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PROBENVORBEREITUNG 

UND 
UMGANG MIT BIOLOGISCHEN 
MATERIALIEN 

Gewebehomogenisierung 

Blender  Ultraschall‐ Potter  Hochleistungs‐


homogeni‐ Elvehjem  homogenisator 
sator  Homogen
isator  

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Blutabnahme und ‐aufarbeitung 
• Für größere Mengen an Blut:  
• Venipunktion 
 

Blutabnahme und ‐aufarbeitung 
• Für größere Mengen an Blut:  
• Venipunktion (einmalig) oder 
• Katheder (venflow) 
 

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Blutabnahme und ‐aufarbeitung 
• Für größere Mengen an Blut:  
• Venipunktion (einmalig) oder 
• Katheder (venflow) 
• Für kleinere Mengen: 
• Kapillarblut (aus der Fingerspitze) 
 

Probennahme: Blut ‐ Gerinnungshemmung 

• Heparinplasma (Li‐Heparin) 
• EDTA‐Plasma (K2EDTA) 
• Zitrat‐Plasma (3.8% Zitronensäure) 
 
• Serum mit/ohne Trenngel 
 

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Probennahme: Separation von Plasma und Erythrozyten 

• Zentrifugation (bei relativ niedriger g‐Zahl) 
• Eventuell Waschen 
• Weitere Auftrennung 
(Differential(ultra)zentrifugation) 

Probennahme: Separation von Plasma und Erythrozyten 

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Probennahme:  Auftrennung der Lipoproteine 

• Differential(ultra)zentrifugation 

(Ch)
Plasma VLDL

NaBr- LDL
Lösung HDL

Probennahme: Auftrennung der Lipoproteine 

• Differential(ultra)zentrifugation 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
• Trennung aufgrund der Dichte  
• (Chylomikronen, VLDL, LDL, HDL) 

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Probenvorbereitung 
 
 
1. Fettextraktion 
 
2.  Spurenelementanalytik 
 
3. Festphasenextraktion (solid phase extraction, 
SPE) in Hinblick auf LC/MS Analysen 
 
 

1. Fettextraktion 

 Soxhlet Fettextraktion 

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1. Fettextraktion 

Automatische Extraktionsgeräte: 
 
Einzelne Schritte (Extraktion, Spülen und 
 Trocknen) lassen sich programmieren 
 
Vorteil: die tatsächliche Anzahl an erforderlichen 
Extraktionszyklen wird auf jeder Position 
durchlaufen 
‐> reproduzierbare Extraktionsbedingungen 

1. Fettextraktion 

 Probenvorbereitung für die Analyse von 
Fettsäuren 
 Fettextraktion 
 eventuell HPTLC der Membranphospholipide 
 Verseifung der Triglyceridester 
 Reveresterung der freien Fettsäuren zu 
Methylfettsäureestern 
 GC‐Analyse der Methylfettsäureester 

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1. Fettextraktion 

 Rotationsverdampfer 

1. Fettextraktion 

 Accelerated Solvent Extraction (ASE) 

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1. Fettextraktion 

 Accelerated Solvent Extraction (ASE) 

2. Spurenelementanalytik 

 Trockene Veraschung: 
 
 Proben werden in geeigneten Gefäßen (Porzellan, Platin) unter 
Hitzezufuhr (500‐1000° C) verascht  
 Zur Bestimmung des Aschegehalts (Differenzwägung) 
 Zur Bestimmung von Mengenelementen (Na, K, Ca, Mg) 
 Ungeeignet für die Analyse von flüchtigen Spurenelementen (J, Se) 

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2. Spurenelementanalytik 

 Trockene Veraschung: 

Muffelofen 

2. Spurenelementanalytik 

 Nasse Veraschung: 
 
 Proben werden unter Zugabe eines Oxidationsmittels verascht (in 
der Regel eine Mischung aus H2O2 und HNO3) 
 Aufschluss erfolgt durch Erhitzung in der Mikrowelle oder unter 
Hochdruck 

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2. Spurenelementanalytik 

 Nasse Veraschung: 

Mikrowellen‐
aufschlussgerät 

2. Spurenelementanalytik 

 Nasse Veraschung: 

Rotoren und 
Reaktionsgefäße für 
Mikrowellenaufschluß 

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2. Spurenelementanalytik 

 Nasse Veraschung: 

Hochdruck‐
aufschlussgerät 

2. Spurenelementanalytik 
 
 Probennahme 
L4
L1
 ca. 5 g Lungengewebe von jedem Lungenlappen
(Alveolare Region)
L2
 5 g Gewebe von Leber und Niere
-> tiefgekühlt: -30°C
-> gefriergetrocknet
-> Mikrowellenaufschluss L3

L5

Probennahme

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Probenvorbereitung – menschliche 
Gewebe 
0.5 g gefriergetrocknetes Gewebe 
gespiked mit 196Pt, 108Pd 
+ 4 mL HNO3 + 1 mL H2O2  Isotopenverdünnungsanalyse 
(194Pt/196Pt; 195Pt/196Pt; 
Mikrowellenaufschluss  105Pd/108Pd; 106Pd/108Pd) 

1 min/250W; 1min/0W; je 5 min 
250W/400W/600W; 220°C 
Abrauchverfahren (offen) 
Einengen auf 500 µL 
+ 100 µL HF + 2 mL HCl (37%) 

Mikrowellenaufschluss 
1h, 400W, 220°C 

Abrauchverfahren (offen) 
einengen auf 200 µL; + 2 mL aqua regia 
einengen auf 200 µL; + 1 mL HCl (37%)  Verdünnung vor dem Messen 1:4; 
einengen auf 200 µL; + H2O subb;    ID‐ICP‐MS 
5 mL Endvolumen 

Analytisches set up 

Analytisches set‐up: 
USN 6000AT+  detector (SEM)
Element 1 
  electrostatic analyser
Quantifizierung:  magnetic sector field
IDMS (194Pt/196Pt,  
195Pt/196Pt) 
extraction lens
plasma torch
spray chamber

ICP‐SFMS  ion optics


skimmer cone
sampler cone

nebulizer

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Probenvorbereitung 
Probenvorbereitung für spezielle chemische Anforderungen: 
PFA (Perfluoralkoxy; trade name: Teflon) 
 
• Hochreines Polymer (Herstellung erfolgt unter Ausschluss 
   von Weichmachern und Füllstoffen) 
• sehr gute chemische Beständigkeit gegen fast alle Chemikalien 
• hohe thermische Stabilität von ‐270°C bis +250°C 
• extrem glatte Oberflächen herstellbar ‐> leicht zu reinigen 
   ‐> keine memory Effekte 
• autoklavierbar und sterilisierbar 

Probenvorbereitung 
Säure Ausdämpf Apparatur: zur Reinigung und Vorbereitung 
von Probengefäßen in der Ultra‐Spurenanalytik 
 
 
 
 
 
 
 
Vessel Cleaner (Reinigung von Mikrowellengefäßen) 
 
Säurereinigung 

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Probenvorbereitung 
Vessel Cleaner (Reinigung von Mikrowellengefäßen) 
 
 

How does it work? 
Vapor rises from the bath and condenses on the vessels; 
droplets carrying impurities and return to the acid bath. 

Probenvorbereitung 
Säurereinigung: subboiling   
Reinigung für Säuren (HNO3, HCl) oder H2O 
 
 
 

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Probenvorbereitung – Urin 
2 g Urin

Gespiked mit 108Pd


+ Standardaddition
Isotopenverdünnungsanalyse
+250µL HNO3, 1000µL H2O2, 500µL HCl,
(105Pd/108Pd; 106Pd/108Pd)
1240 µL H2O

UV-Aufschluss

Abrauchverfahren (offen)
einengen auf 200µL + 1 mL HCl (37%)
einengen auf 200 µL
2 g Probenvolumen

Probenvorbereitung bei der LC/MS 
Kopplung 
 
Welche Probenvorbereitung ist die richtige? 
 
Manuell oder automatisch? 
On‐line oder off‐line? 
Verdünnen oder Aufkonzentrieren? 

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Probenvorbereitung bei der 
  
LC/MS Kopplung 
Warum Probenvorbereitung? 
 
 Minimierung der Matrixeffekte 
 Eliminierung von Störsubstanzen 
 Aufkonzentrieren des Analyten 
 Verdünnen des Analyten 
 Belastung des LC/MS Systems wird verringert (geringere Kosten in 
der Erhaltung) 
 Genauere Ergebnisse  

Manuelle oder automatisierte Probenvorbereitung ? 

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Automatisierung 
 
 
• Probenvorbereitung: off‐line 
  SPE, LLE 
  Manuell oder automatisiert 
 
• Probenvorbereitung: on‐line 
  SPE, mehrdimensionale SPE,  
  Säulenschaltung 

3. Festphasenextraktion (Solid Phase 
Extraction SPE) 
Principles of SPE
    
SPE is an extraction process  
whereby an aqueous sample is filtered through a thin bed of 
sorbent particles,  
the analytes of interest are removed from the liquid matrix,  
and concentrated onto the sorbent.   
 
Once concentrated, the analytes are removed by an eluting 
solvent. 

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3. Festphasenextraktion (Solid 
Phase Extraction SPE) 

SPE Column 
 

3. Festphasenextraktion (Solid Phase 
Extraction SPE) 
Comparison of LLE vs SPE Disk 
    LLE        SPE disk 
     
 Uses 200 ‐ 500 ml solvent    Uses 2 ‐ 20 ml solvent 

     
 Shaking / continuous process     Filtration process 

 Forms emulsions       No emulsions formed 
     
 Little selectivity       Wide selectivity  
   
    (adsorbent)  
 Takes 1 ‐ 2 hours / sample 
      Takes 10 ‐ 20 min. / sample 

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3. Festphasenextraktion (Solid Phase 
Extraction SPE) 
What are the Benefits of SPE? 

 SPE uses less solvent than LLE 
 SPE is faster (at least 5 times) 
 High capacity  
 Total SPE costs are considerably less than LLE 
 High selectivity: broad choice of bonded phases and solvents 
 Automation much easier 
 

3. Festphasenextraktion (Solid 
Phase Extraction SPE) 

SPE Column 
accessories 
 

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3. Festphasenextraktion (Solid Phase 
Extraction SPE) 
            Silicagel‐Phases 
 
  Reversed Phase 
C18 
  Adsorption 
Si‐OH   
  Normal Phase 
NH2 
CN 
C‐OH(OH) 

3. Festphasenextraktion (Solid Phase 
Extraction SPE) 
         
          Anion Exchange 
Phases   N+ 
 NH2 
 Cation Exchange 
 C6H5‐SO3H 
 COOH 
 SO3H 
 Biochromatography 
 WP PEI (NH2)   
 WP Butyl (C4) 
 WP CBX (COO)   
Sephadex G‐25   

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3. Festphasenextraktion (Solid Phase 
Extraction SPE) 
         Interactions 
 
 
 Non polar:    van der Waals     ~20 KJ/mole 
 
 Polar:           Dipole / Dipole   ~ 40 KJ/mole 
    Hydrogen bond   ~40 KJ/mole 
 
 Electrostatic:   Ionic                     ~600 KJ/mole! 

3. Festphasenextraktion (Solid 
Phase Extraction SPE) 

4 Steps 
in SPE 

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3. Festphasenextraktion (Solid Phase 
Extraction SPE) 
Experiment 1: 
Rapid Extraction of 
natural dyes in beverages: 
sample load 

3. Festphasenextraktion (Solid Phase 
Extraction SPE) 
Experiment 1: 
Rapid Extraction of natural 
dyes in beverages: washing 
step 

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3. Festphasenextraktion (Solid Phase 
Extraction SPE) 
Experiment 1: 
Rapid Extraction of natural dyes in 
beverages: elution step 

3. Festphasenextraktion (Solid Phase 
Extraction SPE) 
 Online SPE‐LC 

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3. Festphasenextraktion (Solid Phase 
Extraction SPE) 
 Online SPE‐LC 

3. Festphasenextraktion (SPE) 

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Proteinfällung 

 Vorteile: 
hohe Wiederfindungsrate bei geeignetem Fällungsreagenz 
universell einsetzbar 
schnell durchführbar 
geringe Fehlerquellen, da keine komplizierten Bauteile oder 
Schaltungen verwendet werden 
 
 Nachteile: 
schwer automatisierbar 
Ionische Matrix bleibt erhalten ‐> Belastung des LC/MS Systems 

Verdünnen (Dilute and Shoot) 
 Vorteile: 
Alle Komponenten bleiben für die Messung erhalten (Analyt und Matrix!) 
geringer Aufwand für die Probenvorbereitung 
leicht automatisierbar 
kostengünstig 
 
 Nachteile: 
Die Matrix muss chromatographisch abgetrennt werden 
Belastung der analytischen Säule und des MS mit der Matrix 
hohe Empfindlichkeit des MS erforderlich 
 

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Festphasenextraktion 
 Vorteile: 
leicht automatisierbar 
direktes Einsetzen der Probe beim on‐line Betrieb 
Abtrennung der Matrix 
 
 Nachteile: 
schlechte Wiederfindungsrate bei polaren Analyten 
hoher Zeitaufwand beim Einengen des Eluates 
Kosten für die Kartuschen (Einmalkartuschen) 
höherer Zeitaufwand für die Methodenentwicklung als bei der Proteinfällung 
nicht universell einsetzbar 
 

Flüssig‐Flüssig‐Extraktion (LLE) 
 Vorteile: 
kostengünstiger als SPE 
schnelleres Einengen des Eluates als bei der SPE 
Matrix wird abgetrennt 
 
 Nachteile: 
schlechter automatisierbar als SPE 
schlechte Wiederfindungsrate bei polaren Analyten 
nicht universell einsetzbar 
 

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