Studiengang Life Science Engineering

2. Semester

Prof. Dr. Claudia Baldauf

Dipl.-Ing. (FH) Kristina Wiltner
M.Sc. Tim Kreißler

Labor Analytik C 044 Sommersemester 2021

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Aufarbeitung und Messung einer Obstprobe mittels HPLC zur Ermittlung
von Rückständen bestimmter Pflanzenschutzmittel

Ziele:
Im Rahmen dieses Versuches sollen folgende Kenntnisse erworben werden:
 instrumenteller Aufbau einer HPLC-Anlage (incl. UV-Vis-Detektor)
 eigenständige Inbetriebnahme der Anlage unter Zuhilfenahme der Softwareanleitung
 Aufarbeitung einer Obstprobe nach einer Multimethode der Pestizidanalytik
 Durchführung und Dokumentation sowie Interpretation der Messungen
 Auswertung der Ergebnisse
 Arbeiten im Team / arbeitsteiliges Vorgehen / strategisches Vorgehen

Inhalt:

1. Einführung .......................................................................................................... 2

2. Theoretische Grundlagen .................................................................................. 2

3. Versuchsdurchführung...................................................................................... 3
3.1 Probenaufarbeitung ....................................................................................... 3
3.2 Inbetriebnahme der HPLC-Analge ................................................................ 5
3.3 Messungen.................................................................................................... 5
3.4 Hinweise und Strategie ................................................................................. 5
3.5 Auswertung ................................................................................................... 6

4. Vertiefungsaufgaben ............................................................................................ 6

5. Empfohlene Literatur............................................................................................ 7
 Versuch HPLC/Stand März 2020/Seite 2 von 7

1. Einführung
HPLC – eine Abkürzung die heute in keinem Lehrbuch der Instrumentellen Analytik
fehlt. Während diese Buchstaben historisch der High Pressure Liquid
Chromatography zugeordnet wurden, hat sich heute die Bezeichnung High
Performance Liquid Chromatography durchgesetzt.
Die HPLC stellt eine geradezu ideale Ergänzung der Gaschromatographie (GC) dar,
da genau die Anforderungen, die den praktischen Einsatz in der GC in den meisten
Fällen begrenzen, in der HPLC entfallen. Dies gilt insbesondere für die unzersetzte
Verdampfung des Analyten, die unabdingbare Voraussetzung für die Anwendung
gaschromatographischer Methoden ist. Bei der HPLC stehen allein die Löslichkeit
der Analyten im entsprechenden Eluent und die Wechselwirkung mit dem gewählten
Säulenmaterial auf Grundlage der physikochemischen Eigenschaften im
Vordergrund. Die Detektion kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Gängig sind
UV-Vis-, Diodenarry- Fluoreszenz- oder Brechungsindex-Detektoren. Eine häufige
Gerätekonfiguration ist auch die Kopplung mit einem Massenspektrometer.
Übergeordnetes Ziel des Versuches ist es, den instrumentellen Aufbau und die
praktische Anwendung der HPLC kennen zu lernen.
Gegenstand der Untersuchungen ist die quantitative Analyse von Rückständen
bestimmter Pflanzenschutzmittel in einer realen Obstprobe. Dies erfolgt durch die
Aufarbeitung mit einer bekannten Methode der Pestizidanalytik und anschließender
Messung der Probe gegen Kalibrierfunktionen.

2. Theoretische Grundlagen
Aufgabe vieler öffentlicher Untersuchungsämter und Auftragslaboratorien ist die
Rückstandsanalytik von Lebensmittelproben zum Schutz der Verbraucher und zur
Überprüfung der Einhaltung der Rückstandshöchstmengenverordnung hinsichtlich
der Pflanzenschutzmittelrückstände. Dazu gibt es eine Sammlung mehrerer
etablierter Multimethoden zur Überführung von Probenmatrices in einen
chromatographisch messbaren Extrakt. Die in diesem Versuch verwendete Methode
QuEChERS ist gebräuchlich zur Aufarbeitung von pflanzlichen Lebensmitteln.
Die zu quantifizierenden Analyten (Abb.1) Metobroumuron und Amidosulfuron sind
Pflanzenschutzmittel der Wirkungsart Herbizide. Sie gehören zur Klasse der
Harnstoffderivate (Urone) und kommen im Ackerbau in der gesamten EU zum
Einsatz.

Abb. 1 Analyten
 Versuch HPLC/Stand März 2020/Seite 3 von 7

Isoproturon (Abb. 2) ist, wie der Trivialname schon vermuten lässt, ebenfalls ein Uron
und kann aufgrund eines Zulassungsverbotes in Deutschland als Interner Standard
der Aufarbeitungsmethode fungieren.

Abb. 2 Interner Standard

Welche physikalisch-chemischen Prozesse bei der verwendeten Trennsäule und

dem eingesetzten Detektor stattfinden, soll erarbeitet und im Protokoll dargestellt
werden.

3. Versuchsdurchführung
3.1 Probenaufarbeitung
Die Aufarbeitung einer Apfelprobe (85 % Wassergehalt) soll nach der gängigen Mini-
Multimethode QuEChERS erfolgen.
Grundsätzliche Schritte sind dabei die Extraktion der Rückstände mit einem
geeigneten Lösungsmittel, nachfolgend die Phasentrennung und schließlich die
Aufreinigung durch dispersive Festphasenextraktion mit einem speziellen Kieselgel
(angebundene primäre und sekundäre Amine, Abk. PSA).
Die eingesetzte Probe ist bereits homogenisiert und eingewogen. Die weiteren
Aufarbeitungsschritte sind dem schematischen Ablauf (Seite 4) zu entnehmen.

benötigte Geräte/Chemikalien
Geräte: Analysenwaage
Zentrifuge für 50 ml und 2 ml Zentrifugenröhrchen
Zentrifugenröhrchen (50 ml, 2 ml) mit Schraubverschluss
Wägeschiffchen, Spatel
µL-Pipetten
Probengläschen (HPLC-Vials)
Chemikalien: Acetonitril (für die HPLC)
NaCl, reinst
MgSO4, reinst
Bondesil – PSA (Primary Secondary Amine)
Matrix Standards (Level 1-4 Isoproturon, Metobromuron,
Amidosulfuron), Blindwert, jeweils in ACN-Matrix gelöst
 Versuch HPLC/Stand März 2020/Seite 4 von 7

Schematischer Ablauf zur Aufarbeitung einer Obstprobe mittels

Mini-Multimethode QuEChERS:

im 50-mL-Zentrifugenröhrchen:
10 g homogenisierte Probe (eingefroren)
Zugabe von H2O, so dass Probe einen Gesamtwassergehalt von 10 mL besitzt

+ 200 µL Interner Standard, 2-3 min einwirken lassen

+ 9,8 ml Acetonitril
(bei Proben mit pH > 5 essigsaures Acetonitril verwenden)

mindestens 1 min kräftig schütteln (von Hand) bis vollständig vermischt

+ 4 g MgSO4 + 1 g NaCl

UNVERZÜGLICH 30 sec schütteln (von Hand) bis klumpenfrei

5 min zentrifugieren, bei 4°C und 3000 g

43 mg PSA und 255 mg MgSO4

+ 1,7 mL Probenextrakt in 2-mL Schraubzentrifugenröhrchen überführen

UNVERZÜGLICH 30 sec schütteln (von Hand) bis klumpenfrei

2 min zentrifugieren, bei 4°C und 15.000 g

1 mL Extrakt in Vials zur HPLC-Messung überführen

 Versuch HPLC/Stand März 2020/Seite 5 von 7

3.2 Inbetriebnahme der HPLC-Analge

Machen Sie sich mit den Modulen der HPLC-Anlage (Thermo Scientific, Dionex
Ultimate 3000) mit Hilfe des Laborpersonals vertraut.
Betrachten Sie die Details des Messaufbaus wie z.B.
 Spritzenvolumen
 Sechswegeventil
 Pumpe und Druck
 Laufmittel (Eluenten)
 Funktionsweise des Autosamplers
 RP-Trennsäule C18
 Detektor, Lampenart
 Bedienung der Software Chromeleon (Softwareanleitung am Arbeitsplatz)

3.3 Messungen
Ermittelt werden soll, ob die vorgegebene Probe Rückstände der Herbizide
Amidosulfuron oder Metobromuron enthält, und wenn ja, in welcher Konzentration
(µg/mL). Der Interne Standard Isoproturon dient dabei der Überprüfung der
Aufarbeitungsmethode. Die zur Ermittlung benötigten Standards werden als
Matrixstandards bereitgestellt und sind bereits in der Processing Method der
Software hinterlegt.

Messparameter
Säule: Agilent Eclipse XDB; 3,5 µm; 3x150 mm
Laufmittel: A: H2O (1 mM Ammoniumacetat) B: Acetonitril
Gradient: 50 % B auf 70 % B in 3 min
70 % B auf 50 % B in 1 min
1 min halten
Fluss: 0,6 mL/min
Probevolumen: 10 µL 3 x Waschen nach Einspritzung
Wellenlänge: 245 und 270 nm

Änderungen vorbehalten

3.4 Hinweise und Strategie

Die Erstellung der Probentabelle erfolgt unter Zuhilfenahme der Softwareanleitung.
Jede Messung nimmt 5 Minuten in Anspruch. Jedes Chromatogramm sollte 1x
reproduziert werden (Doppelbestimmung). Zur Überprüfung des Gerätes und der
Methode wird ein Blindwert (aufgearbeitete Probenmatrix Matrix ohne Zusätze) vorn
angestellt.
Zur Zeitersparnis ist es ratsam, die Messungen bereits vor der Probenaufarbeitung
zu starten. Dazu soll die Anlage so programmiert werden, dass Blindwert und Matrix
Standards L1-4 automatisch gemessen werden. Zuletzt folgt nur noch die Messung
der aufgearbeiteten Apfelprobe.
 Versuch HPLC/Stand März 2020/Seite 6 von 7

Sind alle wichtigen Einstellungen vorgenommen kann die Messung gestartet werden.

3.5 Auswertung
Die Bearbeitung und Auswertung der Chromatogramme erfolgt nach
Softwareanleitung am Arbeitsplatz.
Die ausgewerteten Chromatogramme können als PDF- Dokument gedruckt und
gespeichert werden (Übertragung z.B. per E-Mail).
Im Versuchsprotokoll werden in einer übersichtlichen Gliederung die Grundlagen der
Aufarbeitungsmethode kurz erläutert, die Versuchsdurchführung beschrieben, die
Ergebnisse dargestellt und eine Ergebnisdiskussion durchgeführt.
Im Ergebnis-Teil sind die Chromatogramme darzustellen und zu erläutern. Im
Chromatogramm sind die Messwerte gegen die Zeit aufgetragen. Anhand der
unterschiedlichen Retentionszeiten können die Analyten unterschieden werden.
In der Diskussion werden die Ergebnisse bewertet (z.B. warum entspricht das
Ergebnis (nicht) den Erwartungen, mögliche Fehler in der Durchführung, Vergleich
mit bekannten Sachverhalten usw.). Beurteilen Sie die Güte der Kalibration.
Versuchen Sie anhand der Wiederfindungsrate des Internen Standards (IS) in Ihrer
Probe (Prozente der Peakfläche) die Güte Ihrer durchgeführten Probenaufarbeitung
zu bewerten. Eine gute Probenaufarbeitung zeigt sich in einer Wiederfindungsrate
von 70-110%. Ist das bei Ihnen der Fall und wenn nicht, warum?
Neben den genannten Schwerpunkten sollen im Protokoll die Vertiefungsaufgaben
beantwortet werden. Desweiteren ist dem Protokoll die Original-Mitschrift der
Versuchsdurchführung (handschriftlich) beizulegen. Mit Hilfe der Originalprotokolle
wird das Herangehen an die Aufgabenstellung, sowie das Auftreten und Umgehen
mit Problemen nachvollziehbar (sog. Laborjournal).

4. Vertiefungsaufgaben

(1) Was bedeutet die Abkürzung RP in der Chromatographie?

(2) Was versteht man unter Matrixeffekten in der HPLC?

(3) Wofür steht der Name der Mini-Multimethode QuEChERS?

(4) Wo kann ich mich über die Zulassung eines Pflanzenschutzmittels informieren?
Waren die Herbizide des durchgeführten Versuches im Jahr 2019 im Ackerbau
zugelassen?

(5) Wenn Sie an der Versuchsdurchführung etwas ändern könnten; welche Änderung
würden Sie aus analytischer Sicht am wichtigsten finden?
 Versuch HPLC/Stand März 2020/Seite 7 von 7

5. Empfohlene Literatur

www.quechers.com

D.A. Skoog, J.J. Leary Instrumentelle Analytik Springer-Verlag 1996

W. Heller, H. Naumer Untersuchungsmethoden Wiley-VCH Verlag

in der Chemie 2003, 3. Auflage

M. Otto Analytische Chemie Wiley-VCH 2006

3. Auflage