Experimentelles

durch neMESYS 290 N Spritzenpumpen (#A3921000132, Cetoni GmbH, Deutschland) ermög-

licht, die mit Glasspritzen (500 µL PTFE 1/4-28UNF, 3010387, 1,0 mL PTFE 1/4-28UNF,
3010307 und 2,5 mL PTFE 1/4-28UNF, 3010308, SETonic, Deutschland) ausgestattet waren.

12.1.3 Aufbau der Magnetfalle

Die Magnetfalle bestand aus zwei Neodym-Magneten (15x4x4 mm, 1,35 T, NdFeB, # Q-15-04-
04-MN, WebCraft GmbH, Deutschland) auf beiden Seiten entweder eines FEP-Schlauches oder
einer Glaskapillare (2 µL Minicaps, end to end, #L919.2, Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.
KG, Deutschland). Die Magnete wurden durch Servomotoren (Top-Line RS2 MG/BB, mo-
delcraft, #205111-62, Conrad Electronic SE, Deutschland) betätigt, die von einem program-
mierbaren Arduino UNO Mikrocontroller (DIP Version ATMega328, EAN: 9783645652803,
Conrad Electronic SE, Deutschland) mit einem Adafruit-Prototyping-Shield (# EXP-R15-552,
EXP GmbH, Deutschland) gesteuert wurden. Die Magnetfeldlinien wurden mit der Software
Finite Elemente Methode Magnetics (Version 4.2) simuliert.

12.1.4 Optischer Aufbau

Um das Fluoreszenzsignal zu erfassen, verwendeten wir ein inverses Mikroskop (Nikon TS 100,
#203537, Nikon GmbH, Deutschland), das mit 2x (Nikon Plan Achromat UW, MRL00022, Nikon
GmbH, Deutschland) oder 4x (Nikon Plan Fluor, MRH00040, Nikon GmbH, Deutschland) Ob-
jektiven und einer CMOS-Kamera (Orca Flash 4.0 - C13400, #300556, Hamamatsu Photonics
K.K., Japan) und Hokawo - Imaging Software (v2.10, Hamamatsu Photonics K.K., Japan) und
NIS Elements BR (v5.02.01, Nikon GmbH, Deutschland). Ein Metallhalogenid (Intensivlicht C-
HGFI, #684409, Nikon GmbH, Deutschland) oder eine LED-Lichtquelle (SOLA SE II, #14904, LU-
MENCOR, USA) wurden mit Cy5 (Cy5 ET Filter Set, #F46-006, AHF Analysentechnik AG,
Deutschland) oder G-2A (MBE45500, Nikon GmbH, Deutschland) Fluoreszenzfilter verwendet.

128
 Kapitel 12

12.1.5 Mikrofluidisches Verfahren

Das Verfahren besteht aus den folgenden Schritten: (i) Tröpfchenerzeugung, umgekehrt zu Q1
(siehe Abbildung 1) (ii) Zugabe weiterer Reagenzien zu den Tröpfchen an den T-Übergängen.
Proben und Fluorophor-markierte Detektionsantikörper oder PBST (im Falle von Atto-647N-
Biotin-Experimenten). (iii) Inkubation bei konstanter Flussrate. Die Inkubationszeit: Atto-
647N-Biotin, 13,5 Minuten; Sandwich-Immunassays, 27 Minuten. (iv) Magnetische Bead-Ex-
traktion und Detektion des Fluoreszenzsignals an der Magnetfalle. Die magnetischen Beads
jeder Sequenz wurden nacheinander in der Magnetfalle angesammelt. Das Öffnen und Schlie-
ßen der Magnetfalle wurde mit dem fluidischen Arbeitsablauf synchronisiert. Weitere Einzel-
heiten sind im Abschnitt über die Ergebnisse und in den unterstützenden Informationen, Ab-
bildung S-1, enthalten.

12.1.6 Funktionalisierung der Beads mit Fängerantikörpern

Superparamagnetische Streptavidin-beschichtete Beads wurden mit den biotinylierten Fänge-
rantikörpern gemäß den Empfehlungen des Lieferanten funktionalisiert. Die magnetischen Be-
ads wurden zweimal mit PBST gewaschen und auf eine Konzentration von 0,1 mg/mL ver-
dünnt. Die Fängerantikörper wurden in Mengen zugegeben, die die Bindungskapazität der Be-
ads übersteigen und mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichter Bewegung
inkubiert. Nicht gebundene Antikörper wurden durch dreimaliges Waschen mit PBST entfernt.
Die Beads wurden in PBST auf die Endkonzentration rekonstituiert.

12.1.7 Bead-Extraktion unter verschiedenen Benetzungsbedingungen

Um die Bead-Extraktion in hydrophoben FEP-Schläuchen und hydrophilen Glaskapillaren zu
vergleichen, wurden die magnetischen Beads (c = 1 mg/mL) vor der Tröpfchenbildung mit
Atto-647N-Biotin (rot) angefärbt. Um die Tröpfchen sichtbar zu machen, wurde der wässrigen
Lösung ein Cy3-markiertes Oligonukleotid (grün, Cy3-Oli3 (KK), 44mer, #1916046, TIB Molbiol,
Deutschland) zugegeben (G-2A und Cy5-Filter (4 Bilder/s, Q = 1,5 µL/min).

129
Experimentelles

12.1.8 Bild- und Datenanalyse

Die Fluoreszenzintensitäten wurden mit ImageJ (Version 1.52d) analysiert. Die Fluoreszenz-
signale wurden als durchschnittliche Pixelintensität für eine rechteckige Fläche (Region of In-
terest, ROI) gemessen. Die Signalflanken wurden mit der Software OriginPro 2019 (Version
9.6.0.172) an die "untere Hüllkurve" angepasst. Nach dem Aufzeichnen gegen die Konzentra-
tionen wurden die Daten mit Hilfe von OriginPro 2019 durch eine 4-Parameter-Sigmoidale-
Funktion angepasst. Negativkontrollen (c(Ziel) = 0 - nicht in der logarithmischen Darstellung
darstellbar) wurden als niedrigster Wert in der Verdünnungsreihe hinzugefügt.

12.1.9 Gezielte Beschichtung der Glaskapillaren

Hydrophobierung

Um teilweise hydrophobe Glaskapillaren (2 µL Minikaps, end to end, #L919.2, Hirschmann La-

borgeräte GmbH & Co. KG, Deutschland) zu erhalten, wurden die Kapillaren dreimal mit Was-
ser, Isopropanol/Wasser (70:30, v/v) und Isopropanol gewaschen und in einem Vakuum-
schrank (60°C) über Nacht getrocknet. Dann wurden die Kapillaren aufrecht in 200 µL PCR-
Röhrchen (781305, Brand GmbH, Deutschland) platziert, die mit 65 µL einer Trich-
lor(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silan-Lösung (1 Vol-%, #448931, Sigma-Aldrich, Deutschland)
in FC-3283 gefüllt waren. Dabei wurden ca. 19 mm jeder Kapillare gefüllt. Nach 10 Minuten
bei Raumtemperatur wurden die Kapillaren mit Wasser und FC-3283 gewaschen und mit Stick-
stoff getrocknet. Dadurch wurde die Länge des hydrophilen (unbehandelten) Teils auf
13,2 ± 1,0 mm begrenzt.

Hydrophile Beschichtung

Um den nicht funktionalisierten Bereich der Kapillare mit einer PDMAA-Schicht zu versehen,
wurde zunächst eine 4-[3-(Triethoxysilyl)propyloxy]-benzophenon-Lösung (50 mmol/L in To-
luol, wasserfrei gelagert) in die getrockneten Kapillaren aufgenommen (Die Toluol-Lösung be-
netzte dabei nur den hydrophilen Teil). Die Kapillaren wurden auf eine Heizplatte (140°C) ge-
legt und mit Alufolie abgedeckt. Nach 30 min wurden die Kapillaren mit Toluol gewaschen (3x)

130
 Kapitel 12

und getrocknet. In den frisch silanisierten Bereich wurde eine filtrierte, wässrige i Lösung von
PDMAA-2,5%-MABP (10 mg/mL, Mn = 34 kg/mol, Mw = 100 kg/mol, 2018-03-28 NS) über die
Kapillarkräfte aufgesaugt (2x). Überschüssige Lösung wurde mit einem staubfreien Tuch auf-
genommen und die Kapillare mit Druckluft gereinigt. Zur photochemischen Vernetzung wur-
den die Kapillaren mit einer UV-Lampe (365 nm, 10 J/cm², Stratalinker 2400, Stratagene) be-
leuchtet.

12.1.10 Charakterisierung der Lichtquellen

Die Emissionsspektren der Lichtquellen wurden mit einem BLUE-Wave Spektrometer (UVN-25
- 600 g/mm, #16101419, StellarNet Inc., USA) in Kombination mit dem Cy5 ET Filtersatz analy-
siert. Die Faseroptik des Spektrometers wurde mit dem 4x-Objektiv fokussiert.

12.1.11 Bestimmung des Kontaktwinkels

Zur Bestimmung des Kontaktwinkels wurde ein Goniometer (OCA20, Data Physics Instruments
GmbH) verwendet. Zur Bestimmung des statischen Kontaktwinkels wurde ein Tröpfchen (5 µL,
2 µL/s) vorsichtig auf der zu analysierenden Oberfläche abgesetzt und von der Seite mit einer
CCD-Kamera aufgenommen. Für die dynamischen Messungen wurde das Volumen bis zum
Fortscheiten des Dreiphasenpunkts erhöht und anschließend bis zum Rückschreiten des Drei-
phasenpunkts reduziert (0,5 µL/s). Die Kontaktwinkel wurden mit Hilfe der Software OCA20
ermittelt.

12.1.12 Bestimmung von Schichtdicken

Die Bestimmung von Schichtdicken erfolgte auf Silizium-Wafern per Ellipsometrie (SE400adv,
SENTECH Instruments GmbH) bei einer Wellenlänge von 630 nm und einem Einfallswinkel
von 70°.

i
Häufig wird PDMAA-MABP auch durch eine ethanolische Lösung aufgebracht. Diese stoppt jedoch nicht an der
Grenze zur hydrophoben Beschichtung und füllt die ganze Kapillare. PDMAA-2,5%-MABP hat eine höhere Was-
serlöslichkeit als PDMAA-5%-MABP.

131
Experimentelles

12.1.13 Bestimmung der Grenzflächenspannung

Die Grenzflächenspannung zwischen zwei Flüssigkeiten wurde über die Pendant-Drop-Me-
thode bestimmt. Dafür wurde ein Tropfen an einer Kanüle (SNP-D 183/136, 1,83 mm) in eine
nicht mischbare Flüssigkeit geringerer Dichte dispensiert und mit Hilfe eines Goniometers
(OCA20, Data Physics Instruments GmbH) von der Seite mit einer CCD-Kamera aufgenommen.
Das Volumen des Tropfens wurde so groß wie möglich gewählt (bevor er von der Nadel fiel).
Die Oberflächenspannung wurden mit Hilfe der Software OCA20 (v5.0.41) an ermittelt.

12.1.14 Bedrucken der Objektträger

Zur Bestimmung der Sensitivität des Fluoreszenzmikroskops in Abhängigkeit der Lichtquelle
sollten schwarze Objektträger mit Hilfe eines Microarray-Spotters (Scienion S3) mit definierten
Farbstoffmengen bestückt werden. Dafür wurden schwarze COP-Objektträger mit Verdün-
nungsreihen von Atto-647N-Biotin bedruckt. Um auf etablierte Druck-Bedingungen zurück-
greifen zu können, wurde Atto-647N-Biotin (1,25µL, Konzentrationsreihe: 10 µmol/L bis 1
nmol/L in PBST) einer etablierten Zusammensetzung beigemischt. Diese beinhaltet: „Fabian
Polymer“-Lösung (Poly-(DMMA-co-5%-MABP-co-2,5%-SSNa, 5 µL, 10 mg/mL in Wasser), NaPi
(35 µL, 200 mmol/L) und eine Lösung des Oligonukleotids DRB1 (8,75 µL, 100 µmol/L).

Bei einer Tropfengröße von 0,4 nL und 5 Tropfen pro Spot liegt der erwartete Durchmesser
der gedruckten Spots bei ca. 200 µm. Aus den gewählten Farbstoff-Konzentrationen ergeben
sich dadurch: 104, 103, 102, 101, 1 Moleküle/µm². Nach Eintrocknen der Lösung wurden die
bedruckten Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet und ausgewertet (siehe
Kapitel 7.2.1). Anders als in gängigen Druck-Protokollen wurde auf eine UV-Vernetzung des
Polymers verzichtet um eine Beschädigung der Farbstoffe zu vermeiden.

Der Druck mit dem Microarray-Spotter wurde von Holger Frey durchgeführt.

132
 Kapitel 12

12.1.15 Synthese von P(DMAA-2.5%MABP)

In einem Schlenkkolben (100 mL) wurden frisch destilliertes Dimethylacrylamid (DMAA,

39,0 mmol, 4,02 mL), Methacryloyl-Benzophenon (MABP, 1,0 mmol, 226,4 mg) und Azo-
bis(isobutyronitril) [AIBN, 0,04 mmol, 1 mL (0,04 mmol/mL in DMF)] in Dimethylformamid
(29 mL) unter Stickstoff-Gegenstrom vorgelegt. Die Reaktionsmischung wurde durch dreifa-
che Anwendung der freeze-pump-thaw-Methode entgast und anschließend in ein vorgeheiz-
tes Wasserbad (60°C) gegeben. Nach 16 Stunden wurde die Polymerisation abgebrochen, in
Diethylether (ca. 400 mL) gefällt, in Dichlormethan gelöst und erneut gefällt. Nach Trocknen
im Hochvakuum wurde das Polymer (3,16 g, Mn = 34 kg/mol, Mw = 100 kg/mol, D = 3.0) als
weißer Feststoff erhalten.

Die Synthese wurde von Natalia Schatz durchgeführt.

133
Experimentelles

12.1.16 Bestimmung des Gesamtproteingehalts von Zelllysaten

Der Gesamtproteingehalts von frischen Zelllysaten wurde mit Hilfe eines Bradford-Assays be-
stimmt. Zur Erstellung einer Standardkurve wurde zunächst eine Verdünnungsreihe von BSA
in dem verwendeten Lysepuffer erstellt. Die einzelnen Verdünnungen wurden dann mit der
Coomassie Brilliant Blue G-250 (BioRad) versetzt. Mit einem UV/Vis-Spektrometer (IMPLEN
Nanophotometer, #1510) wurde dann die Absorbanz bei 595 nm gemessen. Nach Erhalt der
Kalibrationskurvej wurden die Zelllysate auf die gleiche Weise gemessen. Anhand der Kalibra-
tionskurve kann dann die Gesamtproteinkonzentration abgeschätzt werden.

Anschließend wurden die Zelllysate auf die gewünschte Gesamtproteinkonzentration (meist

1 mg/mL) mit dem entsprechenden Lysepuffer verdünnt.

Tabelle 7 die aus den

messerten erhaltenen
Gesamtproteingehalte am
Beispiel von 7 Messungen.
c(Gesamtprotein)
Probe
/mg/mL
1 2,9
2 1,9
3 3,9
4 1,5
5 6,4
6 2,5
7 5,4

Abbildung 70 Kalibrationskurve eines Bradford-Assays. Horizontal

sind die Absorbanzen von Zelllysaten eingezeichnet.

j
Für hohe Proteinkonzentrationen kann die Kalibrationskurve vom linearen Verlauf abweichen. In diesem Bereich
wird die Konzentrationsbestimmung weniger präzise. Wenn nötig, kann der lineare Messbereich durch Verrin-
gerung der Probenmenge in der Reaktionslösung zu höheren Konzentrationen verschoben werden.

134
 Kapitel 12

12.1.17 Beobachtung der Beadaggregation auf der Mikrotiterplatte

Superparamagnetische Beads (Dynabeads MyOne Streptavidin T1) wurden mit Fängerantikör-
pern (gegen mTOR als Positivkontrolle oder gegen IL-6 als Negativkontrolle) versehen und in
einer Mikrotiterplatte (96 well, PS, F-Boden (Kaminform), µCLEAR®, schwarz, non-binding,
Greiner, 655906) vorgelegt (30 µL, 50 µg/mL). Dazu wurde die jeweilige Reaktionsmatrix (30
µL) und die Detektionsantikörperlösung (30 µL, 1 µg/mL) pipettiert. Das Gemisch wurde auf
einem Kreisschüttler inkubiert (450 rpm, 25°C). Nach dem Waschen, wurden die Partikel unter
dem Mikroskop betrachtet

12.1.18 Bestimmung der Bindungskapazität für TQREP-Alexa647

Zur Etablierung des kompetitiven Assays zwischen dem Peptid TQREP und mTOR wurde zu-
nächst die Bindungskapazität der magnetischen Beads für das Peptid ermittelt. Zunächst wur-
den dafür die magnetischen Beads mit den mTOR-Fängerantikörpern gekoppelt. Anschließend
wurden die Beads einer Verdünnungsreihe (c(TQREP-Alexa647) = 0 – 1000 nmol/L) des Fluo-
reszenz-markierten Peptids ausgesetzt. In einer Mikrotiterplatte wurden magnetische Beads
vorgelegt (50 µL, 50 µg/mL) und mit den Probenlösungen (50 µL) für eine Stunde inkubiert.
Die Fluoreszenzsignale wurden ausgelesen und gegen die Konzentration des Peptids aufgetra-
gen (Abbildung 71). Daraus ergab sich eine Bindungskapazität von 10-50 nmol/L.

160

140

120
Signal

100

80

60

0,1 1 10 100 1000 10000 1000001000000

c(TQREP-Alexa647) [pmol/L]

Abbildung 71 Signale von TQREP-Alexa647 (c(TQREP-Alexa647) = 0 – 1000 nmol/L) auf magnetischen

Beads, die mit mTOR-Fängerantikörpern funktionalisiert wurden.

135
Experimentelles

136
 Kapitel 13

13 Anhang
13.1 Herleitung des mittleren Abstands von Molekülen zu einer Gefäßwand
Zur Berechnung des Abstands homogen verteilter Moleküle (rot) zum Gefäßrand werden fol-
gende Rahmenbedingungen angenommen:

Kreisfläche A = 𝝅 𝒓²
Radius R
Abstand eines Moleküls zur
ai = R- ri
Gefäßwand
Abstand des Moleküls zum
ri
Mittelpunkt
Anzahl der Moleküle N
Dichte der Moleküle p = N/A
Skizze zur Veranschauli-
chung der Rahmenbedingun-
gen.
Der mittlere Abstand 𝑎̅ ergibt sich dann aus:

1
𝑎̅ = ∫ 𝑝 𝑎 𝑑𝑥 𝑑𝑦 (19)
𝑁
𝐴

Nach Einführung von Polarkoordinaten erhält man:

2𝜋 𝑅
1 (20)
𝑎̅ = ∫ ∫ 𝑝 𝑎 𝑟 𝑑𝑟 𝑑𝜃
𝑁
0 0
𝑅
2𝜋 (21)
𝑎̅ = ∫ 𝑝 𝑎 𝑟 𝑑𝑟
𝑁
0
Nach Einsetzen der Rahmenbedingungen (p = N/A, A = 𝜋 𝑅², a = R- r) ergibt sich:
𝑅
2𝜋 𝑁 (22)
𝑎̅ = ∫ (𝑅 − 𝑟) 𝑟 𝑑𝑟
𝑁 𝜋 𝑅²
0
𝑅 𝑅
2
𝑎̅ = (∫ 𝑅𝑟 𝑑𝑟 − ∫ 𝑟² 𝑑𝑟) (23)
𝑅²
0 0
Nach Auflösen der Integrale folgt:
𝑅 (24)
𝑎̅ =
3

 In einem runden Reaktionsgefäß befinden sich homogen verteilte Moleküle durch-

𝑅
schnittlich in einem Abstand 𝑎̅ = 3 von der Gefäßwand.

Diese Berechnung wurde in Zusammenarbeit mit Emanuel Hecht durchgeführt.

137
Anhang

13.2 Auswertung der Tröpfchengrößen

Grundlegende fluidische Parameter wurden zunächst mit schwarz gefärbten Lösungen eruiert.
Dies ermöglichte eine optische Bestimmung der Größe und der Abstände der Tröpfchen. Dazu
wurden die Grauwerte aus Foto-Aufnahmen entlang des fluidischen Kanals mittels ImageJ be-
stimmt (Abbildung 72 a). Nach der Bestimmung eines Schwellenwertes wurden die Rohdaten
in eine binomische Darstellung überführt (Tröpfchen: +1, Abstände: -1). In dieser Darstellung
entsprechen die positiven Integrale der Länge und die negativen Integrale den Abständen der
Tröpfchen (Abbildung 72 b).

Abbildung 72 a) Überlagerung einer Aufnahme schwarz gefärbter Tröpfchen mit den zugehörigen
Helligkeitswerten. b) Umrechnung in eine binomische Darstellung. Durch diese Darstellung entspricht
das Integral des Signals der jeweiligen Länge. Positive Integrale entsprechen der Länge der Tröpfchen.
Negative Integrale entsprechen den Abständen der Tröpfchen.

138