.

I. Tujuan Percobaan
- Dapat melakukan analisis kualitatif tablet parasetamol dengan metode Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi.
- Dapat melakukan analisis kuantitatif tablet parasetamol dengan metode Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi.

II. Prinsip Percobaan

Berdasarkan prinsip kerja HPLC yaitu pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya , alatnya terdiri dari kolom (sebagai fase diam) dan larutan tertentu sebagai
fase gerak.

III. Dasar Teori

KCKT adalah instrument untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik,
maupun senyawa biologis, analisis ketidak murnian ( impurities) dan analisis
senyawasenyawa yang tidak mudah menguap (nonvolatil). KCKT paling sering
digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam
amino,asam-asam nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar
senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain(Cresswell, 2005)
Beberapa senyawa organik yang mudah terurai (labil) pada pemanasan dapat
dianalisis dengan cara kromatografi cairan kinerja tinggi atau HPLC karena HPLC
dilakukan pada suhu kamar. Selain senyawa organic teknik HPLC juga dapat
menganalisis senyawa anorganik, cuplikan yang mempunyai berat molekul tinggi atau
titik didihnya tinggi seperti polimer. Kelebihan KCKT antara lain: Mampu memisahkan
molekul-molekul dari suatu campuran. Resolusinya baik. Kecepatan analisis dan
kepekaannya tinggi. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang
dianalisis. Dapat digunakan bermacam-macam detector. Kolom dapat digunakan
kembali. Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif .
Waktu analisis umumnya singkat. Kromatografi cair preparatif memungkinkan dalam
skala besar. Ideal untuk molekul besar dan ion. Dapat dilakukan pada suhu kamar Mudah
dioperasikan secara otomatis. (Hayun, 2006)
Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT
dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika
sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh. Berikut skema
kerja alat yang digunakan dalam HPLC (Supardani, 2011)
Larutan sampel yang akan dianalisis diinjeksi kemudian sampel akan turun ke dalam
kolom dan di elusi oleh eluen yang disediakan. Lalu detector akan mendeteksi waktu
retensi dalam bentuk kromatogram. Dari kromatogram itu kita dapat meganalisis
sampel(Ibnu Ghalib, 2012)
Pemilihan detektor pada HPLC umumnya didasarkan pada persyaratan sensitivitas,
jenis senyawa yang ada di dalam sampel dan faktor lainnya seperti biaya. Detector yang
paling umum didasarkan pada indeks bias dan eluat kolom, karena hampir semua zat
terlarut akan menghasilkan larutan dengan indeks bias yang berbeda dengan indeks bias
pelarut murni (Day, 2002)
Pada dasarnya instrumen HPLC terdiri dari tandon (reservoir) cairan fase gerak,
pompa, injector, kolom, detektor dan rekorder.
1. Tandon (Reservoir)
Reservoir yang baik disertai degessing system yang berfungsi untuk mengusir
gas-gas terlarut dalam solvent. Degassing dilakukan dengan mengalirkan gas inert
dengan kelarutan yang sangat kecil, misalnya helium. Degassing dapat juga dibuat
sendiri dengan erlermeyer yang dilengkapi dengan pengaduk magnet, pemanas dan
pompa vacum.
2. Pompa
Fungsi pompa adalah untuk memompa fase gerak (solvent) ke dalam kolom
dengan aliran yang konstan dan reproducible. Pompa harus memenuhi persyaratann
seperti dapat memberi tekanan sampai 6000 psi (360 atm), tekanan yang dihasilkan
bebas pulsa, dapat mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 0,1 sampai 10 ml/ menit,
dapat mengalirkan fase gerak dengan reprodusibilitas yang tinggi, tahan terhadap
korosi (biasanya terbuat dari baja atau teflon). Ada beberapa jenis pompa, antara lain :
a. Reciprocating pump
b. Displacement Pump
c. Pneumatic Pump
3. Katup Injector
Bagian ini merupakan tempat dimana sampel diinjeksikan untuk selanjutnya
dibawa oleh fase gerak ke dalam kolom.
4. Kolom (Column)
Kolom merupakan jantung dari HPLC, sebab kunci keberhasilan analisis
sangat tergantung pada efisiensi kolom sebagai alat untuk memisah-misahkan
senyawa dalam campuran yang kompleks. Kolom terbuat dari stainless steel yang
dibor halus atau dari gelas. Ada dua jenis packing kolom yang telah digunakan dalam
kromatografi cair. yaitu berupa partikel porous dan partikel pelliculer.
5. Detektor
Setelah sampel melewati kolom maka komponen-komponennya akan terpisah-
pisah dan keluar dari kolom dengan waktu yang berbeda-beda. Komponen yang sudah
terpisah ini secara berturut-turut akan melewati suatu detektor dan akan dibaca
kadarnya. Detektor yang digunakan harus sesuai dengan jenis zat yang dianalisis.
a. Detektor UV
Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri abssorbsi. Sampel yang
dianalisis harus menyerap sinar UV. Panjang gelombang sinar UV yang biasa
digunakan adalah 254 nm.
b. Detektor Fluoresensi
Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri. Detektor ini lebih sensitif
daripada detektor UV. Pemakaian sumber sinar laser akan memberikan sensitivitas
yang sangat tinggi. Derivatisasi sering dilakukan terhadap asam amino.
c. Detektor Indeks Refraksi (Refraksi Index Detector = RID)
Detektor ini bekerja atas dasar perbedaan indeks refraksi sampel dengan solvent.
Semua larutan suatu zat mempunyai indeks bias yang spesifik, oleh karena itu
detektor ini dapat digunakan untuk hampir semua zat.
6. Recorder
Hasil pembacaan detektor kemudian diolah oleh suatu processor kemudian
dikirim ke recorder. Recorder akan membuat suatu tampilan. Dalam kromatografi
tampilan ini disebut chromathogram. Untuk HPLC dilengkapi seperangkat software
yang dapat menghitung luas kromatogram dan bahkan sekaligus menghitung
kadarnya.
 Daftar Pustaka
Cresswell, Clifford.J. 2005. Analisis Spektrum Senyawa Organik. Bandung: ITB
Hayun, Ibnu Ganjar Dan Abdul Rahman. 2006. Kimia Farmasi Analisis.
Yogyakarta: Pustaka Belajar
Ibnu Ghalib. 2012. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Belajar
R.A.Day, Dr Jan Dan Al - Underwood. 2002. Analitik Kimia Kuantitatif. Jakarta:
Erlangga
Sumar, Hendayana. 1994. Parasetamol. Jakarta: UI Press Supardani. 20011. Ilmu
Kimia Analitik Dasar. PT Gramedia: Jakarta.