mit
höherem Risiko unter Umständen erst Transfer-
Läufe ‒ auch engineering runs genannt ‒ zur Absi-
cherung durchgeführt werden, bevor das Verfahren
im neuen Maßstab endgültig fixiert wird. Diese Absi-
cherung wird umso wichtiger, je weiter man sich auf
dem Weg von der Entwicklung eines Prozesses hin
zur Zulassung eines Produktes bewegt.
12.7 Großtechnische
biopharmazeutische Produktion
Der großtechnische Einsatz der Säugerzelltechnik
konzentriert sich auf die pharmazeutischen Anwen-
dungen, im Wesentlichen die Herstellung von Arz-
neimitteln und Impfstoffen. In . Abb. 12.8 ist die
Prozesskette zur Produktion eines Arzneimittels dar-
gestellt, die aus den zwei großen Blöcken Herstellung
. Abb. 12.8  Prozesskette zur
Herstellung eines biotechnischen
Wirkstoffes und Weiterverarbeitung
zum pharmazeutischen Endprodukt %LRWHFKQLVFKH
:LUNVWRIIKHUVWHOOXQJ
)HUPHQ
WDWLRQ
'LUHNWH$EKlQJLJNHLWEHL3UR]HVVDEOlXIHQ
)XQNWLRQDOJHWUHQQWH(LQKHLWHQ
529 12
des Wirkstoffes (Active Pharmaceutical Ingredient –
API) und Herstellung des pharmazeutischen End-
produktes besteht. Dieses Unterkapitel beschreibt
Aufbau und Betrieb einer großtechnischen Wirk-
stoffanlage zur Produktion von Proteinen für den
therapeutischen Einsatz und adressiert dabei die
relevanten technischen und regulatorischen Aspekte.
Jede großtechnische Produktion muss im Hin-
blick auf Umweltverträglichkeit und Risiken bewer-
tet werden. Die Herstellung von Wirkstoffen in vitro
mithilfe tierischer Zellkulturen ist eine umwelt-
freundliche Technologie. Die Zellen können auf-
grund ihrer natürlichen Eigenschaften nur in saube-
rer, schadstoffarmer und physiologisch verträglicher
Umgebung kultiviert werden. Daher sind in der
Regel sowohl die Rohstoffe als auch die Erzeugnisse
und Reststoffe (Abgas, Abwasser, Zellmasse) der
Zellkultivierung nicht umweltbelastend. Durch Ver-
wendung von Wirtszellen und Vektorsystemen ohne
Gefährdungspotenzial für Mensch und Umwelt, z. B.
entsprechend der Sicherheitsstufe 1 gemäß dem
deutschen Gentechnikrecht, trifft dies auch für die
gentechnisch veränderten Zellen selbst zu.
12.7.1 Aufbau und Organisation einer
großtechnischen biotechnischen
Produktionsanlage
In . Abb. 12.9 ist schematisch der Ablauf einer
konventionellen und sehr häufig kommerziell
angewandten fed-batch-Produktion mit tieri-
schen Zellen in Suspensionskultur dargestellt. Der
%LRSKDUPD]HXWLVFKH3UR]HVVNHWWH
%LRSKDUPD]HXWLVFKH
3URGXNWKHUVWHOOXQJ
3URWHLQ 6WHULO
9HU
&KHPLVFKH )RUPX DEIOOXQJ
SDFNXQJ
$XI OLHUXQJ /\RSKLOL
DUEHLWXQJ VDWLRQ
 530 R. Kempken et al.

Klimatechnik

Upstream Processing Downstream Processing

IPC-Fermentation Zellen
IPC-Proteinchemie
zur
Inakti-
Pr Pr Pr Pr
vierung
Zell- Fermentation Proteinchemische Aufarbeitung Formu-
Ernte
bank lierung
Z
C
Inocu- ZS PL Hitze PL FB
lum 80 L 400 L 2 000 L 10 000 L UF C UF C UF
ZS pH
M M M P P
Medieneinwaage/-herstellung Puffereinwaage/-herstellung

GW Reinst- WfI CIP Prozess- Druckluft Gase

dampf kälte

FB = formulierter Bulk; M = Medium; GW = gereinigtes Wasser; P = Puffer; PL = Produktlösung; Pr = Probe; Wfi = water for injection;
Z = Zellen; ZS = Zellsuspension; UF = Ultrafiltration; C = Chromatographie; IPC = in process control

. Abb. 12.9  Hauptbereiche einer großtechnischen Anlage zur biotechnischen Wirkstoffherstellung im 10.000-Liter-Maßstab

Produktionsbereich ist aufgeteilt in verschiedene, Fermentation

räumlich voneinander getrennte Bereiche, von denen
jeder im Wesentlichen einer Hauptfunktion dient.
Das Upstream Processing besteht aus den Kern-
12 bereichen Zellbank, Inoculum und Fermentation.
Periphere Produktionsbereiche sind Medieneinwaage
(media weighing/dispensing), Medienherstellung
(media preparation, media batching) und IPC-Fermen-
tation (IPC fermentation; IPC = in process control). Die
Zellernte (cell harvest) kann sowohl als Teil der Fermen-
tation, da noch mit Zellen umgegangen wird, als auch
als erster Schritt der Aufreinigung betrachtet werden.
Das Downstream Processing besteht aus den
Kernbereichen proteinchemische Aufarbeitung und
Formulierung. Periphere Produktionsbereiche sind
Puffereinwaage (buffer weighing/dispensing), Puffer-
herstellung (buffer preparation, buffer batching) und
IPC-Proteinchemie (IPC protein chemistry).
Des Weiteren existieren Bereiche für die Gebäu-
detechnik (Klima, Strom), Lager sowie die soge-
nannten Prozess-Utilities, in denen Reinstwasser
(WfI, water for injection), Reinstdampf (clean steam),
gereinigtes Wasser (GW; engl. purified water, PW),
CIP-Anlagen (cleaning in place) untergebracht sind
und die die verschiedenen Produktionsbereiche über
komplexe Rohrleitungssysteme versorgen.
Sämtliche Medien werden zunächst in der Medien-
einwaage gemäß den vorgegebenen Rezepturen für
die verschiedenen Prozessschritte abgewogen. In
der Medienherstellung werden die abgewogenen
Medien in die Medienansatzbehälter eingebracht, in
WfI oder GW gelöst und ggf. physikalische Parameter
wie pH-Wert, Ionenstärke, Osmolarität etc. justiert.
Im Inoculum werden die Zellen zu Beginn in ein-
fachen Kultivierungsgefäßen wie Kunststoff- oder
Glasbehältern kultiviert. Zunächst wird ein Aliquot
aus der Arbeits-Zellbank WCB (7 Abschn. 12.2.1), die
in der Gasphase über flüssigem Stickstoff gelagert
wird, entnommen, aufgetaut und in eine T-Flasche,
einen Schüttelkolben oder einem Spinner im Brut-
raum kultiviert. In der Regel nach zwei bis fünf Tagen
werden die Zellen dann in das nächstgrößere Kulti-
vierungsgefäß, sei es ein Spinner, wave- oder Edel-
stahlbioreaktor transferiert, bis etwa zu einer Grö-
ßenordnung von 10‒20 L.
Diese Kultivierungsgefäße werden als Vorstufen
der Zellvermehrung im Edelstahlfermenter verwen-
det. Die in . Abb. 12.9 dargestellte Anlage besteht aus
den Anzuchtfermentern mit 80 L, 400 L und 2000 L
Nennvolumen sowie Produktionsfermentern mit
10.000 L Nennvolumen, d. h. es liegt ein Scale-Faktor
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
von ca. 5 vor. Die mögliche Verdünnung wird maß-
geblich durch die Einsaatdichte bestimmt, wobei
bei vielen Zelllinien eine Dichte von weniger als 105
Zellen pro Milliliter als kritisch betrachtet wird. Bei
vielen Anlagen für Säugerzellen variiert der Verdün-
nungsfaktor zwischen 3 und 10.
Die Anzuchtfermenter dienen allein dem Zweck,
möglichst schnell hohe Zellzahlen zu erzeugen,
damit der Produktionsfermenter nach möglichst
kurzer Zeit mit einer hohen Einsaatdichte inokuliert
werden kann. Im Produktionsfermenter steht hin-
gegen die Produktgewinnung im Vordergrund, und
die Zellzahl ist nur insofern von Bedeutung, dass bei
gleich bleibender spezifischer Produktivität höhere
Zellzahlen zu höheren Titern führen. In einigen Pro-
zessen wird die letzte Stufe vor dem Produktions-
fermenter als Perfusionsprozess gefahren, um die
Zellzahlen über das Maß hinaus zu erhöhen, das mit
einem reinen fed-batch-Betrieb möglich ist. Teilweise
erfolgt direkt vor dem Transfer in den Produktions-
fermenter ein Medientausch, falls Bestandteile des
Wachstumsmediums oder Stoffwechselprodukte
der Zellen nicht in die Produktionsstufe transferiert
werden sollen.
In der Zellernte werden die Zellen vom Medium
abgetrennt. Hier kommen Membranverfahren (Tan-
gential-Fluss-Filtration und teilweise auch dead-
end-Filtration) sowie Zentrifugation zum Einsatz
( 7   Abschn. 12.5.5 ). Wichtig ist eine schonende
Abtrennung der Zellen, damit der Zellüberstand
nicht zusätzlich mit intrazellulären Proteinen ver-
unreinigt wird, denn all diese Verunreinigungen
müssen im nach geschalteten Downstream Proces-
sing wieder entfernt werden.
Proteinchemische Aufarbeitung und
Formulierung
In der proteinchemischen Aufarbeitung erfolgt der
überwiegende Teil der Reinigung bis hin zu Rein-
heitsgraden von über 99 %. In . Abb. 12.9 ist sche-
matisch ein Aufarbeitungsprozess mit den unter-
schiedlichen Verfahrensschritten dargestellt, im
wesentlichen Chromatographie- und Filtrations-
schritte (7 Abschn. 9.3). Des Weiteren enthält jeder
Aufarbeitungsprozess eines biopharmazeutischen
Produktes Virus-abreichernde bzw. Virus-inakti-
vierende Schritte, damit potenziell im Zellüberstand
enthaltene Viren sicher abgereichert bzw. inaktiviert
531 12
werden und damit die Sicherheit des Produktes
gewährleistet ist. Trotz dieser wirkungsvollen Maß-
nahme zur Arzneimittelsicherheit ist es nicht zuläs-
sig, Fermentationsläufe für die Wirkstoffproduktion
zu verwenden, bei denen tatsächlich Virus nachge-
wiesen wurde. Sollte daher der Zellüberstand vor
Ernte im sogenannten Adventitious Virus Test einen
positiven Befund zeigen, so kann der gesamte Lauf
nicht verwendet werden, unabhängig davon, wie
hoch die Viruskonzentration und wie stark die Viru-
sabreicherung in der Aufarbeitung ist.
Aufarbeitungsverfahren für Proteine aus Säu-
gerzellen enthalten in der Regel als initialen Auf-
arbeitungsschritt eine Konzentrierung, um die
relativ geringe Produktkonzentration zu erhöhen
und die Volumina zu reduzieren. Bei Verwendung
von Chromatographie-Gelen, die hohe Flussraten
erlauben, kann der Zellkulturüberstand auch ohne
vorgeschalteten Konzentrierungsschritt weiter pro-
zessiert werden. Da Säugerzellen-Proteine in vollem
Umfang und in der korrekt gefalteten Form aktiv ins
Medium sezernieren, entfällt der bei Bakterien übli-
cherweise notwendige Schritt des Zellaufschlusses.
Die Hauptreinigungsschritte sind säulenchromato-
graphische Verfahren; die gängigsten sind Ionenaus-
tausch-, Affinitäts-, Hydrophobe Interaktions- (HIC)
und Gelfiltrationschromatographie (7 Abschn. 9.3.7).
Als Filtrationsverfahren kommt einmal die Ultrafil-
tration zum Einsatz, die als Tangential-Fluss-Filtra-
tion mit unterschiedlichem cut-off der Membranen
zwischen 10 und 300 kDa betrieben wird. Sie wird
meist zur Konzentrierung und Umpufferung einge-
setzt. Außerdem kommen spezielle Einweg-Mem-
branfilterkerzen mit Porengrößen bis hinunter zu
20 kDa zur Abreicherung von potenziell vorhande-
nen Viren zur Anwendung [64].
Die Formulierung ist ein von der Aufarbeitung
abgetrennter Bereich, in dem das Protein in die end-
gültige Konzentration bzw. den endgültigen Puffer
gebracht wird. Meist wird eine Ultra-Diafiltration
eingesetzt, teilweise auch ein Chromatographie-
schritt. Alle Virus-abreichernden Schritte sollten
bereits vor der Formulierung erfolgt sein.
Aufteilung in Bereiche
Jedem Raum ist eine Reinheitsklasse zugewiesen,
die sich aus den prozesstechnischen Anforderun-
gen ableitet und deren Einhaltung messtechnisch
 532 R. Kempken et al.
überprüft wird. So stellen beispielsweise die Edel-
stahlfermenter geschlossene Systeme dar, die in situ
gereinigt (cleaning in place, CIP) und sterilisiert (ste-
rilisation in place, SIP) werden können. Im Inocu-
lum hingegen werden Arbeiten am offenen System
durchgeführt. Als Konsequenz aus dem Unterschied
offenes – geschlossenes System folgt, dass im Inocu-
lum höhere Reinheitsanforderungen an die Umge-
bung allgemein und insbesondere an die Arbeiten am
offenen System ‒ nämlich unter einer Sterilwerkbank
(laminar flow hood) ‒ gestellt werden. Unter einer
Sterilwerkbank herrscht die höchste in der Biophar-
mazie übliche Reinheitsklasse vor: Klasse A gemäß
EU-Einteilung; Klasse 100 gemäß FDA-Einteilung ;
ISO 5 gemäß DIN EN ISO 14644-1.
Neben den prozesstechnischen Gründen spielen
aber auch gesetzliche und regulatorische Vorgaben
eine große Rolle für die Auftrennung in Bereiche,
insbesondere:
55 Pharmazeutische Sicherheit (AMG [2],
PharmBetrV [96]),
55 Biologische Sicherheit (GenTG) [41],
55 Arbeitssicherheit (ArbSchG [4], BetrSichV [9]),
55 Umweltsicherheit (BImSchG [11]).
Beispielsweise fordert das Gentechnikgesetz eine
Kennzeichnung und Meldung der Bereiche, in
12 denen mit gentechnisch veränderten Organismen
gearbeitet wird. Dies sind in der Regel die Zell-
bank, das Inoculum, die Fermenter-Bereiche, die
Zellernte und die Zellinaktivierungsanlage. Alle
anderen Bereiche, auch die zum Fermentationsbe-
reich gehörende Medieneinwaage und Medienher-
stellung, fallen nicht unter das GenTG. Eine klare
räumliche Trennung erleichtert die Kennzeichnung
und Registrierung.
Einsatz von Flüssigmedien in Einweg-
Behältnissen
Die in diesem 7 Abschn. 12.7.1 beschriebene fed-batch-
Produktion besitzt ein konventionelles Design in dem
Sinne, dass ein hohes Maß an vertikaler Integration
vorliegt, also weitgehende Eigenfertigung von Medien
und Puffern und wenig Zukauf von fertigen flüssigen
Einsatzstoffen. Inzwischen gibt es einen Trend, ins-
besondere bei kleineren Anlagen, dass fertige Medien
und Puffer von darauf spezialisierten Herstellern in
Einweg-Behältnissen wie Beuteln (bags) hinzugekauft
und zeitnah zum Einsatz geliefert werden. Bei kon-
sequenter Umsetzung dieses Prinzips können nicht
nur Einwaage-, Puffer- und Medienherstellungsbe-
reiche signifikant verkleinert werden, sondern es
entfallen viele Rohrleitungen, da die Beutel direkt
an den Ort ihres Einsatzes gebracht werden und die
Flüssigkeit über an den Beuteln befestigte Einweg-
Schläuche transferiert wird. Damit verringert sich der
Aufwand für CIP- und SIP-Operationen signifikant
und die Automatisierung wird wesentlich einfacher,
sodass solche Anlagen in der Regel kostengünsti-
ger erstellt werden können als Anlagen im traditio-
nellen Design. Dem gegenzurechnen sind die in der
Regel höheren Kosten für die hinzugekauften Medien
und Puffer sowie die starke Abhängigkeit von einem
externen Lieferanten. Außerdem sind die gängigen
bags derzeit auf wenige Kubikmeter begrenzt, sodass
bei Bedarf größerer Mengen viele bags gehandhabt
werden müssen, was neben dem erhöhten Aufwand
auch ein erhöhtes Risiko birgt. Hinzu kommt, dass
die Haltbarkeit je nach Art des Flüssigmediums selbst
unter gekühlten Lagerbedingungen meist nur wenige
Wochen bis Monate beträgt, was den Logistikauf-
wand signifikant erhöhen kann.
Die Entwicklung hin zu Hochtiter(high-titer)-
Prozessen mit Titern von mehr als 5 g/L bringt die
derzeitig verfügbare Aufarbeitungstechnologie an
ihre Grenzen. Die begrenzte Löslichkeit der Pro-
teine führt zwangsläufig zu entsprechend großen
Prozessvolumina und Säulendimensionen von bis
zu 2 m im Durchmesser. Der erforderliche Puffer-
bedarf ist beträchtlich und kann für eine Fermenta-
tionscharge bis zu mehr als 100.000 L betragen. Die
daraus resultierenden längeren Prozesszeiten können
einen signifikanten Einfluss auf die Anlagenkapazität
haben (7 Abschn. 12.7.4).
12.7.2 Prozessvalidierung
und Lebenszyklus
biopharmazeutischer Prozesse
und Produkte
Pharmazeutische Produktionsprozesse sind in detail-
lierten Vorschriften beschrieben, und die Einhaltung
dieser Vorgaben wird von den Überwachungsbe-
hörden streng kontrolliert, um ein möglichst hohes
Maß an Arzneimittelsicherheit zu gewährleisten. Ein
weiteres Kernelement pharmazeutischer Prozesse
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
stellt die Validierung dar. Zur Erläuterung seien
zunächst zwei Definitionen zur Prozessvalidierung
vorangestellt:
» Establishing documented evidence which
provides a high degree of assurance that a
specific process will consistently produce
a product meeting its pre-determined
specifications and quality attributes [35].
Process validation is the documented evidence
that the process, operated within established
parameters, can perform effectively and
reproducibly to produce an intermediate or
API (active pharmaceutical ingredient) meeting
its pre-determined specifications and quality
attributes [58].
Das Prinzip der Validierung wird seit den 1980er-
Jahren konsequent in pharmazeutischen Prozes-
sen angewendet, und eine erfolgreiche Validierung
ist Voraussetzung für die Erteilung einer Zulassung
und damit für die Vermarktung eines Produktes. Das
Validierungskonzept blieb in diesem Zeitraum nicht
statisch, sondern wurde weiterentwickelt. Eine neue
Phase begann im Jahr 2008, als die amerikanische
Gesundheitsbehörde FDA (Food and Drug Admi-
nistration) eine „Guidance for Industry – Process
Validation: General Principles and Practices“ publi-
ziert hat, die dann im Jahr 2011 als Empfehlung für
die Biopharmazeutische Industrie ausgesprochen
wurde [37].
Diese Richtlinie schlägt den Bogen von den
frühen Entwicklungsarbeiten über die Auslegung
eines Prozesses, seine Qualifizierung bis hin zur kon-
tinuierlichen Verifikation für die gesamte Lebens-
zeit eines Produktionsprozesses und fordert damit
einen integrierten, durchgängigen Ansatz über den
Lebenszyklus eines Produktes bzw. Prozesses. Primä-
res Ziel dieses Vorgehens ist die Sicherstellung, dass
alle produzierten Chargen die Akzeptanzkriterien
bezüglich Identität, Wirkstoffgehalt, Reinheit und
Wirksamkeit treffen und damit der Patient repro-
duzierbar immer genau die Medikamentenqualität
erhält, die er bekommen soll. Dabei geht die Behörde
davon aus, dass Qualität nicht in ein Produkt „hinein
geprüft“ werden kann, sondern dass sie „hinein
entwickelt“ wird. Der Validierung eines Prozesses
kommt dabei entscheidende Bedeutung zu.
533 12
Anders als in der Vergangenheit, als die Vali-
dierung eines Prozesses im Wesentlichen durch die
erfolgreiche Produktion mehrerer aufeinander fol-
gender Chargen im endgültigen Produktionsmaß-
stab gezeigt wurde, bezeichnet die FDA jetzt die Pro-
zessvalidierung als die „Erfassung und Bewertung
von Daten, beginnend bei der Prozessdesign-Stufe
über die gesamte Dauer der Produktion, die wissen-
schaftliche Evidenz schaffen, dass ein Prozess in der
Lage ist, konsistent Produkt der definierten Qualität
zu produzieren“ [37].
Die einzelnen Stufen der Prozessvalidierung
werden wie folgt definiert:
55 Prozessdesign (process design): Der kommer-
zielle Prozess wird in dieser Phase auf Basis des
Wissens festgelegt, das während der Prozess-
entwicklung und der Scale-up-Aktivitäten
gewonnen wurde.
55 Prozessqualifizierung (process qualification):
Während dieser Phase wird bestätigt, dass das
Prozessdesign geeignet ist für eine reprodu-
zierbare kommerzielle Herstellung.
55 Kontinuierliche Prozessverifikation (continued
process verification): Durch diese Überwachung
während der Routineproduktion wird sicher-
gestellt, dass der Produktionsprozess unter
Kontrolle bleibt.
Nachdem im 7 Abschn. 12.6 bereits die Entwi-
cklungs- und Scale-up- bzw. Prozesstransfer-Akti-
vitäten beschrieben sind, werden hier die Aspekte
Prozessdesign, Prozessqualifizierung und kontinu-
ierliche Prozessverifikation behandelt.
Prozessdesign
Unter Prozessdesign wird die Definition bzw. Festle-
gung des kommerziellen Herstellprozesses verstan-
den. Ziel ist es, den Prozess für die Routineproduk-
tion so zu entwickeln, dass er konsistent ein Produkt
liefert, das die Qualitätsattribute jederzeit erfüllt [37].
Diese Vorgaben werden in den sogenannten Her-
stellvorschriften und Prozesskontrollvorschriften
festgeschrieben. Sie beschreiben im Detail, welche
Schritte in welchem Anlagenteil wie durchzuführen
sind. Des Weiteren wird festgelegt, welche Proben zu
ziehen und zu analysieren sind. Neben den durch-
zuführenden Aktivitäten werden auch die Ziel-
werte für einzelne Messgrößen sowie das erlaubte
 534 R. Kempken et al.
Schwankungsintervall fixiert. Beispiele hierfür sind
die Festlegung des pH-Wertes einer Fermentation
auf 6,95 ± 0,20 bei 36,0 ± 1,0 °C, die Dauer der Fer-
mentation in einem Vorfermenter auf 3,0 ± 0,5 Tage
oder die Einsaatdichte auf 0,30 ± 0,15 · 106 Zellen pro
Milliliter. Solche Messparameter werden als IPC (in
process control)-Werte bezeichnet, denn sie dienen
der Prozesssteuerung bzw. -regelung.
Dieses Vorgehen basiert auf der Annahme, dass
ein Prozess reproduzierbar Produkt gleich bleibend
guter Qualität liefert, sofern er sich in den „erlaub-
ten“ Prozessgrenzen bewegt. Der Festlegung, welche
Parameter sich in welchem Bereich bewegen dürfen,
kommt damit große Bedeutung zu.
In der Prozessentwicklung (7 Abschn. 12.6) wird
der Ablauf des Prozesses fixiert. In der nachfolgen-
den Prozesscharakterisierung wird der Zusammen-
hang zwischen Variation der Input-Größen und den
resultierenden Output-Größen untersucht. Nach
Abschluss der Prozesscharakterisierung werden die
Zielwerte aller Messgrößen einschließlich der erlaub-
ten Schwankungsbreite unter Berücksichtigung der
gewonnenen Erkenntnisse angepasst.
All diese Versuchs- und Studienergebnisse sind
zu dokumentieren, und mit diesen Erkenntnissen aus
der Prozessentwicklung und der Prozesscharakteri-
sierung wird dann das Prozessformat für den kom-
12 merziellen Prozess festgeschrieben, und die Stufe des
Prozessdesigns ist abgeschlossen.
Prozessqualifizierung
In der Qualifizierungsphase der Prozessvalidierung
wird nachgewiesen, dass der kommerzielle Prozess
in der Lage ist, reproduzierbar Produkt in der gefor-
derten Qualität herzustellen. Diese Bestätigung wird
in zwei Gruppen unterteilt:
55 Design und Qualifizierung der Anlage bzw.
der Anlagenbestandteile (equipment) sowie der
Prozess-Nebenanlagen (utilities),
55 Verfahrensqualifizierung (Process Performance
Qualification,PPQ).
In dieser Phase steigen die Anforderungen an die
korrekte Dokumentation. Es werden für definierte
Aktivitäten ein Plan (protocol) und ein Bericht
(report) gefordert. Im Qualifizierungsplan wird
detailliert festgelegt, was untersucht werden soll und
wie die Akzeptanzkriterien für jeden Test definiert
sind. Im Report werden die Ergebnisse der durch-
geführten Aktivitäten dokumentiert und bewertet;
nach Möglichkeit sollen hierbei statistische Metho-
den eingesetzt werden.
z z Design und Qualifizierung der Anlage und des
Equipments sowie der Prozess-Nebenanlagen
Folgende Stufen müssen vor der Prozessvalidierung
erfolgreich durchlaufen werden:
55 Design Qualification, DQ: Design der
Prozessanlage bzw. der Anlagenbestandteile
(equipment) sowie der Prozess-Nebenanlagen
(WfI, GW, CIP, Reinstdampf) inklusive der
Spezifikation der Materialien, der Leistungs-
merkmale und der Betriebsweise;
55 Installation Qualification, IQ: Verifikation,
dass Prozessanlage und Prozess-Nebenanlagen
in Übereinstimmung mit den Design-Spezi-
fikationen gebaut, installiert, verbunden und
kalibriert wurden;
55 Operational Qualification, OQ: Verifikation,
dass Prozessanlage und Prozess-Nebenanlagen
in den für den späteren Betrieb erwarteten
Betriebszuständen korrekt funktionieren. Dies
beinhaltet den Betrieb unter Last sowie das
Stoppen und Wiederanfahren entsprechend
dem späteren Betrieb.
Die Qualifizierung der Anlage umfasst neben den
mechanischen Aspekten auch die Automatisierung,
da die bestimmungsgerechte Funktion komplexer
Anlagen sich in der Regel nur aus dem korrekten
Zusammenspiel aller installierten Anlagenbestand-
teile ergibt.
z z Process Performance Qualification (PPQ)
Die Verfahrensqualifizierung kombiniert die quali-
fizierte Anlage (Prozess-Equipment und Nebenanla-
gen) mit dem kommerziellen Herstellprozess (Her-
stellvorschriften und Prozesskontrollvorschriften),
um kommerziell verwendbares Produkt herzustellen.
Eine erfolgreiche PPQ bestätigt damit das Prozessde-
sign und zeigt, dass der kommerzielle Herstellprozess
sich wie erwartet verhält.
Eine Prozessvalidierung wird generell als erfolg-
reich angesehen, wenn drei PPQ-Produktionschar-
gen konsekutiv erfolgreich durchgeführt worden
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
sind [37]. Aus dieser Interpretation entstand die
Kurzform „n = 3“. Da die PPQ eines biotechnolo-
gischen Prozesses ein sehr aufwendiges und lang-
wieriges Verfahren ist, in dem eine hohe Anzahl von
Werten erfasst wird, treten gelegentlich Abweichun-
gen vom Plan auf, die zu bewerten sind. Der Bericht
schließt mit einer expliziten Aussage dazu, ob der
Prozess die im Plan definierten Akzeptanzkriterien
erfüllt und sich unter Kontrolle befindet (sufficient
state of control). Wenn dies der Fall ist, so ist die PPQ
erfolgreich und die PPQ-Chargen können kommer-
ziell verwendet werden. Der Prozess wird dann als
validiert bezeichnet.
Eine Validierung muss auch für die verwendeten
analytischen Methoden, die Standzeiten von Gelen
und Filtern, kritische Rohstoffe und die Abreiche-
rung von Kontaminanten durchgeführt werden, um
nur einige der wesentlichen weiteren Prozesse und
Systeme zu nennen. Der Großteil der Prozessvali-
dierung wird normalerweise im Produktionsmaß-
stab während der PPQ durchgeführt. Einige Validie-
rungsaktivitäten können aus technischen Gründen
nicht im Produktionsmaßstab durchgeführt werden.
Beispiele hierfür sind die Validierung der Virus- oder
DNA-Abreicherung. In diesen Fällen finden die Vali-
dierungen im Labor- oder Pilotmaßstab statt.
Neben der Prozessvalidierung kommt der Reini-
gungsvalidierung hohe Bedeutung zu. Sie soll sicher-
stellen, dass die Anlagen nach Benutzung reprodu-
zierbar gereinigt werden und somit kein Risiko einer
Verschmutzung oder Kontamination vor Beginn
der nachfolgenden Produktion besteht. In Multi-
Produktanlagen ist dieser Aspekt noch wichtiger,
da hier eine Kreuzkontamination, d. h. Verunrei-
nigung eines Produktes oder Ausgangsstoffes mit
einem anderen Material oder Produkt, vermieden
werden muss [57].
Kontinuierliche Prozessverifikation und
Prozessmonitoring
Diese Aktivität soll sicherstellen, dass der Prozess
sich nicht von seinem validierten Zustand entfernt
bzw. dass jede Veränderung der Prozesslage (process
drift) zeitnah entdeckt wird und bei Bedarf adäquate
Gegenmaßnahmen ergriffen werden.
Hierzu muss ein System etabliert sein, das fest-
legt, welche Daten wie häufig erfasst werden und nach
535 12
welchen Prinzipien und Prozeduren die Auswertung
erfolgt, um eine Veränderung der Prozesslage feststel-
len zu können [37]. Dies ist kein trivialer Prozess, denn
biologische Prozesse weisen eine inhärente Variabili-
tät auf, die sich aus der biologischen Natur der Pro-
zesse, der teilweise variierenden Qualität der einge-
setzten Rohstoffe sowie der Schwankung der Analytik
ergibt. Die Statistik bietet Methoden, die es erlauben,
eine Veränderung der Prozesslage bzw. einen Trend
zu erkennen und von der normalen Schwankung des
Prozesses abzugrenzen, wie z. B. Nelson-Regeln [84,
85] bzw. die Prozessfähigkeit (Capability of the process,
Cp [93]). Diese kontinuierliche Überwachung des Pro-
zesses mit statistischen Methoden wird als Prozess-
monitoring bezeichnet (siehe auch 7 Abschn. 12.5.4
zur Beschreibung der Technologie).
Eine Veränderung der Prozesslage kann nicht
ausgeschlossen werden, denn trotz des hohen Auf-
wands, der in die Entwicklung und Charakterisie-
rung eines biopharmazeutischen Prozesses investiert
wird, können nicht alle möglichen Kombinationen
getestet werden. Des Weiteren gibt es das inhärente
Maßstabsproblem, das die Gültigkeit der im Klein-
maßstab gewonnenen Erkenntnisse in Bezug auf die
Übertragbarkeit für den Großmaßstab einschrän-
ken kann.
Damit die Validierung erfolgreich ist, muss
bereits während der Prozessentwicklung entspre-
chendes Augenmerk auf die Robustheit der Prozesse
gerichtet werden. Die Forderung nach Robustheit
betrifft sowohl die Durchführung des eigentlichen
Prozesses als auch die analytische Qualität des mit
diesem Prozess erzeugten Produktes. Robustheit
ist ein weiter und nicht genau definierter Begriff; er
umfasst Faktoren wie:
55 Medien und Puffer, die sich leicht in reprodu-
zierbarer Qualität herstellen lassen;
55 stabile WCBs, die sich leicht und reprodu-
zierbar auftauen und kultivieren lassen;
55 Unempfindlichkeit des Prozessverlaufs
gegenüber geringfügigen Schwankungen bei
der Prozessführung innerhalb eines definierten
Bereichs;
55 konstante Produktqualität auch bei leicht
variablen Prozessverläufen;
55 konstante Ausbeuten;
55 definierte Nährmedien mit konstanter,
kontrollierter Qualität;
 536 R. Kempken et al.
55 Gele und Filter, die langzeitstabil sind,
unempfindlich gegenüber Reinigungen und
mechanischen Beanspruchungen;
55 Prozessformate, die wenig Möglichkeiten für
Fehler sowohl menschlicher als auch techni-
scher Art bieten;
55 Einsatz bewährter Technologien bzw. Einsatz
neuer Technologien nur dann, wenn der
resultierende Vorteil das Risiko rechtfertigt, das
mit dem Einsatz einer nicht erprobten Techno-
logie einhergeht.
Validierte Prozesse sind grundsätzlich fixiert und
dürfen nicht verändert werden. Aufgrund der Daten
aus dem Prozessmonitoring können sich jedoch
Ansätze ergeben, wie der Prozess robuster gestaltet
bzw. eine Veränderung der Prozesslage rückgängig
gemacht werden kann. Je nach Umfang der Änderung
bzw. nach dem erwarteten Einfluss auf das Prozess-
verhalten oder die Produktqualität können zusätzli-
che Prozessdesign- und PPQ-Aktivitäten erforderlich
sein, bevor solch eine Änderung dauerhaft im Pro-
duktionsmaßstab eingeführt werden kann.
Neben dem kontinuierlich durchgeführten Pro-
zessmonitoring muss regelmäßig ein Jahresbericht
erstellt werden, der die Produktion des zurücklie-
genden Berichtzeitraums zusammenfassend darstellt
12 und bewertet im Hinblick auf Prozess-Performance,
Produktqualität, Abweichungen und Änderungen
der Prozesslage. Für den Gültigkeitsbereich der ame-
rikanischen Gesundheitsbehörde FDA ist dies der
APR (Annual Product Review), für den europäischen
Raum der PQR (Product Quality Review).
12.7.3 Good Manufacturing Practice
bei biopharmazeutischen
Prozessen
In 7 Abschn. 12.7.2 wurde bereits aufgeführt, dass
pharmazeutische Produktionsprozesse detailliert
beschrieben sind und die Einhaltung der Vorgaben
streng kontrolliert wird. Im Folgenden wird auf die
produktionsrelevanten Aspekte eingegangen, die
sich unter dem Schlagwort cGMP (current Good
Manufacturing Practice) zusammenfassen lassen.
Sowohl die FDA als auch die EU / EMEA [30] haben
ihre Version der cGMP-Richtlinien herausgegeben
(FDA: CFR Code of Federal Regulations, EU: Guide
to Good Manufacturing Practice).
Registrierung
Um die Vertriebserlaubnis für ein Produkt zu erhal-
ten, muss ein Behördendossier (Marketing Autho-
rization Application, MAA, in Europa bzw. Biolo-
gics License Application, BLA, in den USA) erstellt
und bei den Behörden eingereicht werden. Darin
sind unter anderem das Produkt, der Herstellpro-
zess, die Produktcharakterisierung inklusive analyti-
scher Methoden, die Validierung sämtlicher Systeme,
Methoden und Prozesse und die Ergebnisse der kli-
nischen Prüfungen in einem hohen Detaillierungs-
grad darzustellen. Der Aufwand hierfür ist sehr hoch.
Nach erteilter Genehmigung kann das Produkt in
den Verkehr gebracht werden.
Spezifikationen und Prozessgrenzen
In dem Behördendossier sind die Produktspezifi-
kationen, IPC-Spezifikationen und Prozessgrenzen
angegeben. Diese Werte werden wesentlich durch
die Ergebnisse der Prozessentwicklung und Pro-
zesscharakterisierung (7 Abschn. 12.6.4 und 12.7.2)
bestimmt. Die relevanten analytischen Produktspe-
zifikationen finden sich im Analysenzertifikat (Cer-
tificate of Analysis, CoA); Prozessgrenzen können z.
B. die Dauer des Fermentationsprozesses (z. B. 9‒11
Tage) oder die maximale Beladungsdichte eines
Chromatographie-Gels (z. B. max. 15 mg Produkt/
mL Gel) sein. Wenn eine Produktionscharge die
Spezifikationen nicht trifft, kann das Produkt in der
Regel nicht freigegeben werden. Wenn Prozessgren-
zen überschritten werden, generiert dies zunächst
eine Abweichung. Abhängig von der Auswirkung
auf die Produktqualität muss entschieden werden, ob
diese Charge für die Verwendung freigegeben werden
kann oder gesperrt wird.
Vorschriften und Dokumentation
Analog zu den strengen Regelungen bei der Zulas-
sung eines (bio)pharmazeutischen Produktes unter-
liegt auch die Herstellung des Wirkstoffes und des
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
Endproduktes [34] strengen Auflagen. Alle Produk-
tionsschritte und relevanten Handhabungen sind in
Vorschriften (Standard Operating Procedures, SOPs)
festgeschrieben. Für jede Produktionscharge wird
der Herstellbericht (batch record) produktionsbeglei-
tend ausgefüllt, sodass alle relevanten Produktions-
schritte korrekt und aussagekräftig dokumentiert
sind. Die korrekte Dokumentation hat einen hohen
Stellenwert.
Abweichungen
Im Abschnitt Prozessspezifikationen und Prozess-
grenzen ist bereits kurz auf Abweichungen eingegan-
gen worden. Vor dem Hintergrund des Leitgedan-
kens der Validierung muss jede Abweichung vom
definierten Verfahren bewertet werden.
z z Beispiel für eine Abweichung im upstream:
Der Produktionsfermenter wird im fed-batch-Mo-
dus betrieben; an den Tagen 2, 5 und 8 wird die Feed-
lösung A dazugegeben, die Fermentation endet am
Tag 10 mit der Zellernte. Aufgrund eines Mitarbei-
terfehlers ist am Tag 5 nur ca. 30 % der Feedlösung
zugegeben worden. Die Zellen erreichen im weiteren
Verlauf der Fermentation eine ca. 20 % niedrigere
Zellzahl, und die Vitalität beträgt am Erntetag nur
30 % statt der sonst üblichen 50 %.
z z Beispiel für eine Abweichung im downstream:
Das Eluat der Protein-A-Säule eines Prozesses zur
Herstellung eines monoklonalen Antikörpers wird
für 90 Minuten einer Säurebehandlung bei pH
3,5 zur Virusinaktivierung unterzogen. Nach den
90 Minuten wird die Produktlösung wieder auf einen
neutralen pH-Wert eingestellt. Aufgrund eines tech-
nischen Problems wird die maximal zulässige Ein-
wirkzeit bei pH 3,5 um 60 Minuten überschritten.
Die Bewertung einer Abweichung muss jeden
möglichen Einfluss auf den Prozessverlauf und
damit letztlich auf die Produktqualität abdecken. In
den beiden beschriebenen Abweichungen wird ein
besonderer Fokus auf der Produktqualität liegen.
Voraussichtlich sind weitere analytische Unter-
suchungen nötig, um dies abzuklären. Eventuell
müssen zusätzliche analytische Untersuchungen
durchgeführt werden, um auszuschließen, dass die
537 12
Abweichung einen negativen Einfluss auf die Stabili-
tät der Chargen und damit auf das Verfallsdatum hat.
12.7.4 Betrieb einer großtechnischen
Produktionsanlage –
Wechselwirkungen
zwischen Prozessformat und
Anlagendesign
Die 7 Abschn. 12.7.1, 12.7.2 und 12.7.3 geben einen
Eindruck von der Komplexität großtechnischer
Anlagen zur Herstellung eines pharmazeutischen
Wirkstoffes. Solche Anlagen sind in der Regel auto-
matisiert, d. h. die Prozessführung erfolgt über ein
Prozessleitsystem (PLS) (distributed control system,
DCS). Komplexität und Grad der Automatisie-
rung variieren stark, da hier unterschiedliche Phi-
losophien möglich sind: Von „alles automatisiert
und daher bestmöglich kontrolliert und reprodu-
zierbar“ bis zu „KISS (keep it safe and simple)“, d. h.
so wenig Automatisierung wie möglich, damit die
Komplexität reduziert wird und gleichzeitig die
Anlage flexibel bleibt. Auch das Prozessleitsys-
tem muss qualifiziert bzw. der Gesamtprozess mit
PLS muss validiert werden, und der Validierungs-
aufwand steigt mit zunehmender Komplexität des
Automatisierungskonzeptes.
Wie in 7 Abschn. 12.5.4 erläutert, sind neben den
on-line gemessenen Größen auch off-line erzeugte
Daten nötig zur Kontrolle und Bewertung eines Pro-
duktionsprozesses. Bei den off-line-Daten wird zwi-
schen zeitkritischen Daten unterschieden, die zur
Steuerung des Prozesses benötigt werden ‒ Beispiele
sind die Zellzahlen, die z. B. für das Einleiten eines
Transfers von Zellsuspension in den nächstgrößeren
Fermenter benötigt werden, oder Titerbestimmun-
gen, die für die Berechnung des Beladungsvolumens
auf Chromatographiesäulen erforderlich sind ‒, und
den Daten, die zwar zur Bewertung eines Produktions-
laufs benötigt werden, die aber nicht prozesssteuernd
sind. Beispiele hierfür sind die Titer an den verschie-
denen Tagen im Produktionsfermenter oder die SDS-
Gele auf Prozess-Zwischenstufen im downstream.
Die Labors für die prozesssteuernde off-line-Analytik
befinden sich deshalb in der Regel in der Nähe der
Produktion, um lange Transportwege zu vermeiden.
 538 R. Kempken et al.

Anlagenauslastung, Prozessformat und Erreichung des Titers erforderliche Prozesszeit ist

Anlagendesign ebenso wichtig wie das Design der Produktionsan-
Voraussetzung für eine wirtschaftliche Produktion lage, in der der Prozess realisiert werden soll. Letzt-
ist eine hohe Anlagenauslastung, d. h. die Produk- endlich lässt sich die Güte einer Prozessentwick-
tionskapazitäten der verschiedenen Produktions- lung nicht am Titer, sondern an der sogenannten
bereiche müssen aufeinander abgestimmt sein: Dies Raum-Zeit-Ausbeute der Produktionsanlage bzw.
gilt innerhalb der Wirkstoffherstellung für die drei letztendlich anhand der Herstellkosten bewerten.
Bereiche Fermentation – Aufarbeitung – Formu- Die Raum-Zeit-Ausbeute beschreibt, wie viel Kilo-
lierung, aber auch für die beiden großen Bereiche gramm Produkt pro Zeiteinheit in dem verfügbaren
Wirkstoffherstellung und Endproduktherstellung. Produktionsvolumen (Fermentervolumen) herge-
Prozessformat und Anlagendesign müssen zueinan- stellt werden.
der passen. Folgendes Beispiel soll die Abhängigkei- In der Fermentation stellt die Produktbildungs-
ten verdeutlichen: kinetik einen wichtigen Parameter zur Optimierung
Die Anlage enthält zwei Produktionsfermenter, der Raum-Zeit-Ausbeute dar: Wenn diese über die
die zwei Wochen turn-around-Zeit haben, d. h. alle gesamte Fermentationsdauer linear ist, dann sind
zwei Wochen wird ein neuer Produktionsfermenter lange Fermentationszeiten sinnvoll. Wenn jedoch
gestartet. Die turn-around-Zeit umfasst sowohl die zum Ende der Fermentation die Produktbildungs-
Zeit für die Vorbereitung der Fermentation, die rate abnimmt, weil z. B. die Vitalität der Zellkul-
eigentliche Fermentationszeit als auch die Zeit für tur abnimmt, dann kann eine kürzere Fermenta-
die Nachbereitung. Die beiden Fermenter werden tionsdauer zu einer höheren Raum-Zeit-Ausbeute
mit einer Woche Zeitversatz betrieben, sodass pro führen, weil im gleichen Zeitraum mehr Fermenta-
Woche eine Ernte stattfindet. Um den Wirkstoff tionen gestartet werden können. In . Abb. 12.10 sind
aus dem Fermenterüberstand aufzureinigen, steht diese beiden Fälle veranschaulicht: Bei der nicht-li-
somit ebenfalls eine Woche zur Verfügung. Wenn nearen Produktbildungskinetik ist es günstiger, den
die turn-around-Zeit des Produktionsfermenters nur Prozess nach 14 Tagen mit 4 g/L zu beenden, als ihn
eine Woche beträgt, dann stehen für die Aufarbei- 21 Tage laufen zu lassen, um 5 g/L zu erreichen. In
tung nur 3,5 Tage zur Verfügung, oder es muss ein Bezug auf sechs Wochen Produktionszeit ergäbe dies
12 zweiter, unabhängiger Aufarbeitungsbereich etab-
liert werden. Für die Betrachtung der Anlagenkapa-
zität ist die Formulierung in der Regel unkritisch,
da sie meist kürzer als die Aufarbeitung dauert und
deshalb nicht limitierend ist.
Die Zahlen in diesem Beispiel lassen sich vielfäl-
tig variieren, und je nach Kombination befindet sich
der zeitbestimmende Engpass (bottle-neck) entwe-
der im upstream oder im downstream. Durch Anpas-
sung der Schichtmodelle der Produktionsmitarbeiter
können die Auswirkungen von Engpässen verringert
werden. So kann die effektive Kapazität der Aufarbei-
tung verdreifacht werden, wenn vom Ein-Schicht-
Modell auf das Drei-Schicht-Modell gewechselt wird.
Aufgrund dieser Betrachtung ergeben sich inte-
ressante Konsequenzen auf die Prozessentwick-
lung. In der Literatur wird inzwischen von Titern
von 10 g/L und mehr gesprochen, für Säugerzel-
len hohe Werte. Die Angabe des erzielten Titers ist
jedoch in Bezug auf Anlagenproduktivität und nied- . Abb. 12.10  Einfluss der Produktbildungskinetik auf die
rige Herstellkosten nur die halbe Wahrheit: Die zur Raum-Zeit-Ausbeute
Kapitel 12 · Kultivierung von S­ äugetierzellen
bei einem 1000-Liter-Produktionsfermenter 12 kg
Produkt im Fermenter beim 14-Tage-Prozess versus
10 kg Produkt beim 21-Tage-Prozess. Diese Betrach-
tung ist vereinfacht, da die Zeiten für Vor- und Nach-
bereitung des Fermenters vernachlässigt wurden; das
Grundprinzip gilt nach wie vor. Je nach Effektivität
der entsprechenden Produktionsanlage kann der
Zeitraum für Vor- und Nachbereitung jeweils zwi-
schen einem, zwei, drei oder noch mehr Tagen betra-
gen. Je länger der Zeitraum für Vor- und Nachberei-
tung ist, desto günstiger werden Prozesse mit langer
Fermentationszeit in Bezug auf die Optimierung der
Raum-Zeit-Ausbeute.
Wenn eine existente Produktionsanlage genutzt
werden soll, dann ist die Verfahrensentwicklung
gefordert, Prozesse so zu entwickeln, dass die vor-
handenen Kapazitäten optimal genutzt werden.
Wenn hingegen eine neue Anlage gebaut werden
soll, dann muss im Vorfeld das Prozessformat der
Prozesse festgelegt werden, die in dieser Anlage her-
gestellt werden sollen, und dann das Anlagendesign
entsprechend erfolgen.
Kampagnen-Produktion mit
Rüstwechseln
Bei Säugerzell-Prozessen beansprucht die Aufarbei-
tung meist wesentlich weniger Zeit als die Fermen-
tation, sodass in vielen Anlagen, speziell den größe-
ren Anlagen, mehrere Produktionsfermenter einem
Aufarbeitungsbereich zugeordnet sind. Während die
Fermentation von Produkt zu Produkt im Wesent-
lichen in den gleichen Fermentern durchgeführt
wird, gilt für die Aufarbeitung nahezu das Gegenteil:
Nicht nur können sich die Aufarbeitungsprozesse für
unterschiedliche Produkte signifikant voneinander
unterscheiden, sondern aus GMP-Gründen dürfen
Chromatographie-Gele und Filterkerzen/Filterkas-
setten nicht für verschiedene Produkte verwendet
werden. Man spricht von dedicated matrices, da sie
einem bestimmten Produkt gewidmet sind. Jeder
Produktwechsel bedingt also eine größere Rüstakt-
ion, bei der Chromatographiesäulen aus der Auf-
arbeitung entfernt, neu gepackt und dann wieder
neu aufgestellt werden. Gleiches gilt für die Filter
in der Aufarbeitung und Formulierung, aber auch
für die Filter, die in der Ernte mit Tangential-Fluss-
(cross-flow) Filtrationstechnik eingesetzt werden.
539 12
Zusätzlich erfolgt üblicherweise bei jedem Produkt-
wechsel durch Probenahme und entsprechende Ana-
lytik der Nachweis, dass die Anlage sauber ist und
kein Kreuzkontaminationsrisiko des Folgeproduktes
durch das Vorgängerprodukt besteht.
Filter und Gele dürfen nicht unbegrenzt einge-
setzt werden. Zum einen gibt es die Haltbarkeits-
vorgaben des Herstellers, zum anderen muss der
Anwender den Einsatz für jeden einzelnen Prozess
validieren. Das heißt, er muss in dem realen Prozess
nachweisen, dass z. B. ein Chromatographie-Gel 20-,
50-, 100- oder 200-mal eingesetzt werden kann, ohne
dass die Qualität des Produktes negativ beeinflusst
wird. Bei Erreichen der Einsatzgrenze wird das Gel
bzw. der Filter verworfen.
Aus all diesen Gründen wird eine Multi-Pro-
duktanlage sinnvollerweise in Kampagnen gefah-
ren, d. h. zum Beispiel auf zehn Produktionsläufe
mit Produkt A folgen 30 Läufe mit Produkt B, dann
drei Läufe mit Produkt C, darauf wieder zehn Läufe
mit Produkt A usw. Um die optimale Betriebsweise
einer Multi-Produktanlage festzulegen, müssen alle
in diesem Kapitel erwähnten Effekte berücksichtigt
werden. Zur Optimierung der Raum-Zeit-Ausbeute
sind deshalb möglichst wenige, lang andauernde
Kampagnen mit der optimalen Prozesszeit (Fermen-
tation und Aufarbeitung) sinnvoll, da so Effektivi-
tätsverluste durch Rüstwechsel vermieden werden.
Wenn hingegen auch die Minimierung der Lager-
bestände ein Ziel ist, dann sind viele kurze Kampa-
gnen sinnvoller als wenige lange Kampagnen. Letzt-
endlich muss für jede Anlage und jeden Produkt-Mix
die optimale Produktionsstrategie ermittelt werden.
12.7.5 Entwicklung eines
Folgeprozesses und
daraus resultierender
Änderungsaufwand
In 7 Abschn. 12.6 sind die wesentlichen Anforderun-
gen an eine Prozessentwicklung aufgeführt. Idealer-
weise ist bereits der Originalprozess so ausgereift,
dass es keinerlei Änderungsbedarf gibt. In der Reali-
tät hingegen gibt es eine Vielzahl von Gründen, die zu
einer Prozessänderung führen können (. Tab. 12.6).
Aus Sicht der Behörden sind solche Änderungen zu
bevorzugen, die die Produktqualität z. B. im Sinne
 540 R. Kempken et al.

. Tab. 12.6  Beispiele für Gründe, die zu Änderungen des zugelassenen Prozesses bzw. der Methoden führen

Regulatorische Gründe
Wirtschaftliche Gründe
Technologische Gründe
Auflagen der Behörden, wie z. B. der Ersatz von Serum oder anderen bovinen Rohstoffen
zur Minimierung des BSE-Risikos. Da die Qualität des Produktes durch die Art und
Qualität der eingesetzten Rohstoffe signifikant beeinflusst werden kann, kann dies eine
wesentliche Änderung sein.
Post-Approval Commitments; das sind Auflagen, die im Rahmen der Erteilung
der Zulassung der produzierenden Firma auferlegt werden. Beispiele hierfür
sind die Einführung verbesserter analytischer Methoden oder die Durchführung
produktionsbegleitender Validierungsstudien, z. B. zur Standzeit von Gelen.
Signifikante Änderungen an der genehmigten Anlage, z. B. Veränderungen des WFI-
Systems
Veränderungen der Prozesslage
Verlagerung der Produktion von einer Anlage in eine andere Anlage
Verbesserung der Produktqualität, z. B. durch Einführen eines weiteren
Chromatographieschritts
Erhöhung der Ausbeute (höherer Titer in gleicher Zeit oder gleicher Titer in kürzerer
Zeit), die durch außerhalb der Zulassung liegende Änderungen der Prozessbedingungen
erreicht werden
Veränderung der Technologie, z. B. Zellernte mit Zentrifuge statt mit Querstromfiltration
Wechsel eines Chromatographie-Gels

von Konstanz bzw. Verringerung von Kontaminan-
ten bzw. die Robustheit des Prozesses verbessern. Die
pharmazeutische Firma hat neben diesen regulato-
rischen Aspekten ebenfalls die Wirtschaftlichkeit
12 im Fokus, also die Verbesserung der Ausbeute bzw.
Senkung der Herstellkosten.
Wenn ein Folgeprozess (second generation
process) entwickelt wird, steht zusätzlich zu den in
7 Abschn. 12.6 genannten Anforderungen an obers-
ter Stelle die Forderung nach vergleichbarer Pro-
duktqualität. Alle Änderungen in der Produktqua-
lität bergen das Risiko, dass klinische Prüfungen
wiederholt werden müssen. Im besten Fall ist dies
eine sogenannte bridging study, bei der in einer
Studie mit einer geringen Patientenzahl nachgewie-
sen wird, dass die Eigenschaften im Patienten ver-
gleichbar sind. Im anderen Extrem bedeutet dies eine
Wiederholung der gesamten klinischen Entwicklung,
die mit entsprechend hohen Kosten und Zeitverlus-
ten verbunden ist.
Anhand dieser Punkte wird deutlich, dass jede
Änderung eines registrierten Prozesses mit erhebli-
chem Aufwand, Risiko und Kosten verbunden ist. Je
besser das Verständnis der eingesetzten Zellen, Vek-
toren, Medien, Reaktoren, Reinigungstechnologien
und der Produkteigenschaften, desto höher ist die
Wahrscheinlichkeit, dass Prozessänderungen erfolg-
reich sind. Andererseits muss berücksichtigt werden,
dass trotz der erheblichen Fortschritte der letzten
Jahre im Bereich Zellkulturtechnik viele Aspekte
des komplexen Wechselspiels Zelle – Zellumgebung
noch nicht vollständig verstanden sind. Hier weitere
Fortschritte zu erzielen, ist eine der großen Heraus-
forderungen, die gleichzeitig die Faszination der Säu-
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 545 13

Systembiologie in der
­Bioverfahrenstechnik
Ralf Takors

13.1 Einführung in die Systembiologie – 546

13.1.1 Definition der Systembiologie – 546
13.1.2 Metabolic Engineering - Systembiologie – Synthetische
Biologie – 547
13.1.3 Bioprozesstechnik im Wandel der Zeit – 548

13.2 Aufgaben der Systembiologie für die

Bioprozessentwicklung – 548

13.3 Metabolische Ebene – 551

13.3.1 Stöchiometrische Stoffflussanalysen (metabolic flux analysis,
MFA) – 551
13.3.2 Stoffflussanalysen auf der Basis von Markierungsinformation – 554
13.3.3 Metabolic Engineering Strategien aufgrund stationärer
Systemanalysen – 558
13.3.4 Metabolische Kontrollanalyse (metabolic control analysis,
MCA) – 558

13.4 Zelluläre Regulation – 563

13.5 Subpopulationen – 564

13.6 Scale-up – 565

Literatur – 566

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2018

H. Chmiel, R. Takors, D. Weuster-Botz (Hrsg.), Bioprozesstechnik,
https://doi.org/10.1007/978-3-662-54042-8_13
 546 R. Takors
13.1 Einführung in die
Systembiologie
Die Systembiologie ist eine Wissenschaft, die sich
nach wie vor rasant entwickelt [85]. Sie verfolgt
den Ansatz, ein biologisches System holistisch,
d. h. ganzheitlich zu betrachten und quantitativ zu
beschreiben. Dabei steht die Interaktion der einzel-
nen Module (Moleküle, Zellen, Regulationsmecha-
nismen oder Populationen) im Vordergrund der
Untersuchungen. Folgerichtig setzen sich systembio-
logische Studien aus unterschiedlichsten Facetten der
Forschungsthemen zusammen und adressieren viel-
fältige Themenfelder der Biologie und Medizin. Das
nachfolgende Kapitel stellt nur einen kleinen Teilas-
pekt in den Vordergrund: nämlich die systembiolo-
gischen Aspekte in der Bioverfahrens- bzw. Biopro-
zesstechnik. Weitere Themenfelder werden z. B. in
den Übersichten [42, 47, 66] vorgestellt.
13.1.1 Definition der Systembiologie
Die Systembiologie ist eine vergleichsweise junge
Disziplin. Nach Westerhoff und Palsson [102,103]
könnte deren Beginn um das Jahr 2000 datiert
werden. Zu diesem Zeitpunkt liefen zwei unabhän-
gige, wesentlich länger zurückreichende Strömungen
zusammen, die als „Symbiose“ die Systembiologie
13 gründeten. Diese Strömungen sind der datengetrie-
bene, molekular- und messtechnische Zugang zu bio-
logischen Systemen einerseits sowie deren Modellie-
rung andererseits.
Eine Wurzel der Systembiologie wird daher
in der kontinuierlichen Erweiterung der moleku-
larbiologischen Wissensbasis (Identifizierung der
DNA-Struktur durch Watson und Crick, 1953),
der Entwicklung der rekombinanten Technolo-
gien in den 1960er- und 70er-Jahren und der sich
explosionsartig perfektionierenden Techniken zur
DNA-Sequenzierung gesehen. Einen zwischen-
zeitlichen Höhepunkt fand Letztere in der Fertig-
stellung des humanen Genomprojektes (HUGO)
im Jahr 2000, doch wurde bereits 1995 Haemophi-
lus influencae erstmals sequenziert. Bis heute sind
mehr als 50.000 Genome prokaryotischen und euka-
ryotischen Ursprungs (teil-) sequenziert (www.
genomesonline.org/) – Tendenz nach wie vor stark
steigend. Diese stetig zunehmende Fülle an Genom-
information geht einher mit der gleichermaßen
rasant ablaufenden Technologieentwicklung zur
Bestimmung von Transkriptom, Proteom und Meta-
bolomdaten – um nur einige, weit verbreitete Daten-
formate zu nennen. Unter Transkriptomdaten wird
die Gesamtheit aller zellulären Transkripte (mRNA,
messenger RNA) verstanden, die den genomweiten
Genexpressionsstatus der Zelle beschreibt. Das
Proteom repräsentiert die Gesamtheit aller (mess-
technisch) zugänglichen Proteine, und das Meta-
bolom umfasst die analoge Menge aller intra- und
extrazellulären Metabolite. Diese umfassenden
Datensätze werden zudem durch diverse andere
Techniken ergänzt, sodass heute eine noch nie da
gewesene Fülle an Messinformation zur Beschrei-
bung des zellulären Zustands erfassbar ist.
Die zweite Wurzel der Systembiologie reicht zeit-
lich noch weiter in das letzte Jahrhundert zurück und
wird durch die Basisarbeiten zur Thermodynamik
von Nicht-Gleichgewichtszuständen [65] begrün-
det. Grundzüge der Nicht-Gleichgewichtsthermo-
dynamik sind in heute verwendeten Modellierungs-
ansätzen berücksichtigt. Andere Meilensteine sind
beispielsweise die Identifizierung von Feedback-Re-
gulationsmechanismen [93], die Formulierung von
Grundzügen der Genregulation am Beispiel des lac-
Operons [7, 26, 27] sowie erste Arbeiten zur dynami-
schen Modellierung der Glykolyse [18, 34]. Mitte der
70er-Jahre wurden die Methoden der metabolischen
Kontrollanalyse (MCA) entwickelt [31, 39]. Diese
sind bis heute ein wichtiges Werkzeug zur quanti-
tativen Untersuchung der metabolischen Kontrolle
in Zellen. Mit Beginn der 90er-Jahre traten verstärkt
topologische Netzwerkuntersuchungen in den Mit-
telpunkt des Interesses. Diese zielten unter anderem
darauf ab, intrazelluläre Stoffflüsse im Fließgleich-
gewichtszustand (steady state) zu bestimmen [94].
Damit werden intrazelluläre Raten quantitativ
bestimmt, die ansonsten nicht zugänglich wären.
Um das Jahr 2000 vereinigten sich beide Strö-
mungen, d. h. die genomweite Datenerhebung und
die detaillierte Modellierung biologischer Systeme,
zu dem neuen Wissenschaftszweig Systembiologie.
Diese zielt darauf ab, ein holistisches (d. h. ganz-
heitliches) quantitatives Systemverständnis von den
Kapitel 13 · Systembiologie in der ­Bioverfahrenstechnik
betrachteten biologischen Systemen zu erhalten. Die
Kernaufgabe der Systembiologie besteht demnach
darin, die Interaktion aller Komponenten eines bio-
logischen Systems nicht isoliert, sondern in ihrem
in vivo-Kontext quantitativ zu verstehen und zu
beschreiben. Die biologischen Systeme reichen dabei
von „einfachen“ Prokaryoten über höhere Zellen
(z. B. Säugerzellen), Organen und sogar Multi-
Organ-Systemen. Dementsprechend findet die Sys-
tembiologie Anwendung für bioprozesstechnische,
medizinische und pharmazeutische Fragestellungen.
13.1.2 Metabolic Engineering -
Systembiologie – Synthetische
Biologie
Eine wichtige Wurzel der Systembiologie ist das
Metabolic Engineering, das sich in den 1990er-Jah-
ren entwickelte [5, 16]. Es umfasst die gezielte Ver-
änderung zellulärer Eigenschaften durch Anwen-
dung von Rekombinationstechnologien, sodass eine
im Sinne der Zielvorgabe optimierte Zelle entsteht.
Dies berücksichtigt sowohl die Verbesserung exis-
tierender wie auch die Etablierung neuer Zelleigen-
schaften. Neben den dafür notwendigen molekular-
biologischen Technologien verwandte das Metabolic
Engineering die zu diesem Zeitpunkt zugänglichen
quantitativen Analysewerkzeuge für eine quanti-
tative Vorhersage entsprechender Ziele gentechni-
scher Veränderungen. Zu diesen Werkzeugen zählen
die metabolische Kontrollanalyse, die metabolische
Stoffflussanalyse sowie auch andere modellierungs-
technische Ansätze [88]. Obwohl die ursprüngliche
Definition des Metabolic Engineering die gesamte
Zelle im Blickpunkt hatte, fokussierte die Mehrzahl
der in der Folgezeit durchgeführten Untersuchun-
gen auf die metabolische Zellebene. Entsprechende
Zellmodelle berücksichtigten den intrazellulären
Stoffwechsel hauptsächlich in Form von Reaktions-
stöchiometrien mit geeigneten enzymkinetischen
Ansätzen. Einflüsse z. B. der transkriptionellen Kon-
trolle waren darin häufig nicht beinhaltet.
Mit der oben beschriebenen rasanten Entwick-
lung in den omics-Technologien wurde diese anfäng-
liche Limitierung aufgehoben und zu einem neuen
Wissenschaftszweig definiert. Systembiologische
547 13
Modelle zeichnen sich in der Regel dadurch aus,
dass die Vernetzung und Hierarchie zellulärer Regu-
lation möglichst umfassend beschrieben wird. Ein
generelles Problem ist dabei die Wahl des geeigne-
ten Ansatzes. So ist prinzipiell die Entscheidung zu
treffen, ob das zu erstellende biologische Modell
einem top down- oder einen bottom up-Ansatz folgt
[72]. Top down-Ansätze zeichnen sich dadurch
aus, dass ein möglichst umfassendes Bild durch ein
genomskaliges Modell formuliert wird. Die mecha-
nistische Beschreibung einzelner Details tritt dabei
zugunsten der genomskaligen Modellierung in
den Hintergrund. Dies versuchen bottom up-Ans-
ätze zu umgehen. Sie zielen darauf ab, ein mecha-
nistisch konsistentes Bild des betrachteten biologi-
schen (Teil-)Systems zu erhalten. Dabei fokussieren
bottom up-Ansätze beispielsweise nur auf einzelne
Stoffbereiche und deren metabolische und transkrip-
tionelle Regulation. Die Topologie, d. h. der struktu-
relle Aufbau eines genomskaligen Modells, ist daher
in den bottom up-Ansätzen nur zum Teil berücksich-
tigt. Aus diesem Grund werden auch verstärkt Hyb-
ridmodelle eingesetzt, die synergistisch die Vorzüge
des top down-Ansatzes mit dem bottom up-Ansatz
zu verknüpfen versuchen [72].
Oftmals wurde im Metabolic Engineering die
Erfahrung gemacht, dass lokale Veränderungen
z. B. in Biosynthesewegen eine mehrfache, kom-
plexe Systemantwort zur Folge haben [6]. Umge-
kehrt sind häufig mehrere Veränderungszyklen
notwendig, um gewünschte Verbesserungen der zel-
lulären Leistungsdaten zu erhalten. Dies führte zu
der heutigen Sichtweise des systems metabolic engi-
neering [17, 48, 109]. Im Kern bedeutet dies, dass
die gezielte Verbesserung zellulärer Leistungsdaten
nur durch das Verständnis des gesamten zellulären
Kontextes möglich ist. Klassische Metabolic Engi-
neering Ansätze werden in die systemische Betrach-
tung integriert.
Wie auch die Systembiologie so hat auch der
sich etwa seit dem Jahr 2000 immer stärker entwi-
ckelnde Wissenschaftszweig der Synthetischen Bio-
logie eine seiner Wurzeln im Metabolic Engineering.
Ein Kerngedanke der synthetischen Biologie ist es,
die in anderen Ingenieurdisziplinen übliche Vor-
gehensweise der (1) Problemspezifikation, (2) Sys-
temmodularisierung, (3) Simulation, (4) Integration
 548 R. Takors
und (5) Systemtestung auf die Optimierung und Ent-
wicklung biologischer Systeme zu übertragen. Dies
verlangt nach einer Möglichkeit zum orthogonalen
Transfer „biologischer Module“ über die jeweiligen
Systemgrenzen hinweg. Aktuelle Arbeitsgebiete der
synthetischen Biologie sind z. B. die chemische Syn-
these von Genen und Genomen, die Entwicklung
von Minimalzellen und artifiziellen Systemen, das
optimale Design ausgewählter Stoffwechselwege und
die Schaffung orthogonaler Biosysteme (Module).
Beispiele für letztere sind artifizielle Regelkreise
oder Sensoren, die eine neue Funktion in die Zellen
implementieren.
Einige dieser Arbeitsfelder decken sich somit
mit originären Tätigkeitsgebieten des Metabolic
Engineering. Andere bieten eine vollkommen neue,
DNA-getriebene Sichtweise auf die Funktionali-
tät und Veränderbarkeit von biologischen Zellen.
. Abb. 13.1 versucht den Zusammenhang von Meta-
bolic Engineering, Systembiologie und Synthetischer
Biologie grafisch zu veranschaulichen.
.RPSOH[LW¦W
6\VWHPELRORJLH
g OLF
LQ R
HU WDE
QH H
13
JL 0
(Q PV
H
VW
6\
ORJLH
H %LR
LVFK
WKHW
6\Q
6WDPPYLHOIDOW
. Abb. 13.1  Vereinfachte Darstellung der Arbeitsfelder des
systems metabolic engineering, der Synthetischen Biologie und
der Systembiologie aufgeteilt nach betrachteter Komplexität
der Zellen und der Anzahl neuer Stammkonstrukte. Die
Systembiologie richtet sich vorrangig auf die mechanistische
Beschreibung der zellulären Komplexität. Dieses Wissen
dient als Basis für die zielgerichteten Stammverbesserungen
des systems metabolic engineering. Die synthetische Biologie
modularisiert die Zellbetrachtung in einzelne, individuell
veränderbare Einheiten, was zu einer Vielzahl von neuen
biologischen Systemen führt
13.1.3 Bioprozesstechnik im Wandel
der Zeit
Im Vergleich zu den relativ jungen Disziplinen des
systems metabolic engineering, der Systembiologie
und der Synthetischen Biologie ist die Bioprozess-
technik (Biochemical Engineering) eine vergleichs-
weise alte Wissenschaft. Wenngleich ein typischer
Startzeitpunkt für das Biochemical Engineering
nicht benannt werden kann, sollte beachtet werden,
dass bereits 1880 Backhefe nach dem Lufthefever-
fahren hergestellt wurde und ein Jahr später bereits
erste Ansätze zur Milchsäureherstellung technisch
realisiert wurden. Während des Ersten Weltkrieges
wurden die ersten Anlagen zur Aceton-Butanol-
Ethanol Herstellung in Betrieb genommen und im
Zweiten Weltkrieg begann 1942 die Herstellung von
Antibiotika, z. B. Penicillin mit Penicillium chrysoge-
num im technischen Maßstab. In dieser Zeit war die
Bioprozessentwicklung noch stark durch die chemi-
sche Reaktionstechnik geprägt. Insofern Modellie-
rungsansätze für die Bioprozesse verwandt wurden,
handelte es sich um nicht strukturierte (black box)
Ansätze für Bilanzierungszwecke. Eine inhaltlich
substanzielle Erweiterung erfuhr die Bioprozesstech-
nik durch das Metabolic Engineering, das verstärkt in
den 1990er-Jahren in den Mittelpunkt des Interesses
rückte. Ähnliches gilt für die Systembiologie, die seit
ca. 2000 zu einer weiteren inhaltlichen Erweiterung
der Bioprozesstechnik (Biochemical Engineering)
beitrug. In analoger Weise gilt dies für die Synthe-
tische Biologie. . Abb. 13.2 versucht diesen histori-
schen Ablauf zu veranschaulichen.
13.2 Aufgaben der Systembiologie
für die Bioprozessentwicklung
Die Systembiologie zielt auf ein quantitatives, holis-
tisches Verständnis der betrachteten biologischen
Systeme ab. Dieses sehr anspruchsvolle Ziel ver-
langt grundlagenorientierte Forschungsarbeiten. Da
es sich bei der Bioprozesstechnik um eine anwen-
dungsorientierte Forschung handelt, stellt sich die
Frage, inwieweit die Systembiologie für eine effizi-
ente Bioprozessentwicklung Beiträge liefern kann.
Zu deren Beantwortung dient . Abb. 13.3.
Kapitel 13 · Systembiologie in der ­Bioverfahrenstechnik
549 13

0HWDEROLF(QJLQHHULQJ a

%LRFKHPLFDO (QJLQHHULQJ
&KHPLFDO (QJLQHHULQJ

6\VWHPV%LRORJ\
a

6\QWKHWLF%LRORJ\

6\VWHPV
0HWDEROLF
(QJLQHHULQJ

. Abb. 13.2  Bioverfahrenstechnik im Wandel der Zeit: Während die ersten bioverfahrenstechnischen Prozesse noch
wesentlich durch die Herangehensweise der chemischen Verfahrenstechnik geprägt waren, entwickelte sich daraus ein
eigenständiger Zweig, der in den 1990er-Jahren durch das Metabolic Engineering und seit ca. 2000 durch die Systembiologie
und die Synthetische Biologie inhaltlich erweitert wird. In jüngster Zeit rückt die systemische Betrachtung im Metabolic
Engineering als systems metabolic engineering in den Vordergrund

In der Bioprozessentwicklung beginnt die sys- die unterschiedlichen Regulationsebenen mitein-

tembiologische Betrachtung der Produzentenzellen
meist auf der metabolischen Ebene. Das intrazellu-
läre Reaktionsnetzwerk wird stöchiometrisch bzw.
kinetisch modelliert. Daraus werden Hinweise für
Stammverbesserungen und/oder Wechselwirkun-
gen mit dem Bioprozess abgeleitet.
Durch Fokussierung auf die metabolische Ebene
werden übergeordnete Regulationsmechanismen
zwangsläufig ausgeblendet. Beispiele sind die tran-
skriptionale oder die post-translationale Regula-
tion, die schlussendlich auf die Menge und Aktivität
der vorhandenen Enzyme und damit auf das Reak-
tionsnetzwerk einwirken. Ansätze, die versuchen
ander zu vernetzen und die die Rückkopplung auf
das Reaktionsnetzwerk beschreiben, sind somit cha-
rakteristisch für die Komplexität systembiologischer
Modelle der nächsthöheren Skala.
Zelluläre Kulturen sind nicht homogen, sondern
heterogen [58]. Mögliche Gründe mögen in unter-
schiedlichen Zellzyklusstadien, nicht-symmetri-
schen Zellteilungen oder auch extrazellulären Fakto-
ren wie unterschiedlichen Substratverfügbarkeiten,
Wachstumsbedingungen etc. zu finden sein. Phäno-
typisch macht sich dies durch das Auftreten von Sub-
populationen bemerkbar. Diese können beispiels-
weise die Leistungsdaten einer gesamten Kultur im
 550 R. Takors

. Abb. 13.3  Skalenübergreifende Fragestellungen der Systembiologie entlang der Bioprozessentwicklung – Eine Vielzahl
systembiologischer Applikationen betrachtet die metabolische Ebene zellulärer Systeme, d. h. die Interaktion intrazellulärer
Metabolite in Reaktionsnetzwerken. Durch die Vernetzung unterschiedlicher Regulationsebenen wird die nächsthöhere
Komplexitätsstufe erreicht. Die Interaktion von biologischen Systemen (z. B. mikrobielle Produzenten) in Populationen ist ein
weiterer Skalenschritt. Für einen Produktionsprozess stellt die Betrachtung der Heterogenität im großvolumigen Maßstab die
höchste Komplexitätsstufe dar

Vergleich zur integrierten Betrachtung individueller 1. Vollständige Realisierung des Produktions-

Zellen verschlechtern. Die Beschreibung der Interak-
tionen einzelner Zellen bzw. Subpopulationen ist eine
weitere Steigerung der untersuchten Systemkomple-
xität. Daher sind entsprechende Modellierungsan-
sätze auf der nächsthöheren Skala angesiedelt.
Bekanntermaßen sind großvolumige Produk-
tionsreaktoren inhomogen vermischt [38, 91]. Gra-
13 dienten für pH, gelöste Gase (O2, CO2) und Subst-
rate wechselwirken mit den Produzentenzellen. Es
bilden sich Zonen unterschiedlicher Zellaktivität aus,
was die Gesamtleistung des Reaktors oftmals negativ
beeinflusst. Systembiologische Studien versuchen,
die Folgen dieser extrazellulären Einflüsse auf den
intrazellulären Stoffwechsel zu spezifizieren und zu
quantifizieren. Entsprechende Modelle umfassen die
zuvor genannten Skalen der Komplexität und werden
zusätzlich um die räumliche Inhomogenitäten der
zellulären Umgebung ergänzt. Sie verlangen daher
eine sehr komplexe Systembetrachtung und stehen
auf der höchsten Skala der Systemkomplexität.
Unter Berücksichtigung der Skaleneinteilung
systembiologischer Modelle können daher eine
Reihe von Aufgaben für die Systembiologie als
Bestandteil einer Bioprozessentwicklung formuliert
werden (Anmerkung: Die nachfolgende Liste erhebt
keinen Anspruch auf Vollständigkeit):
potenzials: Auf der Basis stöchiometrischer
Zellmodelle ist es möglich, theoretische
Maxima von Produkt/Substrat-Ausbeuten
oder Produktbildungsraten abzuschätzen
(7 Abschn. 13.3). Auch industrielle Produk-
tionssysteme haben diese Optima oftmals
noch nicht erreicht. Dies hat unter anderem
damit zu tun, dass zu deren Realisierung
eine äquilibrierte, aufeinander abgestimmte
Verstärkung bzw. Abschwächung ausgewählter
Zielgene notwendig ist. Je näher das theore-
tische Maximum erreicht werden soll, umso
mehr Zielgene müssen gleichzeitig betrachtet
werden. Mehrere interagierende Stoffwech-
selwege müssen typischerweise einander
angepasst werden, was in einer systembiologi-
schen Fragestellung mündet.
2. Eingriffe in die globale Regulation: Nicht
selten ist es Ziel bei der Entwicklung und
Optimierung von Produktionssystemen, z. B.
alternative Substrate oder die Verwendung
weniger komplexer Substratquellen (und damit
die Vermeidung zur Bedürftigkeit spezieller
Cosubstrate) anzustreben. Dieser Wechsel
der Substratbedürftigkeit greift nicht nur
unmittelbar in den Zentralstoffwechsel ein,
Kapitel 13 · Systembiologie in der ­Bioverfahrenstechnik
sondern ist auch oftmals an die anabole bzw.
katabole Reduktionskraft der Zellen und an
den Energiehaushalt gekoppelt. Aufgrund der
globalen Bedeutung ist damit die Notwen-
digkeit für systembiologische Betrachtungen
gegeben.
3. Optimierung multipler Zelleigenschaften:
Zur Verbesserung von Produktionsprozessen
kann es darüber hinaus interessant sein, die
Zellhandhabung im technischen Prozess zu
verbessern. Hierzu zählt beispielsweise die
Erhöhung der Robustheit eines Prozesses,
was z. B. als fehlende Sensitivität der zellu-
lären Produktion gegenüber ungewollten,
technisch bedingten Einflüssen auf einen
Produktionsprozess verstanden werden kann.
Mögliche Ziele einer Stammentwicklung
könnten z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber
Schwankungen des pH-Wertes, der Tempe-
ratur, der Sauerstoffverfügbarkeit, der Substrat-
verfügbarkeit etc. sein. Auch fallen Frage-
stellungen zur Verringerung der zellulären
Maintenance-Bedürfnisse in diese Kategorie
[52]. Aufgrund ihres globalen Charakters
für den Stoffwechsel sollte eine Realisierung
entsprechender Stammeigenschaften mit
systembiologischen Methoden erfolgen.
4. Zell-Prozess-Wechselwirkung: Produktions-
prozesse im technischen Maßstab werden
oftmals in Volumina von 10 m3 bis 500 m3 und
größer durchgeführt. Mischzeiten im Minuten-
bereich sind für diese Ansätze typisch. Zellen,
die in den großvolumigen Prozessen kultiviert
werden, sind daher Gradienten an Gelöst-
sauerstoff/-CO2, pH, Temperatur, Substrat-
verfügbarkeit etc. ausgesetzt. Aufgrund der in
den Reaktoren herrschenden Strömungsver-
hältnisse erfahren die Zellen wiederkehrende,
extrazelluläre Stimuli, die intrazellulär sowohl
metabolische als auch transkriptionelle
dynamische Veränderungen hervorrufen [12,
41, 46, 53, 83]. Beispielhaft sei die Zuckerauf-
nahme von E. coli in Abhängigkeit der extra-
zellulären Glucosekonzentration genannt (z. B.
[25]). Während unter Zuckerüberfluss-Be-
dingungen (Konzentration: 1 M) der Großteil
der Glucose über das verstärkt exprimierte
Porin ompC und dann hauptsächlich via PtsG
551 13
aber auch via Man in die Zelle gelangt, wird
das für Glucose spezifische PT-System bei
extrazellulären Konzentrationen von 1 μM
nur noch geringfügig genutzt, zugunsten des
verstärkt exprimierten MglBAC-Importers,
der die Glucose nun über LamB und OmpF
erhält. Fällt die extrazelluläre Glucose noch
weiter auf unter 0,1 μM, geht damit nicht
nur eine signifikante Reduktion der Wachs-
tumsrate einher, sondern auch eine veränderte
Expression der verwendeten Porine OmpC,
OmpF und LamB. Die Zuckeraufnahme ins
Zytosol findet nun wiederum via PtsG und
MglBAC statt. Dieses Beispiel verdeutlicht die
Adaptationsfähigkeit der Zellen (hier E. coli)
an sich ändernde, extrazelluläre Bedingungen.
Inwieweit derartige Zelladaptationsvorgänge
auch in Scale-up-Prozessen eine Rolle spielen,
ist bislang nur geringfügig untersucht. Die
Anwendung systembiologischer Werkzeuge
kann helfen, die häufig bei Scale-up-Verfahren
beobachteten Leistungsverluste des Prozesses
[46] besser zu verstehen.
13.3 Metabolische Ebene
Wie in . Abb. 13.3 dargestellt, beginnen systembiolo-
gische Studien bereits auf der metabolischen Ebene –
d. h. das Reaktionsnetzwerk der Zellen steht im Mit-
telpunkt der modellgetriebenen Untersuchungen.
Dabei werden Methoden zur Auswertung (pseudo-)
stationärer oder dynamischer Prozesssituationen
angewandt, die nachfolgend vorgestellt werden.
13.3.1 Stöchiometrische
Stoffflussanalysen (metabolic
flux analysis, MFA)
Bereits Ende der 1970er-Jahre verfolgten Aiba und
Matsuoka [1] den Gedanken, den Kohlenstofffluss
im Citronensäurezyklus von Candida lipolytica über
die quantitative Analyse der Reaktionsstöchiomet-
rie von insgesamt 18 Reaktionsraten (Stoffflüssen)
in Kombination mit sechs experimentell ermittelten
Aufnahme- und Produktbildungsraten zu bestim-
men. Es gelang z. B. durch Fixierung der Aktivität
 552 R. Takors
des Glyoxylat-Weges das aufgestellte Reaktionsnetz-
werk eindeutig zu bestimmen und damit intrazel-
luläre Reaktionsraten zu ermitteln, die anders nicht
zugänglich gewesen wären.
Diese Vorgehensweise charakterisiert im Wesent-
lichen das Kernstück der metabolischen Stofffluss-
analyse (MFA). Sie zielt darauf ab, n intrazelluläre
Reaktionsraten, ausgedrückt im Vektor v, durch
Stoffbilanzierung der m intrazellulären Metabolite x
quantitativ zu erfassen und darüber Rückschlüsse auf
intrazelluläre Stoffflussverteilungen zu ermöglichen.
Anfang der 1990er-Jahre wurde dieses Konzept durch
die stöchiometrische Analyse des Zentralstoffwechsels
eines L-Lysin produzierenden Bakteriums ‒ Coryne-
bacterium glutamicum ‒ maßgeblich verfeinert und
nachhaltig etabliert [94]. Wertvolle Übersichtsbeiträge
zur MFA sind bei Bonarius et al. [10], Stephanopoulos
et al. [88], Wiechert [105] und Sauer [75] zu finden.
Ausgehend von der allgemeinen Stoffbilanz für
die intrazellulären Metabolite
dx
= rx − µ ⋅ x
dt  Gl. 13.1
in der der Term μ · x deren Verdünnung aufgrund
von Wachstum beschreibt und wegen seines gerin-
gen Beitrags gegenüber den Nettoumsatzraten rx
oftmals vernachlässigt werden kann, kann Gl. 13.1
unter Annahme eines Fließgleichgewichts (steady
13 state) vereinfacht werden zu:
dx
= 0 = rx
dt  Gl. 13.2
Unter Berücksichtigung der Reaktionsstöchiometrie
(ausgedrückt in Matrix S) folgt daraus:
rx = S T ⋅ v = 0  Gl. 13.3
Dies ist die Grundgleichung der stöchiometrischen
Stoffflussanalyse. Zerlegt man Gl. 13.3 in die Anteile,
die gemessen (Index mes) und die berechnet werden
(Index calc), so folgt daraus:
T ⋅v T den ist. Um dennoch eine Lösung für das Gleichungs-
Smes mes + Scalc ⋅ v calc = 0  Gl. 13.4
Gl. 13.4 kann eindeutig für den gewünschten Fluss-
vektor vcalc gelöst werden:
−1
v calc = −( Scalc
T
) ⋅ Smes
T ⋅v
mes  Gl. 13.5
Dieser Vektor beinhaltet alle intrazellulären Flüsse,
die zusammen mit den gemessenen Aufnahme-
und Produktbildungsraten vmes die gesamte Fluss-
lage des betrachteten biologischen Systems eindeu-
tig definieren.
Mathematisch ist Gl. 13.5 nur lösbar, wenn
det ( Scalc
T
) ≠ 0, d. h. (Scalc
T
) nicht singulär und der
Rang der Matrix voll ist. Übertragen auf das bioche-
mische Reaktionssystem bedeutet dies, dass keine
linear abhängigen Reaktionsgleichungen bei der
Formulierung von S berücksichtigt werden sollen.
Linear abhängige Reaktionsgleichungen können
jedoch bei der Berücksichtigung typischer Cofak-
tor-Paare, wie z. B. ATP/ADP, NAD+/NADH oder
NADP+/NADPH, dadurch auftreten, dass deren
Gesamtgehalt (z. B. NAD+ + NADH) als konstant
angenommen wird (conserved moieties) und die
Cofaktoren mit unterschiedlichen Vorzeichen an
den Reaktionen teilnehmen. Um dies zu vermeiden,
kann z. B. immer nur ein entsprechender Reaktions-
partner berücksichtigt werden.
Der Freiheitsgrad F des Reaktionssystems aus
Gl. 13.3 bezeichnet dessen Bestimmtheit:
F = n−m  Gl. 13.6
Ist F = 0, existieren genauso viele m linear unabhän-
gige Reaktionsgleichungen, wie n Flüsse (Reaktionsra-
ten) bestimmt werden sollen, d. h. das System ist ein-
deutig bestimmt. Für F > 0 (unterbestimmt) benötigt
das System zusätzliche Flussinformationen für eine
eindeutige Bestimmung (siehe Beispiel von Aiba und
Matsuoka [1]); für F < 0 liegt eine Überstimmung vor,
d. h. zusätzliche Messinformation kann z. B. in einer
Redundanzmatrix zur Überprüfung der gemessenen
Flüsse oder zur Bestimmung von vcalc über eine Feh-
lerquadratminimierung herangezogen werden [88].
Reaktionsnetzwerke biologischer Systeme sind
oftmals so komplex, dass nicht genügend Messinfor-
mation für eine eindeutige Bestimmbarkeit vorhan-
system zu erhalten, werden Methoden der linearen
Optimierung angewandt, die eine besondere Ausprä-
gung durch die flux balance analysis (FBA) erfuhren
[98]. Varma et al. [97] untersuchten beispielsweise
Kapitel 13 · Systembiologie in der ­Bioverfahrenstechnik
ein E. coli-Netzwerk mit 107 Metaboliten, die in 95
reversiblen (d. h. 190) Reaktionen auftraten. Dieses
System hat 83 Freiheitsgrade, die nur durch wenige
Angaben zur Biomassesynthese und zu ATP-Ver-
bräuchen angereichert wurden. Ein vollständiger
Flussvektor vcalc konnte dennoch dadurch ermittelt
werden, dass eine Zielfunktion (objective function)
fobj zur optimierten Berechnung aller Flüsse vorge-
geben wurde. Während es in dem zitierten Beispiel
die Maximierung der Wachstumsrate war, können
ebenso andere Funktionen wie beispielsweise die
Maximierung einer Produkt/Substrat-Ausbeute für
die lineare Optimierung herangezogen werden.
Allgemein sollte demnach ein Gewichtungsvek-
tor a definiert werden, der eine Linearkombination
aller freien Flüsse darstellt und z. B. Flüsse in die Bio-
massesynthese oder in die Produktbildung favori-
siert. Unter Beachtung von Gl. 13.3 wird dann ein
Lösungsvektor vcalc ermittelt gemäß:
min/ max(a ⋅ v calc)
STv=0  Gl. 13.7
Eine Lösung für das stöchiometrische Reaktions-
netzwerk S mit seinen Flüssen v wird demzufolge
durch Minimierung (oder auch Maximierung)
eines gewichteten Vekors a · vcalc erreicht. Dadurch
werden je nach verwendetem Optimalitätskrite-
rium ‒ optimale Systemzustände beschrieben. Die
resultierenden Systemlösungen vcalc befinden sich
an den Kanten bzw. Eckpunkten eines konvexen
553 13
Polyhedron-Lösungsraumes (extreme pathways),
der durch zuvor definierte (biochemische) Grenzen
der reversiblen Flüsse vorgegeben wird [106]. Aus
der Literatur sind einige Beispiele bekannt, in denen
sich biologische Systeme diesen extremen Stofffluss-
lagen annähern [36]. Um sicherzustellen, dass die mit
vcalc ermittelten Lösungen auch thermodynamisch
möglich sind, kann zudem die Rahmenbedingung
für die freie Gibbsʼsche Reaktionsenthalpie der Reak-
tion i (ΔGri < 0) bei der Lösungsfindung berücksich-
tigt werden [23, 32, 43].
Wie in Gl. 13.2 aufgeführt, werden die biologi-
schen Systeme stöchiometrisch oft unter (pseudo-)
stationären Bedingungen untersucht. D. h. Ände-
rungen der bilanzierten Metabolit-Pools finden
nicht statt, die errechneten Reaktionsraten (Flüsse
v i) sind für den betrachteten Arbeitspunkt kons-
tant. Reale Produktionsprozesse werden häufig im
fed-batch-Modus betrieben mit einer anfänglichen
Biomassebildung (. Abb. 13.4, 7 Abschn. I) und
einer wachstumslimitierten Produktbildungsphase
(7 Abschn. III). Durch geeignete Wahl von Beobach-
tungszeiträumen lassen sich in diesen Phasen meist
repräsentative Zeitfenster finden, die den Bedin-
gungen der (pseudo-)Stationarität entsprechen. Die
zuvor beschriebenen Methoden zur intrazellulären
Stoffflussanalyse können angewandt werden. Analog
gilt dies für die Untersuchung von kontinuierlichen
Prozessen, die im steady-state betrieben werden.
Darüber hinaus kann es aber auch von Interesse
sein, den dynamischen Bereich II stoffflusstechnisch

. Abb. 13.4  Stöchiometrische Netzwerkanalyse für (pseudo-)stationäre bzw. dynamische Bedingungen. In der
anfänglichen batch-Wachstumsphase (I) eines fed-batch-Prozesses nimmt die Substratkonzentration cS exponenziell ab
und die Biomassekonzentration cX entsprechend zu, was zu pseudo-stationären Flussbedingungen für die Raten vS und
vX führt. Während der späteren Produktionsphase (III) sind rS und rX meist im Rahmen geeigneter Zeitfenster konstant. Die
Übergangsphase (II) ist dynamisch
 554 R. Takors
zu untersuchen. Dazu wird die Stoffbilanz in der
Form
dn
= S ⋅v*
dt  Gl. 13.8
betrachtet. Wie in . Abb. 13.4 dargestellt, beruht
die dynamische Stoffflussanalyse (DMFA) im Kern
auf einer linearen Interpolation der variablen Flüsse
v zu den Zeitpunkten 1 und 2. In der von Leighty
et al. [49] vorgestellten Methode, werden Stoffmen-
genänderungen für den gesamten Bioreaktor bilan-
ziert, was in entsprechenden volumetrischen Stoff-
flüssen v* mündet. Diese können retrospektiv auf die
jeweilige Biomasse bezogen werden, um biomasse-
spezifische Stoffflüsse zu erhalten.
13.3.2 Stoffflussanalysen auf der Basis
von Markierungsinformation
Die metabolische Stoffflussanalyse unter ausschließ-
licher Verwendung stöchiometrischer Netzwerke ist
ein wertvolles Werkzeug, um intrazelluläre Reak-
tionsraten in biologischen Systemen sichtbar zu
machen. Allerdings ist dieser Ansatz hinsichtlich
seiner Anwendbarkeit (ad 1.) und analytischer Auf-
lösung (ad 2.‒3.) eingeschränkt:
1. Zur umfassenden Beschreibung der
13 katabolen Stoffwechselregulationen ist auch
die Bilanzierung von Energie (ATP) und
Reduktionsäquivalenten (NADH, NADPH
etc.) notwendig (siehe auch conserved moieties).
Die Kopplung an den Energiehaushalt der
Zelle geschieht oftmals durch Vorgabe von
P/O-Verhältnissen, d. h. durch Vorgabe der
ATP-Bildung bei Sauerstoffverbrauch in der
Atmungskette. Zu beachten ist, dass die theore-
tisch erzielbaren Maximalwerte von P/O = 3
(in einigen Eukaryoten) und P/O = 2 (häufig
für Prokaryoten anzutreffen [63]) praktisch
nicht erreicht werden. Auch unterliegen
diese Verhältnisse der Wechselwirkung des
biologischen Systems mit den Kultivierungs-
bedingungen, sodass die Vorgabe adäquater
P/O-Verhältnisse sensibel ist und daher sehr
sorgfältig erfolgen muss. Darüber hinaus haben
Ergebnisse von z. B. Petersen et al. [68] gezeigt,
dass bakterielle Systeme auch unerwartete
Energieverbräuche (futile cycles) aufweisen,
die oftmals nicht in den stöchiometrischen
Ansätzen berücksichtigt sind.
2. Die stöchiometrische Stoffflussanalyse kann
verzweigte Stoffwechselwege dann nicht
auflösen, wenn keine Messinformation zu
den einzelnen Stoffwechselwegen vorliegt.
Ein Beispiel ist die Synthese von L-Lysin
in Corynebacterium glutamicum [87], bei
der die Synthese der Aminosäure über zwei
parallele Reaktionswege erfolgen kann, die
in einer gemeinsamen L-Lysin-Bildungsrate
münden.
3. In Analogie dazu können Nettokreislaufflüsse
in einem Reaktionszyklus nicht allein über die
Bestimmung der Ein- und Austrittsflüsse des
Zyklus ermittelt werden. Dies gilt in ähnlicher
Weise für bidirektionale Flüsse. Diese können
über die stöchiometrische Stoffflussanalyse
maximal als Nettofluss identifiziert werden.
Eine Auflösung in Hin- und Rückreaktion
erlaubt die Technik nicht.
Die Einschränkungen der stöchiometrischen Stoff-
flussanalyse haben dazu geführt, dass zusätzliche
Messinformation verwendet wird, um zumindest
einen Teil der unter den oben genannten Punkten
1. bis 3. genannten Einschränkungen aufzuheben.
Dazu werden stabile Isotope wie z. B. 13C eingesetzt,
wenngleich die Ursprünge der Markierungstechnik
zur quantitativen Flussbestimmung auf 14C-Mar-
kierung beruhen [9]. Ein häufiger Anwendungs-
fall ist dabei die Verwendung von 13C-markierter
Glucose, die an verschiedenen Positionen inner-
halb des C-6-Kohlenstoffgerüstes markiert sein
kann.1
Die generelle Vorgehensweise bei der Stofffluss-
analyse auf der Basis von 13C-Markierungsinforma-
tion ist:
55 Metabolisierung eines entsprechend
markierten Substrates (z. B. Glucose)
durch die Zellen unter geeigneten
Kultivierungsbedingungen;
1 Zu beachten ist, dass 13C mit einer natürlichen Verbrei-
tung von 1,13 % auch in „nicht“-markierten Substraten
vorkommt.
Kapitel 13 · Systembiologie in der ­Bioverfahrenstechnik
55 nachfolgende Analyse des Schicksals der
einzelnen 13C-Atome durch messtechnische
Markierungsanalyse von Stoffwechselinter-
mediaten oder -produkten;
55 Simulation dieser Markierungsmuster durch
geeignete Stoffwechselmodelle.
Wird im letzten Schritt eine Stoffflusslage so ermit-
telt, dass die gemessenen Markierungsmuster aus-
reichend genau simuliert werden, so ist der gesuchte
Vektor v calc der intrazellulären Stoffflussraten
555 13
gefunden. . Abb. 13.5 gibt einen Überblick über die
prinzipielle Vorgehensweise bei der 13C-basierten
Stoffflussanalyse. Übersichtsartikel zu dieser Thema-
tik sind z. B. von Stephanopoulos et al. [88], Szyperski
[90], Christensen und Nielsen [19], Wiechert [105],
Sauer [75] und Tang et al. [92] erschienen.
Die Methode geht implizit davon aus, dass die
untersuchten Zellen keinen Unterschied in der Meta-
bolisierung des markierten zum unmarkierten Subs-
trat „merken“, d. h. das Ergebnis der Stoffflussbe-
rechnung ist auch auf Nicht-Markierungszustände

. Abb. 13.5  Stoffflussbestimmung

EDWFK
in Markierungsexperimenten. 0DUNLHUXQJV
Unter Beachtung der IHGEDWFK DXIJDEH
Rahmenbedingung, dass sich das
&KHPRVWDW
biologische System metabolisch im
Fließgleichgewichtszustand befindet
(dx/dt = 0 = rx), was durch geeignete 3UREHQ
Kultivierungsbedingungen in batch-, QDKPH
fed-batch- oder kontinuierlichen (z. B.
Chemostat) Fermentationen erreicht
werden kann, wird die 13C-markierte
,QWUD]HOOXOlUH ([WUD]HOOXlUH
Kohlenstoffquelle verstoffwechselt
0DUNLHUXQJV )OXVV5DWHQ
und die resultierenden
EHVWLPPXQJ EHVWLPPXQJ
Markierungsmuster (siehe Text)
ermittelt. Zusammen mit den
zusätzlich gemessenen Aufnahme- 5HDNWLRQV
und Produktbildungsraten, VW|FKLRPHWULH
der Information über die
Reaktionsstöchiometrie, der
Markierungsweiterleitung und ,VRWRSRPHU
der ab initio-Schätzung von 0RGHO
Startflussverteilungen werden
intrazelluläre Stoffflüsse nachfolgend
so lange optimiert, bis eine gute DELQLWLR
Übereinstimmung zwischen den sich )OXVVYHUWHLOXQJ
so ergebenden Markierungsmustern
$QSDVVXQJXQ]XUHLFKHQG

und den Messwerten erhalten wird

6LPXODWLRQ
0DUNLHUXQJ

9HUJOHLFK
6WLPXODWLRQ0HVVXQJ

)OXVVYHUWHLOXQJ
 556 R. Takors
übertragbar. Ferner gilt auch für die isotopenba-
sierte Stoffflussanalyse die Randbedingung der
Gl. 13.3, nach der sich die Zellen zumindest in einem
(quasi) Fließgleichgewichtszustand (steady state)
befinden sollen. Dieser metabolisch (quasi-)statio-
näre Zustand (dx/dt = 0) wird z. B. in kontinuierli-
chen Experimenten mit konstanter Wachstumsrate
erreicht, phasenweise in einer batch-Fermentation
während des exponentiellen Wachstums (µ = µmax =
konstant) oder auch in speziellen fed-batch-Fermen-
tationen, bei denen die Feedrate zeitlich so variabel
eingestellt wird, dass die resultierende Wachstums-
rate konstant bleibt.
Zur Beschreibung der markierten Stoffwech-
selmetabolite wurde der Begriff Isotopomer ein-
geführt [56]. Dieser Term ist eine Kombination
der Ausdrücke Isotop und Topomer und charak-
terisiert einen der verschiedenen Markierungszu-
stände, in denen der jeweilige Metabolit auftreten
kann (. Abb. 13.6).
Prinzipiell stehen mehrere unterschiedli-
che Isotopomer-Analysentechniken zur Verfü-
gung, um die Markierungsinformation der Zellen
messtechnisch zu erfassen. Ein Ansatz ist der 1H-
oder Proton-NMR-Ansatz, in dem einfach proto-
nierte C-Atome untersucht werden. Die Kernreso-
nanzspektroskopie(NMR)-Signale erlauben eine
13
6SH]LHV 6SH]LHV 6SH]LHV
positionsspezifische Analyse der Markierung eines
Kohlenstoffgerüstes, was erfolgreich erstmals für
Stoffflussanalysen durch Marx et al. [57] eingesetzt
wurde. Eine verfeinerte Methode der NMR-Technik
wurde durch die 13C-NMR-Analyse für Stoffflussbe-
rechnungen eingeführt. In Abhängigkeit von dem
Markierungszustand benachbarter C-Atome gibt
die 13C-NMR-Technik verschiedene Peaksignale, die
eine detailliertere Auflösung der 13C-Markierungs-
muster erlauben [80]. Auch die Kombination beider
Ansätze in der zweidimensionalen NMR-Analyse ist
möglich [89].
Als eine Alternative zu den NMR-Technologien
entwickelten sich die heute sehr stark verbreiteten
Ansätze zur Massenspektrometrie (MS). Anwen-
dung finden hier Ansätze mit GC-MS [20], LC-MS
[21] und auch MALDI-TOF-MS [108]. Bei Verwen-
dung von GC-MS-Methoden müssen die zu unter-
suchenden Proben im Vorfeld chemisch derivati-
siert werden, um die resultierenden, derivatisierten
Fragmente nach GC-Trennung massenspektrome-
trisch erfassen zu können. Diese Vorbehandlung
kann bei LC-MS-Ansätzen entfallen. Generell sollte
beachtet werden, dass die Stoffflussanalyse bei MS-
Daten auf Massenisotopomeren basiert, wogegen
NMR-Signale positionsspezifische Informatio-
nen liefern (.  Abb. 13.6). Die Verwendung dieser
P P P P

DOOHQ )UDFWLRQDOHQULFKPHQW+3URWRQ105 0DVVHQ,VRWRSRPHUH

,VRWRSRPHUH PLVVW&0DUNLHUXQJXQDEKlQJLJ
YRP1DFKEDU&$WRP

. Abb. 13.6  Isotopomere. Wird ein Kohlenstoffgerüst aus drei C-Atomen betrachtet, so können theoretisch 23
= 8 verschiedene Markierungszustände erreicht werden. Die NMR-basierte Analysentechnik erlaubt prinzipiell die
positionsspezifische Auflösung einzelner Markierungen, während massenspektrometrische Ansätze einzelne Massenfraktionen
zusammen betrachten
Kapitel 13 · Systembiologie in der ­Bioverfahrenstechnik
unterschiedlichen Peaksignale muss im Rahmen der
Simulation der Markierungsmuster entsprechend
angepasst werden.
Die Anfänge der 13C-basierten Stoffflussanaly-
sen fokussierten auf die Auswertung der Markie-
rungsinformation in den proteinogenen Amino-
säuren der Biomasse. Das heißt die Zellen mussten
so lange in einem metabolisch stationären Zustand
gehalten werden (gemäß Gl. 13.3), wie es dauerte, um
die Zusammensetzung der Biomasse markierungs-
technisch in einen stationären Zustand zu verset-
zen. Dies führt zu verhältnismäßig langen Markie-
rungszeiträumen über mehrere Generationszeiten
hinweg. Um den Markierungszeitraum zu verkür-
zen, verwenden heutige Arbeiten meist die Mar-
kierungsinformation von Intermediaten des Stoff-
wechsels. Deren intrazelluläre Pools haben weitaus
schnellere Austauschraten (turn over-Raten), was
dazu führt, dass sich eine Markierungsinforma-
tion wesentlich schneller im Stoffwechsel äquilib-
riert verteilt. In bakteriellen Systemen können so
stationäre Markierungszustände im Minuten- bis
maximal Stundenbereich erzielt werden. Aktu-
elle Arbeiten von Nöh et al. [64] und Schaub et al.
[77] gehen noch einen Schritt weiter, indem zwar
die Bedingung der metabolischen Stationarität für
die Stoffflussanalyse nach wie vor aufrechterhalten
bleibt, jedoch die zeitlich transiente Markierungs-
anreicherung in den untersuchten Metaboliten des
Stoffwechsels genutzt wird, um entsprechende Stoff-
flussverteilungen für diesen beobachteten Zeitraum
zu berechnen. Die Technologie reduziert die not-
wendige Markierungszeit in bakteriellen Systemen
bis auf wenige Minuten.
Wie dargestellt, basiert die 13C-Stoffflussanalyse
auf der detaillierten Analyse von Markierungsmustern
in Zellproben, die durch geeignete Stoffflussmodelle
in einem retrospektiven Analyseschritt analog simu-
liert werden müssen. Neben der Kenntnis der Reak-
tionsstöchiometrie ist für die erfolgreiche Simulation
der Markierungsanteile die Verfolgung einzelner mar-
kierter C-Atome im Reaktionsnetzwerk unumgäng-
lich. Dies geschah erstmalig durch die Einführung von
atom mapping matrices (AMM) [112] bzw. nachfol-
gend durch das Konzept der isotopomer mapping Mat-
rizen (IMM) [79]. Dadurch wurden stöchiometrische
Reaktionsgleichungen mit der Weiterleitung des Mar-
kierungssignals in Matrizenform verbunden.
557 13
Die Nachverfolgung des Markierungssignals
im stöchiometrischen Netzwerk führt sehr schnell
zu komplexen, oftmals nicht linearen Isotopomer-
Bilanzgleichungen, die für längerkettige Kohlen-
stoffgerüste in ihrer Komplexität überproportional
ansteigen. Eine analytische Möglichkeit zur effizi-
enten Lösung dieser Matrixgleichungen wurde von
Wiechert et al. [107] vorgeschlagen. Eine alternative
Vorgehensweise zur Vereinfachung des Rechenauf-
wands bei der Auswertung großer Kohlenstoffske-
lette wurde in Form der EMU(elementary metabo-
lite units)-Netzwerkzerlegung von Antoniewicz et al.
[2] verfolgt.
Festzuhalten ist, dass die 13C-basierte Stofffluss-
analyse inhaltlich auf der rein stöchiometrischen
Stoffflussanalyse aufbaut, jedoch einige Limitie-
rung (wie z. B. ein festzulegendes P/O-Verhältnis)
aufhebt. Darüber hinaus kann dieser Ansatz auch die
unter den oben genannten Punkten 2 und 3 genann-
ten Flussszenarien teilweise analysieren. Durch die
Fokussierung auf die Auswertung metabolisch sta-
tionärer, aber markierungstechnisch instationärer
Zustände konnte die notwendige Markierungszeit
entsprechender Experimente drastisch reduziert
werden, was die prinzipielle Anwendbarkeit dieser
Methode für prozesstechnisch relevante fed-batch-
Bedingungen erlaubt [3].
Prinzipiell können die erhaltenen Stofffluss-
karten verwendet werden, um den metabolischen
Zustand von Zellen unter verschiedenen Prozess-
bedingungen vergleichend zu bewerten oder um
verschiedene Zellen unter ähnlichen Prozessbe-
dingungen zu vergleichen. Dies lässt Rückschlüsse
auf z. B. Maßnahmen für eine weitere Stamm- und/
oder Prozessverbesserung zu. Darüber hinaus
sollte beachtet werden, dass die Stoffflussana-
lyse prinzipiell eine quantitative Bestimmung der
Interaktion von Genen, Proteinen und Metaboli-
ten erlaubt und damit auch für fundamentale sys-
tembiologische Fragestellungen eingesetzt werden
kann [75]. Die Methode eignet sich daher eben-
falls für die Auswertung von high-throughput-
Parallelansätzen, auf der Basis relativer Flussän-
derungen. Beispielsweise verdeutlichten Blank
et al. [8] in einer großskaligen 13C-Flussanalyse
(741 Reaktionen) die Robustheit von Saccharo-
myces cerevisiae durch entsprechende Studien an
Knock-out-Mutanten.
 558 R. Takors
13.3.3 Metabolic Engineering
Strategien aufgrund stationärer
Systemanalysen
Die Methoden der Stoffflussanalyse zielen darauf ab,
intrazelluläre Reaktionsraten zu ermitteln, die ander-
weitig nicht zugängig sind. Damit wird ein Fenster
nicht nur zur Bewertung existierender Stämme und
Prozesse sondern auch zu deren Neuentwicklung
aufgestoßen.
Einhergehend mit der stetig wachsenden Zahl
bekannter Genomsequenzen nimmt auch die Kom-
plexität stöchiometrischer Modelle für die Stoff-
flussanalyse zu. Genomskalige Stoffwechselmodelle
bestehen typischerweise aus 500–1000 Reaktions-
gleichungen. Es ist leicht einzusehen, dass deren
Freiheitsgrad F ≫ 0 ist, d. h., das Modellierungs-
problem ist stark unterbestimmt. Daher kommt den
entsprechenden Bestimmungsmethoden für unter-
bestimmte Systeme in der Praxis eine hohe Bedeu-
tung zu.
Das von Segré et al. [84] vorgestellte MOMA-
Prinzip (minimization of metabolic adjustement)
richtet sich insbesondere an die Vorhersage von
Stoffflussverteilungen in Gen-knock-out Stämmen.
Der MOMA-Algorithmus versucht die sich durch
die Gendeletionen ergebenden Stoffflussände-
rungen gegenüber einem nicht-deletierten Refe-
renzsystem zu minimieren. Im Gegensatz zu einer
13 Flussprädiktion laut FBA befindet sich das Opti-
mierungsergebnis damit nicht auf einer Ecke des
Nullraums, sondern in der Entfernung des kleins-
ten euklidischen Abstands zum Optimum des Refe-
renzsystems. Dahinter verbirgt sich die Annahme,
dass das Ausschalten einzelner Gene nicht gleich-
bedeutend ist mit der Elimination dazugehöriger,
übergeordneter Regulationsmechanismen. Es gibt
daher noch eine ‚Erinnerung‘ an den alten System-
zustand. MOMA hat seine Qualität zur Prädiktion
von ‚kurzfristigen‘ Stoffflussverteilungen in knock-
out-Stämmen gezeigt. Langfristige Stoffflussvorher-
sagen werden allerdings besser durch FBA-Ansätze
realisiert. Ein alternatives Distanzmaß zur Bewer-
tung des Abstands zwischen Stoffflussverteilungen
des Referenzsystems und der knock-out Mutante
wurde durch Shlomi et al. [86] vorgestellt (ROOM).
Stöchiometrische Netzwerkmodelle können
auch dazu verwendet werden, neue Konstruktionen
für Produzentenstämme vorzuschlagen. Der von
Burgard et al. [13] entwickelte OptKnock-Algorith-
mus war vermutlich der erste dieser Art. Er koppelt
die Maximierung eines Zielflusses (z. B. die Produkt-
synthese) an das Wachstum der Zellen und die Auf-
rechterhaltung deren Maintenance-Bedürfnisse. In
einem verschachtelten Optimierungsverfahren wird
so eine Gruppe von 2-3 knock-out-Genen identifi-
ziert, die für die Überproduktion eines Metaboliten
charakteristisch sind. In OptStrain [69] wurde der
Suchraum für die Identifizierung optimaler Mutan-
tenstämme durch Hinzunahme einer metagenomi-
schen Datenbank stark erweitert. Da die somit for-
mulierten Optimierungsprobleme immer komplexer
wurden, hat man nachfolgend effiziente Optimie-
rungsverfahren implementiert (OptGene) [67].
Neben der alleinigen Vorhersage von Gendele-
tionen wurden ebenfalls Algorithmen zur kombi-
nierten Prädiktion von Gendeletionen und -überex-
pressionen entwickelt. Diese gehen in der Regel von
einer Proportionalität zwischen Genverstärkung und
Flusserhöhung aus. Beispielsweise ist dies in OptReg
[70] realisiert. Einen etwas anderen Ansatz verfolg-
ten Bordel und Nielsen [11]. Deren Algorithmus
basiert auf der Identifizierung von Stoffflusslagen
mit maximierter Entropieproduktion. Die zugrunde
liegenden Netzwerke dienen als ‚Blaupause‘ für die
Realisierung von Gendeletionen bzw. notwendigen
Verstärkungen.
Eine weitere Möglichkeit, die stöchiometrischen
Reaktionsnetzwerke auszuwerten, stellt die Bestim-
mung von Elementarmoden dar. Aufgrund ihrer
Definition als kleinste, nicht mehr zerlegbare Reak-
tionssysteme repräsentieren sie ebenfalls kleinste
funktionale Grundeinheiten des biologischen
Systems [82]. Reale Stoffflusslagen können somit als
Überlagerung einzelner Elementarmoden interpre-
tiert werden, was im Fall der Optimierung eines Pro-
duktionsstamms der optimierten Verwendung ent-
sprechender Elementarmoden gleichkommt.
13.3.4 Metabolische Kontrollanalyse
(metabolic control analysis,
MCA)
Die metabolische Kontrollanalyse ist ein wichti-
ges Werkzeug des Metabolic Engineering. Sie zielt
darauf ab, die metabolische Kontrolle in Stoffwech-
selwegen quantitativ zu erfassen. Dadurch können
Kapitel 13 · Systembiologie in der ­Bioverfahrenstechnik
enzymatische Reaktionsschritte (bzw. codierende
Gene) identifiziert werden, die für eine weiterfüh-
rende Stammverbesserung besonders Erfolg ver-
sprechend sind. Ein quantitatives metabolisches
Kontrollmodell ermöglicht somit die gezielte Iden-
tifizierung von Kandidaten zur Genüberexpression
bzw. -abschwächung, um den gewünschten Kohlen-
stofffluss in ein Stoffwechselprodukt zu erhöhen.
Die Wurzeln der heutigen metabolischen Kon-
trollanalyse gehen auf die unabhängig von Kacser
und Burns [39] bzw. Heinrich und Rapoport [31]
entwickelten Ansätze zurück, die 1985 eine Verein-
heitlichung fanden [14]. Die Ansätze zielen darauf
ab, die sich ergebenden Veränderungen eines Fließ-
gleichgewichtzustands (= Referenzzustand 0) für
intrazelluläre (Kohlenstoff-)Flüsse und Metabolit-
konzentrationen als Folge ausgewählter Anregungen
(z. B. durch Erhöhung der aktiven Enzymmenge,
Veränderung von Reaktionsparametern oder äußerer
Stimuli) zu beschreiben. Dabei wurde zunächst der
Fall infinitesimal kleiner Perturbationen betrachtet,
um die Gültigkeit der nachfolgend durchgeführten
Linearisierung der nicht-linearen Systemantwort
zu rechtfertigen. Zusätzlich geht die MCA noch
von weiteren Annahmen aus, wie beispielsweise der
Proportionalität zwischen der Erhöhung der aktiven
559 13
Enzymmenge und der resultierenden Reaktionsrate
und der vollständigen Bilanzierung des betrachte-
ten Reaktionssystems ohne Vernachlässigung z. B.
von Substratquellen oder Produktsenken. Fell [24],
Nielsen et al. [63], Stephanopoulos et al. [88] sowie
Visser und Heijnen [100] bieten einen Überblick
über die Grundzüge der MCA.
Im Wesentlichen verwendet die MCA globale
und lokale Parameter. Zur ersten Gruppe zählen die
Kontroll- (C) und die Antwort-Koeffizienten (R)
(control und response coefficients), die die System-
antwort als Folge der oben aufgeführten Perturba-
tionen beschreiben. Die lokal definierten Elastizitä-
ten ε fokussieren auf einzelne Reaktionsschritte.
Die . Tab. 13.1 gibt eine Übersicht über die übli-
cherweise definierten Kontrollgrößen. Hierin bedeu-
ten xk(k = 1, 2, …, m) die m unabhängigen intra-
zellulären Metabolite eines Stoffwechsels, cl(l = 1, 2,
…, r) die r unabhängigen extrazellulären Metabolite
und ei(i = 1, 2, …, n) die n (aktiven) Enzyme mit den
dazugehörigen Reaktionsraten v i. Jbeschreibt den
Stofffluss durch einen linearen Stoffwechselweg, der
im Fließgleichgewicht einer individuellen Reaktions-
rate eines Enzyms in diesem linearen Weg entspricht.
Das Suffix 0 gibt den Bezug zum Referenzzustand an.
(Die Nomenklatur lehnt sich an Wu et al. [111] an.)

. Tab. 13.1  Übersicht über typische Kontrollgrößen. Zur Definition der Parameterbezeichnung siehe Text

Lokale Größen Globale Größen

0 0
xk0  ∂vi  e 0j  ∂J   ∂ ln J 0
εikx0 =   C Jj 0 =   =  
J 0  ∂xk  J 0  ∂e j   ∂ ln ei 

Elastizität für xk
Fluss-Kontrollkoeffizient

0 0 0
e 0j  ∂vi  e 0j  ∂xk   ∂ ln xk 
εije0 = ⋅   Ckjx0 = ⋅   =  
   
J  ∂e j 
0 xk  ∂e j   ∂e j 
0

Elastizität für ej Metabolit-Kontrollkoeffizient

0 0 0
cl0  ∂vi  c 0j  ∂J   ∂ ln J 
εilc0 = ⋅   R Jj 0 = ⋅   =
 
J 0  ∂cl  
J 0  ∂c j   ∂ ln c j 
Elastizität für cl Fluss-Antwortkoeffizient

0 0
cl0  ∂xk   ∂ ln xk 
Rklx0 = ⋅   =  
 
xk  ∂cl   ∂ ln cl 
0 

Metabolit-Antwortkoeffizient
 560 R. Takors
Die in . Tab. 13.1 aufgeführten Kontrollgrößen
sind durch den jeweiligen Bezug zum Referenzzu-
stand 0 dimensionslos. Die Kontrollkoeffizienten
beschreiben, wie eine infinitesimal kleine Ände-
rung der Enzymkonzentration eine Veränderung des
Stoffflusses J oder der intrazellulären Metabolitkon-
zentration x hervorruft. Die Antwortkoeffizienten
korrelieren die Veränderung von externen Parame-
tern wie z. B. die extrazelluläre Metabolitkonzentra-
tion c mit der Antwort der internen Größen J bzw. x.
Grafisch können diese Kontrollgrößen als Tan-
genten – d. h. Linearisierung ‒ der üblicherweise
nicht linearen Funktionen des Kohlenstoffflusses und
der Metabolitkonzentration von der Enzymkonzen-
tration e am Referenzzustand 0 interpretiert werden
(. Abb. 13.7).
Zusätzlich zu diesen Kontrollgrößen umfasst die
metabolische Kontrollanalyse auch einige wesentli-
che Theoreme (zur mathematischen Herleitung siehe
z. B. [71]).
Kacser und Burns [39] waren die Ersten, die
das Summationstheorem für Fluss-Kontrollkoeffi-
zienten formulierten. Anschaulich lässt sich dieses
wie folgt erklären: In einem linearen Stoffwechsel-
weg seien die einzelnen enzymatischen Reaktions-
geschwindigkeiten proportional von der jeweiligen
13 - einzelnen „reaktionslimitierenden Schritt“, sondern
-
0

∂-,

HM
-


6WHLJXQJ&LM  
∂HM
-L

H H
. Abb. 13.7  Fluss-Kontrollkoeffizient. Die Definition des
Fluss-Kontrollkoeffizienten entspricht einer Linearisierung
der üblicherweise nicht linearen Funktion des Flusses
J in Abhängigkeit von der Enzymkonzentration e am
Referenzpunkt 0
Enzymmenge abhängig. Werden alle Enzyme um den
gleichen Faktor α = dej/ej erhöht, dann erhöht sich
damit proportional die Rate aller Enzymreaktionen
und damit der gesamte Kohlenstofffluss dieses Weges
um den gleichen Anteil α = dJ/J. Die Konzentrationen
der Metabolite bleiben dabei konstant. Die gesamte
Änderung des Kohlenstoffflusses dJ ergibt sich aus
der individuellen Änderung der Teilreaktionen i
1  dJ 
n
dJ
= ∑   dei  Gl. 13.9
J J  de 
i =1  i  e j j =1,…, n und j ≠i
Unter Berücksichtigung der in . Tab. 13.1 angege-
benen Definition für den Fluss-Kontrollkoeffizien-
ten C folgt daraus
dJ
n  de 
= ∑ CiJ  i   Gl. 13.10
J  ei 
i=1
was unter Berücksichtigung von α = dej/ej und α =
dJ/J zum Summationstheorem führt:
n
∑ CiJ = 1  Gl. 13.11
i =1
Das Theorem besagt, dass die Flusskontrolle eines
linearen Stoffwechselweges auf die einzelnen Reak-
tionsschritte verteilt ist. Es gibt demnach nicht einen
mehrere Reaktionen, die mehr oder weniger stark
den Fluss kontrollieren. Nur in dem theoretischen
Fall, dass ein Fluss-Kontrollkoeffizient 1 und der
Rest 0 wäre, hätte dieser die hundertprozentige Stoff-
flusskontrolle. Experimentelle Belege dafür wurden
jedoch nicht beobachtet [24]. Anzumerken ist eben-
falls, dass Fluss-Kontrollkoeffizienten negativ werden
können. Dieser Fall tritt beispielsweise bei verzweig-
ten Stoffwechselwegen auf, wenn sich die Aktivitäts-
erhöhung eines Enzyms negativ auf den Fluss durch
den abzweigenden Weg auswirkt.
In Analogie zum Summationstheorem des Stoff-
flusses kann ein entsprechendes Theorem für Kon-
zentrations-Kontrollkoeffizienten hergeleitet werden:
m
∑ Cix = 0  Gl. 13.12
i =1
Kapitel 13 · Systembiologie in der ­Bioverfahrenstechnik
Diese Formulierung beinhaltet, dass zumindest
einer der Metabolite des linearen Stoffwechselweges
eine negative Konzentrationskontrolle ausübt. Das
heißt, dessen Konzentration verringert sich, wenn
die Enzymaktivität erhöht wird.
Die Elastizitäten ε beschreiben den Einfluss
von Metabolitkonzentrationen oder (aktiven)
Enzymmengen auf eine einzelne Nettoreaktions-
rate. εikx0 < 0 bedeutet beispielsweise, dass die Erhö-
hung der Metabolitkonzentration xk aus dem Refe-
renzzustand 0 die Nettoreaktionsrate vi verringert.
Dies kann z. B. bei einer reversiblen Michaelis-Men-
ten-Reaktion bei Erhöhung der Produktkonzentra-
tion der Fall sein.
Für den Fall einer einfachen Michaelis-Menten-
Kinetik mit v = v max · xS/(xS + KM) errechnet sich
die Elastizität zu
xS ∂v KM  Gl. 13.13
εx = ⋅ =
v ∂xS ( xS + K M )
Das heißt für Konzentrationen x S ≪ K M ist das
System mit dem Grenzwert der Elastizität von 1
relativ sensibel für Änderungen in der Substrat-
konzentration. Für Werte xS ≫ KM dagegen sind die
resultierenden Elastizitäten deutlich kleiner als 1, was
die geringe Sensitivität gegenüber Konzentrationsän-
derungen in diesen Bereichen dokumentiert.
Das Konnektivitätstheorem (connectivity theorem)
verbindet Elastizitäten mit Fluss-Kontrollkoeffizienten.
n form C und E angegeben. I bezeichnet die Einheits-
∑ CiJ ⋅ ε xji = 0  Gl. 13.14
i =1
Es beschreibt damit, wie enzymkinetische Eigen-
schaften (ausgedrückt in den Elastizitäten) den Fluss
kontrollieren. Durch die Verknüpfung von Elastizi-
täten mit Fluss-Kontrollkoeffizienten besitzt es eine
besondere Bedeutung bei der Identifizierung dieser
Größen aus experimentellen Daten.
Wird beispielsweise das einfache Reaktionssys-
tem der . Abb. 13.8 betrachtet, so kann das Konnek-
tivitätstheorem wie folgt formuliert werden:
CJ ε C J0 = E x0 ⋅ C X0 + I 
C1J ⋅ ε11 + C2J ⋅ ε12 = 0 ⇒ 1J = − 12
C2 ε11 −1
 Gl. 13.15
561 13
ˢ ˢ
&- &-
; ; ;
Y Y
. Abb. 13.8  Beispiel eines linearen Stoffwechselweges
mit den Elastizitäten für den Metaboliten X2 sowie Fluss-
Kontrollkoeffizienten der zu- und abführenden Reaktion
Das relative Verhältnis zweier aufeinanderfolgender
Fluss-Kontrollkoeffizienten wird demnach durch
die Elastizitäten des Produktes und des Substrates
(und damit durch die kinetischen Eigenschaften der
beteiligten enzymatischen Reaktionen) bestimmt.
Offensichtlich treten hohe Flusskontrollen zusam-
men mit geringen Elastizitäten auf. Umgekehrt sind
hohe Elastizitäten bei Reaktionen mit geringer Fluss-
kontrolle anzutreffen. Letzteres gilt beispielsweise für
enzymatische Reaktionen, die nahe am thermodyna-
mischen Gleichgewicht arbeiten.
In der Regel sind die betrachteten Reaktionssys-
teme so komplex, dass eine Formulierung der oben
angegebenen MCA-Theoreme in Matrix-Notation
notwendig wird. Daher werden die entsprechen-
den Vektoren x (intrazelluläre Metabolite), c (extra-
zelluläre Metabolite), v (intrazelluläre Flüsse) und
e (aktive Enzymmengen) eingeführt. Die Kontroll-
koeffizienten und Elastizitäten werden in Matrizen-
matrix. Deren Verwendung führt zur Formulierung
der Theoreme wie folgt:
C J0 ⋅ I = 1 Flusskontrolltheorem  Gl. 13.16

C X0 ⋅ I = 0 Konnektivitatstheorem  Gl. 13.17
Wie in Visser und Heijnen [100] gezeigt, können
unter Berücksichtigung der Reaktionsstöchiome-
trie in Matrix S und der Theoreme Gl. 13.16 und
13.17 die Kontrollkoeffizienten wie folgt bestimmt
werden:
Gl. 13.18
C x0 = −( S  J o  E X0 ) ⋅ S  J 0   Gl. 13.19
 562 R. Takors
Die MCA-Anwendung zur Systemanalyse auf expe-
rimenteller Datenbasis war Gegenstand vielseitiger
Studien (z. B. [24]). Allerdings zeigte sich, dass die
Bedingung einer „infinitesimal“ geringen Pertur-
bation experimentell nur schwer umsetzbar ist. So
sollten intrazelluläre Änderungen der Metabolit-
oder Enzymkonzentration nur moderat sein, um
der Theorie-immanenten Homöostase-Bedingung
Rechnung zu tragen. Unerwünschte Sekundäref-
fekte wie z. B. unspezifische Enzymreaktionen oder
enzyme crowding sollen vermieden werden. Darüber
hinaus ist es notwendig, das betrachtete biologische
System im (angeregten) Fließgleichgewichtszustand
zu untersuchen, was oftmals die mehrfache Verände-
rung von Genexpressionen bzw. Enzymmengen zur
erfolgreichen Realisierung eines stabilen steady state-
Referenzzustands notwendig macht. Demgegen-
über steht die Tatsache, dass gerade die quantitative
Analyse einer (starken) dynamischen Systemantwort
ein wertvoller Baustein für ein quantitativ-mecha-
nistisches Systemverständnis darstellt. Diese dyna-
mische Systemanalyse widerspricht jedoch offen-
sichtlich dem ursprünglichen MCA-Gedanken, der
durch die Gültigkeitsbedingung der oben angegebe-
nen Linearisierung geprägt ist.
Eine alternative Vorgehensweise ist daher die
Anwendung der MCA-Werkzeuge (Elastizitäten,
Kontrollgrößen und Theoreme) auf der Basis nicht-
linearer Modelle. Vorausgesetzt, dass deren Para-
13 meter durch repräsentative Studien (z. B. in vivo-
Analysen) für das betrachtete biologische System
ausreichend identifiziert wurden, können die resul-
tierenden Modellaussagen mit den zuvor genannten
MCA-Werkzeugen untersucht werden. Eine Mög-
lichkeit der Systembeschreibung sind die in 7 Kap. 3
aufgeführten mechanistischen Enzymkinetiken.
Diese besitzen typischerweise die Form
v = vmax⋅ f (x, e, c )  Gl. 13.20
Das heißt die enzymkatalysierte Reaktion hängt
von intrazellulären Metabolitkonzentrationen x, der
Enzymmenge e sowie Effektoren c ab. Alternative
Modellierungsansätze sind beispielsweise die S-Sys-
teme [74] oder die convenience-Kinetiken [51].
Die Verwendung mechanistischer Enzymki-
netiken zur Beschreibung metabolischer Reak-
tionen eröffnet prinzipiell die Möglichkeit zur
unmittelbaren Interpretation der identifizierten
Parameter im Kontext der angenommenen Reak-
tionsmechanismen. Andererseits lassen die großen
Unterschiede zwischen den in vitro-Bedingungen
enzymkinetischer Studien und den realen in vivo-
Bedingungen in Zellen Zweifel daran aufkommen,
inwieweit in vitro-Enzymkinetiken zur in vivo-
Modellierung herangezogen werden können [54,
99, 110]. Auch ist die Identifizierbarkeit enzymki-
netischer Parameter anhand experimenteller Daten
oftmals eingeschränkt.
Die von Hatzimanikatis et al. [29, 30] und Hatzi-
manikatis und Bailey [28] vorgestellten Ansätze wie
auch die von Visser und Heijnen [101] vorgestell-
ten lin-log-Kinetiken repräsentieren eine Alternative
zu den zuvor genannten Modellansätzen. Sie zielen
darauf ab, mit vergleichsweise wenig Parametern die
Dynamik eines metabolischen Reaktionssystems
hinreichend genau zu beschreiben. Der Ansatz ist
motiviert durch grundlegende Arbeiten zur Nicht-
Gleichgewichtsthermodynamik [65], die in der Fol-
gezeit von anderen Autoren aufgegriffen und für
biochemische Reaktionen untersucht wurden [62,
73, 96, 104]. So haben beispielsweise van der Meer
et al. [96] gezeigt, dass durch Einführung der Affi-
nität als Differenz der chemischen Potenziale von
Produkt und Substrat einer reversiblen Michaelis-
Menten-Funktion, diese innerhalb 75 % der mög-
lichen Reaktionsraten mit einer Abweichung unter
15 % des „originalen“ Verlaufs approximiert werden
kann. Eine Reaktion des Typs
2⋅ X S ↔ X P  Gl. 13.21
würde demnach unter Verwendung der freien
Gibbs’schen Reaktionsenthalpie Gl. 13.22 mit der
Affinität A zu
A = ∆GR0 + 2 ⋅ R ⋅ T ⋅ ln( xS) − R ⋅ T ⋅ ln( xP)  Gl. 13.22
beschrieben werden. Aufgrund der Annahme,
dass die resultierende Reaktionsrate v proportio-
nal zur (aktiven) Enzymenge e und der Affinität
A ist, können somit Reaktionsraten als Funktion
dieser Größen formuliert werden. Um einen grö-
ßeren Freiheitsgrad in der Beschreibung bioche-
mischer Reaktionen zuzulassen, heben Visser und
Heijnen [101] die Restriktion zur Verwendung der
Kapitel 13 · Systembiologie in der ­Bioverfahrenstechnik
stöchiometrischen Koeffizienten zur Formulierung
der Affinität auf. Der steady state-Fluss J°Für die
Reaktion (13.21) wird somit beschrieben als
J 0 = e 0 ⋅ (a + b ⋅ ln xS0 + c ⋅ ln xP0 )  Gl. 13.23
Unter Verwendung der Definition der Elastizitäten
(. Tab. 13.1) wird daraus
e  x x 
= 0 ⋅ 1 + εS0 ⋅ ln S0 + εS0 ⋅ ln P0   Gl. 13.24
v
J 0 e  xS xP 
oder in allgemeiner Schreibweise:
v e x c
= (1 + Ex0 ⋅ ln 0 + Ec0 ⋅ ln 0 )  Gl. 13.25
J 0 e0 x c
Darin sind v und J° Vektoren der Größe n zur
Beschreibung der Nettoreaktionsraten bzw. der Refe-
renzflüsse, e/e° kennzeichnet eine Diagonalmatrix
der relativen Enzymgehalte, E x0 und Ec0 reprä-
sentieren die nxmx,c Elastizitätsmatrizen für die mx
Metabolitkonzentrationen und mc Effektoren und
ln(x/x°) bzw. ln(c/c°) sind die entsprechenden Vek-
toren der Metabolite bzw. Effektoren.
Unter Verwendung dieses Modellierungsansat-
zes ist es somit möglich, dynamische experimentelle
Daten für die Identifizierung eines entsprechen-
den Modells zu nutzen, welches implizit wichtige
Größen der MCA enthält – namentlich die Elast-
izitäten. Diese können via Gl. 13.18 und 13.19 zur
Bestimmung von Kontrollkoeffizienten herangezo-
gen werden. Damit lassen sich wichtige Kontrollme-
chanismen auf der Basis von dynamischen Experi-
menten bestimmen.
13.4 Zelluläre Regulation
Die in 7 Abschn. 13.3 vorgestellten Ansätze fokus-
sieren auf die systembiologische Analyse der zellu-
lären metabolischen Ebene. Im Vordergrund stehen
(pseudo-)stationäre stöchiometrische Netzwerke, die
keinerlei Information über intrazelluläre Poolgrößen
berücksichtigen. Diese fließt erst bei entsprechen-
den dynamischen Betrachtungen (siehe z. B. linlog-
Gleichung) mit ein. Dadurch ist es möglich meta-
bolische Regulation wie beispielsweise Aktivierung
563 13
oder Hemmung von Enzymreaktionen abzubilden.
Beispiele sind die Reaktionskinetik 1. Ordnung einer
Michaelis-Menten Reaktion für Konzentrationen im
Affinitätsbereich des Substrates oder feedback-In-
hibierungen. Letztere treten häufig in Aminosäure-
Biosynthesewegen auf und wirken als Produkthem-
mung auf ein Eingangsenzym der Biosynthese.
Metabolische Regulationsmechanismen sind
entsprechend der Reaktionsdynamik sehr schnell.
Antworten auf extrazelluläre Stimulationen werden
innerhalb weniger Sekunden in den Zellen sichtbar
[53]. Sie können daher als Bestandteil der taktischen
Stoffwechselregulation betrachtet werden.
Darüber hinaus besitzt die Zelle aber auch Mög-
lichkeiten, sich langfristig z. B. auf nutritive Man-
gelsituationen einzustellen. Die damit verbundenen
Mechanismen sind Bestandteil der strategischen
Regulation. Diesbezügliche Wechselwirkungen
spielen sich auf der transkriptionalen oder auch post-
translationalen Ebene ab. Unter Berücksichtigung
der Tatsache, dass mRNA-Halbwertszeiten meist nur
wenige Minuten betragen, kann davon ausgegangen
werden, dass entsprechende Regulationsmechanis-
men ebenfalls im Minuten- bis Stunden-Zeitfenster
aktiv werden. Die schnellsten strategischen Regula-
tionsantworten liegen damit in der gleichen Größen-
ordnung wie z. B. Mischzeiten in großvolumigen Bio-
reaktoren (siehe 7 Abschn. 13.6).
Eine Möglichkeit zur verknüpften Analyse zwi-
schen metabolischer und transkriptionaler Regu-
lation stellt die transkriptionale Flussbilanzanalyse
(tFBA) von van Berlo et al. [95] dar. Die tFBA geht
von der Grundannahme aus, dass intrazelluläre
Stoffflussveränderungen proportional in den Tran-
skriptionsniveaus der beteiligten Enzym-kodieren-
den Gene sichtbar sein sollten. Dies impliziert, dass
post-translationale Regulationen inklusive Protein-
aktivierungen bzw. -inaktivierungen genauso von
untergeordneter Bedeutung sind, wie Veränderun-
gen der intrazellulären Poolgrößen, die metabolische
Regulationen auslösen könnten. Die tFBA übersetzt
somit unterschiedliche Transkriptionsniveaus in
Unter- und Obergrenzen der entsprechenden Stoff-
flüsse. Im mathematischen Sinn wird dadurch der
Lösungsraum für die tFBA verkleinert.
Darüber hinaus bestehen natürlich vielfach Mög-
lichkeiten, die heterogenen Datensätze systembio-
logischer Experimente miteinander zu vergleichen,
 564 R. Takors
um zugrundeliegende Regulationsmechanismen zu
identifizieren. So können beispielsweise Werkzeuge
der multivarianten Statistik eingesetzt [76] oder Zeit-
reihen aus transkriptionalen Daten und Stoffflussver-
teilungen miteinander verglichen werden, um sensi-
tive Prozessphasen zu untersuchen [81].
13.5 Subpopulationen
Mikrobielle Populationen in Bioprozessen sind nicht
homogen, sondern heterogen [58]. Dies trifft in ana-
loger Weise auch auf Säugerzellkulturen in pharma-
zeutischen Produktionsprozessen zu [37]. Mögliche
Ursachen der Heterogenität sind der Einfluss des
Zellzyklus, des Zellalters und/oder externer Stress-
faktoren [50, 58]. Darüber hinaus wird auch die
Bedeutung stochastischer Genexpressionen disku-
tiert [4]. Asymmetrische Größenverteilungen nach
Zellteilung, unterschiedliche Phasen der Zellzyklus-
Zugehörigkeit und variable Systemantworten auf
extrazelluläre Stresseinwirkungen aus der Mikroum-
gebung der Zellen sind die Folge. Als Konsequenz
wurden z. B. während des exponentiellen Wachstums
bzw. in der stationären Phase einer E. coli Kultur 5
bzw. 10 Subpopulationen detektiert [55].
Die Aufteilung in Subpopulationen kann für
einen mikrobiellen oder zellbiologischen Produk-
tionsprozess Auswirkungen auf die Qualität haben.
13 Integrale Leistungsdaten eines Bioprozesses wie
volumetrische Produktivität, Produkt/Substrat-Aus-
beute, Produkttiter und -reinheit ergeben sich aus der
Summe der Einzelbeiträge der Subpopulationen. Ist
die Produktbildung einer Subpopulation verringert,
wird dadurch das Ergebnis des gesamten Prozesses
in Mitleidenschaft gezogen. Daher ist es von hohem
Interesse, die Mechanismen von Subpopulationsdy-
namiken zu verstehen, um so deren mögliche Leis-
tungsminderende Wirkung durch Stamm- und/oder
Prozessveränderungen zu begegnen.
Zur Untersuchung der Populationsheteroge-
nität sind eine Reihe von unterschiedlichen Mess-
methoden bekannt [50]. Zu nennen sind beispiels-
weise rep-Fingerprinting (repetitive bakterielle
Genomelemente werden detektiert), Gen-Reporter
Systeme (z. B. via β-Galaktosidase, fluoreszieren-
der Proteine, Proteininteraktionen, FRET), mikro-
skopische Verfahren, Raman-Spektroskopie oder
Durchflusszytometrie (in Kombination mit Zellsor-
tierungstechniken). So wurde beispielsweise die GFP
vermittelte Fluoreszenz an die Aktivierung des zen-
tralen Stress-Sigma-Faktors rpoS::gfp [22] oder an
die Plasmidstabilität und -kopienzahl [37] gekop-
pelt. Mustafi et al. (2014) [59] untersuchten mittels
Fluoreszenz (eYFP) die L-Valin-Produktion in C.
glutamicum, wodurch eine starke Heterogenität der
Kultur sichtbar wurde.
Wie in Lencastre Fernandes et al. [50] und
Henson [33] dargelegt, können segregierte Popula-
tionsmodelle prinzipiell in zwei Klassen aufgeteilt
werden: population balance models (PBM) oder cell
ensemble models (CEM). Erste versuchen segregierte
Populationsbilanzen zu erstellen, indem individu-
elle Wachstumsraten und Verteilungsfunktionen für
Zellteilungsraten (breakage function b) bzw. charak-
teristische Zelleigenschaften (partitioning function p)
formuliert werden (siehe Formel 13.26).
∂f (y, t )
+ ∇y (r ⋅ (y, t ) ⋅ f (y, t )) = 2 ⋅ ∫ b (y, t ) ⋅ p (y, y*, t )
∂t
Vy
⋅f ( y*, t ) dy* − b (y, t ) ⋅ f (y, t ) − D ⋅ f (y, t )
 Gl. 13.26
Hierin bezeichnet y einen Zustandsvektor, der zur
Vereinfachung meist auf eine einzige skalare Eigen-
schaft beschränkt wird. Beispielsweise ist dies das
Zellvolumen als Spiegelbild der Wachstumsrate. Die
breakage function b beschreibt die Wahrscheinlich-
keit mit der eine Zelle des Zustands y sich im nächs-
ten Zeitintervall teilt. Die partitioning function p steht
für die Wahrscheinlichkeit, dass Zellen der Eigen-
schaft y im nächsten Intervall gebildet werden. D
entspricht der Durchfluss- bzw. Verdünnungsrate
des bilanzierten Systems. Gl. 13.26 ähnelt somit einer
‚Stoff ‘-bilanz für ein offenes System zur Beschrei-
bung des zeitlichen Verlaufs der Verteilungsfunk-
tion f für die Eigenschaft y.
Intrazelluläre Stoffwechseleigenschaften bleiben
in den PBM Ansätze unberücksichtigt. Dies unter-
scheidet sie von CEMs, die z. B. Stoffwechseldynami-
ken über Differentialgleichungssysteme beschreiben.
Subpopulationen werden durch heterogene Startbe-
dingungen bzw. unterschiedliche Systemparameter
erzeugt. Beide, PBM- und CEM-Ansätze, werden
heute eingesetzt, um etwas Licht in die bislang noch
Kapitel 13 · Systembiologie in der ­Bioverfahrenstechnik
wenig verstandenen Mechanismen der Subpopula-
tionsausprägung und deren Prädiktion zu werfen.
13.6 Scale-up
Wird ein Bioprozess aus dem Labor- in den Produk-
tionsmaßstab übertragen, gilt es eine Vielzahl von
chemischen, biologischen und physikalischen Ein-
flussgrößen zu beachten [91]. Deren Zusammenwir-
ken kann dazu führen, dass Leistungsdaten der groß-
volumigen Produktion (>10.000 L) schlechter sind
als diejenigen des zugrundeliegenden Laborverfah-
rens [46]. Die Wirtschaftlichkeit des gesamten Pro-
zesses – bestehend aus Fermentation und Aufarbei-
tung (up- und downstream) – ist das entscheidende
Kriterium für dessen Realisierung. Werden bei-
spielsweise in der Fermentation wegen unerwarteter
Nebenproduktbildung nicht die erwarteten Produk-
treinheiten erzielt und das Aufarbeitungsverfahren
dadurch aufwändiger, kann dies zum wirtschaftli-
chen Aus des Prozesses führen. Über Erfolg oder
Misserfolg eines neuen Produktionsverfahrens ent-
scheiden somit in erster Linie wirtschaftliche Kenn-
zahlen. Diese beruhen meist auf den Labordaten.
Ziel eines erfolgreichen scale-up sollte es daher
sein, die Leistungsdaten aus dem Labor im Produk-
tionsmaßstab mindestens zu erreichen. System-
biologische Untersuchungen können dabei helfen,
das komplexe Zusammenwirken zwischen biologi-
schen, chemischen und physikalischen Parametern
zu beleuchten.
Ein besonderes Augenmerk wurde bislang auf die
Wechselwirkung von Gradienten im Bioreaktor [38]
mit dem zellulären Stoffwechsel gelegt. Aufgrund
der Schnelligkeit metabolischer Reaktionen ist es
naheliegend, dass lokale Inhomogenitäten, z. B. der
Sauerstoff- oder der Substratverfügbarkeit, die Stoff-
wechselaktivität unmittelbar beeinflussen. Studien
aus dem Jahr 1998 mit einem 12 bzw. 20 m3-Reaktor
offenbarten bis zu 400-fach überhöhte, lokale Gluco-
sekonzentrationen, die zur erhöhten Acetatbildung
und einer um ca. 20 % verringerten Biomassebil-
dung von E. coli führten [15]. In der Folgezeit wurden
überwiegend scale-down-Untersuchungen durchge-
führt, in denen die großskaligen Gradienten in geeig-
neten Versuchsanlagen simuliert wurden. Eine Viel-
zahl von Untersuchungen belegen, dass mikrobielle
565 13
Produktionszellen metabolisch sehr schnell und
zellspezifisch auf extrazelluläre Gradienten reagie-
ren [60, 61, 91].
Wie bereits in 7 Abschn. 13.4 dargestellt, liegen
schnelle transkriptionale Antworten und Mischzei-
ten eines großvolumigen Bioreaktors in ähnlichen
Zeitskalen. Die transkriptionelle Zellantwort auf
Inhomogenitäten eines 20 m3-Reaktors wurde erst-
mals durch Schweder et al. [83] anhand der Expres-
sion ausgewählter Stressgene (dnaK, clpB – Hitze-
stress; clpB – Hungerstress; proU – osmotischer
Stress, ackA – Glucoseüberschuss; frd, pfl – Sauer-
stofflimitierung) für E. coli untersucht. Im ‚mittle-
ren‘ und ‚oberen‘ Reaktorbereich wurde eine erhöhte
Expression dieser Gene festgestellt. Dazugehörige
durchflusszytometrische Messungen von Hewitt et
al. [35] offenbarten, dass die wechselnde Sauerstoff-
und Glucoseverfügbarkeit in einem 20 m3-Reaktor –
trotz reduzierter Biomassebildung – zu relativ hoher
Zellvitalität führt. Für Corynebacterium glutamicum,
einem häufig verwendeten industriellen Aminosäu-
reproduzenten, zeigten Käß et al. [40, 41] dessen
Robustheit gegenüber Substrat- und Sauerstoffgra-
dienten. Gleichzeitig offenbart dieser Stamm sehr
schnelle transkriptionale Antworten in Gegenwart
von pCO2 Gradienten [12], welche in industriellen
Reaktoren ebenfalls auftreten.
Art und Ausprägung der Gradienten in indus-
triellen Bioreaktoren sind daher sehr vielschichtig.
Dies spiegelt sich ebenso in der komplexen System-
antwort wider. Dadurch wird eine a priori Abschät-
zung der Leistungsdaten eines großvolumigen Pro-
zesses ausgehend vom Laborergebnis erschwert.
Entsprechende systembiologische Untersuchun-
gen zielen daher darauf ab, ein quantitatives, modell-
gestütztes Verständnis für die scale-up-bedingten Sti-
mulus/Response-Phänomene zu erlangen. Parallel
dazu werden Ansätze verfolgt, Inhomogenitäten
großvolumiger Reaktoren durch computational fluid
dynamics (cfd)-Ansätze zu simulieren. Neben der
Simulation der Hydrodynamik und des Stofftrans-
ports werden metabolische Aktivitäten der Zellen
mit einbezogen. So erfolgten durch Schmalzriedt
et al. [78] und Vrabel et al. [102] erste Multi-Kom-
partment-Simulationen mit Bacillus subtilis und E.
coli. Diese zunächst auf Euler-Euler Ansätzen beru-
henden Simulationen wurden in der Folgezeit durch
Euler-Lagrange Ansätze ersetzt. Charakteristisch ist
 566 R. Takors
dabei, dass Zellen individuell betrachtet werden und
nicht länger im Kontinuum der Flüssigkeit gebun-
den sind. Lapin et al. [44, 45] waren die ersten, denen
es dadurch gelang, segregierte Populationsmodelle
für Saccharomyces cerevisiae und E. coli im Bioreak-
tor zu erstellen. Es ist davon auszugehen, dass diese
Ansätze zukünftig weiter entwickelt werden, um so
einer verlässlichen a priori Prädiktion großvolumiger
Produktionsprozesse näher zu kommen.
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Serviceteil
Symbolverzeichnis – 572

Indizierung – 578

Stichwortverzeichnis – 579

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2018

H. Chmiel, R. Takors, D. Weuster-Botz (Hrsg.), Bioprozesstechnik,
https://doi.org/10.1007/978-3-662-54042-8
572

Symbolverzeichnis

A [m²] Oberfläche, Austauschfläche, Klärfläche

A Stöchiometrische Matrix der Elemente
a Gewichtungsvektor zur Optimalitätsberechnung
a´ [m-1] spezifische Austauschfläche, bezogen auf den Reaktorinhalt
B* Mikrobiologischer Behandlungseffekt
B Vektor der Bedingungen
Bi Biot-Zahl
Bo Bodensteinzahl
CPPI Contaminant-specific Purification Performance Index
c [kg/m³]; [mol/m³] Konzentration
cp [kJ/(kg K)] spezifische Wärme bei konstantem Druck
C Kontrollkoeffizient
C [KBE/ml]; [mol/l]; [g/l] Keimzahl (Koloniebildende Einheiten), Konzentration
C* chemischer Behandlungseffekt
Cv Kavitationszahl
C w, cw Widerstandsbeiwert
D [1/h] Verdünnungsrate, Durchflussrate
D Matrix zur Beschreibung des dynamischen Prozessverhaltens
D, d [m] Durchmesser
Da Damköhlerzahl
De Deborahzahl
D [m²/s] Diffusionskoeffizient, Dispersionskoeffizient
Dax [m²/s] axialer Dispersionskoeffizient
Dϑ [s]; [min] D-Wert bei der Temperatur ϑ
dp [m] Partikeldurchmesser
[E] [kg/m³]; [mol/m³] Enzymkonzentration
[EI] [kg/m³]; [mol/m³] Konzentration des Enzym-Inhibitor-Komplexes
[ES] [kg/m³]; [mol/m³] Konzentration des Enzym-Substrat-Komplexes
E [V/m] elektrische Feldstärke
E Elastizitätsmatrix
E Anreicherungsfaktor
E a, EA [kJ/mol] Aktivierungsenergie
Es [J/mol] scheinbare Aktivierungsenergie
E<z> Erwartungswert der Größe z
e (aktive) Enzymmenge, Enzymbedarf
ee Enantiomerenüberschuss
eeff [C]; [A s] effektive Ladung eines Teilchens
e(t) Regelabweichung zum Zeitpunkt t
F [C/mol] Faradaykonstante
F Freiheitsgrad des Reaktionssystems
F [s]; [min] F-Wert, Verweilzeitsummenfunktion
F [N] Kraft
Fo Fourierzahl
Fr Froudezahl
F(t) Jacobi-Matrix von f() zum Zeitpunkt t
F [l/h] Zulaufstrom (feed)
FT(t) die transponierte Matrix von F(t)
f Reibungsbeiwert
fM [s/m1/3] Manningfaktor
f(x,θ) Reaktionsvektor
G [kJ/mol] Gibbs-Potenzial (freie Enthalpie)
G [Pa] elastischer Schermodul
 573
Symbolverzeichnis

Ga Galileizahl
Gr Grashofzahl
G* [Pa] komplexer Schermodul1
G‘ [Pa] Realteil von G* (Speichermodul)
G” [Pa] Imaginärteil von G* (Verlustmodul)
ΔG# [kJ/mol] Aktivierungsenergie/ -enthalpie
ΔG°/ [kJ/mol] biologisch verfügbare Energie (Standardbedingungen)
ΔGri freie Gibb’sche Reaktionsenthalpie der Reaktion i
g [m/s²] Erdbeschleunigung
H [mol/(m3 bar)] Henryscher Verteilungskoeffizient, Henry Konstante
H, h [m] Höhe
H(t) Jacobi-Matrix zum Zeitpunkt t
[I] [kg/m³]; [mol/m³] Inhibitorkonzentration
I [mol/m³] Ionenstärke
I Einheitsmatrix
J [mol/s] Stoffstrom, Fluss
IP Isoelektrischer Punkt
i Multiplikationsfaktor
i(t) Istwert zum Zeitpunkt t
J Stofffluss eines linearen Stoffwechselweges
Jp [m³/(m2s)]; [kg/(m2s)] Membranfluss/Flux
j Colburnzahl
K Aussalzungskonstante
K Aufschlussgeschwindigkeitskonstante
K Kalman-Verstärkung
K Verstärkungsfaktor des PID-Reglers
K Flusskonsistenzindex (im Fließgesetz von Ostwald und de Waele)
Ka Assoziationskonstante, Bindungskonstante
Kd Dissoziationskonstante
K E, Ki Verteilungskoeffizient
Keq thermodynamische Gleichgewichtskonstante
KH [mol/(m3 bar)] Henry-Konstante
Ki Gleichgewichtskonstante, Dissoziationskonstante
KiP Produktinhibierungskonstante
KiS Substratüberschussinhibierungskonstante
Kl [m/s] Gesamtstofftransportkoeffizient
Km Michaelis-Menten-Konstante, Sättigungskonzentration (Enzymkinetik)
KMO Proportionalitätskonstante
KS [mmol/l]; [g/l] Sättigungskonzentration des Substrats, Parameter im Monod-Modell
KI [mmol/l]; [g/l] Inhibierungskonstante, Inhibierungskonzentration des Substrats
KS Verteilungskoeffizient des Substrates
K´ Kapazitätsfaktor
k Boltzmann-Konstante
k [1/s] Geschwindigkeitskonstante
kcat [1/s] Wechselzahl
kg [m/s] Stoffübergangskoeffizient gasseitig
k l, kL [m/s] Stoffübergangskoeffizient auf der Flüssigseite
k La [1/s] Volumenbezogener Stofftransportkoeffizient gas - flüssig
kls Stoffübergangskoeffizient von flüssiger zu fester Phase
kw [kJ/(m² s K)] Wärmetransportkoeffizient
L, l [m] Länge
M diverse statistisches Moment
M, m [kg] Masse
M [kg/mol] molare Masse
M [Nm] Drehmoment
M Mischgüte
M* [Nm] komplexes Drehmoment1
574 Symbolverzeichnis

MAFR [mol/s]; [lN/s] Massenflussrate eines Gases

Mi [mol/m³] Molarität der Ionen
m Anzahl der Reaktionsgleichungen
m gemessener Endwert
m [kg] Masse
mS [g/(g h)] Zellspezifische Substrataufnahmegeschwindigkeit für den
Erhaltungsstoffwechsel
m·((Punkt [kg/s] Massenstrom
direkt über m
setzen))
N Trennstufen- / Bodenzahl
Ne Leistungskennzahl (Newtonzahl)
Nu Nusseltzahl
n [1/s] Drehzahl
n Anzahl
n Reaktionsordnung
.
n [mol/s] Molstrom
OD optische Dichte
OTR [kg/(m³ s)] Sauerstoffeintragsrate (oxygen transfer rate)
OUR [kg/(m³ s)] Sauerstoffaufnahmerate (oxygen uptake rate)
o [kg/m³] Gelöstsauerstoffkonzentration
o* [kg/m³] Sauerstoffsättigungskonzentration
[P] [mol/m³] Produktkonzentration
P [W/s] Leistung
P [l/(m² h bar)] Permeabilität
P Ladungsmatrix
PAR photosynthetisch nutzbare Wellenlängen des Lichts
PCE Photokonversionseffizienz
PPI purification performance index
Pe Pécletzahl
Ph Phasenzahl
Pr Prandtlzahl
P(t) Schätzfehler(ko)varianz zum Zeitpunkt t
p [kg/m³] Produktkonzentration
p [Pa] Druck
p [Pa] Flächenbelastung eines angeströmten Bauteils
p Infektionsrisiko
Δp [Pa] Druckdifferenz
pdf(z) Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion der Größe z
Q Gasdurchsatzkennzahl
Q Prozessrauschleistungsmatrix
((Q mit Punkt [m³/s] Volumenstrom
darüber))
((Q mit Punkt [kJ/s] Wärmestrom
darüber)) W
q [kg] adsorbierte Menge
qCO [m³/(kg s)] biomassespezifische CO2-Produktionsrate
2

qF [m³/(m² h)] Klärflächenbelastung

qG [m³/s] Gasstrom
qi i. Parameterwert des digitalen PID-Reglers
qO [kg/(m³ s)]; [s-1] biomassespezifischer Sauerstoffverbrauch
2
qo+
2 [m³/(kg s)] biomassespezifische Sauerstoffaufnahmerate
qo’
2 [kg/(m² s)] Sauerstoffstromdichte
qP [kg/s] biomassespezifische Produktbildungsrate
qS [s-1] biomassespezifische Substratverbrauchsrate
R [J/(mol K)] universelle Gaskonstante
 575
Symbolverzeichnis

R Rückhaltevermögen einer Membran, Retention

R Messrausch(ko)varianz
R Antwort-Koeffizient
R, r [m] Radius
Ra [µm] Rauwert (Oberflächen)
Re Reynoldszahl
Rm maximal freisetzbarer Proteingehalt
Rv Rücklaufverhältnis
RZA [kg/(L h)] Raum-Zeit-Ausbeute
RQ Respirationsquotient
r [kg/(m³ s)]; [mol/(m³ s)] Reaktionsgeschwindigkeit
r [m] radiale Ortskoordinate
r Vektor aller Nettoumsatzraten
rK Verhältnis von Kis zu Km
is
rK Verhältnis von Kip zu Km
ip

rP [kg/(m³ s)] volumenbezogene Produktbildungsgeschwindigkeit

rS [kg/(m³ s)] volumenbezogene Substrataufnahmegeschwindigkeit
rs k Verhältnis der anfänglichen Substratkonzentration zu Km
0 m
rX [kg/(m³ s)] volumenbezogene Wachstumsgeschwindigkeit
[S] [mol/m³] Substratkonzentration
S Löslichkeit eines Proteins
S Selektivität
S stöchiometrische Reaktionsmatrix
SCI [€/g] separation cost indicator
Sc Schmidtzahl
Sh Sherwoodzahl
Str, Sr Strouhalzahl
S# [kJ/mol] Energiewert des Substrates im Übergangszustand
SL Sterilitätskriterium
s, S [kg/m³] Substratkonzentration
s(ti) Messrauschen zum Zeitpunkt ti
T [K] absolute Temperatur
T Score-Matrix
TD Vorhaltezeit
TI Nachstellzeit
TTS [d] Schlammalter bezogen auf das Volumen des Belebungsbeckens
t [s] Zeit
t1/2 [s] Halbwertszeit
td [s] Verdopplungszeit
tg [s] Generationszeit
u [m/s] Strömungsgeschwindigkeit, Leerrohrgeschwindigkeit
uB [m/s] Blasenaufstiegsgeschwindigkeit
U [kg/kg]; [mol/mol] Umsatz
U [µmol/min] Enzymaktivität (unit of activity)
u(t) Eingangsgröße zum Zeitpunkt t
V [m³] Volumen
((V mit [m³/s] Volumenstrom
einem Punkt
darüber))
VBB [m³] Volumen Belebungsbecken
v [m/s] Geschwindigkeit
v Prozessrauschen
v [mol/(m³ s)] Reaktionsgeschwindigkeit
vm Molvolumen
vS [m/s] Sinkgeschwindigkeit
576 Symbolverzeichnis

((v mit [m/s] mittlere Geschwindigkeit

einem Strich
darüber))
We Weberzahl
Wn Weissenbergzahl
w Messrauschen
w(t) Sollwert zum Zeitpunkt t
X [kg/kg]; [mol/mol] Umsatz
X Datenmatrix
x Ortskoordinate
x [kg/m³] Konzentration der Zellmasse
x Molanteil einer Komponente
x Zustandsgröße
x Reinheit
x Vektor aller intrazellulären Metabolite
x Systemzustandsvektor
x^F(ti) gefilterter Schätzwert der Zustandsgröße zum Zeitpunkt ti
XTSBB [kg/m³] Konzentration der Trockensubstanz im Belebungsbecken
XTSe [kg/m³] Konzentration der Trockensubstanz im Ablauf der Nachklärung
XTSÜS [kg/m³] Konzentration der der Trockensubstanz im Überschusschlamm
Y Womersley Parameter
Y Ausbeute, Ausbeutekoeffizient
y [m] kartesische Ortskoordinate
y Messgröße
z, zi Ladungszahl, Wertigkeit eines Ions
Zϑ [K]; [°C] Z-Wert bei der Temperatur ϑ
α relative Retention (Trennfaktor, Selektivität)
α Verhältnis vom Volumen der organischen Phase zum Volumen der
wässrigen Phase
α Wärmeübergangszahl
βP Selektivität für Produkt
βS Selektivität für Substrat
γ [Grad] Deformationswinkel
γ genereller Reduktionsgrad
γ Deformation
((γ mit Punkt [1/s] Scherrate
darüber))
((γ mit Punkt [1/s] komplexe Scherrate1
darüber))*
.
γrep [1/s] repräsentative Schergeschwindigkeit
Γ [1/s] shift Parameter
Δψ [mV] transmembrane Ladungsdifferenz
ε Elastizität
ε Vektor der Residuen
ε [m²/s³] lokale Energiedissipation
ε L, εG Flüssigkeitsanteil, Gasanteil
((ε mit Strich [m²/s³] mittlere Energiedissipation
darüber)), εϕ
ζ Widerstandsbeiwert
η [Pa s] dynamische Viskosität
η Wirkungsgrad
ηd [Pa s] Dehnviskosität
η* [Pa s] komplexe Scherviskosität1
η' [Pa s] Realteil der komplexen Scherviskosität
η'‘ [Pa s] Imaginärteil der komplexen Scherviskosität
Η [Pa s] shift Parameter
θ Parametervektor
 577
Symbolverzeichnis

θX [d] Schlammalter
ϑ [C°] Temperatur
κ [€/kJ] produktspezifische Kosten
λ [kJ/(m² s K)] Wärmeleitfähigkeit
λm [s] Spannungsrelaxationszeit
λv [s] Retardationszeit
µ [s-1] biomassespezifische Wachstumsgeschwindigkeit
ν spezifische Teilungsrate
ν Reaktionsrate
ξ Reaktionslaufzahl
πn dimensionslose Größen
ϱ [kg/m³] Dichte
Δϱ [kg/m³] Dichtedifferenz
θX [s] Mischzeit zur Erzielung eines Homogenitätsgrades x
σ [N/m] Oberflächenspannung
σSP Selektivität einer Reaktion
σx [Pa] = σxx = Normalspannung in x-Richtung
σy [Pa] = σyy = Normalspannung in y-Richtung
σz [Pa] = σzz = Normalspannung in z-Richtung
τ [s] mittlere hydraulische Verweilzeit
τ [Pa] Schubspannung
τ* [Pa] komplexe Schubspannung1
Φ [V] Galvanisierspannung (Standardbedingungen)
Χ (einzelne) Metabolitkonzentration
Χ Umsatz
Φ Thielemodul
Φ Phasenverhältnis
φ [Grad] Winkel
φ relative Luftfeuchte
φG relativer Gasgehalt
ν [m²/s] kinematische Viskosität
ω [rad/s] Kreisfrequenz
Ω [s–1] Winkelgeschwindigkeit
ζD Deckschichtwiderstand
ζM Membranwiderstand

1 Größen mit * betreffen entweder einen Behandlungseffekt oder stellen komplexe Zahlen dar. Der Realteil einer

komplexen Größe wird mit ´, der Imaginärteil mit ´´ gekennzeichnet. Die Angabe der Einheit bezieht sich dabei auf den
Betrag.
578

Indizierung
0 Anfangskonzentration zum Zeit- R  Reaktor, Retenat
punkt t0
ref Referenz
0 Ausgangsmaterial
RL Rücklauf
0 Referenzzustand
S,s Substrat
a Auftrieb
SF  Substrat im Zulauf (feed)
a Volumen-spezifische Stoffaustausch-
oberfläche T  absolute Temperatur

app  apparent, scheinbar TM Transmembran

calc  berechnete Werte V Verunreinigung

E Eintritt W Wand

eff effektiv w  wässrige Phase, Widerstand

ES Enzym-Substratkomplex X Biomasse

F  Filtrat, Feed x Metabolit

f Zielwert XS,μ wahre Biomasse/Substrat Aus-

beute
G,g Gas
z Weglänge
Ges  Gesamt, bezogen auf alle Phasen
Z Zielsubstanz
i, j, k Laufvariablen

in eintretend

J Fluss

L,l Flüssigkeit

M Membran

max maximal

mes  gemessene Werte

O2 Sauerstoff

org  organische Phase

out austretend

P Produkt
 579 A– C

Stichwortverzeichnis

γ-Butyrobetain  428 amperometrische Messung  267 Behandlungseffekt B*

π-Größen Ampholyte  374 –– mikrobiologischer  236
–– dimensionslose  132 Ampicillin  413 Behandlungseffekt C
(S)-(3,4-Methylendioxyphenyl)-2-pro- Amplifikation  498 –– chemischer  236
panol  443 anaerobe Ammonium-Oxidation  Belebtschlammverfahren  479
(S)-4-Chlor-3-hydroxybuttersäureethy- 483 Beweglichkeit  372
lester  441 anaerober Abbau von BSB  482 BHK-Zellen  502
(S)-CHBE  441 Analogie zwischen den Transportvor- Binodale  360
(S)-MDPP  443 gängen  151 Bioethanol  455
3C-basierte Stoffflussanalyse  555 Anfangsreaktionsgeschwindigkeit  11 Biofilm  92
3α-HSDH (3α-Hydroxysteroiddehyd- Anfangsreaktionsgeschwindigkeits- BioLector  211
rogenase)  434 muster  35–36 Biologie
3α-Hydroxysteroiddehydrogenase (3α- Anionenaustauscher  379 –– synthetische  547
HSDH)  434 Anreicherungsfaktor  333 biologischer Sauerstoffbedarf  479
5-Methyl-2-pyrazincarbonsäure Antibiotika  468 –– anaerober Abbau  482
(MPCA)  431 Antikörper Biomasseproduktion
6-Aminopenicillansäure  420 –– monoklonale  494 –– mikrobielle  453
7-Aminocephalosporinsäure  469 Anzuchtfermenter  530 bioREACTOR48  213
7β-HSDH (7β-Hydroxysteroiddehyd- Apparat Bioreaktor  205
rogenase)  434 –– hygienegerecht gestalteter  246 –– nicht-idealer  94
7β-Hydroxysteroiddehydrogenase (7β- Arbeits-Zellbank WCB  530 Biosensor  279
HSDH)  434 Aromastoff  465 Biotin  65
Arrhenius-Ansatz  61 Biotransformation  405
Arrhenius-Gleichung  17 Biotzahl  151
A Assoziationskonstante  5
at-line-Analyse  264
Blasensäule  91
Blasensäulenreaktor  175
Ablaufsteuerung  291 ATR-Sonde  274 –– Leistungseintrag  177
Abtastrate  291 Aufarbeitung Blasenströmung
Abwasserreinigung  478 –– proteinchemische  531 –– heterogene  176
–– industrielle  484 Aufkonzentrierungsfaktor  338 –– homogene  176
–– Stufen  478 Auflösung  376 Böden
ACE-Hemmer  423 Aufnehmer  359 –– theoretische  376
Acrylamid  426 Aufreinigungsschritt Bodenzahl  376
Acrylnitrilhydratase  426 –– Kristallisation  327 Briggs-Haldane-Gleichung  8
adhärent wachsende Kultur  511 Ausbeute  338 BSB (biologischer Sauerstoffbe-
Adsorbentien  377 Außer-Phase-Bedingungen  200 darf )  479
Adsorption  342 Ausführung –– anaerober Abbau  482
Adsorption/Chromatographie  375 –– hygienegerechte  249 Bubble-Point-Test  244
adsorptive Bindung von Enzymen  415 Aussalzeffekt  320 Buckingham’schesπ-Theorem  132
Affinität  5 Aussalzen  320
Affinitätschromatographie  379 Auswaschpunkt  76
Affinitätsextraktion  367
Affinitätsmakroligand  323
Automatisierung  290
Axialdiffusion  376
C
Affinitätspräzipitation  323 Calcium  64
Aktivitätsausbeute  334 Carbonylreduktase  441
akustische Kavitation  312
Albumin  318
B Cephalosporin  468
charakteristische Materialzeit  138
Allosterie  28 Bakterien  504 charakteristische Systemzeit  138
Aminoacylase  424 Bandenverbreiterung  373 chemischer Behandlungseffekt C  236
Aminosäuren  459 batch-Verfahren  515 chemo-biokatalytische Umset-
Ammonifikation  481 Begasungsrührer  165 zung  435
Ammonium-Oxidation Behälterfertigung  249 Chemostat  83
–– anaerobe  483 Behälterplanung  249 CHO-Zellen  501
580 Stichwortverzeichnis

Chromatographie Dreistoffsystem  359 –– Ribozym  3

–– präparative annulare  387 Druck –– Stabilität  25
Chromosomen –– osmotischer  517 –– technisches  471
–– künstliche  504 Druckdifferenz –– trägergebundenes  414
CIP-Prozess  253 –– transmembrane  341 –– zweiphasige Inaktivierung  23–24
Citronensäure  457 druckgetriebenen Membrantrennver- Enzymaggregat  411
Clark-Elektrode  267 fahren  341 Enzymaktivierung
CLEAs (cross-linked enzyme aggrega- Druckhaltetest  246 –– essentielle  24
tes)  411 Durchflusszytometrie  272 –– nichtessentielle  24–25
CLECs (cross-linked enzyme cry- Durchlichtmessungen  273 Enzymaktivität
stals)  410 Durchmischungskennzahl  167 –– Einfluss der Ionenstärke  19
Cleland-Diagramm  34–35 Durchsatz  312 –– Einfluss der Puffersubstanz  18
CLEs (cross-linked enzymes)  410 dynamische Dichtung  255 –– Einheit Katal  9
CO2-Emissionsrate  89 Dϑ-Wert  234 –– Einheit Unit  9
Colburnzahl  152 –– pH-Abhängigkeit  18
COS-Zellen  502 –– pH-Optimum  18
Coulter-Counter  272
CRISPR/Cas  503
E –– spezifische  9
–– Temperaturabhängigkeit  17
Cross-Flow-Filtration  240 Eadie-Hofstee-Darstellung  14–15 –– Temperaturoptimum  17
cross-linked enzyme aggregates(CLE- EBA-Chromatographie  520 enzymatische Umesterung  418
As)  411 Effektivitätskoeffizient  148 Enzymbedarf
cross-linked enzyme crys- Einsaatdichte  517 –– relativer  408
tals(CLECs)  410 Einsalzeffekt  320 Enzymhemmung Siehe Enzyminhibie-
cross-linked enzymes(CLEs)  410 Einschlussimmobilisierung  421 rung  19
cut-off<k>  338 Einstellung von Regelparametern  293 Enzymimmobilisierung  405
Cyanocobalamin  66 Einsubstratreaktion –– Trägermaterial  414
–– reversible  10 Enzyminhibierung  19
Einweg-Bioreaktor  217, 514 –– gemischte  21
D Eisen  64
elektrokinetische Trennverfahren  372
–– irreversible  19, 23
–– kompetitive  19–20
D-Xylose-Isomerase  417 Elektroosmose  373 –– nichtkompetitive  20–21
Dampfsterilisation Elektrophorese  372 –– partiell kompetitive  21–22
–– direkte  238 elektrostatische Van-der-Waals-Kräf- –– partiell nichtkompetitive  21
Dead-End-Filtration  240 te  319 –– partiell unkompetitive  21
Deborahzahl  138 Elementarmodus  558 –– partielle  21–22
Dehnviskosität  122 Eluieren  378 –– reversible  19, 23
Dekanter  303 Elution –– Rückkopplungshemmung  28
Denitrifikation  481 –– im Gradienten steigender Salzkon- –– Substratüberschussinhibierung  20
Diafiltration  351 zentration  378 –– unkompetitive  20
Diagnose  491 Elutionsmittel  378 –– vollständige  22
Dialyse  350 Elutionsvolumen  376 Enzymmembranreaktor  422
Dichtung Elutionszeit  376 Erhaltungsstoffwechsel  53
–– dynamische  255 Emulsionsspaltung  440 Ertragskoeffizient  53
diffuse Doppelschicht  373 Enantiomerenüberschuss  424 ex situ-Sensor  263
Diffusionstest  244 Energiedissipationsrate expanded bed adsorption<k>  384
dimensionslose Kennzahl  132 –– maximale  202 exponentielle Phase  48
dimensionsloseπ-Größen  132 Enzym Extrakt  360
Dirac-Impuls  96 –– adsorptive Bindung  415 Extraktionsmittel  359–360
direkte Dampfsterilisation  238 –– EC-Nummer  3 Extraktstoff  359
Dispersionsmodell  98 –– Inaktivierung  23, 25
Dissoziationskonstante  5 –– katalytische Effizienz  9
Dixon-Diagramm  22
Doppelschicht
–– Klassifizierung  3–4
–– Mikroverkapselung  421
F
–– diffuse  373 –– Nomenklatur  3 F-Wert  234
Downstream Processing  530–531 –– promiskuitives  3 Fällungsmittel
Dreiecksdiagramm  359 –– regulatorisches  27–28, 32 –– Auswahl  323
Stichwortverzeichnis
FBA (flux balance analysis)  552
fed-batch-Verfahren  516
feedback inhibitionSiehe Rückkopp-
lungshemmung  28
Feedvolumenstrom  338
Fehlerquadratminimierung  100
Feldeffekttransistor
–– pH-sensitiver  270
Feldsprungelektrophorese  374
Feldstärkesprung  374
Fermentation
–– hochzelldichte  81
Festbettreaktor  182, 514
FIA (Fließinjektionsanalyse)  282
Filterintegritätstest  244
Filtermittel  304–305
Filtration  304
FIR (Ferninfrarotbereich)  276
Flashing-Light-Effekt  190
Fließbett
–– Porosität  184
Fließbettadsorption  384
Fließbettreaktor  182
Fließgleichgewicht  6, 34
Fließinjektionsanalyse (FIA)  282
Flotation
–– und Schaumseparation  332
Fluid
–– newtonsches  119
Fluidchromatographie
–– superkritische  383
Fluidextraktion
–– superkritische  368
Fluoreszenzspektroskopie  275
Fluss
–– transmembraner  341
Flussbilanzanalyse (FBA)  552
Flüssigkeit
–– ionische  360
–– viskoelastische  110
Flüssigkeit/Feststoff  143
Flüssigkeit/Flüssigkeit  143
Flüssigkeiten
–– ionische  440
Flüssigmembrantrennung
–– trägergestützte  350
Fokussierung
–– isoelektrische  374
Folgeelektrolyt  374
Formulierung  531
Formulierungsschritt
–– Kristallisation  329
Fotobioreaktor  188
Fouling  342
Free-Flow-Elektrophorese  373
Freiheitsgrad  552
Freisetzungssystem  211
Froudezahl  135
Führungsgröße  291
Fuzzy-Regler  296
G High Fructose Corn Sirup(HFCS)  416
Galileizahl  142
Ganzzellbiokatalysator  425
Gas-induzierende Rührorgane  214
Gas/Feststoff  143
Gas/Flüssigkeit  142
Gasanteil  177
Gasdurchsatz  335
Gasdurchsatzkennzahl  140
Gase
–– überkritische  368
Gaskolbenströmung  176
Gaslift-Reaktor  175
Gastrennung  346
Gasverteiler  176
Gefriertrocknung  394
Gelöstkohlendioxidelektrode  269
generelle Liganden  380
genetischer Algorithmus  68
Geschwindigkeitskonstante  4
Gesetz
–– Henry'sches  144
–– Newton'sches  108
–– Stokes`sches  301
Gewebekultur  492
Gewebekulturschalen  220
Gleichgewichtsdiagramm  359
Gleichgewichtskonstante  11
Gleitringdichtung  162, 255
Globulin  318
Glucosedehydrogenase  434
Glucoseisomerase  417
Grashofzahl  135
grenzflächenaktive Substanz  332
Größenausschlusschromatogra-
phie  381
Grundelektrolyt  373
Güte eines Reglers  295
H
Hagen-Poiseuille’sches Gesetz  112
Halbwertszeit  26
Haldane-Beziehung  11
Hanes-Woolf-Darstellung  14–15
Hauptkomponentenanalyse  288
Hauptkomponentenregression  289
Hefen  504
HEK-293-Zellen  502
HeLa-Zellen  502
581 D–I
Henry’sches Gesetz  144
hermetisch abgedichtete Rührerwel-
len  258
heterogene Blasenströmung  176
HFCS (High Fructose Corn Sirup)  416
Hill-Gleichung  28–29
Hill-Koeffizient  28
Hitzebehandlung  321
hoch spezialisierte Tierzellen  491
Hochdruckhomogenisator  313
hochzelldichte Fermentation  81
Hohlfasermodul  348
homogene Blasenströmung  176
Homogenisierdruck  313
Homogenisierventil  313
Hooke’scher Körper  120
Hybridomazellen  494
hydraulische Verweilzeit in Abhängig-
keit des Umsatzes  407
hydrodynamischer Zellaufschluss  312
hydrodynamisches Kavitationsver-
fahren  315
Hydrogel  421
hydrophobe Interaktionschromato-
graphie  378
hydrophobe Wechselwirkung  378
hygienegerecht gestalteter Appa-
rat  246
hygienegerechte Ausführung  249
Hyperaktivierung  412
hyperthermophiler Temperaturbe-
reich  61
Hyphen  58
I
Immobilisierung
–– kovalente  416
Impedanzmesssystem  273
Impfstoff  491
in vitro  491
in vivo  491
in-situ-Mikroskopie  274
in-situ-Produktextraktion  436
in-situ-Sensor  263
in-situ-Substratbereitstellung  436
indirekte Sterilisation  239
induced fit-Hypothese  31
industrielle Abwasserreinigung  484
Infrarot-Analysator  266
Infrarotspektroskopie  276
Inoculum  530
Interaktion
–– unspezifische  377
interaktiv komplementäre Substrate  54
582 Stichwortverzeichnis
Ionenaustauschchromatographie  379
Ionenstärke  19
ionische Flüssigkeit  360, 440
isoelektrische Fokussierung  374
isoelektrische Präzipitation  321
isoelektrischer Punkt  320
Isomerisierungsreaktion  417
Isotachophorese  374
Isotopeneffekt
–– kinetischer  38
Isotopomer  556
Itaconsäure  457
K L-Lysin  459
Kalman-Filter  284
Kapazitätsfaktor  376
Kapillarmodul  348
Kassettenmodul  348
Katalysatorverlust  423
Kationenaustauscher  379
Kavitation  312
–– akustische  312
Kavitationsverfahren
–– hydrodynamisches  315
Keimbildung
–– und metastabiler Betrieb  325
Kennzahl
–– dimensionslose  132
kinetische Racematspaltung  424
kinetischer Isotopeneffekt  38
King-Altman-Verfahren  39–42
Komplexbildner  65
komplexe Viskosität  120
Kondensatableiter  246
Konnektivitätstheorem  561
Konode  360
kontinuierliche Prozessverifikation  533
kontinuierliche Verfahren  238, 516
Kontrollanalyse
–– metabolische  558
Kontrollgrößen
–– metabolische  559
konventionelle Kugelmühlen  310
Konzentration der Zellsuspension  314
Konzentrationspolarisation  343
Kooperativität  28
–– Sequenz-Modell  31–32
–– Symmetrie-Modell  29–31
Körper
–– Hooke´scher  120
Korrosionswiderstand  247
kovalente Immobilisierung  416
Kristallisation  324
–– als Aufreinigungsschritt  327
–– als Formulierungsschritt  329
Kristallisationsverfahren  324
kritische Stellen  245
Kryopräzipitation  322
Kugelmühlen  310
–– konventionelle  310
Kultur
–– adhärent wachsende  511
künstliche Chromosomen  504
Kurzschlussströmung  97
L Membranbioreaktor  185
L-Carnitin  427
L-Methionin  424
Laserstreulichtsensor  274
leichte Reinigbarkeit  246
Leistungscharakteristik, Rührorga-
ne  165
Leistungseintrag
–– in Blasensäulenreaktoren  177
–– in Mikrotiterplatten  200
–– in Schüttelkolben  197
Leistungskennzahl  136
Leitelektrolyt  374
Lichteintrag  188
Liganden
–– generelle  380
Ligandenbindung  5
Lin-log-Modell  26–27
lineare Modelle  100
Lineweaver-Burk-Darstellung  14–15
Lösungsmittel-Präzipitation  321
M
Magnesium  64
Mahlguttemperatur  311
Mahlkörper  310
Mahlkörperfüllungsgrad  311
Markierungsstudie  95
Maßstabsvergrößerung der Protein-
kristallisation  330
Materialzeit
–– charakteristische  138
maximale Energiedissipationsrate  202
Medieneinwaage  530
Medienherstellung  530
Medikamente  491
Mehrphasensysteme  436
Mehrsubstratreaktion
–– geschwindigkeitslimitierender
Schritt  34
–– Inhibierung  34
–– Irreversibilität  34
–– Nomenklatur  34
–– Ping-Pong-Mechanismus  33
–– rapid equilibrium-Mechanismus  34
–– rapidequilibrium-Mechanismus  38
–– sequentieller Mechanismus  33
–– steady state-Mechanismus  34, 39
–– Stöchiometrie  33
–– Substratbindungordered  33
–– Substratbindungrandom  33
–– Unterscheidung  35–38
Membran-Bioreaktor
–– submerser  341
Membrancharakterisierung  338
Membranfluss/Flux  338
Membranfouling  185
Membranmaterial  336
Membranseparation  335
Membranstruktur  336
Membrantrennverfahren
–– druckgetriebene  341
mesophiler Temperaturbereich  61
Messfehler
–– systematischer  101
Messgrößen in der Bioprozesstech-
nik  264
Messung
–– amperometrische  267
Metabolic Engineering  547
metabolische Kontrollanalyse  558
metabolische Kontrollgrößen  559
metastabiler Betrieb
–– und Keimbildung  325
Methoden der Proteinfällung  319
Metzner-Otto-Verfahren  137
Michaelis-Menten-Gleichung  6–8
–– Fließgleichgewicht  6
–– integrierte  16
–– kinetische Parameter  8
–– Linearisierungsverfahren  13, 15
–– Michaeliskonstante  7–8
–– rapid equilibrium-Annahme  8
–– steady state-Annahme  6, 8
mikrobielle Biomasseproduktion  453
mikrobiologischer Behandlungseffekt
B*  236
Mikrofiltersystem  519
Mikrofiltration  341
Mikrokonstante  35
Mikrotiterplatten
–– als Bioreaktor  205
–– Leistungseintrag  200
Mikroverkapselung von Enzymen  421
MIR (Mittelinfrarotspektroskopiebe-
reich)  276
Mischgüte  167
Mischzeit  167
–– Schüttelkolben  204
mittlere Umfangsgeschwindigkeit  311
Stichwortverzeichnis
583 K–R
mobile Phase  375 paramagnetische Sauerstoffmes- Produktbildungsrate  56
Modell sung  266 Produktinhibierung  52
–– empirisches  26 Parameter-adaptiver Regler  296 Produktinhibitionsmuster  36–37
–– mechanistisches  26 Parametervektor  57 Produktionsfermenter  530
–– semi-mechanistisches  26 PCA (principal component analy- Produktisolation  317
MOMA-Prinzip  558 sis)  288 Produktklassen  452
monoklonale Antikörper  494 PCR (principal component regres- Produktkonzentrierung  317
MPCA (5-Methyl-2-pyrazincarbonsäu- sion)  290 Produktreinigung  317
re)  431 Penetrationsmodell  145 Produktselektivität  56
Penicillin-Amidase  413, 420 Produktspezifikation  536
PER.C6-Zelllinie  503 Protein
N Perfusion  516
Perfusionsreaktor  221
–– pharmazeutisches  472
proteinchemische Aufarbeitung 
Nanofiltration  341 permanente Zellenvermehrung  494 531
Natrium  64 Permeabilität  338 Proteinfällung
Nephelometrie  273 Permeatvolumenstrom  338 –– Methoden  319
newtonsches Fluid  108, 119 Pervaporation  346 Proteinkristallisation  326
newtonsches Gesetz  108 Pflanze –– Maßstabsvergrößerung  330
Newtonzahl  136 –– transgene  504 protonenmotorische Kraft der
Niacin  66 Pflanzenzellkultur  505 Zelle  62
nicht interaktiv komplementäre Subs- pH-Einstabmesskette  269 Prozessdesign  533
trate  55 pH-sensitiver Feldeffekttransistor  270 Prozessgrenze  536
nicht-idealer Bioreaktor  94 pH-Wert  62, 517 Prozessmodell  73
nicht-ionogene Polymere  322 pharmazeutisches Protein  472 Prozessmonitoring  535
nichtnewtonsche Flüssigkeit  109 Phase Prozessqualifizierung  533
NIR (Nahinfrarotbereich)  276 –– mobile  375 Prozesstransfer  528
Nitrifikation  481 –– stationäre  375 Prozessverifikation
Non-Equilibrium-Term  376 Phasen-ZahlPh  201 –– kontinuierliche  533
Nootkaton  467 Phasentoxizität  438 psychrophiler Temperaturbereich  61
Normalphasenchromatographie  377 Phosphor  63 Punkt
NS0-Zellen  501 Photo-Konversions-Effizienz  189 –– isoelektrischer  320
Nusseltzahl  152 photosynthetisch nutzbare Wellen- Pyridoxin  66
Nutristat  86 länge  189
PI-Regler  292

O
PID-Regler  292
Plateau-Borders  332
R
Plattenmodul  348 Rabinowitsch-Mooney-Beziehung  112
Oberflächenerneuerung Plattenreaktor  192 Racematspaltung
–– Theorie  145 pO2-Elektrode  267 –– kinetische  424
Oberflächenfiltration  304–305 Polymere Raceway Ponds  191
off-line  518 –– nicht-ionogene  322 Radius
on-line  517 Populationsheterogenität  564 –– repräsentativer  117
on-line-Analytik  264 Porosität des Fließbetts  184 Raffinat  359–360
on-line-Probenahme  251 Prandtlzahl  152 RAMOS (Respiration Activity Monito-
OptKnock-Algorithmus  558 präparative annulare Chromatogra- ring System)  209
Optode  278 phie  387 Reaktion
Organ-on-a-Chip  222 Präzipitation  318 –– erster Ordnung  4
organische Säure  457 –– isoelektrische  321 –– nullter Ordnung  5
Organkultur  491 Primärblasengröße  178 –– pseudo-erster Ordnung  5
osmotischer Druck  517 Primärzellkultur  492 –– zweiter/höherer Ordnung  4
Oxygentransferrate  146 principal component regression  289 Reaktionordnung  4
Probenahme  283 Reaktionsvektor  57

P –– on-line  251 Reflexionsmessung  273

Probenahmeventil Regelgröße  291
–– steriles  252 Regelparameter
P-CAC  387 –– Einstellung  293
Processing
Paddelrührer  215 Regelstrecke  291
–– Downstream  530–531
Pantothensäure  66 Regelung  290
–– Upstream  530
584 Stichwortverzeichnis
Regler
–– Güte  295
–– Parameter-adaptiver  296
Regression
–– lineare  13
–– nichtlineare  13
Reinigbarkeit
–– leichte  246
Reklonierung  498
Relationenpostulat  133–134
relativer Enzymbedarf  408
repräsentative Scherrate  117
repräsentativer Radius  117
Respirationsquotient  90
Response-Surface-Methode  67
Retardationszeit  139
–– Spektrum  140
Retentatvolumenstrom  338
Retention  422
Revers-flow-Diafiltration  186
Reversed-Phase-Chromatogra-
phie  378
reversible Einsubstratreaktion  10–11
Reynoldszahl  132
Riboflavin  66
Röhrenzentrifuge  302
Rohrmodul  348
Rohrreaktor  90, 194
rotating wall vessel reactor  221
Rotor-Stator-Homogenisator  312
Rückhalt  338
Rückhaltevermögen  338
Rückkopplungshemmung  28
Rührer-Rheometer  118
Rührerwellen
–– hermetisch abgedichtete  258
Rührkesselkaskade  97
Rührorgane  163
–– Gas-induzierende  214
–– Leistungscharakteristik  165
Rührreaktor  160
Rührwerk  161
Rührwerksgeometrie  312
Rührwerkskugelmühlen  310
S Spinnerflasche  221
S-Rührer  216
Sättigungskinetik  50
Sättigungskonzentration  50
Satzverfahren  73
Sauerstoff  517
Sauerstoffaufnahmerate  88
Sauerstoffbedarf  170
–– biologischer  479
–– biologischer, anaerober Abbau  482
Sauerstoffeintrag  87
Sauerstoffmessung
–– paramagnetische  266 Stellgröße  291
Sauerstofftransferkapazität  203 steriles Probenahmeventil  252
Sauerstofftransportkoeffizient  179 Sterilfilter  239, 304
Sauerstoffübertragungsrate  170 Sterilisation  232
Säulenqualitätsfaktor  376 –– indirekte  239
Säure Sterilisation-in-Place  245
–– organische  457 Steuerung  291
scale-down  171 Stickstoffelimination  480
scale-up  171, 565 Stoffflussanalyse  552, 555
scale-up-Kriterien  172 Stokes’sches Gesetz  301
Scaling  342 Strahlungsintensität  189
Schaumseparation Stufen der Abwasserreinigung  478
–– und Flotation  332 submerser Membran-Bioreaktor
Scheibenrührer  165 (SMBR, submerged membrane
Scherrate bioreactor<k>)  341
–– repräsentative  117 Substanz
Schlammalter  484 –– grenzflächenaktive  332
Schmidtzahl  135 Substrataufnahmerate  53
Schüttelkolben  196 Substratlimitierungsphase  49
–– Leistungseintrag  197 Substratüberschussinhibierung  50
Schwefel  64 Summationstheorem  560
Sedimentation/Zentrifugation  301 supercritical fluid extraction<k>  368
Selektion  498 superkritische Fluidchromatogra-
–– von Zellhybriden  494 phie  383
Selektivität  338, 376 superkritische Fluidextraktion  368
Sensor  263 Suspensionskonzentration  311
–– spektroskopischer  274 Suspensionskultur  511
Sf21-Zellen  502 synthetische Biologie  547
Sf9-Zellen  502 systematischer Messfehler  101
Sherwoodzahl  135, 150 Systembiologie  546
Siderophor  64 systems metabolic engineering  547
Siebfiltration  304 Systemzeit
Silica-Sol-Gel  421 –– charakteristische  138
simulated moving bed chromatogra- Systemzustandsvektor  57
phy<k> (SMB)  385
Sinkgeschwindigkeit  184
SIP-Prozess  253
size-exclusion chromatogra-
T
phy<k>  381 Talampanel  443
Softwaresensor  284 TALEN (Transcription Activator-like
Solventextraktion  359, 371 Effector Nucleasen)  503
Sophorolipid  463 targeted integration  503
SP2/0-Zellen  501 technisches Enzym  471
Spannungsrelaxationszeit  139 Technologie
spektroskopischer Sensor  274 –– umweltfreundliche  529
Spektrum von Retardationszeiten  140 Tellerseparator  302
Spore
Temperatur  517
Temperaturbereich
–– thermische Stabilität  232 –– Mikroorganismenklassifizierung  61
Sprühtrocknung  395 Temperaturkoeffizient  18
Sprungantwort  292 Tensid  463
Spurenelement  65 Tensidkonzentration  335
Stantonzahl  152 theoretische Böden  376
Starterkultur  455 Theorie der Oberflächenerneue-
stationäre Phase  48, 375 rung  145
statistische Momente  96 thermische Stabilität von Sporen  232
statistische Versuchsplanung  66 Thermokonvektion  373
Stellen thermophiler Temperaturbereich  61
–– kritische  245 Thiamin  65
Stichwortverzeichnis
Thiele-Modul  94, 148
Tiefenfilter  518
Tiefenfiltration  305
Tiere
–– transgene  505
Tierspezies
–– Zellliniengewinnung  503
Tissue Engineering  218
Totvolumen  97
trägergebundenes Enzym  414
trägergestützte Flüssigmembrantren-
nung  350
Trägermaterial für Enzymimmobilisie-
rungen  414
Transformation  494
Transgen  505
transgene Pflanzen  504
transgene Tiere  505
transmembrane Druckdifferenz
(TMP)  341
transmembraner Fluss (TMF)  341
Transportvorgänge
–– Analogie  151
Trennfaktor  376
Trenngrenze  338
Trennstufenzahl  376
Trennverfahren
–– elektrokinetische  372
Trikanter  303
Trocknungsverfahren  394
Tropfkörperreaktor  182
Turbidimetrie  273
Turbidostat  85
turnover number(Wechselzahl)  8
U Wellenlänge
Übergangskomplex  34
überkritische Gase  368
Ultrafiltration  341
Ultraschallverfahren  312
Umesterung
–– enzymatische  418
Umfangsgeschwindigkeit
–– mittlere  311
Umkehrosmose  342
Umkehrphasenchromatographie  378
umweltfreundliche Technologie  529
unspezifische Interaktion  377
585 S–Z
Vanillin  465 Zellhybriden
Verdrängungschromatographie  389 –– Selektion  494
Verfahren Zellreifung  494
–– batch-Verfahren  515 Zellrückhaltung  78
–– fed-batch-Verfahren  516 Zellsuspension
–– kontinuierliches  238, 516 –– Konzentration  314
–– Metzner-Otto-Verfahren  137 Zelltherapie  491
Verlaufskurvenanalyse  16 Zellzyklus  46
Vermehrung  46 Zentralkomplex  34
Verteilungskoeffizient  436 Zentrifugation  519
Verweilzeit Zetapotenziale  305
–– hydraulische  407 Zetapotenzialmessung  305
Verweilzeitdichtefunktion  96 ZFN (Zinkfinger-Nuclease)  503
Verweilzeitfunktionen  95 Zinkfinger-Nuclease  503
Verweilzeitsummenfunktion  96 Zirkulationszellen  179
Verzögerungsphase  48 Zirkulationszellenmodell  180
viskoelastische Flüssigkeit  110 Zonenelektrophorese  373
Viskosität Zulaufverfahren  74
–– komplexe  120 –– wiederholtes  82
Zustandsgrößen  58
Zwei-Film-Modell  87
W Zweifilmtheorie  144
Zweiphasenextraktion
Wachstum  46 –– wässrige  363
Wachstumsmedien  66 Zweipunktregler  292
Wachstumsrate  49 zϑ-Wert  234
Walzentrocknung  397
Wärmeübertragung  151
wässrige Zweiphasenextraktion  363
Wave Bioreactor  217
WCB (working cell bank)  530
Weberzahl  135
Wechselwirkung
–– hydrophobe  378
Wechselzahl  8
Weissenbergzahl  138
–– photosynthetisch nutzbare  189
wiederholtes Zulaufverfahren  82
Wirbelschichtreaktor  514
Wirbelschichttrocknung  396
Wirtszelllinie  496
working cell bank(WCB)  530
X
X/D-Diagramm  77
XAD-7  443

Z
Upstream Processing  530
Ursodesoxycholsäure (UDCA)  433

Zellaufschluss  309

V –– hydrodynamischer  312
Zellaufschlussverfahren  317
van-Deemter-Gleichung  376 Zellbank  499
Van-der-Waals-Kräfte Zelldifferenzierung  494
–– elektrostatische  319 Zellernte  531