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Inaugural-Dissertation
Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
46
Referent: Prof. Dr. med. M. Scheurlen
2
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Das kolorektale Karzinom 1
1.2 Kolonkarzinogenese 1
1.2.1 Mutatorgene und Mikrosatelliteninstabilität 1
1.2.2 Tumorsuppressorgene, Onkogene und chromosomale Instabilität 2
1.2.3 Zytogenetische Veränderungen beim Kolonkarzinom 3
1.3 Zellkulturmodelle des Kolonkarzinoms 4
1.4 Zielsetzungen der Arbeit 5
2.1 Material 6
2.1.1 Geräte 6
2.1.2 Zellkultur 6
2.1.3 Chemikalien 7
2.1.4 Zellkulturmedien- primäre Zellkultur sowie Zelllinie NCOL-1b 8
2.1.5 Zellkulturmedien- Zelllinie Colo 206F und Colo 678 9
2.1.6 Chromsomenaufarbeitung 9
2.1.7 Hybridisierung der Chromosomen 10
2.1.8 SkyView-System 12
2.1.9 Software 12
2.2 Methoden 13
2.2.1 Zellkultur (primär/ kommerziell) 13
2.2.1.1 Herstellung einer Zellsuspension aus dem Primärtumor 13
2.2.1.2 Gewinnung der Kolonepithelzellen mittels Percoll-Gradient 13
2.2.1.3 Zellzahlbestimmung 14
2.2.1.4 Aussaat der Zellen 14
2.2.1.5 Subkultivierung 14
2.2.2 Zytogenetische Charakterisierung 14
2.2.2.1 Hypotone Behandlung und Fixierung 14
2.2.2.2 Auftropfen 15
2.2.2.3 Pepsinvorbehandlung 15
3
Inhaltsverzeichnis
2.2.2.4 Formaldehyd-Vorbehandlung 16
2.2.2.5 Denaturierung 16
2.2.2.6 Hybridisierung 16
2.2.2.7 Nachweis 17
2.2.2.8 Spektrale Karyotypisierung (Garini et al. 1996) 18
2.2.3 Genotypisierung 19
3 Ergebnisse 20
4 Diskussion 41
4
Inhaltsverzeichnis
5 Zusammenfassung 46
6 Literaturverzeichnis 48
7. Anhang 54
7.1 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 54
7.2 Veröffentlichungen 55
7.3 Verzeichnis der akademischen Lehrer 56
Ehrenwörtliche Erklärung
Danksagung
Lebenslauf
5
Einleitung
1 Einleitung
1.2 Kolonkarzinogenese
Derzeit existieren zwei Modelle zur Genese kolorektaler Karzinome, die offenbar entweder
zu einer erhöhten Bereitschaft zum Erwerb sekundärer Mutationen oder zu einer
schnelleren Akquirierung von genetischen Veränderungen führen können. Neben dem
Suppressor-Mechanismus, der auf einer chromosomalen Instabilität beruht und eine
Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen und Aktivierung von Onkogenen zur Folge hat
(85 % der sporadischen kolorektalen Karzinome), gibt es den Mutator-Mechanismus, bei
dem eine DNA-Instabilität für die Karzinomentwicklung und -progression entscheidend ist
(15 % der sporadischen kolorektalen Karzinome).
1
Einleitung
(„Mutatorgene“). Dies ermöglicht die Mutation weiterer Gene und somit die Entstehung
des kolorektalen Karzinoms (und weiterer Tumore). Dieser Mechanismus wurde zuerst
beim hereditären, nicht polypösen Kolonkarzinom (HNPCC) beschrieben (Aaltonen et. al
1993), dem eine autosomal dominant vererbte Mutation eines für ein Reparaturenzym
kodierenden Gens zugrunde liegt. Eine indirekte Nachweismethode für das Vorliegen des
Mutator-Mechanismus ist eine fehlerhafte Replikation repetitiver Sequenzen im
Tumorgenom, die als Mikrosatelliteninstabilität bezeichnet wird. Eine Untersuchung von
sporadischen Kolonkarzinomen auf Mikrosatelliteninstabilität ist von Bedeutung, weil
gezeigt werden konnte, dass ca. 15 % der nicht erblichen kolorektalen Karzinome ebenfalls
durch den Mutator-Mechanismus entstehen, und dass diese Karzinome nur wenig allelische
Verluste aufweisen. Die unterschiedlichen molekularen Entstehungsmechanismen der
kolorektalen Karzinome spiegeln sich auch in einem unterschiedlichen Phänotyp wieder.
Die mikrosatelliteninstabilen Karzinome wachsen schneller und haben eine andere
Lokalisation (proximales Kolon) bzw. Differenzierung als mikrosatellitenstabile Karzinome
(distales Kolon).
2
Einleitung
3
Einleitung
4
Einleitung
Im Rahmen dieser Arbeit soll eine zytogenetische Charakterisierung von Zelllinien aus
normalem Kolonepithel (NCOL-1), aus einem Adenom (Geki-2) und aus kolorektalen
Karzinomzelllinien (Lovo, Colo-678, Colo-206F) durchgeführt werden. Damit soll ein
(zytogenetisch) gut charakterisiertes Modell der Adenom-Karzinom-Sequenz etabliert
werden. Da die meisten verfügbaren Kolonkarzinomzelllinien schon sehr lange in Kultur
sind und Kulturartefakte aufweisen, sollen weiterhin möglichst viele primäre kolorektale
Karzinomzelllinien etabliert und charakterisiert werden. Dazu wird eine bereits im Rahmen
eines IZKF-Projektes aufgebaute Transportlogistik genutzt. Das Nativmaterial wird direkt
aus dem Operationssaal in das Institut für Pathologie transportiert, dort histologisch
charakterisiert, zugeschnitten und dem gastroenterologischen Labor zur Verfügung gestellt.
Nach einer erfolgreichen in-vitro Kultivierung der Karzinomzellen wird in Ergänzung zur
spektralen Karyotypisierung eine Analyse mit mehreren hochpolymorphen
Mikrosatellitenmarkern („genetischer Fingerabdruck“) durchgeführt. Anschließend werden
die Ergebnisse miteinander und mit den Veränderungen kommerziell erhältlicher
Kolonkarzinomzelllinien verglichen.
5
Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Geräte
2.1.2 Zellkultur
6
Material und Methoden
2.1.3 Chemikalien
7
Material und Methoden
Finalmedium- 100 ml
Dulbecco’s modified Eagle’s medium mit 84,4 ml
L-Glutamine
8
Material und Methoden
Ess. Aminosäuren 1 % 1 ml
FCS 10 % 10 ml
Fungizone 0,6 µg/ml 240 ml
Gentamycin 15 pg/ml 1,25 ml
Humanes recombinantes EGF(1 nM/ml) 20 ml
MEM-Vitamine 1 % 1 ml
Mito™ Serum Extender 100 ml
Penicillin 200U/ ml; Streptomycin 2 ml
250 pg/ml
TGF-α 5 ml
Percoll-Lösung – 40 ml
Hanks-Lösung 1 Teil - 4 ml
NaOH (0,1N) 0,4 Teile - 1600 ml
Percoll 9 Teile - 36 ml
Medium
RPMI 1640 450 ml (90 %)
FCS 10 % 50 ml (10 %)
2.1.6 Chromsomenaufarbeitung
9
Material und Methoden
1xPBS/MgCl2: 100 ml
MgCl2 1M 5 ml
1x PBS 95 ml
1 % Formaldehyd-Lösung
Aqua dest. 20 ml
Formamide 70 ml
20xSSC 10 ml
10
Material und Methoden
Waschlösung I: - 300 ml
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Material und Methoden
2.1.8 SkyView-System
2.1.9 Software
Auswertprogramm:
Ha’Emek; Israel
Aufnahmeprogramm:
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Material und Methoden
2.2 Methoden
13
Material und Methoden
2.2.1.3 Zellzahlbestimmung
In der Neugebauerkammer wird die Zellzahl der Zellsuspension bestimmt. Dazu wird ein
Teil der Zellsuspension mit vier Teilen Trypanblau vermischt und damit die
Neugebauerkammer (Volumen 0,9 mm3) gefüllt. Unter dem Phasenkontrastmikroskop (10
x-Objektiv) werden bei 100facher Vergrößerung mindestens vier Quadranten ausgezählt
und der Mittelwert (MW) davon gebildet. Diesen multipliziert man zunächst mit 10 000,
anschließend mit dem Faktor der Verdünnung (VF) (in diesem Fall x 5) und erhält somit
die Zellzahl der Suspension pro Milliliter.
2.2.1.5 Subkultivierung
Nach dem Waschen mit 10 ml PBS werden die Zellen mit 4 ml Trypsin gelöst (10 Minuten
bei 37° C und 5 % CO2), in ein 50 ml-Reaktionsgefäß überführt und zentrifugiert (10
min/900 g). Auf das Zellpellet wird 10 ml frisches Finalmedium (37° C) gegeben und die
gut durchmischte Zellsuspension auf mindestens zwei neue 75 cm2 Kulturflaschen
aufgeteilt. Die Subkultivierung der kommerziellen Zelllinien Colo 206F und Colo 678
entspricht dem von primären Zelllinien, außer dass anderes Medium (90 % RPMI + 10 %
FCS) verwendet wird.
14
Material und Methoden
oft eine dreimalige Inkubation mit 4 ml Trypsin (5 min/ 37° C) und die Ablösung der
danach übrigen Zellen mittels eines Zellschabers erforderlich. Nach Resuspendierung in
Final-Medium werden die Zellen abzentrifugiert (1400 U/min 8 min), in Natrium-
Citratlösung (0,8 %) resuspendiert und 35 Minuten bei 37° C inkubiert. Nach erneuter
Zentrifugation werden die Zellen in 5 ml Carnoy’s Fixativ (Methanol: Essigsäure 3:1)
resuspendiert und dadurch fixiert.
2.2.2.2 Auftropfen
Die zu verwendenden Objektträger werden am Vortag mit Chromschwefelsäure entwässert
und gereinigt. Vor dem Auftropfen werden die fixierten Zellen abzentrifugiert (1400
U/min/8 min) und mit frischem Carnoy´s Fixativ resuspendiert. Zum Auftropfen hält man
den feuchten Objektträger leicht schräg über ein Waschbecken und lässt aus einer Auftropf-
Glaspipette aus etwa 30 – 60 cm Höhe einige Tropfen (im Mittel drei) auf den Objektträger,
möglichst im vorderen Drittel, tropfen. Sollten die Chromosomen in den Metaphasen sehr
dicht beieinander liegen, kann man den Objektträger noch vorsichtig möglichst schnell (um
die Chromosomen nicht zu zerstören) etwa 3 x über eine blaue Bunsenbrennflamme ziehen,
ehe man ihn dann zum Lufttrocknen senkrecht (um Wasserflecken zu vermeiden) aufstellt.
Den getrockneten Objektträger sucht man dann unter dem Phasenmikroskop auf
Metaphasen durch und markiert diese auf einem weiteren Objektträger zur Erleichterung
bei der späteren Hybridisierung.
2.2.2.3 Pepsinvorbehandlung
Die Pepsinbehandlung dient dazu, den Hintergrund zu reduzieren um somit eine bessere
Hybridisierung zu erreichen. Je nach Morphologie der Zelllinien kann darauf verzichtet
und direkt mit der Formaldehydvorbehandlung begonnen werden. Vor Beginn der
Vorbehandlung sollten die Zellen auf dem Objektträger lichtgeschützt und bei
Raumtemperatur mindestens einen bzw. bis zu mehrere Tage (etwa drei bis vier Tage)
altern. Man pipettiert in eine mit 100 ml destillierten Wasser (37° C) gefüllte Küvette 10 µl
Pepsin 10 %. Zum Aktivieren des Enzyms gibt man 1 ml 1M HCl hinzu, vermischt die
Lösung gut und gibt die gewünschten Objektträger hinein. Das Pepsin lässt man für 5 - 10
min auf die Zellen wirken. Zum Abstoppen der Pepsinwirkung und Waschen werden die
Objektträger in einer mit PBS-Lösung gefüllten 100 ml-Küvette inkubiert.
15
Material und Methoden
2.2.2.5 Denaturierung
Die Denaturierung der Chromosomen kann direkt im Anschluss an die Vorbehandlung oder
am Tag darauf durchgeführt werden. Die zu hybridisierenden Objektträger werden für
mehrere Sekunden bis Minuten, je nach Zelllinie, in die im Wasserbad in einer Küvette auf
70° C erhitzte Denaturierungslösung unter laufendem Abzug gestellt. Nach der
Denaturierungszeit durchlaufen die Objektträger eine eisgekühlte Alkoholreihe steigender
Ethanolkonzentration [70 %iges Ethanol, 80 %ig-, 90 %ig- bis 100 %] für jeweils 3
Minuten pro Küvette und werden anschließend luftgetrocknet. Im Folgenden kann man
unter dem Phasenkontrastmikroskop die Chromosomenmorphologie der einzelnen
Metaphasen nach der Denaturierung begutachten.
2.2.2.6 Hybridisierung
Zeitgleich mit der Denaturierung der Chromosomen können die SKY-Hybridisierungs-
Proben denaturiert werden. Zum Eindecken für einen Objektträger werden 6 µl der DNA-
Probe in ein steriles 1,5 ml Reaktionsgefäß pipettiert. Dieses 1,5 ml Reaktionsgefäß wird in
einem vorgeheizten Wärmeblock bei 80° C für 7 Minuten und anschließend in einem
Styroporschwimmkissen im Wasserbad bei 37° C für ein- bis maximal zwei Stunden
inkubiert. Nach dieser Zeit wird die DNA Probe auf die gewünschte zu hybridisierende
Stelle auf dem Objektträger pipettiert und die Stelle mit einem 18 x 18 mm2 (bzw. 15 x 15
mm2) großen Deckgläschen abgedeckt. Wenn sich die DNA-Probe ganz unter dem
Deckgläschen an gewünschter Stelle und ohne Luftbläschen gleichmäßig verteilt hat,
dichtet man um das Deckgläschen luftdicht mit Marabu®-Kleber („rubber-cement“) ab.
Nach Trocknen des Klebers werden die Objektträger in die mit destilliertem Wasser
16
Material und Methoden
getränkte Feuchtkammer gelegt und mit der Feuchtkammer 48 Stunden zum Hybridisieren
bei 37° C inkubiert.
2.2.2.7 Nachweis
Nach etwa 48 Stunden entnimmt man die Objektträger aus der Feuchtkammer und zieht mit
einer Pinzette vorsichtig den Marabu®- Klebstoff („rubber-cement“) ab. Das Deckgläschen
sollte noch locker auf dem Objektträger schwimmen und keinesfalls angetrocknet sein. Alle
Waschschritte erfolgen bei 45° C im Schüttelwasserbad. Zunächst werden die Objektträger
dreimal je 5 Minuten in Waschlösung I und zweimal 5 Minuten in Waschlösung II (1 x
SSC) gewaschen. Anschließend stellt man die Objektträger für etwa 2 Minuten in eine neue
mit Waschlösung III (4 x SSC mit Tween) gefüllte Küvette bei Raumtemperatur.
Die folgenden Arbeitsschritte werden in einem abgedunkelten Raum durchgeführt. Man
nimmt den einzelnen Objektträger aus der Küvette, gibt mit einer 100 µl-Eppendorfpipette
etwa 80 – 100 µl des Antikörper (#3) auf die Chromosomenareale auf dem Objektträger
und legt ein Deckgläschen (26 x 36 mm) darüber, ehe es für 45 Minuten in der
Feuchtkammer bei 37° C inkubiert wird. Nach dieser Inkubationszeit wird das
Deckgläschen abgelöst, und der Objektträger dreimal 3 Minuten bei 45° C in Waschlösung
III gewaschen. Mit der 100 µl-Eppendorfpipette pipettiert man etwa 80 – 100 µl des
Antikörpers (#4) auf die Chromosomenareale auf dem Objektträger, legt ein Deckgläschen
(26 x 36 mm) darüber und inkubiert dies bei 37° C 45 Minuten in der Feuchtkammer. Wie
bereits nach dem ersten Antikörper (#3) löst man die Deckgläschen ab und wäscht die
Objektträger dreimal jeweils für drei Minuten in 45° C-warmer Waschlösung III.
Anschließend gibt man mit der 200 µl-Eppendorfpipette etwa 150 µl DAPI-2 x SSC auf die
Chromosomen, legt ein Deckgläschen (26 x 36mm) darüber und lässt dies etwa 10 -20
Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur (z.B. unter dem Deckel der Feuchtkammer)
inkubieren. Nach Abschütteln des Deckgläschens schwenkt man den Objektträger kurz in 2
x SSC um überschüssige Tween20-Lösung abzuwaschen, gibt einige Tropfen (etwa 30 – 50
µl) Vectashield mit DAPI vor allem auf die hybridisierte Stelle und legt vorsichtig ein
Deckgläschen (26 x 36 mm), möglichst ohne Blasenbildung, darauf. Zusätzlich kann man
den Objektträger mit dem schmalen Rand schräg auf ein saugfähiges Tuch stellen, sodass
dies überschüssige Flüssigkeit ansaugt, und sich das Deckgläschen durch die Sogwirkung
fest an den Objektträger presst.
17
Material und Methoden
=A =B =C =D =E
1 BCD 9 ADE 17 C
2 E 10 CE 18 ABD
3 ACDE 11 ACD 19 AC
4 CD 12 BE 20 A
5 ABDE 13 AD 21 DE
6 BCDE 14 B 22 ABCE
7 BC 15 ABC X AE
8 D 16 BD Y CDE
18
Material und Methoden
Die Grenzen der Chromosomen einer Metaphase werden anhand der DAPI-Färbung
markiert und anschließend erfolgt die Zuordnung der Chromosomen durch das spezielle
Spektrum.
2.2.3 Genotypisierung
Die Genotypisierung wurde in Kooperation mit dem Institut für Rechtsmedizin und der
Firma „ID-Labor“ (Wiesbaden) durchgeführt. Dazu wurde genomische DNA in einer
Konzentration von 100 ng/l zur Verfügung gestellt. Es wurde eine Kombination von
hochpolymorphen Mikrosatellitenmarkern zur Genotypisierung verwendet. In der
Rechtsmedizin wurden das PowerPlex® ES multiplex system (SE 33, vWA, THO1,
D21S11, FGA, D3S1358, D8S1179, D18S51, Amelogenin) und das AmpFlSTR® SGM
PlusTM multiplex system (D3S1358, vWA, D16S359, D2S1338, D8S1179, D21S11,
D18S51, D19S433, TH01, FGA, SE33) verwendet. Im ID-Labor wurde ein Kombination
aus 15 Markern verwendet, die sich zum großen Teil den in der Rechtsmedizin
verwendeten Markern überlappten (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358,
TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818, FGA).
Mittels PCR wurden die hochvariablen DNA-Abschnitte von verschiedenen Chromosomen
sowie der Geschlechtsindikator Amelogenin vervielfältigt und farblich markiert. Die
Detektion der verschieden amplifizierten DNA-Abschnitte erfolgte nach
Größenauftrennung im elektrischen Feld bei einer denaturierenden Kapillarelektrophorese
durch Laser-induzierte Fluoreszenz. Es wurden positive und negative Kontrollen
mitgeführt, die das richtige Ergebnis erzielten. Alle Signale mit einer Höhe von weniger als
10 % der höchsten Signale innerhalb eines Genortes fanden keine Berücksichtigung.
19
Ergebnisse
3 Ergebnisse
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Ergebnisse
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Ergebnisse
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Ergebnisse
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Ergebnisse
numerische Veränderungen bei den Chromosomen 3, 5, 6, 7, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 21 und
22. Ein Chromosomen 1 zeigt bei 1p13 eine Translokation mit Material von Chromosom 10
[der(1)t(1;10) del(1p13)], das zweite Chromosom 1 zeigt bei 1p36.1 eine Translokation mit
Material von Chromosom 20 [der(1)t(1;20)del(1p36.1)]. Ein Chromosom 3 fehlt in allen
Metaphasen, sieben Mal findet sich stattdessen ein, einmal zwei derivatisierte
Markerchromosomen. In drei Metaphasen fehlt ein Chromosom 4. Bei Chromosom 5 zeigt
sich eine Translokation bei 5p13 mit Material von Chromosom 21 [der(5)t(5;21)del(5p13)].
In allen Metaphasen bei jeweils drei von fünf Chromosomen 6 zeigt sich eine „doppelte“
Translokation mit Material von Chromosom 13, sowohl 6q21, sowie 6p11
[[der(6)t(6;13)del(6p11)del(6q21)]]. Chromosom 7 liegt vier Mal vor, in zwei Metaphasen
findet sich bei 7q11 zum einen eine Translokation mit Material von Chromosom 4
[der(7)t(4;7)del(7q11)] (Metaphase 4), sowie eine Translokation mit Material von
Chromosom 11 [der(7)t(7;11)del(7q11)] (Metaphase 22). Chromosom 8 zeigt in acht
Metaphasen bei 8p21 eine Translokation mit Material vom Chromosom 21
[der(8)t(8;21)del(8p21)] (Metaphasen 4,7,8,9,13,17,18,22), in einer Metaphase liegt
Chromosom 8 diploid vor (Metaphase 1). Ein Chromosom 10 zeigt in allen Metaphasen
eine komplexe Translokation bei 10q11 mit Material von Chromosom 17 und daran eine
weitere Translokation mit Material von Chromosom 6 [der(10)t(6;10;17)del(10q11)]. In
zwei Metaphasen liegt Chromosom 10 diploid vor (Metaphasen 9;13), in 4 Metaphasen
fehlt Chromosomenmaterial jeweils im kurzen Arm von Chromosom 10 (Metaphasen
3;4;8;22). In allen Metaphasen finden sich zusätzlich ein bis zwei 11er
Markerchromosomen. Chromosom 12 liegt in einer Metaphase (1), Chromosom 14 in allen
Metaphasen und Chromosom 16 in einer Metaphase (9) diploid vor. Chromosom 13 liegt in
zwei Metaphasen (7;8) diploid, in allen anderen Metaphasen monoploid vor. Ein viertes
Chromosom 15 zeigt eine komplexe Translokation bei 15p11 mit Material von Chromosom
22 und daran eine weitere Translokation mit Material von Chromosom 19
[der(15)t(15;19;22)del(15p11)]. Ein viertes Chromosom 17 zeigt eine Translokation bei
17p11 mit Material von Chromosom 18 [der(17)t(17;18)del(17p11)]. Chromosom 18 liegt
in neun Metaphasen diploid vor, in einer Metaphase findet sich nur ein Chromosom 18
(Metaphase 18). Chromosom 19 liegt in allen Metaphasen zweifach, Chromosom 20 in
allen Metaphasen fünffach und Chromosom 21 dagegen einfach vor. Ein Chromosom 22
zeigt bei 22p11 eine Translokation mit Material von Chromosom 20
[der(22)t(20;22)del(22p11)]. Bei Chromosom Y findet sich eine „Doppel“-Translokation in
27
Ergebnisse
28
Ergebnisse
17 70,XXY,der(1)t(1;10)del(1p13),der(1)t(1;20)del(1p36.1), 3; 5; 6; 1; 8; 10;
der(3)del(3p13)del(3q13.2),+der(5)t(5;21)del(5p13),-6, 7; 11; 14; 18;
+[der(6)t(6;13)del(6p11)(6q21)]x3,+7,der(8)t(8;21)del(8p21), 13; 15; 21; 22
der(10)t(6;10;17)del(10q11),+der11(?),-13x2,-14, 17; 20
+der(15)t(15;19;22)del(15p11),+der(17)t(17;18)del(17p11),-18,-19,
+20x2,-21x2,der(22)t(20;22)del(22p11),
der(Y)t(3;Y)amp(Yp11.3)del(Yq11.221)
18 70,XXY,der(1)t(1;10)del(1p13),der(1)t(1;20)del(1p36.1), 3; 5; 6; 1; 8; 10;
der(3)del(3p13)del(3q13.2),+der(5)t(5;21)del(5p13),-6, 7; 11; 14; 18;
+[der(6)t(6;13) del(6p11)(6q21)]x3,+7,-8,+der(8)t(8;21)del(8p21), 13;15; 21; 22
der(10)t(6;10;17) del(10q11),+der11(?),-13x2,-14, 17; 20
+der(15)t(15;19;22)del(15p11),+der(17)t(17;18)del(17p11),-18x2,
-19,+ 20x2,-21x2,der(22)t(20;22)del(22p11),
der(Y)t(3;Y)amp(Yp11.3)del(Yq11.221)
22 70,XXY, der(1)t(1;10)del(1p13),der(1)t(1;20)del(1p36.1), 3; 5; 6; 1; 8; 10;
der(3)del(3p13)del(3q13.2),+der(5)t(5;21)del(5p13),-6, 7; 11; 14; 18;
+[der(6)t(6;13)del(6p11)(6q21)]x 3,+der(7)t(7;11)del(7q11), 13; 15; 21; 22
der(8)t(8;21) del(8p21),del(10p?),+der(10)t(6;10;17)del(10q11), 17; 20
+der11(?),-13x2,-14,+der(15)t(15;19;22)del(15p11),
+der(17)t(17;18)del(17p11),-18,-19,+der(19)t(15;19;22),+20x2,
-21x2,der(22)t(20;22)del(22p11),
der(Y)t(3;Y)amp(Yp11.3)del(Yq11.221)
Tab. 4 Spektrale Karyotypisierung von 10 Metaphasen (Colo-206F)
Zelllinien Lovo und NCOl-1 durchgeführt. Die in dieser Arbeit analysierten Zellen
entsprechen „Lovo“ und „NCOL-1b“ in der Tabelle 14. „NCOL-1a“ sind Zellen, die zum
Vergleich von einer anderen Arbeitsgruppe bezogen wurden. Die Genotypisierung der
Zelllinien NCOL-1a, -1b und Lovo zeigte identische Allele in 6 Loci (D16S359, D2S1338,
29
Ergebnisse
D8S1179, D21S11, D18S51, TH01) mit einer Genotyp-Frequenz von 0,000004587 und
zwei weiteren Loci identisch (FGA, SE33) mit einer kombinierten Genotyp-Frequenz von
Zelllinien NCOl-1a und -1b haben in zwei weiteren Loci identische Genotypen (D3S1358,
30
Ergebnisse
31
Ergebnisse
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Ergebnisse
33
Ergebnisse
Die Etablierung der Zelllinie sowie die Vorbereitung und Durchführung der Spektralen
Karyotypisierung erfolgte entsprechend dem im Methodenteil beschriebenen Verfahren.
Geki-4 wurde in Passage 17 abgestoppt und die Chromosomen in Pepsin für 30 Sekunden
vorbehandelt. Die Denaturierungszeit in Formalin betrug 4 Minuten, die Nachdenaturierung
1 Minute. Von Geki-4 konnten 6 Metaphasen mittels SKY analysiert und die
Chromosomen eindeutig zugeordnet werden. Der Karyotyp von Geki-4 weist
durchschnittlich einen triploiden Chromosomensatz auf. Bei drei Metaphasen liegt die
Chromosomenzahl bei 75, bei den weiteren drei analysierten Metaphasen jeweils bei 77, 73
sowie 71. Veränderungen finden sich in allen Metaphasen in den Chromosomen 1, 3, 7, 8,
9, 19, 20, 22 und X. Chromosom 1 liegt in zwei Metaphasen (12;16) dreimal, in vier
Metaphasen (11;14;15) viermal, in einer Metaphase (7) fünfmal vor. Alle Metaphasen
zeigen in einem Chromosom 1, zum einen bei 1p13 eine Translokation mit Material von
Chromosom 17, zum anderen fehlt Chromosomenmaterial ab 1q32
[der(1)[t(1;17)del)(1p13)][del(1q32)]]. In Metaphase 7 kann diese Translokation in zwei
Chromosomen 1 nachgewiesen werden. Chromosom 2 liegt in zwei Metaphasen (7;12)
viermal vor. In diesen zwei Metaphasen zeigt sich in einem Chromosom 2 bei 2q31 eine
Translokation mit Material von Chromosom 8 [der(2)t(2;8)del(2q31)]. Diese Translokation
[der(2)t(2;8)del(2q31)] liegt ebenfalls in Metaphase 16 vor. Chromosom 3 liegt in allen
Metaphasen vierfach vor. Chromosom 4 liegt in zwei Metaphasen (7;12) zweifach vor. In
zwei der vier Metaphasen (14;15) mit triploid vorliegendem Chromosom 4 findet sich eine
Translokation bei 4q27 [der(4)t(4;6)del(4q27)] und eine Metaphase mit Translokation bei
4q13 mit Material von Chromosom 6 [der(4)t(4;6)del(4q13)] (Metaphase 11). Chromosom
5 liegt in drei Metaphasen (11;14;15), Chromosom 6 liegt in einer Metaphase (16) vierfach
vor. In fünf Metaphasen findet sich ein viertes Chromosom 7 mit fehlendem
Chromosomenmaterial ab 7q11.2 (Metaphasen 11;12;14;15;16). Diese strukturelle
Veränderung zeigt sich ebenfalls bei einem dritten Chromosom 7 in Metaphase 7 mit zwei
unauffälligen Chromosomen 7. Chromosom 8 liegt in den Metaphasen 14 und 15 je
zweimal, in den Metaphasen 12 und 16 je dreimal, in Metaphase 11 viermal und in
Metaphase 7 fünffach vor. In allen Metaphasen findet sich ein iso-Chromosom 8, wobei in
allen Metaphasen die kurzen Arme fehlen und die langen Arme am Zentromer
zusammenhängen. In Metaphase 7 zeigt sich zudem in zwei Chromosomen 8
Materialverlust im langen Arm, in Metaphase 12 findet sich diese Veränderung bei einem
Chromosom 8. Eine genaue Angabe bzgl. der Höhe des Verlustes lässt sich aufgrund der
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35
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Ergebnisse
22 und es zeigt sich im langen Arm von Chromosom 10 eine Amplifikation. Eine exakte
Angabe der Lokalisation im langen Arm von Chromosom 10 ist wegen der schlechten G-
Bänderung in der DAPI-Färbung nicht möglich. Eine weitere Amplifikation zeigt sich im
langen Arm von Chromosom 7 (Metaphase 18) bei einer Chromosomenzahl 46. Auch dabei
ist die genau Lokalisation aufgrund der unscharfen G-Bänderung nicht möglich. Zwei
Metaphasen (16;20) zeigen in Chromosom 19 eine Translokation mit Material von
Chromosom 10 bei 19q13.3 [der(19)t(10;19)del(19q13.3)] und in Chromosom 10 eine
Deletion ab 10q24. In Metaphase 20 fehlt zudem ein Chromosom 13.
Die Karyotypen jeder Metaphase sind in Tabelle 10 und Abb.9 aufgeführt.
11 44,XX,amp10(q?),-14,-22 10 14; 22
16 46,XX,del 10(q24), ÷ 10; 19
der(19)t(10;19)del(19q13.3)
18 46XX,amp(7q?) 7 ÷
20 45,XX,del 10(q24),-13, ÷ 10; 13; 19
der(19)t(10;19)del(19q13.3)
39
Ergebnisse
Die Zelllinien Geki-2 und -5 sind mit hoher Wahrscheinlichkeit gleichen Ursprungs, d. h.
entstammen der gleichen Zelllinie. Unterschiede in einzelnen Genorten (z.B. in FGA)
beruhen dabei wohl auf unabhängige Mutationsereignisse bei verschiedenen Zellklonen. Da
bei Geki-5 teilweise vier Allele pro Locus (z.B. in vWA) gefunden werden, handelt es sich
dabei möglicherweise um Mischpopulationen mit unterschiedlichem Mutationsstatus.
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Diskussion
4 Diskussion
41
Diskussion
Zelllinien NCOl-1a und -1b haben in zwei weiteren Loci identische Genotypen (D3S1358,
vWA) und in zwei anderen Loci (D3S1358, D3S1358) keine Übereinstimmung. Diese
Differenzen scheinen das Resultat einer Mutation (z.B. D3S1358, VWA) oder eines
heterozygoten Verlustes (D8S1179) zu sein, der bei Zelllinien auftreten kann, die aus
Malignomen etabliert wurden, vor allem da es sich hier um einen mikrosatelliteninstabilen
Tumor handelt.
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Diskussion
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Diskussion
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Diskussion
Analyse von Kolonkarzinomen, aber auch mit den Ergebnissen in einigen späten
Adenomen (Bomme et al., 1998). Dabei sind die Veränderungen bei kommerziellen und
selbstetablierten Kolonkarzinomzelllinien sehr ähnlich. Die kommerziellen Linien sind
bereits seit Jahren in Kultur, ohne dass die Kulturbedingungen zu einer spontanen
Progression der chromosomalen Instabilität führen. Ein möglicher Grund dafür ist, dass die
chromosomale Instabilität in vivo als Anpassungsmechanismus der Tumorzelle dienen
kann, um auf äußere Einflüsse (z.B. Chemotherapie) reagieren zu können, so dass eine
Zunahme der chromosomalen Instabilität in vivo als Produkt von
Selektionierungsprozessen gesehen werden kann.
45
Zusammenfassung
5 Zusammenfassung
46
Zusammenfassung
47
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53
Anhang
7 Anhang
54
Anhang
7.2 Veröffentlichungen
Abstracts/ Posterpreise:
1.) Maisch S., Scheppach W., Melcher R. (2002) Etablierung und zytogenetische
Charakterisierung von Kolonadenom- und Kolonkarzinomzelllinien.
(Promomed-Kongress Würzburg: 2. Posterpreis Würzburg 2002)
Artikel:
1.) Melcher R, Maisch S, Koehler S, Bauer M, Steinlein C, Schmid M, Kudlich T, Schauber
J, Luehrs H, Menzel T, Scheppach W (2005) SKY and genetic fingerprinting revealed a
cross contamination of the putative normal colon epithelial cell line NCOL-1. Cancer Genet
Cytogenet 158: 84-87
55
Anhang
Allolio, Angermann, Asan, Bauer, Bauersachs, Becker, Beckmann, Blattert, Blind, Böck,
Bröcker, Claßen, Collmann, Csef, Darge, Debus, Dietl, Dietz, Drenckhahn, Einsele, Elert,
Ertl, Eulert, Faller, Fallgatter, Fein, Flentje, Franke, Freys, Friedl, Frosch, Fuchs, Galle,
Gassel, Geckle, Gerlach, Girschick, Gohlke, Grehn, Grimm, Guttenbach, Hahn,
Hamelmann, Hamm, Hebestreit, Helms, Höcht, Höhn, Illert, Jahns, Jenett, Karschin, Keil,
Keller, Kellersmann, Klinker, Kneitz, Koepsell, Krämer, Kraus, Kugler, Lang,
Langenfeld, Larena-Avellaneda, Lesch, Lohse, Lüdinghausen, Lührs, Lutz, Mäurer, Marx,
Matthies, Menzel, Meyer, Müller, Müller-Hermelink, Müllges, Patzelt, Reiners K., Reiners
C., Reith, Rieckmann, Riedmiller, Roewer, Roggendorf, Roosen, Sailer, Schartl,
Scheppach, Scheurlen, Schindler, Schlegel, Schmidt, Schmied, Schneider, Sebald, Sefrin,
Seufert, Silbernagel, Sörensen, Solymosi, Sommer, Speer, Sprotte, Steffens, Stöber, Stoll,
Straßburg, Strotmann, Sütterlin, Thiede, Tony, Timmermann, Toyka, Völker, Vogel,
Wagner, Wahrmut-Metz, Waller, Walter, Wanner, Warnke, Weckbach, Wilms, Woydt
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Anhang
Ehrenwörtliche Erklärung
Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die in dem Fachbereich Humanmedizin Würzburg zur
Promotionsprüfung eingereichte Arbeit mit dem Titel „Etablierung und zytogenetische
Charakterisierung von primären Kolonadenom- und Kolonkarzinomzelllinien“ an der
Medizinischen Klinik und Poliklinik II, Schwerpunkt Gastroenterologie, unter der Leitung
von Prof. Dr. med. W. Scheppach und später Prof. Dr. med. M. Scheurlen ohne sonstige
Hilfe selbst durchgeführt und bei der Abfassung der Arbeit keine anderen als in der
Dissertation angeführten Hilfsmittel benutzt habe.
Ich habe bisher an keinem in- und ausländischen Medizinischen Fachbereich ein Gesuch
zur Zulassung zur Promotion eingereicht noch die vorliegende oder eine andere Arbeit als
Dissertation vorlegt.
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Anhang
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich allen danken, die mir mein Studium und die Vollendung
meiner Promotion ermöglichten.
Mein besonderer Dank gilt Dr. med. Ralph Melcher für die Bereitstellung des interessanten
Themas und für die fachliche Betreuung meiner Arbeit über den gesamten Zeitraum, sowie
seiner stetigen Ansprechbarkeit in den jeweiligen Labors an beiden Instituten. Dank seiner
konstruktiven Kritik, seinen Anregungen, seiner motivierenden Persönlichkeit und
Bereitschaft, die erzielten Ergebnisse, Erfolge und so manchen Rückschlag immer wieder
zu diskutieren und ggf. mit neuen Ideen auszubauen entstand die Arbeit in dieser Form.
Ich danke Prof. Dr. med Scheppach, sowie Prof. Dr. med. M. Scheurlen in der
Medizinischen Klinik II, Schwerpunkt Gastroenterologie, für die Möglichkeit, an ihrem
Labor mitarbeiten und einen großen Teil der Arbeit, insbesondere die Zellkultur,
durchzuführen zu dürfen.
In diesem Zusammenhang möchte ich mich bei dem gesamten Team des „Gastrolabors“
bedanken für die stete Hilfe, die vielen Tipps und Hilfestellungen, gerade am Beginn der
Arbeit und für das stets angenehme und oft lustige Arbeitsklima. Insbesondere erwähnen
hierbei möchte ich Gerda Dusel, die meine Zellkulturen stets mit Sorgfalt und Liebe
versorgte.
Ich danke Prof. Dr. rer. biol. hum. M. Schmid am Humangenetischen Institut, in dessen
Labor ich einen großen Teil meiner Arbeit verbrachte zur zytogenetischen
Charakterisierung der Tumorzellen und zur Ausarbeitung meiner Ergebnisse.
Danke v.a. Claus Steinlein für seine große Hilfe, stete freundliche Hilfsbereitschaft, seinen
Tipps und seiner großen Erfahrung.
Danke dem gesamten Team im Humangenetischen Labor für die stets nette, angenehme
und gute Stimmung, weit über die Laborarbeit hinaus.
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Anhang
Auch möchte ich mich bei all denen bedanken, die hier nicht namentlich erwähnt wurden,
die mir aber in irgendeiner Weise behilflich waren, sei es auch durch motivierende Worte.
Ganz besonders danke ich natürlich meinen Eltern für Ihre Geduld und permanente
Unterstützung.
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Lebenslauf
Persönliche Daten
Name Stefanie Maria Maisch
Geburtsdatum 09.03.1976
Geburtsort Bad Neustadt a.d. Saale
Schulausbildung
1982-1986 Grundschule Nordheim v.d. Rhön
1986-1996 Martin Pollich - Gymnasium; Mellrichstadt
Abschluss der Allgemeinen Hochschulreife
Berufsausbildung
1996-1999 Ausbildung zur Kinderkrankenschwester
Abschluss Examen Kinderkrankenpflege
Hochschulausbildung
WS 1999/2000 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin an der
Julius-Maximilian-Universität Würzburg
Prüfungen
30.08.2001 Ärztliche Vorprüfung
26.10.2005 Ärztliche Prüfung
Promotion
Seit 1.10.2002 Prof. Dr. med. W. Scheppach/
Prof. Dr. med. M. Scheurlen
Betreuer: Dr. med. R. Melcher
Schwerpunkt Gastroenterologie
Medizinische Klinik und Poliklinik II der Universität
Würzburg
Berufliche Tätigkeit
Assistenzärztin
01.12.2005 – Prof. Dr. M. Sailer; Chirurgische Klinik
30.11.2007 Bethesda AK Bergedorf; Hamburg
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