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Inaugural
Dissertation
zur
vorgelegt von
Philippe Coulon
aus Hamburg
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultt
der Heinrich-Heine-Universitt Dsseldorf
2005
Gedruckt mit der Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultt der Heinrich-HeineUniversitt Dsseldorf
Referent:
Koreferent:
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
EINLEITUNG...........................................................................................................................5
1.1
1.2
1.3
1.4
Zielsetzung.......................................................................................................................10
2.2
Glasmikroelektroden .......................................................................................................14
2.2.1
Einkanalelektroden..................................................................................................14
2.2.2
2.2.3
2.3
2.3.1
Messprinzip .............................................................................................................21
2.3.2
Versuchsaufbau .......................................................................................................23
2.4
Auswertung .....................................................................................................................26
2.5
Lsungen .........................................................................................................................27
ERGEBNISSE.........................................................................................................................31
3.1
3.2
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.4
3.3
Einfluss von Em auf die nderung des Zellvolumens unter anisotonischen Bedingungen..
.........................................................................................................................................35
3.4
3.5
Strom-Eingangswiderstandsbeziehungen...........................................................................38
3.6
3.6.1
3.6.2
3.7
Inhaltsverzeichnis
3.8
3.9
3.10
3.10.1
Einfluss von K+-Kanalblockern auf die nderungen von Em und Rin unter
hypotonischen Bedingungen....................................................................................48
3.10.2
3.10.3
3.10.4
Einfluss Cl--freier Bedingungen und des Cl--Kanalblockers DIDS auf die StromEingangswiderstandsbeziehung und IVC................................................................51
3.11
Wirkung verminderter extrazellulrer Osmolalitt auf Rin und Em: Zusammenfassung und
Schlussfolgerungen ...........................................................................................................53
DISKUSSION .........................................................................................................................55
4.1
4.1.1
4.1.2
4.2
4.3
4.4
4.5
ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................................69
LITERATUR...................................................................................................................................72
ABBILDUNGEN ............................................................................................................................87
ANHANG......................................................................................................................................124
DANKSAGUNG...........................................................................................................................127
ERKLRUNG ..............................................................................................................................129
Einleitung
EINLEITUNG
Die Plasmamembran tierischer Zellen stellt fr Ionen eine Barriere dar, ist jedoch
fr Wasser durchlssig. Das Volumen einer tierischen Zelle verndert sich
deshalb bei einem osmotischen Ungleichgewicht zwischen Intrazellulrraum und
extrazellulrer Matrix durch Aufnahme oder Abgabe von Wasser, bis keine
Druckdifferenz mehr ber der Plasmamembran besteht und wieder ein
osmotisches Gleichgewicht herrscht. Die Wasserpermeabilitt wird bei manchen
Zelltypen durch den Einbau von Aquaporinen noch zustzlich erhht (Murata et
al. 2000, King et al. 2004). Da nicht-autotrophe, tierische Organismen in der
Regel beweglich bleiben mssen, um ihr berleben zu sichern, sind tierische
Gewebe weich und elastisch. Tierische Zellen haben daher keine feste Zellwand,
und knnen folglich keinen nennenswerten hydrostatischen Druck aufrecht
erhalten. Das Zellvolumen hngt also weitgehend von der intra- und extrazellulren Osmolalitt ab. Da drastische Vernderungen des Zellvolumens jedoch
erhebliche Strungen zellulrer Funktionen verursachen knnen, besitzen praktisch alle tierischen Zellen Mechanismen, die eine Regulation des zellulren
Wasserhaushalts ermglichen (Lang et al. 1998, Frst et al. 2002).
1.1
Einleitung
Ionen, flieen bevorzugt K+-Ionen aus der Zelle in den Extrazellulrraum und
bauen ber der Membran eine Potentialdifferenz auf. Diese Potentialdifferenz
treibt Cl--Ionen aus der Zelle, erniedrigt die intrazellulre Cl--Konzentration und
schafft damit osmotischen Raum fr die essentiellen organischen Molekle. Die
Gradienten fr Na+ und K+ werden durch die Na+-K+-ATPase aufrecht erhalten,
die pro Pumpzyklus unter Spaltung eines ATP-Molekls 3 Na+-Ionen aus der
Zelle heraus und 2 K+-Ionen in die Zelle hinein transportiert (Skou 1990).
Da Vernderungen des Zellvolumens zu erheblichen Strungen zellulrer Funktionen und sogar zum Zelltod fhren knnen, besitzen die meisten tierischen
Zellen Mechanismen zur Regulation des Zellvolumens (Okada 1998, Sarkadi und
Parker 1991, Waldegger et al. 1998, Wehner 1998). Dabei wird zwischen einer
regulatorischen Volumenabnahme (regulatory volume decrease = RVD), die eine
Zellschwellung kompensiert und einer regulatorischen Volumenzunahme
(regulatory volume increase = RVI), mit der die Zelle auf Schrumpfung reagiert,
unterschieden.
Die grundlegende RVD-Strategie ist, die Menge der im Cytosol gelsten Osmolyte zu verringern und einen Wasserausstrom zu induzieren. Dies kann zum einen
durch den Transport von Osmolyten in den Extrazellulrraum geschehen, zum
anderen durch Polymerisierung organischer Monomere. Die Menge der im
Cytosol gelsten Ionen, Aminosuren, Zucker und Alkohole kann durch Auswrtstransport vorbergehend abgesenkt werden, ohne die normalen Zellfunktionen nachhaltig zu beeintrchtigen. Das Resultat dieser Vorgnge ist die
Verringerung des Zellvolumens unter den volume-set-point, der das Volumen
darstellt, bei dessen berschreitung eine RVD einsetzt. Der volume-set-point
kann jedoch durch eine Zellschwellung verndert werden, so dass bei einer RVD
nicht unbedingt das Ausgangsvolumen erreicht wird (Frst et al. 2002, Simkiss
1998). Bei einer RVI wird analog durch die Aufnahme von Osmolyten oder die
Depolymerisierung von organischen Makromoleklen die Menge im Cytosol
gelster Osmolyte erhht, so dass Wasser in die Zelle einstrmt.
Einleitung
Bei hheren Eukaryonten ist fr eine RVD primr eine KCl-Abgabe der Zelle
verantwortlich, wohingegen eine RVI auf einer NaCl-Aufnahme beruht (Siebens
und Kregenow 1985, Eveloff und Warnock 1987). An der KCl-Abgabe whrend
der RVD sind je nach Zelltyp der K+/Cl--Cotransporter (Larson und Spring 1984)
sowie schwellungsaktivierte K+- und Cl--Kanle beteiligt (Niemeyer et al. 2000,
Nilius et al. 1996, Ege et al. 1997, Okada 1997, Nagasaki et al. 2000, Idriss et al.
2000, Frst et al. 2002), bei Nierenzellen zustzlich spannungsaktivierte K+Kanle (Kv 1.3, Kv 1.5) und Ca2+-aktivierte K+-Kanle (Pasantes Morales et al.
2000). An der NaCl-Aufnahme bei der RVI ist unter anderem der Na+-H+Austauscher beteiligt, der in Kooperation mit dem Cl--HCO3--Austauscher Na+und Cl--Ionen in die Zelle transportiert (Kregenow et al. 1985, Eveloff und
Warnock 1987).
Auch das Cytoskelett kann an der Regulation des Zellvolumens beteiligt sein
(Schwiebert et al. 1994, Cantiello 1997, Larsen et al. 2000). Sowohl AktinFilamente als auch Mikrotubuli knnen die Aktivierung von Ionenkanlen
bewirken, die den Transport von Osmolyten ber die Zellmembran ermglichen
und das Zellvolumen verndern. Hierbei erfolgt eine mechanische Weiterleitung
der durch Zellschwellung auftretenden Krfte an mechanosensitive Kanle
(Janmey 1998).
1.2
Einleitung
Einleitung
1.3
Einleitung
1.4
Zielsetzung
Das Ziel der in dieser Arbeit durchgefhrten Experimente lag zunchst darin, die
Auswirkung anisotonischer Bedingungen auf passive Membraneigenschaften, wie
Membranpotential (Em), Eingangswiderstand (Rin) und Membrankapazitt (Cin),
von Blutegel-Neuronen zu untersuchen, um Hinweise auf eine osmotisch
induzierte Aktivierung von Membranstrmen sowie den Ein- oder Ausbau von
Membranelementen zur Vergrerung der Zelloberflche zu erhalten. Hierzu
wurden die current-clamp-Technik (Stromklemme) und die voltage-clamp-
10
Einleitung
11
Einleitung
Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden in Teilen bereits als Tagungsbeitrge bzw.
einer Originalarbeit verffentlicht (Coulon et al. 2002, 2003, Dierkes et al. 2002).
12
2
2.1
13
Die Prparation der Segmentalganglien wurde nach dem Protokoll von Deitmer
und Schlue (1981) durchgefhrt. Der Blutegel wurde in einer mit Wachs
ausgegossenen Prparierschale in leicht gestrecktem Zustand mit Stecknadeln
fixiert. Durch einen tiefen dorso-ventralen Schnitt direkt hinter dem Kopfsaugnapf
wurden Ober- und Unterschlundganglion von der Ganglienkette getrennt. Mit
einer feinen Schere wurde der Hautmuskelschlauch auf der Dorsalseite ber die
ganze Lnge des Tieres aufgeschnitten, wobei das Darmepithel mit durchtrennt
wurde. Der Hautmuskelschlauch wurde vorsichtig auseinandergezogen und
seitlich mit Stecknadeln fixiert (Abb. 2 A). Das im Darm vorhandene Blut wurde
mit Normalsalzlsung (NSL, siehe 2.5) ausgesplt. Anschlieend wurde die
ventrale Darmwand und umgebendes Bindegewebe entfernt und der ventrale
Blutsinus freigelegt. Nach Durchtrennung der Konnektive und Seitenwurzeln
wurden die Segmentalganglien aus dem Blutsinus heraus gezogen, in ein mit NSL
geflltes Blockschlchen berfhrt und dort bis zum Versuchsbeginn gekhlt aufbewahrt.
Die
Segmentalganglien
wurden
ausschlielich
adulten
Tieren
entnommen, die entweder aus der institutseigenen Zucht stammten oder von der
Fa. Moser (Schorndorf) bezogen wurden. Mit Ausnahme der Geschlechtsganglien
(Segmentalganglien 5 und 6) wurden alle Segmentalganglien fr die Versuche
verwendet.
2.2
2.2.1
Glasmikroelektroden
Einkanalelektroden
14
2.2.2
Ionensensitive Glasmikroelektroden
oder
mehrere
ionensensitive
Kanle
mit
einem
elektrolytgefllten
Anstieg
der
Konzentration
des
Volumenmarkers
entspricht
einer
15
([TMA+]i)
abhngig
(Neumann
et
al.
2001).
Der
Herstellung
ionensensitiver
Zweikanal-Glasmikroelektroden
wurden
16
zuvor mit einer Heizplatte auf 40 C erwrmt und mindestens 20 min bei dieser
Temperatur belassen, bevor mit der Silanisierung begonnen wurde. Nach ~90 min
HMDS-Bedampfung bei 40 C wurden die Mikrokapillaren im Ofen fr 120 min
auf 200 C erhitzt, wobei das Wasser in den Referenzkanlen verdampfte und die
HMDS-Schicht fixiert wurde.
Zunchst wurde der Referenzkanal mit Elektrolytlsung gefllt. So konnten etwaige Luftblasen durch Erwrmen mit einem Ltkolben entfernt werden, ohne
den temperaturempfindlichen Corning-Sensor zu beschdigen. Danach wurde der
Sensor mit Hilfe einer fein ausgezogenen Kunststoffkapillare in den silanisierten
Kanal eingebracht und die Elektrode im Exsikkator ~10 min lang einem Unterdruck ausgesetzt, um Luftblasen in der organischen Phase zu beseitigen. Anschlieend wurde der Sensor mit der backfill-Lsung berschichtet. Beide Kanle wurden mit chlorierten Silberdrhten versehen und mit Hartklebewachs
verschlossen. Die Glasmikroelektroden wurden mit ihren Spitzen in NSL
eingetaucht und konnten in einem verschlossenen Gef ohne Qualittseinbue
fr bis zu 3 Tage aufbewahrt werden.
2.2.3
E0:
Standardpotential
s:
Nernst-Steigung
ai :
(1)
17
s = 2,303
R T
zi F
R:
T:
z i:
F:
(2)
Bei einer Temperatur von 21C (siehe 2.3.2) betrgt die Nernst-Steigung s fr ein
einfach positiv geladenes Ion 58 mV.
Alle Flssigmembran-Ionophore weisen eine geringe Empfindlichkeit gegenber
anderen Ionen auf (Strionen). Dies hat zur Folge, dass bei niedrigen
Messionenaktivitten das Potential der ionensensitiven Glasmikroelektrode nicht
mehr proportional zum dekadischen Logarithmus der Messionenaktivitt ist. Der
Zusammenhang zwischen Elektrodenpotential, Messionen- und Strionenaktivitt
wird durch die Nikolsky-Eisenman-Gleichung beschrieben (Eisenman 1962,
Ammann 1986):
Eion
zi
zj
pot
= E 0 + s log ai + k i , j (a j )
aj:
zj:
(3)
k ipot
potentiometrische Selektivittskoeffizienten des Ionophors
,j :
18
verwendeten
Flssigmembran-Ionophor
wurde
nur
eine
Strionensorte
Eion
zi
zj
pot
= E 0 + s log ai + k i , j (a j )
(4)
Der Einfluss der Messionen auf Eion nimmt mit wachsender ai immer mehr zu, so
dass sich Gleichung (4) der Nernst-Gleichung (1) annhert. Mit abnehmendem ai
nhert sich Eion asymptotisch einem konstanten Wert, der dem Potentialbeitrag
von aj entspricht. Das Detektionslimit ai0 ist durch den Schnittpunkt der beiden
Asymptoten der Eichkurve definiert und stellt definitionsgem die kleinste ai
dar, die vor einem Strionenhintergrund messbar ist (Abb. 4). Die rechnerische
Bestimmung von ai0 erfolgt durch Gleichsetzen der Nernst-Gleichung (1) mit
Gleichung (4):
zi
z
E0 + s log ai0 = E0 + s log k ipot
, j (a j ) j
(5a)
z
ai0 = k ipot
, j (a j ) j
(5b)
Hieraus folgt:
zi
Das Einsetzen von Gleichung (5b) in Gleichung (4) liefert folgende Gleichung
(6), nach der Eion dem Logarithmus der Summe von ai und ai0 proportional ist:
(6)
, = Akti-
(7)
19
Da der Aktivittskoeffizient i des Messions in den Eichlsungen nur um 2% variiert und E0 und s konstant sind, kann Gleichung (7) folgendermaen
umgeschrieben werden:
(8)
20
2.3
2.3.1 Messprinzip
In dieser Arbeit wurde berprft, inwieweit die extrazellulre Osmolalitt
elektrophysiologische Parameter und das Zellvolumen von Retzius-Neuronen
beeinflusst. Hierzu wurden drei Methoden angewendet: die current-clampTechnik (Stromklemme), die voltage-clamp-Technik (Spannungsklemme) und die
Technik ionensensitiver Glasmikroelektroden in Kombination mit der voltageclamp-Technik (Abb. 5). Zur Anwendung der current-clamp- und der voltageclamp-Technik wurden jeweils zwei Einkanal-Glasmikroelektroden in die Zelle
eingestochen, wobei eine Elektrode zur Strominjektion und die andere Elektrode
zur Em-Messung diente. Bei der Kombination der Technik ionensensitiver
Glasmikroelektroden mit der voltage-clamp-Technik wurden eine EinkanalGlasmikroelektrode und eine ionensensitive Zweikanal-Glasmikroelektrode in die
Zelle eingestochen. Hierbei diente die Einkanal-Elektrode zur Strominjektion und
der Referenzkanal der Zweikanal-Elektrode zur Registrierung von Em. Mit dem
ionensensitiven Kanal wurden durch Messung der TMA+-Konzentration Zellvolumennderungen bestimmt (siehe 2.2.2).
Bei der current-clamp-Technik (Abb. 5 A) wird die Wirkung einer Strominjektion auf das Em registriert. Ein negativer Strom hyperpolarisiert, ein positiver
Strom depolarisiert die Membran der Zelle. Die Amplitude der Em-Verschiebung
ist dem Injektionsstrom und dem Eingangswiderstand (Rin) der Zelle proportional.
Rin ist somit umso hher, je grer die durch den Injektionsstrom hervorgerufene
Em-Verschiebung ist. nderungen der durch Strominjektion induzierten EmVerschiebung knnen somit Aufschluss ber die Aktivierung bzw. De- oder
Inaktivierung von Ionenkanlen geben. Der Vorteil der current-clamp-Technik
besteht darin, dass zustzlich zu Rin auch Em sowie Frequenz, Kinetik und
Amplitude von Aktionspotentialen registriert werden knnen.
21
Bei der voltage-clamp-Technik wird der Strom (IVC) gemessen, der in die Zelle
injiziert werden muss, um Em auf ein vorgegebenes Haltepotential (Eh) zu
klemmen. Somit kompensiert IVC den Nettostrom, der bei Eh ber die Zellmembran fliet. IVC wird ber einen Rckkopplungsschaltkreis des voltage-clampVerstrkers, der im Prinzip aus zwei Differenzverstrkern besteht, ermittelt (Abb.
5 B). Der erste Differenzverstrker registriert ber die Potentialelektrode Em, das
auf den invertierenden Eingang des zweiten Differenzverstrkers, des so genannten Klemmverstrkers gelegt wird. Der Klemmverstrker injiziert IVC in die Zelle,
entsprechend der Differenz zwischen Em und Eh, und klemmt dadurch Em auf Eh.
Die voltage-clamp-Technik liefert ebenso wie die current-clamp-Technik Aufschluss ber die Aktivierung bzw. De- oder Inaktivierung von Ionenkanlen. Sie
bietet gegenber der current-clamp-Technik jedoch zum einen den Vorteil der
Quantifizierung von Membranstrmen. Zum anderen bleibt wegen der Klemmung
von Em die Aktivitt spannungsgesteuerter Ionenkanle unverndert.
Die Kombination der Technik ionensensitiver Glasmikroelektroden mit der
voltage-clamp-Technik wurde in der vorliegenden Arbeit verwendet, um bei
einem definierten Em die nderungen des Zellvolumens zu messen, die nach
Vernderung der extrazellulren Osmolalitt auftreten. Die Beladung der RetziusNeuronen mit dem Volumenmarker TMA+ erfolgte durch Applikation von 5 mM
TMA-Cl ber die Badlsung (Abb. 6 A). Das aufgenommene TMA+ wurde von
der Zelle in TMA+-freier Lsung langsam wieder abgegeben, so dass [TMA+]i
kontinuierlich abnahm. Dieser [TMA+]i-Abfall konnte mit Hilfe eines Tabellenkalkulationsprogramms (Excel, Microsoft) durch eine einfache Exponentialfunktion beschrieben werden (Fit; gestrichelte Linie in Abb. 14 A), so dass es
mglich war, den durch Auswrtstransport bedingten [TMA+]i-Abfall zu jedem
Zeitpunkt des Experiments zu berechnen ([TMA+]i,fit) und somit volumenbedingte
[TMA+]i-nderungen zu isolieren. In frheren Arbeiten zeigte sich, dass die K+Sensitivitt von Corning 477317 bei einer hinreichenden TMA+-Konzentration,
die das 2- bis 3-fache des Detektionslimits fr TMA+ betrug, vollstndig unterdrckt ist (Neumann et al. 2001, Trosiner 2003). Entsprechend wurde die
Messung des Zellvolumens nur solange durchgefhrt, bis [TMA+]i auf das 3-fache
22
2.3.2 Versuchsaufbau
Der Versuchsaufbau war zur Abschirmung gegen elektrische Streinflsse in einem Faraday-Kfig untergebracht, der zur Dmpfung mechanischer Schwingungen auf Gummipuffern gelagert war. Einzelne Segmentalganglien wurden in einer
mit Sylgard ausgegossenen Versuchswanne mit der Ventralseite nach oben mit
vier Minutiennadeln festgesteckt. Das Flssigkeitsvolumen in der Versuchswanne
betrug ~50 l. Die Versuchslsungen wurden zum Abfangen von Gasblasen ber
einen Windkessel in die Versuchswanne gesplt und ber eine Glaskapillare
mittels einer Vakuum-Kolbenpumpe (HyFlo Bros. Medcalf, Potters Bar, Herts,
UK) wieder abgesaugt. Die Durchlaufgeschwindigkeit betrug ~4 ml/min, so dass
die Badlsung ~80 mal pro Minute ausgetauscht wurde. Die Versuchswanne
wurde ber eine mit einem chlorierten Silberdraht versehene Agarbrcke geerdet
(Kunststoffschlauch, 3 % Agar in 3 M KCl). Die Positionierung der Elektroden
und der Einstich in die Zelle erfolgten unter optischer Kontrolle (Stereolupe M5,
23
WPI),
an
dessen
hochohmigen
Eingang
(~1015 )
der
24
genutzt,
um
rasche
Folgen
unterschiedlicher
Spannungs-
oder
25
Wurden diese Werte nicht innerhalb von 5 min nach dem Elektrodeneinstich
erreicht, wurden Prparat und Elektroden verworfen.
Bei den voltage-clamp-Messungen wurde nach dem Elektrodeneinstich Em
zunchst auf -50 mV geklemmt. Mit den Messungen wurde begonnen, nachdem
IVC unter 3 nA gefallen war und fr eine kurzzeitige (1 s) Membranhyperpolarisation auf -100 mV maximal 10 nA zustzlich bentigt wurde, wiederum
entsprechend einem Rin von 5 M. Zur Ermittlung von Strom-Spannungskennlinien wurde Em in 10 mV-Intervallen fr jeweils 1 s auf -120 bis -20 mV geklemmt, wobei zwischenzeitlich immer wieder fr mindestens 3 s auf -50 mV
zurckgeklemmt wurde. Um eine mgliche Schdigung der Zellen durch zu hohe
IVC zu vermeiden, wurde der TEC-05L so eingestellt, dass in der Regel nicht auf
Eh positiver als -20 mV geklemmt werden konnte (oscillation shut-off). Nur in
Na+-freien Lsungen waren die Strme zur Einstellung positiver Eh
verhltnismig gering, so dass es in einigen Fllen mglich war, die Zellen ohne
Schdigung bis auf +10 mV zu klemmen.
2.4
Auswertung
26
2.5
Lsungen
Die Lsungen wurden mit entsalztem Wasser hergestellt, das ber eine UmkehrOsmose-Anlage (Milli-Q Reagent Water System; Millipore, Molsheim, Frankreich) aus vorentsalztem Leitungswasser gewonnen wurde. Der spezifische
Widerstand des so aufbereiteten Wassers betrug mindestens 18 Mcm.
Die Zusammensetzungen der Versuchslsungen sind in Tabelle 1 wiedergegeben.
Die NSL entsprach der von Nicholls und Kuffler (1964) verwendeten Lsung,
jedoch war der NaCl-Gehalt um 26 mM reduziert, um Isotonie zur BlutegelHmolymphe zu erreichen (Munsch und Deitmer 1992). Zur pH-Pufferung wurde
HEPES verwendet (N-[2-hydroxyethyl]piperazin-N-2-ethansulfonsure, Applichem, Darmstadt). Der pH-Wert wurde normalerweise mit 1 M NaOH auf 7,4
eingestellt, wodurch die Na+-Konzentration um ~4 mM erhht wurde und
entsprechend 4 mM HEPES in die anionische Form berfhrt wurden.
Lsungen, in denen Na+ anteilig oder vollstndig ersetzt war, wurde NMDG (NMethyl-D-Glucamin, Sigma, Deisenhofen) hinzugefgt, das durch Titrierung mit
HCl in NMDG-Cl umgesetzt wurde. Zur Herstellung von Lsungen mit
reduzierter
Cl--Konzentration
wurden
die
entsprechenden
Gluconatsalze
und
Ionenstrke
der
Lsung
entsprachen
jedoch
einer
27
28
K+
NSL
89
95
190 mosm/kg
-20 NaCl
69
75
150 mosm/kg
-30 NaCl
59
65
130 mosm/kg
-40 NaCl
49
55
110 mosm/kg
-50 NaCl
39
45
90 mosm/kg
-59 NaCl
30
36
81 mosm/kg
+20 NaCl
109
105
230 mosm/kg
+40 NaCl
129
135
270 mosm/kg
+85 NaCl
174
180
360 mosm/kg
49
95
40
40
49
95
40
89
55
40
49
55
+80 mM
Saccharose
Cl--frei
89
95
Cl--frei
49
55
Na+-frei
95
89
Na+-frei
55
49
20 TEA+
69
95
+20 mM
TEA+
20 TEA+
29
55
+20 mM
TEA+
80
0,5
89
konst. Ionenstrke
red. Ionenstrke
hypotonisch
hypotonisch
hypotonisch
Eichlsungen
(pH 7,3)
Ca2+ Mg2+
Cl-
Konzentrationsangaben in mM. Alle Lsungen enthielten 10 mM HEPES, wovon 4 mM bei pHEinstellung in die anionische Form bergehen. Wenn nicht anders angegeben, wurden die
Lsungen auf einen pH von 7,4 eingestellt. Die Osmolalitt der Versuchslsungen wurde mit
einem Osmometer bestimmt. Abweichungen von maximal 5 % von der in der Tabelle
angegebenen Osmolalitt wurden toleriert.
29
TEA+
Clofiliumtosylat
Vollstndiger Name
Quelle
Konzentration
Tetraethylammonium, Chloridsalz
Sigma
20 mM
(Tabelle 1)
Sigma
1 M
Sigma
50 M
Sigma
50 M
Sigma,
Fluka
0,5 mM
Sigma
25 M
Tocris
20 M
-Aminobuttersure
Sigma
0,5 mM
Carbamylcholinchlorid
Sigma
0,5 mM
4-Chlor-N,N-diethyl-Nheptylbenzenbutanamin tosylat
2-[3-(Trifluormethyl)anilin]
Nifluminsure
nicotinsure
5-Nitro-2-(3-phenylpropylamin)
NPPB, N-150
benzoesure
4,4-Diisothiocyanatstilben-2,2-
DIDS
Colchizin
Disulfonsure
N-(5,6,7,9-tetrahydro-1,2,3,10tetramethoxy-9-oxobenzo
[a]heptalen-7-yl)-acetamid
6,7-Dinitroquinoxalin-2,3(1H,4H)-
DNQX
GABA
Carbachol
30
dion
Ergebnisse
3
3.1
ERGEBNISSE
Em nach
Einstich CEl
[mV]
Em nach
Erholung
[mV]
Rin nach
Erholung
[M]
PEl: Einkanal
-46,8 7,6
(375)
-42,4 6,8
(343)
-49,4 7,5
(336)
8,0 1,7
(357)
PEl: Zweikanal
-47,8 8,2
(44)
-44,4 7,7
(27)
-49,1 9,1
(33)
6,9 1,6
(23)
p = 0,002
Mittelwerte S.D., die Anzahl der Messungen ist in Klammern angegeben. PEl: Potentialelektrode
(diese wurde stets zuerst eingestochen, bei ionensensitiven Zweikanal-Elektroden wurde das ber
den Referenzkanal bestimmte Potential angegeben), CEl: Stromelektrode (diese wurde stets nach
der Potentialelektrode eingestochen). Rin wurde anhand der durch Injektion von -5 nA induzierten
Em-Verschiebung bestimmt.
Die Werte fr Em nach Einheilung der Elektroden waren in den beiden Versuchsanordnungen praktisch identisch und stimmen mit Angaben aus frheren Arbeiten
gut berein (Dierkes 1998, Lucht 1997). Der Einstich der Stromelektrode bewirkte zwar eine leichte Abnahme von Em, nach einer Erholungsphase von einigen
Minuten stellte sich jedoch ein stabiles Em ein, das negativer war als unmittelbar
nach dem Einstich der Potentialelektrode. Der Rin der Zellen war bei Verwendung
31
Ergebnisse
von Zweikanal-Elektroden gegenber Einkanal-Elektroden zwar geringfgig verringert, dennoch erscheint eine Vernderung der elektrophysiologischen Eigenschaften von Retzius-Neuronen durch den Einstich der Elektroden vernachlssigbar.
3.2
32
Ergebnisse
33
Ergebnisse
34
Ergebnisse
die
Aktivierung
depolarisierend
wirkender,
schwellungsaktivierter
3.3
Einfluss von Em auf die nderung des Zellvolumens unter anisotonischen Bedingungen
35
Ergebnisse
36
Ergebnisse
3.4
37
Ergebnisse
durch eine Summe von zwei e-Funktionen mglich war, was zwei Zeitkonstanten
lieferte. Dabei spiegelt die kleinere vermutlich die Membrankapazitt des
Zellsomas wider und die grere die Membrankapazitt der Zellfortstze. Da
jedoch Rin nur fr die gesamte Zelle bestimmt wurde und zudem der
Innenlngswiderstand zwischen Soma und Fortstzen unbekannt ist und sich bei
einer Zellschwellung mglicherweise verndert, wurde nur nherungsweise
bestimmt.
Die Registrierbeispiele der strominduzierten Membranhyperpolarisation in Abb.
15 A zeigen, dass unter hypotonischen Bedingungen signifikant kleiner war als
unter isotonischen Bedingungen (19 7 ms bzw. 37 15 ms, n = 60, p < 10-6;
Abb. 15 B). Da jedoch Rin noch strker reduziert war (6,7 2,8 M bzw.
13,3 4,2 M, n = 60, p < 10-6; vgl. Abb. 17 B), ergab sich insgesamt eine CinZunahme um ~14 % (2,8 0,8 3,2 1,8 nF, n = 60, p = 0,06; Abb. 15 B).
Wegen der Cin-Zunahme kann davon ausgegangen werden, dass zustzliche
Membran, beispielsweise durch die Fusion von Vesikeln mit der Plasmamembran,
bereitgestellt wird, die vor der Volumenzunahme keinen elektrischen Kontakt zur
Badlsung aufwies. Da die Zunahme der Membrankapazitt jedoch kleiner war
als 35 %, ist zu vermuten, dass zustzlich eine Ausstlpung von Membraninvaginationen zur Vergrerung der Zelloberflche und somit des Zellvolumens
notwendig ist. Ob umgekehrt bei einer Zellschrumpfung die Membranoberflche
reduziert wird, wurde nicht untersucht.
3.5
Strom-Eingangswiderstandsbeziehungen
38
Ergebnisse
39
Ergebnisse
Tabelle 4: Anzahl der Retzius-Neuronen (von 61), die bei Injektion von +1, +2
oder +3 nA in NSL bzw. in hypotonischer Lsung (-40 mM NaCl)
Aktionspotentiale zeigten sowie Frequenz und Amplitude der Aktionspotentiale
Strom (nA)
+1
+2
+3
Lsung
NSL
-40 mM
NaCl
NSL
-40 mM
NaCl
NSL
-40 mM
NaCl
Anzahl
(n = 61)
52
37
54
43
57
47
Frequenz
(s-1)
2,6 1,5
2,1 1,5
p = 3.10-3
6,1 3,4
4,2 3,2
p = 1.10-4
9,8 5,1
6,3 4,7
p = 1.10-6
Amplitude
(mV)
31 10
18 8
p < 10-6
24 8
15 7
p < 10-6
20 7
13 6
p < 10-6
Ergebnisse
Kleine, negative Injektionsstrme riefen verhltnismig groe Em-Verschiebungen hervor, entsprechend einem groen Rin (Abb. 17 B). Bei strkeren Injektionsstrmen und folglich greren Em-Verschiebungen wurde Rin zunehmend
kleiner. In hypotonischer Lsung war Rin bei allen Stromstrken erniedrigt, wobei
die Erniedrigung bei schwachen Injektionsstrmen, also in der Nhe des Ruhe-Em,
am grten war. Wegen der Spannungsabhngigkeit von Rin wurde das Stufenprotokoll bei allen Experimenten angewendet, bei denen die Rin-Abnahme unter
hypotonischen Bedingungen durch die Versuchsbedingungen verndert war.
3.6
3.6.1
Schwellungsaktivierter Membranstrom
41
Ergebnisse
42
Ergebnisse
3.7
43
Ergebnisse
hypotonischer Lsung auf die durch Strominjektion hervorgerufenen EmVerschiebungen reproduziert (Abb. 16). Nach dem Austausch von 40 mM NaCl
durch 80 mM Saccharose blieben die strominduzierten Em-Verschiebungen
dagegen unverndert. Auch die Membranhyperpolarisation nach Injektion positiver Strme blieb erhalten. Frequenz und Amplitude der Aktionspotentiale
waren jedoch hnlich verringert wie unter hypotonischen Bedingungen, da diese
Parameter wahrscheinlich von der extrazellulren Na+-Konzentration bzw. dem
elektrochemischen Na+-Gradienten bestimmt werden (siehe 3.5).
Die Daten in Abb. 23 zeigen, dass der Austausch von 40 mM NaCl gegen 80 mM
Saccharose die Strom-Spannungs- und Strom-Eingangswiderstandsbeziehungen
kaum beeinflusst. Tendenziell waren die strominduzierten Em-Verschiebungen
und entsprechend Rin sogar vergrert und nicht wie in hypotonischer Lsung
deutlich vermindert (vgl. Abb. 16 und 22).
Der Ersatz des extrazellulren NaCl durch Saccharose lste eine hnliche
Membranhyperpolarisation aus wie die Verminderung der extrazellulren
Osmolalitt (-40 mM NaCl / +80 mM Saccharose: -4,6 3,0 mV, n = 9; -40 mM
NaCl: -5,1 5,3 mV, n = 56). Um sicherzustellen, dass diese Membranhyperpolarisation auf der Schwchung des Na+-Gradienten beruht, wurden Experimente
durchgefhrt, bei denen in der Badlsung Na+ bzw. Cl- durch NMDG+ bzw.
Gluconat ersetzt wurden (Tabelle 5). Die Daten zeigen, dass der Ersatz von NaCl
durch Saccharose oder NMDG-Gluconat zu einer hnlichen Membranhyperpolarisation fhrte wie die hypotonische Lsung. Dagegen war die
Membranhyperpolarisation nach einem partiellen Austausch von Cl- gegen
Gluconat vergleichsweise gering und blieb nach dem vlligen Austausch ganz
aus. Diese Befunde sprechen sehr dafr, dass die Membranhyperpolarisation nach
Verminderung der extrazellulren NaCl-Konzentration durch die Schwchung des
elektrochemischen Na+-Gradienten bedingt ist.
Die Beobachtung, dass beim isotonischen Austausch von 40 mM Na+, Cl- oder
NaCl Rin unverndert blieb, lsst den Schluss zu, dass die Rin-Abnahme in
44
Ergebnisse
hypotonischer Lsung tatschlich auf der verringerten Osmolalitt und damit der
Zellschwellung beruht. In Na+-freier Lsung war zwar eine Rin-Abnahme zu
beobachten, die jedoch deutlich kleiner als die in hypotonischer Lsung ausfiel.
Tabelle 5: Einfluss des extrazellulren Na+ bzw. Cl- auf Em und Rin
Lsung
Em (mV) zu NSL
-40 mM NaCl
-40 mM NaCl
+80 mM Saccharose
-40 mM NaCl
+40 mM NMDG-Gluc
-40 mM Na+
+40 mM NMDG+
-89 mM Na+
+89 mM NMDG+
45
Ergebnisse
3.8
3.9
Das Cytoskelett ist eine filamentse Struktur innerhalb der Zelle, die von F-Aktin,
Mikrotubuli und intermediren Filamenten gebildet wird. Eine wesentliche
Funktion des Cytoskeletts ist es, extrazellulre Reize mechanisch an das
Zellinnere weiterzuleiten (Janmey 1998). Auch schwellungsaktivierte Ionenkanle
werden hufig ber das Cytoskelett aktiviert. Schwellungsaktivierte Cl--Kanle,
u. a. die als VSOR bezeichneten Cl--Kanle (volume sensing outwardly
rectifying, Okada 1997), werden sowohl mit F-Aktin als auch mit Mikrotubuli in
Verbindung gebracht (siehe Frst et al. 2002).
Colchizin, ein Alkaloid der Herbstzeitlosen (Colchicum autumnale), depolymerisiert die Mikrotubuli und verhindert dadurch bei vielen Prparaten die ffnung
von schwellungsaktivierten Cl--Kanlen und folglich auch eine RVD (Downey et
al. 1995, Shen et al. 1999; siehe Frst et al. 2002). In Abb. 27 A sind
46
Ergebnisse
Registrierbeispiele gezeigt, anhand derer die Wirkung von Colchizin auf die durch
Verminderung
der
extrazellulren
Osmolalitt
verursachte
Rin-Abnahme
47
Ergebnisse
3.10.1 Einfluss von K+-Kanalblockern auf die nderungen von Em und Rin unter
hypotonischen Bedingungen
Im Zusammenhang mit der elektroneutralen KCl-Abgabe bei einer RVD wurde
auch eine Beteiligung schwellungsaktivierter K+-Kanle (KVol) beschrieben
(Barrire et al. 2003). Der fr KVol-Kanle selektive Blocker Clofiliumtosylat
(CT, 1 M, siehe 2.5 und Abb. 8) hatte jedoch bei Retzius-Neuronen keinen
Einfluss auf die Rin-Abnahme unter hypotonischen Bedingungen, unabhngig
davon, ob Rin durch positive oder negative Strominjektionen bestimmt wurde
(Tabelle 6). Die durch hypotonische Bedingungen hervorgerufene Membranhyperpolarisation war in Gegenwart von CT deutlich verstrkt.
In Gegenwart von TEA+, einem Blocker fr IK-Kanle (siehe 2.5 und Abb. 8),
lsten depolarisierende Strompulse nach einiger Zeit groe Spannungsspitzen aus
(nicht gezeigt), die vermutlich auf eine durch die Blockierung der IK-Kanle
bedingte, stark verlangsamte Repolarisation eines einzelnen Aktionspotentials
zurckzufhren sind. TEA+ hatte jedoch keinen Einfluss auf die durch
Verminderung der extrazellulren Osmolalitt hervorgerufene Rin-Abnahme und
Membranhyperpolarisation (Tabelle 6).
berraschenderweise fhrte die Applikation von 3 mM 4-AP, einem Blocker fr
IA-Kanle, zu einer Abnahme des Rin (nicht gezeigt), so dass es unmglich war,
die Wirkung dieser Substanz auf IVC zu untersuchen. Eine 4-AP-induzierte
Rin-Abnahme, deren Ursache mglicherweise die Aktivierung eines Na+- oder
Ca2+-Einstroms war, wurde bereits bei Gliazellen beschrieben (Mller 1996).
Die Befunde sprechen gegen eine Aktivierung von K+-Kanlen bei Verminderung
der extrazellulren Osmolalitt. Ein elektroneutraler KCl-Ausstrom kann jedoch
durch K+-Kanle erfolgen, die bereits unter Ruhebedingungen aktiv sind.
48
Ergebnisse
Tabelle 6: Einfluss der K+-Kanalblocker TEA+ und Clofiliumtosylat auf die durch
Verminderung der extrazellulren Osmolalitt (-40 mM NaCl) hervorgerufenen
nderungen von Em und Rin
Lsung
Em (mV)
Rin (%)
Kontrolle
+20 mM TEA+
+1 M CT
Mittelwerte S.D. aus n = 4 bis 56 Messungen. Die Kontrollwerte wurden aus Tabelle 5
bernommen.
49
Ergebnisse
50
Ergebnisse
Em (mV) in
-40 mM NaCl
Rin (%) in
-40 mM NaCl
-40 mM NaCl
Cl--frei
-40 mM Na-Gluc.
-40 mM NaCl
+50 M NFA
-40 mM NaCl
+50 M NPPB
3.10.4 Einfluss Cl--freier Bedingungen und des Cl--Kanalblockers DIDS auf die
Strom-Eingangswiderstandsbeziehung und IVC
Der Einfluss Cl--freier Bedingungen und des Cl--Kanalblockers DIDS wurde in
current-clamp- und voltage-clamp-Messungen mit der in Abschnitt 3.5 und 3.6
beschriebenen Vorgehensweise nher untersucht. In Abb. 33 wurden die unter
Kontrollbedingungen durch Verminderung der extrazellulren Osmolalitt
hervorgerufenen Rin-Abnahmen (Abb. 17) mit den Abnahmen verglichen, die in
Abwesenheit des extrazellulren Cl- (A) bzw. in Gegenwart des Cl--Kanalblockers
DIDS (B) induziert wurden.
51
Ergebnisse
Die Daten zeigen erneut, dass Rin nach Entzug des extrazellulren Cl- bzw. in
Anwesenheit von DIDS zunimmt und die Rin-Abnahme nach Verminderung der
extrazellulren Osmolalitt stark reduziert ist (Tabelle 7). Es fllt auf, dass unter
Cl--freien Bedingungen die Rin-Abnahme bei Injektionsstrmen negativer als
-5 nA und bei positiven Injektionsstrmen besonders gering war, whrend die
Abnahme bei Injektionsstrmen von -1 bis -4 nA noch verhltnismig deutlich
war. Entsprechendes gilt fr die Rin-nderung in Gegenwart von DIDS. Auch
unter Kontrollbedingungen war die Rin-Abnahme bei kleinen negativen
Injektionsstrmen strker als bei groen Injektionsstrmen.
In Abb. 34 ist die Wirkung von Cl--freien Bedingungen und von DIDS auf IVC
gezeigt. Der bereits in Abb. 20 gezeigte IVC war in Gegenwart von DIDS und
unter Cl--freien Bedingungen deutlich vermindert (Abb. 34 A, B). Der
verbleibende Strom ist vermutlich auf unzureichende Blockierung der Cl--Kanle
durch DIDS bzw. auf eine Leitfhigkeit der Cl--Kanle fr andere Anionen
zurckzufhren. Die Tatsache, dass das Umkehrpotential der verbleibenden
Strme unverndert in der Nhe von ECl liegt (Abb. 34 C), spricht fr die
Vermutung, dass bei Verminderung der extrazellulren Osmolalitt ausschlielich
Cl--Kanle aktiviert werden. Der hier als IVC bezeichnete Strom weist hnliche
Eigenschaften auf wie ein als ICl,swell bzw. VSOR-Cl--Kanal bei zahlreichen
Prparaten beschriebener Strom (siehe Frst et al. 2002, Okada 1997). Gegen eine
Verwandtschaft mit VSOR-Cl--Kanlen spricht allerdings, dass sich IVC bei
Retzius-Neuronen nicht durch NPPB hemmen lie. Da die Aktivierung des Cl-Stroms nur mit geringen nderungen von Em einhergeht (Abb. 12), ist zu
erwarten, dass es zu einer gemeinsamen Bewegung von K+- und Cl--Ionen kommt,
wobei der K+-Transport ber tonisch aktive K+-Kanle erfolgt.
52
Ergebnisse
53
Ergebnisse
Unter Na+-freien Bedingungen war die Rin-Abnahme signifikant grer als unter
Kontrollbedingungen. Die K+-Kanalblocker TEA+ und Clofiliumtosylat sowie die
Cl--Kanalblocker NPPB und Nifluminsure beeinflussten die Rin-Abnahme nicht.
54
Diskussion
4
4.1
4.1.1
DISKUSSION
55
Diskussion
[Na+]i
(mM)
ENa
(mV)
[Cl-]a
(mM)
[Cl-]i
(mM)
ECl
(mV)
[K+]i
(mM)
EK
(mV)
NSL
89
9,1 (1)
+58
95
8,0 (1)
-63
78 (2)
-75
+40 mM
NaCl
(Beginn)
129
9,1
+67 (3)
135
8,0
-72 (3)
78
-75
+40 mM
NaCl
(5 min)
129
~12
~+60 (4)
135
~10
~-66 (4)
~101
~-82 (4)
(1)
aus Dierkes et al. 2002: [Na]i = 9,1 3,0 (n = 14), [Cl-]i = 8,0 3,6 (n = 6); (2)aus Dierkes et al.
(3)
Konzentration unmittelbar nach dem Wechsel der Badlsung unverndert war; (4)geschtzt unter
der Annahme, dass die intrazellulren Ionenkonzentrationen nur durch das Volumen verndert
wurden: Volumenabnahme: -23 8 % (n = 9; siehe 3.3).
Die Tatsache, dass die Erhhung der extrazellulren Osmolalitt eine RinZunahme hervorrief (Abb. 13), spricht gegen eine Aktivierung von Ionenkanlen
zur NaCl-Aufnahme. Dies untersttzt Befunde einer frheren Arbeit (Wsten
2004), welche die NaCl-Aufnahme auf die gemeinsame Aktivitt des Na+/H+Austauschers und des Cl-/HCO3--Austauschers zurckfhren. Sollte die RinZunahme tatschlich auf einer Deaktivierung von GABA-Rezeptoren beruhen
(Abb. 11), knnte die Cl--Leitfhigkeit unter Ruhebedingungen auf die Aktivitt
von GABA-Rezeptoren zurckgehen (siehe Abb. 29 und 31). Die vermehrte
Aktionspotential-Auslsung bei der Erhhung der extrazellulren Osmolalitt
beruht vermutlich sowohl auf der Membrandepolarisation als auch auf der
Deaktivierung von GABA-Rezeptoren.
56
Diskussion
4.1.2
57
Diskussion
eines idealen Osmometers auftritt (siehe Wsten 2004). Durch die Zunahme des
Zellvolumens (~57 %) werden die intrazellulren Ionenkonzentrationen abgesenkt, so dass sich erneut die Gleichgewichtspotentiale verschieben (Tabelle 9).
ENa verschiebt sich dabei in positive Richtung und erreicht schlielich einen
gegenber Ruhebedingungen um ~4 mV negativeren Wert. Auch hier ist eine
partielle Em-Repolarisation nach einer anfnglich strkeren Membranhyperpolarisation zu beobachten (Abb. 12). Eine Membranhyperpolarisation von
~5 mV bleibt ber die Applikationsdauer erhalten.
Tabelle 9: Gleichgewichtspotentiale fr Na+ und Cl- in NSL und nach Absenkung
der extrazellulren NaCl-Konzentration
[Na+]a
(mM)
[Na+]i
(mM)
ENa
(mV)
[Cl-]a
(mM)
[Cl-]i
(mM)
ECl
(mV)
[K+]i
(mM)
EK
(mV)
NSL
89
9,1 (1)
+58
95
8,0 (1)
-63
78 (2)
-75
-40 mM
NaCl
(Beginn)
49
9,1
+43 (3)
55
8,0
-49 (3)
78
-75
-40 mM
NaCl
(5 min)
49
~5,8 (4)
~+54
55
~5,1 (4)
~-60
~50
~-64 (4)
(1)
aus Dierkes et al. 2002: [Na]i = 9,1 3,0 (n = 14), [Cl-]i = 8,0 3,6 (n = 6); (2)aus Dierkes et al.
(3)
Konzentration unmittelbar nach dem Wechsel der Badlsung unverndert war; (4)geschtzt unter
der Annahme, dass die intrazellulren Ionenkonzentrationen nur durch das Volumen verndert
wurden: Volumenzunahme: +57 37 % (n = 6; siehe 3.3).
58
Diskussion
beeinflusst (Abb. 35 B). Eine Rin-Abnahme war folglich von der Verminderung
der Osmolalitt abhngig, jedoch unabhngig von der Ionenstrke sowie der
extrazellulren Na+- und Cl--Konzentration. Die Tatsache, dass unter Cl--freien
Versuchsbedingungen bzw. in Gegenwart von DIDS diese Rin-Abnahme stark
vermindert war (Abb. 35 B) zeigt, dass sie durch die Aktivierung von Cl--Kanlen
verursacht wird. Abb. 13 zeigt, dass Rin dann besonders stark absinkt, wenn eine
Osmolalitt von ~60 % von NSL unterschritten wird. Dabei erreicht das
Zellvolumen offenbar eine Schwelle, die eine verstrkte ffnung schwellungsaktivierter Cl--Kanle verursacht. Die Amplitude der Membranhyperpolarisation
wurde mit abnehmender extrazellulrer Osmolalitt immer kleiner (Abb. 13), was
ebenfalls auf die strkere ffnung schwellungsaktivierter Cl--Kanle als Folge
zunehmender Zellschwellung zurckzufhren sein knnte. Diese volumenabhngige Aktivierung spiegelt sich auch in der Tatsache wider, dass die RinAbnahme im Mittel erst ~60 s nach Beginn der Membranhyperpolarisation einsetzte (vgl. Abb. 12 C), also zu einem Zeitpunkt, zu dem bereits eine gewisse
Zellschwellung erfolgt war (Abb. 14).
Die Membranhyperpolarisation von ~5 mV, die ber die Applikationsdauer
hypotonischer Lsung erhalten blieb, ist wahrscheinlich auf die ffnung
schwellungsaktivierter Cl--Kanle zurckzufhren, die letztlich bewirken, dass
sich Em zunehmend ECl annhert. Diese Vermutung wird durch die Beobachtung
gesttzt, dass die Membranhyperpolarisation in Gegenwart von DIDS unterdrckt
war (Abb. 35 A). Die Befunde lassen die Schlussfolgerung zu, dass unmittelbar
nach der Verminderung der Badosmolalitt ENa fr die Membranhyperpolarisation
verantwortlich ist, whrend am Applikationsende schwellungsaktivierte Cl--Kanle potentialbestimmend sind, die auch die Rin-Abnahme bedingen.
Bei Klemmung von Em auf -50 mV trat nach Verminderung der extrazellulren
NaCl-Konzentration zunchst ein schneller Auswrtsstrom auf, der wahrscheinlich die Verminderung des Na+-Einstroms widerspiegelt (Abb. 18). Aufgrund der Zellschwellung und der dadurch bedingten Wiederherstellung des ursprnglichen Na+-Gradienten sollte dieser Strom nach und nach abklingen. Dass
59
Diskussion
der Strom erhalten blieb, lsst sich auf die zunehmende ffnung der
schwellungsaktivierten Cl--Kanle zurckfhren, die eine Erhhung des
Klemmstroms durch zwei Faktoren bewirken. Zum einen wird durch die ffnung
der Kanle fr die Klemmung auf -50 mV zunehmend mehr Strom bentigt, zum
anderen wird ein Teil des Klemmstroms aufgewendet, um den durch die ffnung
schwellungsaktivierter Cl--Kanle verursachten Strom zu kompensieren. Am Ende
der 5-mintigen Applikation ist der schwellungsaktivierte Strom (IVC)
wahrscheinlich ausschliesslich auf schwellungsaktivierte Cl--Kanle zurckzufhren. Dies erklrt den Befund, dass das Umkehrpotential von IVC in der
Nhe von ECl liegt (Abb. 20). Weiterhin wurde gezeigt, dass sich die Aktivierung
von IVC ber mehrere Minuten hinzieht. Dies ist wahrscheinlich darauf
zurckzufhren, dass die Aktivierung ber das Cytoskelett an die Zellschwellung
gekoppelt ist (siehe 4.4). Da unmittelbar nach Verminderung der extrazellulren
Osmolalitt zunchst der verminderte Na+-Einstrom kompensiert wird, war eine
verzgerte Aktivierung von IVC nicht erkennbar. In patch-clamp-Untersuchungen wurde jedoch gezeigt, dass eine schwellungsabhngige Kanalaktivierung erst erkennbar war, nachdem das Zellvolumen um mindestens 10 %
zugenommen hatte (Buchholz 1999).
Da ECl unmittelbar nach Verminderung der NaCl-Konzentration zunchst
positiver ist als Em, sollte es zunchst zu einem Cl--Ausstrom durch tonisch aktive
und spter durch schwellungsaktivierte Cl--Kanle kommen. Dieser Cl--Ausstrom
kommt jedoch nach Wiederherstellung des Na+- und Cl--Gradienten zum Erliegen.
Dies erklrt das Fehlen einer messbaren regulatorischen Volumenabnahme
(Abb. 14 A). Der Cl--Ausstrom, der gemeinsam mit einem K+-Ausstrom erfolgen
sollte, ist offenbar zu gering, um die Zellschwellung zu unterbinden.
Unter der Annahme eines idealen Osmometers sollte die intrazellulre
Cl--Konzentration bei einer Zellschwellung von 67 % auf ~4,8 mM absinken. Bei
der tatschlich auftretenden Zellschwellung von ~57 % sollte die intrazellulre
Cl--Konzentration auf ~5,1 mM absinken, was mit experimentell ermittelten
Werten bereinstimmt (5,2 2,6 mM, n = 6; Dierkes et al. 2002). Wre die
60
Diskussion
61
Diskussion
Verbindung mit der hierbei beobachteten Erhhung der intrazellulren Cl-Konzentration knnte die ffnung schwellungsaktivierter Cl--Kanle und der
resultierende KCl-Ausstrom das Zellvolumen wirksam regulieren.
4.2
bei
Retzius-Neuronen,
wie
beispielsweise
nderungen
der
62
Diskussion
4.3
63
Diskussion
Membranstrom auch bei Em unterhalb der Schwelle zur Aktionspotential-Auslsung in gewissem Mae aktiv ist (Kolb 1990). IA-Kanle waren wahrscheinlich
fr den anfnglich hheren Klemmstrom bei Verstellung von Em auf Werte
positiver -40 mV verantwortlich (Abb. 19) und trugen mglicherweise auch zur
Membranhyperpolarisation nach Abschalten positiver Strme bei. Der verzgerte
K+-Strom (delayed rectifier, IK; Johansen und Kleinhaus 1986, Stewart et al.
1989a) aktiviert erst ab -20 mV und trgt daher nicht zu der in Abb. 17 gezeigten
Rin-Abnahme bei.
Der Ca2+-abhngige K+-Strom (Stewart et al. 1989), der zum Gesamtstrom
erheblich beitragen kann, wird durch einen Anstieg der intrazellulren Ca2+Konzentration aktiviert, wie er beispielsweise bei einem Ca2+-Einstrom durch
spannungsabhngige Ca2+-Kanle auftritt (Merz 1995, Yang und Kleinhaus 1984,
Stewart et al. 1989). Ca2+-abhngige K+-Kanle knnten ebenfalls an der
vorbergehenden Membranhyperpolarisation nach der Injektion positiver Strme
beteiligt sein.
Die
spannungsabhngigen
Ca2+-Kanle
bentigen
zur
Aktivierung
eine
Membrandepolarisation auf -40 bis -30 mV und sind bei fortgesetzter Membrandepolarisation anhaltend aktiv (Dierkes et al. 1997, Hochstrate et al. 1995, Lhrke
und Deitmer 1996, Bookman und Liu 1990, Dierkes et al. 1997, Kleinhaus und
Prichard 1976). Spannungsabhngige Ca2+-Kanle knnten ebenfalls an der RinAbnahme bei positiven Injektionsstrmen beteiligt sein.
4.4
Sowohl die Rin-Abnahme als auch IVC konnten auf die ffnung schwellungsaktivierter Cl--Kanle zurckgefhrt werden. Bei ~-56 mV kehrte IVC die Polaritt um, also in der Nhe des nach 5 min in hypotonischer Lsung bestimmten
ECl (~-60 mV; Tabelle 9; vgl. Munsch und Schlue 1993). Die Strom-Spannungskennlinie war zwischen -70 und -40 mV annhernd linear und flachte im Bereich
negativerer Em-Werte zunehmend ab, d. h. die Zunahme des Cl--Ausstroms wurde
64
Diskussion
immer geringer. Diese Auswrtsgleichrichtung ist fr schwellungsaktivierte Cl-Kanle typisch (Okada 1997).
Die Tatsache, dass Nifluminsure, ein Blocker Ca2+-abhngiger Cl--Kanle, auf
die durch hypotonische Bedingungen hervorgerufene Rin-Abnahme keinen
Einfluss ausbte, lsst die Beteiligung von Ca2+-abhngigen Cl--Kanlen am
schwellungsaktivierten Cl--Strom unwahrscheinlich erscheinen, zumal bei einer
Zellschwellung nur geringe Anstiege der intrazellulren Ca2+-Konzentration im
nanomolaren Bereich beobachtet wurden (Wsten 2004). Die verwendete
Nifluminsure-Konzentration von 50 M sollte zur Blockierung ausreichend sein,
da die halbmaximale Blockierung von Ca2+-aktivierten Cl--Kanlen bei Musen
bereits bei 7,6 M erreicht ist (Qu et al. 2003).
Der Blocker fr schwellungsaktivierte Cl--Kanle, NPPB (siehe Frst et al. 2002,
Barrire et al. 2003, Okada 1997), bte ebenfalls keinen Effekt auf die durch
hypotonische Bedingungen hervorgerufene Rin-Abnahme aus. Auch fr diesen
Blocker wurde fr die hier verwendete Konzentration von 50 M in frheren
Arbeiten eine weitgehende Blockierung von Cl--Kanlen erzielt (Kirkup 1996,
Schmieder et al. 2002, Wehner et al. 2003). Schwellungsaktivierte Cl--Kanle, die
von NPPB nicht gehemmt werden, wurden bisher nicht beschrieben.
In Cl--freier Lsung war IVC nur um ~60 % reduziert. Da zum Zeitpunkt der
Messung wegen der Cl--Ruheleitfhigkeit und der Abwesenheit extrazellulren Clwahrscheinlich kein intrazellulres Cl- mehr vorhanden ist, kann der verbleibende
Strom nur durch andere Anionenstrme durch die Cl--Kanle verursacht worden
sein. Schwellungsaktivierte Cl--Kanle sind fr zahlreiche Ionensorten permeabel,
u. a. auch Anionen aus Glykolyse und Citratzyklus, so dass sie auch als unselektive Anionenkanle bezeichnet werden. Die Permeabilittssequenz wurde zu SCN> I- > Br- > Cl- > F- > Gluconat- bestimmt (siehe Frst et al. 2002). Die hemmende
Wirkung von DIDS beruht darauf, dass die beiden Thiocyanat-Gruppen des
Blockers (Abb. 8) mit der Kanalpore starke Wechselwirkungen eingehen, so dass
Cl- verdrngt wird. DIDS kann jedoch wegen seiner voluminsen Phenylgruppen
65
Diskussion
den Kanal nicht permeieren. Der Cl--Kanalblocker DIDS (0,5 mM) hemmte IVC
zu ~75 % (Abb. 34).
Nach 60-mintiger Inkubation in 25 M Colchizin war IVC deutlich reduziert
(Abb. 28). Das Umkehrpotential war in negative Richtung verschoben,
mglicherweise durch eine starke Erniedrigung der intrazellulren Cl-Konzentration infolge einer verstrkten Zellschwellung bedingt (Wsten 2004).
Dieser Befund spricht fr eine Beteiligung der Mikrotubuli an der Aktivierung
schwellungsaktivierter Cl--Kanle.
Die zeitliche Verzgerung zwischen Membranhyperpolarisation und Rin-Abnahme
nach Verminderung der extrazellulren Osmolalitt deutet darauf hin, dass
zwischen diesen Ereignissen kein Zusammenhang besteht. Sie gibt jedoch
Aufschluss ber den Zeitraum der Aktivierung der schwellungsaktivierten Cl-Kanle. Die Rin-Abnahme und damit die Aktivierung setzte im Mittel ~60 s nach
dem Lsungswechsel ein. Der Zeitpunkt war stark variabel ( 40 s). Unklar bleibt,
ob dabei die Zellschwellung unterschiedlich schnell verlief oder ein jeweils
unterschiedlicher volume-set-point verantwortlich war.
Der untersuchte Potentialbereich gab keinen Aufschluss ber eine mgliche
spannungsabhngige Inaktivierung von IVC. Bei verschiedenen Prparaten wurde
bei Em > +40 mV eine Inaktivierung von schwellungsaktivierten Cl--Kanlen
beobachtet, die ATP-abhngig war und durch hohe intrazellulre Mg2+Konzentrationen verstrkt wurde (Okada 1997). Die physiologische Bedeutung
dieser Inaktivierung ist unklar, da Em unter physiologischen Bedingungen keine
positiven Werte dieser Grenordnung erreicht.
Bei vielen Prparaten wurden Cl--Kanle mit Einzelkanalleitfhigkeiten von 0,2
bis 2 pS (mini ClC) bis ber 100 pS (maxi ClC) mit einer RVD in
Verbindung gebracht. In der Mehrzahl betrugen die Einzelkanalleitfhigkeiten
~50 pS und variierten mit den Versuchsbedingungen (Frst et al. 2002). Mit Hilfe
der patch-clamp-Technik wurden beim Blutegel vier verschiedene Cl--Kanle mit
66
Diskussion
4.5
67
Diskussion
~8 mM (siehe Dierkes et al. 2002) begrenzt. Beides knnte die geringe Wirkung
der Volumenregulation und das Fehlen einer regulatorischen Volumenabnahme
erklren.
68
Zusammenfassung
ZUSAMMENFASSUNG
1.
In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe der current-clamp- und der
voltage-clamp-Technik untersucht, ob nderungen der Osmolalitt und der
ionalen Zusammensetzung des Extrazellulrraums Membranpotential (Em),
Eingangswiderstand (Rin) und Membrankapazitt (Cin) von Retzius-Neuronen
des medizinischen Blutegels beeinflussen. Darber hinaus wurden nderungen des Zellvolumens bei unterschiedlichem Em bestimmt, um die
Spannungsabhngigkeit von Zellvolumennderungen zu erfassen. Hierzu
wurde die Technik ionensensitiver Glasmikroelektroden mit der voltageclamp-Technik kombiniert. Schlielich wurde ein Membranstrom, der durch
Zellschwellung aktiviert wird, funktionell und pharmakologisch charakterisiert. Die Vernderung der extrazellulren Osmolalitt wurde entweder
durch Erhhung der extrazellulren NaCl-Konzentration vorgenommen
(hypertonische Bedingungen) oder durch deren Absenkung (hypotonische
Bedingungen).
2.
3.
Der Neurotransmitter -Aminobuttersure (GABA; 0,5 mM) lste eine RinAbnahme aus (-26 9 %, n = 6), die unter hypertonischen Bedingungen
signifikant vergrert war (-52 15 %, n = 6). Rin-nderungen, die durch
Applikation des cholinergen Agonisten Carbachol (Carbamylcholinchlorid;
0,5 mM) oder des glutamatergen Antagonisten DNQX (6,7-Dinitroquinoxalin-2,3(1H,4H)-dion; 20 M) induziert wurden, waren unter hypertonischen
Bedingungen nicht signifikant beeinflusst.
69
Zusammenfassung
4.
5.
In der Spannungsklemme fhrten hypotonische Bedingungen (nach Absenkung der extrazellulren NaCl-Konzentration um 40 mM) bei Em =
-40 mV zu einer Zellschwellung von 33 16 % (n = 5), die nur halb so gro
war, wie bei Em = -70 mV (66 58 %, n = 4). Dagegen war die Zellschrumpfung unter hypertonischen Bedingungen (nach Erhhung der extrazellulren NaCl-Konzentration um 40 mM) im untersuchten Em-Bereich (-40
bis -70 mV) spannungsunabhngig und betrug im Mittel -23 8 % (n = 9).
6.
Hypotonische Bedingungen (nach Absenkung der extrazellulren NaClKonzentration um 40 mM) bewirkten eine Verkrzung der Membranzeitkonstante () von 37 15 ms auf 19 7 ms (n = 60). Dabei nahm Cin von
2,8 0,8 auf 3,2 1,8 nF (n = 60) zu.
7.
Versuchslsungen mit isotonischem Ersatz von 40 mM NaCl durch NMDGGluconat oder Saccharose fhrten zu einer vergleichbaren Membranhyperpolarisation wie Versuchslsungen ohne osmotische Kompensation, bten
jedoch keinen Einfluss auf Rin aus. Nach vollstndigem Austausch von Na+
durch NMDG+ (89 mM) war die Amplitude der Membranhyperpolarisation
verdoppelt (-9,6 3,2 mV, n = 8), whrend der vollstndige Austausch von
Cl- durch Gluconat keinen Einfluss auf Em ausbte.
70
Zusammenfassung
8.
9.
71
Literatur
72
Literatur
LITERATUR
Altamirano, J., Brodwick, M.S., Alvarez-Leefmans, F.J. (1998): Regulatory
volume decrease and intracellular Ca2+ in murine neuroblastoma cells studied with
fluorescent probes. J. Gen. Physiol. 112, 145-160
Ammann, D. (1986): Ion-Selective Microelectrodes. Springer Verlag, Berlin
Angstadt, J.D. (1999): Persistent inward currents in cultured Retzius cells of the
medicinal leech. J. Comp. Physiol. A 184, 49-61
Arieff, A.I., Carroll, H.J. (1972): Nonketotic hyperosmolar coma with
hyperglycemia: clinical features, pathophysiology, renal function, acid-base
balance, plasma cerebrospinal fluid equilibria and the effects of therapy in 37
cases. Medicine 51, 73-94
Ayrapetyan, S.N., Suleymanyan, M.A. (1979): On the pump-induced cell volume
changes. Comp. Biochem. Physiol. A 64, 571-575
Bailey, N.T. (1992): Statistical Methods in Biology. 2nd Edition, Cambridge
University Press
Ballanyi, K., Schlue, W.-R. (1989): Electrophysiological characterization of a
nicotinic acetylcholine receptor on leech neuropile glial cells. Glia 2, 330-345
Ballanyi, K., Grafe, P., Serve, G., Schlue, W.-R. (1990): Electrophysiological
measurements of volume changes in leech neuropile glial cells. Glia 3, 151-158
Barrire, H., Rubera, I., Belfodil, R., Tauc, M., Tonnerieux, N., Poujeol, C.,
Barhanin, J., Poujeol, P. (2003): Swelling-activated chloride and potassium
conductance in primary cultures of mouse proximal tubules. Implication of
KCNE1 protein. J. Membr. Biol. 193, 153-170.
73
Literatur
74
Literatur
Coggeshall, R.E., Fawcett, D.W. (1964): The fine structure of the central nervous
system of the leech, Hirudo medicinalis. J. Neurophysiol. 27, 229-289
Coulon, P. (2001): Einfluss extrazellulrer Ionen auf das Volumen und die
elektrophysiologischen
Eigenschaften
identifizierter
Blutegel-Neuronen.
75
Literatur
Dierkes, P.W. (1998): Mikrofluorimetrische und elektrophysiologische Untersuchungen des Ca2+-Einstroms durch Ca2+-Kanle und Neurotransmitter-Rezeptoren in Neuronen und Gliazellen im Zentralnervensystem des medizinischen
Blutegels. Inaugural-Dissertation, Heinrich-Heine-Universitt Dsseldorf
Dierkes, P.W., Mller, A., Schlue, W.-R. (1999): Ouabain-induced swelling of
leech Retzius neurones. In: Elsner N., Eysel, U. (Eds.) Proceedings of the 27th
Gttingen Neurobiology Conference 1999, Vol. II, Georg Thieme Verlag
Stuttgart, S. 842
Dierkes, P.W., Coulon, P., Neumann, S., Schlue, W.-R. (2002): Potentiometric
measurement of cell volume changes and intracellular ion concentrations under
voltage-clamp conditions in invertebrate nerve cells. Anal. Bioanal. Chem.
373, 762-766
Dierkes, P.W., Neumann, S., Klees, G., Schlue, W.-R. (2003): Multi-barrelled
ion-selective microelectrodes as tools for the investigation of volume regulation
mechanisms in invertebrate nerve cells under hyperosmotic conditions.
Electrochim. Acta 48, 3373-3380
Dietzel, I., Heinemann, U., Lux, H.D. (1989): Relations between slow
extracellular potential changes, glial potassium buffering, and electrolyte and
cellular volume changes during neuronal hyperactivity in cat brain. Glia 2, 25-44
Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M.A. (1999): Pathobiology of ischaemic
stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 22, 391-397
Drner, R., Ballanyi, K., Schlue, W.-R. (1990): Glutaminergic responses of
neuropile glial cells and Retzius neurones in the leech central nervous system.
Brain Res. 523, 111-116
76
Literatur
Downey, G.P., Grinstein, S., Sue-A-Quan, A., Czaban, B., Chan, C.K. (1995):
Volume regulation in leukocytes: requirement for an intact cytoskeleton. J. Cell
Physiol. 163, 96-104
Ege, S., Harvey, B.J., Thomas, S. (1997): Volume-activated DIDS-sensitive
whole-cell chloride currents in trout red blood cells. J. Physiol. (Lond.) 504, 57-63
Eisenman, G. (1962): Cation selective glass electrodes and their mode of
operation. Biophys. J. 2, Pt. 2, 259-323
Eveloff, J.L., Warnock, D.G. (1987): Activation of ion transport systems during
cell volume regulation. Am. J. Physiol. 252, F1-F10
Frst, J., Gschwentner, M., Ritter, M., Bott, G., Jakab, M., Mayer, M.,
Garavaglia, L., Bazzini, C., Rodighiero, S., Meyer, G., Eichmller, S., Wll, E.,
Paulmichl, M. (2002): Molecular and functional aspects of anionic channels
activated during regulatory volume decrease in mammalian cells. Eur. J.
Physiol. 444, 1-25
Gerard, E., Hochstrate, P., Schlue, W.-R. (2001): Funtional properties of Ih
channels in leech P neurones. In: Elsner, N., Kreutzberg, G.W. (Eds.):
Proceedings of the 4th meeting of the german neuroscience society 2001; Vol. II,
28th Gttingen Neurobiology Conference Georg Thieme Verlag Stuttgart, p. 814
Gerard, E. (2003): Elektrophysiologische Eigenschaften und Modulation hyperpolarisations-aktivierter Kationenkanle im Zentralnervensystem des medizinischen Blutegels. Inaugural-Dissertation, Heinrich-Heine-Universitt Dsseldorf
Gnzel, D., Schlue, W.-R. (1996): Sodium-magnesium antiport in Retzius
neurones of the leech Hirudo medicinalis. J. Physiol. (Lond.) 491, 595-608
77
Literatur
Hussinger, D., Lang, F., Bauers, K., Gerok, W. (1990): Interaction between
glutamine metabolism and cell-volume regulation in perfused rat liver. Eur. J.
Biochem. 188, 689-695
Hussinger, D. (1996): The role of cellular hydration in the regulation of cell
function. Biochem. J. 313, 697-710
Hallows, K.R., Knauf, P.A. (1994): Principles of cell volume regulation. In:
Strange, K. (Ed.): Cellular and Molecular Physiology of Cell Volume Regulation,
Boca Raton, FL, CRC Press, 3-29
Hille, B. (Ed.; 2001): Ionic Channels of Excitable Membranes (3rd Edition).
Sinauer Associates, Sunderland, MA
Hochstrate, P., Piel, C., Schlue, W.-R. (1995): Effect of extracellular K+ on the
intracellular free Ca2+ concentration in leech glial cells and Retzius neurones.
Brain Res. 696, 231-241
Idriss, H.T., Hannun, Y.A., Boulpaep, E., Basavappa, S. (2000): Regulation of
volume-activated chloride channels by P-glycoprotein: phosphorylation has the
final say! J. Physiol. (Lond.) 524, 629-36
Janmey, P.A. (1998): The cytoskeleton and cell signaling: component localization
and mechanical coupling. Physiol. Rev. 78, 763-781
Johansen, J., Kleinhaus, A.L. (1986): Transient and delayed potassium currents in
the Retzius cell of the leech Macrobdella decora. J. Neurophysiol. 56, 812-822
Johansen, J., Kleinhaus, A.L. (1987): Saxitoxin differentiates between two types
of Na+-dependent potentials in the Retzius cell of hirudinid leeches. J. Exp.
Biol. 131, 351-363
78
Literatur
Neuronen
und
Gliazellen
im
Zentralnervensystem
des
79
Literatur
Lhrke, S., Deitmer, J.W. (1996): Kainate responses of leech Retzius neurons in
situ and in vitro. J. Neurobiol. 31, 345-358
Lucht, M. (1997): Elektrophysiologische und pharmakologische Charakterisierung von 5-Hydroxytryptamin-Rezeptoren und second-messenger-Kaskaden
bei identifizierten Neuronen des Blutegel-Nervensystems. Inaugural-Dissertation,
Heinrich-Heine-Universitt Dsseldorf
McManus, M.L., Churchwell, K.B. (1994): Clinical significance of cellular
osmoregulation. In: Strange, K. (Ed.): Cellular and Molecular Physiology of Cell
Volume Regulation, CRC Press, 63-77
Merz, D.C. (1995): Segmental specialization of calcium-activated potassium
conductances in an identified leech neuron. J. Neurophysiol. 73, 957-963
Mller, M. (1996): Elektrophysiologische Eigenschaften und Regulation von K+und Cl--Kanlen der Neuropil-Gliazellen in den Segmentalganglien des
medizinischen Blutegels, Hirudo medicinalis. Inaugural-Dissertation, HeinrichHeine-Universitt Dsseldorf
Mller, M., Somjen, G.G. (2000): Na+ and K+ concentrations, extra- and
intracellular voltages, and the effect of TTX in hypoxic rat hippocampal slices.
J. Neurophysiol. 83, 735-745
Muller, K.J., Nicholls, J.G., Stent, G.S. (1981): Neurobiology of the Leech. Cold
Spring Harbor Laboratory, New York
Munsch, T. (1991): Elektrophysiologische Untersuchungen zur Wirkung von
5-Hydroxytryptamin an Neuronen im Zentralnervensystem des medizinischen
Blutegels. Inaugural-Dissertation, Heinrich-Heine-Universitt Dsseldorf
80
Literatur
Munsch, T., Deitmer, J.W. (1992): Calcium transients in identified leech glial
cells in situ evoked by high potassium concentrations and 5-hydroxytryptamine.
J. Exp. Biol. 167, 251-265
Munsch, T., Schlue, W.-R. (1993): Intracellular chloride activity and the effect of
5-hydroxytryptamine on the chloride conductance of leech Retzius neurons.
Eur. J. Neurosci. 5, 1551-1557
Murata, K., Mitsuoka, K., Hirai, T., Walz, T., Agre, P., Heymann, J.B., Engel, A.,
Fujiyoshi, Y. (2000): Structural determinants of water permeation through
aquaporin-1. Nature 407, 599-605
Nagasaki, M., Ye, L., Duan, D., Horowitz, B., Hume, J.R. (2000): Intracellular
cyclic AMP inhibits native and recombinant volume-regulated chloride channels
from mammalian heart. J. Physiol. (Lond.) 523, 705-717
Neher, E., Lux, H.D. (1973): Rapid changes of potassium concentration at the
outer surface of exposed single neurons during membrane current flow. J. Gen.
Physiol. 61, 385-399
Neumann, S. (2000): Potentiometrische Messungen zur Volumenregulation im
Zentralnervensystem des medizinischen Blutegels. Diplomarbeit, Heinrich-HeineUniversitt Dsseldorf
Neumann, S., Dierkes, P.W., Schlue, W.-R. (2001): Potentiometric measurement
of cell volume changes and intracellular ion concentrations in leech Retzius
neurones. Electrochim. Acta 47, 309-317
Nichol, J.A., Hutter, O.F. (1996): Tensile strength and dilatational elasticity of
giant sarcolemmal vesicles shed from rabbit muscle. J. Physiol. (Lond.) 493,
187-198
81
Literatur
82
Literatur
83
Literatur
84
Literatur
N.S.
(2003):
Elektrophysiologische
und
mikrofluorimetrische
85
Literatur
Wehner, F., Olsen, H., Tinel, H., Kinne-Saffran, E., Kinne, R.K. (2003): Cell
volume regulation: osmolytes, osmolyte transport, and signal transduction. Rev.
Physiol. Biochem. Pharmacol. 148, 1-80
Weiss, J.L., Yang, J., Jie, C., Walker, D.L., Ahmed, S., Zhu, Y., Huang, Y.,
Johansen, K.M., Johansen, J. (1999): Molecular cloning and characterization of
LKv1, a novel voltage-gated potassium channel in leech. J. Neurobiol. 38,
287-299
Willard, A.L. (1981): Effects of serotonin on the generation of the motor program
for swimming by the medicinal leech. J. Neurosci. 1, 936-944
Wilson, T.H. (1954): Ionic permeability and osmotic swelling of cells. Science
120, 104-105
Wsten, H.J. (2000): Mikrofluorimetrische und elektrophysiologische Untersuchungen von Volumennderungen bei identifizierten Neuronen des BlutegelZentralnervensystems. Diplomarbeit, Heinrich-Heine-Universitt Dsseldorf
Wsten, H.J. (2004): Zellvolumen-Regulation und nderungen intrazellulrer
Ionenkonzentrationen in Retzius- und P-Neuronen des medizinischen Blutegels.
Inaugural-Dissertation, Heinrich-Heine-Universitt Dsseldorf
Yang, J., Kleinhaus, A.L. (1984): Effects of tetraethylammonium-chloride and
divalent cations on the afterhyperpolarization following repetitive firing in leech
neurons. Brain Res. 311, 380-384
86
Abbildungen
ABBILDUNGEN
87
1 cm
Geschlechtsganglien
Analganglion
Oberschlundganglion
Unterschlundganglion
Segmentalganglien 1- 21
1 cm
Analganglion
Hinterdarm
Hoden
Harnblase
Ductus ejaculatorius
Prostata
Ober- und
Unterschlundganglion
20
11
10
21
18
19
1
2
0.5 cm
Blutsinus
Seitenwurzeln
Konnektiv
0.1 mm
0.5 mm
Nach Durchtrennung der Kutikula und der Darmwnde von dorsal liegt das ventral gelegene ZNS frei (A). Das Oberschlundganglion liegt dorsal ber
dem vorderen Teil des Pharynx, das Unterschlundganglion ventral darunter. Beide sind ber die Schlundkonnektive miteinander verbunden. Die Zahlen
in den Ausschnittsvergrerungen bezeichnen die jeweiligen Segmentalganglien. Im Bereich der Geschlechtsganglien (5 und 6) sind die Organe des
Geschlechtsapparates lokalisiert. Insgesamt siebzehn Paare Nephridien mit Harnblasen und neun Paare Hoden ziehen sich vom Bereich der
Geschlechtsganglien bis zu den hinteren Segmentalganglien. Im Bereich des Analganglions ist der glatte Enddarm zu sehen. Die Segmentalganglien
sind miteinander ber paarige Konnektive und den dnnen Faivre-Nerv verbunden und in den ventralen Blutsinus eingebettet (B). Die Seitenwurzeln
fhren zu den Organen des jeweiligen Segmentes. Die Aufnahme eines isolierten Segmentalganglions im Durchlicht-Mikroskop ist in C gezeigt: In der
oberen linken und der unteren rechten Bildecke sind die Seitenwurzeln zu erkennen. Die Pfeile markieren die serotonergen Retzius-Neuronen, die hier
zur Verdeutlichung mit Neutralrot angefrbt wurden.
Eion+Eref
Lsungszulauf
Lsungsabsauger
Ionensensitive
Glasmikroelektrode
Eref
Eion
Eref
Erdung ber
Agarbrcke
-20
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
-20
20
10
1 000
2,5
2 000
80
0,5
3 000
4 000
[K+] (mM)
[TMA+] (mM)
5 000
B) Registrierbeispiel einer Eichung: Der ionensensitive Kanal war mit dem K+-Ionophor Corning 477317 gefllt, der auch fr TMA+ sensitiv ist, das
hier als Volumenmarker verwendet wurde. Eion nahm mit der TMA+-Konzentration der Eichlsungen zu. In den Eichlsungen war die K+Konzentration von 4 auf 80 mM erhht, um die intrazellulren ionalen Verhltnisse zu simulieren. In Gegenwart von TMA+ ist die K+-Sensitivitt
des Sensors unterdckt (Neumann et al. 2001).
A) Versuchsaufbau (schematisch): Die beiden Kanle der Glasmikroelektrode waren ber chlorierte Silberdrhte mit den Eingngen des Verstrkers
verbunden. Der ionensensitive Kanal registrierte die Summe aus Ionenpotential (Eion) und Referenzpotential (Eref), der Referenzkanal nur Eref. Durch
Subtraktion des Referenzpotentials vom Summenpotential mittels eines Differenzverstrkers wurde Eion ermittelt. Als ionenselektive
Glasmikroelektroden wurden Zweikanal-Elektroden des gedrehten Typs verwendet.
A
Eref (mV)
Eion (mV)
250
200
Eion (mV)
150
100
50
0
0
-log [TMA+]
Abb. 4
Die ermittelten Eion (Mittelwerte S.D., n = 51) wurden gegen den negativen
dekadischen Logarithmus der TMA+-Konzentration der Eichlsung aufgetragen. Die
durchgezogene Kurve wurde mittels der Nikolsky-Eisenman-Gleichung berechnet. Der
Schnittpunkt der beiden Asymptoten (gestrichelte Linien), die sich aus der Steigung der
Eichkurve im TMA+-sensitiven Bereich und dem in TMA+-freier Lsung ermittelten
Mewert ergeben, entspricht dem Detektionslimit der Elektroden (Pfeil). Im Mittel
betrug die Steigung -74 22 mV und das Detektionslimit 0,45 0,31 mM.
Potentialelektrode
Erdung ber
Agarbrcke
Injektionselektrode
Stimulation
Em
Eh
Em
Injektionselektrode
Ionensensitive
Glasmikroelektrode
Eh
Em
Injektionselektrode
IVC
Eion+Em
A) Current-clamp-Technik: ber die Stromelektrode wurde ein definierter Injektionsstrom appliziert und die dadurch hervorgerufene nderung des
Membranpotentials (Em) ber die Potentialelektrode registriert.
B) Voltage-clamp-Technik: Das von der Potentialelektrode registrierte Em wurde auf den invertierenden Eingang des Klemmverstrkers gelegt, der
proportional zur Differenz zwischen Em und dem eingestellten Haltepotential (Eh) Strom in die Zelle injizierte und dadurch Em auf Eh klemmte.
C) Kombination der Technik ionensensitiver Glasmikroelektroden mit der voltage-clamp-Technik: Der ionensensitive Kanal registrierte die Summe aus
Ionenpotential und Em, der Referenzkanal nur Em. Das registrierte Em wurde auf den invertierenden Eingang des voltage-clamp-Verstrkers gelegt,
der wiederum durch Strominjektion Em auf das vorgegebene Eh klemmte.
Abb. 5
Lsungszulauf
Lsungsabsauger
Potentialelektrode
5 mM TMA+
5 min
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
(5)
-40
(5)
-50
(14)
(17)
(6)
-60
(6)
Em (mV)
Aufnahme und Abgabe des Volumenmarkers TMA+ bei unterschiedlichen Membranpotentialen (Em)
-80
-60
-40
-4
-2
10
-70
(10)
(13)
Alle
(35)
(41)
Aufnahme
Abgabe
B) Zusammenfassung der Messergebnisse. Die TMA+-Aufnahmerate war unabhngig von Em, whrend die Abgaberate mit negativer werdendem Em um den
Faktor 2,6 anstieg (-40 mV vs. -70 mV: p = 0.06). Die Aufnahmerate war etwa um den Faktor drei grer als die Abgaberate. Mittelwerte S.D. aus n = 5
bis 41 Messungen.
A) Registrierbeispiel der TMA+-Aufnahme durch ein Retzius-Neuron. Die Applikation von 5 mM TMA+ bewirkte einen Anstieg der intrazellulren TMA+Konzentration sowie einen transienten Einwrtsstrom (Pfeil). Die Messung erfolgte mit einer Corning 477317-gefllten Zweikanal-Glasmikroelektrode
(siehe Abb. 3 und 4) unter Klemmung von Em auf -60 mV (siehe Abb. 5 C). Nach dem Ende der TMA+-Applikation wurde das intrazellulr akkumulierte
TMA+ wieder abgegeben. Die Aufnahme- und Abgaberaten wurden aus den Steigungen der jeweiligen Kurvenabschnitte ermittelt (gestrichelte Linien).
Der transiente Einwrtstrom ist auf die Aktivierung von Acetylcholin-Rezeptoren durch TMA+ zurckzufhren (Neumann et al. 2001).
Abb. 6
Em (mV)
IVC (nA)
[TMA+] (mM)
A
TMA+-Aufnahme-/Abgaberate (mM/min)
MAX-21
Digidata
1322A
Schalter:
siehe B
CEL
Mode
Select
LED mV
LED nA
4 ml/min
Current
Headstage
PIon
Potential
Headstage
PEL
Digidata 1322A:
Analog Out 2
(V fr voltage-clamp)
Max 21:
Ch 2
(I fr current-clamp)
Stromelektrode
RCel= 56 M
Rm= 10 M
RPel= 56 M
Potentialelektrode
Cm= 100 pF
Max 21:
Ch 1
(V fr voltage-clamp)
TEC 05L
(current stimulus input)
Digidata 1322A:
"Analog Out 1"
(I fr current-clamp)
TEC-05L
(voltage command input)
Zur Erfassung der elektrischen Signale wurde ein Zwei-Elektroden voltage-clamp-Verstrker (modifizierter TEC-05L, NPI Electronics) sowie ein
Verstrker fr die ionensensitive Glasmikroelektrode verwendet (FD-223, World Precision Instruments; A). ber einen Analog/Digital-Wandler
(Digidata 1322A, Axon Instruments) wurden die Daten digitalisiert und an einen Computer geleitet. Injektionsstrme oder Haltepotentiale konnten
entweder ber einen Stimulator (Max21, Zeitz Instruments) eingestellt werden oder in programmierter Folge ber den analogen Ausgang (A. Out) des
Digidata 1322A. Um diese beiden Stimulationssysteme alternierend verwenden zu knnen, wurde die in B dargestellte Schaltung verwendet. Die
Messapparatur wurde mit einem Zellmodell (C) regelmig auf ihre korrekte Funktion geprft. Die elektrischen Elemente des Zellmodells entsprachen
in ihrer Dimension ungefhr den Versuchsbedingungen (RPel = Widerstand der Potentialelektrode, Rm = Membranwiderstand, Cm = Membrankapazitt,
RCel = Widerstand der Stromelektrode).
Computer
A. Out
Analog In
Dig.Out
TEC-05L
Current
Output
Output
PEL
Ref.
WPI FD-223
Abschirmung
SO3SCN
N+
NCS
-O S
3
N+
O
C
Cl
Clofiliumtosylat (1 M)
CF3
O-
N
H
O-
Nifluminsure (50 M)
O
N C
NPPB (50 M)
NH3
O-
Colchizin (25 M)
O
N+
O
NH3
O
O
DNQX (20 M)
Abb. 8 Strukturformeln der verwendeten Pharmaka mit den jeweils eingesetzten Konzentrationen.
.....
IVC (nA)
Em (mV)
10 s
.....
...
...
.
Eion (mV)
5 min
Abb. 9 Ionenpotential (Eion), Membranpotential (Em) und Haltestrom (IVC) bei Einstich einer K+-sensitiven Zweikanal-Glasmikroelektrode und einer elektrolytgefllten
Einkanal-Glasmikroelektrode
Nach dem Einstich der K+-sensitiven Elektrode (1) stieg das Ionenpotential (Eion)
bedingt durch die hohe intrazellulre K+-Konzentration um ~50 mV an. Gleichzeitig
wurde vom Referenzkanal der Elektrode das Membranpotential (Em) registriert
(~_38 mV). Der Einstich der Einkanal-Elektrode (2) vernderte Em und Eion kaum. Die
Klemmung von Em auf _50 mV durch die Einkanal-Elektrode (3) erforderte anfangs
einen Klemmstrom (IVC) von ~3 nA. Anschlieend nahm IVC erheblich ab und betrug
nach 5 min nur noch ~_0,2 nA. Eion wurde durch die Klemmung von Em nicht signifikant
beeinflusst (Eh = _50 mV: 67,5 14,7 mV, n = 15; Eh = _70 mV: 60,5 12,0 mV,
n = 17).
-20
-10
10
20
**
(56)
60
(5)
80
(8)
100
120
140
Osmolalitt (% NSL)
(4)
**
(23)
160
180
200
40
(6)
**
(7)
(8)
**
20
40
60
80
100
120
40
(6)
**
60
(5)
**
**
(56)
80
(8)
(4)
120
140
**
(23)
Osmolalitt (% NSL)
100
(7)
160
180
(8)
200
Mittelwerte S.D. aus n = 4 bis 56 Messungen. Sternchen markieren signifikante (*, p < 0,05) bzw. hoch-signifikante (**. p < 0,01) Vernderungen.
Zur Erhhung der extrazellulren Osmolalitt wurde die NaCl-Konzentration um 20, 40 bzw. 85 mM erhht und zur Verminderung um 20, 30, 40,
50 bzw. 59 mM reduziert. Die Daten aus A und B stammen aus identischen Messungen.
B) Die Erhhung der extrazellulren Osmolalitt fhrte zu einer vergleichsweise kleinen Zunahme von Rin, die Verminderung zu einer starken Abnahme, insbesondere bei Osmolalitten kleiner als 60 %. Die nach nderung der extrazellulren Osmolalitt erhaltenen Werte fr Rin wurden auf
den zuvor in NSL bestimmten Wert normiert.
A) Die Erhhung der Osmolalitt bewirkte eine kontinuierlich zunehmende Membrandepolarisation, die Verminderung eine Membranhyperpolarisation, die jedoch mit abnehmender Osmolalitt immer geringer wurde.
Abb. 13
Em (mV)
Rin (% NSL)
+40 mM NaCl
5 min
-0.5
-50
0.00
0.5
50
1.0
100
1.5
150
-40
Em (mV)
-50
-40 mM NaCl
+40 mM NaCl
Einfluss von Em auf die nderung des Zellvolumens nach Vernderung der extrazellulren Osmolalitt
-60
-80
1
-1
-3
-40
80
0.8
100
1
120
1.2
-40 mM NaCl
-60
-70
B) nderungen des Zellvolumens nach Vernderung der extrazellulren Osmolalitt bei unterschiedlichem Em. Ein signifikanter Einfluss von Em auf die
nderung des Zellvolumens war nicht erkennbar. Mittelwerte S.D. aus n = 2 bis 6 Experimenten.
A) Wirkung anisotonischer Bedingungen auf [TMA]i, das Zellvolumen und den Membranstrom (IVC) bei Em = -60 mV. [TMA+]i nahm whrend des
gesamten Experiments kontinuierlich ab (gestrichelte Linie). In hypotonischer Lsung (-40 mM NaCl) trat ein zustzlicher, reversibler [TMA+]iAbfall auf, in hypertonischer Lsung ein [TMA+]i-Anstieg. Die nderungen von [TMA+]i zeigen eine Zunahme bzw. eine Abnahme des
Zellvolumens an. IVC verschob sich in hypotonischer Lsung reversibel in positive Richtung und in hypertonischer Lsung in negative Richtung.
Abb. 14
[TMA+]i (mM)
Volumen (%)
IVC (nA)
Em (mV)
Zellvolumen-nderung (%)
(ms)
0
10
20
30
40
50
NSL -40 mM
NaCl
p < 10-6
NSL -40 mM
NaCl
Cin
p = 0,06
B) Statistische Auswertung. Unter hypotonischen Bedingungen sank von 37 15 ms auf 19 7 ms whrend Cin von 2,8 0,8 nF auf
3,2 1,8 nF anstieg. Mittelwerte S.D. aus n = 60 Experimenten.
A) Registrierbeispiele von Em-Verschiebungen unter isotonischen (NSL) und hypotonischen Bedingungen (-40 mM NaCl), induziert
durch die Injektion eines hyperpolarisierenden Strompulses (-1 nA fr 1 s). Die Membranzeitkonstante () wurde ber den Zeitpunkt
erhalten, zu dem die Hyperpolarisation zu 63 % abgeschlossen war (Kreise). Anhand der Amplitude der Em-Verschiebung am Ende
des Pulses wurde Rin bestimmt und aus Rin und die Membrankapazitt (Cin).
50 ms
Abb. 15
5 mV
Cin (nF)
Injektionsstrom (nA)
-12
-10
-8
-6
-4
-2
Em (mV)
-40
-80
-120
NSL (Vorkontrolle)
-40 mM NaCl
-160
NSL (Nachkontrolle)
20
Rin (M)
15
10
0
-12
-10
-8
-6
-4
-2
Injektionsstrom (nA)
Abb. 17
A) In NSL war die Strom-Spannungsbeziehung leicht sigmoid, nach 5 min in hypotonischer Lsung (-40 mM NaCl) dagegen nahezu linear. Die strominduzierten EmVerschiebungen und damit Rin waren in hypotonischer Lsung insgesamt vermindert.
B) In NSL war Rin bei kleinen Injektionsstrmen, d. h. in Nhe des Ruhepotentials, am
grten und fiel bei greren Injektionsstrmen zunehmend ab. Unter hypotonischen
Bedingungen war Rin durchweg vermindert, wobei die Abnahme in Nhe des Ruhepotentials am grten war. Zur Bestimmung von Rin siehe Abb. 10.
Datenpunkte in A und B sind Mittelwerte S.D. aus n = 61 Messungen. Die Wirkung
verminderter extrazellulrer Osmolalitt auf die Strom-Spannungsbeziehung und Rin
war vollstndig reversibel.
Injektionsstrom (nA)
-12
-10
-8
-6
-4
-2
Em (mV)
-40
-80
-120
NSL
-40 mM NaCl
-40 mM NaCl + 80 mM Saccharose
-160
20
Rin (M)
15
10
0
-12
-10
-8
-6
-4
-2
Injektionsstrom (nA)
Abb. 23
Saccharose kaum verndert. Bei hohen Injektionsstrmen waren die Em-Verschiebungen sogar tendenziell verstrkt.
B) Entsprechend wurde Rin durch den Austausch von NaCl gegen Saccharose kaum
beeinflusst. Bei groen negativen Strmen war Rin sogar geringfgig vergrert.
Datenpunkte in A und B sind Mittelwerte S.D. aus n = 7 Messungen. Versuchsablauf siehe Abb. 22.
-40
-20
-80
-60
Em (mV)
-40
-5
-20
-100
-4
-15
-120
-3
-10
-1
-2
Einfluss von Ionenstrke bzw. reduzierter NaCl-Konzentration auf die Strom-Spannungskennlinie und auf IVC
-80
-60
Em (mV)
-40 mM NaCl
-5
10
15
20
25
Datenpunkte in A und B sind Mittelwerte S.D. aus n = 6 Messungen. Versuchsablauf siehe Abb. 24.
B) Nach Austausch von 40 mM NaCl gegen 80 mM Saccharose trat ein auswrts gerichteter Strom auf, der mit zunehmender Negativierung von Em
anstieg. Zur Bestimmung von IVC siehe Abb. 20.
A) Nach Austausch von 40 mM NaCl gegen 80 mM Saccharose war IVC geringfgig vermindert und nicht wie in hypotonischer Lsung (-40 mM
NaCl) vergrert (siehe Abb. 24).
Abb. 25
-100
-40 mM NaCl
NSL
30
IVC (nA)
-120
IVC (nA)
30
Cl-frei
Cl-frei -40 mM Na-Gluconat
NSL
n = 61
-40 mM NaCl
25
Rin (M)
20
n=5
15
10
5
0
-12
-10
30
-6
-4
-2
Injektionsstrom (nA)
NSL+0,5 mM DIDS
-40mM NaCl +0,5 mM DIDS
NSL
n = 61
-40 mM NaCl
25
Rin (M)
-8
20
n = 10
15
10
5
0
-12
-10
-8
-6
-4
-2
Injektionsstrom (nA)
Abb. 33
Einfluss von Cl--freien Bedingungen (A) sowie von DIDS (B) auf
die durch Verminderung der extrazellulren Osmolalitt hervorgerufene
Abnahme von Rin
A) Unter Cl--freien Bedingungen war zum einen Rin erhht und zum anderen die RinAbnahme unter hypotonischen Bedingungen deutlich reduziert.
B) Auch in Gegenwart von DIDS waren Rin erhht und die Rin-Abnahme unter
hypotonischen Bedingungen deutlich reduziert.
Mittelwerte S.D. aus n = 5, 10 bzw. 61 Messungen. Die Vergleichsdaten in A und
B (NSL, _40 mM NaCl) wurden bereits in Abb. 17 B gezeigt. Weitere experimentelle
Einzelheiten siehe dort.
-20
-15
-10
-5
10
Clofiliumtosylat (3)
-70
-60
-50
-40
-30
-20
TEA (6)
**
-40 mM NaCl
Clofiliumtosylat (3)
Kontrolle (56)
Rin (%)
-40 mM NaCl
+80 mM Sacch. (9)
Cl--frei
-40 mM Na-Gluconat (5)
Na+-frei
-40 mM NMDG-Cl (6)
Nifluminsure (4)
NPPB (4)
TEA (6)
Kontrolle (56)
nderungen von Em und Rin unter verschiedenen Versuchsbedingungen. Zusammenfassung der Daten
DIDS (12)
**
-10
10
NPPB (4)
-40 mM NaCl
DIDS (12)
**
Na+-frei
-40 mM NMDG-Cl (6)
**
Cl--frei
-40 mM Na-Gluconat (5)
Nifluminsure (4)
**
Im Einzelnen lagen folgende Versuchsbedingungen vor: 1) Verminderung der extrazellulren NaCl-Konzentration um 40 mM unter Kontrollbedingungen
sowie in Gegenwart verschiedener K+-Kanal- bzw. Cl--Kanalblocker. 2) Verminderung der extrazellulren Osmolalitt unter Na+-freien bzw. Cl--freien
Bedingungen. 3) Zum Vergleich: Isotonischer Austausch von 40 mM NaCl durch 80 mM Saccharose. Mittelwerte S.D., die Anzahl der Messungen ist
jeweils in Klammern angegeben. Signifikante Unterschiede bezglich der Kontrolle sind mit einem (p < 0,05) bzw. zwei Sternen (p < 0,01) markiert.
Abb. 35
Em (mV)
-40 mM NaCl
+80 mM Sacch. (9)
H2O
ECl
ENa
Osm
[Cl-]
H2O
Cm
Am
Rin
Colchizin
Cl-
Em
[Na+]
ENa
[Cl ] ECl
+
Verzgert
Cl-
Em
[Na+]
-40 mM NaCl
gCl
Iswell
DIDS
Bei Verminderung der extrazellulren Osmolalitt durch Wegnahme von 40 mM NaCl werden die Gleichgewichtspotentiale fr Na+ (ENa) und Cl- (ECl)
verndert. Die Absenkung des ENa fhrt zu einer Membrandepolarisation, die Anhebung des ECl zu einem Cl--Ausstrom. Die Verminderung der
extrazellulren Osmolalitt (Osm) fhrt zu einem Wassereinstrom und somit zu einer Zunahme des Zellvolumens (V). Durch das einstrmende H2O
vermindern sich die intrazellulren Ionenkonzentrationen und somit auch [Na+]i und [Cl-]i. Gleichzeitig fhrt die Volumenzunahme zu einer Zunahme der
Membranleitfhigkeit fr Cl- (gCl) und somit zu einer Rin-Abnahme durch die Aktivierung von Iswell. Iswell ist durch DIDS blockierbar und wird vermutlich
ber das Cytoskelett aktiviert, da die Depolymerisierung der Mikrotubuli mit Colchizin den Iswell unterdrckt. Die Volumenzunahme erfordert eine
Zunahme der Membranoberflche (Am) ber Membranausstlpungen und den Einbau neuer Membranelemente. Letzteres fhrt zu einer Zunahme der
Membrankapazitt (Cm).
Abb. 36
Sofort
Anhang
124
Anhang
ANHANG
125
Anhang
126
Anhang
DANKSAGUNG
Prof. Dr. Wolf-Rdiger Schlue gilt fr seine Bereitschaft zur Betreuung dieser
Arbeit und die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes und Prof. Dr. Klaus Lunau fr
seine Bereitschaft zur Erstellung des Zweitgutachtens besonderer Dank.
Dr. Peter Hochstrate hat mit seinen Hilfestellungen, seiner geduldigen Diskussionsbereitschaft und der akribischen Durchsicht der Arbeit sehr geholfen.
Dr. Paul Wilhelm Dierkes half mir mit vielen Anregungen und Ideen.
Besonders danken mchte ich auerdem Simone Durry und Claudia Roderigo fr
die hervorragende technische Assistenz und Hanne Horn fr die Untersttzung bei
fotografischen Arbeiten.
Guido Klees, Dr. Verena Wende und Dr. Hans-Joachim Wsten gilt besonderer
Dank fr die beraus gute Arbeitsatmosphre und stetige Hilfsbereitschaft.
Auerdem mchte ich mich bei Dr. Eberhard von Berg, Dr. Ednan Gerard,
Dr. Jrgen Schoppe und Dr. Dirk Schubert fr ihre Freundschaft und ihre
fachliche Untersttzung bedanken.
Schlielich mchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, die mir das Studium
ermglichten und auch whrend der Promotion immer fr mich da waren und bei
Anne Brockerhoff, die mir mit ihrem Verstndnis und ihrer moralischen
Untersttzung whrend der Entstehung dieser Arbeit, insbesondere in Zeiten
experimenteller Katastrophen und zeitlicher Engpsse, immer zur Seite stand.
127
Anhang
128
Anhang
ERKLRUNG
Hiermit erklre ich, dass ich die vorgelegte Dissertation selbstndig verfasst und
keine unerlaubten Hilfsmittel verwendet habe und sie in der vorgelegten oder
einer hnlichen Form noch keiner anderen Institution eingereicht habe.
Philippe Coulon
129