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Copyright für diesen Preprint (der nicht von Fachleuten begutachtet wurde) liegt beim Autor / Förderer, der bioRxiv die Lizenz
zur unbefristeten Darstellung des Preprint erteilt hat. Es wird unter einer internationalen CC-BY-NC-ND 4.0-Lizenz zur
Verfügung gestellt .
Abstrakt:
Derzeit erleben wir eine schwere Epidemie, die durch das neuartige Coronavirus
2019 (2019-nCoV) verursacht wird. Die Entwicklung von 2019-nCoV ist weiterhin
schwer fassbar. Wir haben 4 Insertionen im Spike-Glykoprotein (S) gefunden, die
für 2019-nCoV einzigartig sind und in anderen Coronaviren nicht vorhanden
sind. Wichtig ist, dass Aminosäurereste in allen 4 Inserts mit denen in HIV-1
gp120 oder HIV-1 Gag identisch oder ähnlich sind . Interessanterweise deutet die
3D-Modellierung des 2019-nCoV darauf hin, dass die Insertionen, obwohl sie in
der primären Aminosäuresequenz diskontinuierlich sind , konvergieren und die
Rezeptorbindungsstelle bilden. Die Entdeckung von 4 einzigartigen Inserts im
2019-nCoV, die alle Identität / Ähnlichkeit mit Aminosäureresten in
Schlüsselstrukturproteinen von HIV-1 aufweisen, ist wahrscheinlich nicht
zufällig. Diese Arbeit liefert bisher unbekannte Erkenntnisse zu 2019-nCoV und
gibt Aufschluss über die Entwicklung und Pathogenität dieses Virus mit wichtigen
Implikationen für die Diagnose dieses Virus.
Einführung
Coronaviren (CoV) sind einzelsträngige positive-sense- RNA-Viren, die Tiere und
Menschen infizieren. Diese werden basierend auf ihrer Wirtsspezifität in 4
Gattungen eingeteilt: Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Deltacoronavirus und
Gammacoronavirus (Snijder et al., 2006). Es gibt sieben bekannte Arten von CoVs,
zu denen 229E und NL63 (Gattung Alphacoronavirus), OC43, HKU1, MERS und
SARS (Gattung Betacoronavirus) gehören. Während 229E, NL63, OC43 und HKU1
häufig infizieren Menschen, die SARS und MERS Ausbruch im Jahr 2002 bzw.
2012 eingetreten , wenn das Virus überkreuzten vom Tier auf den Menschen
verursacht erhebliche Mortalität (J. Chan et al, nd;. JFW Chan et al., 2015). Im
Dezember 2019 wurde aus Wuhan, China, ein weiterer Ausbruch des Coronavirus
gemeldet, der auch von Tieren auf Menschen übertragen wurde. Dieses neue
Virus wurde von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) vorübergehend als
neuartiges Coronavirus (2019-nCoV) bezeichnet (JF-W. Chan et al., 2020; Zhu et al.,
2020). Obwohl es mehrere Hypothesen zur Entstehung von 2019-nCoV gibt, ist die
Quelle dieses anhaltenden Ausbruchs noch nicht bekannt.
Die Übertragungsmuster von 2019-nCoV ähneln den Übertragungsmustern, die in
den vorangegangenen Ausbrüchen dokumentiert wurden, unter anderem durch
Körper- oder Aerosolkontakt mit mit dem Virus infizierten Personen.
bioRxiv Preprint zum ersten Mal online gestellt 31. Januar 2020; doi: http://dx.doi.org/10.1101/2020.01.30.927871 . Das
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Aus Wuhan wurden Fälle von leichten bis schweren Erkrankungen und
Todesfälle aufgrund der Infektion gemeldet. Dieser Ausbruch hat schnell
entfernte Nationen wie Frankreich, Australien und die USA unter anderem
verbreitet. Die Zahl der Fälle innerhalb und außerhalb Chinas nimmt stark zu.
Unser derzeitiges Verständnis beschränkt sich auf die Virusgenomsequenzen und
bescheidene epidemiologische und klinische Daten. Eine umfassende Analyse der
verfügbaren 2019-nCoV-Sequenzen kann wichtige Hinweise liefern, die unser
derzeitiges Verständnis zur Bewältigung des anhaltenden Ausbruchs verbessern
können.
Das Spike-Glycoprotein (S) des Cornonavirus wird in zwei Untereinheiten (S1 und
S2) gespalten. Die S1-Untereinheit hilft bei der Rezeptorbindung und die S2-
Untereinheit erleichtert die Membranfusion (Bosch et al., 2003; Li, 2016). Die
Spike-Glykoproteine von Coronoviren sind wichtige Determinanten des
Gewebetropismus und des Wirtsbereichs. Darüber hinaus sind die Spike-
Glykoproteine wichtige Ziele für die Impfstoffentwicklung (Du et al., 2013). Aus
diesem Grund sind die Spike-Proteine die am intensivsten untersuchten unter
den Coronaviren. Wir haben daher versucht, das Spike-Glykoprotein des
2019-nCoV zu untersuchen, um seine Evolution, die Sequenz neuartiger
Merkmale und strukturelle Merkmale mithilfe von Rechenwerkzeugen zu
verstehen.
Methodik
Retrieval und Alignment von Nukleinsäure- und Proteinsequenzen
Wir haben alle verfügbaren Coronavirus-Sequenzen (n = 55) aus der NCBI-
Genomdatenbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) abgerufen und die GISAID
(Elbe & Buckland-Merrett, 2017) verwendet [https: //www.gisaid.org/], um alle
verfügbaren Sequenzen in voller Länge (n = 28) von 2019 - nCoV am 27. Januar
2020 abzurufen. Die mehrfache Sequenzabstimmung aller Coronavirus-Genome
wurde unter Verwendung der MUSCLE-Software durchgeführt (Edgar, 2004).
basierend auf der Nachbarverbindungsmethode. Von 55 Coronavirus-Genomen
wurden 32 repräsentative Genome aller Kategorien für die phylogenetische
Baumentwicklung unter Verwendung der MEGAX-Software verwendet (Kumar et
al., 2018). Der nächste Verwandte war SARS CoV. Die Glykoproteinregion von
SARS CoV und 2019-nCoV wurde unter Verwendung von Multalin-Software
(Corpet, 1988) ausgerichtet und visualisiert. Die identifizierte Aminosäure- und
Nukleotidsequenz wurde mit der gesamten viralen Genomdatenbank unter
Verwendung von BLASTp und BLASTn abgeglichen. Die Konservierung der
Nucleotid- und Aminosäuremotive in 28 klinischen Varianten des 2019-nCoV-
Genoms wurde durch Durchführung eines Mehrfachsequenz-Alignments unter
Verwendung der MEGAX-Software dargestellt. Die dreidimensionale Struktur von
2019-nCoV- Glykoprotein wurde unter Verwendung des SWISS-MODEL- Online-
Servers (Biasini et al., 2014) erzeugt und die Struktur unter Verwendung von
PyMol (DeLano, 2002) markiert und visualisiert.
Ergebnisse
Unheimliche Ähnlichkeit neuartiger Inserts im 2019-nCoV- Spike-Protein
mit HIV-1 gp120 und Gag
Unser phylogenter Baum von Coronaviren voller Länge legt nahe, dass
2019-nCoV eng mit SARS CoV verwandt ist [Abb. 1]. Darüber hinaus haben
andere neuere Studien die 2019-nCoV mit der SARS CoV in Verbindung gebracht.
Wir verglichen daher die Spike-Glykoproteinsequenzen des 2019-nCoV mit
denen des SARS-CoV (NCBI-Zugangsnummer: AY390556.1). Bei sorgfältiger
Prüfung des Sequenz-Alignments stellten wir fest, dass das 2019-nCoV-Spike-
Glykoprotein 4 Insertionen enthält [Abb. 2]. Um weiter zu untersuchen, ob diese
Inserts in einem anderen Koronavirus vorhanden sind, haben wir ein Vielfaches
durchgeführt
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Wir haben dann das ausgerichtete Genom übersetzt und festgestellt, dass diese
Inserts in allen Wuhan 2019-nCoV-Viren mit Ausnahme des 2019-nCoV- Virus von
Bat als Wirt vorhanden sind [Abb. S4]. Fasziniert von den 4 hochkonservierten
Beilagen, die nur für 2019-nCoV erhältlich sind , wollten wir ihre Herkunft
verstehen. Zu diesem Zweck haben wir das lokale Alignment von 2019-nCoV mit
jedem Insert als Abfrage für alle Virusgenome verwendet und Treffer mit 100%
Sequenzabdeckung berücksichtigt. Überraschenderweise stimmte jeder der vier
Inserts mit kurzen Segmenten der Human Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1) -
Proteine überein. Die Aminosäurepositionen der Inserts in 2019-nCoV und die
entsprechenden Reste in HIV-1 gp120 und HIV-1 Gag sind in Tabelle 1 gezeigt. Die
ersten 3 Inserts (Insert 1,2 und 3) sind auf kurze Aminosäuresegmente
ausgerichtet Reste in HIV-1 gp120. Der Einsatz 4 war auf HIV-1- Gag ausgerichtet.
Das Insert 1 (6 Aminosäurereste) und Insert 2 (6 Aminosäurereste) im Spike-
Glykoprotein von 2019-nCoV sind zu 100% identisch mit den auf HIV-1 gp120
kartierten Resten . Das Insert 3 (12 Aminosäurereste) in 2019-nCoV ist mit Lücken
auf HIV-1 gp120 abgebildet [siehe Tabelle 1]. Das Insert 4 (8 Aminosäurereste) ist
mit Lücken auf HIV-1- Gag abgebildet.
Das HIV-1- Gag-Protein ermöglicht die Wechselwirkung von Viren mit negativ
geladenen Wirtsoberflächen (Murakami, 2008), und eine hohe positive Ladung
des Gag-Proteins ist ein Schlüsselmerkmal für die Wechselwirkung zwischen
Wirt und Virus . Bei der Analyse der pI-Werte für jeden der 4 Inserts in
2019-nCoV und der entsprechenden Abschnitte der Aminosäurereste von HIV-1-
Proteinen stellten wir fest, dass a) die pI-Werte für jedes analysierte Paar sehr
ähnlich waren, b) die meisten dieser pI-Werte waren 10 ± 2 [siehe Tabelle 1].
Bemerkenswerterweise waren die pI-Werte trotz der Lücken in den Beilagen 3
und 4 vergleichbar. Diese Gleichförmigkeit der pI-Werte für alle 4 Inserts
verdient weitere Untersuchung.
Da keines dieser 4 Inserts in einem anderen Coronavirus vorhanden ist, stellt die
für diese Inserts kodierende Genomregion ideale Kandidaten für das Design von
Primern dar, die 2019-nCoV von anderen Coronaviren unterscheiden können.
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HIV HIV
Protein Genom Nummer Gesamt Pi
Virus
Motive Motivausrichtung und Quelle von Polar Verkohlen Valu
Glykoprotein
Variable Land/ Rückstände ge e
Region Untertyp
Thailand
71 76 */
Einfügen 2019-nCoV (GP) TNGTKR gp120- 5 2 11
1 HIV1 (GP120) TNGTKR
V4 CRF01_ 5 2 11
404 409 AE
150 145
Einfügen 2019-nCoV (GP) HKNNKS gp120- Kenia*/ 6 2 10
2 HIV1 (GP120) HKNNKS
V5 G 6 2 10
462 467
Einfügen 2019-nCoV (GP) 245 256 gp120- 8 2 10,84
RSYL - - - - TPGDSSSG
3 HIV1 (GP120) RTYL FNE TRGNSSSG V1 Indien * / C 10 1 8.75
136 150
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Abbildung 3. Modelliertes Homotrimer - Spike-Glykoprotein des 2019-nCoV-
Virus. Die Inserts von HIV-Hüllprotein sind mit farbigen Kügelchen gezeigt, die
an der Bindungsstelle des Proteins vorhanden sind.
Evolutionsanalyse von 2019-nCoV
Es wurde spekuliert, dass 2019-nCoV eine Variante des Coronavirus ist, die aus
einer tierischen Quelle stammt, die auf den Menschen übertragen wurde.
Angesichts der Änderung der Spezifität für den Wirt beschlossen wir, die
Sequenzen des Spike-Glykoproteins (S-Protein) des Virus zu untersuchen. S-
Proteine sind Oberflächenproteine, die dem Virus bei der Erkennung und
Bindung des Wirts helfen. Somit kann eine Änderung dieser Proteine als eine
Änderung der Wirtsspezifität des Virus widergespiegelt werden. Um zu wissen ,
die Veränderungen in der S - Protein - Genen von 2019-Ncov und seine Folgen in
strukturellen Umordnungen führten wir in-Sillico Analyse von 2019-Ncov in
Bezug auf alle anderen Viren. Ein Mehrfachsequenz-Alignment zwischen den S-
Protein-Aminosäuresequenzen von 2019-nCoV, Bat-SARS-Like, SARS-GZ02 und
MERS ergab, dass sich S-Protein mit der größten signifikanten Diversität
gegenüber SARS-GZ02 entwickelt hat (Abbildung 1).
Da das S-Protein von 2019-nCoV die engste Verwandtschaft mit SARS GZ02
aufweist, wurde die Sequenz, die für die Spike-Proteine dieser beiden Viren
kodiert, mit der MultiAlin-Software verglichen. Wir fanden vier neue Insertionen
im Protein von 2019-nCoV- „GTNGTKR“ (IS1), „HKNNKS“ (IS2), „GDSSSG“ (IS3) und
„QTNSPRRA“ (IS4) (Abbildung 2). Zu unserer Überraschung fehlten diese
Sequenzinsertionen nicht nur im S-Protein von SARS, sondern wurden auch bei
keinem anderen Mitglied der Coronaviridae- Familie beobachtet (ergänzende
Abbildung). Dies ist verblüffend, da es ziemlich unwahrscheinlich ist, dass ein
Virus in kurzer Zeit auf natürliche Weise solche einzigartigen Insertionen
erhalten hat.
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Diskussion
Der aktuelle Ausbruch von 2019-nCoV erfordert eine gründliche Untersuchung
und ein umfassendes Verständnis seiner Fähigkeit, Menschen zu infizieren. Unter
Berücksichtigung der Tatsache, dass sich die Präferenz des Wirts gegenüber
früheren Coronaviren gegenüber diesem Virus deutlich geändert hat, haben wir
die Veränderung des Spike-Proteins zwischen 2019-nCoV und anderen Viren
untersucht. Wir fanden vier neue Insertionen im S-Protein von 2019-nCoV im
Vergleich zu seinem nächsten Verwandten, SARS CoV. Die Genomsequenz der
letzten 28 klinischen Isolate zeigte, dass die für diese Insertionen kodierende
Sequenz unter all diesen Isolaten konserviert ist. Dies weist darauf hin, dass diese
Insertionen vorzugsweise vom 2019-nCoV erworben wurden, was ihm einen
zusätzlichen Überlebens- und Infektionsvorteil verschafft. Bei näherer
Betrachtung stellten wir fest, dass diese Insertionen mit
HIV-1 vergleichbar waren. Unsere Ergebnisse belegen eine erstaunliche
Beziehung zwischen dem gp120 und dem Gag-Protein von HIV mit dem
2019-nCoV- Spike-Glykoprotein. Diese Proteine sind von entscheidender
Bedeutung, damit die Viren ihre Wirtszellen identifizieren und an diese binden
und sich viral zusammensetzen können (Beniac et al., 2006). Da
Oberflächenproteine für den Wirtstropismus verantwortlich sind, implizieren
Änderungen in diesen Proteinen eine Änderung in der Wirtsspezifität des Virus.
Berichten aus China zufolge hat 2019-nCoV an Wirtsspezifität gewonnen, da
ursprünglich bekannt war, dass das Virus Tiere und nicht Menschen infiziert,
aber nach den Mutationen hat es auch beim Menschen Tropismus gewonnen.
Schlussfolgerungen
Unsere Analyse des Spike-Glykoproteins von 2019-nCoV ergab mehrere
interessante Ergebnisse: Zunächst identifizierten wir 4 einzigartige Inserts im
2019-nCoV- Spike-Glykoprotein, die in keinem anderen Coronavirus enthalten
sind, das bis heute gemeldet wurde. Zu unserer Überraschung wurden alle 4
Beilagen im 2019-nCoV zugeordnet
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bioRxiv Preprint zum ersten Mal online gestellt 31. Januar 2020; doi: http://dx.doi.org/10.1101/2020.01.30.927871 . Das
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Zhu, N., Zhang, D., Wang, W., Li, X., Yang, B., Song, J., Zhao, X., Huang, B., Shi, W., Lu, R., Niu, P.,
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Abb. S2: Alle vier Inserts sind in den ausgerichteten 28 Wuhan 2019-nCoV -
Virusgenomen vorhanden, die von GISAID erhalten wurden. Die Lücke in der
Bat-SARS Like CoV in der letzten Reihe zeigt, dass Insert 1 und 4 für Wuhan
2019-nCoV sehr einzigartig sind.
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Abb. S3 Phylogenetischer Baum von 28 klinischen Isolaten des Genoms von 2019-nCoV, einschließlich eines
aus Fledermaus als Wirt.
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