Protokoll zum Versuch 1 im Fachmodul

Genetik

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Inhalt

Einleitung....................................................................................................................................3

Ergebnisse...................................................................................................................................4

Wachstumskurve.....................................................................................................................4

Transformationseffizienz........................................................................................................7

Diskussion...................................................................................................................................8

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Einleitung

Die folgenden Versuche sollen zunächst grundlegende Techniken des Laboralltags vermitteln.
Dabei wird in einem ersten Teil eine Wachstumskurve einer Bakterienkultur von E.coli
angefertigt. Nach Vorbereitung der benötigten Medien wird frisches LB-Medium mit einer
Probe der Übernachtkultur angeimpft. Während der Inkubation bei 37°C wird nun alle 45
Minuten eine Probe entnommen und die Zelldiuchte mittels Photometer bestimmt
(OD600nm).

Der zweite Teil der Laborwoche diente zur Bestimmung der Transformationseffizienz bei
E.coli Zellen, die ein Plasmid mittels Elektroporation aufnehmen sollen. Zur Quantifizierung
werden die Zellen nach der Behandlung auf ampicillinhaltigen LB-Agarplatten ausplattiert,
auf denen sie aufgrund des Ampicillin-Resistenzgens des eingebrachten Vektors wachsen
sollten.

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Ergebnisse

Wachstumskurve

Um die Zellzahl in einer Kultur mit definierter Verdünnung zu bestimmen, wird eine
Verdünnungsreihe ausplattiert und die Zahl der wachsenden Kolonien gezählt.

Tabelle 1: Zellzahl der Übernachtkultur

Verdünnung Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4 Gruppe 5 Gruppe 6 Gruppe 7 Gruppe 8

10^-2
10^-4 4880 3456 3952 1968 2136
10^-6 1400 244 255 502 36 310 1340
10^-7 332 29 4 32 36 39
10^-8 25 6 4 12 3 5
10^-9 4 3 2 2 1
Zellzahl / ml 2,8E+11 1,4E+09 1,17E+09 7,3E+09 3,2E+09 5,3E+09 7,5E+09 2,96E+09

Die Ergebnisse zeigen, dass sich in den von uns vorbereiteten Lösungen zwischen 1,17E+09
bis 7,5E+09 Zellen befinden. Lediglich Gruppe 1 hat eine signifikant höhere Zellzahl
ermittelt, die um den Faktor 100 von den anderen Ergebnissen abweicht.

Zur Erstellung der Wachstumskurve wird nun 2,5ml Übernachtkultur auf 250ml frisches LB-
Medium gegeben. Die nun zu Beginn ermittelte optische Dichte wird mit der Zellzahl, die
sich aus Tabelle 1 ergibt, gleich gesetzt. Um die Zellzahlen im Verlauf zu bestimmen wird
angenommen, dass der gemessene Wert der optischen Dichte sich in gewissen Grenzen auch
proportional zur Bakteriendichte verhält.

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Tabelle 2: Optische Dichte und Zellzahl

Standartabweichun
Zeit OD 1 OD 2 OD 3 OD 4 OD 5 OD 6 OD 7 OD 8 Mittelwert g Varianz
0 0,025 0,033 0,023 0,028 0,026 0,043 0,025 0,035 0,030 6,78E-03 4,59E-05
45 0,064 0,049 0,04 0,038 0,046 0,063 0,047 0,044 0,049 9,72E-03 9,44E-05
90 0,077 0,093 0,067 0,075 0,065 0,098 0,086 0,076 0,080 1,18E-02 1,39E-04
165 0,28 0,37 0,208 0,28 0,29 0,38 0,33 0,27 0,301 5,66E-02 3,21E-03
190 0,46 0,52 0,39 0,445 0,48 0,55 0,49 0,45 0,473 4,91E-02 2,41E-03
235 0,73 0,81 0,644 0,711 0,72 0,85 0,77 0,7 0,742 6,55E-02 4,29E-03
280 1,11 1,18 0,923 1,08 1,14 1,23 1,15 1,044 1,107 9,41E-02 8,85E-03
325 1,35 1,42 1,316 1,39 1,34 1,52 1,4 1,3 1,380 7,04E-02 4,96E-03

Standartabweichun
Zeit Zellzahl 1 Zellzahl 2 Zellzahl 3 Zellzahl 4 Zellzahl 5 Zellzahl 6 Zellzahl 7 Zellzahl 8 Mittelwert g Varianz
0 7,00E+09 3,50E+07 2,93E+07 1,83E+08 8,00E+07 1,33E+08 1,88E+08 7,40E+07 9,65E+08 2,44E+09 5,95E+18
45 1,79E+10 5,20E+07 5,09E+07 2,48E+08 1,42E+08 1,94E+08 3,53E+08 9,30E+07 2,38E+09 6,28E+09 3,94E+19
90 2,16E+10 9,86E+07 8,52E+07 4,89E+08 2,00E+08 3,02E+08 6,45E+08 1,61E+08 2,94E+09 7,53E+09 5,66E+19
165 7,84E+10 3,92E+08 2,65E+08 1,83E+09 8,92E+08 1,17E+09 2,48E+09 5,71E+08 1,07E+10 2,73E+10 7,48E+20
190 1,29E+11 5,52E+08 4,96E+08 2,90E+09 1,48E+09 1,69E+09 3,68E+09 9,51E+08 1,76E+10 4,50E+10 2,02E+21
235 2,04E+11 8,59E+08 8,19E+08 4,63E+09 2,22E+09 2,62E+09 5,78E+09 1,48E+09 2,79E+10 7,14E+10 5,09E+21
280 3,11E+11 1,25E+09 1,17E+09 7,04E+09 3,51E+09 3,79E+09 8,63E+09 2,21E+09 4,23E+10 1,09E+11 1,18E+22
325 3,78E+11 1,51E+09 1,67E+09 9,06E+09 4,12E+09 4,68E+09 1,05E+10 2,75E+09 5,15E+10 1,32E+11 1,74E+22

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Mit Hilfe der beiden Tabellen, wird das Wachstum der Bakterien erfasst. Wichtig ist
anzumerken, dass die Messungen nicht immer im gleichen Intervall erfolgten. Nach der
Messung bei 90 Minuten, wurde erst wieder nach 75 Minuten gemessen. Somit ist der
sprunghafte Anstieg der Zellzahl zu erklären. Allerdings wird auch ein exponentielles
Wachstum zunächst erwartet und deshalb die Messung zur besseren Darstellung grafisch
aufgetragen.

Wachstumskurve
Z 10.00
e
l 9.80
l
z 9.60
a
h 9.40
l
9.20
l
o 9.00
g
a 8.80
r
i 8.60
t
h 8.40
m 8.20
i
s 8.00
c
h 0 45 90 135 180 225 270 315
Zeit in min

Abbildung 1: Wachtumskurve

Anhand der Grafik können die verschiedenen Wachstumsphasen zeitlich eingegrenzt werden.
Zu Beginn nimmt die Zellzahl nur langsam zu. Die Anwachsphase könnte man somit von
Minute 0 bis ca. Minute 90 ansetzen. Ab hier nimmt der Zuwachs der Kultur etwas zu, was
für die log-Phase charakteristisch ist. Ab Minute 190 kann man bereits ein starkes Abflachen
im Kurvenverlauf erkennen. Es tritt also die stationäre Phase ein.

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Transformationseffizienz

Um die Transformationseffizienz zu bestimmen, wird 1ml unserer Bakterienkultur der

Elektroporation unterzogen. Die Anzahl der Zellen kann aus Tabelle 1 entnommen werden.
Um nun die Bakterien zu quantifizieren, die das Plasmid aufgenommen haben, wird eine
Verdünnungsreihe auf ampicillinhaltigen LB-Agarplatten ausplattiert.

Tabelle 3: Transformationseffizienz

Gruppe Gruppe Gruppe Gruppe Gruppe Gruppe Gruppe Gruppe

Verdünnung 1 2 3 4 5 6 7 8
10^-4 256 78 394 446 374 482 240
10^-5 51 9 30 57 52 43 19
cfu / µg
DNA 0 3,83E+08 8,40E+06 3,50E+08 5,08E+08 4,40E+08 4,56E+08 2,30E+08
cfu / ml 2,8E+11 1,40E+09 1,17E+09 7,30E+09 3,20E+09 5,30E+09 7,50E+09 2,96E+09

Aus der Tabelle kann die Zahl der eingesetzten und transformierten Zellen entnommen
werden. Dabei zeigt sich, dass die Zahl der Zellen, die erfolgreich das Plasmid aufgenommen
haben, von der ursprünglichen Zahl ca. um den Faktor 10 unterscheidet. Einzige Ausnahme
bildet das Ergebnis von Gruppe 3, deren Transformation sich um den Faktor 1000 von der
ursprünglichen Zellzahl unterscheidet.
Auf den Platten von Gruppe 1 sind keine Bakterienkulturen gewachsen.

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Diskussion

Aus Tabelle 1 kann man die Anzahl der Bakterien in der Übernachtkultur ablesen. Dabei
bewegen sich die Werte, bis auf den von Gruppe 1, alle innerhalb einer Größenordnung.
Trotzdem wird gerade wenn man die einzelnen Verdünnungsstufen vergleicht deutlich, dass
sich die Anzahl der Kolonien nicht proportional zur Verdünnung verhält. Daraus lässt sich
schließen, dass bei den verschiedenen Pipettierschritten nicht exakt gearbeitet wurde. Dieser
Fehler gilt natürlich auch für alle vorherigen Schritte, wie zur Herstellung des LB-Mediums
oder der LB-Agarplatten.
Ein Fehler beim Zählen von sehr stark bewachsenen Platten lässt sich auch nicht ausschließen
und so lässt sich erklären, dass in jeder Kultur eine unterschiedliche Anzahl an Zellen ist.
Rein theoretisch müsste die Anzahl identisch sein, da alle Schritte gleich ausgeführt werden
sollten.

Bei der Messung der optischen Dichte entstehen falsche Messwerte zum Beispiel durch nicht
sachgerechten Umgang mit den Küvetten. Wird der Strahlengang berührt, gibt das Gerät
falsche Werte aus. Außerdem verändert sich die OD, wenn die Küvette nach der
Probenentnahme nicht direkt vermessen wird. Zum einen nimmt die Zellzahl durch
Zellteilung zu, während die Zellen innerhalb der Küvette durch die fehlende Bewegung
absinken. Durch die ungleiche Verteilung können somit auch falsche Werte ausgegeben
werden.

Bei der Transformation gelten ähnliche Fehler, wie ungenaues Pipettieren. Allerdings sind bei
diesem Versuch ebenfalls einige temperatursensitive Schritte durchzuführen. Werden die
Bakterien also bei der Vorbereitung nicht wie im Skript beschrieben gelagert, kann es sein das
sie selbst nach der Elektroporation keine DNA aufnehmen können.

Insgesamt kann man der Tabelle 3 entnehmen, dass im Schnitt die transformierten Zellen ca.
ein Zehntel der eingesetzten Zellen ausmachen. Da bei Gruppe 3 deutlich weniger Zellen
erfolgreich Transformiert wurden, könnte es auch sein, dass durch unsauberes Arbeiten bei
den Waschschritten einige Zellen verloren gingen.
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