2002-06-11 DiplomArbeit Goran

Synthese von Substraten für die Selektion
funktionalisierter DNA mit der Fähigkeit zur Katalyse

von Peptidknüpfungen
Diplomarbeit
von
Goran Gerhardt G. Rasched
aus Troisdorf
Bonn, Juni 2002

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Okober 2001 bis Juni 2002 am Kekulé-
Institut für Organische Chemie und Biochemie der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-
Universität Bonn unter Leitung von Herrn Prof. Dr. Michael Famulok angefertigt.
Angefertigt mit Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
Referent: Prof. Dr. Michael Famulok

Korreferent: Prof. Dr. Heinrich Wamhoff
Gewidmet in Liebe und Anerkennung meiner Mutter Ana Rasched
und in Erinnerung an meine Großmutter Dora Lorencic.
i
1 ALLGEMEINER TEIL ..................................................................... 1

1.1 Einleitung ........................................................................................... 1
1.2 Prinzipien der in vitro-Selektion von Nukleinsäuren (SELEX) ............ 2
1.3 Katalytisch aktive Nukleinsäuren ....................................................... 5
1.4 Funktionalisierte DNA ........................................................................ 8
2 SPEZIELLER TEIL ...................................................................... 14
2.1 Katalytisch wirksame Nukleinsäuren zur Knüpfung von
Peptidbindungen ................................................................................. 14
2.2 Aufgabenstellung ............................................................................. 18
3 DURCHFÜHRUNG UND ERGEBNISSE ............................................ 20
3.1 Entwicklung der Selektionsstrategie ................................................ 20
3.2 Retrosynthetische Planung .............................................................. 27
3.3 Synthesen........................................................................................ 28
3.3.1 Synthesen von D-N-Biotinyl-6-aminohexansäure ..................... 28
3.3.2 D-N-Biotinyl-6-aminohexansäure-(N-succinimidyl)-ester .......... 32
3.3.3 6-(D-N-Biotinylamino)-hexanoyl-L-methionin............................. 33
3.3.4 3´(2´)-[6-(D-Biotinylamino)-hexanoyl-L-methionyl]-adenosin-5´-
monophospat ............................................................................ 35
3.3.5 N-(Trifluoracetyl)-phenylalanin ................................................. 38
3.3.6 4-Ethyl-3-nitrobenzoesäuremethylester .................................... 39
3.3.7 4-(1-Bromethyl)-3-nitrobenzoesäuremethylester ...................... 40
3.3.8 Versuch zur basischen Hydrolyse des 4-(1-Bromethyl)-3-
nitrobenzoesäuremethylester.................................................... 41
3.4 Ausblick ........................................................................................... 42
4 EXPERIMENTELLER TEIL ............................................................ 44
4.1 Material und Methoden .................................................................... 44
4.2 Synthese und analytische Daten ..................................................... 46
4.2.1 D-N-Biotinyl-6-aminohexansäure .............................................. 46
4.2.2 D-N-Biotinyl-6-aminohexansäure-(N-succinimidyl)-ester .......... 47
4.2.3 6-(D-N-Biotinylamino)-hexanoyl-L-methionin............................. 48
4.2.4 3´(2´)-[6-(D-Biotinylamino)-hexanoyl-L-methionyl]-adenosin-5´-
monophospat ............................................................................ 50
4.2.5 N-(Trifluoracetyl)-phenylalanin ................................................. 52
ii
4.2.6 4-Ethyl-3-nitrobenzoesäuremethylester .................................... 53

4.2.7 4-(1-Bromethyl)-3-nitrobenzoesäuremethylester....................... 56
5 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................. 57
6 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ........................................................ 59
7 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................ 62
Danksagungen............................................................................................ 66
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1 Allgemeiner Teil
1.1 Einleitung
Das ursprünglich stark eingeschränkte Bild, dass Nukleinsäuren ausschließlich als

Träger und Überträger der Erbinformation dienen, hat sich im Laufe der Zeit immer
stärker gewandelt. Mit der Entdeckung der katalytischen Fähigkeiten der RNA durch
Thomas Cech und Sidney Altman in den frühen achtziger Jahren wurde die Grundlage
zur Erforschung und Erweiterung des Konzepts funktionaler Nukleinsäuren, sowohl
von RNA als auch von DNA, geschaffen[1,2]. Thomas Cech machte die Beobachtung,
dass aus dem prä-RNA-Vorläufer der ribosomalen RNA des Ciliaten Tetrahymena
thermophilia im Reifungsprozess ein kleines RNA-Fragment - das Gruppe I-Intron –
herausgeschnitten wird, während die verbleibenden Enden wieder miteinander
verknüpft werden (sog. Spleißen). Das diese Reaktion auch in Abwesenheit der in vivo
vorhandenen Proteinanteile gelingt, war ein Nachweis für die einzig der Nukleinsäure
zuzusprechende katalytische Eigenschaft. Sidney Altman konnte nachweisen, dass die
katalytisch aktive Komponente der RNAse P, einem aus RNA und Protein
bestehenden Ribonukleoproteinenzym, das eine entscheidende Rolle während des
Reifungsprozesses der tRNA in Escherichia Coli spielt, allein aus dem
Nukleinsäureanteil des Enzyms besteht. Thomas Cech und Sidney Altman wurden für
ihre Entdeckungen auf diesem Gebiet 1989 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet und
ihren ersten beiden Beispielen von RNA mit enzymatischer Aktivität folgten nach und
nach weitere Beispiele natürlich vorkommender, katalytisch wirksamer RNA, so zum
Beispiel die RNA-Motive vom Hammerhead- und Hairpin-Typ aus Viroiden[3,4] oder
die RNA des Hepatitis Delta Virus[5]. Bei den von diesen Ribonukleinsäuren
katalysierten Reaktionen handelt es sich jeweils um die Knüpfung oder Spaltung von
Phosphodiester-Brückenbindungen. Bis zur Mitte der neunziger Jahre hat sich
schließlich der Begriff der Ribozyme etabliert. In Anlehnung an die Bezeichnung
Enzym für katalytisch aktive Proteine, beinhaltet der Begriff des Ribozyms sowohl die
Funktionalität als auch die Stoffklasse bzw. den Grundbaustein dieses Biopolymers in
seiner Bezeichnung. Mit den durch Thomas Steitz gemachten kristallographischen
Untersuchungen des Ribosoms - des wohl prominentesten Ribonukleoproteins - wurde
die bereits lang gehegte Vermutung schließlich bestätigt, dass es sich bei der
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katalytisch aktiven Komponente des Ribosoms um dessen RNA-Anteil handelt.[6,7]

Mit dieser Erkenntnis muss also auch das Ribosom als Ribozym anerkannt
werden.[8,9]
1.2 Prinzipien der in vitro-Selektion von Nukleinsäuren

(SELEX)
Angeregt durch die Entdeckung der natürlich vorkommenden Ribozyme galt es, das
Potential funktionaler Nukleinsäuren und ihr Aktivitätsspektrum bezüglich anderer
chemischer Reaktionen zu erforschen. Man kann übergeordnet zwischen zwei
Haupteigenschaften von funktionalen Nukleinsäuren unterscheiden: zum einen die
oben erwähnte katalytische Funktionalität der Ribo- oder Desoxyribozyme
(DNAzyme), zum anderen die Fähigkeit, als Ligand Zielmoleküle hochspezifisch zu
binden. Diese Oligonukleotide, die sehr komplexe Eigenschaften in der molekularen
Erkennung sowohl kleiner als auch großer Zielmoleküle (Targets) aufweisen,
bezeichnet man als Aptamere (lat. aptus, passend). Bei der Suche nach geeigneten
Methoden zur Generierung von funktionalen Nukleinsäuren mit neuen Eigenschaften
entwickelten die Laboratorien von J. F. Joyce (La Jolla), J. W. Szostak (Boston) und
L. Gold (Boulder) das Verfahren der in vitro-Selektion. Ausgangspunkt für die
Gewinnung von substratspezifischen Nukleinsäurekatalysatoren für chemische
Reaktionen oder hochselektiven Aptameren gegen ein definiertes Zielmolekül sind
dabei Nukleinsäurebibliotheken von bis zu 1015 verschiedenen Molekülen, die gemäß
ihrer gewünschten Funktionalität durch ein kombinatorisches Ausleseverfahren
selektiert werden. Diese Technik bezeichnet man auch als SELEX (Systematic
evolution of ligands by exponential enrichment). Zieht man das Darwinsche Bild der
Evolutionsbiologie zur Beschreibung hinzu, so stellt diese Nukleinsäurebibliothek
eine Anfangspopulation dar, die einem Selektionsprozess unterworfen wird, an dessen
Ende nur die dem Selektionsdruck standhaltenden Nukleinsäuren zurückbleiben
(Abbildung 1). Dem biologischen Evolutionsprozess folgend wird diese Auswahl
dann vermehrt, und es folgt ein neuer Selektionszyklus. Mit der Methode der
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder im Falle der RNA, mit einer Kombination aus
Reverser Transkription und PCR (RT-PCR), sind relativ leicht zu handhabende
Werkzeuge zur Amplifikation der Nukleinsäuren vorhanden. Die Eleganz dieser
appear here. 3
Methode liegt in der Tatsache begründet, dass die Eigenschaft der gesuchten
Nukleinsäurespezies (der Phänotyp) direkt gekoppelt ist mit dem ihm zu Grunde
liegenden Genotyp und dass mit der PCR ein sehr leistungsfähiges Verfahren zur
schnellen Vermehrung kleinster Mengen an Nukleinsäuren in vitro zur Verfügung
steht. Die Darstellung der RNA- bzw. DNA-Bibliotheken geschieht an
Oligonukleotid-Festphasensynthese-Apparaten, die es erlauben, neben definierten
Sequenzen auch Oligonukleotide mit teilweise oder vollständig randomisierten
Sequenzbereichen zu synthetisieren.
Randomisierter
Nukleinsäure-Pool
Nukleinsäurebibliothek
Modifikation mit Substrat A
Nukleinsäure—A
Inkubation mit Substrat B
B—Anker
Nukleinsäure—AB—Anker und Nukleinsäure—A
SELEKTION
Ungebundene Nukleinsäuren
Abspaltung von Nukleinsäure—A
Trägermatrix
PCR-Amplifikation Selektierte Nukleinsäuren
Nukleinsäure—AB
Abbildung 1: Schema der SELEX-Methode.
Auf diese Weise können komplexe Nukleinsäurebibliotheken in der Größenordnung

von 1015 Individuen in einem automatisierten Prozess in kurzer Zeit generiert werden.
Diese Oligonukleotide werden an ihren Anfangs- und Endpositionen mit kurzen,
bekannten Sequenzen versehen, die als Bindungsregionen für die Primer der PCR
dienen und auch Schnittstellen für eine Klonierung beinhalten können. Mit Hilfe einer
Klonierung, z.B. in E. coli, können nach der Selektion die selektierten Nukleinsäuren
unterschiedlicher Sequenz als Monoklone getrennt und anschließend sequenziert
werden.
Nach der Erstellung der randomisierten Nukleinsäurebibliothek am Festphasen-
Synthesizer wird die Bibliothek mit dem Zielmolekül oder Substrat inkubiert, welches
meist kovalent über einen Linker mit einer Ankergruppe wie z.B. Biotin verknüpft ist.
Nach erfolgter Reaktion oder Bindung mit dem Substrat enthalten nur jene
Nukleinsäuren des Pools die Ankergruppe, die das Substrat an sich gebunden haben;
diese können nun durch Affinitätschromatographie an einer geeigneten stationären
Phase (im Falle des Biotins als Ankergruppe beispielsweise durch mit den Proteinen
Streptavidin oder Avidin beladene Chromatographie-Säulen) angereichert werden,
während die nicht aktiven Spezies durch stringente Waschprozesse abgetrennt werden.
Die Stringenz des Waschprozesses kann durch diverse Parameter wie z. B. das
Waschvolumen beeinflusst werden. In einem zweiten Schritt können dann die an das
Trägermaterial gebundenen Nukleinsäuren, z. B. durch Waschen mit überschüssigem
Eluenten oder durch denaturierende Bedingungen, welche die spezifische
Wechselwirkung zwischen Ankergruppe und stationärer Phase aufheben, eluiert und
anschließend durch PCR amplifiziert werden. Die so selektierten und amplifizierten
Individuen bilden einen neuen Nukleinsäure-Pool, der erneut einem Selektionszyklus
unterworfen werden kann. So wird iterativ mit jedem neuen Zyklus eine Anreicherung
der am besten geeigneten Individuen aus einer anfänglich großen Population erreicht.
Mit Ausnahme des oben genannten Ribosoms und der RNAse P, katalysieren alle
bisher erwähnten natürlich vorkommenden Ribozyme die Spaltung oder Knüpfung der
Phosphodiester-Brückenbindung (Phosphoester-Transferase-Reaktion) stets in-cis,
also intramolekular, was zu einer Selbstmodifikation führt. Um nun die Möglichkeit
zu eröffnen, auch bimolekulare Reaktionen zwischen zwei Substraten durch
Nukleinsäuren katalysieren zu lassen, sind ausgehend vom Ansatz der SELEX-
Methode (Abbildung 1) Selektionsexperimente entwickelt worden, deren Aufbau nach
zwei grundsätzlichen Prinzipien gestaltet sein kann:
 Das Prinzip der indirekten Selektion beruht auf der Theorie von Haldane und
Pauling, dass Moleküle, die Strukturen ausbilden, die den Übergangszustand
einer zu katalysierenden Reaktion stabilisieren, zugleich auch Katalysatoren
appear here. 5
für diese Reaktion sein sollten. In der Praxis des Selektionsexperiments
bedeutet das für den Versuchsaufbau, dass eine Nukleinsäure selektiert werden
muss, die sich als hochaffiner Ligand, also als Aptamer, für ein
Übergangszustandsanalogon der gewünschten Reaktion erweist. Die Erfolge
dieses Ansatzes waren im Falle der Ribozym-Selektion bisher nur mäßig, was
unter anderem an der höchst variablen dreidimensionalen Struktur der RNA im
ungebundenen Zustand liegt. Im Gegensatz zu Proteinen bildet RNA ohne
entsprechendes Templat keine stabilen Bindungstaschen aus. Außerdem
verlangt diese Methode genaue Kenntnis über die Struktur des relevanten
Übergangszustandes und die Synthese eines adäquaten Analogons. Immerhin
gelang es so D. Sen ein DNAzym mit Chelataseaktivität zu selektieren,
welches die Insertion von Kupferionen in Porphyrine katalysiert.[10,11]
 Die Methode der direkten Selektion stellt eine Variante der in cis-Reaktion
katalytisch aktiver Nukleinsäuren dar, bei der alle Nukleinsäuren einer
Population mit einem der beiden Reaktanden (A) der bimolekularen Reaktion
derivatisiert werden und der zweite Reaktand (B) mit einer Ankergruppe
versehen wird, die es gestattet, nach erfolgter Reaktion mittels
affinitätschromatographischer Methoden das Reaktionsprodukt AB aus dem
Pool von den nicht reaktiven Spezies abzutrennen. Das isolierte Produkt
enthält die nun die miteinander verknüpften Reaktanden A (inklusive der daran
befindlichen Nukleinsäure) und B (Abbildung 1).
1.3 Katalytisch aktive Nukleinsäuren
Mittlerweile konnte mit der oben beschriebenen Selektionsmethode das Repertoire an

katalytisch wirksamen Nukleinsäuren um einige interessante Spezies erweitert
werden. So gelang es C. Wilson und J. W. Szostak ein N-alkylierendes Ribozym zu
selektieren.[12] Auch Beispiele für die S-Alkylierung und Amid-Spaltung sind
bekannt, ebenso eine größere Zahl (Übersicht siehe Lit.[13]) an Phosphodiester-
spaltenden und -knüpfenden Ribozymen.[14] Die Reihe von Ribozymen, die mit Hilfe
linkergekoppelter Reaktanden in einer direkten Selektion erhalten wurden, wird
fortgesetzt durch ein Ribozym mit Peptidyltransferase-Aktivität,[15-17] auf das im
speziellen Teil näher eingegangen werden soll. Diese RNA vermag eine Aminosäure
als Substrat auf einen Aminoacylakzeptor zu übertragen. Ein weiteres neueres

Beispiel ist ein Michaelase-Ribozym, das in Anlehnung an die natürlich
vorkommende Thymidylatsynthase die Bildung eines Michael-Addukts aus einem
Fumaramid als Michaelakzeptor-Substrat und der Thiol-Gruppe eines Cysteins,
welches als Nucleophil fungiert, katalysiert.[18] Das Ribozym zeigt Substratspezifität
und dient als intermolekularer Katalysator, der das Michael-Donor Substrat auf ein
externes, mit einem kurzen RNA-Oligonukleotid derivatisiertes, Michael-Akzeptor-
Molekül überträgt. Weitere Beispiele für sich selbst modifizierende RNA-Spezies sind
Ribozyme mit Estertransferase-Aktivität, die A. Jenne und M. Famulok erhielten.[19]
Diese selektierten eine RNA, welche die Aminosäure eines Aminosäureesters eines
kleinen Substrates auf eine interne 2´-Hydroxy-Gruppe der RNA überträgt. Auch P. A.
Lohse und J. W. Szostak berichteten von einem Ribozym, welches einen biotinylierten
Methionin-Rest von einem kleinen Oligonukleotid-Substrat auf das 5´-OH-Ende eines
Ribozyms transferiert.[19,20]
Bei den bisher vorgestellten Nukleinsäure-Enzymen handelt es sich zunächst nur um
Ribonukleinsäuren, doch mit Hilfe der direkten Selektion gelang es G. F. Joyce, eine
bis dahin weit verbreitete Annahme zu widerlegen, dass sich RNA, aufgrund ihrer
höheren Flexibilität und der Anwesenheit der 2´-Hydroxyl-Gruppe, besser als DNA
für die Selektion von wirksamen Nukleinsäure-Katalysatoren eignen würde.[21,22] So
war man zunächst überrascht, als G. F. Joyce ein DNAzym selektierte, das in der Lage
war, besser als die bis dahin bekannten Ribozyme RNA zu schneiden.[23,24] Es hatte
sich gezeigt, dass die vorgefassten Meinungen über das Potential von DNAzymen neu
überdacht werden mussten. DNA ist also wie RNA in der Lage, sich in für die
Katalyse notwendige, dreidimensionale Strukturen zu falten, und die 2´-OH-Gruppe
hat sich als für die Katalyse nicht essentiell erwiesen. Für eventuelle medizinische und
therapeutische Anwendung von katalytisch wirksamen Nukleinsäuren könnten sich
sogar DNAzyme als bedeutender und vielseitiger herausstellen als Ribozyme, wenn
man bedenkt, dass DNA eine höhere Lebensdauer in vivo besitzt als RNA.[21] Bei
Anwendungen, die auf der Antisense-Technik beruhen, bei der es gilt, Proteine, die
von mRNA mit bestimmter Sequenz codiert werden, im Organismus auszuschalten,
indem ihre mRNA dauerhaft durch Watson-Crick-Basenpaarung mit eingeschleusten
Nukleinsäuren entsprechender Sequenz blockiert, erweisen sich RNA/DNA-Hybride
als erheblich stabiler als RNA/RNA-Hybride. Eine solche DNA-vermittelte
appear here. 7
Applikation kann z. B. aus den DNAzymen erwachsen, die S. W. Santoro und G. F.
Joyce vorgestellt haben.[21,23,24] Zur nachhaltigen Deaktivierung bestimmter
Proteine würde man diese RNA-schneidenden DNAzyme zusätzlich zu ihren
katalytischen Sequenzmotiven mit einer entsprechenden Antisense-Sequenze zur
Protein-codierenden mRNA versehen. Diese Spezies wird in der Lage sein in einem
entsprechenden System zunächst einen stabilen DNAzym/mRNA-Hybriden über die
komplementären Regionen auszubilden. In einem zweiten Schritt sollte das DNAzym,
aufgrund seiner katalytischen Eigenschaften, die mRNA schneiden und so dauerhaft
deaktivieren. F. S. Santiago et al. (Australien) erbrachten den Nachweis das die
selektive Deaktivierung von mRNA und somit auch die Inhibition der Expression der
von ihr kodierten Proteine auf diese Weise gelingt.[25] In ihren Experimenten setzten
sie das DNAzym ED5 erfolgreich gegen die mRNA des Egr-1 Faktors ein. Das
Translationsprodukt dieser mRNA bindet an Promotoren einer Gruppe von Genen,
welche die Beweglichkeit und Replikation des Gewebes der glatten Muskulatur und
der Zellen in den Arterien-Wänden steuern. Die Aktivierung dieses Promotors, die in
vivo durch Gefäß-Verletzungen hervorgerufen werden kann, konnte durch den Einsatz
des DNAzyms bei vorangegangener Stimulation des entsprechenden Testsystems
erfolgreich verhindert werden. Ein interessanter Aspekt bezüglich der zuletzt
präsentierten RNA-schneidenden DNAzyme von S. W. Santoro und G. F. Joyce ist,
dass zusätzlich zur erfolgreichen DNAzym-Selektion, ausgehend von DNA-
Bibliotheken bestehend aus natürlichen dNTPs, in einer späteren Reselektion, in
Zusammenarbeit mit Barbas et al., eine DNA-Bibliothek verwendet wurde, die
modifizierte Nukleotide enthielt.[21] Die vielversprechenden Erwartungen und
Möglichkeiten die aus dem Einsatz solcher funktionalisierter Nukleinsäuren
erwachsen soll in Kapitel 1.4 näher ausgeführt werden.
Weitere Beispiele für DNAzyme, die oftmals kleiner sind als die Proteine mit
vergleichbarer Aktivität, sind die Anfangs bereits erwähnte 8000 Dalton große DNA-
Chelatase, welche die Insertion von Kupferionen in Porphyrine katalysiert, eine
Reaktion, die in Säugetieren von einem 42000 Dalton großen Protein bewerkstelligt
wird, allerdings auch mit einer entsprechend höheren katalytischen Effizienz.[11] Aus
der selben Arbeitsgruppe stammen auch Peroxidasen auf DNA-Basis sowie einige
DNAzyme, die sowohl mit als auch ohne Cofaktoren in der Lage sind,
sequenzspezifisch RNA zu spalten. Bei den Cofaktoren handelt es sich meist um
bivalente Kationen oder auch um kleine Moleküle, die zum einen die Struktur der
Nukleinsäuren stabilisieren und zum anderen als (Lewis-)Säuren fungieren können.
Die bislang vorgestellten Ribo- und Desoxyribozyme benötigen alle solche
Cofaktoren, um die zu katalysierende Reaktion auszuführen. Die Tatsache, dass
katalytisch aktive Nukleinsäuren auch ohne Cofaktoren auskommen können, schien
deshalb zunächst keine Selbstverständlichkeit zu sein, bis Ribozyme und DNAzyme
selektiert wurden, die ohne Metall-Cofaktoren auskommen (s.o.[11], für eine
Übersicht siehe Lit. [13]). Andererseits können bei entsprechendem Versuchsaufbau
Ribozyme sowie DNAzyme so selektiert werden, dass sie zwingend in Abhängigkeit
von Cofaktoren gelangen. Dies wurde z.B. an Hand von Histidin-abhängigen
DNAzymen, welche RNA hydrolysieren, gezeigt.[22] Ein weiteres Beispiel für
DNAzyme mit Cofaktorabhängigkeit ist die von J. Burmeister et al. selektierte,
Phosphoramidit spaltende DNA, die diese Reaktion nur in Anwesenheit eines
Trinukleotids durchführt.[19]
1.4 Funktionalisierte DNA
Die beobachtete Notwendigkeit der Anwesenheit von Cofaktoren bei katalytisch

wirksamen Nukleinsäuren kann auf den Mangel an chemischer Diversität im
Vergleich zu der großen Anzahl der unterschiedlichen funktionellen Gruppen der
Proteine zurückgeführt werden. Das große Repertoire und die katalytische Effizienz,
die proteinbasierende Enzyme bei chemischen und biochemischen Prozessen
demonstrieren, hängt in großem Maße von den vielfältigen funktionellen Gruppen ab,
die durch die Seitenketten der Aminosäuren repräsentiert werden, und nicht zuletzt
auch von diversen prosthetischen Gruppen, die mit den Proteinen verknüpft sind.
Dieser Überlegung folgend, entstand ein großes Interesse an der Erweiterung des
katalytischen Spektrums der Nukleinsäuren durch Erhöhung ihrer chemischen
Diversität. Eine Möglichkeit dazu besteht darin, die monomeren Bausteine der
Nukleinsäuren, namentlich die Nukleotide, mit funktionellen Gruppen auszustatten, in
der Hoffnung, die Katalyse-Eigenschaften zu verbessern oder sogar erst zu
ermöglichen. Dazu muss natürlich gewährleistet sein, dass diese modifizierten
Nukleotide auch enzymatisch in Nukleinsäuren eingebaut werden. Die Einführung
von Nukleotidanaloga eröffnet zusätzlich zur Steigerung der Vielfalt auch die
appear here. 9
Möglichkeit, Wirkstoffe oder Cofaktoren (analog den prosthetischen Gruppen bei
Proteinen) kovalent an Nukleinsäuren zu binden.
Den Nukleotiden von RNA und DNA fehlen vor allen Dingen funktionelle Gruppen,
die analog den basischen Seitenketten der Aminosäuren kationische Spezies ausbilden
können, um anionische Übergangszustände zu stabilisieren, sowie hydrophobe
Anteile, die für entsprechende Substrate Bindungstaschen ausbilden.[26] Weiterhin
besitzen die natürlichen Nukleotide keine der oftmals maßgeblich an der Katalyse
beteiligten Carboxyl-, Imidazol-, oder Sulfhydryl-Gruppen, die in den aktiven Zentren
der protein-basierenden Enzyme durch die Aminosäuren Aspartat/Glutamat, Histidin
und Cystein, zur Verfügung gestellt werden. Für die Bemühungen, entsprechende
Modifikationen in die Nukleotide einzubringen, stehen prinzipiell drei Bereiche eines
Nukleotids zur Verfügung. Die Funktionalisierung kann am Zucker-Anteil, an der
Base oder am Phosphat-Rest des Moleküls erfolgen. Für alle drei Möglichkeiten sind
Beispiele präsentiert worden;[27-29] welche die entsprechenden Nukleotide als
Substrat für DNA-Polymerasen zulassen, wobei sich die Funktionalisierung der
Nukleotid-Base als eine synthetisch relativ einfach zu realisierende Verfahrensweise
erwiesen hat. Erste Selektionsexperimente mit aus modifizierten Nukleotiden
bestehender RNA oder DNA führten bereits zu Erfolgen.
N
O O O
O
N N NH
N NH H H
H
N O O O O N O
O O O
-O P O P O P O -O P O P O P O
O O
O- O- O- O- O- O-
OH OH OH OH
1a 1b
5-[(4-Pyridylmethyll)carbamoyl-UTP 5-(Imidazolyethyl)carbamoyl-UTP
Abbildung 2: Modifizierte UTP-Nukleotide von Eaton et al..
Beispiele für funktionalisierte RNA lieferten B. E. Eaton und Mitarbeiter, denen es

gelang, durch direkte Selektion mit linker-gekoppelten Reaktanden, Katalysatoren auf
RNA-Basis sowohl für eine Amid-Synthese als auch für eine Diels-Alder-Reaktion zu
finden.[30] Die zusätzlichen Funktionalitäten für das Diels-Alderase Ribozym wurde
in der enzymatischen RNA-Synthese durch Verwendung des Uridin-5´-

triphosphat(UTP)-Analogons 5-[(4-Pyridylmethyl)-carbamoyl]-UTP 1a (Abbildung 2)
eingebracht.[31] Diese sollten in der RNA zusätzliche Möglichkeiten für hydrophobe
und dipolare Wechselwirkungen, für Wasserstoffbrückenbindungen sowie für
Metallionenkoordinationen liefern.
Der Versuchsaufbau für die RNA-katalysierte Amid-Synthese sah so aus, dass ein
primäres aliphatisches Amin mittels eines Polyethylenglykol(PEG)-Linkers an die
RNA gekoppelt wurde und mit dem Anhydrid aus Biotin und Adenosinmonophosphat
inkubiert wurde, um eine Amidbindung zwischen Biotin und dem aliphatischen Amin
zu erzeugen. Auch hier wurde ein modifiziertes Nukleotid eingesetzt; so war die 5-
Position des Uracils mit dem (5-Imidazolylethyl)carbamoyl-Rest 1b (Abbildung 2)
derivatisiert, von dem verbesserte Eigenschaften in der allgemeinen Säure/Base-
Katalyse, sowie bei der Metallionenkoordination erwartet wurden.[32] Ein weiters
Ribozym mit modifiziertem Uridin selektierten X. Dai und G. F. Joyce, die alle 99
Uridine des Tetrahymena Gruppe-I Ribozyms durch 5-Bromouridin 1c (Abbildung 3)
ersetzten.[33]
H2 N
O
NH
Br
NH N
N
O O O O O O
N O
N N
O O
O- O- O- O- O- O-
OH OH OH OH
1c 2
5-Bromo-UTP N6-Aminohexyl-ATP
Abbildung 3: Basen-modifizierte Nukleotide von Dai et al. sowie Teramoto et al..
Das Wildtyp-Ribozym mit den substituierten Uridinen zeigte eine Reduzierung der
Phosphoestertransferase-Aktivität um das 13fache. Ausgehend von dieser RNA wurde
eine Population mit 1013 Varianten konstruiert und nach 5 Selektionszyklen eine
RNA-Spezies mit 27 facher Erhöhung der katalytischen Effizienz der
Phosphoestertransferase-Aktivität - gemessen am 5-Bromouridin substituierten
appear here. 11
Wildtyp - erhalten. Dies bedeutete das dieses Ribozym auch die katalytische Aktivität
des nicht 5-Bromouridin substituierten Wildtyps übertraf. Aus einem vollständig
randomisierten RNA-Pool selektierten N. Teramoto et al. ein Ligase-Ribozym
welches an der exocyklischen Amino-Funktion des Adenins modifizierte Nukleotide
enthielt 2 (Abbildung 3).[34] In Gegenwart eines DNA-Templat-Strangs knüpfte das
Ribozym eine Phospohdiester-Bindung zwischen einer am Templatstrang
hybridisierten DNA und dem eigenen 5´-Triphosphat enthaltenden 5´-Terminus. Den
entscheidenden Einfluss der Nukleotid-Modifikation bewiesen Ligations-Versuche
mit RNA der gleichen Sequenz aber ohne modifiziertem Adenosin die zu keiner
Bindungsknüpfung zwischen DNA und RNA führten.
Die Erfolge dieser Selektionsexperimente ermutigten dazu, dass Spektrum der
natürlich vorkommenden Nukleotide als monomer Bausteine um derivatisierte bzw.
modifizierte Desoxynukleotide zu erweitern. Erste erfolgreiche Selektionsexperimente
mit funktionalisierter DNA gehen auf J. A. Latham et al. zurück.[35] Es gelang ihnen
sowohl ein modifiziertes Desoxynukleotid (dNTP) enzymatisch in DNA einzubauen,
als auch die Effizienz dieser DNA in Selektionsexperimenten unter Beweis zu stellen.
J. A. Latham et al. ersetzten Thymidin durch 5-(1-Pentinyl)-2´-desoxyuridin 3a
(Abbildung 4) in einer randomisierten DNA-Bibliothek und selektierten damit
erfolgreich ein Aptamer gegen humanes Thrombin.
O O
+H3N
NH NH
O O O N O O O O N O
O O
O- O- O- O- O- O-
OH OH
3a 3b
5-(1-Pentinyl)-2´-dUTP 5-(3-Aminopropinyl)-2´-dUTP
Abbildung 4: Modifizierte dUTP-Derivate von Latham et al. und Benner et al..
Es folgten Versuche von C. F. Barbas III et al., die Bibliotheken mit modifizierten
Desoxyuridin-Derivaten aufbauten, die von verschiedenen thermostabilen DNA-
Polymerasen als Substrat erkannt wurden.[28] Auch die bereits in Kapitel 1.3
erwähnten RNA-spaltenden DNAzyme, die von S. W. Santoro und G. F. Joyce in ihrer
Reselektion erhalten wurden, enthalten von C. F. Barbas III et al. modifizierte
Desoxyuridine.[21] Statt des natürlichen Thymidins wurde jeweils ein mit Imidazol
am C5 modifiziertes Desoxyuridin in die Nukleinsäurebibliothek eingebracht. Mit
Imidazol als funktioneller Modifikation wurde eine Histidin-analoge Gruppe in die
Nukleinsäurebibliothek eingeführt. Dies machte das selektierte DNAzym unabhängig
von der Anwesenheit des von vielen anderen RNA-spaltenden DNAzymen benötigten
Cofaktors Histidin. Neben C. F. Barbas III et al. gelang auch der Arbeitsgruppe von
S. Benner der enzymatische Einbau eines kationischen Nukleotids 3b (Abbildung 4) in
DNA mit der erfolgreich Selektionsexperimente gegen ATP als Target durchgeführt
wurden.[36]
Mit dem Ziel, Nukleinsäuren auf enzymatischem Wege zu erstellen, die ausschließlich
aus modifizierten bzw. funktionalisierten Nukleotiden bestehen, gelang es M. Perrin
et al. zunächst zwei Nukleotide - modifiziertes Desoxyadenosin (dA) und
Desoxyuracil (dU) - in DNA einzubringen,[37] während O. Thum und S. Jäger in der
Arbeitsgruppe von M. Famulok erstmalig die enzymatische Synthese eines
Oligonukleotids präsentierten, bei dem alle vier Nukleotide durch basenmodifizierte
Nukleotidanaloga ersetzt wurden (Abbildung 5).[38] Diese neue Art eines
enzymatisch replizierbaren Biopolymers bezeichneten sie als funktionalisierte DNA
(fDNA). Bei diesen Arbeiten galt es zu gewährleisten, dass die Watson-Crick-Paarung
der Nukleobasen möglichst wenig beeinflusst wird, um eine fehlerfreie enzymatische
Replikation nicht zu behindern. Als entsprechend geeignete Positionen für die
Modifikationen erwiesen sich die 5- Position der Pyrimidine, wie die diversen bereits
vorgestellten 5-modifizierten Uridin-Derivate belegen, sowie die Position 7 der 7-
Deazapurine. Die Modifikationen werden an diesen Positionen über relativ starre
Alkinyl- oder Alkenyl-Arme an die Base geknüpft. Detaillierte Studien über geeignete
Linker präsentierten S. E. Lee et al., die primäre Aminofunktionen und Imidazol-
Gruppen über Alkinyl-, (Z/E) Alkenyl- und Alkanyl- Arme mit unterschiedlicher
Länge und Konfiguration in PCR-Einbaustudien untersuchten.[39] Modifiziert wurden
dUTPs an C5 und es zeigte sich das z.B. die relativ flexiblen Alkan-Linker und Z-
konfiguierte Alken-Linker hierfür ungeeignet sind.
appear here. 13
HOOC
NH
H2 N NH
NH2 O
O NH2
H 2N
N NH
NH N
N N
N N NH2 N O N O
R
R R R
mod. dG mod. dA mod. dC mod. dU

4 5 6 7
R=
O O O
-O P O P O P O O
O- O- O-
OH
Abbildung 5: Eine Auswahl der funktionalisierten dNTPs, synthetisiert von O.Thum und S.Jäger.
Die Auswahl der an die Nukleotide angebrachten funktionellen Gruppen in Abbildung

5 soll die Funktionalität der Seitenketten bedeutender, häufig in katalytischen Zentren
vertretener Aminosäuren nachahmen. So repräsentiert das mod. dG 4 unpolare bzw.
aromatische Reste, mod. dA 5 ähnelt den Aminosäuren Aspartat oder Glutamat, die
Moleküle 6 und 7 (mod. dC, mod. dU) sind Analoge für das basische Lysin bzw. das
kationische Arginin.
2 Spezieller Teil
2.1 Katalytisch wirksame Nukleinsäuren zur Knüpfung von

Peptidbindungen
Das Bestreben, Nukleinsäuren zu selektieren, die in der Lage sind, Peptidbindungen

zwischen zwei Aminosäuren zu knüpfen, also als Peptidyltransferasen wirken,
erwächst aus dem Wunsch, eine Brücke zwischen Nukleinsäuren und Proteinen zu
schlagen. Die Proteinsynthese durch das Ribosom ist eine der fundamentalsten
Prozesse, die im lebenden Organismus stattfinden und ist somit Gegenstand intensiver
Untersuchungen.
Nachdem das Peptidyltransferase-Zentrum des Ribosoms mit Hilfe ausgeklügelter
Inhibitoren intensiven strukturellen Untersuchungen unterzogen wurde, war deutlich
geworden, dass die aktive Region der großen Untereinheit des Ribosoms nahezu frei
von Protein ist und fast ausschließlich von dicht gepackter RNA gebildet wird.[9] Es
zeigte sich, dass die große Untereinheit des Ribosoms in Abwesenheit des größten
Teils ihres Proteinrückgrates immer noch im Stande ist den Peptidyltransfer
durchzuführen, so dass das Ribosom mit Recht als `RNA-Maschine´ bezeichnet
werden kann, also ein Ribozym ist.[16,40] Nachdem bereits von P.A. Lohse und J.W.
Szostak 1996 gezeigt wurde, dass der Transfer von einer kovalent an RNA
gebundenen Aminosäure an das eigene 5´-Amino-modifizierte Ende der RNA
gelingt,[20] präsentierten T. Cech und B. Zhang ein von ihnen selektiertes Ribozym,
das im Stande ist, wie das Ribosom, die Verknüpfung zweier Aminosäuren über eine
Amidbindung zu katalysieren.[16] B. Zhang und T. Cech verwendeten
linkergekoppelte Reaktanden, wobei das 5´-Ende des RNA-Pools über eine kurze
Cystamin-Abstandsgruppe, die eine reduktiv spaltbare Disulfidbrücke enthält, an
Phenylalanin gebunden wurde (Abbildung 6 und Abbildung 7, A). Die freie
Aminogruppe des Phenylalanins fungierte hierbei als Aminoacyl-Akzeptor, während
der Aminoacyl-Donor als freier Reaktand durch einen AMP-Aminoacylester
repräsentiert wurde. Letztere Komponente diente als einfaches Modell der natürlichen
N-Formylmethionin-tRNA, dem Molekül, das die Translation durch Besetzung der
sogenannten P-Stelle durch Bindung an das Startcodon der mRNA im Ribosom
appear here. 15
initiiert. Im Detail handelte es sich dabei um 2´(3´)-[6-(Biotinylamido)caproyl-L-
methionyl]adenosin-5´-monophosphat (Abbildung 8; 8a und 8b).
Die Abbildung 6 vergleicht schematisch den in vio stattfindenden Prozess der
Peptidbindungsknüpfung im Ribosom mit dem Katalyse-Schritt der Ribozymselektion
nach B. Zhang.[16,17]
Peptidbindungsknüpfung durch das Ribosom Peptidbindungsknüpfung durch ein Ribozym
nach dem Selektionsdesign von B. Zhang et al.
H
H
N
O S
N
H H
O
HN
P-Stelle A-Stelle
H
O
3´
O
NH
NH
S
O H2N S H2N
O
O
O O O
OH OH
O O NH
OH O-
O O
O P O- O P O-
N O
N N
O O N
O P O- O S
N N N N N N
NH2 C O S
N N C NH2
C NH2 C
5´ 5´
fMet-tRNA Phe-tRNA mRNA
mR N A
5´-Substrat-modifiziertes-Ribozym
Aktives Zentrum des Ribosoms
H
(schematisch) H
N
O S
N
H H
O
HN
P-Stelle A-Stelle
H
O O
NH
3´ NH
S S
O O
HN HN
OH OH
OH OH O O
O-
O O NH
OH O O P O-
O
O P O-
N O N O
N N
O O O P O-
N N N S
N N O N
NH2 C S
N
N C NH2
C NH2 C
5´ 5´
fMet-tRNA Phe-tRNA mRNA
Abbildung 6: Gegenüberstellung des Katalyse-Schemas beruhend auf dem Konzept zur Selektion von
Peptidyltransferansen auf RNA-Basis nach Zhang et al. und dem Schema der Peptidbindungsknüpfung
im Ribosom in Analogie zu Lit.[16,17].
Nach erfolgter Inkubation des RNA-Pools mit dem Reaktanden wurde die
biotinylierte RNA mit Hilfe von trägergebundenem Streptavidin durch
Affinitätschromatographie immobilisiert und nach Anwendung diverser Wasch-

Protokolle durch reduktive Spaltung der Disulfidbrücke wieder freigesetzt. Bei diesem
Schritt gelang es, selektiv die RNA-Moleküle freizusetzen, bei denen die Reaktion am
gebundenen Phenylalanin erfolgt war. Nebenprodukte, bei denen das Biotin mit
internen Positionen der RNA verknüpft war, wurden abgetrennt, da sie auch nach
Spaltung der Disulfidbrücke immobilisiert blieben. Nach 19 Selektionsrunden wurden
die aktiven RNAs isoliert und sequenziert, wobei sich mindestens zwei Klassen von
Sequenzen unterscheiden ließen. Die kinetischen Untersuchungen ergaben eine
Beschleunigung der RNA katalysierten Reaktion etwa um den Faktor 1:106 gegenüber
der unkatalysierten Reaktion. Für die Reaktionsbeschleunigung als essentiell erwies
sich auf der RNA Seite der eingesetzte Linker, der vermutlich mit der RNA in
Wechselwirkung tritt und so eine günstige Ausrichtung des Substrats bewirkt, und auf
Seiten des biotinylierten Reaktanden schien das AMP als entscheidendes
Erkennungsmerkmal für das Ribozym zu dienen. Es zeigte sich, dass auch andere
Aminosäuren aus den entsprechenden biotinylierten AMP-Derivaten auf den an der
RNA befindlichen Akzeptor übertragen werden können.
H
H
N
O S
N
H
H
H A H
N
O S
N
H H
O
HN H
B
H
N
O S
O N
H H
HN
O
NH
O
S
O NH
O
HN H2N
NH O
O
S H2N OH OH O
O OH HN
O
O-
O NH O-
OH O O O P O- O
NH O P O-
O- N N O N N
O
O
O P O- N S N H2N
N N N
N O
O S S
NH 2
N NH 2 HN
N S
NH 2 COOH
S
5´ S
5´
RNA RNA
5´
RNA
Selektionsdesign von A. Jenne et al..
Abbildung 7:Vergleich der Selektionsdesigns von Zhang/Cech (A) sowie Jenne und Famulok (B).
Bei dem Versuch ein Ribozym mit Peptidyltransferase-Aktivität in einem zu dem von
B. Zhang et al. analogen Selektionsprozess zu selektieren, erhielten A. Jenne et al.
appear here. 17
überraschenderweise ein anderes Ergebnis.[19] Obwohl das Konzept der Selektion auf
den Erhalt eines Ribozyms mit der Fähigkeit zur Peptidbindungsknüpfung ausgelegt
war (Abbildung 7; B), wurde ein Ribozym erhalten, welches das eingesetzte
biotinylierte Aminosäureester-Substrat auf eine interne 2´-OH-Gruppe des Ribozyms
übertrug, statt eine Amidbindung an seinem modifizierten 5´-Terminus auszubilden.
Neben mehreren denkbaren Ursachen für dieses Resultat steht die Tatsache im
Vordergrund, dass das Ribozym mit seinen zahlreichen freien 2´-OH-Gruppen viele
nucleophile Positionen zur Verfügung stellt, demgegenüber nur eine nucleophile
Amino-Funktion am modifizierten 5´-Terminus des Ribozyms entgegensteht. Bedenkt
man hierbei dass sich die reduktive Spaltung der Disulfidbrücke (im Falle von Jenne
et al. mit 2-Mercaptoethanol) als nicht sehr selektiv erwies, in der Hinsicht das dieses
Reagenz die Wechselwirkungen zwischen Biotin und Streptavidin stört, so kann
vermutet werden das alle RNA-Spezies, welche das biotinylierte Substrat zu binden
vermögen in den nächsten Selektionszyklus gelangen. So könnte aus rein statistischen
Gründen bei diesem Aufbau die Selektion einer Estertransferase gegenüber einer
Peptidyltransferase bevorzugt worden sein. Weitere Gründe für die unterschiedlichen
Ergebnisse der beiden Arbeitsgruppen werden im Einsatz unterschiedlich langer
RNA-Sequenzen vermutet: die Nukleinsäuren der RNA-Bibliothek B. Zhangs waren
mit 196 Nukleotiden länger als die A. Jennes mit 158 Nukleotiden. Es wird vermutet,
dass die Ausbildung einer zur Peptidbindungsknüpfung befähigter Ribonukleinsäure
einer relativ langen Sequenz bedarf. Unterstützt wird diese Vermutung dadurch, dass
einige der von Zhang erhaltenen Ribozyme die volle Länge ihrer 196 Nukleotide zur
Katalyse benötigten.
In der neusten Veröffentlichung von B. Zhang et al. wurde zu den hier beschrieben
Experimenten erneut Bezug genommen und eingeräumt, dass das eigentliche
biotinylierte Substrat des selektierten Ribozyms das gemischte Anhydrid 5´-[6-
(Biotinylamido)caproyl-l-methionyl]adenosin-5´-monophosphat war.[15] Dieses
entsteht bei der Synthese der Verbindungen 2´(3´)-[6-(Biotinylamido)caproyl-L-
methionyl]adenosin-5´-monophosphat (Abbildung 8; 8a und 8b) in kleinen Mengen
als schwer zu detektierende und abzutrennende Verunreinigung, so dass bei der
Inkubation mit dem RNA-Pool dieses energiereichere Substrat als Aminoacyl-Donor
fungierte. Damit wird die Ähnlichkeit zu der vom Ribosom katalysierten Reaktion,
wie sie in der Gegenüberstellung von Abbildung 6 dargestellt wird, abgeschwächt und
die abweichenden Resultate der Reselektionsversuche verständlicher.
2.2 Aufgabenstellung
Vor dem Hintergrund der Ausführungen über die gesteigerte chemische Diversität und
das erhoffte katalytische Potential von funktionalisierter DNA (Kapitel 1.4), sollte in
Analogie zu den Selektionsexperimenten von B. Zhang und T. Cech ein
Versuchsaufbau geschaffen werden, der es erlaubt eine Bibliothek aus
funktionalisierter DNA (fDNA) auf die Fähigkeit zur Katalyse einer
Peptidbindungsknüpfung hin zu selektieren. Um einen Vergleich zwischen der
katalytischen Kapazität der fDNA gegenüber natürlicher DNA ziehen zu können,
muss der experimentelle Aufbau so gestaltet sein, dass parallel zu der Selektion mit
funktionalisierter DNA eine Versuchsreihe mit unmodifizierter DNA durchgeführt
werden kann. Zum Vergleich mit den Experimenten von B. Zhang wird angestrebt
diesen Aufbau später auch für eine RNA Selektion einzusetzen. Mit diesen Vorgaben
galt es, eine an diese Fragestellung angepasste Selektionsstrategie zu entwickeln und
die dazugehörigen Reaktanden und Komponenten zu entwerfen. Die Synthesen der
daraus resultierenden Vorstufen sollten im zur Verfügung stehenden Zeitraum
etabliert und so weit als möglich vorrangetrieben werden. Das erste Syntheseziel
stellte 3´(2´)-N-[6-(Biotinylamino)-hexanoyl-L-methionyl-adenosin-5´-monophosphat
(AMP-Met-Bio) 8a/8b (Abbildung 8) dar.
NH2
N
N
O N N
O -O P O
O
O-
HN NH O O OH
H H O
H
N
S N
H
O
S
8a NH2
N
N
O N N
-O P O
O
O
O-
HN NH OH
O O
H H O
H
N
S N
H
O
S
8b
appear here. 19
Abbildung 8: AMP-Met-Bio (zwei Regioisomere) als fMet-Substrat-Analoga für das
Selektionsexperiment.
Diese Verbindung repräsentiert im Selektionsexperiment ein einfaches Analogon für
die in der Natur vorkommende Formylmethionin(fMet)-transfer-RNA. Dieses Substrat
enthält mit AMP verestertes Methionin und dient als Aminoacyl-Donor. Das über eine
Amidbindung über 6-Aminohexansäure verbundene Biotin dient als Ankergruppe zur
Isolierung auf einer Streptavidin-beladenen Säule. Dieses Molekül sollte, ausgehend
vom Grundbaustein Biotin, in guten Ausbeuten, im vorhandenen Zeitrahmen und
gegebenenfalls über neue Syntheserouten dargestellt werden. Weiterhin sollte die
Synthese des zweiten Reaktionspartners begonnen werden. Bei diesem handelte es
sich um Phenylalanin, das als Phosphoramidit in einen Primer eingebracht wird um
später als in-cis Substrat im Selektionsexperiment zu dienen. Das Phenylalanin sollte
dabei über einen Linker und eine photospaltbare Gruppe an das Phosphoramidit bzw.
später an den Primer gekoppelt sein. Diese Vorstufen stellen die ersten Komponenten
der entwickelten direkten Selektionsstrategie mit modularem Aufbau zur Selektion
von fDNAzymen bzw. DNAzymen dar.
3 Durchführung und Ergebnisse
3.1 Entwicklung der Selektionsstrategie
Mit der Wahl der einzelnen Komponenten für die in-cis Selektion wurde zum einen
auf etablierte Methoden unterschiedlicher Selektionsexperimente zurückgegriffen, und
zum anderen bereits vorhandene Komponenten in abgewandelter Form eingesetzt.
[16-19,41] Bei dem Design der Selektionsstrategie sollten in Anlehnung an die
Experimente von B. Zhang und T. Cech die von diesen verwendeten Aminosäuren als
Reaktionspartner für die Selektion verwendet werden.
a) O b)
N
NH
O N N NH2
R O N(iPr)2
-S P O P
O
O- OEtCN
OH OH
Guanosin-5´-monophosphorothioat (GMPS) R-Phosphoramidit
R SH
N
NH
O N N NH2 O B
R S S P O R O P O
O O
O- O-
OH OH O OH
DNA-Primer
Guanosin-5´-monophosphorothioat (GMPS), kann mit R-modifiziertes Phosphoramidit zur Synthese von

dem in-cis Reaktanden R über eine Disulfidbrücke R-modifizierten Oligonucleotiden am DNA-Synthesizer.
modifiziert werden um enzymatisch in RNA
eingebaut zu werden.
Abbildung 9: Unterschiedliche Methoden des Einbringens von in-cis Reaktanden in RNA (a) bzw.
(f)DNA (b). Bei dem Initiatornukleotid handelt es sich um Guanosin-5´-monophosphorothioat (GMPS),
das von der RNA-Polymerase als Substrat akzeptiert wird. Dem gegenübergestellt ist das modifizierte
Phosphoramidit zur Synthese von modifizierten Oligonukleotiden am DNA-Synthesizer.
Da jedoch die Prozesse der DNA- und fDNA-Selektion in entscheidenden Schritten

Unterschiede zur Selektion von RNA beinhalten, sind der experimentelle Aufbau und
die Eigenschaften der benötigten Komponenten verschieden von denen, die B. Zhang
und T. Cech verwendeten. Ein erster wichtiger Unterschied ist das Einbringen des in-
cis Reaktanden in die Population des zu selektierenden fDNA/DNA-Pools. Während
appear here. 21
bei der Ribozym-Selektion das Substrat Phenylalanin, welches mit seiner freien
Aminogruppe als Aminoacyl-Rezeptor fungiert, über ein sogenanntes
Initiatornukleotid an das 5´-Ende einer jeden RNA des Pools einbracht wird, muss
dies bei DNA und fDNA über ein entsprechendes Phosphoramidit am DNA-
Synthesizer geschehen (Abbildung 9).
Um die selektierte und durch Affinitätschromatographie immobilisierte RNA von dem
daran gekoppelten Reaktionsprodukt und somit auch von der Trägermatrix zu lösen,
bediente sich die Arbeitsgruppe von Cech einer Disulfidbrücke. Diese wurde durch
ein Cystamin, das als Linker zwischen Aminosäure und RNA dient, eingebracht. Das
Ablösen von der Streptavidin-Säule geschah reduktiv durch Zugabe von Dithiothreitol
(DTT).[17] Als alternatives Reagenz zur Reduktion kann auch 2-Mercaptoethanol
eingesetzt werden.[19] Da es für die Selektion essentiell ist zu gewährleisten, dass von
den immobilisierten Nukleinsäuren nur jene im Amplifikationsschritt angereichert
werden, die das biotinylierte Substrat über eine Peptidbindung an sich gebunden
haben und um auszuschließen das Nukleinsäuren eluiert werden, die das biotinylierte
Substrat durch Reaktion an anderer Stelle der (f)DNA gebunden haben, wurde eine
andere Verknüpfungsart gewählt als die oben beschriebene. In vorrangegangen
Selektions-Experimenten hatte sich das Reduktionsmittel 2-Mercaptoethanol als
möglicher Störfaktor bei der Bindung von Biotin an Streptavidin erwiesen (siehe
Kapitel 2.1).[19] Um die Interaktion zwischen dem auf Trägermatrix aufgebrachtem
Streptavidin und den biotinylierten Nukleinsäuren so wenig wie möglich zu
beeinflussen, wurde eine photospaltbare Gruppe gewählt, die nach Belichtung selektiv
das Reaktionsprodukt von dem modifizierten 5´-Terminus der (f)DNA abtrennt, und
alle verbleibenden (f)DNA-Moleküle mit unspezifischer Substrat-Kupplung
unverändert lässt. Bei der Selektion des Michaelase-Ribozyms durch G. Sengle et al.
hatte sich zur selektiven Spaltung ein Linker bewährt, der aus 4-Brommethyl-3-nitro-
benzoesäureester dargestellt werden kann und nach Einbringen als photolabile Gruppe
(Photocleaver) dient.[18] Im Gegensatz zur reduktiven Spaltung muss kein weiteres
chemisches Reagenz hinzugesetzt werden, sondern es reicht eine Belichtung der
Trägermatrix mit UV-Licht. Dieser photospaltbare Linker wurde von A. Eisenführ in
soweit modifiziert,[42] als dass in der benzylischen Position des Aromaten eine
Methylgruppe zusätzlich eingebracht wurde, um als Spaltprodukt, statt des reaktiveren
Aldehyds 9b, das chemisch weniger reaktive aromatische Keton 10b zu erhalten
(Abbildung 10). Auf diese Weise sollten störende Nebenreaktionen vermieden

werden, die ansonsten nicht auszuschließen wären.
O O
O O
9a 10a
NO2 NO2
Photospaltung
O O
OH OH
9b 10b
O NO O NO
Reaktives arom. Nitroso-Aldehyd Vergleichweise unreaktives arom. Nitroso-Keton
Abbildung 10: Vergleich des ursprünglichen Photocleavers 9a und seines Spaltprodukts 9b mit dem
modifizierten Photocleaver (10a, 10b).
Damit stand eine substrattragende Komponente als Syntheseziel fest. Die

Verbrückung zwischen Aminosäuresubstrat und Phosphoramidit über den
Photocleaver und einen Spacer kann unterschiedlich gestaltet werden. Eine
Möglichkeit wäre, 6-Aminohexanol als Linker zwischen Phenylalanin und dem
Photocleaver zu platzieren (12, Abbildung 11). Dann könnte der Aminoalkohol an das
benzylische Kohlenstoffatom der photospaltbaren Gruppe über eine Etherbrücke
angebracht werden, während die Amino-Funktion eine Amidbindung zum
Phenylalanin ausbilden würde.
Substrat A:
O N(iPr)2
O P TEG-Linker verknüpfte Aminosäure
N OEtCN
H H
N O O
TFAHN O O
O NO2
11
O N(iPr)2
O P 6-Aminohexanol-Linker verknüpfte Aminosäure
O N OEtCN
H
TFAHN O
N
H
NO2
12
appear here. 23
Abbildung 11: Zwei denkbare Linker für die Substrat/Photocleaver-Verknüpfung: Substrat A mit
favorisiertem TEG-Linker 11 und mit einem Aminoalkohol 12.
Das Phosphoramidit würde dann über die Aminogruppe des kurzen Aminoalkohols 2-
Ethanolamin mit der Benzoesäuregruppierung der photolabilen Verbindung durch eine
Amidbindung verknüpft. Da die Spaltung an der benzylständigen Etherbindung
stattfände, würde im Ergebnis die Nukleinsäure weiterhin mit dem zum Keton
transformierten Photocleaver verbunden bleiben. Diese Variante wurde nicht gewählt,
weil verhindert werden sollte, dass durch Einbringen des vergleichsweise unpolaren 6-
Aminohexanol bei der Selektion nach Motiven selektiert wird, die unpolare Nischen
für diese Art von Substrat ausbilden. Alternativ könnte, in Analogie zu der
Verfahrensweise bei der Michaelase-Selektion,[18] statt einer Etherknüpfung das
Phosphoramidit direkt an die Benzylstellung angebracht werden, so dass nach der
Primersynthese am DNA-Synthesizer an dieser Stelle eine Phosphorsäureester-
Brücke zwischen Nukleinsäure und Photocleaver besteht (13, Abbildung 12).
NH2 O
H
N
N N(iPr)2
H
O O P
OEtCN
NO2
13
O O
DNA-Synthesizer
HN HN O B
N(iPr)2
O P O P O
O
OEtCN
O-
NO2 NO2
O
13 14
(f)DNA
Photospaltung HN O B
O HO P O
O
O-
NO
O
15 (f)DNA
16
Abbildung 12: Verknüpfung des Aminosäuresubtrates mit dem Photocleaver in umgedrehter

Orientierung.
Nach erfolgter Spaltung durch Bestrahlung würde die DNA bzw. fDNA eluiert
werden, während der zum Keton transformierte Photocleaver nun am Substrat 15
verbleibt. Bei dieser Vorgehensweise würde das Phenylalanin über ein Diamin wie
z.B. 1,4-Diaminobutan über Amidbindungen an die Benzoesäuregruppierung des
Photocleavers und die Carboxyl-Gruppe der Aminosäure verknüpft. Diese Idee wurde
zunächst verworfen, weil vermutet wurde, dass auf diese Weise keine ausreichend
große Flexibilität bezüglich des an der Nukleinsäure befindlichen Substrates
gewährleistet wäre. Außerdem ist zu befürchten, dass die Analyse des gebildeten
Produktes durch den zusätzlichen Molekülanteil erschwert wird.
Es wurde die am geeignetsten erscheinende Variante gewählt, bei der ein
Tetraethylenglykol (TEG)-Linker, auf Seiten der Aminosäure über eine Amidbindung,
und auf Seiten des Photocleavers über eine Etherbrücke die Aminosäure mit dem
Photocleaver (11; Abbildung 13) verknüpft. Dabei muss zunächst eine Etherbindung
zwischen Photocleaver und TEG geknüpft werden und schließlich das andere Ende
des TEG in ein Amin konvertiert werden, um es als Amid an das Carboxyl-C des
Phenylalanins zu binden.
O N(iPr)2
O P TEG-Linker verknüpfte Aminosäure
N OEtCN
H H
N O O
TFAHN O O
O NO2
11
DNA-Synthesizer
O O B
O P O
N O
H H O- Phosphordiester verknüpftes Oligonukleotid
N O O
H2 N O O O
O NO2 (f)DNA
17
Photospaltung
O O B
O P O
N O
H H O-
N O OH O
HN O O O
O NO (f)DNA
18 19
Abbildung 13: Design des mit der (f)DNA verknüpften Aminosäuresubstrates A.
Das Phosphoramidit wird am Sauerstoff des 2-Aminoethanols gebildet, das über den
Stickstoff mit einer Amidbindung an der Benzoesäuregruppe des Photocleavers
gebunden ist. Der TEG-Linker wurde gewählt, weil man gegenüber einem
aliphatischen Linker in Form eines Aminoalkohols oder Diamins eine bessere
Hydratisierung im wässrigen Milieu erwartet und die Flexibilität einem quasi frei in
Lösung befindlichen Substrat am nächsten kommt.
Das zweite Syntheseziel ist das 3´(2´)-N-[6-(Biotinylamino)-hexanoyl]-L-methionyl-
adenosin-5´-monophospat (AMP-Met-Bio) 8a bzw. 8b, welches als einfaches
Analogon für die in der Natur vorkommende Formylmethionin(fMet)-transfer-RNA
appear here. 25
dienen soll. Dieses Substrat enthält mit AMP verestertes Methionin und dient als
Aminoacyl-Donor. Das über Amidbindungen mit 6-Aminohexansäure verbundene
Biotin dient als Ankergruppe zur Isolierung auf einer Streptavidin-beladenen Säule.
NH2
N
N
Substrat B: O N N
O -O P O
O
O-
HN NH O O OH
H H O
H
N
S N
H
O
S
8a
Substrat A:
O N(iPr)2
O P
N OEtCN
H H
N O O
TFAHN O O
O NO2
11
Abbildung 14 : Vorstufen für das Selektionsexperiment (Von Substrat B ist nur ein Regioisomer
aufgeführt).
Die Abbildung 15 (Seite 26) zeigt schematisch den entscheidenden Schritt - die
Katalyse der Peptidbindung - im entwickelten Selektionskonzept zum Erhalt von
(f)DNA im Vergleich zum Schema der Peptidbindungsknüpfung im Ribosom (zum
Vergleich siehe auch Abbildung 6, Kapitel 2.1). Die Initiation der Translation beginnt
im Ribosom durch die Besetzung der P-Stelle durch die fMet-tRNA (den Aminoacyl-
Donor), wenn das Startcodon erkannt wurde. Im Falle des Selektionsexperiments soll
dieses Initiator- und Aminoacyl-Donor-Molekül durch den biotinylierten Methionin-
AMP-Ester nachgeahmt werden. Anschließend besetzt eine weitere Aminosäure-
tragende tRNA die A-Stelle des Ribosoms, wobei diese tRNA komplementär zum in
der A-Stelle exponierten Codon der prozessierten mRNA ist. Im obigen Beispiel ist es
die Aminosäure Phenylalanin, die durch die tRNA in die A-Stelle des Ribosoms
gelangt und mit ihrer freien Aminofunktion den Aminoacyl-Ester der P-Stelle
nucleophil angreift. Im Selektionsexperiment ist es das über einen flexiblen Linker an
die (f)DNA befestigte Phenylalanin, das als nucleophile Komponente die
Peptidbindung ausbilden soll.
Peptidbindungsknüpfung durch ein fDNAzym:

H
H
N
O S
N
H H H
H
N
O S
N
H H
O
HN
O
HN
O
NH
S
O O
NH HN
S H2N
O
OH OH
O O
OH O O-
O NH
NH O P O-
O-
O N N O
O P O-
N N
O O N O
N
N N
NH2
NH2
O O
O O
fDNA NO2 O (f)DNA NO2 O

O O
O- H O- H
O N N
O P O O
O P O
B O O O
B O
Peptidbindungsknüpfung durch das Ribosom:
P-Stelle A-Stelle P-Stelle A-Stelle

H
H O
O NH
NH S
S O
O H2N
HN
O
OH O
OH OH O
O
OH O
O O PO 2- OH
N O
N O PO 2-
O O OPO 2- N N
N N O O PO 2-
N N O N
NH2 C N N N O
N N C NH2 C
N
N C
C NH2 C
C NH2 C
5´ 5´ 5´ 5´
fMet-tRNA Phe-tRNA mRNA fMet-tRNA Phe-tRNA
Abbildung 15: Gegenüberstellung des Katalyse-Schemas beruhend auf dem Selektionskonzept zur
Selektion von Peptidyltransferansen auf (f)DNA-Basis und dem Schema der Peptidbindungsknüpfung
im Ribosom in Analogie zu Lit.[16,17]

appear here. 27
3.2 Retrosynthetische Planung
Aus den oben vorgestellten Vorgaben für das geplante Selektionsexperiment

resultierten die drei oben vorgestellten Zielmoleküle, von denen die Komponenten
8a/8b (AMP-Met-Bio) sowie die Bausteine TFA-Phe und der Photocleaver einmal als
Bromid und ein anderes mal als Alkohol zu synthetisieren waren.
Bei dem Phosphoramidit-Substrat zur Herstellung eines modifizierten Primers für den
Einsatz in der enzymatischen (f)DNA-Pool-Generierung muss beachtet werden, dass
bei der Darstellung des substrattragenden Phosphoramidits und beim Einsatz
desselben im DNA-Synthesizer die freie Aminogruppe des Phenylalanins zunächst
geschützt sein muss. Die Schutzgruppe ist so zu wählen, dass sie den Bedingungen der
weiteren Kupplungsschritte zum Photocleaver und der Umsetzung zum
Phosphoramidit, sowie denen der DNA-Synthese standhält.[43] Weiterhin muss sie
nach der Primer-Herstellung unter ausreichend milden Bedingungen wieder abspaltbar
sein, so dass der Primer nicht zersetzt wird. Retrosynthetischen Ansätzen folgend, sind
die Amidbindungen und die Etherbindung die strategisch wichtigen Bindungen, die es
zwischen den Molekülen zu knüpfen gilt.
Bei dem biotinylierten Substrat sind es sowohl die Amidbindungen, als auch die
Esterbindung zum AMP, die unter retrosynthetischen Gesichtspunkten die
Anknüpfungspunkte für eine Synthese darstellen. Die Synthese des biotinylierten
Substrates sollte kostengünstig ausgehend vom Grundbaustein Biotin entwickelt und
vorrangetrieben werden. Entscheidend für den Erfolg der angestrebten Selektion ist
die Reinheit des biotinylierten Substrats B. Da im letzten Schritt der Synthese ein
schwer voneinander abzutrennendes Produktgemisch entsteht, dessen einzelne
Komponenten mit herkömmlichen Analyse-Methoden (1D-NMR, FAB- bzw. EI-MS
und IR) auch schwer voneinander zu unterscheidenden sind, wurde der sorgfältigen
Reinigung und Analyse des Endprodukts besondere Aufmerksamkeit gewidmet.
3.3 Synthesen
3.3.1 Synthesen von D-N-Biotinyl-6-aminohexansäure
Bei dem Versuch 6-Aminohexansäure 23 als Spacer über eine Amidbindung an die
Carboxyl-Funktion des Biotins 21 zu knüpfen, wurden zwei Wege verfolgt. Beide
sehen eine Aktivierung der Carbonsäure-Funktion des Biotins als NHS-Ester 22 vor,
bevor die Kupplung mit dem primären Amin der -Aminosäure 23 stattfindet. In
beiden Syntheserouten ist die Isolierung des Biotin-NHS-Esters 22 nicht erforderlich.
3.3.1.1 Variante 1 nach Standard-Methode[44,45]
O O
HN NH HN NH
DCC, NHS
H H H H O
DMF
OH O
RT, 20h N
S S
O 22 O
21
O
O O
H2N
OH HN NH
23
H H O
DIPEA H
N
DMF S OH
O
24
Abbildung 16:Synthese der D-N-Biotinyl-6-aminohexansäure nach konventioneller Methode.
Die Aktivierung erfolgt bei der klassischen Methode mit den Standard-Reagenzien N-
Hydroxysuccinimid (NHS) 28 und N,N´-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) 25 unter
Rühren bei Raumtemperatur. Die ersten Versuche nach einer Vorschrift von B.
Cosimelli et al. ohne Zusatz einer Base zum Reaktionsgemisch schlugen fehl.[44] Der
Grund dafür lag offenbar darin, dass die Autoren die Amidknüpfung mit einem
basischen Amin durchführten, während man bei der 6-Aminohexansäure von einem
zwitterionischen Stoff ausgehen muss, bei dem das primäre Amin teilweise oder
vollständig protoniert ist und somit keine nucleophilen Eigenschaften mehr aufweist.
Aus diesem Grund wurde einer Vorschrift von Zhao folgend, nach Bildung des NHS-
Ester-Intermediats, Diisopropylethylamin (DIPEA) zur 6-Aminohexansäure als nicht
appear here. 29
nucleophile Stickstoffbase zugesetzt.[45] Dies führte zu einer Ausbeute von 20 % der

Verbindung 24. Da die angewandten Literaturvorschriften sich nicht exakt auf das
vorhandene Syntheseproblem bezogen, sondern nur vergleichbare
Bindungsknüpfungen beschrieben, wurde bei der Wahl der Stöchiometrie bezüglich
der Base ausgehend von theoretischen Überlegungen ein leichter Überschuss von 1.1
Äquivalenten als naheliegend erachtet. Dies Menge sollte ausreichend sein, um die
protonierte Aminofunktion der 6-Aminohexansäure in quantitativem Maße zu
deprotonieren und sie in ein gutes Nukleophil zu überführen. Gegebenenfalls lässt sich
durch Variation der Basen-Menge eine Verbesserung der Ausbeute erzielen.
Alternativ zu diesen Versuchen wurde in parallelen Experimenten N-Ethyl-N´-(3-
dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) 26 statt DCC 25 (Abbildung 17) als
aktivierende Carbodiimid-Komponente gewählt.
DCC: N C N
25
N C N
EDC: HCl. N
26
Abbildung 17: Die Carbodiimid Aktivierungsreagenzien EDC und DCC.

EDC ist im Gegensatz zu DCC wasserlöslich.
Als Richtlinie hierbei diente eine Versuchsvorschrift von P. S. Arora der auf diese
Weise ein aliphatisches Amin an Biotin knüpfte.[46] Bei dieser Variante wird statt
DMF ein Acetonitril/Methanol-Gemisch als Lösungsmittel benutzt. Der Vorteil liegt
in der Wasserlöslichkeit des dabei entstehenden Harnstoffsderivats EDU (N-Ethyl-N’-
(3-dimethylaminopropyl)-harnstoff) und damit in dessen leichterer Abtrennbarkeit
vom unpolaren Produkt durch Extraktion mit unpolaren organischen Lösungsmitteln.
Bei den Versuchen mit EDC als alternativem Kupplungs-Reagenz konnte das
gewünschte Produkt sowohl mit als auch ohne Zusatz von DIPEA als Base nicht
isoliert werden. Der Grund hierfür ist vermutlich in der Unlöslichkeit des Biotins in
dem Lösungsmittelgemisch Acetonitril/Methanol zu suchen. Sowohl Biotin als auch
die in den nachfolgenden Reaktionen erstellten biotinylierten Verbindungen lösen sich
in den gängigen Lösungsmitteln nahezu gar nicht, was es bei den nachfolgenden
Versuchen und den Reinigungsschritten jeweils zu berücksichtigen galt. Lediglich in
DMF wird Biotin in befriedigender Weise gelöst.
3.3.1.2 Variante 2 mit TSTU[47]

O O
HN NH HN NH
DIPEA, TSTU
H H H H O
DMF/Dioxan/H2O O
OH
RT, 20 min S N
S
21 O 22 O
O
O O
H2N
OH HN NH
23
H H O
H
1.) 23, RT, 35min N
S OH
2.) H2O
O
24
TSTU: BF4- O
O N
N
N O 27
N,N,N´,N´-Tetramethyl-(succinimido)- uronium tetrafluoroborat
Abbildung 18: Synthese der D-N-Biotinyl-6-aminohexansäure mit dem Uroniumsalz TSTU.
In der alternativen Syntheseroute wird ein Uroniumsalz als Aktivierungsreagenz

verwendet[47]. Da es sich bei dem von W. Bannwarth et al. verwendeten Uroniumsalz
N,N,N´,N´-Tetramethyl-(succinimido)-uronium tetrafluoroborat (TSTU) 27 um ein
NHS-Derivat handelt, ist das dabei entstehende aktivierte Intermediat wie in Variante
1 (Kapitel 3.3.1.1) ebenfalls der NHS-Ester 22.
Bei dieser für dieses konkrete Syntheseproblem neu erprobten Methode, in der das
Uroniumsalz TSTU als NHS-Donor fungiert, wird mit dem Salz ein Reagenz
eingeführt wird, welches dem Übergangszustand eines mit Carbodiimid aktivierten
NHS ähnelt (Abbildung 19).
appear here. 31
R O O O
N +
H
C HO N R O N R O N
N N N
O N O H N O 29
R´
28 R H R H
Carbodiimid NHS
TSTU: BF4- O
O N
N
N O
27
N,N,N´,N´-Tetramethyl-(succinimido)- uronium tetrafluoroborat
Abbildung 19: Betrachtung der formalen Ähnlichkeit des Uroniumsalzes und des Übergangszustandes
des mit dem Carbodiimid aktivierten NHS
Der Vorteil dieser Methode liegt darin begründet, dass der Einführung der
Carbonsäure-aktivierenden Gruppe NHS keine Aktivierung durch das Hilfsreagenz
DCC vorangehen muss, welches häufig den Geschwindigkeitsbestimmenden Schritt
darstellt. Die NHS-Gruppe wird in aktivierter Form durch die Zugabe als Salz der zu
aktivierenden Carbonsäurekomponente sofort zugänglich gemacht. Durch den Einsatz
des Lösungsmittelgemisches mit unterschiedlicher Polarität werden die polaren
Nebenprodukte, wie der aus dem Uronium-Salz entstehende Harnstoff N,N,N´,N´-
Tetramethylharnstoff, dem Reaktionsgleichgewicht direkt entzogen und die Reaktion
so beschleunigt.
Auch diese Syntheseroute sieht keine Isolierung des Biotin-NHS-Esters vor. Die kurze
Reaktionszeit von 20 Minuten ist ein Vorteil dieser Methode, ein zweiter liegt darin
dass man - ähnlich den Kupplungsmethoden mit EDC/NHS - nicht unter
Feuchtigkeitsausschluss arbeiten muss, da diese Reaktion in einem
Lösungsmittelgemisch aus DMF/Dioxan/Wasser stattfindet. Beim Ansetzen der
Reaktion, wenn Ausgangsubstanz 21 mit Lösungsmittel versetzt wurde, wurde stets
eine Suspension erhalten, die sich aber nach Zugabe von TSTU und der Base DIPEA
durch die Bildung des leichter löslichen Biotin-NHS-Ester Intermediats (22,
Abbildung 18) auflöste. Nach dem Start der Reaktion betrug die Reaktionszeit zur
Transformierung in das NHS-Ester-Intermediat nur 25 Minuten, gegenüber den 22-
24 h, die bei der zuerst vorgestellten Route mit DCC/NHS benötigt werden. Unter
ständiger Reaktionskontrolle wurde dann die zu kuppelnde 6-Aminohexansäure
hinzugegeben und nach weiteren 30-35 Minuten war die Kupplung vollzogen. Dabei
wurden Ausbeuten von 75 % erzielt.
3.3.2 D-N-Biotinyl-6-aminohexansäure-(N-succinimidyl)-ester
O O
HN NH HN NH
DCC, NHS, DMAP O
H H O H H O
H DMF/DMSO H
N N N
S OH RT, 24 h
S O
O O
O
24 30
Abbildung 20: Darstellung des D-N-Biotinyl-6-aminohexansäure-(N-succinimidyl)-esters.
Im nächsten Schritt der Synthese des biotinylierten Substrats konnten prinzipiell die
selben Methoden wie im vorrangegangenen Schritt Anwendung finden. Auch bei
dieser Reaktion handelt es sich um eine Amidbindungsknüpfung zwischen einer
Carbonsäure-Komponente und einer Aminosäure, die bei Wahl geeigneter
Lösungsmittel, nach den unter Kapitel 3.3.1 beschriebenen Bedingungen gut verlaufen
sollte. Die Vorschrift aus den Arbeiten von Zhang und Cech [16,17](Abbildung 20)
sehen dabei die Isolierung des labilen NHS-Esters 30 vor. Da nach der Literatur als
Lösungsmittel DMF und DMSO verwendet werden mussten, gestaltete sich das
Abtrennen des DMSO vom Produkt und die Trocknung im Ölpumpenvakuum, wegen
des hohen Siedepunktes als sehr schwierig. Die Literaturvorschrift sieht eine
Aufreinigung des Produktes durch Umkristallisation vor, dabei wurde allerdings ein
so geringer Teil des eingesetzten Rohproduktes ausgefällt, dass die Menge nicht
ausreichte um die notwendige Analytik (1H-, 13C-NMR) zur eindeutigen Identifikation
des Produktes durchzuführen, deshalb wurde die Substanz säulenchromatographisch
aufgereinigt. Die Schwierigkeiten bei der Isolierung des Produktes durch
Umkristallisation könnten unter anderem auf die deutlich kleineren Mengen bei der
Ansatzgröße der Synthese gegenüber den Mengen der Originalliteratur zurückgeführt
werden. Die Lösungs- und Kristallisations-Eigenschaften können sich dabei soweit
verändern das sie im präparativen Maßstab zur Isolierung durch Umkristallisation
nicht mehr effektiv ausgenutzt werden können.
Aktivierte Carbonsäuren vom Typ 30 sind bekannt dafür, relativ instabil zu sein und
aufgrund der dünnschichtchromatographischen Ergebnisse und der geringen Ausbeute
(24%) kann vermutet werden, dass sich die Substanz bei der erfolgten
säulenchromatographischen Aufreinigung zu einem großen Teil zersetzt hat. Die bei
dieser Aufreinigungsmethode unumgängliche und vergleichsweise lange
appear here. 33
Verweildauer auf der Säule sowie die Notwendigkeit, die Substanz aus relativ großen
Laufmittelmengen vom Lösungsmittel unter vermindertem Druck abzutrennen,
erwiesen sich für diese labile Verbindung als unvorteilhaft. Alle Versuche, die
Reaktion ausschließlich in DMF als Lösungsmittel durchzuführen, um diese
Problematik zu umgehen, schlugen fehl. Aus diesem Grund wurde bei späteren
Synthesen der NHS-Ester nicht isoliert, sondern das Reaktionsgemisch nur von
überschüssigem unlöslichen NHS durch Filtration befreit und das
Lösungsmittelgemisch DMF/DMSO so weit möglich im Ölpumpenvakuum entfernt.
Das so erhaltene, immer noch DMSO enthaltende, ölige Rohprodukt wurde sofort zur
Weiterreaktion mit Methionin in DMF eingesetzt.
3.3.3 6-(D-N-Biotinylamino)-hexanoyl-L-methionin
Die Kupplung des Methionins erfolgte, wie oben unter Kapitel 3.3.2 beschrieben nach
der Darstellung der aktivierten NHS-Ester Spezies 30 (Variante1, Kapitel 3.3.3.1).
Gleichzeitig wurde in Analogie zu der in Kapitel 3.3.1.2 beschriebenen Reaktion das
Kupplungsreagenz TSTU 27 zur Amidbindungsknüpfung verwendet (Variante 2,
Kapitel 3.3.3.2).
3.3.3.1 Variante 1 nach Zhang und Cech[17]

O O
HN NH HN NH
DCC, NHS, DMAP O
H H O O
H H
H DMF/DMSO H
N N N
S OH RT, 24 h
S O
O O
O
24 30
O
S
HN NH
H2 N COOH
31 H H O S
H
N
Et 3N S N COOH
H
RT, 48 h O
32
Abbildung 21: Kupplung der Aminosäure Methionin an den biotinylierten Linker mit den
Kupplungsreagenzien NHS/DCC.
Wie in Kapitel 3.3.2 beschrieben, wurde zur Synthese von N-Biotinyl-6-amino-

hexansäure-L-methionin 32 so vorgegangen, dass entgegen der Synthesevorschrift[17]
nach der Reaktion zum aktivierten Zwischenprodukt 30, sofort die Reaktion zum
Amid eingeleitet wurde. 30 und Methionin wurden in DMF gelöst und tropfenweise 6
Äquivalente Triethylamin langsam hinzugegeben und 48 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Bei der Reaktion entstandenes NHS sollte gemäß der Versuchsbeschreibung
ausfallen und so durch Filtration vom Reaktionsgemisch abgetrennt werden. Mehrere
durchgeführte Versuche machten aber deutlich, dass sich die Abtrennung des
anfallenden NHS schwierig gestaltet. Nach 48 h Reaktionszeit fiel ein schwer
filtrierbarer Niederschlag an. Die Filtration gelang schließlich durch Filtrieren durch
Celite. Beim Versuch das Produkt anschließend gemäß der Versuchsanweisung durch
Zugabe von Aceton zu fällen, zeigte sich aber oft, dass die vorrangegangene
Ausfällung des NHS offenbar nicht vollständig gelungen war. In Gegenwart von NHS
lässt sich das Produkt nicht ausfällen, stattdessen beobachtete man nach einiger Zeit in
der Kälte einen Niederschlag von nadelförmigen Kristallen, bei denen es sich um in
der Reaktionslösung verbliebenes NHS handelt. Aus diesem Grund wurde in späteren
Versuchen das Reaktionsgemisch nach erfolgter Reaktion 24 h bei 4 °C gelagert. Der
dann anfallende Niederschlag in Form von nadelförmigen Kristallen wurde verworfen
und der Überstand mit Aceton zum Ausfällen des Produktes versetzt. Die Ausbeute
lag mit 75 % nur wenig unter der von B. Zhang und T. Cech angegebenen (Aus 85 %
für die Reaktion aus Kapitel 3.3.2 und 90 % Ausbeute für die 2. Stufe wie sie in
Abbildung 21 (zweite Zeile) beschrieben wird errechnen sich 76.5 % als
Gesamtausbeute bei Zhang et al.).[16,17]
3.3.3.2 Variante 2 mit TSTU[47]

O O
HN NH 1.) DIPEA HN NH O
2.) TSTU
H H O H H O
H H
N DMF/Dioxan/H2O N N
S OH RT, 25 min S O
O O O
30
24
O
S
HN NH
H2N COOH
H H O S
31
H
N
RT, 35 min S N COOH
H
quenschen mit H2O
O
32
Abbildung 22: Kupplung der Aminosäure Methionin an den biotinylierten Linker mit TSTU.
Aufgrund der Ähnlichkeit der vorliegenden Reaktion zu der Amidbindungsknüpfung

aus Kapitel 3.3.1, ist auch hier versucht worden, TSTU als alternatives Reagenz zur
appear here. 35
Aktivierung der Carbonsäure-Komponente zu benutzen. Unter den selben
Reaktionsbedingungen wie in Kapitel 3.2.1.2 beschrieben, wurde eine sehr gute
Ausbeute von 96 % erhalten. Für die mechanistischen Aspekte gilt das in Kapitel
3.2.1.2 gesagte. Der klare Vorteil bei dieser Methode liegt wiederum in der kurzen
Reaktionszeit (ca. 1h) verglichen mit Kapitel 3.2.3.1 (72 h), wobei der Unterschied bei
dieser Bindungsknüpfung noch erheblich größer ausfällt als bei dem Vergleich der
beiden Reaktionszeiten unter Kapitel 3.2.1. Mit 96 % wurde eine sehr gute Ausbeute
erhalten.
3.3.4 3´(2´)-[6-(D-Biotinylamino)-hexanoyl-L-methionyl]-adenosin-
5´-monophospat
O O
HN NH DMF, 15 min HN NH
H H O S H H O S
H H
N O N O
S N COOH S N
H H
O N N O N
32 N N
34
N
33
NH2
N
N
O N N
NH2 O -O P O
O
N O-
N HN NH O O OH
O N N H H O
H
-O P O N
O N
S
O- H
O
OH OH S
3´-N-[6-(Biotinylamino)-hexanoyl-L-methionyl-adenosin-5´-monophosphat
35 8a NH2
Formamid, 24 h N
N
O N N
-O P O
O
O
O-
HN NH OH
O O
H H O
H
N
S N
H
O
S
2´-N-[6-(Biotinylamino)-hexanoyl-L-methionyl-adenosin-5´-monophosphat
8b
Abbildung 23: Bildung des AMP-Esters über die Aktivierung des biotinylierten Methionin mit CDI.
Der letzte Schritt der Darstellung des als Formylmethionin-tRNA-Analogon

fungierenden AMP-Met-Bio sieht eine Knüpfung der Aminosäure-Carboxylfunktion
des biotinylierten Substrats 32 mit der 3´- oder 2´ Hydroxy-Gruppe des Nukleotids
Adenosin-5´-monophospat (AMP) 32 vor. Die Umsetzung fand unter den bei Zhang
und Cech beschriebenen Reaktionsbedingungen statt.[16,17] Als Kupplungsreagenz
diente 1,1´-Carbonyldiimidazol (CDI) 33. Zunächst wurde 32 in das Imidazolamid 34
überführt, welches vergleichbar den NHS-Estern (30, 22) der oben beschriebenen
Reaktionen, als carboxyl-aktivierte Zwischenstufe diente. 34 wurde dann zu einer
Lösung von AMP hinzugegeben, um dann innerhalb von 24 h die erwünschten AMP-
Ester 8b und 8a zu ergeben. Von den vier möglichen nucleophilen Positionen im
AMP sind unter diesen Bedingungen nur die 2´- und 3´-Hydroxy-Funktionen des
Zuckerrestes ausreichend nucleophil, so dass Nebenreaktionen mit der 4-Amino-
Gruppe der Nukleotid-Base vernachlässigbar sind.[48,49] Die Bildung eines
gemischten Anhydrids zwischen der Carboxylfunktion des biotinylierten Moleküls
und einem Sauerstoff der 5´-Monophosphatgruppe des AMPs findet nur im geringen
Maße statt, wie die nachstehenden Experimente zur Aufreinigung belegen.[49] Weil
zum Einsatz der Komponenten 8b und 8a in den biochemischen Experimenten ein
hoher Reinheitsgrad erstrebenswert ist, wurde die Aufreinigung der Produkte zunächst
durch Umkehrphasen Säulenchromatographie (RP-MPLC: reverse phase-medium
pressure liquid chromatography) vorgenommen, statt wie in der Literatur
beschrieben,[17] durch einfach Säulenchromatographie ohne Druck und ohne
Gradienten an Silicagel. Das Produkt wurde in Wasser aufgenommen und durch einen
Gradienten (Details über die Spezifikationen der Säule und den Werten des
Gradienten siehe experimenteller Teil Kapitel 4.1 und 4.2.4) eluiert, wobei keine
Trennung des Isomerengemisches erfolgte. Das Protonenspektrum der isolierten
Fraktion bestätigte zunächst die in der Vorschrift erwähnte Produktverteilung der
13
Isomeren zu 70 % 3´-Isomer 8a und 30 % 2´-Isomer 8b zeigte aber im C-NMR-
Spektrum einige nicht leicht zu identifizierende Verunreinigungen. Um deshalb
anschließend die oben benannten Regioisomere – das gemischte Anhydrid 5´-[6-
(Biotinylamido)caproyl-l-methionyl]adenosin-5´-mono-phosphat und das Amid an
dem exocyclischen Stickstoff der Nukleotidbase - als Verunreinigungen
auszuschließen, wurden unterschiedliche spektrometrische Analysemethoden
herangezogen.
appear here. 37
Dass die Carbonsäurekomponente nicht mit der exocyclischen Aminofunktion der
Nukleobase unter Ausbildung des Amids reagierte, konnte durch die Analyse des UV-
31
Spektrums der Verbindung ausgeschlossen werden. Die P-NMR-Spektren zeigten,
dass trotz MPLC-Reinigung des Produkts eine geringe Verunreinigung vorhanden
war, deren chemische Verschiebung ein Hinweis auf das gemischte Anhydrid ist,[15]
in Ermanglung einer Vergleichssubstanz aber nicht eindeutig als solche bestätigt
werden konnte. Die Verunreinigung konnte durch analytische High performance
liquid chromatography (HPLC) detektiert werden. Die Elutions-Profile der erstellten
Probenpräparationen zeigten zum einen noch geringen Anteil der Verunreinigung,
sowie nicht verestertes reines AMP. Mehrere Messungen von Proben in wässriger
Lösung nach unterschiedlich langen Lagerungszeiten in Wasser bei RT (Zeitraum ca.
70h) zeigten, dass das Produkt sich langsam unter diesen Bedingungen zu AMP und
freier Säure zersetzt. Probenpräparationen in Methanol, die zur Aufnahme von NMR-
Spektren gemacht wurden, zeigten bei einer anschließenden HPLC-Analyse eine noch
deutlich ausgeprägtere Tendenz zum Zerfall in AMP und biotinylierter Aminosäure.
Die Abtrennung der Verunreinigung, von der vermutet wird dass es sich um das
gemischte Anhydrid handelt und die durch die MPLC nicht abgetrennt werden konnte,
gelang über eine HPLC im semi-präparativen Maßstab. Das Elutionsprofil der
gereinigten Substanz zeigte nur noch ein starkes Signal bei der dem Produkt
entsprechenden Retentionszeit und ein schwaches Signal, das durch eine
Referenzmessung als AMP identifiziert wurde und durch die langsame Zersetzung des
31
Produkts entsteht. Das P-NMR-Spektrum bestätigt mit zwei Singuletts ähnlicher
Verschiebung (einem schwachen Signal für das in Spuren vorhandene AMP und
einem starken Signal für die Bio-Met-AMP-Ester 8a/8b) dieses Ergebnis. Bis auf das
in kleinen Mengen aufgrund der Zersetzungsreaktion vorhandene AMP ist das
Substrat von Verunreinigungen befreit. Nach der Reinigung betrug die Ausbeute 27%.
3.3.5 N-(Trifluoracetyl)-phenylalanin
O
F3C
H2N COOH
TFA HN COOH
F3C O CF3
-20°C RT, in 1h
O O
37
36
38
Abbildung 24: Synthese des TFA-geschützten Phenylalanins mit TFA-Anhydrid
Die freie Aminogruppe des in-cis Reaktionspartners Phenylalanin 36 sollte durch eine
geeignete funktionelle Gruppe geschützt werden, damit sie in den folgenden
Kupplungsschritten an den Abstandshalter TEG und an die photolabile Gruppe nicht
als Nucleophil störende Nebenreaktionen verursacht. Nebenreaktionen wären auch bei
der Überführung der gesamten Einheit Aminosäure/Linker/Photocleaver zum
Phosphoramidit zu befürchten. Weiterhin darf bei der Primer-Synthese kein störendes
Nucleophil zugegen sein; die gewählte Aminoschutzgruppe muss den
Reaktionsbedingungen der Oligonukleotid-Festphasensynthese am DNA-Synthesizer
standhalten.[43] Die Schutzgruppe darf also nicht bei Exposition von
Trichloressigsäure, welches zur Entschützung in der Festphasensynthese eingesetzt
wird, abgespalten werden und muss auch dem Oxidierungsprozess des Phosphors
durch Iod in Pyridin standhalten. Trifluoracetat (TFA) erweist sich hierbei als
geeignete Schutzgruppe, weil sie eine ausreichende Stabilität gegenüber Säuren bis zu
einem pH von 1 bei Raumtemperatur aufweist, hingegen unter leicht basischen
Bedingungen entfernt werden kann,[50] was für die Entschützung ohne Zersetzung
des synthetisierten Primers wichtig ist. Die Entschützung ist somit kompatibel mit den
Bedingungen der Oligonukleotid-Synthese (wässrige NH3, 33%). Unter den vielen
möglichen Vorschriften zur Einführung der TFA-Schutzgruppe,[50] wurde die
Methode von Sievers et al. [51] gewählt, weil sie ohne großen apparativen Aufwand
mit wenigen Reagenzien in kurzer Zeit das gewünschte Produkt liefert. Eine
Aufreinigung des Produktes ist hierbei nicht vorgesehen und erwies sich auch als
unnötig. Phenylalanin wurde in Trifluoressigsäure als Lösungsmittel bei –20 °C mit
Trifluoressigsäureanhydrid (TFAA) umgesetzt und nach einer Reaktionszeit von einer
appear here. 39
Stunde bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit
und das Produkt in 95 % Ausbeute isoliert.
3.3.6 4-Ethyl-3-nitrobenzoesäuremethylester
O O
O H2SO 4/HNO3 O
NO2
39 40
Abbildung 25: Nitrierung der Photocleaver-Vorstufe.
Ausgangsprodukt für die Darstellung der photospaltbaren Gruppe in größerem

Maßstab war der von A. Eisenführ hergestellte p-Ethyl-benzoesäuremethylester 39
(Abbildung 25). Die Nitrierung des Aromaten gelang mit Standardmethoden [52]
durch den Einsatz von dem als Nitrier-Säure bekannten Säuregemisch aus
Salpetersäure (65 %) und Schwefelsäure (96 %) (1:1.2, v/v). Gemäß den Regeln für
eine elektrophile Substitution am Aromaten, findet die Nitrierung in der gewünschten
Position 3 am Aromaten statt. Der negative Mesomerie-Effekt (-M) der
Benzoesäuremethylester Funktion, dirigiert einen elektrophilen Substituenten in die
meta-Position (Positionen 3, 5 bei 39) während die zum Benzoesäuremethylester
para-ständige Ethyl-Gruppe einen positiven induktiven Effekt ausübt, und damit
ebenfalls die Positionen 3 bzw. 5 in 39 für einen elektrophilen Angriff prädestiniert
(ortho dirigierend). Wegen des Einsatzes der starken Säuren musste zur Kontrolle der
leicht exothermen Reaktion die Reaktionslösung gekühlt (5 °C) werden. Da das
entstandene Produkt sich nicht im wässrigen Medium der Reaktionslösung löst,
gelang die Isolierung des Produktes leicht durch Extraktion mit organischen
Lösungsmitteln (Diethylether). Nach säulenchromatographischer Aufreinigung
wurden 55% Produkt erhalten. Die geringe Ausbeute könnte aus dem Umstand
resultieren, dass der Aromat durch den –M-Effekt der Carbonsäureesterfunktion
desaktiviert und so die elektrophile Substitution gehemmt wird. Eine Verlängerung
der Reaktionszeit bei geringfügig erhöhter Temperatur könnte gegebenenfalls zu
höhere Ausbeuten führen.
3.3.7 4-(1-Bromethyl)-3-nitrobenzoesäuremethylester
Br N
O O
41
O O
O
(PhCO)2O2(kat.)
Br
CCl4
NO2 2h30min, reflux. NO2
40 42
Abbildung 26: Bromierung der Photocleaver-Vorstufe mit NBS.
Die Bromierung des 4-Ethyl-3-nitrobenzoesäuremethylesters 40 an der benzylischen

Position der Ethyl-Seitenkette erfolgte radikalisch mit N-Bromsuccinimid (NBS) als
Bromradikal-Donor und Dibenzoylperoxid als Radikalstarter in katalytischen Mengen.
Die ersten Versuche der Synthese nach der Vorschrift von A. Eisenführ mit einer
Reaktionsdauer von 30 Minuten zeigten im Protonenspektrum der isolierten
Verbindung stets ein 1:1 Gemisch aus Edukt und Produkt.[42] Die
dünnschichtchromatographische Reaktionskontrolle (DC) konnte auch bei Variation
der Laufmittel keinen Aufschluss auf den Reaktionsverlauf geben, da der Polaritäts-
Unterschied von Edukt und Produkt nur marginal ist. Dies machte die Aufreinigung
des Produkts durch Säulenchromatographie an Silicagel sehr mühsam. Reagenzien
und Nebenprodukte konnten vom Produkt abgetrennt werden, nicht jedoch das Edukt.
Durch Variation der Reaktionsdauer ergab sich bei der gewählten Ansatzgröße von ca.
10 mmol in einem Zeitraum von ca. 2 ½ Stunden eine Ausbeute von 82 %.
appear here. 41
3.3.8 Versuch zur basischen Hydrolyse des 4-(1-Bromethyl)-3-

nitrobenzoesäuremethylester
O O O
O H2O/iPrOH OH OH
Br 1.) RT, 72h Br HO
2.) +Na2CO3, RT, 16h

NO2 NO2 NO2
42 43 44
O O O
O H2O/Aceton OH OH
Br 1.) RT, 72h Br HO
2.) +Na2CO3, RT, 16h

NO2 NO2 NO2
42 43 44
Abbildung 27: Der Versuch zur basischen Hydrolyse des bromierten Photocleavers resultierte in der
basischen Verseifung des Methylesters.
Nachdem erste Vorversuche[42] zur Knüpfung einer Etherbindung zwischen der

benzylischen Position der Ethylseitenkette des Photocleavers und eines TEG-Linkers
durch nucleophile Substitution nicht zum Erfolg führten, sollte die Bindungsknüpfung
ausgehend vom Photocleaver als nucleophile Komponente durchgeführt werden. Dazu
muss die Verbindung 42 in den entsprechenden Alkohol umgewandelt werden, d.h.
das Bromid hydrolysiert werden. In Anlehnung an unterschiedliche Vorschriften der
Literatur,[53-56] in denen die Hydrolyse sekundärer Bromide sowohl in neutralen
wässrigen oder alkoholischen Lösungen, als auch unter basischen Bedingungen
beschrieben wird, wurde zunächst eine schonende Variante versucht und bei
Raumtemperatur in wässrigem Milieu gearbeitet. Um zu gewährleisten das sich 42 in
der Reaktionslösung löst, wurden zum einen Isopropanol und zum anderen Aceton als
organische Solventien hinzugegeben. Nachdem auch nach 72 Stunden kein Umsatz zu
verzeichnen war, wurde unter den vielen Basen, die in der oben aufgezählten Literatur
Verwendung finden, wie Natriumhydrid, Ammoniak, Silberoxid und
Calciumcarbonat, Natriumcarbonat als milde Base gewählt. Hier war nach 16 Stunden
bei Raumtemperatur, wie das Protonenspektrum zeigte, die freie Säure entstanden.
Die Hydrolyse des Bromids gelang so nicht.
3.4 Ausblick
Neben der Fortsetzung der Versuche zur Knüpfung einer Etherbrücke zwischen
Photocleaver und TEG-Linker sollten, aufgrund der bisherigen Erfahrungen und
Schwierigkeiten mit dieser Bindungsbildung, parallel Synthesen durchgeführt werden,
die eine umgekehrte Orientierung des Photocleavers vorsehen (Kapitel 3.1, Abbildung
12), um mit dieser bereits etablierten Methode schnell mit den angestrebten
Selektionsexperimenten beginnen zu können.
Um verifizieren zu können, ob die selektierten Nukleinsäuren tatsächlich die
gewünschte Reaktion, einen Aminoacyl-Transfer, katalysiert haben, ist es
unumgänglich, das Reaktionsprodukt zu analysieren. Da die von der (f)DNA
katalysierte Reaktion, nach Abspaltung der Nukleinsäure durch Belichtung, nur eine
sehr geringe Menge an Produkt liefern wird, ist zu dessen Identifizierung nur eine
massenspektrometrische Analyse sowie eine Analyse durch HPLC möglich. Zur
Bestätigung der Identität des Produktes ist die chemische Synthese des
Selektionsproduktes, welches sich prinzipiell aus dem biotinylierten Substrat und dem
Reaktionspartner inklusive seines Linkers zusammensetzt, nötig. Dieses dient dann als
Vergleichs-Substanz und wird dann parallel zum aus dem Selektionsexperiment
isolierten Selektionsprodukt als Referenz mit den oben genannten Analyse-Verfahren
analysiert. Zur näheren Charakterisierung der Struktur des Selektionsproduktes mit
den üblichen spektroskopischen Methoden (NMR, MS) kann dann die synthetisierte
Referenzsubstanz herangezogen werden.
Nach Abschluss der verbleibenden Synthesen und der Generierung der fDNA- bzw.
DNA-Startbibliotheken kann mit den Selektionsexperimenten begonnen werden.
Dabei sollten die Selektionsexperimente sowohl mit DNA als auch mit fDNA
durchgeführt werden, um beim Vergleich der Ergebnisse den Einfluss der
Funktionalisierung auf die katalytischen Eigenschaften bestimmen zu können. Es gilt
zu prüfen ob die Sequenz-Motive der selektierten katalytisch wirksamen DNA und
fDNA sich gleichen und ob Unterschiede in der Effizienz zu beobachten sind.
Weiterhin ist die Länge der essentiellen Sequenz-Motive von Interesse. Es stellt sich
z.B. die Frage , ob durch die Modifikationen der fDNA die zur Katalyse benötigte
minimale Länge der essentiellen Sequenz verkleinert werden kann. Ein Vergleich der
appear here. 43
minimalen Sequenzlänge die von DNAzymen bzw. fDNAzymen benötigt wird könnte
darüber Aufschluss geben.
Der Klärung dieser Fragen schließen sich dann Vergleiche mit den Ergebnissen der
Selektionsexperimente von Zhang und Cech an. Zum direkten Vergleich könnte eine
Reselektion der Ribozyme nach Zhang und Cech hilfreich sein, wobei die Details des
Selektionsaufbaus für diese Ribozymselektion, d.h. die eingesetzten Linker, der
Photocleaver etc. entsprechend der DNA/fDNA-Selektion übernommen werden
müssten. Das Substrat A würde bei diesen Experimenten über ein Initiatornukleotid in
die RNA-Bibliothek eingeführt wie in Kapitel 3.1 (Abbildung 9) beschrieben.
4 Experimenteller Teil
4.1 Material und Methoden
NMR-Spektroskopie:
1
H-NMR: Bruker DPX 300, 400 (300, 400 MHz) und DRX 500 (500 MHz)
13
C-NMR: Bruker DPX 300, 400 (75, 101 MHz) und DRX 500 (125 MHz)
31
P-NMR: Bruker DRX 500 (202 MHz)
Alle NMR-Spektren wurden bei 298 K aufgenommen. Chemische Verschiebungen ()
sind in ppm angegeben und beziehen sich auf Tetramethylsilan (1H-/13C-NMR) bzw.
85%ige Phosphorsäure (31P-NMR) als Standard. Für die 1H-/13C-NMR-Spektroskopie
diente das verwendete Lösungsmittel (für 1H-NMR dessen undeuterierter Restgehalt)
als interner Standard.
IR-Spektren: IFS Lambda 2-Spektrometer der Firma Perkin-Elmer (Substanzfilm auf

KBr bzw. KBr-Pressling).Relative Intensitäten wurden wie folgt bezeichnet :
s (strong) = starke Bande; m (medium) = Bande mittlerer Intensität; w (weak) =
schwache Bande.
UV-Spektren: Agilent 1100 Diodenarray-Detektor (Agilent Technologies, Böblingen)
Massenspektren:
EI-Spektren: MS-50 der Firma A.E.I. (Manchester) oder MAT 95 XL der Firma
ThermoQuest (Bremen) mit Datenverarbeitung DS-50, Probenaufgabe durch
Direkteinlass oder Hot Box, Ionisierungsenergie 70 eV.
FAB-Spektren: Concept 1H der Firma Kratos mit m-Nitrobenzylalkohol (mNBA) als
Matrix, teilweise wurde den Proben Natriumacetat zugesetzt.
Präparative Säulenchromatographie:
Kieselgel 60, Körnung: 40-63 m (Merck, Darmstadt).
Dünnschichtchromatographie:
appear here. 45
DC-Alufolien 20 x 20 cm Kieselgel 60 F254 (Merck, Darmstadt).
Die Detektion erfolgte durch UV-Fluoreszenz (UV-Lampe Typ 204 AC der Hanau
Quarzlampen GmbH) oder durch Eintauchen in Färbereagenz 1 (nach Seebach: 2,5 g
Cer(IV)-sulfat-Tetrahydrat, 6,25 g Ammoniumheptamolybdat-Tetrahydrat, 225 ml
Wasser, 25 ml konz. Schwefelsäure)[52] bzw. Färbereagenz 2 (10 ml p-Anisaldehyd,
2 ml Eisessig, 180 ml Ethanol, 10 ml konz. Schwefelsäure)[52] und nachfolgendes
Erwärmen.
MPLC: MPLC-Pumpe 688 der Firma Büchi, Lobar-Fertigsäule Größe A (240-10),

Säulenmaterial LiChroprep RP-18 (40-63 µm) der Firma Merck, Flussrate ca. 3
ml/min.
Präparative-HPLC: HPLC der Firma Knauer, 2 Pumpen Typ „64“, variabler UV-
Detektor, Säule 250 x 4 mm, Säulenmaterial Nucleosil RP-18 100-5 der Firma Merck.
Mobile Phase A: 100 mM TEAA-Puffer, Mobile Phase B: Acetonitril (LiChrosolv®
gradient grade, Merck, Darmstadt).
Analytische-HPLC: HPLC der Firma Agilent, Quarternäres Gradientensystem

(Agilent Technologies, Böblingen, Modell 1100), 250 x 4.6 mm Säule (Nucleosil 100-
5 C18, Merck, Darmstadt) 10.0 x 4.6 mm Vorsäule (Nucleosil 100-5 C18, Merck,
Darmstadt), UV-Detektion bei einer Wellenlänge von 254 nm.
Mobile Phase A: 100 mM TEAA-Puffer, Mobile Phase B: Acetonitril (LiChrosolv®
gradient grade, Merck, Darmstadt).
Lösungsmittel wurden wenn nötig absolutiert von der Firma Fluka bezogen oder
nach Standardverfahren getrocknet.
Chemikalien wurden von den Firmen Acros, Aldrich, Fluka sowie Bachem und
Merck bezogen und ohne weitere Aufreinigung in der Synthese eingesetzt.
Reaktionen wurden in nach Standardmethoden ausgeheizten Apparaturen unter

Argon als Schutzgas durchgeführt.
4.2 Synthese und analytische Daten
4.2.1 D-N-Biotinyl-6-aminohexansäure
O
1 2
3
HN NH
6a 3a
H H O
4 2´ 4´ H 7´ 9´ 11´
6 N
S OH
5 1´ 3´ 5´ 6´ 8´ 10´
O
Variation nach[47] :
Zu einer Suspension aus 646 mg (2.64 mmol) Biotin in einem Lösungsmittelgemisch
aus 6 ml Dioxan, 5 ml DMF und 2.7 ml Wasser werden bei RT 1.4 ml (7.92 mmol)
DIPEA und 1.00 g (3.32 mmol) TSTU hinzugegeben. Unter ständiger
Reaktionskontrolle durch Dünnschichtchromatographie werden nach 15 min 520 mg
(3.96 mmol) 6-Aminohexansäure der Reaktionsmischung zugesetzt. Nach weiteren 20
min Rühren bei RT wird die Reaktion durch Zugabe von 30 ml Wasser beendet und
die Reaktionslösung anschließend lyophylisiert. Das Rohprodukt wird durch
Säulenchromatographie an Silicagel mit Dichlormethan/Methanol (Gradient von 8/2
bis 7/3, v/v) gereinigt. Als Produkt wurden 710 mg (1.99 mmol, 75%) eines
farblosen Feststoffes erhalten.
Variation nach[44,45]:
Zu einer Suspension aus 1.00 g (4.10 mmol) Biotin und 522 mg (4.5 mmol) NHS in
20 ml DMF werden 843 mg (4.10) DCC hinzugegeben und 22 h bei RT gerührt.
Anschließend wird dem Reaktionsgemisch eine Suspension aus 591 mg (4.5 mmol) 6-
Aminohexansäure und 0.77 ml (4.5 mmol) DIPEA in 20 ml zugesetzt und weitere 3 h
bei RT gerührt. Die Reaktionslösung wird durch Celite filtriert, der Filterrückstand
mit wenig DMF gespült. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck vom
Lösungsmittel befreit und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum getrocknet. Der
farblose Feststoff wird durch Säulenchromatographie an Silicagel mit
Dichlormethan/Methanol (Gradient von 8/2 bis 7/3, v/v) gereinigt. Als Produkt
wurden 300 mg (0.84 mmol, 20%) eines farblosen Feststoffes erhalten.
appear here. 47
Rf-Wert (SiO2, Färbereagenz1): 0.11 (CH2Cl2/MeOH 8.5:1.5 v/v)
1
H-NMR (300 MHz, DMSO):
H[ppm] = 7.70 (t, 3JHH= 5.46, 1H, Amid-NH), 6.39 (s, 1H, Biotin-NH), 6.33 (s, 1H,
Biotin-NH), 4.30 (m, 1H, 3a-H), 4.13 (m, 1H, 6a-H), 3.10 (ddd, 3JHH=8.4, 3JHH=6.2,
3
JHH=4.4, 1H, 4-H), 3.00 (dt, 3JHH=6.83, 3JHH=5.7, 2H, 6´-H), 2.82 (dd, 3JHH=5.09,
2
JHH=12.43, 1H, 6-Hx), 2.55 (d, 2JHH=12.43, 1H, 6-Hy), 2.17 (t, 3JHH=7.44, 2H, 10´-
H), 2.00 (t, 3JHH=7.35, 1H, 4´-H), 1.20-1.60 (m, 14H, CH2).
13
C-NMR (75 MHz, DMSO):
C[ppm] = 175.1 (C-11´, COOH), 172.2 (C-5´, CONH), 163.1 (C-2, CO(NH)2), 61.5
(Biotin-CH), 59.6 (Biotin-CH), 55.8 (Biotin-CH), 40.2 (C-6´, CH2NH), 38.7 (C-6,
CH2S), 35.6 (C-10´, CH2), 34.3 (C-4´, CH2), 29.3 (CH2), 28.6 (CH2), 28.4 (CH2), 26.4
(CH2), 25.7 (CH2), 24.7 (CH2).
4.2.2 D-N-Biotinyl-6-aminohexansäure-(N-succinimidyl)-ester
O
1 3
HN 2 NH
6a 3a O
H H O
4 2´ 4´ H 7´ 9´ 11´
6 N N
S O
5 1´ 3´ 5´ 6´ 8´ 10´
O
O
Es werden 200 mg (0.56 mmol) N-Biotinyl-6-aminohexansäure, 66 mg (0.58 mmol)

NHS und 8 mg (0.06 mmol) DMAP in 20 ml DMF/DMSO (1:1, v/v) gelöst. Zu
diesem Reaktions-Gemisch wird bei RT unter Rühren eine Lösung von 128 mg (0.61
mmol) DCC in 5 ml DMF hinzugegeben und weitere 24 h bei RT gerührt. Die
Reaktionslösung wird anschließend durch Celite filtriert, der Filterrückstand mit
wenig DMF gewaschen und das Filtrat im Anschluss unter vermindertem Druck vom
Lösungsmittel befreit. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch an Silicagel
mit Dichlormethan/Methanol (9:1, v/v) gereinigt. Es werden 62 mg (24%) eines
gelben Feststoffs erhalten.
Rf-Wert (SiO2, Färbereagenz1): 0.47 (CH2Cl2/MeOH 8.5:1.5 v/v)

1
H[ppm] = 7.70 (t, 3JHH= 5.56, 1H, Amid-NH), 6.39 (s, 1H, Biotin-NH), 6.33 (s, 1H,
Biotin-NH), 4.30 (m, 1H, 3a-H), 4.13 (m, 1H, 6a-H), 3.10 (ddd, 3JHH=8.4, 3JHH=6.0,
3
JHH=4.5, 1H, 4-H), 3.00 (m, 2H, 6´-H), 2.82 (m, 5H, 6-Hx, NHS-CH2), 2.65 (t,
3
JHH=7.25, 2H, 10´-H), 2.59 (m, 1H, 6-Hy), 2.05 (t, 3JHH=7.35, 1H, 4´-H), 1.20-1.60
(m, 14H, CH2).
13
C[ppm] = 172.2 (C-11´, COOH), 170.6 (C-5´, CONH), 169.3 (NHS-C, CONH, 2C),
163.1 (C-2, CO(NH)2), 61.5 (Biotin-CH), 59.6 (Biotin-CH), 55.8 (Biotin-CH), 40.2
(C-6´, CH2NH), 38.5 (C-6, CH2S), 35.6 (C-4´, CH2), 30.6 (C-10´, CH2), 29.0 (CH2),
28.6 (CH2), 28.5 (CH2), 25.9 (NHS-CH2, 2C), 25.7 (CH2), 25.6 (CH2), 24.4 (CH2).
FAB-MS :
m/z = 455.1[M+H]+ (88%), 307.0 [2mNBA+H]+ (100%).
4.2.3 6-(D-N-Biotinylamino)-hexanoyl-L-methionin
M2
O
1 2
3
HN NH  
6a 3a
O  S
H H
4 2´ 4´ H 7´ 9´ 11´
6 N
N  COOH
S 5´
5 1´ 3´ 6´ 8´ 10´ H
O
M1
Variante 1 nach Zhang und Cech[17]:

Es werden 200 mg (0.56 mmol) N-Biotinyl-6-aminohexansäure, 66 mg (0.58 mmol)
NHS und 8 mg (0.06 mmol) DMAP in 10 ml DMF/DMSO (1:1, v/v) gelöst. Zu
diesem Reaktions-Gemisch wird bei RT unter Rühren eine Lösung von 128 mg (0.61
mmol) DCC in 2 ml DMF hinzugegeben und weitere 24 h bei RT gerührt. Die
Reaktionslösung wird anschließend durch Celite filtriert, der Filterrückstand mit
wenig DMF gewaschen und das Filtrat im Anschluss unter vermindertem Druck
appear here. 49
weitestgehend vom Lösungsmittel befreit. Ohne den intermediär entstandenen NHS-
Ester zu isolieren, wird der ölige Rückstand direkt in 25 ml DMF aufgenommen und
unter Rühren bei RT tropfenweise Triethylamin dazugegeben. Es wird weitere 48 h
bei RT gerührt und das Reaktionsgemisch im Anschluss filtriert, der Filterrückstand
verworfen und das Filtrat unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der
verbleibende Rückstand wird erneut in wenig DMF gelöst und über Nacht bei +4°C
gelagert. Die ausgefallenen nadelförmigen Kristalle werden verworfen und der klare
Überstand mit Aceton versetzt. Das Produkt fällt als farbloser Feststoff aus und wird
zur Aufreinigung noch zweimal in DMF gelöst und durch Zugabe von Aceton
ausgefällt. Es wurden 204 mg (75 %) eines weißen Feststoffs erhalten.
Variante 2 mit TSTU[47]:

250 mg (0.70 mmol) N-Biotinyl-6-aminohexansäure werden in 3 ml DMF/Dioxan
(1:1, v/v) suspendiert, mit 0.5 ml Wasser und 0.36 ml (2.1 mmol) DIPEA versetzt und
265 mg (0.88 mmol) TSTU hinzugegeben. Während dünnschichtchromatographischer
Reaktionskontrolle (SiO2, CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v) werden nach 25 min Rühren bei
RT 157.5 mg (1.05 mmol) Methionin zur Reaktionslösung gegeben und weitere 35
min bei RT unter Reaktionskontrolle gerührt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 35
ml Wasser gestoppt und das Reaktionsgemisch über Nacht lyophylisiert. Der
Rückstand wird in wenig DMF aufgenommen und das Produkt durch Zugabe von
Aceton ausgefällt. Die Suspension wird über Nacht bei 4° Grad aufbewahrt und der
Überstand anschließend abpipettiert. Der verbleibende Feststoff wurde im
Ölpumpenvakuum getrocknet. Es wurden 330 mg (0.676 mmol, 96%) eines beigen
Feststoffs erhalten.
Rf-Wert (SiO2, Färbereagenz1): 0.22 (CH2Cl2/MeOH 9:1 v/v)
IR[cm-1]: 3301.9 (s), 2929.0 (s), 2856.7 (m), 1700.3 (s), 1644.1 (s), 1542.7 (s), 1426.5
(m), 1213.7 (m), 1072.8 (s), 823.7 (w), 654.1 (w)
1
H[ppm] = 8.02 (d, 3JHH= 7.83, 1H, Methionin-NH), 7.69 (t, 3JHH= 5.49, 1H, Amid-
NH), 6.39 (s, 1H, Biotin-NH), 6.33 (s, 1H, Biotin-NH), 4.30 (m, 2H, 3a-H, Methionin
-CH), 4.13 (m, 1H, 6a-H), 3.10 (ddd, 3JHH=8.53, 3JHH=5.87, 3JHH=4.75, 1H, 4-H),
3.00 (dt, 3JHH=7.04, 3JHH=5.60, 2H, 6´-H), 2.82 (dd, 3JHH=12.44, 3JHH=5.12, 1H), 2.56
(d, 3JHH=12.13, 1H), 2.10 (dt, 3JHH=7.61, 3JHH=1.73, 2H), 2.03 (s, 3H, CH3), 1.80-2.00
(br, 2H, CH2), 1.20-1.60 (m, 16H, CH2).
13
C[ppm] = 173.9 (Methionin C-1, COOH), 172.8 (C-11´, CONH), 172.2 (C-5´,
CONH), 163.1 (C-2, CO(NH)2), 61.5 (Biotin-CH), 59.6 (Biotin-CH), 55.8 (Biotin-
CH), 54.0 (Methionin -CH), 40.2 (C-6´, CH2NH), 38.7 (C-6, CH2S), 35.6 (C-4´,
CH2), 35.4 (C-10´, CH2), 31.1 (CH2), 30.2 (CH2), 29.4 (CH2), 28.6 (CH2), 28.5 (CH2),
26.5 (CH2), 25.7 (CH2), 25.6 (CH2), 15.0 (CH3, SCH3).
FAB-MS :
m/z = 489.1 [M+H]+ (96%), 347.3 [M1+H]+ (18%), 227.0 [Biotin-OH-]+ (24%), 307.0
[2mNBA+H]+ (100%).
4.2.4 3´(2´)-[6-(D-Biotinylamino)-hexanoyl-L-methionyl]-adenosin-
5´-monophospat
NH2
7
4
N 5 3
N
8
9 N 2
O 6 N
5´ 1
O HO P O
O
2´´´ 4´
1´´´ 3´´´ OH H H 1´
HN NH O H 3´ 2´ H
3a´´´ O OH
H H O
6a´´´
4´´´ 2´´ 4´´ H 7´´ 9´´ 11´´ 
6´´´ N 
S 6´´ 8´´
N
1´´ 3´´ 5´´ 10´´ H
5´´´
O  
S
200 mg (0.41 mmol) N-Biotinyl-6-aminohexansäure-L-methionin und 99.7 mg (0.62

mmol) 1,1´-Carbonyldiimidazol werden in 3 ml wasserfreiem DMF 15 min bei RT
gerührt und anschließend zu einer gerührten Lösung aus 494.7 mg (1.23 mmol)
appear here. 51
Adenosin-5´-monophosphatmononatriumdihydrat in 5 ml Formamid hinzugegeben.
Das Reaktionsgemisch wird weitere 26 h bei RT gerührt und dann mit 100 ml einer
Aceton/Diethylether Lösung (1:1, v/v) versetzt; dabei bildet sich ein flockiger weißer
Niederschlag der abzentrifugiert wird (2 x 4000 rpm, 3 min). Der Überstand wird
verworfen und der Rückstand mit 50 ml Diethylether gewaschen. Das Rohprodukt
wurde in Wasser aufgenommen und über eine MPLC säulenchromatographisch grob
gereinigt (RP 18, Gradient 100%A, 0%B  20%A, 80%B in 30 min; A: wässriger
TEAA-Puffer (100 mM), B: Acetonitril/w. TEAA-Puffer 1:1, v/v). Das erhaltene grob
gereinigte Produkt waren 140 mg (41 %) eines Isomerengemisches (70% 3´und 30%
2´- Isomer). Zur Abtrennung noch der kleinsten Spuren des unerwünschten
gemischten 5´-Phosphoesteranhydrid-Regioisomers wurde das Produkt durch
präparative HPLC aufgereinigt. Es sind 90 mg (27%) hochreines Produkt isoliert
worden.
Präparative-HPLC (Säule 250 x 4 mm, Säulenmaterial Nucleosil RP-18 100-5,

Mobile Phasen: A = 100 mM TEAA-Puffer, B =Acetonitril)
Elutions-Gradient:
Zeit [min] %A %B
00 5 95
05 35 65
25 40 60
35 45 55
40 95 5
(Flussgeschwindigkeit 4 ml/min, Probenvolumen 1.5 ml, Probenkonzentration 15

mg/ml)
Retentionszeit des Produkts tR = 13 min
Rf-Wert (SiO2, Färbereagenz2): 0.50 (nBuOH/HAc/H2O 5:2:3, v/v).
IR[cm-1]: 3312.9 (s), 2931.8 (s), 1744.3 (w), 1646.4 (s), 1546.7 (m), 1474.0 (m),
1331.8 (w), 1170.4 (m), 1070.2 (m), 916.2 (w), 798.5 (w), 723.1 (w), 650.6 (w).
UV: 260 nm.

1
H-NMR (500 MHz, D2O):
H[ppm] = 8.45-8.57 (br, 2H, 8-H(2´/3´-Isomer)), 8.20 (br, 2H, 2-H(2´/3´-Isomer)),
6.28 (m, 1H, 1´-H (2´-Isomer)), 6.11 (m, 1H, 1´-H (3´-Isomer)), 5.57 (m, 1H, 2´-
H(2´-Isomer)), 5.53 (m, 1H, 3´-H(3´-Isomer)), 4.99 (m, 1H, 2´-H (3´-Isomer)), 4.72
(m,) 4.54-4.60 (m, 2H, 3a-H, Methionin -CH), 4.33 (m, 1H, 6a-H), 4.12 (br, 2H),
3.12 (m, 2H), 2.90 (m, 1H), 2.70 (m, 2H), 2.33 (m, 1H), 2.30 (m, 1H), 2.16 (m, 4H),
2.09 (m, 5H), 1.40-1.70 (m, 12H), 1.30 (m, 4H).
13
C-NMR (125 MHz, D2O):
C[ppm] = 175.5 (CONH), 174.9 (CONH), 171.6 (CONH), 171.4 (CO(NH)2), 156.3
(Purin-C), 153.0 (Purin-CH), 150.5 (Purin-CH), 140.0 (Purin-C), 119.0 (Purin-C),
86.9 (Ribose-CH), 83.0 (Ribose-CH), 75.4 (Ribose-CH) ), 73.9 (Ribose-CH), 64..9
(Ribose-CH2), 62.49 (CH), 60.6 (CH), 56.0 (CH), 52.0 (CH), 40.1 (CH2), 39.2 (CH2),
35.8 (CH2), 35.6 (CH2), 31.1 (CH2), 30.1 (CH2), 29.1 (CH2), 28.7 (CH2), 28.5 (CH2),
26.5 (CH2), 25.9 (CH2), 25.5(CH2), 14.2(CH3).
31
P-NMR (125 MHz, MeOD):
P[ppm] = 0.32 (-OPO3-C5).
FAB-MS :
m/z = 818.3 [M+H]+ (45%), 347.3 [AMP]+ (18%), 227.0 [Biotin-OH-]+ (24%), 307.0
[2mNBA+H]+ (100%).
4.2.5 N-(Trifluoracetyl)-phenylalanin
O
F3C
1
HN COOH
2
4 3
7 5
6
appear here. 53
1.66 g (10.0 mmol) Phenylalanin werden bei RT unter Rühren in 8 ml
Trifluoressigsäure gelöst und das Reaktionsgemisch dann auf –20°C abgekühlt.
Innerhalb eines Zeitraums von 25-30 min werden 7 ml Trifluoressigsäureanhydrid der
Reaktionslösung zugetropft und dabei eine leichte Erwärmung der Lösung bis auf –5
°C gestattet. Es wird anschließend noch eine weitere Stunde bei RT gerührt und das
Reaktionsgemisch dann unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Es
werden 2.5 g (95%) eines farblosen Feststoffs erhalten.
Rf-Wert (SiO2, UV): 0.56 (CH2Cl2/MeOH 6.5:3.5, v/v).
IR[cm-1]: 3307.8 (s), 3099.5 (w), 1843.1 (m), 1705.6 (s), 1557.6 (s), 1497.6 (w),
1183.4 (s), 1082.5 (m), 914.8 (w), 866.6 (w), 808.3 (w), 754.1 (m), 727.0 (w), 701.1
(m).
1
H-NMR (400 MHz, MeOD):
H[ppm] = 7.28 (m, 2H, Ar-H), 7.23 (m, 3H, Ar-H), 4.61 (dt, 3JHH= 10.17, 3JHH= 4.88,
1H, -CH), 3.31 (m, 1H, Ar-CH´´H´), 3.03 (m, 1H, Ar-CH´H´´), 1.38 (s, 9H, CH3).
13
C-NMR (101 MHz, MeOD):
C[ppm] = 173.1 (C-1, COOH), 158.7 (q, 2JCF= 37.35, TFA-CO), 138.1 (Ar, Cq),
130.1 (Ar, CH, 2C), 129.5 (Ar, CH, 2C), 127.9 (Ar, CH), 118.0 (q, 3JCF= 286.60,
CF3), 55.4 (-CHNH), 37.7 (C-3, Ar-CH2).
FAB-MS :
m/z = 262.1 [M+H]+ (19%), 216.0 [M-COOH]+ (39%), 165.0 [M-TFA]+ (36%), 307.0
[2mNBA+H]+ (100%).
.
4.2.6 4-Ethyl-3-nitrobenzoesäuremethylester
O
6
1
5 O
4
1´ 2
3
NO2
2´
Eine Lösung aus 10 ml wässriger Salpetersäure (65%) und 12 ml Schwefelsäure

(96%) werden auf 5°C gekühlt und anschließend tropfenweise 16.4 g (0.1 mol) p-
Ethyl-benzoesäuremethylester so langsam hinzugegeben, dass sich das
Reaktionsgemisch nicht über 10°C erwärmt. Es wird noch weitere 3 h bei RT
weitergerührt und dann das Reaktionsgemisch in 250 ml Eiswasser gegossen. Das
Produkt wird 2 mal mit 100 ml Diethylether extrahiert, die organischen Phasen dann
einmal mit 100 ml 5% wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und einmal mit
100 ml Wasser gewaschen. Zur besseren Phasentrennung werden dabei jeweils etwas
gesättigte Natriumchlorid-Lösung den Phasengemischen zugesetzt. Die gesammelten
organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel
unter vermindertem Druck entfernt und das Rohprodukt durch Säulenchromatographie
an Silicagel mit Cyclohexan/Diethylether (10:1, v/v) gereinigt. Als Produkt werden
11.0 g (55%) fahl-grüne Kristalle erhalten.
Rf-Wert (SiO2, Färbereagenz1 u. UV): 0.28 (cHex/EE 9:1, v/v).
IR[cm-1]: 2951.8 (m), 1729.4 (s), 1618.3 (m), 1534.5 (s), 1437.8 (m), 1355.1 (m),
1294.5 (s), 1192.6 (m), 1128.6 (m), 976.1 (w), 853.0 (w), 819.9 (w), 760.0 (m) ),
714.3 (w), 673.6 (w).
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3):
H[ppm] = 8.49 (d, 4JHH= 1.64, 1H, H-2), 8.16 (dd, 3JHH= 8.08, 4JHH= 1.77, 1H, H-6),
7.45 (d, 3JHH= 8.08, 1H, H-5 ), 3.95 (s, 3H, O-CH3), 2.95 (q, 3JHH= 7.50, 2H, Ethyl-
CH2), 1.30 (t, 3JHH= 7.50, 3H, Ethyl-CH3).
13
C-NMR (101 MHz, CDCl3):
C[ppm] = 165.2 (-COO-), 149.5 (C-3, CNO2(arom.)), 143.8 (C-4, Cq(arom.)), 133.5
(CH(arom.)), 131.5 (CH(arom.)), 129.5 (C-1, Cq), 125.7 (CH(arom)), 52.7 (Methoxy-
C, OCH3), 26.4 (Ethyl-C, CH2), 14.8 (Ethyl-C, CH3).
FAB-MS :
m/z = 210.1 [M+H]+ (100%), 178.1 [M-OCH3]+ (89%).
appear here. 55
4.2.7 4-(1-Bromethyl)-3-nitrobenzoesäuremethylester
O
6
1
5 O
4
Br 1´ 2
3
NO2
2´
2.0 g (9.56 mmol) 4-Ethyl-3-nitrobenzoesäuremethylester, 2.0 g (11.46 mmol) NBS

und 34 mg (0.15 mmol) Dibenzoylperoxid werden 2 h lichtgeschützt unter Rückfluss
in 12 ml Tetrachlormethan erhitzt (85°C Badtemperatur). Nachdem die
Reaktionslösung auf RT abgekühlt ist, wird das überschüssige unlösliche NBS durch
Celite abfiltriert und der Rückstand mit wenig Tetrachlormethan gespült. Das Filtrat
wird unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit und das ölige Rohprodukt
säulenchromatographisch an Silicagel mit Cyclohexan/Ethylacetat (9.5:0.5, v/v)
gereinigt. Es wurden 2.26 g (82%) grünlich-gelbe Kristalle als Produkt erhalten.
Rf-Wert (SiO2, Färbereagenz1 u. UV): 0.17 (cHex/EE 9:1, v/v).
IR[cm-1]: 2956.6 (m), 1730.0 (s), 1619.8 (m), 1534.4 (s), 1434.0 (m), 1350.6 (s),
1294.5 (s), 1292.2 (s), 1262.2 (s), 1200.9 (m), 1127.1 (m), 980.5 (m), 853.9 (w), 822.0
(m), 759.3 (m), 712.0 (w), 679.8 (m).
1
H-NMR (300 MHz, CDCl3):
H[ppm] = 8.45 (d, 3JHH= 1.70, 1H, 2-H(arom.)), 8.24 (dd, 3JHH= 8.29, 4JHH= 1.88, 1H,
6-H(arom.)), 7.95 (d, 3JHH= 8.29, 1H, 5-H(arom.)), 5.78 (q, 3JHH= 6.78, 1H, Ethyl-
CH-Br), 3.98 (s, 3H, O-CH3), 2.07 (d, 3JHH= 6.78, 3H, Ethyl-CH3).
13
C-NMR (75 MHz, CDCl3):
C[ppm] = 164.5 (COOMe), 147.5 (C-3, CNO2(arom.)), 141.9 (C-4, Cq(arom.)), 133.7
(CH(arom.)), 131.0 (Cq(arom.)), 130.3 (CH(arom.)), 125.5 (CH(arom.)), 52.8
(Methoxy-C, OCH3), 40.8 (C-1´,-CH-Br ), 26.8 (C-2´, CH3).
EI-MS:
appear here. 57
m/z = 255.9 [M-OCH3]+ (4%), 208.0 [M-HBr]+ (100%).
5 Zusammenfassung
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer Selektionsstrategie für die
Selektion von funktionalisierter DNA und natürlicher DNA mit der Fähigkeit zur
Katalyse von Peptidbindungen und das Voranbringen der chemisch-synthetischen
Vorarbeiten zur Darstellung der benötigten Substrate.
Nach der Ausarbeitung der Selektionsstrategie und dem Entwurf der dafür benötigten
Substrate ist mit der gelungenen Synthese des Formylmethionin-tRNA Analoga 8a
und 8b und der erfolgreichen Abtrennung auch kleinster Verunreinigungen, ein
benötigter Reaktionspartner für das angestrebte Selektionsexperiment erhalten
worden. Die entscheidenden Bindungsknüpfungen konnten sowohl über eine
konventionelle Syntheseroute, als auch über eine alternative Kupplungs-Methode, mit
einem für diese Verbindungen neu erprobten Kupplungsreagenz realisiert werden.
Dabei hat sich gezeigt, dass das Kupplungsreagenz N,N,N´,N´-Tetramethyl-
(succinimido)-uronium tetrafluoroborat (TSTU) hinsichtlich der erforderlichen
Reaktionsbedingungen für die Umsetzung vorteilhafter ist. Es muss nicht, wie
ansonsten bei vergleichbaren Amidbindungsknüpfungen, unter wasserfreien
Bedingungen gearbeitet werden. Außerdem ist die Reaktionsdauer mit Zeiten in der
Größenordnung von Minuten bis zu einer Stunde bei weitem günstiger, als der
Zeitraum von Tagen, der bei den Standardmethoden erforderlich ist. Die Ausbeuten
sind beim Einsatz des Uroniumsalzes sehr gut und übertreffen die in der Literatur
angegebenen Ausbeuten für die konventionellen Methoden.[17,44] Während die sehr
guten Ausbeuten der Methode mit dem Uroniumsalz nach W. Bannwarth der Literatur
entsprachen waren die praktisch erzielten Ausbeuten nach der konventionellen
Methode sogar deutlich schlechter als sie in der Literatur dokumentiert werden, was
den Unterschied in der Effizienz der beiden Methoden noch verstärkte.[47]
Da die Reinheit des in die Selektion einzusetzenden Substrates von entscheidender
Bedeutung ist, wurde mit der Etablierung geeigneter Methoden zur Aufreinigung des
Produktes eine entscheidende Bedingung für die erfolgreiche Durchführung der
Selektionsexperimente erfüllt. Die damit gewonnen Erkenntnisse über die Labilität
des Substrates in den beiden Lösungsmitteln Methanol und Wasser erwiesen sich als
wichtig für die Handhabung des Substrates während der Aufreinigung und der
Handhabung bei den Selektionsexperimenten.
Für die zweite Komponente des Selektionsexperiments – dem substrat-modifizierten
Phosphoramidit zur Erstellung des substrat-modifizierten Primers – wurde mit dem
geschützten Phenylalanin 38 der erste Baustein synthetisiert. Der zweite Baustein ist
der Photocleaver, der über einen TEG-Linker das TFA-geschützte Phenylalanin mit
dem Phosphoramidit bzw. später - nach Erstellung der Oligonukleotid-Bibliothek am
DNA-Synthesizer – mit der (f)DNA verbindet. Mit der erfolgreichen Synthese des
bromierten und Methylester-geschützten Photocleavers 42 im größeren Maßstab, steht
ausreichend Substanz zur Verfügung weitere Versuche zur Knüpfung einer
Etherbindung zwischen TEG-Linker und Photocleaver durchzuführen. Eine geeignete
Methode zur Verknüpfung des Photocleavers an den TEG Linker wurde noch nicht
etabliert. Die naheliegendste Methode, durch die Wahl geeigneter Basen den TEG-
Linker in das entsprechende Alkoholat umzuwandeln um dann eine nucleophile
Substitution (SN-Reaktion) am sekundären Bromid des Photocleavers durchzuführen
gelang bisher nicht. Eine alternative Synthese-Route, die vorsieht den Photocleaver als
nucleophiles Agens an einen TEG-Linker mit geeigneter Abgangsgruppe wie z.B. das
p-Toluolsulfonat in einer SN-Reaktion anzubringen (Kapitel 3.2.8), scheiterte bisher
an der Darstellung des entsprechenden Photocleaver-Nucleophils. Versuche zur
Hydrolyse des Photocleaver-Bromids 42 zum Alkohol waren bisher nicht erfolgreich,
werden aber mit veränderten Reaktionsbedingungen und stärkeren Basen fortgesetzt.
Im Anschluss an die Fertigstellung des über den Photocleaver verknüpften Substrates
wird dieses, nach der Überführung in ein Phosphoramidit, im DNA-
Festphasensynthese-Apparat im letzten Schritt der Primer Synthese an den Primer
gebunden, von dem ausgehend die (f)DNA-Bibliothek erzeugt wird. Danach kann mit
den Selektionsexperimenten begonnen werden.
appear here. 59
6 Abkürzungsverzeichnis
AMP Adenosin-5´-monophosphat
AMP-Met-Bio 3´(2´)-N-[6-(Biotinylamino)-hexanoyl-L-methionyl-adenosin-5´-
monophosphat
Ar Aromat
Arom. Aromatisch
ATP Adenosin-5´-triophosphat
Boc tert Butyloxycarbonyl
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
ca. Zirka
CDI 1, 1´-Carbonyldiimidazol
Chex Cyclohexan
DA 2´-Desoxyadenosin
DC Desoxycytidin
DC Dünnschichtchromatographie
DCC N,N´-Dicyclohexylcarbodiimid
DCU Dicyclohexylharnstoff
dG Desoxyguanosin
DNA Deoxynucleicacid (Desoxynukleinsäure)
dNTP Desoxynukleosidtriphosphat
DIPEA Diisopropylethylendiamin
DMF N,N-Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
DTT Dithiothreitol
DU Desoxyuridin
dUTP Desoxyuridintriphosphat
E. coli Eschericha Coli
EDC N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid
EDU N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)-harnstoff
EE Essigester (Ethylacetat)
EI Elektronenstoß-Ionisation
FAB Fast Atom Bombardment
fDNA Funktionalisierte DNA
fMet Formyl-Methionin
GMP Guanosinmonophosphat
GMPS Guanosin-5´-monophosphorothioat
H Stunden
HAc Essigsäure
IR Infrarot
Ipr iso Propyl
KD Kilo Dalton
konz. Konzentriert
Lit. Literatur
M Molar
Met Methionin
min Minuten
mmol Millimol
mNBA meta Nitrobenzylalkohol
mod. Modifiziert
MS Massenspektrometrie
nBuOH n-Butanol
NBS N-Bromsuccinimid
NHS N-Hydroxiuccinimid
NMR Nuclear Magnetic Resonance
PCR Polymerase chainreaction (Polymerase-Kettenreaktion)
PEG Polyethylenglykol
Phe Phenylalanin
Rf R(elate to) f(ront)-Wert
RNA Ribonucleicacid (Ribonukleinsäure)
rpm rounds per minute
RP-HPLC Reverse phase high performance liquid chromatography
RT Raumtemperatur
appear here. 61
RP-MPLC Reverse phase medium preassure liquid chromatography

Reverse transcription polymerase chainreaction ( Reverse
RT-PCR Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion)
TEAA Triethylamoniumacetat
TEG Tetraethylenglykol
TFA Trifluoressigsäure
TFAA Trifluoressigsäureanhydrid
tR Retentionszeit
tRNA Transfer-RNA
TSTU N,N,N´,N´-Tetramethyl-(succinimido)-uronium tetrafluoroborat
SELEX Systematic evolution of ligands by exponential enrichment
UTP Uridintriphosphat
UV Ultraviolett
w. Wässrig
z. B. Zum Beispiel
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56) Fittig, W. R.; Binder, B. N.; Justus Liebigs Ann. Chem. 1879, 195, 138-143.
appear here. 65
Danksagungen
Ich danke
Herrn Prof. Dr. Michael Famulok, Kekulé-Institut für Organische Chemie und Biochemie der
Universität Bonn, für die interessante Themenstellung und die engagierte Betreuung dieser
Diplomarbeit,
Herrn Prof. Dr. Dr. h. c. Heinrich Wamhoff, Kekulé-Institut für Organische Chemie und
Biochemie der Universität Bonn, für die freundliche Übernahme des Korreferats.
Den Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der Zentralanalytik möchte ich für die Aufnahme der
NMR- und Massenspektren danken. Außerdem danke ich Frau Dahmen für die Aufnahme der
IR-Spektren.
Ich danke allen Mitgliedern der Arbeitsgruppen Famulok und Marx für die freundschaftliche
Aufnahme und für die sehr angenehme und unterhaltsame Arbeitsatmosphäre.
Oliver Thum danke ich für die freundliche Einführung in den Arbeitskreis und seine
vielseitige Unterstützung und wertvollen Ratschläge.
Dr. Andreas Marx danke ich für seinen kompetenten Rat und seine Gesprächsbereitschaft.
Stefan Jäger verdient Dank für die vielen Anregungen und Hilfestellungen in der
synthetischen Arbeit, die Einweisung in die Geräte und Arbeitsmethoden des Syntheselabors
(auch an Wochenenden) sowie seine große Geduld und das Betreiben des Mensa-Taxis.
Alexander Eisenführ möchte ich für das zur Verfügung stellen seines von ihm synthetisierten
Photocleavers danken, sowie für all die hilfreichen Tips und Tricks betreffend der Synthese-
Probleme von biotinylierten Linkern und Photocleavern.
Für das Korrekturlesen dieser Arbeit bedanke ich mich bei Dr. Andreas Marx, Oliver Thum
und Alexander Eisenführ. Ein Dankeschön für die Hilfe bei der Formatierung und anderen
Microsoft-Fairnissen gebühren Michael Strerath und Nikolai Raffler.
Der größte Dank gilt meiner Mutter für ihre Liebe und aufopferungsvolle Unterstützung
während meines Studiums und weit darüber hinaus.
Danksagung
Hiermit versichere ich an Eides Statt,
die vorliegende Arbeit selbst verfaßt
und keine weiteren als die angegebenen
Quellen und Hilfsmittel verwendet zu haben.
(Goran Rasched)
Bonn, Juni 2002

2002-06-11 DiplomArbeit Goran

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Synthese von Substraten für die Selektion

funktionalisierter DNA mit der Fähigkeit zur Katalyse

Bonn, Juni 2002

Angefertigt mit Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

Referent: Prof. Dr. Michael Famulok

1 ALLGEMEINER TEIL ..................................................................... 1

4.2.2 D-N-Biotinyl-6-aminohexansäure-(N-succinimidyl)-ester .......... 47

4.2.6 4-Ethyl-3-nitrobenzoesäuremethylester .................................... 53

Das ursprünglich stark eingeschränkte Bild, dass Nukleinsäuren ausschließlich als

katalytisch aktiven Komponente des Ribosoms um dessen RNA-Anteil handelt.[6,7]

1.2 Prinzipien der in vitro-Selektion von Nukleinsäuren

Modifikation mit Substrat A

Nukleinsäure—AB—Anker und Nukleinsäure—A

PCR-Amplifikation Selektierte Nukleinsäuren

Abbildung 1: Schema der SELEX-Methode.

Auf diese Weise können komplexe Nukleinsäurebibliotheken in der Größenordnung

1.3 Katalytisch aktive Nukleinsäuren

Mittlerweile konnte mit der oben beschriebenen Selektionsmethode das Repertoire an

als Substrat auf einen Aminoacylakzeptor zu übertragen. Ein weiteres neueres

1.4 Funktionalisierte DNA

Die beobachtete Notwendigkeit der Anwesenheit von Cofaktoren bei katalytisch

Abbildung 2: Modifizierte UTP-Nukleotide von Eaton et al..

Beispiele für funktionalisierte RNA lieferten B. E. Eaton und Mitarbeiter, denen es

in der enzymatischen RNA-Synthese durch Verwendung des Uridin-5´-

Abbildung 3: Basen-modifizierte Nukleotide von Dai et al. sowie Teramoto et al..

Abbildung 4: Modifizierte dUTP-Derivate von Latham et al. und Benner et al..

mod. dG mod. dA mod. dC mod. dU

Die Auswahl der an die Nukleotide angebrachten funktionellen Gruppen in Abbildung

2.1 Katalytisch wirksame Nukleinsäuren zur Knüpfung von

Das Bestreben, Nukleinsäuren zu selektieren, die in der Lage sind, Peptidbindungen

im Ribosom in Analogie zu Lit.[16,17].

Affinitätschromatographie immobilisiert und nach Anwendung diverser Wasch-

3 Durchführung und Ergebnisse

3.1 Entwicklung der Selektionsstrategie

Guanosin-5´-monophosphorothioat (GMPS), kann mit R-modifiziertes Phosphoramidit zur Synthese von

Da jedoch die Prozesse der DNA- und fDNA-Selektion in entscheidenden Schritten

(Abbildung 10). Auf diese Weise sollten störende Nebenreaktionen vermieden

Reaktives arom. Nitroso-Aldehyd Vergleichweise unreaktives arom. Nitroso-Keton

Damit stand eine substrattragende Komponente als Syntheseziel fest. Die

Abbildung 12: Verknüpfung des Aminosäuresubtrates mit dem Photocleaver in umgedrehter

Abbildung 13: Design des mit der (f)DNA verknüpften Aminosäuresubstrates A.

Peptidbindungsknüpfung durch ein fDNAzym:

fDNA NO2 O (f)DNA NO2 O

Peptidbindungsknüpfung durch das Ribosom:

P-Stelle A-Stelle P-Stelle A-Stelle

im Ribosom in Analogie zu Lit.[16,17]

3.2 Retrosynthetische Planung

Aus den oben vorgestellten Vorgaben für das geplante Selektionsexperiment

3.3.1 Synthesen von D-N-Biotinyl-6-aminohexansäure

3.3.1.1 Variante 1 nach Standard-Methode[44,45]

Abbildung 16:Synthese der D-N-Biotinyl-6-aminohexansäure nach konventioneller Methode.

nucleophile Stickstoffbase zugesetzt.[45] Dies führte zu einer Ausbeute von 20 % der

Abbildung 17: Die Carbodiimid Aktivierungsreagenzien EDC und DCC.

3.3.1.2 Variante 2 mit TSTU[47]

N,N,N´,N´-Tetramethyl-(succinimido)- uronium tetrafluoroborat

Abbildung 18: Synthese der D-N-Biotinyl-6-aminohexansäure mit dem Uroniumsalz TSTU.

In der alternativen Syntheseroute wird ein Uroniumsalz als Aktivierungsreagenz

N,N,N´,N´-Tetramethyl-(succinimido)- uronium tetrafluoroborat

Abbildung 20: Darstellung des D-N-Biotinyl-6-aminohexansäure-(N-succinimidyl)-esters.

3.3.3.1 Variante 1 nach Zhang und Cech[17]

Wie in Kapitel 3.3.2 beschrieben, wurde zur Synthese von N-Biotinyl-6-amino-

3.3.3.2 Variante 2 mit TSTU[47]

Aufgrund der Ähnlichkeit der vorliegenden Reaktion zu der Amidbindungsknüpfung