Sie sind auf Seite 1von 65

Zusammenfassung

Aus der Medizinschen Klinik und Poliklinik II der Universität Würzburg

Direktor: Professor Dr. med. Hermann Einsele

Etablierung und spektrale Karyotypisierung von primären


Kolonadenom– und Kolonkarzinomzelllinien

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde der

Medizinischen Fakultät der

Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von

Stefanie Maria Maisch


aus Sülzfeld

Würzburg, Juli 2008

46
Referent: Prof. Dr. med. M. Scheurlen

Koreferent: Priv. Doz. Dr. med. B. Illert

Dekan: Prof. Dr. med. M. Frosch

Tag der mündlichen Prüfung: 14. November 2008

Die Promovendin ist Ärztin

2
Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1
1.1 Das kolorektale Karzinom 1
1.2 Kolonkarzinogenese 1
1.2.1 Mutatorgene und Mikrosatelliteninstabilität 1
1.2.2 Tumorsuppressorgene, Onkogene und chromosomale Instabilität 2
1.2.3 Zytogenetische Veränderungen beim Kolonkarzinom 3
1.3 Zellkulturmodelle des Kolonkarzinoms 4
1.4 Zielsetzungen der Arbeit 5

2 Material und Methoden 6

2.1 Material 6
2.1.1 Geräte 6
2.1.2 Zellkultur 6
2.1.3 Chemikalien 7
2.1.4 Zellkulturmedien- primäre Zellkultur sowie Zelllinie NCOL-1b 8
2.1.5 Zellkulturmedien- Zelllinie Colo 206F und Colo 678 9
2.1.6 Chromsomenaufarbeitung 9
2.1.7 Hybridisierung der Chromosomen 10
2.1.8 SkyView-System 12
2.1.9 Software 12

2.2 Methoden 13
2.2.1 Zellkultur (primär/ kommerziell) 13
2.2.1.1 Herstellung einer Zellsuspension aus dem Primärtumor 13
2.2.1.2 Gewinnung der Kolonepithelzellen mittels Percoll-Gradient 13
2.2.1.3 Zellzahlbestimmung 14
2.2.1.4 Aussaat der Zellen 14
2.2.1.5 Subkultivierung 14
2.2.2 Zytogenetische Charakterisierung 14
2.2.2.1 Hypotone Behandlung und Fixierung 14
2.2.2.2 Auftropfen 15
2.2.2.3 Pepsinvorbehandlung 15

3
Inhaltsverzeichnis

2.2.2.4 Formaldehyd-Vorbehandlung 16
2.2.2.5 Denaturierung 16
2.2.2.6 Hybridisierung 16
2.2.2.7 Nachweis 17
2.2.2.8 Spektrale Karyotypisierung (Garini et al. 1996) 18
2.2.3 Genotypisierung 19

3 Ergebnisse 20

3.1 Spektrale Karyotypisierung von Zelllinien der 20


Adenom-Karzinom-Sequenz
3.1.1 Kolonepithelzelllinie NCOL-1b 20
3.1.2 Kolonkarzinomzelllinie Lovo 22
3.1.3 Kolonkarzinomzelllinie Colo-678 23
3.1.4 Kolonkarzinomzelllinie Colo-206F 26
3.1.5 Fingerprinting-Analyse der Zelllinien NCOL-1b und Lovo 29

3.2 Etablierung und spektrale Karyotypisierung von primären 31


Kolonadenom- und Kolonkarzinomzelllinien
3.2.1 Kolonadenomzelllinie Geki-2 31
3.2.2 Kolonkarzinomzelllinie Geki-3 32
3.2.3 Kolonkarzinomzelllinie Geki-4 33
3.2.4 Kolonkarzinomzelllinie Geki-5 36
3.2.4.1 Geki-5 Passage 6 37
3.2.4.2 Geki-5 Passage 36 38
3.3 Fingerprinting-Analyse der Zelllinien Geki-2-5 40

4 Diskussion 41

4.1 Zellkulturmodelle der Adenom-Karzinom-Sequenz 41


4.2 Mikrosatellitenstabile und –instabile Kolonkarzinomzelllinien 42
4.3 Charakterisierung kommerzieller und selbstetablierter Zelllinien 43
4.3.1 Kreuzkontamination als Problematik bei der Etablierung eigener 43
Zelllinien

4
Inhaltsverzeichnis

4.3.2 Chromosomale Veränderungen bei kommerziellen und selbstetablierten 44


Zelllinien

5 Zusammenfassung 46

6 Literaturverzeichnis 48

7. Anhang 54
7.1 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 54
7.2 Veröffentlichungen 55
7.3 Verzeichnis der akademischen Lehrer 56

Ehrenwörtliche Erklärung
Danksagung
Lebenslauf

5
Einleitung

1 Einleitung

1.1 Das kolorektale Karzinom (Übersicht bei Weitz et al., 2005)


Das kolorektale Karzinom (CRC) ist eine der häufigsten malignen Erkrankungen in
Deutschland. Mit einer Inzidenz von circa 50.000 Neuerkrankungen pro Jahr macht es etwa
ein Drittel aller Krebserkrankungen aus und stellt sowohl für Frauen als auch für Männer
die zweithäufigste Krebstodesursache dar. Das kolorektale Karzinom betrifft insbesondere
Menschen in höherem Lebensalter. Der Altersgipfel der Erkrankung liegt etwa zwischen
dem 60. und 70. Lebensjahr, ab dem 40.Lebensjahr verdoppeln sich die Inzidenzraten von
Dekade zu Dekade. Etwa 70 % der Darmkrebserkrankungen werden zwischen dem 50. und
80. Lebensjahr festgestellt und 90 % der kolorektalen Karzinome entwickeln sich aus
benignen adenomatösen Polypen. Obwohl den Ernährungs- und Lebensgewohnheiten
(fettreiche, cholesterinreiche und ballaststoffarme Ernährung) bei der Entstehung von
Krebserkrankungen des Magen-Darm-Traktes eine sehr große Bedeutung zugeschrieben
werden, geht man davon aus, dass etwa 5 bis 10 % der Erkrankungen aufgrund einer
erblichen Veranlagung auftreten. Bisher sind zwei Formen des erblichen Kolonkarzinoms
bekannt, das hereditäre nicht polypöse Kolonkarzinom (HNPCC) und die familiäre
adenomatöse Polyposis (FAP). Bei beiden liegt ein autosomal dominanter Erbgang vor.

1.2 Kolonkarzinogenese
Derzeit existieren zwei Modelle zur Genese kolorektaler Karzinome, die offenbar entweder
zu einer erhöhten Bereitschaft zum Erwerb sekundärer Mutationen oder zu einer
schnelleren Akquirierung von genetischen Veränderungen führen können. Neben dem
Suppressor-Mechanismus, der auf einer chromosomalen Instabilität beruht und eine
Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen und Aktivierung von Onkogenen zur Folge hat
(85 % der sporadischen kolorektalen Karzinome), gibt es den Mutator-Mechanismus, bei
dem eine DNA-Instabilität für die Karzinomentwicklung und -progression entscheidend ist
(15 % der sporadischen kolorektalen Karzinome).

1.2.1 Mutatorgene und Mikrosatelliteninstabilität


Die Aktivierung des Mutator-Mechanismus erfolgt über eine initiale Inaktivierung eines
oder mehrerer Enzyme, die für die Reparatur von DNA-Schäden verantwortlich sind

1
Einleitung

(„Mutatorgene“). Dies ermöglicht die Mutation weiterer Gene und somit die Entstehung
des kolorektalen Karzinoms (und weiterer Tumore). Dieser Mechanismus wurde zuerst
beim hereditären, nicht polypösen Kolonkarzinom (HNPCC) beschrieben (Aaltonen et. al
1993), dem eine autosomal dominant vererbte Mutation eines für ein Reparaturenzym
kodierenden Gens zugrunde liegt. Eine indirekte Nachweismethode für das Vorliegen des
Mutator-Mechanismus ist eine fehlerhafte Replikation repetitiver Sequenzen im
Tumorgenom, die als Mikrosatelliteninstabilität bezeichnet wird. Eine Untersuchung von
sporadischen Kolonkarzinomen auf Mikrosatelliteninstabilität ist von Bedeutung, weil
gezeigt werden konnte, dass ca. 15 % der nicht erblichen kolorektalen Karzinome ebenfalls
durch den Mutator-Mechanismus entstehen, und dass diese Karzinome nur wenig allelische
Verluste aufweisen. Die unterschiedlichen molekularen Entstehungsmechanismen der
kolorektalen Karzinome spiegeln sich auch in einem unterschiedlichen Phänotyp wieder.
Die mikrosatelliteninstabilen Karzinome wachsen schneller und haben eine andere
Lokalisation (proximales Kolon) bzw. Differenzierung als mikrosatellitenstabile Karzinome
(distales Kolon).

1.2.2 Tumorsuppressorgene, Onkogene und chromosomale


Instabilität
Eine chromosomale Instabilität kann früh in der Kolonkarzinogenese beobachtet werden
(Shih et al., 2001) und führt durch Amplifikation und Deletion chromosomaler Bereiche
und der daraus resultierenden Onkogenaktivierung und Tumorsuppressorgeninaktivierung
zu einer schnelleren Tumorprogression. Zur Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen ist
allerdings die Inaktivierung beider Allele notwendig. Nach der Knudson-Hypothese
(Knudson, 1971) kommt es zuerst zu einer Mutation in einem Allel eines
Tumorsuppressorgens und danach zur Deletion des zweiten Allels („two-hit hypothesis“).
Der Nachweis einer chromosomalen Region, die häufig beim kolorektalen Karzinom
deletiert ist, entspricht somit einem indirekten Hinweis auf ein Tumorsuppressorgen, das
sich in dieser Region befindet. Im Jahr 1988 führte die Gruppe um Vogelstein eine
Untersuchung aller nicht akrozentrischen Chromosomen auf das Vorliegen allelischer
Verluste (LOH´s) durch und konnte 5q, 17p und 18q als besonders häufig deletierte
Regionen in kolorektalen Tumoren identifizieren. Dabei konnten 5q-Deletionen bereits bei
Adenomen gefunden werden, während 17p und 18q-Verluste meist erst beim Übergang von
frühen zu fortgeschrittenen Karzinomen auftraten (Adenom-Karzinom-Sequenz). Den im

2
Einleitung

Kolonkarzinom häufig deletierten Regionen 5q und 17p konnten 1990 die


Tumorsuppressorgene APC und p53 zugeordnet werden (Fearon und Vogelstein, 1990). Im
Bereich von 18q wurden drei Kandidatengene gefunden (DCC/ Smad2/ DPC4) (Fearon und
Vogelstein, 1990; Eppert et al., 1996, Hahn et al., 1996). In den folgenden Jahren konnten
aufgrund der größeren Anzahl polymorpher Marker die Regionen 1p32-36, 2p21-16, 3p23,
4p14-16, 8p21-22, 11q22-23, 14q32 und 22q13 ebenfalls als häufig deletierte Regionen in
kolorektalen Adenomen/ Karzinomen identifiziert werden (Praml et al., 1995; Bisgaard et
al., 2001; Iniesta et al., 2000; Arribas et al., 1999; Gustafson et al., 1996; Tomlinson und
Bodmer, 1996; Young et al., 1993; Yana et al., 1995). Der Verlust der Region 8p, 14q32
und 22q wird eher bei fortgeschrittenen Karzinomen, der Verlust 11q22-q32 bei
Karzinomen in früheren Stadien und von 1p35 bereits bei Adenomen beobachtet.
(Cunningham et al. 1994; Young et al., 1993; Lee et al., 2000; Lothe et al., 1995). Daher ist
die Adenom-Karzinom-Sequenz als weit komplexer anzusehen als von Fearon und
Vogelstein dargestellt. Obwohl einige Kandidatengene in diesen neu identifizierten
Regionen untersucht wurden, konnte dort bislang kein weiteres für die Kolonkarzinogenese
relevantes Tumorsuppressorgen gefunden werden.

1.2.3 Zytogenetische Veränderungen bei Kolonkarzinom


Die Identifizierung chromosomaler Alterationen erfolgte beim Kolonkarzinom bislang in
erster Linie durch klassische Bänderungstechniken. Der niedrige mitotische Index, eine oft
minderwertige Qualität der Metaphase-Chromosomen und die oft komplexen
chromosomalen Veränderungen schränken die Möglichkeiten der Analyse deutlich ein, so
dass eine vollständige Karyotypisierung oft nicht möglich ist. Trotzdem wurden in den
letzten Jahren etliche Kolonkarzinome zytogenetisch untersucht. Viele
Markerchromosomen blieben dabei nicht klassifiziert. Mertens et al. fassten die Ergebnisse
mehrerer Studien zusammen und konnten so die (erkannten) chromosomalen
Veränderungen von 333 Kolonkarzinomen beschreiben (Mertens et al. 1997). Im Gegensatz
zu hämatologischen Tumoren, bei denen es oft zu balancierten Translokationen kommt, die
zu einer Deregulation von Onkogenen oder zu der Entstehung rekombinanter Gene führen,
ist die Tumorgenese solider Tumoren hauptsächlich durch die Kombination von Deletionen
und Amplifikationen von multiplen chromosomalen Segmenten charakterisiert. Beim
kolorektalen Karzinom kommt es häufig zu Amplifikationen der Chromosomen 7, 8q, 13q,
20q und zu Deletionen von 1p, 5q, 8p, 14p, 17p, 18 und Y. Die betroffenen Bereiche

3
Einleitung

enthalten mit großer Wahrscheinlichkeit Tumorsuppressorgene (bei Deletionen) und


Onkogene (bei Amplifikationen). Neuere zytogenetische Analysen wie die spektrale
Karyotypisierung (SKY) ermöglichen eine genauere Analyse der komplexen
chromosomalen Änderungen bei Tumoren des Suppressor-Typs. SKY ermöglicht die
gleichzeitige Darstellung aller Chromosomen in unterschiedlichen Farben, wodurch auch
kleinste chromosomale Aberrationen sichtbar werden (Schröck et al., 1996). Durch
Analysen von Kolonkarzinomzelllinien mit SKY konnten bereits etliche neue
chromosomale Markerchromosomen identifiziert werden. Die Analyse von primären
Tumoren ist von großem Interesse, da Zelllinien oft bereits lange Zeit in Kultur sind, nur
einen Klon repräsentieren und multiple Zellkulturartefakte enthalten. Leider ist die
Darstellung von Metaphasen in primären Tumoren schwierig und es existieren bislang
kaum entsprechende Studien.

1.3 Zellkulturmodelle des Kolonkarzinoms


Da die in-vitro Kultivierung von epithelialen Tumorzellen schwierig ist, und die
Metaphasengewinnung an primärem Material nicht in ausreichender Menge und Qualität
möglich ist, wurden in der Vergangenheit meist kommerzielle Kolonkarzinomzelllinien für
zytogenetische Studien zum Kolonkarzinom verwendet (Whitehead und Watson, 1997).
Das Problem dieser Karzinomzellkulturmodelle ergibt sich gleichzeitig aus deren Vorteil,
der langen Kultivierbarkeit und stetigen Verfügbarkeit. Diese Karzinomzellen befinden sich
seit langem in Kultur, so dass während der langen Kultivierung die Vergleichbarkeit zum
Primärtumor durch die Akkumulation von sekundären Mutationen, Kulturartefakten und
klonale Selektion nicht mehr gegeben ist. Durch die Nachteile der kommerziell
erwerbbaren Karzinomzelllinien, ist es das Ziel, trotz der Schwierigkeit der Etablierung
neuer Zelllinien, aus frischem Gewebe von Kolon- und Rektumresektaten primäre
Karzinomzelllinien zu etablieren und daran weitere Studien durchzuführen, um möglichst
nahe bei der in-vitro-Forschung mit Zellkulturmodellen am in-vivo-Geschehen bleiben zu
können. Um optimale zytogenetische Studien zur Adenom-Karzinom-Sequenz durchführen
zu können, wäre es von großem Vorteil, zusätzlich den Karyotyp von normalen
unveränderten Enterozyten und Adenomen ebenfalls darzustellen. Bislang war es allerdings
nicht möglich, aus normaler Darmmukosa und Adenomen etablierte Zelllinien zu erwerben
(Melcher et al., 2005).

4
Einleitung

1.4 Zielsetzungen der Arbeit

Im Rahmen dieser Arbeit soll eine zytogenetische Charakterisierung von Zelllinien aus
normalem Kolonepithel (NCOL-1), aus einem Adenom (Geki-2) und aus kolorektalen
Karzinomzelllinien (Lovo, Colo-678, Colo-206F) durchgeführt werden. Damit soll ein
(zytogenetisch) gut charakterisiertes Modell der Adenom-Karzinom-Sequenz etabliert
werden. Da die meisten verfügbaren Kolonkarzinomzelllinien schon sehr lange in Kultur
sind und Kulturartefakte aufweisen, sollen weiterhin möglichst viele primäre kolorektale
Karzinomzelllinien etabliert und charakterisiert werden. Dazu wird eine bereits im Rahmen
eines IZKF-Projektes aufgebaute Transportlogistik genutzt. Das Nativmaterial wird direkt
aus dem Operationssaal in das Institut für Pathologie transportiert, dort histologisch
charakterisiert, zugeschnitten und dem gastroenterologischen Labor zur Verfügung gestellt.
Nach einer erfolgreichen in-vitro Kultivierung der Karzinomzellen wird in Ergänzung zur
spektralen Karyotypisierung eine Analyse mit mehreren hochpolymorphen
Mikrosatellitenmarkern („genetischer Fingerabdruck“) durchgeführt. Anschließend werden
die Ergebnisse miteinander und mit den Veränderungen kommerziell erhältlicher
Kolonkarzinomzelllinien verglichen.

5
Material und Methoden

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Geräte

Analysenwaage Mettler, Toledo (Schweiz)


Brutschrank „Hera cell“ Kedro, Osterode
Feuchtkammer (Edelstahlkästchen zum Roth, Karlsruhe
Sterilisieren von Instrumenten 10 x 20 cm
mit saugfähigem Papiervlies ausgelegt)
Kühlschrank Liebherr
Mediumschüttler "Certomat" B. Braun Biotech International
Mikroskop – „Axioskop“ Zeiss, Göttingen
Mikroskop – „Axiophot“ Zeiss, Göttingen
Schüttelwasserbad GFL, Burgwedel
Sterilwerkbank „HeraSafe“ Kedro, Osterode
Tiefkühltruhe –20° C Bosch
Wasserbad GFL, Burgwedel
Vortexer Bender
Zentrifuge „Laborfuge“ Kedro Osterode

2.1.2 Zellkultur

Kulturflaschen 75 ml Corning New York (USA)

Kulturflaschen 50 ml Nunc™ (Dänemark)

6er-Loch-Platte (Collagenbeschichtet) Becton-Dickinson Bedford (UK)


Pipetten (2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) Corning New York (USA)
Reaktionsgefäß 50 ml Greiner bio-one, Nürtingen
Zellschaber Greiner bio-one, Nürtingen
Zellsieb 100 µm Silicon Becton Dickonson Labware, Franklin
Lakes (USA)

6
Material und Methoden

2.1.3 Chemikalien

20 x SSC Sigma, Deisenhofen


Anti-Fade DAPI reagent Migdal Ha’Emek, Israel
Chromschwefelsäure Merck GmbH, Darmstadt
Colzemid Gibco™, Eggenstein
DAPI Serva; Heidelberg
DMEM/Hepes/Glutamine Gibco™, Eggenstein
Dulbecco’s modified Eagle’s medium mit Gibco™, Eggenstein
L-Glutamine
Essentielle Aminosäuren Gibco™, Eggenstein
Essigsäure Rotipuran 100 % Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Ethanol Rotipuran > 99;9 % Roth GmbH & Co, Karlsruhe
FCS 10 % GibcoBRL, Eggenstein
Formaldehyd 37 % Sigma, Deisenhofen
Formamide Fluca Chemie AG, Buchs(Schweiz)
Fungizone 0,6 µg/ ml Gibco™, Eggenstein
Gentamycin 50 mg/ ml Gibco™, Eggenstein
Hanks-Lsg Biochrom
Humanes recombinantes EGF(1nM/ ml) Promega, Madison (USA)
Kaliumchlorid Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Kollagenase Typ I Mettler, Toledo (Schweiz)
Methanol Mallinckrodt Baker; Deventer(Holland)
MITO™ Serum Extender Becton Dickinson Labware, Belford
(USA)
Natriumchlorid Merck GmbH, Darmstadt
PBS Gibco™, Eggenstein
Penicillin200 U/ml Gibco™, Eggenstein

Streptomycin 250 pg/ml


Percoll Pharmacia
RPMI 1640 Gibco™, Eggenstein

7
Material und Methoden

Salzsäure 1M Applichem, Darmstadt


TGF-α Gibco BRL, Eggenstein
Trypanblau Gibco™, Eggenstein
Trypsin-EDTA mit Ca2+ und Mg2+ Gibco™, Eggenstein
Tween 20 AppliChem GmbH, Darmstadt
Vectashield with DAPI Vector Laboratoris, Burlingame (USA)
Vitamine Gibco™, Eggenstein

2.1.4 Zellkulturmedien- primäre Zellkultur sowie Zelllinie NCOL-1b

Kulturmedium (serumfrei) – 100 ml

DMEM mit Glutamin 96,5 ml


Fungizone 0,6 µg/ ml 0,24 ml
Gentamycin 125 pg/ ml 1,25 ml
Penicillin 200 U/ml; Streptomycin 2 ml
250 pg/ml

Kulturmedium (mit Serum) – 100 ml

DMEM mit Glutamin 86,51 ml


Gentamycin 125pg/ ml 1,25 ml
FCS 10 % 10 ml
Fungizone 0,6 µg/ml 0,24 ml
Penicillin 200 U/ml; Streptomycin 2 ml
250 pg/ml

Finalmedium- 100 ml
Dulbecco’s modified Eagle’s medium mit 84,4 ml
L-Glutamine

8
Material und Methoden

Ess. Aminosäuren 1 % 1 ml
FCS 10 % 10 ml
Fungizone 0,6 µg/ml 240 ml
Gentamycin 15 pg/ml 1,25 ml
Humanes recombinantes EGF(1 nM/ml) 20 ml
MEM-Vitamine 1 % 1 ml
Mito™ Serum Extender 100 ml
Penicillin 200U/ ml; Streptomycin 2 ml
250 pg/ml
TGF-α 5 ml

Percoll-Lösung – 40 ml
Hanks-Lösung 1 Teil - 4 ml
NaOH (0,1N) 0,4 Teile - 1600 ml
Percoll 9 Teile - 36 ml

2.1.5 Zellkulturmedien- Zelllinie Colo 206F und Colo 678

Medium
RPMI 1640 450 ml (90 %)
FCS 10 % 50 ml (10 %)

2.1.6 Chromsomenaufarbeitung

Fixativ (Carnoy’s) – 100 ml (Lagerung bei -20° C)

Essigsäure 100 % 25 ml (1 Teil)


Methanol 100 % 75 ml (3 Teile)

9
Material und Methoden

Lösungen für die Vorbehandlung:

1xPBS/MgCl2: 100 ml

MgCl2 1M 5 ml
1x PBS 95 ml

1 % Formaldehyd-Lösung

Formaldehyd 37 %ig 2,7 ml


1xPBS/MgCl2 100 ml

Alkoholreihen -100 ml:

Ethanol 100 % Aqua dest.


70 %ige Lösung 70 ml 30 ml
80 %ige Lösung 80 ml 20 ml
90 %ige Lösung 90 ml 10 ml
100 %ige Lösung 100 ml ÷

2.1.7 Hybridisierung der Chromosomen

Denaturierungslösung -100 ml:

Aqua dest. 20 ml
Formamide 70 ml
20xSSC 10 ml

+ HCl 1M, bis pH = 7,0

10
Material und Methoden

Alkoholreihen - 100 ml (eisgekühlt)

Ethanol 100 % Aqua dest.


70 %ige Lösung 70 ml 30 ml
80 %ige Lösung 80 ml 20 ml
90 %ige Lösung 90 ml 10 ml
100 %ige Lösung 100 ml ÷

Waschlösungen für Nachweis:

Waschlösung I: - 300 ml

Aqua dest. 120 ml


Formamide 150 ml
20 x SSC 30 ml

+ HCl 1M, bis pH = 7,0

Waschlösung II : 1x SSC – 500 ml


Aqua dest. 475 ml
20 x SSC 25 ml

+ HCl 1M, bis pH = 7,0

Waschlösung III : 1000 ml


Aqua dest. 800 ml
20xSSC 200 ml
Tween 20 1 ml

+ HCl 1M, bis pH = 7,0

11
Material und Methoden

Kits und Antikörper:

Antikörper 3: Cy5 Staining reagent Migdal Ha’Emek, Israel


Antikörper 4: Cy5.5 reagent Migdal Ha’Emek, Israel
Blocking reagent Migdal Ha’Emek, Israel
SkyPaintTMKit H-10 Migdal Ha’Emek, Israel

2.1.8 SkyView-System

Spectra Cube SD-200 Applied Spectral Imaging; Migdal Ha’Emek;


Israel

2.1.9 Software

Auswertprogramm:

SkyView Version 1.6.1 Applied Spectral Imaging; Migdal

Ha’Emek; Israel

Aufnahmeprogramm:

SkyImaging 2.5 Applied Spectral Imaging; Migdal


Ha’Emek, Israel

12
Material und Methoden

2.2 Methoden

2.2.1 Zellkultur (primär/ kommerziell)

2.2.1.1 Herstellung einer Zellsuspension aus dem Primärtumor


Mit einem sterilen Skalpell wird das Tumorgewebe auf einer sterilen Glasplatte zerkleinert
und in ein mit etwa 30 ml PBS gefülltes 50 ml-Plastik-Gefäß gegeben. Auf einer sterilen
Glasplatte wird mit einem weiteren sterilen Skalpell die Mukosa von der darunter liegenden
Lamina muscularis mucosae vorsichtig abgestreift und ebenfalls in ein mit 30 ml PBS (mit
Magnesium und Calciumzusatz) gefülltes 50 ml-Plastik-Tube gegeben. Beide Gefäße
werden gut geschüttelt und anschließend 3 Minuten bei 800 g zentrifugiert. Der PBS-
Überstand wird entfernt und der Waschvorgang nach Resuspension mit 30 ml PBS
wiederholt. Nach Entfernung des Überstandes wird das Zellpellet mit 15 ml Kulturmedium
resuspendiert und 30 mg des Enzyms Kollagenase Typ I dazugegeben (2 mg Kollagenase/
ml Kulturmedium). Dieses Gemisch wird unter Schütteln 45 Minuten bei 37° C inkubiert,
mit dem Vortexer gut durchmischt und anschließend durch einen 100 µm Zellsieb gegeben,
um größere Gewebereste abzutrennen. Nach erneutem Zentrifugieren (3 min/ 800 g)
werden die Zellen mit 10 ml serumfreiem, mit Antibiotika versetztem Kulturmedium
resuspendiert.

2.2.1.2 Gewinnung der Kolonepithelzellen mittels Percoll-Gradient


10 ml einer Zellsuspension aus Primärtumor/ Mukosa wird mit 10 ml Percollmix
(Dichte:1,059 g/ml) (siehe Material) vermischt und 15 Minuten bei 100 g ohne Bremse
zentrifugiert. Durch diese Dichtegradiententeilung reichern sich die Epithelzellen in einer
bestimmten Schicht an, werden mit einer 5 ml-Pipette aufgenommen, in ein neues 50 ml-
Tube überführt und mit 10 ml frischem serumfreien Kulturmedium (mit Antibiotikazusatz)
aufgefüllt und gut durchmischt. Nach Zentrifugation (3 min/800 g) wird der Überstand
entfernt, 10 ml neues Kulturmedium dazugegeben und erneut zentrifugiert. Dieser
Waschschritt wird dreimal durchgeführt und die Zellen anschließend mit serumhaltigem (+
10 % FBS-Zusatz) Kulturmedium resuspendiert.

13
Material und Methoden

2.2.1.3 Zellzahlbestimmung
In der Neugebauerkammer wird die Zellzahl der Zellsuspension bestimmt. Dazu wird ein
Teil der Zellsuspension mit vier Teilen Trypanblau vermischt und damit die
Neugebauerkammer (Volumen 0,9 mm3) gefüllt. Unter dem Phasenkontrastmikroskop (10
x-Objektiv) werden bei 100facher Vergrößerung mindestens vier Quadranten ausgezählt
und der Mittelwert (MW) davon gebildet. Diesen multipliziert man zunächst mit 10 000,
anschließend mit dem Faktor der Verdünnung (VF) (in diesem Fall x 5) und erhält somit
die Zellzahl der Suspension pro Milliliter.

2.2.1.4 Aussaat der Zellen


In eine 6-Loch-Platte werden in jede Vertiefung 1,5 – 2 x 106 Zellen pipettiert und 4 ml
Finalmedium dazu gegeben. Alternativ werden bei großer Zellzahl etwa 3 – 4 x 106 Zellen
mit Zugabe von 10 ml Finalmedium direkt in eine 50 ml-Kulturflasche gegeben. Die Zellen
werden einmal unter dem Phasenmikroskop begutachtet und anschließend zur Kultivierung
in den Brutschrank (37° C; 5 % CO2) gestellt.

2.2.1.5 Subkultivierung
Nach dem Waschen mit 10 ml PBS werden die Zellen mit 4 ml Trypsin gelöst (10 Minuten
bei 37° C und 5 % CO2), in ein 50 ml-Reaktionsgefäß überführt und zentrifugiert (10
min/900 g). Auf das Zellpellet wird 10 ml frisches Finalmedium (37° C) gegeben und die
gut durchmischte Zellsuspension auf mindestens zwei neue 75 cm2 Kulturflaschen
aufgeteilt. Die Subkultivierung der kommerziellen Zelllinien Colo 206F und Colo 678
entspricht dem von primären Zelllinien, außer dass anderes Medium (90 % RPMI + 10 %
FCS) verwendet wird.

2.2.2 Zytogenetische Charakterisierung

2.2.2.1 Hypotone Behandlung und Fixierung


Subkonfluent wachsende Kolonepithelzellen werden mit 10 ml Colzemid in 200 ml
Medium versetzt und 4 Stunden bei 37° C inkubiert. Nach Waschen mit PBS werden die
Zellen mit Trypsinlösung abgelöst. Da die Kolonepithelzellen stark adhärent wachsen, ist

14
Material und Methoden

oft eine dreimalige Inkubation mit 4 ml Trypsin (5 min/ 37° C) und die Ablösung der
danach übrigen Zellen mittels eines Zellschabers erforderlich. Nach Resuspendierung in
Final-Medium werden die Zellen abzentrifugiert (1400 U/min 8 min), in Natrium-
Citratlösung (0,8 %) resuspendiert und 35 Minuten bei 37° C inkubiert. Nach erneuter
Zentrifugation werden die Zellen in 5 ml Carnoy’s Fixativ (Methanol: Essigsäure 3:1)
resuspendiert und dadurch fixiert.

2.2.2.2 Auftropfen
Die zu verwendenden Objektträger werden am Vortag mit Chromschwefelsäure entwässert
und gereinigt. Vor dem Auftropfen werden die fixierten Zellen abzentrifugiert (1400
U/min/8 min) und mit frischem Carnoy´s Fixativ resuspendiert. Zum Auftropfen hält man
den feuchten Objektträger leicht schräg über ein Waschbecken und lässt aus einer Auftropf-
Glaspipette aus etwa 30 – 60 cm Höhe einige Tropfen (im Mittel drei) auf den Objektträger,
möglichst im vorderen Drittel, tropfen. Sollten die Chromosomen in den Metaphasen sehr
dicht beieinander liegen, kann man den Objektträger noch vorsichtig möglichst schnell (um
die Chromosomen nicht zu zerstören) etwa 3 x über eine blaue Bunsenbrennflamme ziehen,
ehe man ihn dann zum Lufttrocknen senkrecht (um Wasserflecken zu vermeiden) aufstellt.
Den getrockneten Objektträger sucht man dann unter dem Phasenmikroskop auf
Metaphasen durch und markiert diese auf einem weiteren Objektträger zur Erleichterung
bei der späteren Hybridisierung.

2.2.2.3 Pepsinvorbehandlung
Die Pepsinbehandlung dient dazu, den Hintergrund zu reduzieren um somit eine bessere
Hybridisierung zu erreichen. Je nach Morphologie der Zelllinien kann darauf verzichtet
und direkt mit der Formaldehydvorbehandlung begonnen werden. Vor Beginn der
Vorbehandlung sollten die Zellen auf dem Objektträger lichtgeschützt und bei
Raumtemperatur mindestens einen bzw. bis zu mehrere Tage (etwa drei bis vier Tage)
altern. Man pipettiert in eine mit 100 ml destillierten Wasser (37° C) gefüllte Küvette 10 µl
Pepsin 10 %. Zum Aktivieren des Enzyms gibt man 1 ml 1M HCl hinzu, vermischt die
Lösung gut und gibt die gewünschten Objektträger hinein. Das Pepsin lässt man für 5 - 10
min auf die Zellen wirken. Zum Abstoppen der Pepsinwirkung und Waschen werden die
Objektträger in einer mit PBS-Lösung gefüllten 100 ml-Küvette inkubiert.

15
Material und Methoden

2.2.2.4 Formaldehyd- Vorbehandlung


Den Objektträger stellt man in eine Küvette mit PBS/MgCl2-Lösung für 5 min, danach in
die Küvette mit 1 %iger Formaldehyd-Lösung für 10 min. Zum Waschen gibt man die
Objektträger für 5 Minuten in eine Küvette mit 1 x PBS-Lösung. Nachdem die Objektträger
die Alkoholreihe für jeweils 3 Minuten in steigender Konzentration [70 %iges Ethanol, 80
%ig-, 90 %ig- bis 100 %] durchlaufen haben, lässt man sie, senkrecht gestellt zur
Vermeidung von Wasserflecken, lufttrocknen.

2.2.2.5 Denaturierung
Die Denaturierung der Chromosomen kann direkt im Anschluss an die Vorbehandlung oder
am Tag darauf durchgeführt werden. Die zu hybridisierenden Objektträger werden für
mehrere Sekunden bis Minuten, je nach Zelllinie, in die im Wasserbad in einer Küvette auf
70° C erhitzte Denaturierungslösung unter laufendem Abzug gestellt. Nach der
Denaturierungszeit durchlaufen die Objektträger eine eisgekühlte Alkoholreihe steigender
Ethanolkonzentration [70 %iges Ethanol, 80 %ig-, 90 %ig- bis 100 %] für jeweils 3
Minuten pro Küvette und werden anschließend luftgetrocknet. Im Folgenden kann man
unter dem Phasenkontrastmikroskop die Chromosomenmorphologie der einzelnen
Metaphasen nach der Denaturierung begutachten.

2.2.2.6 Hybridisierung
Zeitgleich mit der Denaturierung der Chromosomen können die SKY-Hybridisierungs-
Proben denaturiert werden. Zum Eindecken für einen Objektträger werden 6 µl der DNA-
Probe in ein steriles 1,5 ml Reaktionsgefäß pipettiert. Dieses 1,5 ml Reaktionsgefäß wird in
einem vorgeheizten Wärmeblock bei 80° C für 7 Minuten und anschließend in einem
Styroporschwimmkissen im Wasserbad bei 37° C für ein- bis maximal zwei Stunden
inkubiert. Nach dieser Zeit wird die DNA Probe auf die gewünschte zu hybridisierende
Stelle auf dem Objektträger pipettiert und die Stelle mit einem 18 x 18 mm2 (bzw. 15 x 15
mm2) großen Deckgläschen abgedeckt. Wenn sich die DNA-Probe ganz unter dem
Deckgläschen an gewünschter Stelle und ohne Luftbläschen gleichmäßig verteilt hat,
dichtet man um das Deckgläschen luftdicht mit Marabu®-Kleber („rubber-cement“) ab.
Nach Trocknen des Klebers werden die Objektträger in die mit destilliertem Wasser

16
Material und Methoden

getränkte Feuchtkammer gelegt und mit der Feuchtkammer 48 Stunden zum Hybridisieren
bei 37° C inkubiert.

2.2.2.7 Nachweis
Nach etwa 48 Stunden entnimmt man die Objektträger aus der Feuchtkammer und zieht mit
einer Pinzette vorsichtig den Marabu®- Klebstoff („rubber-cement“) ab. Das Deckgläschen
sollte noch locker auf dem Objektträger schwimmen und keinesfalls angetrocknet sein. Alle
Waschschritte erfolgen bei 45° C im Schüttelwasserbad. Zunächst werden die Objektträger
dreimal je 5 Minuten in Waschlösung I und zweimal 5 Minuten in Waschlösung II (1 x
SSC) gewaschen. Anschließend stellt man die Objektträger für etwa 2 Minuten in eine neue
mit Waschlösung III (4 x SSC mit Tween) gefüllte Küvette bei Raumtemperatur.
Die folgenden Arbeitsschritte werden in einem abgedunkelten Raum durchgeführt. Man
nimmt den einzelnen Objektträger aus der Küvette, gibt mit einer 100 µl-Eppendorfpipette
etwa 80 – 100 µl des Antikörper (#3) auf die Chromosomenareale auf dem Objektträger
und legt ein Deckgläschen (26 x 36 mm) darüber, ehe es für 45 Minuten in der
Feuchtkammer bei 37° C inkubiert wird. Nach dieser Inkubationszeit wird das
Deckgläschen abgelöst, und der Objektträger dreimal 3 Minuten bei 45° C in Waschlösung
III gewaschen. Mit der 100 µl-Eppendorfpipette pipettiert man etwa 80 – 100 µl des
Antikörpers (#4) auf die Chromosomenareale auf dem Objektträger, legt ein Deckgläschen
(26 x 36 mm) darüber und inkubiert dies bei 37° C 45 Minuten in der Feuchtkammer. Wie
bereits nach dem ersten Antikörper (#3) löst man die Deckgläschen ab und wäscht die
Objektträger dreimal jeweils für drei Minuten in 45° C-warmer Waschlösung III.
Anschließend gibt man mit der 200 µl-Eppendorfpipette etwa 150 µl DAPI-2 x SSC auf die
Chromosomen, legt ein Deckgläschen (26 x 36mm) darüber und lässt dies etwa 10 -20
Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur (z.B. unter dem Deckel der Feuchtkammer)
inkubieren. Nach Abschütteln des Deckgläschens schwenkt man den Objektträger kurz in 2
x SSC um überschüssige Tween20-Lösung abzuwaschen, gibt einige Tropfen (etwa 30 – 50
µl) Vectashield mit DAPI vor allem auf die hybridisierte Stelle und legt vorsichtig ein
Deckgläschen (26 x 36 mm), möglichst ohne Blasenbildung, darauf. Zusätzlich kann man
den Objektträger mit dem schmalen Rand schräg auf ein saugfähiges Tuch stellen, sodass
dies überschüssige Flüssigkeit ansaugt, und sich das Deckgläschen durch die Sogwirkung
fest an den Objektträger presst.

17
Material und Methoden

2.2.2.8 Spektrale Karyotypisierung (Garini et al. 1996)

Der DNA-Sonden-Mix beinhaltet 57 markierte chromosomenspezifische Sonden. Diese


sind in unterschiedlicher Kombination mit bis zu vier aus fünf möglichen Farbstoffen
(Rhodamine; Texas-Red; FITC; Cy-5, sowie Cy 5.5) markiert. Durch diese
unterschiedliche Kombination existiert für jedes Chromosom des menschlichen Karyotyps
eine eigene Sonde mit spezifischem Spektralbild, welches mittels der Sky-Software
erkannt, ausgearbeitet und in ein in ein spezifisches Falschfarbenbild umgearbeitet wird.

Label Rhodamine Texas Red Cy5 FITC Cy5.5

=A =B =C =D =E

Abs (nm) 550 596 650 495 675

Em (nm) 570 620 670 525 694

Die unterschiedlichen Farbkombinationen der einzelnen Chromosomen-DNA-Sonden:

Chromosom Label Chromosom Label Chromosom Label

1 BCD 9 ADE 17 C

2 E 10 CE 18 ABD

3 ACDE 11 ACD 19 AC

4 CD 12 BE 20 A

5 ABDE 13 AD 21 DE

6 BCDE 14 B 22 ABCE

7 BC 15 ABC X AE

8 D 16 BD Y CDE

Durch das Phasenkontrast-Mikroskop werden die einzelnen hybridisierten Metaphasen


aufgesucht, mit der Kamera sowohl als Spektralbild, als auch in der DAPI-Färbung
aufgenommen und anschließend computerunterstützt bearbeitet.

18
Material und Methoden

Die Grenzen der Chromosomen einer Metaphase werden anhand der DAPI-Färbung
markiert und anschließend erfolgt die Zuordnung der Chromosomen durch das spezielle
Spektrum.

Pro Zelllinie werden mindestens zehn gut zugeordnete Metaphasen aufgenommen.

2.2.3 Genotypisierung
Die Genotypisierung wurde in Kooperation mit dem Institut für Rechtsmedizin und der
Firma „ID-Labor“ (Wiesbaden) durchgeführt. Dazu wurde genomische DNA in einer
Konzentration von 100 ng/l zur Verfügung gestellt. Es wurde eine Kombination von
hochpolymorphen Mikrosatellitenmarkern zur Genotypisierung verwendet. In der
Rechtsmedizin wurden das PowerPlex® ES multiplex system (SE 33, vWA, THO1,
D21S11, FGA, D3S1358, D8S1179, D18S51, Amelogenin) und das AmpFlSTR® SGM
PlusTM multiplex system (D3S1358, vWA, D16S359, D2S1338, D8S1179, D21S11,
D18S51, D19S433, TH01, FGA, SE33) verwendet. Im ID-Labor wurde ein Kombination
aus 15 Markern verwendet, die sich zum großen Teil den in der Rechtsmedizin
verwendeten Markern überlappten (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358,
TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818, FGA).
Mittels PCR wurden die hochvariablen DNA-Abschnitte von verschiedenen Chromosomen
sowie der Geschlechtsindikator Amelogenin vervielfältigt und farblich markiert. Die
Detektion der verschieden amplifizierten DNA-Abschnitte erfolgte nach
Größenauftrennung im elektrischen Feld bei einer denaturierenden Kapillarelektrophorese
durch Laser-induzierte Fluoreszenz. Es wurden positive und negative Kontrollen
mitgeführt, die das richtige Ergebnis erzielten. Alle Signale mit einer Höhe von weniger als
10 % der höchsten Signale innerhalb eines Genortes fanden keine Berücksichtigung.

19
Ergebnisse

3 Ergebnisse

3.1 Spektrale Karyotypisierung von Zelllinien der Adenom-


Karzinom-Sequenz

3.1.1 Spektrale Karyotypisierung der Kolonepithelzelllinie


NCOL-1b
1996 isolierte Deveney et al. Epithelzellen von normaler Kolonschleimhaut. Aus dieser
primären Zellkultur konnte die bislang, soweit bekannt, einzige langlebige, kommerzielle
Zelllinie nicht transformierter Epithelzelllinie aus normaler Dickdarmschleimhaut etabliert
werden. Die Zellen wurden uns freundlicherweise von Prof. Deveney (Division of General
Surgery, School of Medicine, Oregeon Health Sciences University) zur Verfügung gestellt.
Die Kultivierung der Zelllinie mit den entsprechenden Nährmedien, sowie die Vorbereitung
und Durchführung der Spektralen Karyotypisierung erfolgte entsprechend dem Protokoll
von Prof. Deveney speziell zu dieser Zelllinie (s. Methodenteil). Die Chromosomen wurden
mit 100 µg/100 ml Pepsin 5 Minuten vorbehandelt. Die Denaturierungszeit in Formalin
betrug 8 Minuten. Von NCOL-1b konnten 11 Metaphasen mittels SKY analysiert, und die
Chromosomen eindeutig zugeordnet werden. Der Karyotyp von NCOL-1b weist
durchschnittlich einen dipoloiden Chromosomensatz mit 47 Chromosomen bei vier und 48
Chromosomen bei sieben Metaphasen auf. Strukturelle Veränderungen finden sich in allen
Metaphasen bei den Chromosomen 2, 3, 6, 7, 12 und 15, numerische Veränderungen in
allen Metaphasen bei den Chromosomen 3, 5, 7, 13 und 15. In allen Metaphasen finden
sich zwei reziproke Translokationen, zum einen zwischen den Chromosomen 2 und 12,
sowie zwischen den Chromosomen 6 und 7. Die Bruchpunkte liegen bei 2p15 und 12p12
[t(2;12)(2p15)(12p12)], sowie bei 6p11.1 und 7q11.2 [t(6;7)(6p11.1)(7q11.2)]. Das
strukturell veränderte Chromosom 7 liegt zusätzlich neben zwei in SKY unauffälligen
Chromosomen 7 vor. In allen Metaphasen findet sich eine zusätzliche Translokation im
zweiten Chromosom 12 bei 12p12 mit Material des Chromosoms 15
[der(12)t(12;15)del(12p12)] und eine Translokation in Chromosom 3 bei 3q25 mit Material
von Chromosom 13 [der(3)t(3;13)del(3q25)]. Zudem findet sich in allen Metaphasen ein
verändertes Chromosom 3. Metaphase 6 zeigt ein drittes nicht näher zuordenbares
derivatisiertes Chromosom 12. Chromosom 13 liegt in allen Metaphasen einzeln vor. Die

20
Ergebnisse

beiden Chromosomen 15 sind an den langen Armen zu einem iso-Chromosom fusioniert,


die kurzen Arme sind deletiert. Chromosom 20 liegt in den Metaphasen 4 und 5 einzeln,
Chromosom 22 in 9 Metaphasen (1;4;5;7;8;9;12;18;19) triploid vor. Das Y- Chromosom
fehlt in Metaphase 1. Die detaillierten Karyotypen jeder Metaphase sind in Tabelle 1 und
Abbildung 1 aufgeführt.

Metaphase SKY-Karyotyp Gewinne Verluste


1 47,XY,-2,+t(2;12)(2p15)(12p12),der(3)t(3;13)del(3q25), 3; 5; 7; 22 12; 13; 15; Y
+der(3)del(?),+5,-6;+t(6;7)(6p11.1)(7q11.2),-12,
der(12)t(12;15)del(12p12),-13,-15x2,+i(15)del(15p11.1),+22,-Y
4 47,XY,-2,+t(2;12)(2p15)(12p12),der(3)t(3;13)del(3q25), 3; 5; 7; 22 12; 13; 15;
+der(3)del(?),+5,-6;+t(6;7)(6p11.1)(7q11.2),-12, 20
der(12)t(12;15)del(12p12),-13,-15x2,+i(15)del(15p11.1),
-20,+22
5 47,XY,-2,+t(2;12)(2p15)(12p12),der(3)t(3;13)del(3q25), 3; 5; 7; 22 12; 13; 15;
+der(3)del(?),+5,-6;+t(6;7)(6p11.1)(7q11.2),-12, 20
der(12)t(12;15)del(12p12),-13,-15x2,+i(15)del(15p11.1),-20,+22
6 48,XY,-2,+t(2;12)(2p15)(12p12),der(3)t(3;13)del(3q25), 3; 5; 7 13; 15
+der(3)del(?),+5,-6; t(6;7)(6p11.1)(7q11.2),der12(?),
der(12)t(12;15)del(12p12),-13,-15x2,+i(15)del(15p11.1)
7 48,XY,-2, +t(2;12)(2p15)(12p12), der(3)t(3;13)del(3q25), 3; 5; 7; 22 12; 13; 15
+der(3)del(?),+5,-6;+t(6;7)(6p11.1)(7q11.2),-12,
der(12)t(12;15)del(12p12),-13,-15x2,+i(15)del(15p11.1),+22
8 48,XY,-2,+t(2;12)(2p15)(12p12),der(3)t(3;13)del(3q25), 3; 5; 7; 22 12; 13; 15
+der(3)del(?),+5,-6;+t(6;7)(6p11.1)(7q11.2),-12,
der(12)t(12;15)del(12p12),-13,-15x2,+i(15)del(p11.1),+22
9 48,XY,-2,+t(2;12)(2p15)(12p12),der(3)t(3;13)del(3q25), 3; 5; 7; 22 12; 13;15
+der(3)del(?),+5,-6;+t(6;7)(6p11.1)(7q11.2),-12,
der(12)t(12;15)del(12p12),-13,-15x2,+i(15)del(p11.1),+22
12 48,XY,-2,+t(2;12)(2p15)(12p12),der(3)t(3;13)del(3q25), 3; 5; 7; 22 12; 13; 15
+der(3)del(?),+5,-6;+t(6;7)(6p11.1)(7q11.2),-12,
der(12)t(12;15)del(12p12),-13,-15x2,+i(15)del(p11.1),+22
15 47,XY,-2,+t(2;12)(2p15)(12p12),der(3)t(3;13)del(3q25), 3; 5; 7 12; 13; 15
+der(3)del(?),+5,-6;+t(6;7)(6p11.1)(7q11.2),-12,
der(12)t(12;15)del(12p12),-13,-15x2,+i(15)del(p11.1)
18 48,XY,-2,+t(2;12)(2p15)(12p12),der(3)t(3;13)del(3q25), 3; 5; 7; 22 12; 13; 15
+der(3)del(?),+5,-6;+t(6;7)(6p11.1)(7q11.2),-12,
der(12)t(12;15)del(12p12),-13,-15 x 2,+i(15)del(p11.1),+22
19 48,XY,-2, +t(2;12)(2p15)(12p12), der(3)t(3;13)del(3q25), 3; 5; 7; 22 12; 13; 15
+der(3)del(?),+5,-6; +t(6;7)(6p11.1)(7q11.2),-12,
der(12)t(12;15)del(12p12),-13,-15 x 2,+i(15)del(p11.1), +22
Tab. 1 Spektrale Karyotypisierung von 11 Metaphasen (NCOL-1b)

21
Ergebnisse

Abb.1 Spektraler Karyotyp der Kolonkarzinomzelllinie NCOL-1b

3.1.2 Spektrale Karyotypisierung der Kolonkarzinomzelllinie Lovo


Die Kolonkarzinomzelllinie Lovo wurde von der DSMZ („Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen“) Heidelberg bezogen. Die Kultivierung der Zelllinie
mit den entsprechenden Nährmedien, sowie die Vorbereitung und Durchführung der
Spektralen Karyotypisierung erfolgte entsprechend dem Protokoll für diese Zelllinie
(s. Methodenteil). Die Chromosomen wurden mit Pepsin vorbehandelt. Die
Denaturierungszeit in Formalin betrug 1 - 2 Minuten. Von Lovo konnten 10 Metaphasen
mittels SKY analysiert, und die Chromosomen eindeutig zugeordnet werden. Der Karyotyp
von Lovo weist durchschnittlich einen Chromosomensatz mit 49 Chromosomen auf.
Strukturelle Veränderungen finden sich in allen Metaphasen bei den Chromosomen 2 und
12, numerische Veränderungen bei den Chromosomen 5, 7 und 12. In allen Metaphasen
findet sich eine reziproke Translokation zwischen den Chromosomen 2 und einem dritten
Chromosom 12. Die Bruchpunkte liegen bei 2q13 und 12p11 [t(2;12)(2q13)(12p11)]. Ein
Chromosom 15 mit Bruchpunkt bei 15q10 ist an den langen Armen zu einem iso-
Chromosom fusioniert, die kurzen Arme sind deletiert. Die Chromosomen 5 und 7 liegen
dreifach vor. Eine der Metaphasen zeigt einen Subklon mit einer zweiten reziproken
Translokation zwischen den Chromosomen 1 und 5 [t(1;5)]. Für die detaillierten
Karyotypen jeder Metaphase siehe Tabelle 2 und Abbildung 2.

22
Ergebnisse

Metaphase(n) SKY-Karyotyp Gewinne Verluste


1-9 49,XY,t(2;12)(2q13)(12p11),+5,+7,+12i(15)(q10) 5; 7; 12; 15 ÷
Subklon 10 49,XY,t(1;5), t(2;12)(2q13)(12p11), 5; 7; 12; 15 ÷
+5,+7,+12i(15)(q10)
Tab. 2 Spektrale Karyotypisierung von 10 Metaphasen (Lovo)

Abb.2 Spektraler Karyotyp der Kolonkarzinomzelllinie Lovo

3.1.3 Spektrale Karyotypisierung der Kolonkarzinomzelllinie Colo-678


Die Kolonkarzinomzellen wurden aus einer Lymphknotenmetastase eines 69jährigen
männlichen Patienten mit Kolonkarzinom gewonnen. Die Zelllinie wurde primär 1984 von
Dr. G.E. Moore, Colorado Oncology Foundation, Denver, CO U.S.A. etabliert und wurde
von der deutschen Zellbank DSMZ („Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH“) in Braunschweig bezogen. Die Kultivierung der Zelllinie mit den
entsprechenden Nährmedien, sowie die Vorbereitung und Durchführung der Spektralen
Karyotypisierung erfolgte entsprechend dem im Methodenteil beschriebenen Verfahren.
Die Chromosomen wurden ohne Pepsin vorbehandelt. Die Denaturierungszeit in Formalin
betrug 1,5 Minuten. Von Colo-678 konnten 10 Metaphasen mittels SKY analysiert, und die
Chromosomen eindeutig zugeordnet werden. Der Karyotyp von Colo-678 weißt
durchschnittlich einen diploiden Chromosomensatz auf. Die Anzahl der Chromosomen pro
Metaphase liegt zwischen 54 und 58. Strukturelle Veränderungen finden sich in allen
Metaphasen bei den Chromosomen 1, 3, 7 und 13, numerische Veränderungen bei den
Chromosomen 1, 3, 6, 7, 11, 12, 13, 20, und Y. Bei Chromosom 1 liegen in allen

23
Ergebnisse

ausgewerteten Metaphasen zusätzlich zwei gleichartig strukturell veränderte Chromosomen


mit einer Translokation bei 1p13 mit Material von Chromosom 17, sowie bei 1q21 mit
Material von Chromosom 6 vor [der(1)[t(1;6)del(1q21)][t(1;17)del(1p13)]]. In neun von
zehn Metaphasen findet sich zusätzlich ein Chromosom 1 mit einer Translokation 1p13 mit
Material von Chromosom 17 und ein deletierter langer Arm ab 1q25
[der(1)[t(1;17)del(1p13)]del(1q25)]. In allen Metaphasen liegt Chromosom 3 dreifach vor.
Bei sieben Metaphasen (2;18;19;22;29;30;31) findet sich bei 3p13 eine Translokation mit
Material von Chromosom 5 [der(3)t(3;5)del(3p13)]. Metaphase 20 zeigt neben dieser
Translokation [der(3)t(3;5)del(3p13)] des Chromosoms 3 zusätzliches Material von
Chromosom 17 am Chromosom 5-Anteil [der(3)t(3;5;17)del(3p13)]. In den Metaphasen 4
und 21 findet sich am Chromosom 3 ein deletierter kurzer Arm ab 3p13. Chromosom 6
liegt in allen Metaphasen einzeln vor. Bei Chromosom 7 findet sich in allen Metaphasen
ein drittes Chromosom 7. In acht Metaphasen (18;19;20;21;22;29;30;31) zeigen jeweils
zwei der drei 7er Chromosomen eine Translokation bei 7q11.2 mit Material von
Chromosom 17 und daran wiederum eine Translokation mit Material von Chromosom 7
[der(7)t(7;17;7)del(7q11.2)]. Die genaue Bestimmung des Bruchpunktes ist nicht möglich.
Metaphase 4 zeigt diese „doppelte“ Translokation [der(7)t(7;17;7)del(7q11.2)] bei nur
einem Chromosom 7, und zusätzlich eine Amplifikation an einem Chromosom 7 am langen
Arm. Diese Amplifikation an einem Chromosom 7 liegt in Metaphase 1 isoliert bei
Chromosom 7 vor. Chromosom 10 liegt in neun Metaphasen, die Chromosomen 11 und 12
liegen in allen Metaphasen dreifach vor. Bei Chromosom 13 finden sich in acht
Metaphasen (2;4;19;21;22;29;30;31) vier, in den Metaphasen 18 und 20 drei Chromosomen
13. Die Metaphasen 2;4;18;19;21,22 sowie 22 zeigen in einem Chromosom 13 eine
Translokation bei 13p12 mit Material von Chromosom 5 [der(13)t(5;13)del(13p12)]. Diese
Translokation liegt in Metaphase 29 und 31 zweifach vor. Chromosom 14 liegt in
Metaphase 22 dreifach vor, Chromosom 15 liegt in acht Metaphasen dreifach und in den
Metaphasen 4 und 30 zweifach vor. Chromosom 17 liegt in neun Metaphasen einfach und
nur in Metaphase 2 zweifach vor. Die Chromosomen 20 liegen in allen Metaphasen
vierfach vor. In Metaphase 4 findet sich ein Chromosom 21 sowie Chromosom 22. Das X-
Chromosom liegt in neun Metaphasen zweifach und in Metaphase 18 einfach vor. Das Y-
Chromosom fehlt in allen Metaphasen. Die detaillierten Karyotypen jeder Metaphase sind
in Tabelle 3 und Abbildung 3 dargestellt.

24
Ergebnisse

Metaphase SKY-Karyotyp Gewinne Verluste


2 57,XY,+der(1)[t(1;17)del(1p13)]del(1q25), 1; 3; 5; 7; Y
+<der(1)[t(1;6)del(1q21)][t(1;17)del(1p13)]>x2, 11;
+der(3)t(3;5)del(3p13),-6,+amp7q(?),+11,+12,+13, 12; 13;
+der(13)t(5;13)del(13p12),+15,+20x2;+X;-Y 15; 20; X
4 54,XY, +der(1)[t(1;17)del(1p13)]del(1q25), 1; 3; 5; 7; 21; 22;
+<der(1)[t(1;6)del(1q21)][t(1;17)del(1p13)]>x2,+del(3p13),-6, 10; Y
amp7q(?),+[der(7)t(7;17;7)del(7q11.2)] ,+10,+11,+12,+13, 11; 12;
+der(13)t(5;13)del(13p12),-17,+20x2,-21,-22;+X;-Y 13; 20; X
18 54,XY,+<der(1)[t(1;6)del(1q21)][t(1;17)del(1p13)]>x2, 1; 3; 5; 7; 6; Y
+der(3)t(3;5)del(3p13),-6,-7,+[der(7)t(7;17;7)del(7q11.2)]x2,+10, 10; 11;
+11,+12,+der(13)t(5;13)del(13p12),+15,-17,+20x2,-Y 12; 13;
15 ; 20
19 57,XY,+der(1)[t(1;17)del(1p13)]del(1q25), 1; 3; 5; 7; Y
+<der(1)[t(1;6)del(1q21)][t(1;17)del(1p13)]>x2, 10; 11;
+der(3)t(3;5)del(3p13),-6,-7,+[der(7)t(7;17;7)del(7q11.2)]x2,+10, 12; 13;
+11,+12,+13,+der(13)t(5;13)del(13p12),+15,-17,+20x2;+X;-Y 15; 20; X
20 56,XY,+der(1)[t(1;17)del(1p13)]del(1q25), 1; 3; 5; 7; Y
+<der(1)[t(1;6)del(1q21)][t(1;17)del(1p13)]>x2, 10; 11;
+der(3)t(3;5;17)del(3p13),-6,-7,+[der(7)t(7;17;7)del(7q11.2)]x2, 12; 13;
+10,+11,+12,+13,+15,-17,+20x2;+X;-Y 15; 20; X
21 57,XY,+der(1)[t(1;17)del(1p13)]del(1q25), 1; 3; 5; 7; Y
+<der(1)[t(1;6)del(1q21)][t(1;17)del(1p13)]>x2,+del(3p13),-6,-7, 10; 11;
+[der(7)t(7;17;7)del(7q11.2)]x2,+10,+11,+12,+13, 12; 13;
+der(13)t(5;13)del(13p12),+15,-17,+20x2;+X;-Y 15; 20; X
22 58,XY,+der(1)[t(1;17)del(1p13)]del(1q25), 1; 3; 5; 7; Y
+<der(1)[t(1;6)del(1q21)][t(1;17)del(1p13)]>x2, 10; 11;
+der(3)t(3;5)del(3p13),-6,-7,+[der(7)t(7;17;7)del(7q11.2)]x2,+10, 12; 13;
+11,+12,+13,+der(13)t(5;13)del(13p12),+14,+15,-17,+20x2,+X,-Y 14; 15;
20, X
29 57,XY,+der(1)[t(1;17)del(1p13)]del(1q25), 1; 3; 5; 7; Y
+<der(1)[t(1;6)del(1q21)][t(1;17)del(1p13)]>x2, 10; 11;
+der(3)t(3;5)del(3p13),-6,-7,+[der(7)t(7;17;7)del(7q11.2)]x2,+10, 12; 13;
+11,+12,+[der(13)t(5;13)del(13p12)]x2,+15,-17,+20x2,+X,-Y 15; 20; X
30 57,XY,+der(1)[t(1;17)del(1p13)]del(1q25), 1; 3; 5; 7; Y
+<der(1)[t(1;6)del(1q21)][t(1;17)del(1p13)]>x2,+der(3)t(3;5)del(3p13), 10; 11;
-6,-7,+[der(7)t(7;17;7)del(7q11.2)]x2,+10,+11,+12,+13, 12; 13;
+der(13)t(5;13)del(13p12),-17,+20x2,+X,-Y 20; X

25
Ergebnisse

Metaphase SKY-Karyotyp Gewinne Verluste


31 57,XY, +der(1)[t(1;17)del(1p13)]del(1q25), 1; 3; 5; 7; Y
+<der(1)[t(1;6)del(1q21)][t(1;17)del(1p13)]>x2, 10; 11;
+der(3)t(3;5)del(3p13),-6,-7,+[der(7)t(7;17;7)del(7q11.2)]x2,+10,+11, 12; 13;
+12,+[der(13)t(5;13)del(13p12)]x2,+15,-17,+20x2;+X,-Y 15; 20; X
Tab. 3 Spektrale Karyotypisierung von 10 Metaphasen (Colo 678)

Abb.3 Spektraler Karyotyp der Kolonkarzinomzelllinie Colo-678 (Metaphase 19)

3.1.4 Spektrale Karyotypisierung der Kolonkarzinomzelllinie Colo-206F


Die Zellen der Kolonkarzinom-Zelllinie Colo-206F entstammen der Aszitesflüssigkeit
eines 71jährigen Patienten mit Dickdarmkrebs und wurden im Jahre 1975 gewonnen. Die
Zelllinie wurde primär von Dr. G. E. Moore, Colorado Oncology Foundation, Denver, USA
etabliert und wurde von der deutschen Zellbank „Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH“ in Braunschweig bezogen. Die Kultivierung
der Zelllinie mit den entsprechenden Nährmedien sowie die Vorbereitung und
Durchführung der Spektralen Karyotypisierung erfolgte entsprechend dem im Methodenteil
beschriebenen Verfahren. Die Chromosomen wurden ohne Pepsin vorbehandelt. Die
Denaturierungszeit in Formalin betrug 1 Minute. Von Colo-206F konnten 10 Metaphasen
mittels SKY analysiert, und die Chromosomen eindeutig zugeordnet werden. Der Karyotyp
von Colo-206F weist durchschnittlich einen triploiden Chromosomensatz auf. Die Anzahl
der Chromosomen pro Metaphase liegt zwischen 66 und 72. Strukturelle Veränderungen
finden sich in allen Metaphasen bei den Chromosomen 1, 5, 6, 10, 15, 22 und Y,

26
Ergebnisse

numerische Veränderungen bei den Chromosomen 3, 5, 6, 7, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 21 und
22. Ein Chromosomen 1 zeigt bei 1p13 eine Translokation mit Material von Chromosom 10
[der(1)t(1;10) del(1p13)], das zweite Chromosom 1 zeigt bei 1p36.1 eine Translokation mit
Material von Chromosom 20 [der(1)t(1;20)del(1p36.1)]. Ein Chromosom 3 fehlt in allen
Metaphasen, sieben Mal findet sich stattdessen ein, einmal zwei derivatisierte
Markerchromosomen. In drei Metaphasen fehlt ein Chromosom 4. Bei Chromosom 5 zeigt
sich eine Translokation bei 5p13 mit Material von Chromosom 21 [der(5)t(5;21)del(5p13)].
In allen Metaphasen bei jeweils drei von fünf Chromosomen 6 zeigt sich eine „doppelte“
Translokation mit Material von Chromosom 13, sowohl 6q21, sowie 6p11
[[der(6)t(6;13)del(6p11)del(6q21)]]. Chromosom 7 liegt vier Mal vor, in zwei Metaphasen
findet sich bei 7q11 zum einen eine Translokation mit Material von Chromosom 4
[der(7)t(4;7)del(7q11)] (Metaphase 4), sowie eine Translokation mit Material von
Chromosom 11 [der(7)t(7;11)del(7q11)] (Metaphase 22). Chromosom 8 zeigt in acht
Metaphasen bei 8p21 eine Translokation mit Material vom Chromosom 21
[der(8)t(8;21)del(8p21)] (Metaphasen 4,7,8,9,13,17,18,22), in einer Metaphase liegt
Chromosom 8 diploid vor (Metaphase 1). Ein Chromosom 10 zeigt in allen Metaphasen
eine komplexe Translokation bei 10q11 mit Material von Chromosom 17 und daran eine
weitere Translokation mit Material von Chromosom 6 [der(10)t(6;10;17)del(10q11)]. In
zwei Metaphasen liegt Chromosom 10 diploid vor (Metaphasen 9;13), in 4 Metaphasen
fehlt Chromosomenmaterial jeweils im kurzen Arm von Chromosom 10 (Metaphasen
3;4;8;22). In allen Metaphasen finden sich zusätzlich ein bis zwei 11er
Markerchromosomen. Chromosom 12 liegt in einer Metaphase (1), Chromosom 14 in allen
Metaphasen und Chromosom 16 in einer Metaphase (9) diploid vor. Chromosom 13 liegt in
zwei Metaphasen (7;8) diploid, in allen anderen Metaphasen monoploid vor. Ein viertes
Chromosom 15 zeigt eine komplexe Translokation bei 15p11 mit Material von Chromosom
22 und daran eine weitere Translokation mit Material von Chromosom 19
[der(15)t(15;19;22)del(15p11)]. Ein viertes Chromosom 17 zeigt eine Translokation bei
17p11 mit Material von Chromosom 18 [der(17)t(17;18)del(17p11)]. Chromosom 18 liegt
in neun Metaphasen diploid vor, in einer Metaphase findet sich nur ein Chromosom 18
(Metaphase 18). Chromosom 19 liegt in allen Metaphasen zweifach, Chromosom 20 in
allen Metaphasen fünffach und Chromosom 21 dagegen einfach vor. Ein Chromosom 22
zeigt bei 22p11 eine Translokation mit Material von Chromosom 20
[der(22)t(20;22)del(22p11)]. Bei Chromosom Y findet sich eine „Doppel“-Translokation in

27
Ergebnisse

beiden Armen des Chromosoms mit Material des Chromosoms 3


[der(Y)t(3;Y)amp(Yp11.3)del(Yq11.221)]. Die detaillierten Karyotypen jeder Metaphase
siehe Tabelle 4 und Abbildung 4.

Metaphase SKY-Karyotyp Gewinne Verluste


1 66,XXY,-1,der(1)t(1;10)del(1p13),der(1)t(1;20)del(1p36.1),-2,-3,-4, 5; 6; 7; 1; 2; 4; 8;
+der(5)t(5;21)del(5p13),-6,+[der(6)t(6;13)del(6p11)del(6q21)]x3,+7, 11; 13; 10; 12;
-8,del(10p),der(10)t(6;10;17)del(10q11),+der11(?)x2,-12,-13x2,-14, 15; 17; 14; 18;
+der(15)t(15;19;22)del(15p11),+der(17)t(17;18)del(17p11),-18,-19, 20 21; 22
+20x2,-21x2,der(22)t(20;22)del(22p11),
der(Y)t(3;Y)amp(Yp11.3)del(Yq11.221)
3 71,XXY,der(1)t(1;10)del(1p13),der(1)t(1;20)del(1p36.1), 3; 5; 6; 1; 10; 14;
der(3)del(3p13)del(3q13.2),+der(5)t(5;21)del(5p13),-6, 7; 11;13; 18; 21;
+[der(6)t(6;13)del(6p11)del(6q21)]x3,+7,del(10p?), 15; 17; 22
der(10)t(6;10;17)del(10q11),+derl1(?),-13x2,-14, 20; Y
+der(15)t(15;19;22)del(15p11),+der(17)t(17;18)del(17p11),-18,-19,
+20x2,-21x2,der(22)t(20;22)del(22p11),
der(Y)t(Y;3)amp(Yp11.3)del(Y11.221),+der(Y)t(3;Y)del(Y-?)
4 70,XXY,der(1)t(1;10)del(1p13),der(1)t(1;20)del(1p36.1),-3,-4, 3; 5; 6; 1; 4; 8;
+der(5)t(5;21)del(5p13),-6,+[der(6)t(6;13)del(6p11)(6q21)]x3, 7; 11; 10; 14;
+der(7)t(4;7)del(7q11),der(8)t(8;21)del(8p21), 13; 15; 18; 21;
del(10p?),der(10)t(6;10;17)del(10q11),+der11(?)x2,-13x2, 17; 20 22
-14,+der(15)t(15;19;22)del(15p11),+der(17)t(17;18)del(17p11),-18,
-19,+ 20x2,-21x2,-22,der(22)t(20;22)del(22p11),
der(Y)t(3;Y)amp(Yp11.3)del(Yq11.221)
7 72,XXY,der(1)t(1;10)del(1p13),der(1)t(1;20)del(1p36.1), 3; 5; 6; 1; 8; 10;
der(3)del(3p13)del(3q13.2),+der(5)t(5;21)del(5p13),der6(?), 7; 11; 14; 18;
+[der(6)t(6;13)del(6p11)(6q21)]x3,+7,der(8)t(8;21)del(8p21), 13; 15; 21; 22
der(10)t(6;10;17)del(10q11),+der11(?),-13,-14, 17; 20
+der(15)t(15;19;22)del(15p11),der17(?),+der(17)t(17;18)del(17p11),
-18,-19,+20x2,-21x2,der(22)t(20;22)del(22p11),
der(Y)t(3;Y)amp(Yp11.3)del(Yq11.221)
8 68,XXY,der(1)t(1;10)del(1p13),der(1)t(1;20)del(1p36.1), 3; 5; 6; 1; 4; 8;
der(3)del(3p13)del(3q13.2),-4, +der(5)t(5;21)del(5p13),-6, 7; 11; 10; 14;
+[der(6)t(6;13)del(6p11)(6q21)]x3,+7,der(8)t(8;21)del(8p21), 13; 15; 18; 21;
del(10p?),der(10)t(6;10;17)del(10q11),der11(?),-13, -14, 17; 20 22
+der(15)t(15;19;22)del(15p11),+der(17)t(17;18)del(17p11),
-18,-19,+20x2,-21x 3,-22,der(22)t(20;22)del(22p11),
der(Y)t(3;Y)amp(Yp11.3)del(Yq11.221)
9 66,XXY,der(1)t(1;10)del(1p13), der(1)t(1;20)del(1p36.1),-3, 3; 5; 6; 1; 8; 10;
+[der(3)del(3p13)del(3q13.2)]x2,+der(5)t(5;21)del(5p13),-6, 7; 11; 14; 16;
+[der(6)t(6;13)del(6p11)(6q21)]x3,+7,der(8)t(8;21)del(8p21),-10, 13; 15; 18; 21;
der(10)t(6;10;17)del(10q11),+11,-13x2,-14, 17; 20 22
+der(15)t(15;19;22)del(15p11),-16,+der(17)t(17;18)del(17p11),
-18,-19,+ 20x2,-21x2,der(22)t(20;22)del(22p11),
der(Y)t(3;Y)amp(Yp11.3)del(Yq11.221)
13 70,XXY,der(1)t(1;10)del(1p13),der(1)t(1;20)del(1p36.1), 3; 5; 6; 1; 8; 10;
der(3)del(3p13)del(3q13.2),+der(5)t(5;21)del(5p13),-6,der6q(?), 7; 11; 14; 18;
+[der(6)t(6;13)del(6p11)(6q21)]x3,+7,der(8)t(8;21)del(8p21),-10, 13;15; 21; 22
der(10)t(6;10;17) del(10q11),+der11(?),-13x2,-14, 17; 20
+der(15)t(15;19;22)del(15p11),+der(17)t(17;18)del(17p11),-18,-19,
+20x2,-21x2,der(22)t(20;22)del(22p11),
der(Y)t(3;Y)amp(Yp11.3)del(Yq11.221)

28
Ergebnisse

17 70,XXY,der(1)t(1;10)del(1p13),der(1)t(1;20)del(1p36.1), 3; 5; 6; 1; 8; 10;
der(3)del(3p13)del(3q13.2),+der(5)t(5;21)del(5p13),-6, 7; 11; 14; 18;
+[der(6)t(6;13)del(6p11)(6q21)]x3,+7,der(8)t(8;21)del(8p21), 13; 15; 21; 22
der(10)t(6;10;17)del(10q11),+der11(?),-13x2,-14, 17; 20
+der(15)t(15;19;22)del(15p11),+der(17)t(17;18)del(17p11),-18,-19,
+20x2,-21x2,der(22)t(20;22)del(22p11),
der(Y)t(3;Y)amp(Yp11.3)del(Yq11.221)
18 70,XXY,der(1)t(1;10)del(1p13),der(1)t(1;20)del(1p36.1), 3; 5; 6; 1; 8; 10;
der(3)del(3p13)del(3q13.2),+der(5)t(5;21)del(5p13),-6, 7; 11; 14; 18;
+[der(6)t(6;13) del(6p11)(6q21)]x3,+7,-8,+der(8)t(8;21)del(8p21), 13;15; 21; 22
der(10)t(6;10;17) del(10q11),+der11(?),-13x2,-14, 17; 20
+der(15)t(15;19;22)del(15p11),+der(17)t(17;18)del(17p11),-18x2,
-19,+ 20x2,-21x2,der(22)t(20;22)del(22p11),
der(Y)t(3;Y)amp(Yp11.3)del(Yq11.221)
22 70,XXY, der(1)t(1;10)del(1p13),der(1)t(1;20)del(1p36.1), 3; 5; 6; 1; 8; 10;
der(3)del(3p13)del(3q13.2),+der(5)t(5;21)del(5p13),-6, 7; 11; 14; 18;
+[der(6)t(6;13)del(6p11)(6q21)]x 3,+der(7)t(7;11)del(7q11), 13; 15; 21; 22
der(8)t(8;21) del(8p21),del(10p?),+der(10)t(6;10;17)del(10q11), 17; 20
+der11(?),-13x2,-14,+der(15)t(15;19;22)del(15p11),
+der(17)t(17;18)del(17p11),-18,-19,+der(19)t(15;19;22),+20x2,
-21x2,der(22)t(20;22)del(22p11),
der(Y)t(3;Y)amp(Yp11.3)del(Yq11.221)
Tab. 4 Spektrale Karyotypisierung von 10 Metaphasen (Colo-206F)

Abb.4 Spektraler Karyotyp der Kolonkarzinomzelllinie Colo-206F (Metaphase 4)

3.1.5 Fingerprinting-Analyse der Zelllinien NCOL-1b und Lovo


In Kooperation mit dem Institut für Rechtmedizin wurde eine Fingerprintinganalyse der

Zelllinien Lovo und NCOl-1 durchgeführt. Die in dieser Arbeit analysierten Zellen

entsprechen „Lovo“ und „NCOL-1b“ in der Tabelle 14. „NCOL-1a“ sind Zellen, die zum

Vergleich von einer anderen Arbeitsgruppe bezogen wurden. Die Genotypisierung der

Zelllinien NCOL-1a, -1b und Lovo zeigte identische Allele in 6 Loci (D16S359, D2S1338,

29
Ergebnisse

D8S1179, D21S11, D18S51, TH01) mit einer Genotyp-Frequenz von 0,000004587 und

einer Übereinstimmungswahrscheinlichkeit von 99,9995412. Lovo und NCOL-1b sind in

zwei weiteren Loci identisch (FGA, SE33) mit einer kombinierten Genotyp-Frequenz von

8,573103exp-11 und einer Übereinstimmungswahrscheinlichkeit von > 99,99999. die

Zelllinien NCOl-1a und -1b haben in zwei weiteren Loci identische Genotypen (D3S1358,

vWA) und in zwei anderen Loci (D3S1358, D3S1358) keine Übereinstimmung.

Lovo NCOL-1a NCOL-1b


PowerPlex® ES multiplex system
SE 33 20.2/25.2 19.2/24.2 18.2/19.2/20.2/25.2
vWA 17/19 16/17/18 17/18
THO1 9.3 9.3 9.3
D21S11 29/31.2 29/31.2 28/29/30.2/31.2
FGA 18/19/20 17/20 18/20
D3S1358 14/16 14/17 14/17
D8S1179 9/10 10 9/10
D18S51 13/18 13/18 13/18
Amelogenin X/Y X/Y X/Y
AmpFlSTR® SGM PlusTM multiplex system
D3S1358 14/16 14/17 14/17
vWA 17/19 17/18 17/18
9/12 9/12 9/12
D16S359
(16)/17/18 17/18 17/18
D2S1338
D8S1179 9/10 10 9/10
D21S11 29/31.2 29/31.2 28/(29)/31.2
13/18 13/18 13/18
D18S51
D19S433 15 14/15 13/15
9.3 9.3 9.3
TH01
FGA 18/20 17/20 18/20
SE33 19.2/20.2/25.2 19.2/24.2 18.2/19.2/20.2/25.2
Tab. 5 Genotypisierung der Zelllinien NCOL-1a, -1b und Lovo

30
Ergebnisse

3.2 Etablierung und spektrale Karyotypisierung von primären


Kolonadenom und - Kolonkarzinomzelllinien

3.2.1 Kolonadenomzelllinie Geki-2


Direkt im Anschluss an eine Resektion eines tubulo-villösen Rektumpolyen bei einer
57jährigen Patientin im Jahr 2001 wurde durch die Chirurgische Klinik natives Material
dieses Adenoms bereitgestellt. In der pathologisch-anatomischen Begutachtung konnten
keine Hinweise auf Malignität festgestellt werden. Die Etablierung der Zelllinie, die
Vorbereitung und Durchführung der Spektralen Karyotypisierung erfolgte entsprechend
dem im Methodenteil beschriebenen Verfahren. Geki-2 wurde in Passage 4 abgestoppt, und
die Chromosomen in 5 µl Pepsin 5 Minuten vorbehandelt. Die Denaturierungszeit in
Formalin betrug 3 Minuten. Von Geki-2 konnten 10 Metaphasen mittels SKY analysiert,
und die Chromosomen eindeutig zugeordnet werden. Der Karyotyp von Geki-2 weist
durchschnittlich einen unauffälligen diploiden Chromosomensatz mit 46 Chromosomen
auf. Metaphase 20 zeigt eine Chromosomenzahl von 43. Es fehlen je ein Chromosomen
6,17 und 22. Die veränderten Karyotypen jeder Metaphase sind in Tabelle 6 aufgeführt.

Metaphase(n) SKY-Karyotyp Gewinne Verluste


1; 2; 3; 4; 8; 46,XX ÷ ÷
15;18;22 sowie 23
20 43XX, -6, -17, -22 ÷ 6;17;22

Tab. 6 Spektrale Karyotypisierung von Geki-2

Abb. 5 Spektraler Karyotyp der Kolonadenomzelllinie Geki-2

31
Ergebnisse

3.2.2 Kolonkarzinomzelllinie Geki-3


Direkt im Anschluss an eine Hemikolektomie rechts bei einer 88jährigen Patientin wurde
durch die Chirurgische Klinik natives Material eines 5 x 5 cm großen ulzerierenden
Tumors im Bereich des Ileoceocalpols bereitgestellt. Lymphknoten- oder Fernmetastasen
konnten im Rahmen der präoperativen Bildgebung und postoperativen histopathologischen
Untersuchung nicht festgestellt werden. Es handelte sich um ein UICC-Stadium I
[pT2pN0pM0G2]. Mikrosatelliteninstabilität lag nicht vor. Die Erstdiagnose war im Jahr
2000. Die Etablierung der Zelllinie, sowie die Vorbereitung und Durchführung der
Spektralen Karyotypisierung erfolgte entsprechend dem im Methodenteil beschriebenen
Verfahren. Geki-3 wurde in Passage 35 abgestoppt und die Chromosomen in Pepsin für 10
Minuten vorbehandelt. Die Denaturierungszeit in Formalin betrug 4 Minuten. Von Geki-3
konnten 12 Metaphasen mittels SKY analysiert, und die Chromosomen eindeutig
zugeordnet werden. Der Karyotyp von Geki-3 weist durchschnittlich einen diploiden
Chromosomensatz mit zwei zusätzlichen Markerchromosomen auf. Bei acht Metaphasen
liegt die Chromosomenzahl bei 48, zweimal bei 47 und jeweils eine Metaphase zeigt eine
Anzahl der Chromosomen von 46 bzw. 45 auf. In allen Metaphasen zeigt ein Chromosom 9
bei 9q32 eine Translokation mit Material von Chromosom 14 [der(9)t(9;14)(del 9q32)]. In
einer Metaphase findet sich an einem Chromosom 3 ein Materialverlust ab 3q25
(Metaphase 1). Chromosom 5, sowie Chromosom 12 liegen in Metaphase 30 einfach,
Chromosom 17 in vier Metaphasen (11;25;26;30) ebenfalls einfach vor. Chromosom 14
liegt in einer Metaphase (26) dreifach und in elf Metaphasen vierfach vor. Drei der
Chromosomen 14 zeigen dabei in zehn Metaphasen einen Materialverlust ab 14q24. Eine
Metaphase zeigt diese Veränderung in zwei Chromosomen 14 (Metaphase 3). Für die
detaillierten Karyotypen jeder Metaphase siehe Tabelle 7 und Abbildung 6.

32
Ergebnisse

Metaphase SKY-Karyotyp Gewinne Verluste


1 48,XX,del3(q25),der(9)t(9;14)del(9q32),-14,+(del 14q24)x3 14 3
3 48,XX,der(9)t(9;14)del(9q32),+(del 14q24)x2 14 ÷
11 47,XX,der(9)t(9;14)(del9q32),-14,+(del14q24)x3,-17 14 17
16 48,XX,der(9)t(9;14)(del9q32),-14,+(del 14q24)x3 14 ÷
17 48,XX,der(9)t(9;14)(del9q32),-14,+(del 14q24)x3 14 ÷
18 48,XX,der(9)t(9;14)(delq32),-14,+(del 14q24)x3 14 ÷
19 48,XX,der(9)t(9;14)(del9q32),-14,+(del 14q24)x3 14 ÷
25 47,XX,der(9)t(9;14)(del9q32),-14,+(del 14q24)x3,-17 14 17
26 46,XX,der(9)t(9;14)(del9q32),-14x2,+(del 14q24)x3,-17 14 17
28 48,XX,der(9)t(9;14)(del9q32),-14,+(del 14q24)x3 14 ÷
30 45,XX,-5,der(9)t(9;14)del(9q22),-12,-14,+(del 14q24)x3,-17 14 5; 12; 17
31 48,XX,der(9)t(9;14)del(9q22),-14,+(del 14q24)x3 14 ÷
Tab.7 Spektrale Karyotypisierung von 12 Metaphasen (Geki-3)

Abb. 6 Spektraler Karyotyp der Kolonkarzinomzelllinie Geki-3 (Metaphase 28)

3.2.3 Kolonkarzinomzelllinie Geki-4


Direkt postoperativ an eine Hemikolektomie rechts bei einer 79jährigen Patientin wurde
durch die Chirurgische Klinik natives Material eines etwa 5 cm großen randwärts
erhabenen, mit zentraler Einsenkung, Tumors im Colon ascendens bereitgestellt. Der
Tumor lag etwa 1,5 cm aboral der Bauhin’schen Klappe. Fernmetastasen waren im Rahmen
der präoperativen Bildgebung bereits sichergestellt. Bei der postoperativen
histopathologischen Untersuchung wurden zudem Lymphknotenmetastasen festgestellt. Es
handelte sich um ein UICC-Stadium IV [pT3pN2pM1G2]. Mikrosatelliteninstabilität lag
nicht vor. Die Erstdiagnose war im Jahre 2001 erfolgt, die Patientin verstarb im Jahre 2002.

33
Ergebnisse

Die Etablierung der Zelllinie sowie die Vorbereitung und Durchführung der Spektralen
Karyotypisierung erfolgte entsprechend dem im Methodenteil beschriebenen Verfahren.
Geki-4 wurde in Passage 17 abgestoppt und die Chromosomen in Pepsin für 30 Sekunden
vorbehandelt. Die Denaturierungszeit in Formalin betrug 4 Minuten, die Nachdenaturierung
1 Minute. Von Geki-4 konnten 6 Metaphasen mittels SKY analysiert und die
Chromosomen eindeutig zugeordnet werden. Der Karyotyp von Geki-4 weist
durchschnittlich einen triploiden Chromosomensatz auf. Bei drei Metaphasen liegt die
Chromosomenzahl bei 75, bei den weiteren drei analysierten Metaphasen jeweils bei 77, 73
sowie 71. Veränderungen finden sich in allen Metaphasen in den Chromosomen 1, 3, 7, 8,
9, 19, 20, 22 und X. Chromosom 1 liegt in zwei Metaphasen (12;16) dreimal, in vier
Metaphasen (11;14;15) viermal, in einer Metaphase (7) fünfmal vor. Alle Metaphasen
zeigen in einem Chromosom 1, zum einen bei 1p13 eine Translokation mit Material von
Chromosom 17, zum anderen fehlt Chromosomenmaterial ab 1q32
[der(1)[t(1;17)del)(1p13)][del(1q32)]]. In Metaphase 7 kann diese Translokation in zwei
Chromosomen 1 nachgewiesen werden. Chromosom 2 liegt in zwei Metaphasen (7;12)
viermal vor. In diesen zwei Metaphasen zeigt sich in einem Chromosom 2 bei 2q31 eine
Translokation mit Material von Chromosom 8 [der(2)t(2;8)del(2q31)]. Diese Translokation
[der(2)t(2;8)del(2q31)] liegt ebenfalls in Metaphase 16 vor. Chromosom 3 liegt in allen
Metaphasen vierfach vor. Chromosom 4 liegt in zwei Metaphasen (7;12) zweifach vor. In
zwei der vier Metaphasen (14;15) mit triploid vorliegendem Chromosom 4 findet sich eine
Translokation bei 4q27 [der(4)t(4;6)del(4q27)] und eine Metaphase mit Translokation bei
4q13 mit Material von Chromosom 6 [der(4)t(4;6)del(4q13)] (Metaphase 11). Chromosom
5 liegt in drei Metaphasen (11;14;15), Chromosom 6 liegt in einer Metaphase (16) vierfach
vor. In fünf Metaphasen findet sich ein viertes Chromosom 7 mit fehlendem
Chromosomenmaterial ab 7q11.2 (Metaphasen 11;12;14;15;16). Diese strukturelle
Veränderung zeigt sich ebenfalls bei einem dritten Chromosom 7 in Metaphase 7 mit zwei
unauffälligen Chromosomen 7. Chromosom 8 liegt in den Metaphasen 14 und 15 je
zweimal, in den Metaphasen 12 und 16 je dreimal, in Metaphase 11 viermal und in
Metaphase 7 fünffach vor. In allen Metaphasen findet sich ein iso-Chromosom 8, wobei in
allen Metaphasen die kurzen Arme fehlen und die langen Arme am Zentromer
zusammenhängen. In Metaphase 7 zeigt sich zudem in zwei Chromosomen 8
Materialverlust im langen Arm, in Metaphase 12 findet sich diese Veränderung bei einem
Chromosom 8. Eine genaue Angabe bzgl. der Höhe des Verlustes lässt sich aufgrund der

34
Ergebnisse

schlecht beurteilbaren G-Bänderung in der DAPI-Färbung nicht machen. Chromosom 9


liegt in fünf Metaphasen (7;11;12;14;15) vierfach, in Metaphase 16 fünffach vor. In allen
Metaphasen findet sich dabei bei 9p22 eine Translokation mit Material von Chromosom 11
[der(9)t(9;11)del(9p22)]. Chromosom 10 liegt in Metaphase 15 vierfach, Chromosom 11 in
den Metaphasen 11 und 16 zweifach und in Metaphase 7 vierfach vor. In Metaphase 12 mit
drei Chromosomen 11 sowie in Metaphase 7 mit vier Chromosomen 11 findet sich jeweils
bei 11p11.2 eine Translokation mit Material von Chromosom 20
[der(11)t(11;20)del(11p11.2)]. Chromosom 12 liegt in vier Metaphasen (7;12;14;15)
viermal, in Metaphase 16 fünfmal vor. Chromosom 13 liegt in Metaphase 12 vierfach vor,
Chromosom 14 in Metaphase 14 zweifach und in Metaphase 7 vierfach vor. Chromosom 16
liegt in den Metaphasen 11;12;15 vierfach vor. In drei Metaphasen (7;11;15) liegt
Chromosom 17 zweifach, in Metaphase 16 einfach vor. Die Chromosomen 18 liegen in
allen sechs Metaphasen zweifach, Chromosom 19 in Metaphase 14 zweifach vor. Bei
Chromosom 20 findet man in zwei Metaphasen (11;14) fünf Chromosomen, in drei
Metaphasen (7;12;15) vier Chromosomen und in Metaphase 16 zwei Chromosomen 20.
Chromosom 22 liegt in allen Metaphasen zweifach, Chromosom X in allen Metaphasen
vierfach vor. Die detaillierten Karyotypen sind in Tabelle 8 und in Abbildung 7 aufgeführt.

Metaphase SKY-Karyotyp Gewinne Verluste


7 77,XXX, 1; 2; 3; 8; 9; 11; 4; 7; 18; 22
+[der(1)[t(1;17)del)(1p13)][del(1q32)]]x2, 12; 14; 20; X
+der(2)t(2;8)del(2q31);+3,-4,del7(q11.2),-8,
+del8(q?)x2,+iso 8(delp11),
+der(9)t(9;11)del(9p22),
+der(11)t(11;20)del(11p11.2),+12,+14,-17,
-18,+20,-22,+X
11 75,XXX, 1; 3; 5; 6; 7; 8; 4; 11; 17;
+der(1)[t(1;17)del(1p13)][del(1q32)],+3, 9; 16; 20; X 18; 22
der(4)t(4;6)del(4q13),+5,+del 7(q11.2),
+iso8(delp11),+der(9)t(9;11)del(9p22),-11,
+16,-17,-18,+20x2,-22,+X
12 75,XXX, der(1)[t(1;17)del(1p13)][del(1q32)], 2; 3; 7; 8; 9; 12; 1; 4; 11; 18;
+der(2)t(2;8)del(2q31),+3,-4,+del 7(q11.2), 13; 16; 20; X 22
del 8(q?),iso 8(del p11),
+der(9)t(9;11)del(9p22),
der(11)t(11;20)del(11p11.2),+12,+13,+16,
-18,+20,-22,+X
14 73,XXX, 1;3;5;7;9;11;12; 4;8;14;18;
+der(1)[t(1;17)del(1p13)][del(1q32)],+3, 17;20; X 19;22
der(4)t(4;6)del(4q27),+5,+del 7(q11.2),-8,
iso8 (del p11),+der(9)t(9;11)del(9p22),+12,
-14,-18,-19,+20x2,-22,+X

35
Ergebnisse

15 75,XXX, 1; 3; 5; 7; 9; 10; 4; 8; 17; 18; 22


+der(1)[t(1;17)del(1p13)][del(1q32)],+3, 11; 12; 16; 20; X
der(4)t(4;6)del(4q27),+5,+ del7(q11.2),-8,
iso8 (delp11),+der(9)t(9;11)del(9p22),+10,
+12,+16,-17,-18,+20,-22,+X
16 71,XXX,der(1)[t(1;17)del(1p13)][del(1q32)], 3; 6; 7; 8; 9; 12; 1; 2; 11; 17; 18;
der(2)t(2;8)del(2q31),+3,+6,+ del 7(q11.2), X 20; 22
iso8(delp11),+9,+der(9)t(9;11)del(9p22),-11,
+12x2,-17x2,-18,-20,-22,+X
Tab.8 Spektrale Karyotypisierung von 6 Metaphasen (Geki-4)

Abb.7 Spektraler Karyotyp der Kolonkarzinomzelllinie Geki-4 (Metaphase 11)

3.2.4 Kolonkarzinomzelllinie Geki-5


Direkt im Anschluss an eine Hemikolektomie rechts bei einer 76jährigen Patientin wurde
durch die Chirurgische Klinik natives Material eines etwa 10 cm großen ulzerierenden
Tumors im Bereich der Bauhin’schen Klappe bereitgestellt. Lymphknotenmetastasen
konnten sowohl in der präoperativen Bildgebung, sowie postoperativen histopathologischen
Untersuchung nachgewiesen, Fernmetastasen konnten nicht festgestellt werden. Es handelte
sich um ein UICC-Stadium III (pT4pN2M0G3). Mikrosatelliteninstabilität konnte
nachgewiesen werden.
Die Erstdiagnose war im Jahre 2001, die Patientin verstarb im Jahre 2002. Die Etablierung
der Zelllinie, sowie die Vorbereitung und Durchführung der Spektralen Karyotypisierung
erfolgte entsprechend dem im Methodenteil beschriebenen Verfahren. Geki-5 wurde
erstmalig in Passage 6, sowie in Passage 36 abgestoppt, und die Chromosomen der Passage
36 in Pepsin für 30 Sekunden vorbehandelt. Die Denaturierungszeit in Formalin betrug für
die frühe Passage 2,5 Minuten, für die späte Passage 2 Minuten.

36
Ergebnisse

3.2.4.1 Geki-5 Passage 6


Von Geki-5 Passage 6 konnten 13 Metaphasen mittels SKY analysiert und die
Chromosomen eindeutig zugeordnet werden. Der Karyotyp von der frühen Passage Geki-5
weist durchschnittlich einen diploiden Chromosomensatz mit 46 Chromosomen auf. Bei
zehn Metaphasen liegt ein normaler Karyotyp mit 46 Chromosomen und ohne strukturelle
Veränderungen vor. Bei zwei Metaphasen (3;13) liegt die Chromosomenzahl bei 45, in
Metaphase 3 fehlt Chromosom 11, in Metaphase 13 Chromosom 2. Metaphase 19 zeigt
eine Chromosomenzahl von 49 und weißt zudem multiple strukturelle Veränderungen auf.
Dabei zeigt sich eine reziproke Translokation zwischen den Chromosomen 3 und 9 und
eine zweite reziproke Translokation zwischen den Chromosomen 3 und 18. Der
Bruchpunkt für die Translokation mit Material des Chromosoms 9 liegt bei 3q13. In
Chromosom 9 liegt er bei 9p13 für die Translokation mit Chromosom 3
[t(3)t(3;9)(3q13)(9p13)]. Im zweiten Chromosom 3 liegt der Bruchpunkt für die reziproke
Translokation mit Chromosom 18 bei 3q29. Im Chromosom 18 liegt dieser Bruchpunkt für
die Translokation mit Chromosomenmaterial 3 bei 18p11.3 [t(3;18)(3q29)(18p11.3)].
[der(18)t(3;18)del(18p11.3)] Diese Translokation mit Material von Chromosom 3 im
kurzen Arm findet sich bei beiden Chromosomen 18. Ein Chromosom 21 zeigt bei 21p11
eine Translokation mit Material von Chromosom 10 [der(21)t(10;21)del(21p11)]. Eines der
Chromosomen 10 liegt nur bruchstückhaft vor. Eine genaue Aussage über die Lokalisation
der Deletionen ist anhand der G-Bänderung in der DAPI-Färbung nicht möglich. Die
Chromosomen 1 und 2 liegen einzeln, Chromosom 7 und das X-Chromosom dreifach,
sowie das Chromosom 20 vierfach vor. Die detaillierten Karyotypen jeder Metaphase sind
in Tabelle 9 aufgeführt. Abbildung 8 zeigt den Karyotyp der stark veränderten Metaphase
19.

37
Ergebnisse

Metaphase(n) SKY-Karyotyp Gewinne Verluste


1; 2; 4; 6; 8; 10; 46,XX ÷ ÷
10a; 18; 21;
sowie 23
3 45,XX,-11 ÷ 11
13 45,XX,-2 ÷ 2
19 49,XX,-1,-2,-3x2,+t(3)t(3;9)(3q13)(9p13), 3; 7; 13; 20; X 1; 2; 18
+t(3;18)(3q29)(18p11.3), +7,amp8(p?),-9,
der10(?),+13,-18,der(18)t(3;18)del(18p11.3),+20x2,
der(21)t(10;21)del(21p11),+X
Tab. 9 Spektrale Karyotypisierung von 13 Metaphasen (Geki-5(6))

Abb. 8 Spektraler Karyotyp der Kolonkarzinomzelllinie Geki-5(6) (Metaphase 19)

3.2.4.2 Geki-5 Passage 36


Von Geki-5 Passage 36 konnten 10 Metaphasen mittels SKY analysiert und die
Chromosomen eindeutig zugeordnet werden. Der Karyotyp von acht Metaphasen zeigt
einen diploiden Chromosomensatz mit 46 Chromosomen. Bei Metaphase 20 finden sich 45,
bei Metaphase 11 44 Chromosomen. Bei sechs Metaphasen liegt ein normaler Karyotyp vor
(2;3;7;15;16;19). In Metaphase 11 mit 44 Chromosomen fehlen die Chromosomen 14 und

38
Ergebnisse

22 und es zeigt sich im langen Arm von Chromosom 10 eine Amplifikation. Eine exakte
Angabe der Lokalisation im langen Arm von Chromosom 10 ist wegen der schlechten G-
Bänderung in der DAPI-Färbung nicht möglich. Eine weitere Amplifikation zeigt sich im
langen Arm von Chromosom 7 (Metaphase 18) bei einer Chromosomenzahl 46. Auch dabei
ist die genau Lokalisation aufgrund der unscharfen G-Bänderung nicht möglich. Zwei
Metaphasen (16;20) zeigen in Chromosom 19 eine Translokation mit Material von
Chromosom 10 bei 19q13.3 [der(19)t(10;19)del(19q13.3)] und in Chromosom 10 eine
Deletion ab 10q24. In Metaphase 20 fehlt zudem ein Chromosom 13.
Die Karyotypen jeder Metaphase sind in Tabelle 10 und Abb.9 aufgeführt.

Metaphase(n) SKY-Karyotyp Gewinne Verluste


2; 3; 7; 46,XX ÷ ÷
15; 16; sowie 19

11 44,XX,amp10(q?),-14,-22 10 14; 22
16 46,XX,del 10(q24), ÷ 10; 19
der(19)t(10;19)del(19q13.3)

18 46XX,amp(7q?) 7 ÷
20 45,XX,del 10(q24),-13, ÷ 10; 13; 19
der(19)t(10;19)del(19q13.3)

Tab. 10 Spektrale Karyotypisierung von 10 Metaphasen (Geki-5(36))

Abb.9 Spektraler Karyotyp der Kolonkarzinomzelllinie Geki-5 (Metaphase 15)

39
Ergebnisse

3.3 Fingerprinting-Analyse der Kolonkarzinomzelllinien Geki-2-5

Die Zelllinien Geki-2 und -5 sind mit hoher Wahrscheinlichkeit gleichen Ursprungs, d. h.
entstammen der gleichen Zelllinie. Unterschiede in einzelnen Genorten (z.B. in FGA)
beruhen dabei wohl auf unabhängige Mutationsereignisse bei verschiedenen Zellklonen. Da
bei Geki-5 teilweise vier Allele pro Locus (z.B. in vWA) gefunden werden, handelt es sich
dabei möglicherweise um Mischpopulationen mit unterschiedlichem Mutationsstatus.

Geki-2 Geki-3 Geki-4 Geki-5


D8S1179 14/17/18 14 10/11 14/17/18
D21S11 28/29 31.2 30/31 28/29
D7S820 10/12 10 10/11 9/10/12
CSF1PO 10/11 10/11 12/13 10/11
D3S1358 14/15 14/15 18 14/15
TH01 6/9.3 8 6/8 6/9.3
D13S317 11/12 12/13 11/13 11/12
D16S539 11/12 11 9/12 11/12
D2S1338 18/21 17/23 19 18/21
D19S433 13/14/15 14 14/14.2 13/14/15
vWA 15/20 16/18 17/18 15/16/20/21
TPOX 9/10 8/11 8/11 9/10
D18S51 13 14 17 13
D5S818 8/14 12 10/13 8/14
FGA 19/22 21/24 21 19/22/23
Amelogenin X X X X
Tab. 11 Genotypisierung der Zelllinien Geki-2, -3, -4 und -5

40
Diskussion

4 Diskussion

4.1 Zellkulturmodelle der Adenom-Karzinom-Sequenz


Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei Kolonkarzinomzelllinien und eine
Adenomzelllinie etabliert und durch spektrale Karyotypisierung (SKY) sowie
Mikrosatellitenanalyse charakterisiert. Der native Primärtumor und die korrespondierende
Normalschleimhaut sind verfügbar. Ergebnisse, die aus Zellkulturstudien gewonnen
wurden, können dadurch am Primärtumor auf DNA, RNA und Proteinebene verifiziert
werden. Der klinische Verlauf der Patienten steht seit der Operation lückenlos zur
Verfügung. Eine Kontamination mit anderen Karzinomzellen wurde durch eine
Fingerprinting-Analyse ausgeschlossen. Für die Erforschung der Karzinogenese und der
Prüfung von Substanzen zur Chemoprävention und Chemotherapie stehen damit gut
charakterisierte Adenom- und Karzinomzelllinien in frühen Passagen zur Verfügung.
Obwohl normale Epithelzelllinien für solche Studien dringend benötigt würden, nutzen die
meisten Arbeitsgruppen weder Epithelzelllinien, noch Adenomzelllinien, sondern
überwiegend kommerziell erhältliche Kolonkarzinomzelllinien. Dies liegt an einer
Diskrepanz zwischen den verfügbaren Kolonkarzinomzellinien (n = 24 in der „American
Type Culture Collection“ ATCC) und den Adenom- und Epithelzelllinien. Außer der in
unserem Labor etablierten Adenomzelllinie Geki2 sind nur noch vier weitere
Adenomzelllinien beschrieben, die allerdings nicht in Zellbanken zur Verfügung stehen
(PC/ AA: Berry und Paraskeva, 1988; RG/C2, AA/Cl, BH/C1: Hague et al., 1997). Aus
normalen Kolonepithelzellen konnte bisher noch keine Zelllinie etabliert werden. Staufer et
al. haben zwar 1995 zwei Zelllinien aus normaler Mukosa isoliert, die jedoch nach näherer
Analyse im Verlauf der Kultur maligne Eigenschaften entwickelten. Im Rahmen dieser
Arbeit konnte gezeigt werden, dass die putative Kolonepithelzelllinie NCOL-1 (Deveney et
al., 1996) der mikrosatelliteninstabilen Kolonkarzinomzelllinie Lovo entspricht. Die
Genotypisierung der Zelllinien NCOL-1a, -1b und Lovo zeigte identische Allele in 6 Loci
(D16S359, D2S1338, D8S1179, D21S11, D18S51, TH01) mit einer Genotyp-Frequenz von
0,000004587 und einer Übereinstimmungswahrscheinlichkeit von 99,9995412. Daraus
folgt ein gemeinsamer genetischer Ursprung der drei Zelllinien. Lovo und NCOL-1b sind
in zwei weiteren Loci identisch (FGA, SE33) mit einer kombinierten Genotyp-Frequenz
von 8,573103exp-11 und einer Übereinstimmungswahrscheinlichkeit von > 99,99999, die

41
Diskussion

Zelllinien NCOl-1a und -1b haben in zwei weiteren Loci identische Genotypen (D3S1358,
vWA) und in zwei anderen Loci (D3S1358, D3S1358) keine Übereinstimmung. Diese
Differenzen scheinen das Resultat einer Mutation (z.B. D3S1358, VWA) oder eines
heterozygoten Verlustes (D8S1179) zu sein, der bei Zelllinien auftreten kann, die aus
Malignomen etabliert wurden, vor allem da es sich hier um einen mikrosatelliteninstabilen
Tumor handelt.

4.2 Mikrosatellitenstabile und –instabile Kolonkarzinomzelllinien


Vergleicht man die Karyotypen der kommerziellen mikrosatelliten
Kolonkarzinomzelllinien Colo 206F und Colo 678 mit der kommerziellen
mikrosatelliteninstabilen Zelllinie Lovo, dann findet man bei den mikrosatellitenstabilen
Karzinomzellen deutlich mehr Veränderungen im Karyotypen, sowohl struktureller, als
auch numerischer Art, im Gegensatz zu den mikrosatelliteninstabilen Karzinomzellen. Es
konnte gezeigt werden, dass mikrosatelliteninstabile Kolonkarzinome chromosomal stabil
und mikrosatellitenstabile Karzinome chromosomal instabil sind (Melcher et al., 2002;
Abdel-Rahman et al., 2001). Zusätzlich existiert allerdings noch eine Gruppe von
kolorektalen Karzinomen (ca. 30 %), die weder chromosomal- noch mikrosatelliteninstabil
sind (Hawkins et al., 2001, Risques et al., 2003, Chang et al., 2006, Kets et al., 2007). Trotz
einer weitgehenden chromosomalen Stabilität existieren in allen MSI-Zelllinien vereinzelte
chromosomale Aberrationen, und zwar vor allem Translokationen. Diese Translokationen
sind teilweise reziprok, wie z. B. bei der Zelllinie Lovo (Melcher et al., 2002) oder HCA7
(Abdel-Rahman et al., 2001). Die Karyotypen der MSI-Zelllinie ähneln damit mehr denen
von Leukämiezellen als denen von chromosomal instabilen Zelllinien. Bei Leukämiezellen
findet man überwiegend einen diploiden Karyotyp mit vereinzelten, oft balancierten
Translokationen. Diese Translokationen resultieren oft in Fusionsgenen. Dabei sind meist
Transkriptionsfaktoren oder Thyrosinkinasen betroffen (Mitelman et al., 2004). Auch bei
soliden Tumoren konnten Fusionsgene identifiziert werden, die durch balancierte
Translokationen entstehen. So wiesen Tomlins et al. (2005) Genfusionen zwischen der 5´-
untranslatierten Region von TMPRSS2 (21q22) und mehreren Mitgliedern der ETS-Familie
(ERG (21q22), ETV1 (7p21), ETV4 (17q21) nach, die zu einer Überexpression der
entsprechenden ETS-Proteine führten. Ob es bei MSI-Kolonkarzinomzellen zu ähnlichen
Veränderungen kommt, ist bisher nicht ausreichend untersucht. Dadurch, dass nur 10 -15 %
aller sporadischen Kolonkarzinome eine Mikrosatelliteninstabilität aufweisen und die

42
Diskussion

Kultivierung von Kolonkarzinomzelllinien schwierig ist, gibt es bisher nur wenige


Karyotypisierungen von dieser Kolonkarzinomsubgruppe. In weiteren Studien muss die
Bedeutung von Fusionsgenen in MSI-Karzinomen untersucht werden.

4.3 Charakterisierung kommerzieller und selbstetablierter


Zelllinien

4.3.1 Kreuzkontamination als Problematik bei der Etablierung


eigener Zelllinien
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zusätzlich zu der bereits etablierten und
ausgearbeiteten Kolonkarzinomzelllinie Geki-1 die Kolonadenomzelllinie Geki-2 und drei
weitere Kolonkarzinomzelllinien (Geki -3, -4, -5) aus nativem Tumormaterial gewonnen
und deren Karyotypen mittels SKY zytogenetisch charakterisiert werden. Leider zeigte eine
Genotypisierung mittels Fingerprinting-Analyse, dass nur die Zelllinien Geki-3 und -4
originäre Zellkulturen sind, und Geki-5 mit der Zelllinie Geki-2 identisch war. Die
Karyotypisierung von Geki-5 zeigte allerdings einen Klon mit komplexen chromosomalen
Veränderungen, die offensichtlich den Rest der ursprünglich etablierten
Kolonkarzinomzelllinie darstellt. Nach einer Kontamination mit Geki-2, deren Ursache
auch nach intensiven Nachforschungen nicht gefunden werden konnte, ist es zu einem
„Überwachsen“ der Kolonkarzinomzelllinie mit Adenomzellen gekommen. Daraus muss
ein geringes in-vitro Wachstumspotential der Karzinomzelllinie geschlossen werden. Die
adenomatöse Herkunft von Geki-2 konnte durch Fingerprintinganalysen gezeigt werden
und ein Wachstum in der Nacktmaus war nicht nachweisbar (Menzel et al., 2002). Dem
Problem der Kreuzkontamination wurde in der Literatur erstmals 1970 durch Walter
Nelson-Rees Bedeutung geschenkt. Er konnte aufzeigen, dass ein Großteil verschiedener
Zelllinien, die von Zellbanken vertrieben und in den Labors in aller Welt benutzt werden,
mit Hela-Zellen identisch sind (Nelson-Rees et al, 1974). Immer mehr verschiedene
Zelllinien verschiedenstartiger Gewebe sind mittlerweile beschrieben. Es stellt sich die
Frage nach der derzeit tatsächlichen verbreiteten Kreuzkontamination in den verschiedenen
Zelllinien. Auch unter den Kolonkarzinomzelllinien sind bereits Kreuzkontaminationen
beschrieben worden. Es ist zum Beispiel gezeigt worden, dass die Zelllinien WiDr/HAT-29
(Chen et al., 1987), DLD-1/HCT-15 (Chen et al, 1995) und die Linien DLD-1/HCT-

43
Diskussion

15/HCT-8/HRT-18 (Vermeulen et al, 1998) einen gemeinsamen genetischen Hintergrund


besitzen.

4.3.2 Chromosomale Veränderungen bei kommerziellen und


selbstetablierten Zelllinien
In der (kommerziellen) mikrosatelliteninstabilen Kolonkarzinomzelllinie Lovo wurden
lediglich vier amplifizierte chromosomale Areale auf den Chromosomen 5, 7, 12 und 15
und keine Deletionen gefunden. Die steht in guter Übereinstimmung mit der Beobachtung,
dass mikrosatelliteninstabile Karzinome meistens eine weitgehende chromosomale
Stabilität aufweisen (s. Kapitel 4.2). Keine chromosomalen Veränderungen konnten in der
Adenomzelllinie Geki-2 gefunden werden. Es gibt nur wenige Studien zu chromosomalen
Veränderungen kolorektaler Adenome. Im Jahr 1998 untersuchten Bomme et al. 24
kolorektale Adenome mit klassischen Bänderungsverfahren (G-Bänderung) und fanden im
Gegensatz zu unseren Ergebnissen häufige Gewinne im Bereich der Chromosomen 3, 7, 13,
und 20 und Verluste von Chromosomen 18. In dieser Arbeit wurden aber auch zwei
Adenome ohne chromosomale Veränderungen beschrieben. Offensichtlich entsteht die für
den Großteil der kolorektalen Karzinome (85 %) typische chromosomale Instabilität nach
der Entstehung der Adenome, aber vor der endgültigen Progression zum Karzinom. Bei
diesen chromosomal instabilen Zelllinien ist das Resultat der chromosomalen
Veränderungen (Deletionen, Amplifikationen und Translokationen) Zugewinne und
Verluste von chromosomalen Bereichen. Dabei kann es zu einer Aktivierung von
Onkogenen (im Rahmen der Zugewinne) und zu einer Inaktivierung von
Tumorsuppressorgenen (im Rahmen der Verluste) kommen. Tabelle 12 zeigt einen
Vergleich der zugewonnenen und verlorenen chromosomalen Areale in den untersuchten
chromosomal instabilen Zelllinien. Dabei wurden nur die Veränderungen berücksichtigt,
die in mindestens der Hälfte der untersuchten Metaphasen gefunden werden konnten. Eine
Ausnahme bildet der Klon 19 der Zelllinie Geki-5 (Passage 6), der mutmaßlich den Zustand
vor der Kreuzkontamination mit Geki-2 zeigt. Die von uns identifizierten chromosomalen
Veränderungen waren nicht zufällig, sondern es ergab sich ein bestimmtes Muster von
häufig deletierten (Chromosom 18) und amplifizierten Regionen (3; 5; 7; 11; 13; 20). In
den häufig deletierten Regionen liegen potentielle Tumorsuppressorgene (DCC/ SMAD4:
18q21.1), in den häufig amplifizierten Regionen Onkogene (z.B. Cyclin D1: 11q13.3). Dies
steht in guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen bei der

44
Diskussion

Analyse von Kolonkarzinomen, aber auch mit den Ergebnissen in einigen späten
Adenomen (Bomme et al., 1998). Dabei sind die Veränderungen bei kommerziellen und
selbstetablierten Kolonkarzinomzelllinien sehr ähnlich. Die kommerziellen Linien sind
bereits seit Jahren in Kultur, ohne dass die Kulturbedingungen zu einer spontanen
Progression der chromosomalen Instabilität führen. Ein möglicher Grund dafür ist, dass die
chromosomale Instabilität in vivo als Anpassungsmechanismus der Tumorzelle dienen
kann, um auf äußere Einflüsse (z.B. Chemotherapie) reagieren zu können, so dass eine
Zunahme der chromosomalen Instabilität in vivo als Produkt von
Selektionierungsprozessen gesehen werden kann.

MSI-Status Gewinne Verluste


Geki-2 - (Adenom)
Lovo + 5; 7; 12; 15
Colo-206F - 3; 5; 6; 7; 11;13; 15; 17, 20 1; 8 ; 10; 14; 18;
21; 22

Colo-678 - 1; 3; 5; 7; 10; 11; 12; 13; 15; Y


20; X
Geki-3 - 14
Geki-4 - 1; 3; 5; 7; 8; 9; 11; 12; 14; 20; 4; 11; 17;18; 22
X

Geki-5 + 3; 7; 13; 20; X 1; 2; 18


(Subklon)
Häufige -/+ 3; 5; 7; 11; 13; 20 18
Alterationen
>= 3/6
Tab. 12 Chromosomale Aberrationen bei kommerziellen und selbstetablierten
Kolonadenom-, und Karzinomzelllinien

45
Zusammenfassung

5 Zusammenfassung

1.) Etablierung eines Zellkulturmodells zur Adenom-Karzinom-Sequenz


Da die in-vitro Kultivierung von epithelialen Tumorzellen schwierig ist, und die
Metaphasengewinnung an primärem Material nicht in ausreichender Menge und Qualität
möglich ist, wurden in der Vergangenheit meist kommerzielle Kolonkarzinomzelllinien für
Studien zur Kolonkarzinogenese verwendet. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei
Kolonkarzinomzelllinien und eine Adenomzelllinie etabliert. Der native Primärtumor und
die korrespondierende Normalschleimhaut sind verfügbar. Damit steht nun ein Modell der
Adenom-Karzinom-Sequenz zur Verfügung und Ergebnisse, die aus Zellkulturstudien
gewonnen wurden, können am Primärtumor auf DNA, RNA und Proteinebene verifiziert
werden.

2.) Charakterisierung der neuetablierten Adenom- und Karzinomzelllinien mittels der


spektralen Karyotypisierung (SKY)
Die neuetablierten Kolonkarzinomzelllinien Geki-3 und -4 und die Adenomzelllinie Geki-2
wurden mit den kommerziellen Zelllinien Colo206F und Colo678 verglichen. Dazu wurde
eine Charakterisierung mittels der spektralen Karyotypisierung (SKY) sowie einer
Mikrosatellitenanalyse durchgeführt. Im Gegensatz zu der Adenomzelllinie fanden sich in
allen untersuchten Kolonkarzinomzelllinien multiple chromosomale Aberrationen. Dabei
zeigten sich keine wesentlichen Unterschiede zwischen den kommerziell erhältlichen
Zelllinien, die schon Jahre in Kultur sind und den neuetablierten Linien. Obwohl die
chromosomale Instabilität in-vivo wichtig für die Karzinomentstehung und -metastasierung
ist, kommt es unter Kulturbedingungen offenbar nicht zu einer Progression der
chromosomalen Instabilität.

3.) Charakterierung der normalen Koleonepithelzelllinie NCOL-1 mittels SKY und


Fingerprinting-Analyse
Neben Adenom- und Karzinomzelllinien wären normale Kolonepithelzelllinien für Studien
zur Kolonkarzinogenese ebenfalls von großer Wichtigkeit. Die Etablierung von normalen
Epithelzelllinien ist allerdings noch schwieriger als die Etablierung von Adenomzelllinien.
Aus normalen Kolonepithelzellen wurde bisher nur die Etablierung der Epithelzelllinie
NCOL-1 beschrieben (Deveney et al., 1996). Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt

46
Zusammenfassung

werden, dass diese Zelllinie der mikrosatelliteninstabilen Kolonkarzinomzelllinie Lovo


entspricht. Die Genotypisierung der Zelllinien NCOL-1a, -1b und Lovo zeigte identische
Allele in 6 Loci (D16S359, D2S1338, D8S1179, D21S11, D18S51, TH01) mit einer
Genotyp-Frequenz von 0,000004587 und einer Übereinstimmungswahrscheinlichkeit von
99,9995412. Daraus folgt ein gemeinsamer genetischer Ursprung der drei Zelllinien, so
dass zurzeit keine normale Kolonepithelzelllinie verfügbar ist.

47
Literaturverzeichnis

6 Literaturverzeichnis

Aaltonen LA, Peltomaki P, Leach FS, Sistonen P, Pylkkanen L, Mecklin JP, Jarvinen H,
Powell SM, Jen J, Hamilton SR, Petersen G, Kinzler KW, Vogelstein B, de la Chapelle
(1993) Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science 260:812-816

Abdel-Rahman WM, Katsura K, Rens W, Gorman PA, Sheer D, Bicknell D, Bodmer WF,
Arends MJ, Wyllie AH, Edwards PA (2001) Spectral karyotyping suggests additional
subsets of colorectal cancers characterized by pattern of chromosome rearrangement. Proc
Natl Acad Sci U S A 98:2538-2543

Arribas R, Risques RA, Gonzalez-Garcia I, Masramon L, Aiza G, Ribas M, Capella G,


Peinado MA (1999a) Tracking recurrent quantitative genomic alterations in colorectal
cancer: allelic losses in chromosome 4 correlate with tumor aggressiveness. Lab Invest
79:111-122.

Berry RD, Paraskeva C (1988) Expression of carcinoembryonic antigen by adenoma and


carcinoma derived epithelial cell lines: possible marker of tumour progression and
modulation of expression by sodium butyrate. Carcinogenesis 9: 447-450

Bisgaard ML, Jager AC, Dalgaard P, Sondergaard JO, Rehfeld JF and Nielsen FC (2001)
Allelic loss of chromosome 2p21-16.3 is associated with reduced survival in sporadic
colorectal cancer. Scand J Gastroenterol 36:405-409.

Bomme L, Bardi G, Pandis N, Fenger C, Kronborg O, Heim S. (1998) Cytogenetic analysis


of colorectal adenomas: karyotypic comparisons of synchronous tumors. Cancer Genet
Cytogenet. 106:66-71

Chang SC,Lin JK,Yang SH,Wang HS,Li AF,Chi CW (2006) Relationship between genetic
alterations and prognosis in sporadic colorectal cancer. Int J Cancer 118: 1721-7

48
Literaturverzeichnis

Chen TR, Dorotinsky CS, McGuire LJ, Macy ML, Hay RJ. (1995) DLD-1 and HCT-15
cell lines derived seperatly from colorectal carcinomas have totally different chromosome
changes but the same genetic origin. Cancer Genet Cytogenet 81:103-108

Chen TR, Drabkowski D, Hay RJ, Macy M, Peterson W Jr. (1987) WiDr is a derivative of
another colon adenocarcinoma cell line, HT-29. Cancer Genet Cytogenet 27:125-34

Cunningham C, Dunlop MG, Bird CC, Wyllie AH (1994) Deletion analysis of chromosome
8p in sporadic colorectal adenomas. Br J Cancer 70:18-20.

Deveney, C. W., L. Rand-Luby, M. J. Rutten, C. A. Luttropp, W. M. Fowler et al. (1996)


Establishment of human colonic epithelial cells in long-term culture. J Surg Res 64: 161-
169

Eppert K, Scherer SW, Ozcelik H, Pirone R, Hoodless P, Kim H, Tsui L C, Bapat B,


Gallinger S, Andrulis I L, et al. (1996) MADR2 maps to 18q21 and encodes a TGFbeta-
regulated MAD-related protein that is functionally mutated in colorectal carcinoma. Cell
86:543-552.

Fearon ER and Vogelstein B (1990) A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell
61:759-767.

Gustafson CE, Wilson PJ, Lukeis R, Baker E, Woollatt E, Annab L, Hawke L, Barrett JC,
Chenevix-Trench G (1996) Functional evidence for a colorectal cancer tumor suppressor
gene at chromosome 8p22–23 by monochromosome transfer. Cancer Res 56: 5238-5245

Hague, A., G. D. Diaz, D. J. Hicks, S. Krajewski, J. C. Reed et al. (1997) bcl-2 and bak
may play a pivotal role in sodium butyrate-induced apoptosis in colonic epithelial cells;
however overexpression of bcl-2 does not protect against bak-mediated apoptosis. Int J
Cancer 72: 898-905

49
Literaturverzeichnis

Hahn SA, Schutte M, Hoque AT, Moskaluk CA, da Costa LT, Rozenblum E, Weinstein
CL, Fischer A, Yeo CJ, Hruban RH and Kern SE (1996) DPC4, a candidate tumor
suppressor gene at human chromosome 18q21.1. Science 271:350-353.

Hawkins NJ, To mlinson I, Meagher A, Ward RL. (2001) Microsatellite-stable diploid


carcinoma: a biologically distinct and aggressive subset of sporadic colorectal cancer.Br J
Cancer 84:232-6

Iniesta P, Massa MJ, Gonzalez-Quevedo R, de Juan C, Moran A, Sanchez-Pernaute A,


Cerdan J, Torres A, Balibrea JL and Benito M (2000) Loss of heterozygosity at 3p23 is
correlated with poor survival in patients with colorectal carcinoma. Cancer 89:1220-1227.

Kets CM, van Krieken JH, van Erp PE, Feuth T, Jacobs YH, Brunner HG, Ligtenberg MJ,
Hoogerbrugge N. (2007) Is early-onset microsatellite and chromosomally stable colorectal
cancer a hallmark of a genetic susceptibility syndrome? Int J Cancer Oct 23; [Epub ahead
of print]

Knudson AG: Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma. Proc Natl Acad Sci
USA 68:820–3 (1971)

Lee AS, Seo YC, Chang A, Tohari S, Eu KW, Seow-Choen F, McGee JO (2000) Detailed
deletion mapping at chromosome 11q23 in colorectal carcinoma. Br J Cancer 83:750-755.

Lothe RA, Andersen SN, Hofstad B, Meling GI, Peltomaki P, Heim S, Brogger A, Vatn M,
Rognum TO, Borresen AL (1995) Deletion of 1p loci and microsatellite instability in
colorectal polyps. Genes Chromosomes Cancer 14:182-188.

Melcher R, Al-Taie O, Kudlich T, Hartmann E, Maisch S, Steinlein C, Schmid M,


Rosenwald A, Menzel T, Scheppach W, Lührs H (2007) SNP-Array genotyping and
spectral karyotyping reveal uniparental disomy as early mutational event in MSS- and MSI-
colorectal cancer cell lines. Cytogenet Genome Res 118:214-221

50
Literaturverzeichnis

Melcher R, Köhler S, Steinlein C, Müller CR, Schmid M, Luehrs H, Menzel T,


Scheppach W, Moerk H, Scheurlen M, Köhrle, J, Al-Taie O (2002) Spectral karyotype
analysis of colon cancer cell lines of the tumor suppressor and mutator pathway Cytogenet
Genome Res 98:22-8

Melcher R, Maisch S, Koehler S, Bauer M, Steinlein C, Schmid M, Kudlich T,


Schauber J, Luehrs H, Menzel T, Scheppach W (2005) SKY and genetic fingerprinting
revealed a cross contamination of the putative normal colon epithelial cell line NCOL-1.
Cancer Genet Cytogenet 158: 84-87

Melcher R, Steinlein C, Feichtinger W, Müller CR, Menzel T, Lührs H, Scheppach W,


Schmid M (2000) Spectral karyotyping of the human colon cancer cell lines SW480 and
SW620. Cytogenet. Cell Genet. 88: 145-152

Melcher R, von Golitschek R, Steinlein C, Schindler D, Neitzel H, Kainer K, Schmid M,


Hoehn H. (2000) Spectral karyotyping of Werner syndrome fibroblast cultures. Cytogenet
Cell Genet 91:180-5

Menzel T*, Melcher R*, Koehler S, Dusel G, Backhaus K, Ott G, Breithaupt W, Al-Taie O,
Schauber J, Gostner A, Scheppach W, Luhrs H (2004) Establishment of a colonic adenoma
cell line (GEKI-2): spectral karyotype analysis and functional characterization. Int J
Colorectal Dis 19:12-17 *Autoren gleichberechtigt

Mertens F, Johansson B, Höglund M, Mitelman F. 1997. Chromosomal Imbalance Maps of


Malignant Solid Tumors: A Cytogenetic Survey of 3185 Neoplasms. Cancer Res. 57: 2765-
2780

Mitelman F, Johansson B, Mertens F. (2004) Fusion genes and rearranged genes as a linear
function of chromosome aberrations in cancer. Nat Genet 36:331-4

Nelson-Rees WA, Flandermeyer RR, Hawthorne PK. (1974) Banded marker chromosomes
as indicators of intraspecies cellular contamination. Science 212: 446-452

51
Literaturverzeichnis

Praml C, Finke LH, Herfarth C, Schlag P, Schwab M, and A mler L (1995) Deletion
mapping defines different regions in 1p34.2-pter that may harbor genetic information
related to human colorectal cancer. Oncogene 11:1357-1362

Risques RA,Moreno V,Ribas M,Marcuello E,Capella G,Peinado MA. (2003) Genetic


pathways and genome-wide determinants of clinical outcome in colorectal cancer. Cancer
Res 63:7206-14

Schröck, E., deManoir, T., Veldman, T., Schoell, B, Wienberg, J., Ferguson-Smith, M. A.,
Ning, Y., Ledbetter, D. H., Bar-Am, I., Soenksen, D., Garini, Y., Ried, T. (1996)
Multicolor Spectral Karyotyping of Human Chromosomes. Science 273: 494-497

Shih IM, Zhou W, Goodman SN, Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstein B. (2001)
Evidence that genetic instability occurs at an early stage of colorectal tumorigenesis.
Cancer Res 61:818-22

Stauffer JS, Manzano LA, Balch GC, Merriman RL, Tanzer LR, Moyer MP. (1995)
Development and characterization of normal colonic epithelial cell lines derived from
normal mucosa of patients with colon cancer. Am J Surg 169:190-5

Tomlins SA, Rhodes DR, Perner S, Dhanasekaran SM, Mehra R, Sun XW, Varambally S,
Cao X, Tchinda J, Kuefer R, Lee C, Montie JE, Shah RB, Pienta KJ, Rubin MA,
Chinnaiyan AM. (2005) Recurrent fusion of TMPRSS2 and ETS transcription factor genes
in prostate cancer. Science 310:644-8

Tomlinson IP, Bodmer WF (1996) Chromosome 11q in sporadic colorectal carcinoma


patterns of allele loss and their significance for tumorigenesis. J Clin Pathol 49:386-390.
Vermeulen SJ, Chen TR, Speleman F, Nollet F, van Roy FM, Mareel MM. (1998) Did the
four human cancer cell lines DLD-1, HCT-15, HCT-8, and HRT-18 originate from one and
the same patient? Cancer Genet Cytogenet 107:76-79

52
Literaturverzeichnis

Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR, Kern SE, Preisinger AC, Leppert M, Nakamura Y,
White R, Smits AM, Bos JL. (1988) Genetic alterations during colorectal-tumor
development. N Engl J Med 319:525-32.

Weitz J, Koch M, Debus J, Hohler T, Galle PR, Buchler MW. (2005) Colorectal cancer.
Lancet 365:153-165.

Whitehead RH, Watson NK (1997) Gastrointestinal cell lines as a model for differentiation.
In: Halter F, Winton D, Wright NA (Editoren). The gut as a modell in cell and molecular
biology. Volume 94. Falk Symp Dordrecht: Kluwer Academic, 1997:275-290

Yana I, Kurahashi H, Nakamori S, Kameyama M, Nakamura T, Takami M, Mori T, Takai


S, Nishisho I (1995) Frequent loss of heterozygosity at telomeric loci in 22q in sporadic
colorectal cancers. Int J Cancer 60:174-177.

Young J, Leggett B, Ward M, Thomas L, Buttenshaw R, Searle J, Chenevix-Trench G


(1993) Frequent loss of heterozygosity on chromosome 14 occurs in advanced colorectal
carcinomas. Oncogene 8:671-675

53
Anhang

7 Anhang

7.1. Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

Tab. 1 Spektrale Karyotypisierung von 11 Metaphasen (NCOL-1b)


Tab. 2 Spektrale Karyotypisierung von 10 Metaphasen (LoVo)
Tab. 3 Spektrale Karyotypisierung von 10 Metaphasen (Colo 678)
Tab. 4 Spektrale Karyotypisierung von 10 Metaphasen (Colo 206F)
Tab. 5 Genotypisierung der Zelllinien NCOL-1a, -1b und Lovo
Tab. 6 Spektrale Karyotypisierung von Geki-2
Tab.7 Spektrale Karyotypisierung von 12 Metaphasen (Geki-3)
Tab.8 Spektrale Karyotypisierung von 6 Metaphasen (Geki-4)
Tab. 9 Spektrale Karyotypisierung von 13 Metaphasen (Geki-5(6))
Tab. 10 Spektrale Karyotypisierung von 10 Metaphasen (Geki-5(36))
Tab. 11 Genotypisierung der Zelllinien Geki-2, -3, -4 und -5
Tab. 12 Chromosomale Aberrationen bei kommerziellen und selbstetablierten
Kolonadenom-, und karzinomzelllinien

Abb. 1 Spektraler Karyotyp der Kolonkarzinomzelllinie NCOL-1b


Abb. 2 Spektraler Karyotyp der Kolonkarzinomzelllinie Lovo
Abb. 3 Spektraler Karyotyp der Kolonkarzinomzelllinie Colo-678 (Metaphase 19)
Abb. 4 Spektraler Karyotyp der Kolonkarzinomzelllinie Colo-206F (Metaphase 4)
Abb. 5 Spektraler Karyotyp der Kolonadenomzelllinie Geki-2
Abb. 6 Spektraler Karyotyp der Kolonkarzinomzelllinie Geki-3 (Metaphase 28)
Abb. 7 Spektraler Karyotyp der Kolonkarzinomzelllinie Geki-4 (Metaphase 11)
Abb. 8 Spektraler Karyotyp der Kolonkarzinomzelllinie Geki-5(6) (Metaphase 19)
Abb. 9 Spektraler Karyotyp der Kolonkarzinomzelllinie Geki-5 (Metaphase 15)

54
Anhang

7.2 Veröffentlichungen

Abstracts/ Posterpreise:
1.) Maisch S., Scheppach W., Melcher R. (2002) Etablierung und zytogenetische
Charakterisierung von Kolonadenom- und Kolonkarzinomzelllinien.
(Promomed-Kongress Würzburg: 2. Posterpreis Würzburg 2002)

2.) Maisch S, Steinlein C, Dusel G, Kudlich T, Schauber J, Weber F, Gostner A, Luehrs H,


Menzel T, Schmid M, Scheppach W, Melcher R. Establishment and cytogenetic characteri-
zation of colon adenoma and carcinoma cell lines. Gastroenterology 2003;124:A602-A603
(„Poster of distinction“ DDW, Orlando, USA)

Artikel:
1.) Melcher R, Maisch S, Koehler S, Bauer M, Steinlein C, Schmid M, Kudlich T, Schauber
J, Luehrs H, Menzel T, Scheppach W (2005) SKY and genetic fingerprinting revealed a
cross contamination of the putative normal colon epithelial cell line NCOL-1. Cancer Genet
Cytogenet 158: 84-87

2.) Melcher R, Al-Taie O, Kudlich T, Hartmann E, Maisch S, Steinlein C, Schmid M,


Rosenwald A, Menzel T, Scheppach W, Lührs H (2007) SNP-Array genotyping and
spectral karyotyping reveal uniparental disomy as early mutational event in MSS- and MSI-
colorectal cancer cell lines. Cytogenet Genome Res 118:214-221

55
Anhang

7.3 Verzeichnis der akademischen Lehrer

Meine akademischen Lehrer in Würzburg waren die Damen und Herren


Professoren:

Allolio, Angermann, Asan, Bauer, Bauersachs, Becker, Beckmann, Blattert, Blind, Böck,
Bröcker, Claßen, Collmann, Csef, Darge, Debus, Dietl, Dietz, Drenckhahn, Einsele, Elert,
Ertl, Eulert, Faller, Fallgatter, Fein, Flentje, Franke, Freys, Friedl, Frosch, Fuchs, Galle,
Gassel, Geckle, Gerlach, Girschick, Gohlke, Grehn, Grimm, Guttenbach, Hahn,
Hamelmann, Hamm, Hebestreit, Helms, Höcht, Höhn, Illert, Jahns, Jenett, Karschin, Keil,
Keller, Kellersmann, Klinker, Kneitz, Koepsell, Krämer, Kraus, Kugler, Lang,
Langenfeld, Larena-Avellaneda, Lesch, Lohse, Lüdinghausen, Lührs, Lutz, Mäurer, Marx,
Matthies, Menzel, Meyer, Müller, Müller-Hermelink, Müllges, Patzelt, Reiners K., Reiners
C., Reith, Rieckmann, Riedmiller, Roewer, Roggendorf, Roosen, Sailer, Schartl,
Scheppach, Scheurlen, Schindler, Schlegel, Schmidt, Schmied, Schneider, Sebald, Sefrin,
Seufert, Silbernagel, Sörensen, Solymosi, Sommer, Speer, Sprotte, Steffens, Stöber, Stoll,
Straßburg, Strotmann, Sütterlin, Thiede, Tony, Timmermann, Toyka, Völker, Vogel,
Wagner, Wahrmut-Metz, Waller, Walter, Wanner, Warnke, Weckbach, Wilms, Woydt

56
Anhang

Ehrenwörtliche Erklärung

Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die in dem Fachbereich Humanmedizin Würzburg zur
Promotionsprüfung eingereichte Arbeit mit dem Titel „Etablierung und zytogenetische
Charakterisierung von primären Kolonadenom- und Kolonkarzinomzelllinien“ an der
Medizinischen Klinik und Poliklinik II, Schwerpunkt Gastroenterologie, unter der Leitung
von Prof. Dr. med. W. Scheppach und später Prof. Dr. med. M. Scheurlen ohne sonstige
Hilfe selbst durchgeführt und bei der Abfassung der Arbeit keine anderen als in der
Dissertation angeführten Hilfsmittel benutzt habe.
Ich habe bisher an keinem in- und ausländischen Medizinischen Fachbereich ein Gesuch
zur Zulassung zur Promotion eingereicht noch die vorliegende oder eine andere Arbeit als
Dissertation vorlegt.

57
Anhang

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich allen danken, die mir mein Studium und die Vollendung
meiner Promotion ermöglichten.

Mein besonderer Dank gilt Dr. med. Ralph Melcher für die Bereitstellung des interessanten
Themas und für die fachliche Betreuung meiner Arbeit über den gesamten Zeitraum, sowie
seiner stetigen Ansprechbarkeit in den jeweiligen Labors an beiden Instituten. Dank seiner
konstruktiven Kritik, seinen Anregungen, seiner motivierenden Persönlichkeit und
Bereitschaft, die erzielten Ergebnisse, Erfolge und so manchen Rückschlag immer wieder
zu diskutieren und ggf. mit neuen Ideen auszubauen entstand die Arbeit in dieser Form.

Ich danke Prof. Dr. med Scheppach, sowie Prof. Dr. med. M. Scheurlen in der
Medizinischen Klinik II, Schwerpunkt Gastroenterologie, für die Möglichkeit, an ihrem
Labor mitarbeiten und einen großen Teil der Arbeit, insbesondere die Zellkultur,
durchzuführen zu dürfen.
In diesem Zusammenhang möchte ich mich bei dem gesamten Team des „Gastrolabors“
bedanken für die stete Hilfe, die vielen Tipps und Hilfestellungen, gerade am Beginn der
Arbeit und für das stets angenehme und oft lustige Arbeitsklima. Insbesondere erwähnen
hierbei möchte ich Gerda Dusel, die meine Zellkulturen stets mit Sorgfalt und Liebe
versorgte.

Ich danke Prof. Dr. rer. biol. hum. M. Schmid am Humangenetischen Institut, in dessen
Labor ich einen großen Teil meiner Arbeit verbrachte zur zytogenetischen
Charakterisierung der Tumorzellen und zur Ausarbeitung meiner Ergebnisse.
Danke v.a. Claus Steinlein für seine große Hilfe, stete freundliche Hilfsbereitschaft, seinen
Tipps und seiner großen Erfahrung.
Danke dem gesamten Team im Humangenetischen Labor für die stets nette, angenehme
und gute Stimmung, weit über die Laborarbeit hinaus.

Danke allen im IZKF-Projekt, insbesondere den Chirurgen der Universitätsklinik Würzburg


für die Bereitstellung von nicht vorbehandeltem Tumormaterial. Danke den Pathologen und
den Kollegen der Rechtsmedizin für die Fingerprintanalysen.

58
Anhang

Auch möchte ich mich bei all denen bedanken, die hier nicht namentlich erwähnt wurden,
die mir aber in irgendeiner Weise behilflich waren, sei es auch durch motivierende Worte.

Ganz besonders danke ich natürlich meinen Eltern für Ihre Geduld und permanente
Unterstützung.

59
Anhang

Lebenslauf
Persönliche Daten
Name Stefanie Maria Maisch
Geburtsdatum 09.03.1976
Geburtsort Bad Neustadt a.d. Saale

Schulausbildung
1982-1986 Grundschule Nordheim v.d. Rhön
1986-1996 Martin Pollich - Gymnasium; Mellrichstadt
Abschluss der Allgemeinen Hochschulreife

Berufsausbildung
1996-1999 Ausbildung zur Kinderkrankenschwester
Abschluss Examen Kinderkrankenpflege

Hochschulausbildung
WS 1999/2000 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin an der
Julius-Maximilian-Universität Würzburg

Prüfungen
30.08.2001 Ärztliche Vorprüfung
26.10.2005 Ärztliche Prüfung

Promotion
Seit 1.10.2002 Prof. Dr. med. W. Scheppach/
Prof. Dr. med. M. Scheurlen
Betreuer: Dr. med. R. Melcher
Schwerpunkt Gastroenterologie
Medizinische Klinik und Poliklinik II der Universität
Würzburg

Thema: Etablierung und spektrale Karyotypisierung


von primären Kolonadenom– und
Kolonkarzinomzelllinien

Berufliche Tätigkeit
Assistenzärztin
01.12.2005 – Prof. Dr. M. Sailer; Chirurgische Klinik
30.11.2007 Bethesda AK Bergedorf; Hamburg

Seit 01.12.2007 Dr. med. H.J. Düwel, Abteilung für Allgemein-,


Visceral- und Gefäßchirurgie am Klinikum
Meiningen; Meiningen
Sülzfeld, den 30.06.2008

60