2 STICHWORTLISTE (Zu diesen Stichworten sollen Sie sich vor dem Praktikum belesen) Entstehen des Membranpotentials Funktionen

des Membranpotentials Diffusionspotential Gleichgewichtspotential Aktionspotential Refraktrperiode Ruhepotential Depolarisation Hyperpolarisation chemische Triebkraft elektrische Triebkraft Nernst-Gleichung Leitfhigkeit/Permeabilitt Goldmann-Hodgkin-Katz-Gleichung Na+-K+-ATPase Ionenkanle Spannungsabhngigkeit von Ionenkanlen Kotransport/Antiport intra-/extrazellulre Ionenverteilung aktiver Transport sekundr-aktiver Transport passiver Transport

3 EINLEITUNG Jede lebende tierische Zelle hat ein Membranpotential. Es ist Voraussetzung fr viele physiologische Prozesse in den verschiedenen Zelltypen. Sehr offensichtlich ist seine Bedeutung fr die Signalbertragung im Nervensystem oder fr die Erregung der Skelettmuskulatur. Aber auch die Funktion der Darmepithel- oder Nierenepithelzellen (Resorption, Sekretion) ist von deren Membranpotential abhngig. Ebenso wird die Sekretion des Pankreashormons Insulin ber das Membranpotential der -Zellen gesteuert. (Zur Therapie des Diabetes mellitus eingesetzte Pharmaka beeinflussen dementsprechend das Membranpotential der -Zellen.) Umgekehrt knnen Strungen der Prozesse, die am Entstehen und Regulieren des Membranpotentials beteiligt sind, zu schweren Krankheitsbildern fhren. Ohne auf Details einzugehen, seien folgende Beispiele genannt: Herzrhythmusstrungen, Myasthenia gravis (Strung der neuro-muskulren Erregungsbertragung), Epilepsie, Myotonien (Muskelerkrankungen, denen Fehlfunktionen von Natriumkanlen in Skelettmuskelzellen zugrunde liegen), Mukoviszidose (= Zystische Fibrose; hufigste Erbkrankheit, bei der ein defekter Chloridkanal in Epithelzellen u.a. zu schwersten Lungenfunktionsstrungen fhrt), Diarrhoe (Aktivierung der

Chloridleitfhigkeit im Darmepithel). Darberhinaus wirken viele Pharmaka und natrlich vorkommende Gifte spezifisch auf Ionenkanle (Lokalansthetika, Calcium-Antagonisten; Botulinus-Toxin; Curare).

4 Im Rahmen dieses Praktikums wollen wir uns mit den theoretischen Grundlagen der Entstehung des Membranpotentials beschftigen: I) Eine K+-Elektrode wird als Modell fr eine Zelle und ihr Membranpotential angenommen, und es wird die Entstehung eines Diffusionspotentials erklrt. II) In einem Demonstrationsversuch wird das Membranpotential einer lebenden Froscheizelle gemessen.

I. ENTSTEHUNG EINES DIFFUSIONSPOTENTIALS

Theoretische Grundlagen Um ein Diffusionspotential zu erzeugen, gengt es, zwei Salzlsungen durch eine selektiv permeable Membran zu trennen. Wir stellen uns folgenden Modellversuch vor:

undurchlssige Membran

K - selektive Membran

A
K =
+

B
Cl =
-

Abb. 1: Modellversuch zur Entstehung eines Diffusionspotentials ber einer K+-selektiven Membran

5 Eine Kammer ist in zwei Kompartimente unterteilt. In Kompartiment A befindet sich eine Lsung mit 100 mmol/l KCl und in Kompartiment B eine mit 10 mmol/l KCl. Positiv geladene K+- und negativ geladene Cl--Ionen sind in den Lsungen vllig ungeordnet, solange beide Kompartimente durch die undurchlssige Trennwand voneinander abgeteilt sind. Es kann keine Potentialdifferenz gemessen werden (Abb. 1, links). Das ndert sich, wenn die Trennwand durch eine K+-selektive Membran ersetzt wird (Abb. 1, rechts). Der Konzentrationsgradient liefert jetzt die chemische Triebkraft fr die Diffusion der K+-Ionen. Diese diffundieren entlang des Konzentrationsgradienten (= chemischer Gradient) durch die Membran. Allerdings wird die Diffusion wegen der elektrischen Ladung der K+-Ionen bald limitiert. Das erste K+-Ion erfhrt nur die Triebkraft des chemischen Gradienten. Es lt jedoch ein negativ geladenes Cl--Ion zurck, so da bereits eine gewisse Ladungstrennung eintritt und dadurch eine elektrische Triebkraft entsteht, die der chemischen entgegengesetzt ist. Das zweite K+-Ion erfhrt zwar die chemische Triebkraft wie Nr. 1, es mu aber die elektrische Anziehungskraft des vorher zurckgebliebenen Cl-Ions berwinden und kann deshalb die Membran nicht mehr so leicht passieren wie Nr. 1. Nachdem einige K+Ionen nach B diffundiert sind, ben die zurckgebliebenen Cl--Ionen eine so starke Anziehungskraft aus, bzw. ist die elektrische Triebkraft so gro, da keine weiteren K+-Ionen das Kompartiment A verlassen knnen. Chemische und elektrische Triebkraft halten sich die Waage, wir haben das Gleichgewicht erreicht. Entsprechend mit man jetzt das Gleichgewichtspotential. Da sich das Gleichgewichtspotential auf Grund der Diffusion der K+-Ionen von A nach B aufgebaut hat, handelt es sich hierbei um ein Diffusionspotential. (Das Diffusionspotential ist brigens immer so gerichtet, da es die Diffusion des besser permeablen Ions, hier K+, verlangsamt.) Wichtig ist, da sich die K+-Konzentrationen in A und B im Gleichgewichtszustand nicht mebar von denen im Ausgangszustand unterscheiden, und es zu keinem Konzentrationsausgleich fr K+-Ionen kommt. Es kommt also nur zu einer Ladungstrennung in unmittelbarer Nhe der Membran, so da die Membran als eine Art Plattenkondensator aufgefat werden kann, dessen Platten ihre an die Kompartimente A und B grenzenden Flchen sind. Da diese Membran sehr dnn ist, gengen schon geringe Ladungsunterschiede, um eine Spannung aufzubauen.

6 Die Gre des D i f f u s i o n s p o t e n t i a l s lt sich mit der Nernst-Gleichung berechnen: RT CA _ _____ . ln __ E= zF CB Es bedeuten: E = Gleichgewichtspotential [mV] T = absolute Temperatur; 310 K(elvin) bei Krpertemperatur, 293 K bei 20C F = Faraday-Konstante = 9,65 104 Asmol-1 R = allgemeine Gaskonstante = 8,31 JK-1 mol-1 z = Wertigkeit des Ions CA = Konzentration in A CB = Konzentration in B RT Fr einwertige Ionen kann fr -----unter Einbeziehung einer Umwandlung vom natrlichenzF (ln) zum dekadischen Logarithmus (lg) eine Konstante 61 mV eingesetzt werden. Fr unser Beispiel ergibt sich demnach bei 37C ein Diffusionspotential von: 100 mmol/1 E = -61 mV lg ----------------- = -61 mV 10 mmol/1

7 Das Diffusionspotential hngt also ausschlielich von der Gre des Konzentrationsgradienten fr das betreffende Ion ab, in unserem Beispiel fr K+. Diese theoretischen berlegungen sollen nun experimentell mit einer K+-selektiven Elektrode nachvollzogen werden (siehe Abb. 2).

K -Elektrode

ReferenzElektrode

chlorierter Silberdraht
Cl
-

K
+ +

Cl

Cl

- - - - - - - - - - - Na + + + + + + + + + + K Cl
-

Na

K Cl
K
+

Cl
+

Na Cl
-

K -selektive Membran
Abb. 2: Schematischer Aufbau einer K+-selektiven Elektrode

Das Kernstck dieser Elektrode ist eine Membran, die ausschlielich fr K+-Ionen permeabel ist. Gefllt ist das Innere der Elektrode mit einer 3 M KCl-Lsung, in der ein chlorierter Silberdraht steckt, der die Verbindung zum Verstrker herstellt. Taucht man die Elektrode nun in KCl-haltige Lsungen, hat man die gleiche Situation wie im oben beschriebenen Modellversuch. Entlang des chemischen Gradienten fr K+ ber der K+-selektiven Membran der Elektrode baut sich ein Diffusionspotential auf, das von der Gre des Konzentrationsgradienten abhngt.

8 Versuch

Ziel dieses Versuchs ist es, das Diffusionspotential fr K+ zu bestimmen, das sich zwischen RingerLsungen mit unterschiedlichen K+-Konzentrationen ausbildet. Dazu sind Ihnen eine Modellsung fr das Zytoplasma (Innen) und fnf verschiedene Modellsungen fr den Extrazellulrraum (Auen) vorgegeben.

1. Aufgabe: Bestimmung der K+-Konzentration in der Zytoplasmalsung (Innen) Praktischer Versuchsablauf: Wie in Abb. 2 schematisch gezeigt, tauchen Sie K+-Elektrode und Referenzelektrode in ein Becherglas, das zunchst die Auenlsung mit 5 mmol/1 K+ enthlt, bis Sie ein stabiles Potential am Verstrker ablesen knnen (E auen). Anschlieend wiederholen Sie diese Messung mit der Innenlsung (E innen). Bilden Sie die Potentialdifferenz Eauen - Einnen und setzen Sie diesen Wert in die Nernst-Gleichung zur Berechnung der K+-Konzentration der Innenlsung ein. [K+]innen EK = Eauen - Einnen = slope lg ------------[K+]
auen

Der slope gibt das Antwortverhalten der K+-Elektrode wieder. Er wird bei der Eichung der Elektrode bestimmt. Unter idealen Bedingungen betrgt er (bei Raumtemperatur) -59 mV, wenn die Konzentration des Meions (hier K+) um den Faktor 10 verndert wird. Warum? (Die Eichung wird vor dem Praktikum von den Kursbetreuern durchgefhrt.)

2. Aufgabe: Bestimmung der K+-Konzentrationen der verbleibenden Auenlsungen. Gehen Sie in der gleichen Weise vor wie in Aufgabe 1 und verwenden Sie den dabei bestimmten Wert fr die K+-Konzentration der Innenlsung. Kauen1 = ..........mmol/l Kauen2 = ..........mmol/l Kauen3 = ..........mmol/l Kauen4 = ..........mmol/l Tragen Sie Ihre Werte auch in das Diagramm (Abb. 3, halb-logarithmisches Papier) ein. Was fr eine Kurve erwarten Sie? Warum?

9 Abb. 3 zeigt die Abhngigkeit der Ruhemembranpotentiale einer Herzmuskelzelle von der extrazellulren K+Konzentration [K+]a. Dabei wurde mit einer Mikroelektrode (s.u.) in die Zelle eingestochen und schrittweise die [K+]a variiert.

0Membranpotential (mV) -20 -40 -60 -80 -100 -120 1

+

Mewerte

Nernstbeziehung fr [K ]
+

10

30

K -Auenkonzentration (mmol/l)
Abb. 3: Ruhemembranpotentiale einer Herzmuskelzelle

Vergleichen Sie Ihre Kurve auf dem halblogarithmischen Papier mit der aus Abb. 3! Wieso ist der Kurvenverlauf bei Herzmuskelzellen nicht linear?

100

10 Fragen Wie sind die intra- und extrazellularen Konzentrationen von K+, Na+, Cl-, Ca2+ in mmol/l? - Berechnen Sie die jeweiligen Gleichgewichtspotentiale! Vergleichen Sie diese Gleichgewichtspotentiale mit dem

Ruhemembranpotential einer Nervenzelle von -80 mV! - Wie gro sind die Triebkrfte fr die jeweiligen Ionen ber die Zellmembran? - Wie kann eine Zelle den groen elektrochemischen Gradienten fr Na+ und Ca2+ aufrechterhalten? - Was ist der grundlegende Unterschied zwischen der Diffusion geladener Teilchen wie z.B. K+-Ionen und der Diffusion ungeladener Teilchen wie z.B. Harnstoff?

II. Demonstrationsversuch

Im ersten Teil des Praktikums wurden am Beispiel einer K+-Elektrode die theoretischen Grundlagen des Membranpotentials besprochen. In diesem Demonstrationsversuch soll das Membranpotential einer lebenden Zelle, nmlich einer Froschoozyte, gemessen werden. Auf Grund ihrer enormen Gre (Durchmesser ca. 1,2 mm; vergleiche Erythrozyt: 0,007 mm) sind Froschoozyten sehr gut fr solche Messungen geeignet. Bei der Besprechung des Diffusionspotentials hatten Sie die Nernst-Gleichung kennengelernt. Mit ihr lassen sich Diffusionspotentiale fr jeweils eine Ionenart berechnen. Wie bereits erwhnt, wird das Membranpotential jedoch nicht nur durch eine Ionenart, sondern durch mehrere bestimmt. Zur Berechnung des Membranpotentials Em einer Zelle wurde die Nernst-Gleichung daher zur Goldmann-Hodgkin-KatzGleichung erweitert:

RT

PK[K+] i + P Na[Na+]i + PCl[Cl-]a

E = ln F P K [K+]a + PNa[Na+ ]a + PCl [ Cl-]i

P = Permeabilitt der Zellmembran jeweils fr Kalium, Natrium oder Chlorid Indices a und i = Bezeichnung fr Extra- und Intrazellulrraum

Die

Aussage

dieser

Gleichung

ist,

da

das

Membranpotential

einer

Zelle

vom

Konzentrationsgradienten und der Leitfhigkeit der K+-, Na+- und Cl--Ionen abhngt. Wre z.B. eine Zellmembran fr Cl- impermeabel, also PCl = 0, so werden die Produkte PCl[Cl-]i und PCl[Cl-]a in der Goldmann-Hodgkin-Katz-Gleichung ebenfalls Null. Die intra- und extrazellulren Chloridkonzentrationen htten daher in diesem Beispiel keinen Einflu auf das Membranpotential. Umgekehrt wirken sich nderungen des Konzentrationsgradienten eines Ions um so strker auf das Membranpotential aus, je hher seine Permeabilitt ist.

11 In dem Demonstrationsversuch sollen diese berlegungen am Beispiel von K+-Ionen veranschaulicht werden. Wir untersuchen die Abhngigkeit des Membranpotentials von Froschoozyten vom Konzentrationsgradienten fr Kaliumionen und von der Permeabilitt der Zellmembran fr Kaliumionen. Den

Konzentrationsgradienten fr K+-Ionen verndern wir, indem wir die K+-Konzentration im Extrazellulrraum anheben (Hyperkalimie). Die K+-Permeabilitt der Oozytenmembran verndern wir durch die Gabe eines K+Kanalblockers. Wir verwenden hier Barium als wirksamen K+-Kanalblocker.

Versuchsaufbau Der Versuchsaufbau ist schematisch in Abb. 4 gezeigt.

Verstrker

Mikroelektrode Referenzelektrode Ringerlsung

Oozyt
Abb. 4: Versuchsaufbau zum Messen des Membranpotentials von Froschoozyten

Die Oozyten liegen in Vertiefungen in einer Experimentierkammer und werden kontinuierlich mit Ringer-Lsung berstrmt. Ihr Membranpotential wird mit Mikroelektroden gemessen. Mikroelektroden sind fein ausgezogene Glaskapillaren, deren ffnungen an der Spitze einen Durchmesser von < 1 m haben und mit denen man durch die Zellmembran ins Zytoplasma der Oozyten sticht. Eine Elektrolyt-Lsung im Innern der Mikroelektroden sorgt fr die elektrische Verbindung zwischen Zytoplasma und Verstrker. Obwohl Oozyten im Vergleich zu anderen Zellen riesige Ausmae haben (s.o.), sind sie immer noch zu klein, um sie ohne Hilfsmittel mit einer Mikroelektrode zu punktieren. Daher werden alle Experimente unter einem Stereomikroskop (max. 160fache Vergrerung) durchgefhrt, und die Mikroelektrode wird mit einem Mikromanipulator bewegt.

12 Das Membranpotential der Oozyten wird unter vier verschiedenen Bedingungen gemessen: Em(mV) 1) Kontrolle ([K+]a = 3 mmol/l) ___________________________________________________________________________ 2) Leichte Hyperkalimie ([K+]a = 6 mmol/l) ___________________________________________________________________________ 3) Schwere Hyperkalimie ([K+]a = 30 mmol/l) ___________________________________________________________________________ 4) Blockade der K+-Kanle mit Bariumionen ___________________________________________________________________________

Fragen Erklren Sie die beobachteten Vernderungen des Membranpotentials! - Erwarten Sie auer fr K+ noch Permeabilitten fr andere Ionen, z.B. Na+, Cl-? Warum? - Wieviel mV Spannungsnderung beim Wechsel von 3 auf 30 mmol/l K+ htten Sie mit einer K+-Elektrode gemessen? - Was erwarten Sie, wenn [Cl-]a erniedrigt wird? - Was erwarten Sie bei einer Gabe von Na+-Kanalblockern? - Wozu braucht die Zelle ein Membranpotential? - Was hlt das Membranpotential aufrecht? - Was ist ein Gleichgewichtspotential?