01 Einfuehrung Begriffe v02 PDF

Fakultät für Chemie und Mineralogie
Institut für Bioanalytische Chemie
Vorlesung Bioanalytische Chemie

Molekularbiologische Methoden zur rekombinanten Proteinexpression
Einführung - Aufbau der Bakterien
Prof. Dr. Norbert Sträter
Bioanalytische Chemie
 Molekularbiologie/Gentechnik (N.S.)
Genklonierung und molekularbiologische Methoden
Mikrobiologische Methoden
Aufreinigung von DNA und RNA
Nukleinsäureanalytik: UV, Gelelektrophorese, Sequenzierung
Klonierung und Expression von Genen
Plasmide
Expressionssysteme
Restriktionsenzyme
Ligation
 Molekularbiologie/Gentechnik
Transformation
Zellanzucht und Zellaufschluss
Amplifikation und Mutagenese von DNA (PCR)
Primerdesign
PCR-Reaktion
ortspezifische Mutagenese
Struktur und Funktion von DNA-Polymerasen
Struktur und Funktion von Restriktionsendonukleasen
Proteinsezernierung ins Periplasma
Expression und Solubilisierung von Membranproteinen
 Molekularbiologie/Gentechnik
zellfreie Expression
Renaturierung von Proteinen
Proteinfaltung und Chaperone
Probleme bakterieller Expression eukaryontischer Proteine
Expression und Aufreinigung von Proteinen: Fallbeispiele und
die Anwendung der bioanalytischen Methoden
Lagerung von Proteinen
Zellkultur zur Proteinexpression in eukaryontischen Systemen:

HEK-Zellen und das Baculovirus-Insektenzellen-System
 Proteinanalytik (Teil Professor Hoffmann)
Fällung von Proteinen, Zentrifugation
Dialyse, Ultrafiltration, Lyophilisierung
Chromatographische Methoden:
 Gelfiltration
 Ionenaustauschchromatographie
 hydrophobe Interaktionschromatographie
 Affinitätschromatographie
Konzentrationsbestimmung
SDS-PAGE
Isoelektrische Fokussierung
Nativelektrophorese
 Proteinanalytik
Western Blot
Immunologische Methoden
MS
UV-Spektroskopie von Proteinen
Posttranslationale Modifizierungen: Synthese, Funktion
und Analytik
 Literatur Molekularbiologie
Annette Reineke: Gentechnik(UTB) 19.90 EUR
Brown: Gentechnologie für Einsteiger 34.95 EUR
Clark: Molecular Biology (m. Übersetzungshilfen) 69.70 EUR
Wikipedia (deutsch und englisch)
https://www.utb-studi-e-book.de/molekularbiologische-methoden-2-0.html
Ziel der Vorlesung/Konzept

Vermittlung der wichtigsten biochemischen und bioanalytischen Methoden für die
Überexpression von Proteinen in E. coli und in Zellkultur (Molekularbiogische
Methoden) sowie die Aufreinigung und Charakterisierung von Proteinen
(Proteinanalytik).
Die chemischen/biochemischen Hintergründe der Methoden sollen vermittelt

werden, so dass ein Verständnis der molekularen Grundlagen der typischen
molekularbiologischen Protokolle erlangt wird.
Die biologische Herkunft und die Funktionsweise der Enzyme soll vermittelt
werden.
Warum Molekularbiologie/Gentechnik in
einem Modul Bioanalytische Chemie?
• Voraussetzung für die Charakterisierung eines Proteins mit
zahlreichen bioanalytischen Methoden ist die Verfügbarkeit
ausreichender Mengen (oft Milligramm) von hochreinem Protein
• Beispiele: insbesondere Strukturanalytik (Kristallographie, NMR,
Elektronenmikroskopie), aber auch Bindungsstudien oder
Enzymassays.
• Voraussetzung sowohl für die Menge (Überexpression), Qualität (Art
des Expressionssystems - bakteriell oder eukaryotische Zellkultur) als
auch Reinheit (gentechnisch fusionierte Peptidtags) sind
gentechnische Methoden.
Bakterienkolonien. Jede Kolonie ist ein Klon.
Klon
Der Begriff Klon wird in zwei unterschiedlichen Bedeutungen verwendet:
1. Identische Kopien von (ganzen) Lebewesen

Genetisch (in ihrem Erbgut) weitgehend identische (erbgleiche) Lebewesen, die durch asexuelle
(also nicht geschlechtliche bzw. ungeschlechtliche) Fortpflanzung entstanden sind und von einem
Individuum abstammen.
Ein geklontes Tier ist, vereinfacht dargestellt, im Grunde nichts anderes als ein eineiiger Zwilling,
der mit einer gewissen Verspätung ins Leben tritt.
Auch: eine Bakterienkolonie als Klon.
2. Identische Kopien eines beliebigen Abschnitts der DNA

Einzelne Bruchstücke oder auch vollständige Gene werden mit Hilfe rekombinanter DNA-Technologie
identisch vervielfältigt (Klonierung). Wird ein bestimmtes, vollständiges Gen kloniert, bezeichnet
man dies als Genklonierung.
abgeändert nach: http://www.biologie-lexikon.de/lexikon/klon.php

Klonierung vs. Klonen
Ziel einer Klonierung ist, ein DNA-Fragment zu vermehren, seine Eigenschaften zu untersuchen oder
auch daraus ein Protein rekombinant zu exprimieren (beispielsweise bei einer Proteinüberexpression).
Klonen ist dagegen das Duplizieren der genetischen Information eines kompletten (höheren)
Organismus.
Das Schaf Dolly (* 5.

Juli 1996; † 14. Februar
2003) war ein
walisisches Bergschaf
und das erste aus einer
ausdifferenzierten
somatischen Zelle
geklonte Säugetier.
Klonierung
Als Klonierung (oder Klonieren, engl. molecular cloning, von „Klon“) bezeichnet man den Prozess
zur Herstellung eines Klons. Der Begriff wird meistens auf die DNA angewendet, z.B. „Das Gen für
den YXZ-Rezeptor wurde kloniert“. Wichtig dafür sind die Methoden zur Gewinnung und identischen
Vervielfältigung von Desoxyribonukleinsäure (DNA).
Dabei wird ein beliebiges DNA-Fragment (z. B. ein Gen) in einen Vektor („Genfähre“, z. B. ein
Plasmid) integriert. Diese rekombinante DNA wird anschließend in eine Wirtszelle (z. B. das
Bakterium Escherichia coli) eingebracht. Die Bakterienzellen vermehren sich durch Zellteilung. Das
Resultat ist eine Population von Zellen, die alle einen Klon des originalen DNA-Fragments enthalten .
Als Gen wird meist ein Abschnitt auf der DNA bezeichnet, der Grundinformationen für die Entwicklung
Gen von Eigenschaften eines Individuums und zur Herstellung einer biologisch aktiven RNA enthält.
https://www.khanacademy.org
neu besprechen
Rekombinante DNA
Als rekombinante DNA wird ein artifizielles DNA-Molekül bezeichnet, welches in vitro, mittels
gentechnischer Methoden (z.B. Restriktion und Ligation), neu zusammengesetzt wurde. Die DNA kann dabei
aus verschiedenen Organismen stammen oder in vitro synthetisiert worden sein (Oligonukleotidsynthese oder
Polymerasekettenreaktion (PCR)).
Ein Beispiel für rekombinante DNA sind Plasmide, die zunächst aus Bakterienzellen isoliert werden und in die
man dann DNA aus fremden Organismen einbaut.
Rekombinante DNA wurde erstmals 1973 von den US-Amerikanern Herbert W. Boyer und Stanley N. Cohen
erzeugt.
Übersicht Klonierungsschritte
Klonierung Transformation Selektion über
Antibiotikaresistenz
Vektor- DNA
konstruct
PCR-Amplifikation
Restriktions Restriktionsverdau
-verdau
Ligation
E. coli Expressionsstamm
Plasmid
Übersicht
Klonierungsschritte
AUFBAU VON
BAKTERIEN
Bezeichnung von Bakterien
Die Bakterien (Bacteria) (Singular das Bakterium, veraltend auch die Bakterie; von altgriechisch
βακτήριον baktērion ‚Stäbchen‘, ugs. auch Bazille) bilden neben den Eukaryoten und Archaeen eine
der drei grundlegenden Domänen, in die alle Lebewesen eingeteilt werden.
Nomenklatur der Bakterien

• Der Name einer Spezies folgt der auf Carl von Linné zurückgehenden binären Nomenklatur mit
einem Gattungsnamen und einem Artnamen (Epitheton)
• Gattungsnamen werden groß geschrieben und als lateinisches Substantiv behandelt
• Artnamen werden klein geschrieben und müssen als Adjektiv dem grammatischen Geschlecht
des Gattungsnamens folgen, beispielsweise Sporosarcina antarctica, da Sporosarcina feminin ist
und Micrococcus antarcticus, da Micrococcus maskulin ist.
• Die Bezeichnungen werden typischerweise kursiv geschrieben.
• Häufig werden Abkürzungen verwendet, wobei meist der Gattungsname abgekürzt wird:
Escherichia coli: E. coli
Aufbau von Bakterien (Prokaryoten)
Müller-Esterl, Biochemie, 3. Auflage

2.
Nun um zu lesen
äußere
20-80 nm Membran
< 10 nm
Gram-positive Bakterien Gram-negative Bakterien haben

lassen sich aufgrund der eine dünne Zellwand und
dicken Zellwand mit werden nicht angefärbt. Die rot-
Farbstoffen wie pinke Anfärbung der E. coli-
Kristallviolett anfärben Zellen links beruht auf der
Danish bacteriologist Hans Christian Gram Gegenfärbung mit Fuchsin
Aufbau der
Zellwand und
Zellmembranen
in gramnegativen
Bakterien
Periplasma
Aufbau der Zellmembran als Lipid-Doppelschicht von Phospholipiden
und Glycolipiden
Serin Ethanolamin Cholin Inosit

Inositol
+
Fettsäure
->
ein
Ceramid
Struktur des Peptidoglycans der Zellwand

Peptidoglycane bestehen aus Strängen der zwei β(1→4) glycosidisch miteinander
verknüpften Monosaccharide N-Acetylglucosamin und N-Acetylmuraminsäure, die als
lineare Kettenmoleküle das Rückgrat bilden.
β-1,4 β-1,4
N-Acetylmuraminsäure (auch N-Acetylglucosamin (auch

MurNAc oder NAM abgekürzt) GlcNAc oder NAG genannt)
Die parallel angeordneten Stränge sind quervernetzt. Diese Verbindung wird durch
eine Transpeptidase katalysiert, die auch als Penicillin-bindendes Protein (PBP)
bezeichnet wird und Angriffspunkt der Beta-Lactam-Antibiotika ist (später mehr).
Bei Escherichia coli und anderen gramnegativen Bakterien sind die beiden Tetrapeptide direkt verbunden.
Die Sequenzen der Tetrapeptide unterscheiden sich in verschiedenen Bakterien.
2,6-Diaminopimelinsäure (DAP)
Die Aminogruppe der Diaminopimelinsäure des einen Peptids

an die Carboxygruppe des terminalen D-Alanins des
benachbarten Peptids verknüpft.
Schematische Darstellung der Mureinschicht von gramnegativen

Bakterien am Beispiel von Escherichia coli
MurNAc = N-Acetylmuraminsäure;
GlcNAc = N-Acetylglucosamin;
DAP = Diaminopimelinsäure

Bei Escherichia coli und anderen gramnegativen Bakterien sind die beiden Tetrapeptide direkt verbunden.
Die Sequenzen der Tetrapeptide unterscheiden sich in verschiedenen Bakterien.
Schematische Darstellung der

Mureinschicht (Peptidoglycan)
von gramnegativen Bakterien
Bei Staphylococcus aureus bzw. grampositiven Bakterien verbindet eine Interpeptidbrücke aus fünf Glycinmolekülen
zwei Tetrapeptide.
Die Aminogruppe der Seitenkette des Lysins ist an die

Carboxygruppe des terminalen D-Alanins des benachbarten
Peptids verknüpft.
Schematische Darstellung der Mureinschicht von

grampositiven Bakterien am Beispiel von
Staphylococcus aureus
MurNAc = N-Acetylmuraminsäure;
GlcNAc = N-Acetylglucosamin
Aufbau von Bakterien

Modul Bioanalytische Chemie

Isolierung von genomischer und Plasmid-DNA aus Bakterien
Woher kommt die DNA?

Ziel: Klonierung eines Gens zur Charakterisierung oder Überexpression
DNA-Quellen:
► Isolierung genomischer bakterieller DNA aus dem kultivierten Bakterium

► Präparation von cDNA aus isolierter mRNA aus Eukaryonten
► Amplifikation von DNA in Umweltproben (auch nicht-kultivierbare Organismen)
► DNA ist schon kloniert (d.h. befindet sich in einem Vektor) und muss nur
subkloniert werden
► Präparation eines synthetischen Gens anhand der bekannten Sequenz (~1
EUR/Aminosäure) oder eine artifizielle DNA-Sequenz (z.B. Proteindesign)
Fordern E Farbstoff
Methoden zur Isolierung von Nukleinsäuren
(1) Bereitstellen und Aufschließen des Zellmaterials

(2) Aufreinigung der Nukleinsäuren
(A) Isolierung von genomischer DNA
erster Schritt: Aufbrechen der Zellen
mechanischer Zellauschluß:
- Zugabe von flüssigem Stickstoff
- Mörsern mit feinem Sand
- French Press (Zellen platzen nach Behandlung mit hohem Druck)
- Ultraschall
- „Kugelmühle“: Kugeln in schneller Bewegung brechen Zellen auf
D muss ausbrach
fumianalysieren
Felle
"
zu
stabiler
pdysaccaoin besteht
trennt äße % und innere Zelle keine Zelten

d
-
Meer
Innere Zelle
E. Zucker
: Ionen
,
Salzsre dünne
,
coli (Gram-negatives Bakterium) hat die Form gerader,
Lipoprotein
. . .
zylindrischer Stäbchen mit runden Enden. Der

Durchmesser beträgt 1,1–1,5 µm und die Länge 2,0–6,0
µm.
Die French Press
←
Lsg
→
Bakterien
↳ konzentriere äffen
↓
verbindet Schlauch
lag zu
saugen
dann heraus :
The French Press
The French pressure cell press, or French press, is an apparatus used in biological
experimentation to disrupt the plasma membrane of cells by passing them through a
narrow valve under high pressure (~5 MPa, 50 bar).
The press uses an external hydraulic pump to drive a piston within a larger cylinder that
contains the sample. The highly pressurized solution is then squeezed past a needle
valve. Once past the valve, the pressure drops to atmospheric pressure and generates
shear stress that disrupts the cells.
A French press is commonly used to break the resilient plasma membrane and cell
walls of bacteria during protein isolation. Some disadvantages of the press include that
it is prone to valve clogging, is not well suited to processing of large sample volumes,
and is awkward to manipulate and clean due to the weight of the assembly (about 30 lb
or 14 kg).
Ultraschall/Sonifier Methode -
'
geeignet für
kleines Volumina
| Elektronsteuern
Kopf ultraschall
)

(A) Isolierung genomischer DNA aus Bakterien
Lysispuffer/Extraktionspuffer:
Lysozym: baut bei Bakterien die widerstandsfähigen Zellwände ab
pH-Puffer
EDTA: Komplexiert divalente Metallionen, inaktiviert Metalloenzyme, hier DNasen (Desoxyribonukleasen)
SDS: Natriumdodecylsulfat: starkes Detergenz, inaktiviert/entfaltet Proteine, löst Interaktionen von Proteinen
mit Nukleinsäuren
SDS
EDTA
Lysozym
Lysozym ist ein in Speichel, Schweiß, Tränen, Ohrenschmalz sowie

Nasen- und Darmschleimhäuten, aber auch im Blutplasma
vorkommendes Enzym, das gegen Bakterien wirkt, indem es deren
Zellwand abbaut. Es ist wichtig für die Abwehr bakterieller
Infektionen.
Das am besten untersuchte und am meisten verwendete Lysozym
stammt aus Hühnereiweiß (hen egg white lysozyme, HEW-Lysozym)
HEW-Lysozym besteht aus 129 Aminosäuren, mit einer molaren Masse

von 14.388 Dalton. Lysozym weist eine globuläre Struktur auf, die aus
fünf α-Helices und fünf β-Faltblattsträngen aufgebaut ist und vier
Disulfidbrücken besitzt.
Lysozym spaltet die β-1,4-glycosidische Bindung zwischen N-Acetyl-D-
muraminsäure und 2-Acetylamino-2-desoxy-D-glucose (= N-Acetyl-D-
glucosamin) in den Zuckerketten des Peptidoglucangerüsts der
Bakterienzellwand.
basisch
polare extrem
sofort protoniert
II.
" → muss
Katalysemechanismus des HEW-Lysozyms ↓
* Negativ
-
(1) Asp52 greift als Nukleophil das anomere C-Atom der glykosidischen
Bindung an und es bildet sich ein kovalentes Intermediat. Glu35 wirkt
als Säure und protoniert die Abgangsgruppe*.
(2) Ein Wassernukleophil (oder Hydroxidion nach Deprotonierung durch
Glu35) greift das anomere C-Atom an und Asp52 tritt aus
*Die Katalyse des Austritts einer Abgangsgruppe durch Protonierung ist

immer dann sinnvoll, wenn die Abgangsgruppe im austretenden Zustand
sonst nicht stabil ist, z.B. hier das stark basische Alkoholat.
?⃝
(B) Isolierung genomischer DNA aus Eukaryonten
Aufreinigung der DNA:
- Abtrennung unlöslicher Zelltrümmer durch Zentrifugation (Membranen, Organellen)
- in Lösung: Proteine, Kohlenhydrate, DNA, RNA, Metabolite
CTAB: Cetyltrimethylammoniumbromid: CTAB ist ein kationisches Tensid, das als

Komplexbildner und Detergens Verwendung findet. Es bildet, abhängig von der
Salzkonzentration in der Lösung, Komplexverbindungen mit Nukleinsäuren wie DNA und
RNA, die in Wasser löslich, aber in konzentriertem Alkohol unlöslich sind.
Proteinase K: Protease, die unspezifisch Proteine hydrolysiert

RNase (Ribonuklease): hydrolysiert RNA (Verdau)
DNA-Fällung: Mit Ethanol oder Isopropanol in der Kälte, DNA nach Zentrifugation als weißes
Pellet am Boden
Eppendorf-Gefäß
Eppendorf-Tube
„Eppi“ Mischen: mit Vortexer
Lagerung der aufgereinigten DNA:

- isolierte DNA kann für kurze Zeit bei 4°C
oder RT gelagert werden
- für längere Lagerung wird die DNA bei
-20°C eingefroren
stabieiey
→
der DNA
Amine
Good-Puffer die meisten Puffer sind
Ein Good-Puffer (englisch Good's buffer) ist ein in der Biochemie verwendeter Puffer nach den Kriterien von
Norman Good.
Eigenschaften
Norman E. Good und Mitarbeiter entwickelten zwischen 1966 und 1980 zwanzig Substanzen zur Verwendung als
pH-Puffer. Im Gegensatz zu anderen Puffersubstanzen sollten Good-Puffer möglichst wenige Wechselwirkungen mit
Proteinen, eine hohe Löslichkeit, keine Diffusion durch Biomembranen, einen Pufferbereich zwischen pH 6 und 8,
eine geringe Toxizität, eine geringe UV-Absorption, eine Unabhängigkeit der Pufferwirkung von anderen Faktoren,
eine kostengünstige Herstellung und eine metabolische und chemische Stabilität aufweisen.
Tris (pKs = 8,2) HEPES (pKs = 7,5) MES (pKs = 6,1)

Tris(hydroxymethyl)aminomethan 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)- 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
ethansulfonsäure
(C) Präparation von Plasmid-DNA ausgehend

von einer E.coli-Kolonie
Plasmide: kleine (meist 1 – 25 kBp) ringförmige DNA-Moleküle, die unabhängig von der chromosomalen
DNA in Bakterien vorkommen.
Isolierung ähnlich wie genomische DNA, nur muss die Plasmid-DNA von genomischer DNA getrennt
werden
Tag 1:
(A1) Transformation kompetenter Zellen mit Plasmid-DNA und Ausplattieren auf Agar-Petrischale
oder (A2) Ausstreichen ausgehend von gefrorenem Glycerol-Stock (engl. stock, Lager, Bestand)
(B) Ausstreichen einer Bakterienkultur auf Petrischale mit Agar ausgehend von der tiefgefrorenen
Bakterienkultur
Inkubation der Platte über Nacht bei 37 °C (Inkubator, Brutschrank)

Ausgangspunkt: Eine eingefrorene E.coli-Kultur, die das gewünschte Plasmid trägt
Erster Schritt: Ausstreichen auf eine Agar-Platte zur Gewinnung von vereinzelten Kolonien
über Nacht im Inkubationsschrank (37 Grad C)
Versucht einzelne Ketone

zu verteilen und die nicht
aufeinander .
/ → Genetisch unterscheiden
erst erhitzen
→ aus streicheln ein
BakterienTemperatur
Reihenfolge
1 → 234 → 567
→ 8910 → 111213
Dann eintauchen und Abbkühlen
Präparation von Plasmid-DNA ausgehend von

einer E.coli-Kolonie
Tag 2:
Inokulation von 5 ml sterilen LB-Mediums mit einer
runden, einzelnen Kolonie mit steriler Draht-Schlaufe
Problematisch ist die Inokulation direkt mit der

Transformationsmischung oder eines Teils der
gefrorenen Bakterienkultur ohne Vereinzelung auf eine
Kolonie. Dies kann zu einer inhomogenen Kultur führen.
Präparation von Plasmid-DNA ausgehend von
einer E.coli-Kolonie
Sterile Schlaufe (Draht
vorher in Flamme erhitzt)
Petrischale mit Agar

(Agarplatte)
Kolonie
Wachstum LB Medium von FBabeterien

Anzug
-
Lysogeny: Infektion von Bakterien durch Bakteriophagen (Viren), broth: Brühe
mit NaOH
Trypton und Pepton in bakteriellen Nährmedien
• Pepton ist ein Gemisch aus Peptiden und Aminosäuren, das durch Hydrolyse
durch das Enzym Pepsin oder chemisch durch Säuren aus tierischen oder
pflanzlichen Proteinen hergestellt wird. Peptone besitzen nur eine geringe
Molekülmasse, wodurch sie nicht durch Salz ausgefällt werden oder verklumpen
(„koagulieren“). Dadurch bleiben sie gelöst und können zum Beispiel in
Nährlösungen für Bakterien oder Hefe eingesetzt werden.
• Tryptisch verdaute Proteine (mittels Trypsin) werden analog als Trypton
bezeichnet und dienen ähnlichen Zwecken.
( viele Vitamine
, gesund , Bakterien zugesetzt
Isolierung von Plasmid-DNA Diese und die folgenden fünf Folien
sind eine Wiederholung aus dem
Modul Trennmethoden.
(1) Anzucht von Bakterienzellen in Escherichia coli

(2) Aufschluss der Bakterien
(3) Trennung der Plasmid-DNA von anderen Nukleinsäuren (genomische DNA, RNA),
Proteinen und Zellbestandteilen
Unterschiedliche Trennverfahren:
a) Phenol-Chloroform-Extraktion (klassisch aber kaum noch verwendet, hier nicht

besprochen)
b) Säulenbasiert über Filtrationsmembranen und "Harz" (Säulenmaterial):
Festphasenextraktion
c) Magnetische Beads (Perlen, Kügelchen) die die DNA an der Oberfläche durch
ionische Wechselwirkung binden
Isolierung von Plasmid-DNA durch alkalische Lyse
Infolge des stark alkalischen

pH-Wertes der Natronlauge
denaturiert die Plasmid-
DNA ebenso wie die alkalische Lyse: NaOH, SDS, RNase A → RNA abbauen
chromosomale DNA.
Nach Ansäuern mit

Kaliumacetatpuffer
renaturiert die kleine
Plasmid-DNA schnell und ist
Demotiviert
gelöst, während die große Zugabe von 3 M Kaliumacetat/Eisessig pH 5.5
genomische DNA auch
durch die Copräzipitation
von denaturierten
Proteinen sich nicht wieder
faltet und löst. Zentrifugation
Isolierung von Plasmid-DNA
Reinigung von Plasmid-DNA über Säulen aus Kieselgel (Siliziumdioxid)
Es werden zwei Beiträge zur Bindung in der Literatur diskutiert:
Die Bindung findet unter leicht sauren pH-Werten und in
Gegenwart höherer Salzkonzentrationen, meist chaotroper
Salze wie Guanidiniumchlorid.
positiveLad findet
.
Lad
negative .
https://www.bioke.com/webshop/mn/nucleospintech.html https://en.wikipedia.org/wiki/Spin_column-based_nucleic_acid_purification
Isolierung von Plasmid-DNA: Kits... → Gleiche

Bedingung / Standard
Bdg
E T
primer
Reinigung von Plasmid-DNA über Anionenaustausch-Säulen
Mülhardt, 2009, Experimentator: Molekularbiologie, Genomics

Fällung und Reinigung von DNA mit Alkoholen Lagerung der gereinigten DNA
Eine weitere Aufreinigung der DNA kann durch Fällung mit
kaltem 70 % Ethanol (oder anderen Alkoholen) erfolgen. Nach Die so gereinigte DNA ist sehr stabil
Zentrifugation kann der Vorgang noch mehrmals wiederholt und kann über Jahre bei -20°C
werden. gelagert werden.
Ein Alternative ist es, Plasmid-DNA in

den eingefrorenen E. coli-Zellen bei
-80 °C zu lagern.
kleines weißes Pellet,

im trüben "Eppi" kaum sichtbar
Lagerung von Plasmid-DNA
Lagerung von über einen längeren Zeitraum benutzten Gen-Konstrukten:

(A) als aufgereinigte Plasmid-DNA bei -20 °C (Vorteil: sicherste und stabilste Lagerung,
Nachteil: Transformation notwendig)
(B) als bei -80 °C gelagerte transformierte Bakterienkultur (Vorteil: schneller Einsatz,
keine Transformation; Nachteil: Zellen und Konstrukt verändern sich mit der Zeit,
die Überexpression des Zielproteins kann ausgeschaltet werden)
kommt
Falls leicht toxic → nicht mehr
transformiere ,
keine Änderung

Klonierung eukaryontischer Gene
Methoden zur Isolierung von Nukleinsäuren Intron

ausgeschnitten
und Exon Prof
Klonierung eukaryontischer Gene
für .
ueroa
der
-
Im Unterschied zu bakterieller DNA bestehen die Gene eukaryontischer Organismen aus Introns und Exons.
Die Introns werden vor der Gentranslation (Proteinsynthese) herausgeschnitten (Spleißen), sie werden also
nicht in die Proteinsequenz übersetzt. Da Bakterien keinen Spleißmechanismus besitzen, dürfen zur
rekombinanten Proteinexpression in Bakterien eingebrachte Gene keine Introns mehr enthalten. Daher wird
die mRNA isoliert und in cDNA übersetzt.
Sinn des Spleißens:
(1) Evolution: Exons
Intron Intron
codieren für
funktionelle Domänen
und können als Exons
Intron
neu kombiniert
Intron
werden
Prozessierung
der mRNA (2) Alternatives Spleißen:
Aus einem Gen
reife mRNA
entstehen durch
Weglassen einzelner
Exons verschiedene
funktionelle Proteine.
wikimedia
Unterschiede bakterielle und eukaryontische Genexpression
Kein Zellkern
-
gesamte DNAin =
Transkription
Zellkern und
in Protein besetzen
https://www.khanacademy.org/science/high-school-biology/hs-molecular-genetics/hs-rna-and-protein-synthesis/a/intro-to-gene-expression-central-dogma

(D) Isolierung von mRNA
Problem: Vorkommen von RNasen in der Zelle, die RNA sehr schnell abbauen
(schneller als DNA durch DNasen abgebaut wird)
RNasen sind recht stabil (lassen sich durch Hitze nicht irreversibel denaturieren) und
benötigen keine Metallcofaktoren zur Aktivität
↳ schnell und sauber durchführen

Struktur und Funktion von Ribonukleasen
Es gibt mehrere unterschiedliche RNasen, darunter Endoribonukleasen und Exoribonukleasen.
Im Unterschied zu den Restriktionsenzymen für DNA sind RNasen in der Regel unspezifisch.
RNase A is an RNase that is commonly used in research. RNase

A (e.g., bovine pancreatic ribonuclease A) is one of the hardiest
enzymes in common laboratory usage; one method of isolating it is
to boil a crude cellular extract until all enzymes other than RNase
A are denatured. It is specific for single stranded RNAs.
The side chains of the four disulfide-bonded cysteines are shown

in yellow, with their sulfur atoms highlighted as small spheres.
Residues important for catalysis are shown in magenta.
Biologische Funktion: Verdauungsenzym für RNA, welches vom Pankreas (Bauchspeicheldrüse) in den
Zwölffingerdarm sezerniert wird.
Kommerziell erhältliche RNase A stammt aus dem Rind
Ribonuclease A: Katalysemechanismus
Intramdehu OH mit P
als DNA
↳ RNA instabiler
deswegen
His 12
① H
Protonierung an
2
^
②☆
angreifen *
B.
ai
1) Proton
: .
2
3) Abgang
deprotoniert
3
1 a) P
angreife
3) Protorueig
'
4) Deprctonui
H12 wirkt als Base und deprotoniert die 2‘-OH-Gruppe (das Alkoholat ist ein besseres Nukleophil). H119 deprotoniert die
Abgangsgruppe (warum ist das notwendig?). Es entsteht 2‘,3‘-zyklisches Nukleotid als Intermediat. Dieses Intermediat wird
durch nukleophilen Angriff eines Wassermoleküls hydrolysiert, welches von H119 deproniert wird (OH- als besseres
Nukleophil). H12 protoniert die Abgangsgruppe.
Inaktivierung von RNasen
DEPC: Diethylpyrocarbonat: inaktiviert RNasen durch kovalente Modifikation von Lysin und
Histidin; überschüssiges DEPC kann danach im Autoklaven in Ethanol und CO2 zersetzt werden.
Alternative: Zusatz von GTC (Guanidinisothiocyanat), ein chaotropes Salz, welches Proteine
(auch RNase) denaturiert.
Abtrennung eukaryontischer mRNA von anderen RNA-Formen

über den poly-A-Schwanz am 3`-Ende
Abtrennung anderer RNA: zelluläre

RNA:
80 % rRNA
15 % tRNA
2-5 % mRNA
Eukaryontische mRNA: besitzt einen

poly-A-Schwanz am 3‘-Ende
-> Abtrennung an Säule mit
immobilisiertem poly-dT-Oligonukleotid
cDNA-Synthese: reverse Transkription
mRNA wird in der Regel mit dem Ziel isoliert, diese für die Klonierung und rekombinante Expression wieder
in DNA umzuschreiben.
Die aus mRNA umgeschriebene DNA nennt man cDNA (complementary DNA, komplementäre DNA) RNT zurück -
von DNA → EDNA

-
Zum Umschreiben dient das Enzym Reverse Transkriptase (RT):

Reverse Transkription, da RNA in DNA umgeschrieben wird.
Vorkommen: In Retroviren (z.B. HIV), welche RNA-Viren sind (enthalten RNA als
Erbmaterial) mit Einzel(+)-strängigem RNA-Genom, dient die RT zur
Umschreibung der RNA in DNA, welche dann vom Wirt vervielfältigt werden kann.
Aufgrund der pharmakologischen Bedeutung wurden mehrere unabhängige

Strukturbestimmungen der HIV-RT durchgeführt.
Das Enzym besitzt eine ähnliche Struktur wie die DNA-Polymerasen (später
dazu).

cDNA-Synthese: reverse Transkription
Zusätzlich zur Polymerase-

Aktivität besitzt die RT eine
RNase H-Domäne, in der die
RNA-Matrize nach der DNA-
Synthese hydrolysiert wird.
RT weisen eine wesentlich höhere Fehlerrate als DNA-Polymerasen auf.
Nach der Synthese des DNA-Stranges wird die RNA durch Zugabe von RNase H verdaut und die
DNA in einer normalen PCR-Reaktion amplifiziert.
Die cDNA wird dann in einen Vektor kloniert, um stabil amplifiziert und sequenziert zu werden.
Künstliche Gensynthese
(1) Chemische Synthese von kurzen einzelsträngigen DNA-Sequenzen
(2) Hybridisierung auf Basis der Watson-Crick-Basenpaarung
(3) Ligation (dazu später)

Klonierung: Vektoren/Plasmide und Antibiotika
VEKTOREN UND
PLASMIDE
Prinzipien und Methoden
der DNA-Klonierung: Vektoren/Plasmide
Bei der Klonierung wird ein DNA-Abschnitt über einen Vektor in eine Empfängerzelle eingebracht und dort vermehrt.
In der Gentechnik und der Biotechnologie versteht man unter einem Vektor ein Transportvehikel ("Genfähre") zur
Übertragung einer Fremd-Nukleinsäure (oft DNA) in eine lebende Empfängerzelle. Als Vektoren werden verschiedene
solcher Vehikel bezeichnet:
 Plasmide kommen in Bakterien und Archaea vor. Sie haben große Bedeutung für die Klonierung und Expression von
Genen.
 Cosmide oder YACs (yeast artificial chromosome) können mit Hilfe von Bakteriophagen- bzw. Hefezellstrukturen
große DNA-Abschnitte transferieren.
 Modifizierte Viren (z. B. Adenoviren oder Retroviren) werden auch als virale Vektoren bezeichnet und dienen dem
Einbringen von DNA in eukaryontische Zellen und Gewebe.
Schon bei der Einbringung der zu klonierenden DNA in den Vektor wird dabei in der Regel DNA aus verschiedenen
Quellen neu kombiniert (rekombiniert), man spricht von rekombinanter DNA und rekombinanter DNA-Technologie.
Das DNA-Stück (oft ein Gen), welches in den Vektor eingebracht werden soll, wird als Insert (engl. einfügen)
bezeichnet.
Prinzipien und Methoden der DNA-Klonierung:

Vektoren/Plasmide
Plasmide sind kleine, in der Regel zirkuläre, autonom replizierende DNA-Moleküle, die in
Bakterienzellen vorkommen können, aber nicht zur eigentlichen DNA des Chromosoms gehören,
also extrachromosomal sind.
1: chromosomale DNA (in E. coli 4639 kBp)

2: Plasmide (ca. 1-25 kBp)
Biologische Funktion von natürlichen Plasmiden:

Fruchtbarkeits-(F-)Plasmide. Ihre einzige Funktion ist die Einleitung der Konjugation (Austausch von Plasmiden
zwischen Bakterien).
Resistenz-(R-)Plasmide, die Resistenzgene gegen Antibiotika oder Gifte enthalten.
Col-Plasmide, die Gene enthalten, die für Colicine (Proteine, die für andere Bakterien toxisch sind) kodieren.
Degradations-Plasmide, die den Abbau von ungewöhnlichen Substanzen, wie z.B. von Toluol oder Salicylsäure
ermöglichen.
Virulenz-Plasmide, die ein Bakterium zu einem Krankheitserreger machen.
Vektoren/Plasmide
Plasmide sind für das Überleben und Wachstum unter normalen Bedingungen nicht notwendig.
Sie enthalten Gene, die unter bestimmten Bedingungen für das Bakterium vorteilhaft oder
essentiell werden können.
In der Gentechnologie verwendete Plasmide enthalten in der Regel die folgenden Elemente:
ori: origin of replication (Replikationsstartpunkt) zur autonomen Replikation der DNA (immer
vorhanden)
Marker-Gen, in der Regel Antibiotika-Resistenz, um Bakterien mit und ohne Plasmid voneinander
trennen zu können
Eine Multiple Klonierungsstelle (MKS), in der mehrere Schnittstellen für
Restriktionsendonukleasen nacheinander vorkommen.

Vektoren/Plasmide
Schema der Plasmidvektoren
base pBR322 und pUC19
lang
=
Das Plasmid pBR322 wurde 1977 von Francisco Bolivar und Raymond Rodriguez konstruiert und war eines der
ersten künstlich hergestellten Plasmide.
pUC19 und pUC18 sind künstlich hergestellte, bakterielle Plasmide, die zu den ersten häufig verwendeten
Vektoren zur Klonierung und Expression von Proteinen im Bakterium Escherichia coli gehören. Der Name der
Plasmide leitet sich von der University of California (UC) ab, an der diese Plasmide (p) konstruiert wurden.
Plasmidkonformationen
stabiler
Plasmide können in folgenden Formen auftreten:

schneiden
► "Supercoiled" (or "Covalently Closed-Circular") In
i.
den Bakterien liegt die Plasmid-DNA typischerweise können

in einer durch DNA-Gyrasen überspiralisierten Form ↓
vor.
► "Nicked Open-Circular" Ein Strang ist geschnitten. spannen
DNA
Die Superspiralisierung wird dadurch aufgehoben. Sup
-
zu einer
normalen
► "Relaxed Circular" Beide Stränge sind intakt;
Superspiralisierung wurde z.B. enzymatisch als Schnitt
DNA
entfernt.
÷::
► "Linear" Beide Stränge wurden nah beieinander
instabile
geschnitten (z.B. durch Restriktionsenzym), so dass ,
das Plasmid linearisiert wurde.

ikorriepei DNA .
Schnitt
to nick: einkerben, einschneiden

nick: Kerbe
Für
GGW
← reale Bilder
① ② ③ DNA
entspannte läuft langem
als die stark kdleräot
super
J DNA (*)
ikd
kennen Super
•
auf gereinigte
DNA nur der
① super
:
,
:
DNA und relaxed DNA
② topologische
Phase , langsam aufgehoben .
Einfluss von Ethidiumbromid

schnellst
langsamst
Ethidiumbromid verringert die Wicklungen der Stränge umeinander durch Einlagerung zwischen die Basen.
Dadurch wird die Superspiralisierung verringert und das Laufverhalten der DNA ändert sich.
Plasmidkonformationen
Supercoiled und relaxed DNA laufen
unterschiedlich in einem Agarosegel. Die
überspiralisierte DNA ist kompakter und läuft
deutlich schneller.
Das funktioniert allerdings nur, wenn die DNA erst

nach der Elektrophorese mit Ethidiumbromid
gefärbt wird, da durch die Intercalation die
Überspiralisierung aufgehoben wird (bzw. bei
hohen Konzentrationen in der umgekehrten
Richtung neu überspiralisiert).
Aus der Zelle isolierte Plasmide sind überwiegend

überspiralisiert (supercoiled).
http://en.wikipedia.org/wiki/Supercoiling
Elo R1 DNA
:
Enzym ,
schneller
Zu schneiden,
als 0C
Plasmid -Kopienzahl
Plasmid copy number: Plasmide können sich in Abhängigkeit von der Art des Replikationsursprungs stark
in der Anzahl an Kopien pro Zelle unterscheiden. Bei low-copy-number-Plasmiden liegen nur einige Kopien pro
Zelle vor. Bei high-copy-number-Plasmiden kann durch Selektionsdruck die Anzahl der Kopien auf einige
Tausend erhöht werden, was sowohl für die Plasmidpräparation als auch für die Überexpression hilfreich ist.
0
ANTIBIOTIKA
Antibiotika
Ein Antibiotikum (von griech. ἀντί- anti- „gegen“ und βίος bios „Leben“; Plural:
Antibiotika) im ursprünglichen Sinne ist ein natürlich gebildetes niedermolekulares
Stoffwechselprodukt von Pilzen oder Bakterien, das schon in geringer Konzentration
das Wachstum anderer Mikroorganismen hemmt oder diese abtötet.
Als Antibiotikum im weiteren Sinn gilt auch eine antimikrobiell eingesetzte

Substanz, die in der Natur nicht vorkommt und teilsynthetisch, vollsynthetisch oder
gentechnisch gewonnen wird, nicht jedoch Desinfektionsmittel.
Antibiotika und ihre Derivate werden vielfach als Antiinfektiva (Arzneistoffe zur
Behandlung von Infektionskrankheiten) verwendet.
Antibiotika β-Lactam-Ring
Antibiotika:
Die β-Lactam-Antibiotika sind eine Gruppe von Antibiotika, die alle
in ihrer Strukturformel einen viergliedrigen Lactam-Ring aufweisen.
Sie gehen auf das Penicillin zurück, das der englische Bakteriologe
Alexander Fleming 1928 aus Kulturen des Schimmelpilzes
Penicillium notatum extrahierte. Sie wirken alle bakterizid, indem sie
die Peptidoglykansynthese bei der Zellteilung hemmen. Der β-
Lactam-Ring inaktiviert dabei das aktive Zentrum von Enzymen
(Transpeptidase), welche für die Quervernetzung der
Peptidoglycanschicht verantwortlich sind. Penicilline
Penicilline: Ampicillin
Cephalosporine:
Cephalosporine
1928: Entdeckung der antibiotischen Wirkung

von Schimmelpilzen durch Alexander Fleming
Penicilline
Prinzipien und Methoden der DNA-Klonierung: Antibiotika
Penicilline inaktivieren das Enzym Transpeptidase, welches beim Aufbau der bakteriellen Zellwand
kurze Peptide des Peptidoglykans verlinkt. Unter Spaltung des Lactamrings binden Penicilline kovalent
an das Serin-Nukleophil im aktiven Zentrum der Transpeptidasen.
Möglicherweise verhindert der

sterische Anspruch durch die
Verzweigung am Cα, dass ein
Wassermolekül zur Hydrolyse
des Esters positioniert und
Ser- aktiviert werden kann.
Nukleophil
nicht weiter teilen
Säure
protoniert
Abgangs-
gruppe
Kovalentes Addukt, welches nicht hydrolysiert
wird (-> kovalenter Inhibitor).
Intermediat wird
in zweitem Schritt
hydrolysiert
Resistenz gegen β-Lactam-Antibiotika:

Die Resistenzgene kodieren für β-Lactamasen,
welche den Lactamring hydrolysieren.
amp (oder bla) kodiert für die Ampicillinase,
welches Ampicillin zersetzt.
Hemmung der Proteinsynthese am Ribosom durch Antibiotika
Beide aus Streptomyceten
isoliert
große Untereinheit
kleine Untereinheit

Antibiotika:
Kanamycin, Streptomycin. Wirkmechanismus: Bindung an das Ribosom
Resistenz: Enzyme zur Modifikation des Antibiotikums (Phosphorylierung, Acetylierung)
Tetrazyklin: Bindung an das Ribosom

Resistenz: Aktiver Transport des Antibiotikums aus der Zelle

Kurze Übersicht über einen pET-Vektor
Restriktionsendonukleasen
Vektorkarte Novagen pET45b

Kette ( 526dg
längere
Ap Ampicollinan .
✓ um das Gen mitzubringen

Ap kodiert für Ampicillinase
chem.subitan-sehdt.tw
lacI für lac-Repressor/ sorgt dafür ,
f1 ori ermöglicht Verpackung der DNA in Phagen
pET45b: Multiple Klonierungsstelle Bilder fiü ARNA .
Tt funktioniert nur
Lac
wenn
operator
niteht
besetztwiede
+ Über Ribosom Gb)
und weiter bist
Iac Operator →Schnittpunkt ab synthetisiert Normalerweise.
Iaa
operator
bindet
rbsabge lese bis
ab Alanin
Neo 1CMet mit laeprq
abschneide
.
l ↳verbinden RNAEnde .
↓
nach kgs
Enzym
GenI
Neal bis Ava I raus
geschnitten sog .
I Arif Met
RESTRIKTIONS-
ENDONUKLEASEN
Nobelpreis für Physiologie oder Medizin 1978 an Werner Arber
(Schweiz), Daniel Nathans (USA) und Hamilton Othanel Smith
Restriktionsenzyme (USA „für ihre Entdeckung der Restriktionsenzyme und die
Anwendung dieser Enzyme in der Molekulargenetik“.
Restriktionsenzyme, genauer Restriktionsendonukleasen, sind Enzyme, welche

DNA innerhalb einer Sequenz schneiden können.
Jede Restriktionsendonuklease erkennt eine spezifische DNA-Basensequenz.

Nach ihren Eigenschaften unterscheidet man drei Typen:
* Typ I schneidet die DNA an einer zufälligen Stelle weit von der
Erkennungssequenz entfernt. Benötigt ATP und transferiert eine Methylgruppe
von S-Adenosyl-Methionin.
* Typ II schneidet die DNA innerhalb oder in unmittelbarer Nähe der
Erkennungssequenz. Benötigt kein ATP und hat keine Methyltransferase-
Aktivität.
* Typ III schneidet die DNA etwa 20 bis 25 Basenpaare von der
Erkennungssequenz entfernt. Benötigt ATP und transferiert eine Methylgruppe
von S-Adenosyl-Methionin.
Restriktionsenzyme
Im allgemeinen Sprachgebrauch wird der Begriff Restriktionsenzym meist mit den
Restriktionsendonukleasen vom Typ II gleichgesetzt, da die Enzyme der Typen I und III in
der Molekularbiologie nur eine geringe Bedeutung besitzen.
Die Namen der Restriktionsenzyme geben ihre Herkunft an. Der erste Buchstabe steht
für die Gattung, der zweite und dritte für die Art, erweitert wird es durch Namenszusätze
und die chronologische Abfolge der Entdeckung. Das Enzym EcoRI ist beispielsweise das
erste Restriktionsenzym, das in dem Stamm Escherichia coli R(rough) gefunden wurde und
AluI das erste Restriktionsenzym aus Arthrobacter luteus.
Imitation
Restriktionsenzyme unterschiedlicher Herkunft mit identischer Erkennungssequenz und
gleichem Schnittmuster werden Isoschizomere genannt. Schneiden sie innerhalb der
selben Sequenz, hinterlassen aber unterschiedliche Schnittenden, bezeichnet man sie als
Neoschizomere.
Restriktionsenzyme
Die Erkennungssequenzen der Restriktionsendonukleasen vom Typ II bestehen meist aus
palindromischen Sequenzen von vier, sechs oder acht Basenpaaren. Der Schnitt kann versetzt
(engl. sticky ends, deut. klebrige Enden, z.B. EcoRI) oder gerade sein (engl. blunt ends, deut. stumpfe
Enden oder glatte Enden, z.B. AluI). Klebrige Enden sind leichter ligierbar. Die Erkennungssequenz von
EcoRI lautet GAATTC. Der Schnitt erfolgt zwischen dem G und dem A:
Als Palindromische Sequenz wird in der Genetik eine (kurze) doppelsträngige DNA-Sequenz
bezeichnet, die auf beiden Strängen in einer Richtung (z.B. 5'->3') die gleiche Basenabfolge zeigt.
Restriktionsenzyme
Herkunft und biol. Bedeutung

Der Name „Restriktionsenzym“ stammt von dem bakteriellen Restriktions-Modifikationssystem, das der
Abwehr fremder (viraler) DNA dient. Viele Bakterien besitzen stammspezifische
Restriktionsendonukleasen. In der eigenen DNA sind die entsprechenden Erkennungssequenzen
methyliert und werden daher nicht geschnitten. Wenn Viren, die sich in den Bakterien vermehren
(Bakteriophagen), ihre DNA in die Zellen injizieren, ist diese nicht methyliert und wird durch das
Restriktionsenzym geschnitten und damit inaktiviert. Nur Viren, die aus Bakterien desselben Stammes
kommen, besitzen das richtige Methylierungsmuster und können sich weiter vermehren. Die Vermehrung
der Viren ist damit auf diesen Stamm „beschränkt“ (Restriktion = Beschränkung).
Die Bakterienstämme besitzen also immer eine spezifische DNA-Methylase, die die gleiche DNA-
Sequenz methyliert, welche die Restriktionsendonuklease schneidet.
(Falsch: „Restriktionsschnittstelle“ für Proteasespaltstelle im Protein)

https://docplayer.org/15144045-Dna-rekombinationstechnik-gentechnik.html
Restriktionsenzyme
Mechanismus 1 (kovalentes Intermediat)
Phosphoryl-
transferreaktionen
Phosphoryltransferreaktionen
Restriktionsenzyme
Funktionen des Metallions:

(1) Positionierung der Substrate
(2) Deprotonierung des Wassernukleophils (Erniedrigung pKa)
(3) Polarisierung des Phosphatdiesters
(4) Stabilisierung der negativen Ladung des Übergangszustands am P
Restriktionsenzyme
Restriktionsenzyme
Die Achsen sind kolinear.
Restriktionsenzyme
Restriktionsenzyme
Restriktionsenzyme
Restriktionsenzyme
Der KD-Wert (Bindungsaffinität) des spezifischen und unspezifischen Komplexes ist ungefähr gleich. Die
zusätzliche Bindungsenergie der spezifischen Wechselwirkungen wird in die Verformung der DNA
gesteckt (dazu muss Energie aufgewendet werden), damit der katalytisch kompetente Enzym-Substrat-
Komplex gebildet wird.
Restriktionsenzyme
Übliche Einheiten für die Enzymaktivität (Substratumsatz):
Restriktionsenzyme Unit (U): Mikromol pro Minute (µmol/min)
Katal (kat, SI-Einheit): mol/s
Gebrauch von Restriktionsenzymen:
Aktivitätsangabe: Ein Unit Restriktionsendonuklease-Aktivität entspricht der Enzymmenge, die notwendig

ist, um 1 μg Substrat-DNA in einem Reaktionsvolumen von 50 μl innerhalb 1 h vollständig zu verdauen.
Reaktionspuffer und Reaktionstemperatur sind für jedes Enzym angegeben.
Einzelverdau und Doppelverdau: In den meisten Fällen muss ein PCR-Produkt oder ein Plasmid mit zwei
verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten werden.
In der Regel findet sich ein Puffer (Herstellerangabe), in dem beide Enzyme aktiv sind, so dass die Reaktion
mit beiden Enzymen gleichzeitig durchgeführt werden kann (Doppelverdau, double digest). Alternativ führt
man die zwei Reaktionen nacheinander durch (Verdau, DNA-Reinigung, zweiter Verdau).
Star-Aktivität: Einige Enzyme schneiden bei längerer Inkubation, hohen Enzymkonzentrationen oder nicht
optimalen Pufferbedingungen auch andere Stellen. Diese Nicht-Spezifität wird als Star-Aktivität bezeichnet.
Bei diesen Enzymen sollte man entsprechend vorsichtig mit der Enzymmenge und Reaktionszeit sein.
Mayer, Hubert (1978). "Optimization of the EcoRI*-activity of EcoRI endonuclease". FEBS Lett. 90 (2): 341–44.

DNA-Transkription und das pET-Vektorsystem
PROMOTOREN:
STARTPUNKTE
DER DNA-
TRANSKRIPTION
Promotor
Als Promotor wird eine DNA-Sequenz bezeichnet, die die Expression eines Gens reguliert.
Die Promotorsequenz ist ein essenzieller Bestandteil eines Gens. Sie liegt meistens am 5'-
Ende und somit vor dem RNA-kodierenden Bereich. Die wichtigste Eigenschaft eines
Promotors ist die spezifische Wechselwirkung mit der RNA-Polymerase und
Transkriptionsfaktoren (vor allem in Eukaryoten).
Der Promotor ist Teil der „(Gen-)regulatorischen Sequenzen“. Zu ihnen gehören ebenso vom
Gen weiter entfernte Sequenzen, die dessen Expression dennoch beeinflussen. So haben
Enhancer-Sequenzen einen fördernden Einfluss auf die Expression, während Silencer
diese vermindern.
Bakterielle Promotoren haben eine relativ einheitliche Struktur, hier herrschen eher
begrenzte Unterschiede in der genauen Nukleotid-Sequenz vor.
Man spricht hier sequenzabhängig von starken beziehungsweise schwachen Promotoren.
Starke Promotoren resultieren in einer starken Transkription und damit hohen mRNA- und
Proteinsynthese. Starke Promotoren ähneln meist der Konsensussequenz aus
verschiedenen Promotoren.
Promotor
Als Gen wird meist ein Abschnitt auf der DNA

bezeichnet, der die Grundinformationen zur
Herstellung einer biologisch aktiven RNA enthält.
Promotor
Bakterielle Promotoren haben häufig folgende Konsensussequenz:
-35 -10 +1
5'-------TTGACA--------------------------TATAAT------------Startstelle
Das erste Nukleotid der DNA-Sequenz, welche in mRNA umgeschrieben wird, wird als +1
bezeichnet, das Nukleotid vor dem Startpunkt als -1. Die oben angeführte Konsensussequenz
definiert den kodierenden Strang (sense- oder (+)-Strang), der die gleiche Sequenz besitzt wie
hinterher das RNA-Transkript (abgesehen von T->U). Der komplementäre nicht-kodierende
Strang (antisense- oder (-)-Strang) dient als Matrizenstrang für die RNA-Polymerase.
Diese Unterscheidung der zwei Stränge ist wichtig, da nur der korrekte Strang die richtige
Aminosäuresequenz festlegt (->Codonsonne).
Außerdem gilt, dass starke Promotoren direkt vor dem Startpunkt der Transkription reich an AT-
Basenpaaren sind. Dies erleichtert das für die Transkription notwendige Entwinden der
Doppelhelix, da AT-Basenpaare weniger Wasserstoffbrücken als GC-Basenpaare ausbilden.
Der Promotor bestimmt, welcher Strang sense ist, er

bestimmt in welcher Richtung die RNA-Polymerase in
5'->3' Richtung des sense-Stranges synthetisiert.
Wenn beide Stränge als Sequenz angegeben sind,
wird der sense-Strang meist oben angeführt.
Auf einem Plasmid (oder Chromosom) können Gene in
unterschiedlichen Richtungen abgelesen werden, d.h.
sense und antisense ist nur für ein Transkript definiert.
Es ist dann für den Promotor oder das Gen durch
einen Pfeil angegeben, in welche Richtung abgelesen
wird.
TRANSKRIPTION
DER DNA IN mRNA
RNA-Polymerase und Transkription

Das RNA-Polymerase aus E. coli hat eine Größe von etwa
400 kDa. Sie ist nicht verwandt zu den DNA-Polymerasen
(Sequenz/Struktur). Dennoch weisen RNA- und DNA-
Polymerasen einen ähnlichen Zweimetallionen-
Mechanismus zur Katalyse auf.
-> konvergente Evolution
Der Übergang vom geschlossenen Promotorkomplex (DNA Doppelhelix) zum offenen
Promotorkomplex macht den Weg frei für die Bildung der neuen RNA-Kette.
Im Gegensatz zur DNA-Synthese kann die RNA-Synthese ohne Primer beginnen.
Bei der ersten Base handelt es sich meist um pppG oder pppA.
Während der RNA-Synthese sind stets ca. 17 bp entwunden ("Transkriptionsblase").
Geschwindigkeitsvergleich:
DNA-Polymerase: ~1000 bp/sec
RNA-Polymerase: ~40 Nukleotide/sec
Ribosom: ~15 AS/sec
Die RNA-Polymerase ist prozessiv, das RNA-Transkript wird von einem Enzym ohne
Assoziation/Dissoziation synthetisiert.
Es gibt keine Fehlerkorrektur (keine Exonucleaseaktivität)

->1 Fehler pro 104 - 105 Nukleotide (DNA-Polymerasen sind ~105fach genauer)

Die Transkription wird durch eine Terminationssequenz
(Terminationssignal) beendet. Diese wird auch in RNA
übersetzt, bildet dann aber eine charakteristische
Sekundärstruktur in Form eines stem loops oder
hairpins (Stamm-Schleife, auch Haarnadelstruktur
genannt). Dadurch wird eine Dissoziation der RNA-
Polymerase von der DNA bewirkt.
Operatoren: Regulation der Expression
Die Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor und damit die Genexpression wird zusätzlich
durch Operatorsequenzen gesteuert. An diese binden Regulatorproteine, entweder Aktivatoren
oder Repressoren. Die Bindung der Regulatorproteine kann durch kleine Moleküle gesteuert sein,
so dass sich dadurch eine Kontrolle der Genexpression ergibt, die für die gentechnische
Proteinproduktion von großer Bedeutung ist.
Das in der Gentechnik am meisten verwendete System beruht auf dem Lactose-Operator.
Der lac-Operator hat eine weitgehend symmetrische Basensequenz, an welche der
homodimere lac-Repressor (Gen lacI) bindet und so die Transkription verhindert.
besser: zweizählige Symmetrie, fast palindromisch
Der Lactose-Repressor-Operator-Komplex
Der lac-Operator
Natürlicherweise wird die Bindung des lac-Repressors durch das Disaccharid 1,6-Allolactose aufgehoben,
welches als Induktor aus Lactose entsteht und dann die Expression von Genen des Lactose-Stoffwechsels
induziert, welche sich auf dem lac-Operon befinden. In der Gentechnik wird jedoch meist die ähnliche
Verbindung Isopropylthiogalactosid (IPTG) verwendet. Beide Induktoren binden an den Repressor,
verursachen dadurch eine Konformationsänderung und die Dissoziation des Proteins von der DNA. Die
Gene können dann transkribiert werden.
Operon
Ein Operon besteht aus Promotor, Operator(en) und mehreren (Struktur-)Genen, die für Proteine mit
typischerweise verwandten Funktionen codieren. Je nach Operon können verschiedene regulatorische
Proteine (Repressoren bzw. Aktivatoren), abhängig von ihrer Wechselwirkung mit von der Zelle
aufgenommenen oder in der Zelle gebildeten Stoffen, mit den Operatoren in Wechselwirkung treten und
dadurch die Transkription der Gene im Operon an- oder abschalten. Auf diese Weise wird die Synthese der
betreffenden mRNA (messenger-RNA) und damit indirekt der codierten Proteine durch Translation dieser
mRNA aktiviert oder gehemmt.
Alle Gene eines Operons werden koordiniert gesteuert. Das Operon-Modell der Genregulation wurde
1960 von den französischen Wissenschaftlern François Jacob und Jacques Monod u.a. anhand des lac-
Operons von E. coli entwickelt und später erweitert. Für ihre Arbeiten auf diesem Gebiet erhielten sie 1965
den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin.
pET-
VEKTORSYSTEM
Vektorkarte Novagen pET45b

pET45b: Multiple Klonierungsstelle
Das pET-Vektorsystem
In dem pET-Vektorsystem wird als RNA-Polymerase keine E. coli-
Polymerase benutzt, sondern die Polymerase aus dem
Bakteriophagen T7. Dies hat den Vorteil, dass der zu erstellende
Expressionsvektor für ein Gen zunächst in E. coli-Stämmen
gehandhabt werden kann, die keine T7-Polymerase besitzen und
das Gen damit nicht exprimiert wird. Das ist besonders wichtig, wenn
das Gen toxisch ist, was zu Plasmidinstabilitäten führen kann oder
dazu, dass keine Transformanten (Kolonien bei der Transformation)
erhalten werden.
Zur Expression wird das Gen dann in einen speziellen E. coli-
Expressionsstamm transformiert, welcher ein chromosomales Gen
für die T7-Polymerase enthält. Dieses t7pol-Gen ist zudem unter der
Kontrolle des lacUV5-Promotors, wodurch die T7-Polymerase
ebenfalls nur in Gegenwart von IPTG gebildet wird. Durch diese
doppelte Regulation sollte die Expression des Zielgens also erst bei
IPTG-Zugabe beginnen.
Klonierungsstämme: NovaBlue, JM109, DH5α
Die pET-
Das pET-Vektorsystem Vektoren sind
auch durch
den lac
Operator
reguliert

PCR-Reaktion
DNA-Polymerase
PCR-Mutagenese
DIE KLASSISCHE
PCR-REAKTION
Einbringen eines Gens in den Expressionsvektor
Durch die Isolierung genomischer Bakterien-DNA oder durch die Präparation von cDNA ist das
zu klonierende Gen isoliert oder präpariert worden. Um das Gen nun in den Expressionsvektor
klonieren zu können, müssen geeignete Schnittstellen angefügt werden. Das geschieht in der
Regel durch eine Polymerasekettenreaktion, womit das gewünschte DNA-Stück vermehrt
werden kann und gleichzeitig die Schnittstellen über die Primer eingebracht werden.
BamHI
Zu klonierender DNA-Bereich
5' 3' z.B. genomische

3' 5'
DNA
HindIII
BamHI HindIII
5' 3'
3' 5'
Polymerasekettenreaktion (PCR)
Mit der Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) kann DNA amplifiziert
(vervielfältigt) werden.
Für eine PCR-Reaktion werden folgende Komponenten benötigt:

► Die Templat-DNA (Template), die den zu vervielfältigenden Abschnitt enthält
► Zwei Primer, um auf den beiden Einzelsträngen der DNA jeweils den Startpunkt der DNA-Synthese
festzulegen, wodurch der zu vervielfältigende Bereich von beiden Seiten begrenzt wird.
► Eine DNA-Polymerase, die bei hohen Temperaturen nicht zerstört wird, um den festgelegten Abschnitt
zu replizieren (z. B. Taq-Polymerase)
► Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs), die Bausteine für den von der DNA-Polymerase
synthetisierten DNA-Strang
► Mg2+-Ionen, die für die Funktion der Polymerase essentiell sind
► Pufferlösungen
► Thermocycler
Die DNA-Polymerase (eine Polymerase, die ausgehend von einem DNA-Einzelstrangtemplat einen
komplementären DNA-Einzelstrang synthetisiert) verlängert die Primer anhand der Sequenz der
Templat-DNA und erzeugt damit eine Kopie des DNA-Templats, jedoch mit komplementärer
Sequenz.
Nur die kurzen Stücke enthalten die Schnittstellen in beiden Strängen
Als allgemeines Beispiel sei hier die „Rezeptur“ für eine PCR-Reaktion wiedergegeben
1,0 µl DNA-Lösung (100 ng/µl)

2,0 µl pro Primer (10 µM) (Auftragssynthese)
1,0 µl Pfu-, Taq- oder andere thermostabile Polymerase (1–5 U/µl)
1,0 µl 10 mM Desoxy-Nukleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), „dNTP“
5,0 µl 10-fach konzentrierte Polymerase-Pufferlösung
38,0 µl H2O
50,0 µl Gesamtvolumen Für eine PCR-Reaktion werden

typischerweise kleine (500 µl)
Gefäße benutzt, die sehr
dünnwandig sind, um einen
effektiven Wärmetransport und
damit schnelle
Temperaturänderungen zu
gewährleisten
Der PCR-Prozess besteht aus einer Anzahl von 25-50 Zyklen.

Jeder Zyklus besteht aus drei Schritten:
Denaturierung (Melting, Schmelzen): Zunächst wird die doppelsträngige DNA auf 94–96 °C
erhitzt, um die Stränge zu trennen. Die Wasserstoffbrückenbindungen, die die beiden DNA-
Stränge zusammenhalten, werden aufgebrochen.
Im ersten Zyklus wird die DNA oft für längere Zeit erhitzt (Initialisierung), um sicherzustellen,
dass sich sowohl die Ausgangs-DNA (die sehr lang sein kann) als auch die Primer vollständig
voneinander getrennt haben und nur noch Einzelstränge vorliegen.
Dieses und folgende Bilder: https://prezi.com/a0v_kmxqu1us/polymerase-kettenreaktion/
Primerhybridisierung (primer annealing): Die
Temperatur wird ca. 30 Sekunden lang auf einer
Temperatur gehalten, die eine spezifische
Anlagerung der Primer an die DNA erlaubt. Die
genaue Temperatur wird hierbei durch die Länge
und die Sequenz der Primer bestimmt (bzw. der
komplementären Nukleotide im Primer, wenn durch
diesen Mutationen eingeführt werden sollen).
Wird die Temperatur zu niedrig gewählt, können sich die Primer unter Umständen auch an nicht vollständigen
komplementären Sequenzen anlagern und so zu unspezifischen Produkten („Geisterbanden“) führen. Wird die
Temperatur zu hoch gewählt, binden die Primer nicht und er kommt zu keiner oder nur ineffizienter
Produktbildung.
Die Temperatur, welche die beiden oben genannten Effekte weitgehend ausschließt, liegt normalerweise 2–
3 °C unter dem Schmelzpunkt der Primersequenzen (siehe unten). Die Primer werden in der Regel so
gewählt, dass dies einer Temperatur von 55–65 °C entspricht.
PCR
Elongation (Polymerisation, Verlängerung, Amplifikation): Schließlich füllt die DNA-Polymerase die fehlenden
Stränge mit freien Nukleotiden auf. Sie beginnt am 3'-Ende des angelagerten Primers und folgt dann dem
DNA-Strang. Der Primer wird nicht wieder abgelöst, er bildet den Anfang des neuen Einzelstrangs. Die
Temperatur hängt vom Arbeitsoptimum der verwendeten DNA-Polymerase ab (68–72 °C). Dieser Schritt
dauert etwa 30 Sekunden je 500 Basenpaare, variiert aber in Abhängigkeit von der verwendeten DNA-
Polymerase.
Übliche Thermocycler kühlen die Reaktionsansätze nach Vollendung aller Zyklen auf 4–8 °C, so dass eine
PCR am Abend angesetzt werden kann und die Proben am Morgen darauf weiter verarbeitet werden können.
https://www.youtube.com/watch?v=wsjLd8Vs2VY
Primer-Design
► Bewährte Primer-Länge: 17-28 Nukleotide
► Die Schmelztemperatur (Tm) der Primer muss im Bereich 55 °C bis 80 °C liegen
Tm (°C) ~ 2 (NA + NT) + 4 (NC + NG) (es zählt nur der komplementäre Bereich)
genauer berechnen: http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html
► Die Tm-Differenz (der zwei Primer) sollte < 4°C sein
► G oder C am 3‘-Ende für gute Hybridisierung am Startpunkt der Elongation
► Aber: nicht mehr als drei GC-Paare am 3‘-Ende, da sich sonst aufgrund der höheren Affinität der
GC-Paarung leicht unspezifische Hybridisierungen der wenigen Reste am 3‘-Ende als Startpunkt
ausbilden
► keine Haarnadelstrukturen
► keine Primerdimere (innerhalb eines Primers oder zwischen den zwei unterschiedlichen Primern)
► PolyA und GC-Folgen vermeiden (da in genomischer DNA häufig vorkommend)
Dimer
Haarnadel
Analyse der PCR-Reaktion durch Agarose-Gelelektrophorese
Optimierung der
Annealingtemperatur
(„Gradienten-PCR“)
1: DNA-Leiter
2: 52°
3: 55°
4: 57°
5: 60°
6: 62°
Nebenbanden bei höherem MW ein Produkt 1 2 3 4 5 6
DNA-REPLIKATION
DURCH DIE DNA-
POLYMERASE
Die DNA-Polymerase: Reaktion
5‘
3‘
5‘
3‘
Bildung einer Phosphodiesterbrücke den DNA durch die DNA-Polymerasen:

(DNA)n + dNTP = (DNA)n+1 + PPi
Die DNA-Polymerase: Struktur
Die DNA-Polymerase benötigt zur Initiation der Reaktion einen Primer, der bereits über Basenpaarungen
an die Matrize gebunden ist und das freie 3‘-OH für den nukleophilen Angriff zur Verfügung stellt.
Alle Polymerasen besitzen eine ähnliche Topologie und einen

ähnlichen Mechanismus. Einige davon besitzen aber eine
andere Faltung (z.B. Anordnung der Stränge eines
Faltblattes), so dass man hier auch bemerkenswerte
Beispiele konvergenter Evolution findet.
Struktur der T7-DNA-

Polymerase im Komplex
mit doppelsträngiger DNA
Die DNA-Polymerase: Katalyse (ganz analog -> RNA-Polymerase,
obwohl keine Homologie vorliegt)
Die DNA-Polymerase: Spezifität
Dieses „Abtasten“ der Entstehung eines

korrekten Watson-Crick-Basenpaares erhöht die
Spezifität über die einfache Basenerkennung
der Paare hinaus
Die DNA-Polymerase: Fehlerkorrektur
Die Genauigkeit der Basenerkennung an der Polymeraseeinheit reicht
für die notwendige Genauigkeit der DNA-Replikation aber noch nicht aus.
Viele Polymerasen besitzen eine zusätzliche Exonukleasedomäne, die an
der Polymerisationsreaktion selbst nicht mitwirkt, jedoch falsch gepaarte
Nukleotide durch Hydrolyse vom 3‘-Ende der DNA entfernt. Dieser
Mechanismus wird als Korrekturlesen (proof reading) bezeichnet. Er
erhöht die Genauigkeit der DNA-Polymerasen etwa um den Faktor 1000
(auf typischerweise 1 Fehler pro 109 bis 1010 Basen). Einige Polymerasen
besitzen keine Exonukleasedomäne und daher eine deutlich höhere
Fehlerrate.
Thermostabile DNA-Polymerasen
Für PCR-Reaktionen werden DNA-Polymerasen aus thermophilen Organismen benutzt:
Name: Taq Polymerase Pfu Vent

Ursprung: Thermus aquaticus Pyrococcus furiosus Thermococcus litoralis
T-Optimum: 75°-80° C
T1/2 bei 97.5 °C: 9 min >94 % 1 hr at 95°C >90 % 1 hr at 95°C
v (72 °C) 100 bp/s 17-33 bp/s
Fehlerrate 8•10-6 1,3 • 10-6 2,8 • 10-6
Mutationsrate* 16 % 2,6 % 5,6 %
*in vitro, 20 PCR-Zyklen und Zielsequenz von 1 kb
-> Nach einer PCR-Reaktion und Einführung des Produkts in das Plasmid ist immer eine vollständige Sequenzierung
notwendig, um festzustellen, dass keine zusätzlichen Mutationen entstanden sind.
PCR-MUTAGENESE
Ortsspezifische Mutagenese
Site-directed mutagenesis
Bei der ortsspezifischen Mutagenese wird eine gezielte Veränderung der DNA ermöglicht. Es können damit gezielt
einzelne Nukleinbasen eines Gens ausgetauscht oder auch ganze Gene entfernt (z.B. Knockout-Maus) werden. In
den letzten Jahren sind neue Verfahren der gezielten Mutagenese entwickelt worden, die unter dem Begriff
Genome Editing zusammengefasst werden.
Methoden
Im Laufe der Zeit wurden eine Vielzahl von Methoden entwickelt. Dazu gehören u. a. die Kassettenmutagenese,
Primer-Extension-Mutagenese, Ligation-During-Amplification (QuikChange), Megaprimer-Mutagenese und die
Overlap-Extension-PCR. Allen Verfahren ist die Verwendung von mindestens einem synthetischen, eine Mutation
beinhaltenden Oligonukleotid und der Einsatz einer zu mutierenden DNA als Vorlage, in der Regel ein Plasmid,
gemein. (die unter obigen Links verfügbaren Artikel sind teils noch nicht sehr hilfreich)
Für ein erleichtertes Screening kann es sinnvoll sein, Schnittstellen für Restriktionsenzyme auf dem mutagenen
Oligonukleotid einzuführen oder zu entfernen.
Geschichte
Ein wichtiger Meilenstein in der modernen Molekularbiologie war 1978 die erstmalige Beschreibung der
ortsspezifischen Mutagenese mit Hilfe von Oligonukleotiden für die In-vitro-Synthese von mutierter DNA. Für die
Etablierung dieser Technik erhielt Michael Smith 1993 den Nobelpreis für Chemie.
verändert nach:
https://de.wikipedia.org/wiki/Mutagenese
Die klassische Mutagenese-PCR
Mutagenese-PCR: Quik-Change-Mutagenese
Was passiert in den

nächsten PCR-Zyklen?
Mutagenese-PCR: Quik Change Mutagenese
Mutagenese-PCR: Quick Change Mutagenese
Die Methylierung der DNA durch die Dam-

Methylase hat eine Funktion bei der
weitergehenden Fehlerkorrektur von DNA. Durch
sie kann der Templatstrang von dem neu
synthetisierten Tochterstrang unterschieden
werden (nur der Templatstrang ist zunächst
methyliert an den Adeninbasen)
mehr dazu:
https://de.wikipedia.org/wiki/Dam-Methylase
A
Wenn man die Primer so plant, wie in der oberen Abbildung (A) dargestellt (also symmetrisch um die Mutationsstelle und
wie in der Originalpublikation beschrieben), kommt es bei der Quik-Change-Mutagenese nur zu einer linearen Zunahme
der DNA-Konzentration (nicht exponentiell wie in der klassischen PCR-Reaktion), da der komplementäre Primer die neu
synthetisierten Stränge nicht amplifizieren kann (immer nur die ursprüngliche zyklische Plasmid-Templat-DNA).
Bei einem Versatz der Primer (B) kann hingegen auch exponentiell amplifiziert werden.
Codonsonne
Übungen zu
PCR-REAKTION,
PRIMERDESIGN
UND
KLONIERUNGS-
STRATEGIEN AM
19.11.2021
DNA-Ligation
Ligation: Kovalente Verknüpfung zweier DNA-Abschnitte über die Ausbildung einer
Phosphodiesterbindung katalysiert durch die DNA-Ligase
In der Natur dienen DNA-Ligasen zur Reparatur eines Strangbruchs der DNA, welcher z.B. bei der DNA-
Replikation entsteht, sowie bei der Beseitigung von strahlungsinduzierten Mutationen.
In der Gentechnik haben die DNA-Ligasen eine

wichtige Bedeutung in der Einbringung des Inserts
(DNA-Abschnitt, meist ein Gen) in einen Vektor
DNA-Ligation
Die DNA-Ligase katalysiert die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen der 3'-OH-Gruppe der
einen DNA-Kette und der 5'-Phosphatgruppe der anderen Kette:
DNA-Ligase
Mechanismus einer NAD-abhängigen Ligase
"NMN"-Gruppe
(Nicotinamidmononukleotid)
"AMP"-Gruppe
Nicotinamidadenindinukleotid
NAD+
Ligasereaktion
One Weiss unit is defined as the amount of enzyme

required to catalyze the exchange of 1 nmole of
32P from pyrophosphate to ATP, into Norit-
adsorbable material in 20 minutes at 37 °C. The

reaction conditions for Weiss unit definition assay
are: 66 mM Tris-HCl (pH 7.6), 6 mM MgCl2, 1 mM
DTT, 0.066 mM ATP and 3.3 µM [32PPi].
Adenosin-P-P-P + 32P-P ⇋ Adenosin-P-P-32P + P-P
ATP Pyrophosphat
Ligation mit klebrigen (kohäsiven) und glatten Enden
Die Klonierung mit kohäsiven Enden hat den Vorteil, dass die Ligation effizienter ist (da die DNA-Abschnitte
stärker wechselwirken) als mit glatten Enden. Zudem ist die Richtung des Einbaus des Gens vorgegeben,
wenn zwei verschiedene Restriktionsenzyme verwendet werden. Die Klonierung mit glatten Enden ist
vorteilhaft, wenn ohne PCR-Reaktion Gene aus einer Bibliothek oder aus einer Multiplen Klonierungsstelle
eines Vektors neu kloniert werden sollen.
Bei der Ligation mit glatten Enden wechselwirken

die DNA-Enden nur durch eine hydrophobe
Stapelwechselwirkung der Basen.
Auch in Kristallen von DNA oder Protein-DNA-
Komplexen findet sich häufig diese
Wechselwirkung.
Transformation
Als Transformation wird in der Molekularbiologie die Aufnahme von freier DNA in kompetente
Bakterienzellen bezeichnet („Kompetenz“: Die Zellen sind fähig, DNA aufzunehmen). Im Gegensatz dazu
wird die Aufnahme von DNA in eukaryotische Zellen als Transfektion bezeichnet. Bei einigen
Bakterien, etwa Escherichia coli, besteht jedoch keine natürliche Kompetenz, so dass vorbereitende
Schritte für die Transformation notwendig sind: Die Herstellung kompetenter Zellen: chemisch
kompetente Zellen und elektrokompetente Zellen. Es gibt somit zwei gängige Verfahren zur Transformation
von E. coli-Zellen: (1) chemische Transformation und (2) Elektroporation.
Mit der Aufnahme der Plasmid-DNA wird die Bakterienzelle transformiert, sie erhält neue Eigenschaften.
Daher falsch, aber häufig verwendet: „Nach der Ligation wurde die Plasmid-DNA in DH5α-Zellen
transformiert.“
Richtig: „Nach der Ligation wurden DH5α-Zellen mit der Plasmid-DNA transformiert“.
Chemische
Transformation
Die einfachste Methode zur Transformation ist der sogenannte Hitzeschock. Die Bakterienzellen werden
hierbei mit Calciumchlorid (0.1 M) behandelt, so dass zwischen der negativ geladenen DNA und der
negativ geladenen Zellmembran weniger abstoßende Kräfte bestehen. Bei einem kurzen Hitzeschock
(41–43 °C für 45–90 Sekunden) entstehen Poren in der Membran, so dass die DNA in die Zellen
gelangen kann. Diese Methode wird auch als chemische Transformation bezeichnet.
Die durch mit CaCl2-Behandlung erlangten kompetenten Zellen können bei -80°C gelagert werden.
Elektroporation
Eine weitere Methode ist die sogenannte Elektroporation. Hierbei werden die Bakterien mit einem
elektrischen Schock behandelt (2000-2500 V für einige Millisekunden), um die Membran zu öffnen.
Diese Methode ist effektiver als die chemische Methode. Allerdings muss das Medium mit den Bakterien
entsalzt werden, da es sonst zu einem Kurzschluss kommt.
Transformation
Selektion des gewünschten

Expressionsvektors
Nach der Ligationsreaktion besteht das Ligationsgemisch

neben dem gewünschten Produkt auch aus selbst ligierten
Vektormolekülen (ohne Insert) sowie falsch rekombinierten
Vektormolekülen.
Da die Transformationseffizienz klein ist, enthält jedes
transformierte Bakterium (und die aus ihm hervorgegangene
Kolonie) nur ein Plasmid in vielen Kopien.
Identifizierung des gewünschten Plasmidkonstrukts
Verdau mit BamHI / XhoI
Nach der Transformation des Ligationsgemisches werden
einzelne Kolonien von der Agarplatte mit einer Schlaufe in 3 ml-
BamHI
Kulturen (LB-Medium) überführt und über Nacht angezogen. Von
XhoI
diesen Kulturen wird dann jeweils eine Plasmidpräparation
durchgeführt. Mit einem Restriktionsverdau wird überprüft, ob pET-28a
das Plasmid ein Insert der richtigen Größe enthält. Dazu werden kmR
LacI
normalerweise die Schnittstellen gewählt, mit denen das Gen in
ori
den Vektor eingeführt wurde. Ein positiv identifiziertes Plasmid
wird dann sequenziert, um zu überprüfen, ob das Gen richtig
eingeführt wurde und keine Mutationen entstanden sind.
Gelegentlich wird alternativ auch eine Kolonie-PCR PCR-Reaktion
durchgeführt. Dazu wird eine Kolonie der Agarplatte direkt als
Templat in einer PCR-Reaktion eingesetzt, wobei als Primer
zwei Abschnitte des Gens dienen. Dadurch kann nachgewiesen
werden, dass sich das gewünschte Gen in dem Vektor befindet. pET-28a
kmR
Auch hier ist anschließend eine Sequenzierung notwendig. LacI
ori
Ligationsunabhängige Klonierungsmethoden
„Restriction free cloning“ – „Ligation free cloning“
PCR-Klonierung
(1) Durchführung einer PCR des zu klonierenden Gens. Über die Primer werden keine Schnittstellen eingeführt,
sondern an den 5‘-Enden Bereiche, die mit dem Vektor geeignet überlappen.
(2) Anschließend wird das gereinigte PCR-Produkt im Zuge einer Ligation-During-Amplification (einer PCR-
verwandten Mutagenese-Reaktion, analog Quik-Change-Mutagenese) als Megaprimer verwendet, um das
Plasmid in vitro zu synthetisieren.
(3) Abbau der Ausgangsplasmide mit DpnI. Direkte Transformation in E. coli.
Die zweite Abbildung zeigt das Verfahren in einer erweiterten Version, wobei zunächst ein Fusionskonstrukt zweier
Gene erzeugt wird.
Klonierung ohne Restriktionsenzyme und Ligation:
Die PCR-Megaprimer-Methode In einer ersten PCR-Reaktion wird der
gewünschte DNA-Abschnitt von einem
beliebigen Templat amplifiziert und es
werden an den Enden zusätzliche Anhänge
hinzugefügt, die den Bereichen des Vektors
entsprechen, zwischen denen die DNA
eingefügt werden soll.
In einer zweiten PCR-Reaktion wird dieses

PCR-Produkt als Primer (Aufgrund der Größe
auch "Megaprimer" genannt) eingesetzt. Das
Templat ist der Klonierungsvektor. Durch die
vorher frei gewählten beliebigen Bereiche
(gelb und grün) kann das Insert unabhängig
von Restriktionsschnittstellen eingeführt
werden.
Das Produkt hat Nicks (nicht gezeigt, wo?),

kann aber direkt zur Transformation
eingesetzt werden.
Proteinexpression: Expressionstest
Nachdem das gewünschte Expressionsplasmid erstellt wurde, wird ein Expressionstest
durchgeführt. Dabei wird der Expressionsstamm mit dem Plasmid in Gegenwart eines Antibiotikums
im Nährmedium auf eine Zelldichte von OD600 ca. 0,5 anwachsen gelassen. Vor der Induktion wird
eine Probe genommen. Dann wird der Induktor hinzugefügt (meist 1 mM IPTG) und es werden in
Abständen von ca. 1 h Proben genommen, um die Expression zeitlich zu verfolgen.
Die Proben (ca. 1 ml) werden dann z.B. mittels Ultraschall aufgeschlossen und durch Zentrifugation
werden lösliche und unlösliche Zellbestandteile getrennt. Von beiden Fraktionen wird eine SDS-
PAGE-Gelelektrophorese angefertigt, um zu sehen, ob das Protein löslich exprimiert wird oder ob es
unlöslich in Einschlußkörpern (Inclusion bodies) ausfällt.
Manchmal gelingt es, durch Wachstum bei 20° C oder durch Verwendung kleinerer Konzentrationen
an Induktor die Ausbeute an löslichem Protein zu erhöhen. Besonders eukaryontische Proteine
werden jedoch häufig in Inclusion bodies exprimiert, da E. coli nicht die richtigen Chaperone oder
Bedingungen für eine lösliche Expression besitzt.
Wachstumskurven der Bakterien

Bestimmung der Zelldichte über OD600
Induktion meist bei OD = 0.5 - 1.0
Induktionszeit: 2 h – 4 h, manchmal länger
Schüttelkolben oder Fermenter
Fermenter:
Zufuhr von Sauerstoff
und Nährmedium
Titration pH
Plasmid pET-28a
Stamm: E. coli BL21 (DE3) CodonPlus RIL / RP
Konstrukt: N-terminaler (His)6-Tag, T7-Tag, Thrombin-Spaltstelle
Insert: PPARα-LBD
PPARα-
LBD
(His)6- Thrombin-
Tag Spaltstelle
kmR pET-28a PPARα-LBD
LacI
T7-Tag
ori gewünschtes Konstrukt

Plasmid pET-28a
Stamm: E. coli BL21 (DE3) CodonPlus RIL / RP
Konstrukt: N-terminaler (His)6-Tag, T7-Tag, Thrombin-Spaltstelle
Insert: PPARα-LBD
PPARα-
LBD
Stopcodon
(His)6- Thrombin-
Spaltstelle TGA
Tag
kmR pET-28a PPARα-LBD
LacI
Startcodon T7-Tag BamHI XhoI
ATG
ori
Restriktionsendonukleolyse
1 2 3 4 5 6
kbp M P V I
3000
2000
1500
1000
500
BamHI SacI
P Plasmid pET-28a (ohne Verdau) XhoI
V Vektor pET-28a (BamHI / XhoI) PPARα-LBD
I Insert PPARα (BamHI / XhoI) pET-28a
kmR
BamHI / XhoI LacI
SacI / XhoI
ori
Expressionstest
Wenn das Gen auf dem Expressionsvektor sequenziert wurde und in Ordnung ist, wird ein Expressionstest
durchgeführt:
(1) Kompetente E.coli-Zellen werden mit dem Vektor transformiert, am nächsten Morgen eine Kolonie gepickt und
eine 3 ml Übernachtkultur erstellt
(2) 100 ml Zellmedium werden mit der Übernachtkultur inokuliert (angeimpft)
(3) Das Zellwachstum (37 °C, Schüttelinkubator) wird bei OD600 durch regelmäßige Probennahme verfolgt
(4) Bei OD600 = 0.5 wird die Genexpression durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert
(5) Vor der Zugabe von IPTG und in regelmäßigen Zeitabständen nach der Zugabe werden 1 ml Proben
entnommen.
(6) Die Proben werden aufgeschlossen (Zellaufschluss mit Ultraschall) und zentrifugiert
(7) Überstand und Pellet werden in einer SDS-PAGE analysiert
Expressionstest 37°C
Induktion: 1 mM IPTG bei OD595 0,6; 37°C
Stamm: E. coli BL21 (DE3) CodonPlus RIL

vI 2h 4h 6h 8h 24 h vI: vor Induktion
P: Pellet
kDa M P S P S P S P S P S P S S: Überstand (Supernatant)
250
75
50
37
25
20
15
10
"Rückfaltung": in vitro-Faltung denaturierter Proteine
Insbesondere eukaryontische extrazelluläre Proteine

mit zahlreichen Disulfidbrücken und Glykosylierung
können sich in E. coli häufig nicht richtig falten und
werden unlöslich und fehlgefaltet in Inclusion Bodies NTPDase1
(Einschlußkörperchen) exprimiert.
In diesem Fall gibt es zwei Möglichkeiten für die

weitere Vorgehensweise:
(1) Renaturierung/Rückfaltung des fehlgefalteten

Proteins SDS-PAGE
1: Gesamtzellprotein
(2) Expression in höheren Expressionssystemen 2: lösliche Fraktion
3: inclusion bodies
M: Größenmarker (kDa)
Präparation der NTPDase 1 für strukturelle

Untersuchungen
Nucleosidtriphosphat-Diphosphohydrolase 1
Extrazelluläres Enzym
Hydrolysiert ATP und ADP
4 Disulfidbrücken (orange)
Mehrere Glykosylierungsstellen (violett)
Expression der Ektodomäne in E. coli

Unlösliche Expression als cytosolische inclusion bodies - Beispiel NTPDase1
IBs
NTPDase1
Elektronenmikroskopie-Aufnahme von E. coli mit inclusion bodies
Gründe für die unlösliche Expression

SDS-PAGE
• Expressionsrate >> Faltungsrate
1: Gesamtzellprotein
• fehlende N-Glykosylierung
2: lösliche Fraktion
3: inclusion bodies • keine Ausbildung von Disulfidbrücken im
reduzierenden Cytosol
M: Größenmarker (kDa)
• Insbesondere disulfidreiche eukaryontische
Proteine werden häufig in IBs exprimiert
Renaturierung von Proteinen

Die Expression in Inclusion bodies hat jedoch auch Vorteile, z.B. wird in der Regel eine sehr
gute Ausbeute erzielt und die Inclusion bodies enthalten das Zielprotein schon in recht guter
Reinheit. Das Protein liegt in den inclusion bodies allerdings größtenteils entfaltet vor und muss
renaturiert (rückgefaltet) werden.
Dazu werden die Inclusion bodies durch eine chaotrope Verbindung wie z.B. 6 M Harnstoff
oder Guanidiniumchlorid gelöst und sind dann vollständig denaturiert. Durch Dialyse oder
schnelle Verdünnung wird die Chaotrop-Konzentration verringert, so dass das Protein sich
falten kann. In der Regel muss das korrekt gefaltete Protein dann von fehlgefalteten Spezies
chromatographisch getrennt werden. Ideal geeignet ist dazu eine Affinitätschromatographie,
mit der zwischen korrekt gefaltetem und fehlgefaltetem Protein unterschieden werden kann.
Beispielsweise die Bindung an das an der Säule immobilisierte Substrat oder Produkt eines
Enzyms.
In vitro Protein-Rückfaltung
Protein in
6 M GdmCl
Rückfaltungspuffer Vortexen
Solubilisierung oxidative ohne GdmCl
(6 M GdmCl) Rückfaltung
• Solubilisierung der inclusion bodies in 6 M Guanidiniumchlorid (GdmCl)

• Vorreinigung unter denaturierenden Bedingungen über His6-tag
• in vitro-Rückfaltung zur nativen (aktiven), disulfidverbrückten Form durch
schnelle Verdünnung in nicht-denaturierende Puffer
 Absenkung der Chaotrop-Konzentra8on (z.B. 6 M → 60 mM)
 geringe Proteinkonzentration zur Aggregationsvermeidung
(z.B. 3 mg/mL → 30 µg/mL)
• Optimierung des Faltungspuffers durch Messung der Aktivität von Enzymen

Einfluss von pH und Konzentration des
oxido-shuffling Systems
NTPDase1 NTPDase2 NTPDase3
pH-Wert
Redoxpuffer
(hier nur
Konzentration)
Glutathion (GSH)
Ergebnis der Rückfaltungsoptimierung

0,6 M NaCl 1,0 M L-Arginin 1,0 M L-Arginin
33 % Glycerol 20 % Glycerol 1,2 M NaCl
100 mM TrisHCl pH 9,0,

1 mM ox. + 2 mM red. Glutathion,
1 mM EDTA, 1 mM Benzamidin, 0,2 mM PMSF,
30 µg/mL Protein
9-14 °C 4-9 °C 4-9 °C
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Benzamidin ist ebenfalls ein

inhibiert Serinproteasen Serinprotease-Inhibitor
Rückfaltungsausbeute und -kinetik
Faltungsausbeute:
10 % 5% 11 %
Sehr langsame Faltungskinetik:

• bei 9 °C Verdopplungszeiten von 1 bis 2 Tagen
• nicht erklärbar durch Disulfidbrücken, cis/trans Peptidyl-Prolyl-Isomerisierung
Nachweis freier Thiolgruppen (Cysteine) mit ABD-F

O O
N N N N
O E O
E SH + F S NH2 S S NH2 + HF
O O
ABD-F
NTPDase NTPDase
Bovines Serum-Albumin BSA wird

als Kontrolle eingesetzt, oxidiertes
BSA enthält ein freies Cystein,
aber zahlreiche Cystinbrücken.
Fehlgefaltete Spezies enthalten

meist freie Cysteine, da dich in
der falschen Faltung nicht alle
Disulfidbrücken ausbilden können
nicht-reduziert SDS-PAGE reduziert

Kirley (1989) Anal Biochem 180, 231-236 ABD-F: 7-Fluoro-2,1,3-benzoxadiazole-4-sulfonamide
Rückfaltung und Aufreinigung der humanen 5'-NT (CD73)
Größenausschluss-
chromatographie (SEC)
nach der Rückfaltung des
in Inclusion bodies
exprimierten Proteins:
IB-Reinigung
IB-Solubilisierung
denaturierende Ni-NTA-
Affinitätschromatographie
SEC
Die Absorption bei 280 nm ist proportional zur Proteinkonzentration (blau)

Die Absorption bei 620 nm ist das Ergebnis eines Aktivitätstests des Enzyms, wobei das bei der Enzymreaktion
freigesetzte Phosphat (AMP -> Adenosin + Phosphat) über ein Addukt mit Malachitgrün nachgewiesen wird.
Im Falle der humanen 5‘-NT konnte eine effektive Aufreinigung nach der Rückfaltung durch eine AMP-Säule
erfolgen. In dieser Säule ist das Substrat AMP kovalent an das Säulenmaterial gekoppelt. Nur das korrekt
gefaltete Enzym bindet an die Säule und kann dann durch Zugabe von 10 mM AMP eluiert werden.
Fehlgefaltetes Protein bindet nicht an die Säule.
Eine Affinitätschromatographie ist in der Regel immer der erste Chromatographieschritt einer Aufreinigung. Die
Bindung sollte hochspezifisch sein. Dazu werden in der Regel kurze Peptide („Tags“) oder auch Proteine an das
aufzureinigende Protein gentechnisch fusioniert (N-terminal oder C-Terminal). Diese Tags erlauben auch eine
Detektion des Proteins in einem Western Blot (für die meisten vielverwendeten Tags (His-Tag, Strep-Tag, etc.)
gibt es kommerzielle Antikörper, die für einen Western-Blot eingesetzt werden können.
Eine Affinitätschromatographie ist in der Regel immer der erste
Chromatographieschritt einer Aufreinigung. Die Bindung sollte hochspezifisch sein.
Dazu werden in der Regel kurze Peptide („Tags“) oder auch Proteine an das
aufzureinigende Protein gentechnisch fusioniert (N-terminal oder C-Terminal).
Diese Tags erlauben auch eine Detektion des Proteins in einem Western Blot (für
die meisten vielverwendeten Tags (His-Tag, Strep-Tag, etc.) gibt es kommerzielle
Antikörper, die für einen Western-Blot eingesetzt werden können.
Affinitätstags: His-Tag
H
Ein His-Tag besteht in

der Regel aus sechs bis
zehn Histidinen Nickel-Nitriloessigsäure-Matrix (NTA-Ni)
Formel korrigieren
weitere Elutionsmöglichkeiten:
- Imidazol (häufigste Option)
- pH-Änderung
https://www.biotrend.com/kauf/cat-nickel-nta-fplc-columns-3463.html
Affinitätstags: Strep-Tag
Biotin
Streptavidin ist ein

homotetrameres Protein, das
von Bakterien der Spezies
Streptomyces avidinii produziert
wird.
Strep-Tag:
Jede der vier Untereinheiten kann mit sehr hoher Affinität (Ka ~ 1014–1015 M-1) jeweils ein
AWRHPQFGG Molekül des Vitamins Biotin binden. Die Streptavidin-Biotin-Bindung ist eine der stärksten
bekannten nichtkovalenten biologischen Bindungen. Der (artifizielle) Strep-Tag wurde durch
Strep-Tag II: evolutive Mutations-Selektions-Zyklen entwickelt und bindet ebenfalls hochaffin und selektiv
WSHPQFEK an Streptavidin. Eine Strep-Tag-Reinigung ist in der Regel effektiver als eine His-Tag-
Reinigung.
viel verwendete Tags

Affinitätstags Funktionsweise (Aufbau, Bindung, Elution) kennen
steigern häufig die Löslichkeit des Konstrukts
mAb: monoclonal Antibody, monoklonaler Antikörper: ist auf der Säule immobilisiert. Die Antikörper wurden gegen
die Peptidepitope generiert, die nun als Tag an das Protein fusioniert sind und vom mAb hochspezifisch gebunden
werden.
Affinitätschromatographie: Matrix und Elutionsbedingungen
Affinity tag Matrix Elution condition
NaCl linear gradient from 0 to 400 mM at alkaline
Poly-Arg Cation-exchange resin
pH>8.0
Poly-His Ni2+-NTA, Co2+-CMA (Talon) Imidazole 20-250 mM or low pH
FLAG Anti-FLAG monoclonal antibody pH 3.0 or 2-5 mM EDTA (da Bindung Ca2+-abhängig)
Strep-tag II Strep-Tactin (modified streptavidin) 2.5 mM desthiobiotin
c-myc Monoclonal antibody Low pH
3 M guanidine thiocyanate, 0.2 M citrate pH 2,

S S-fragment of RNaseA
3 M magnesium chloride
HAT (natural histidine affinity tag) Co2+-CMA (Talon) 150 mM imidazole or low pH
Calmodulin-binding peptide Calmodulin EGTA or EGTA with 1 M NaCl

Family I: guanidine HCl or urea>4 M
Cellulose-binding domain Cellulose
Family II/III: ethylene glycol
SBP Streptavidin 2 mM Biotin
Fused with intein: 30-50 mM dithiothreitol, -

Chitin-binding domain Chitin
mercaptoethanol or cysteine
Glutathione S-transferase Glutathione 5-10 mM reduced glutathione meist für E. coli-Expression

Maltose-binding protein Cross-linked amylose 10 mM maltose verwendet
Konstruktvarianten mit Affinitätstag

Der Linker kann auch C-
terminal platziert werden.
Oder C-terminal und N-
terminal (Vorteil: Detektion
proteolytischer Fragmente
oder ribosomaler
Translationsabbruch)
Der Linker ergibt sich meist aus dem verwendeten Vektor. Er kann aber auch die Funktion haben, dass der
Tag nicht zu nahe am Protein liegt, wodurch eine Bindung an die Säule sterisch behindert sein kann.
Proteasen zur Tag-Abspaltung
im Eluat
mit His-Tag
im Durchlauf
Einführung in die Zellkultur
Was ist "Zellkultur"?

• Als Zellkultur wird die Kultivierung tierischer oder pflanzlicher Zellen in
einem Nährmedium außerhalb des Organismus bezeichnet. Also nicht:
Bakterien, Hefen, ...
• Zelllinien sind Zellen einer Gewebeart, die sich im Lauf dieser Zellkultur
unbegrenzt fortpflanzen können (immortalisierte Zellen).
• Als Primärkultur bezeichnet man eine nicht immortalisierte Zellkultur, die
direkt aus einem Gewebe gewonnen wurde.
• Zellkulturen finden breite Verwendung in der biologischen und medizinischen
Forschung, Entwicklung und Produktion.
Anwendungen der Zellkultur
Zellbiologische Untersuchungen an eukaryontischen Zellen
• Mikroskopie
• Bindestudien
• Signaltransduktionsassays
• Vitalität/Toxizität etc.
Proteinproduktion:
• Bakterielle Zellen exprimieren das Zielprotein nicht funktionell (z.B. nur in
Einschlusskörperchen)
• Posttranslationale Modifikationen sind notwendig (insbesondere die
Glykosylierung)
Immortalisierung von Zellen

• Unter Immortalisierung versteht man in der Zellbiologie das Unsterblich-
Machen von Zellen
• Dabei handelt es sich um eine Aufhebung der Begrenzung der Anzahl von
Zellteilungen (Hayflick-Grenze); diese Zellen können sich im Gegensatz zu
gewöhnlichen Zellen beliebig häufig teilen und lassen sich in Zellkultur
unbegrenzt vermehren.
• Dieses unbegrenzte Zellwachstum kann z. B. erworben werden durch:
- Infektion mit bestimmten Viren
- Fusion mit Tumorzellen (Hybridom-Technik)
- Einwirkung mutagener Agenzien oder Strahlung
- Einschleusung von Fremd-DNA (Transfektion)
Morphologie von Zellen in Kultur
Fibroblastisch: Die Zellen sind bipolar oder
multipolar und weisen eine längliche Form auf. Sie
wachsen gebunden auf einer Substratoberfläche.
Epithelartige Zellen weisen eine polygonale Form

und eher gleichmäßige Dimensionen auf. Sie wachsen
ebenfalls gebunden auf einem Substrat in diskreten
Gruppen.
Lymphoblast-artige Zellen weisen eine sphärische

Form auf und wachsen normalerweise in Suspension
ohne Kontakt zu einer Oberfläche.
https://www.thermofisher.com/de/de/home/references/gibco-cell-culture-basics/cell-morphology.html
Kultivierungsbedingungen
Die Kultivierungsbedingungen variieren stark in Abhängigkeit vom Zelltyp.
Benötigt werden ein geeignetes Gefäß und das Wachstumssubstrat oder Medium, welches die
essentiellen Nährstoffe bereit stellt:
- Aminosäuren, Kohlenhydrate, Vitamine, Mineralien
- Wachstumsfaktoren, Hormone (Unterschied zu Medien für Bakterien)
- Gase: CO2, O2
Ein wesentlicher Unterschied ist, ob die Zellen auf einer Oberfläche wachsen (adhärente Zellen) oder
frei im Kulturmedium wachsen (Suspensionskultur).
In der Suspensionskultur sind höhere Zelldichten möglich. Adhärente Zellen sind oft stabiler.
Kultivierungsbedingungen: pH
Zellkulturmedien wird oft der pH-Indikator Phenolrot zugefügt, um

Änderungen des pH-Wertes zu überwachen. Kontaminationen
können eine Änderung des pH-Wertes verursachen: Bakterien
führen häufig zu einer Acidifizierung des Mediums.
Phenolrot
Vergleich Zellkultur mit adhärenten Zellen und in Suspension
Passagierung
Zellen werden passagiert
Kontaminationen
• Eukaryontische Zellen wachsen deutlich langsamer (Kultur über Tage statt Stunden) als
bakterielle Kulturen und erhöhte Sorgfalt in der Anwendung von sterilen Arbeitstechniken ist
notwendig, um mikrobielle Kontaminationen zu vermeiden.
• Biologische Kontaminationen können durch Bakterien, Hefen, Schimmelpilze, Mykoplasmen

(sehr kleine Bakterien ohne Zellwand) und Viren erfolgen.
Größenvergleich HEK-Zellen und Bakterienzellen, Kontamination
100 µm
HEK293 E. coli
size ~14 µm size 2 x 0.5 µm
Verschiedene Expressionssysteme:
Vorteile und Nachteile
Zelllinien für die Proteinproduktion
CHO Ovarien des chinesischen Hamsters
(Chinese Hamster Ovary)
Insektenzellen/ Baculovirus Schmetterlingsraupen Spodoptera frugiperda
(Sf9/Sf21) oder Trichoplusia ni (High Five) oder
Schneiderzellen/S2-Zellen (Drosophila
melanogaster)
HEK wichtigster Typ: HEK293
Human Embryonic Kidney
COS COS is a fibroblast-like cell line derived from
CV-1 (simian) in Origin, and monkey kidney tissue (African green monkey).
carrying the SV40 genetic material COS cells are obtained by immortalizing CV-1
cells with a version of the SV40.
Wichtigste Zelllinien: COS-1 and COS-7.
CHO-Zellen
• Als CHO-Zellen, abgekürzt von engl. Chinese Hamster Ovary, wird eine
immortalisierte Zelllinie aus Ovarien des chinesischen Hamsters (Cricetulus
griseus) bezeichnet, die in der Zellbiologie und Biotechnologie zur Produktion von
rekombinanten Proteinen Verwendung findet. Es existieren verschiedene Zelllinien mit
unterschiedlichen genetischen Veränderungen.
• Die CHO-Zelllinie ist eine der am häufigsten verwendeten Zelllinien in der

biotechnologischen Produktion von Proteinwirkstoffen wie beispielsweise
therapeutische Antikörper. Nahezu 70 % aller rekombinant hergestellten Proteine
mit Bestimmung zur therapeutischen Verwendung werden gegenwärtig in CHO-Zellen
exprimiert.
https://de.statista.com/statistik/daten/studie/312865/umfrage/arzneimittel-top-praeparate-weltweit-nach-umsatz/
monoklonaler Antikörper
LBD Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2
Kleinmolekül
Domäne des VEGF1-Rezeptors
Glykoprotein-Impfstoff
Kleinmolekül
Kleinmolekül
Kleinmolekül
mehrere Kleinmoleküle
Insektenzellen
typical size: 13-15 µm

larger after protein expression
HEK293-Zellen
Fibroblastenähnliche
Zellmorphologie
Das Baculovirus-basierte Bac-to-Bac- Baculoviren sind
Expressionssystem für Insektenzellexpression
doppelsträngig-zirkuläre
filamentöse DNA-Viren.
Sie befallen ausschließlich
Wirbellose, ihr Hauptwirt
sind Mottenlarven,
jedoch sind über 600 Wirte
beschrieben. Baculoviren
werden in der
Gentechnologie zur
Erzeugung von komplexen
Eukaryotenproteinen in
Zellkulturen sowie zur
Vektorklonierung
verwendet. Auch werden
sie in der Landwirtschaft
zur Kontrolle von
Schadinsekten eingesetzt.
https://de.wikipedia.org/wiki/Baculoviridae
Analyse von Zelldichte und Zellzustand

sowie der Transfektion und Expression durch Coexpression von GFP
Analyse der Expression des Zielproteins zu verschiedenen Zeiten nach Transfektion
durch Western Blot
Passagieren der Zellen: Transfer der Zellen in frisches Kulturmedium

s19A: soluble form of
stem cell marker protein
(five glycosylation sites)
MALDI-MS nach
Abspaltung der Glykane
N-Glykosylierung und O-Glykosylierung

weitere Monosaccharide weitere Monosaccharide
immer N-Acetylgalactosamin
N-Acetylglucosamin oder andere
GlcNAc Monosaccharide
N-Glykosylierung an Asn O-Glykosylierung an Ser oder Thr

Grundstruktur der Glykanketten
HEK293 T
HEK293 S GnTI-
N-Glykosylierung in verschiedenen Organismen: Asn-Reste innerhalb der

Erkennungssequenz Asn-X-Ser/Thr können glykosyliert werden
Wie kann die Glykosylierung beeinflußt werden?
- Mutation der Asn Reste (z.B. Asn -> Asp)
- Expression in Zelllinien, denen Glykosidasen fehlen
- Inhibierung der Glykosidasen durch synthetische Substanzen im Zellmedium
- Deglykosylierung nach der Proteinexpression
MI: α-mannosidase I
GnTI: N-acetylglucosaminyltransferase I
HEK 293S GnTI-
HEK 293T
MI: α-mannosidase I
GnTI: N-acetylglucosaminyltransferase I
Mit Endoglucosidase H oder Endo F1 spaltbar
Mit PNGase F spaltbar
Glykosylierung kann die Kristallisierbarkeit von Proteinen durch die Heterogenität der
Glykosylierung und die Flexibilität der Glykanketten stören.
Use of the endoglycosidic enzyme PNGase F (N-Glycosidase F) is the most effective method
of removing virtually all N-linked oligosaccharides from glycoproteins. PNGase F cleaves all
asparagine-linked complex, hybrid, or high mannose oligosaccharides unless the core contains
an α(1→3)-fucose. A tripeptide with the oligosaccharide-linked asparagine as the central residue
is the minimal substrate for PNGase F (see Figure 1). The asparagine residue from which the
glycan is removed is deaminated to aspartic acid (see Figure 2). The oligosaccharide is left intact
and is suitable for further analysis.
Für adhärent wachsende

HEK293-Kulturen
HEK 293S-Zellen in Suspensionskultur
Bei kleinen Gefäßen

wird der Brutschrank in
der Regel mit CO2
begast, bei größeren
Gefäßen mit viel
Gasvolumen kann die
Flasche mit CO2-Gas
befüllt und verschlossen
werden.
pHLsec – ein häufig verwendeter Vektor für die Sekretion von Proteinen
bei Expression in HEK293-Zellen
(Info nächste Folie)

from chicken receptor-type tyrosine-protein phosphatase S
AgeI
KpnI
Die Kozak-Sequenz, auch engl. Kozak consensus sequence genannt, ist eine nach der US-
amerikanischen Biochemikerin Marilyn Kozak benannte Nukleinbasen-Sequenz in der Messenger-RNA
(mRNA) eukaryotischer Lebewesen.
Sie stellt einen Konsens aus den am häufigsten vorkommenden Nukleinbasen in unmittelbarer
Nähe des Startcodons AUG auf der mRNA dar. Als Kozak-Sequenz wird oft die Basenfolge
(gcc)gccRccATGG genannt, wobei es deutliche Unterschiede zwischen verschiedenen Gruppen von
Eukaryoten gibt.
Die Kozak-Sequenz oder eine ähnliche Nukleinbasenfolge wird von den Ribosomen erkannt und ist für
den Start der Translation im Rahmen der Proteinbiosynthese von Bedeutung. Abweichungen in der
Nukleinbasenfolge können Auswirkungen auf die Proteinbiosynthese haben.
Stabile Zelllinien: DNA des zu exprimierenden Gens wurde in die genomische

DNA integriert. Vorteil: Zelllinie kann dann für lange Zeit für die
Proteinexpression genutzt werden. Oft höhere Expressionsrate als bei
transienter Expression.
Alternative (schneller):
Transiente Expression: Die Plasmid-DNA wird zunächst in E. coli produziert
und isoliert. Dann werden die Zellen transfiziert und das Protein wird transient
exprimiert. Die Plasmid-DNA kann sich jedoch in den eukaryontischen Zellen
nicht vermehren.
Schnelle Proteinproduktion
durch transiente Expression
in HEK293-Zellen
Dot blot:
Proteinlösung wird auf
eine geeignete
Membran fürs Blotting
getropft und wie beim
Western Blotting
angefärbt. Es entfällt die
gelchromatographische
Trennung und der
Transfer auf die
Blotting-Membran.
Schlechte Expressionsrate?
- Stabile Zelllinie statt transiente Expression

- Codonoptimierung: Ein höherer GC-Gehalt kann zu einer
deutlichen Erhöhung der Expressionsausbeute führen
- Andere Konstrukte (länger, kürzer), anderer Organismus (des zu
exprimierenden Gens)
- Anderes Expressionssystem

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Fakultät für Chemie und Mineralogie

Institut für Bioanalytische Chemie

Vorlesung Bioanalytische Chemie

Prof. Dr. Norbert Sträter

Zellkultur zur Proteinexpression in eukaryontischen Systemen:

Ziel der Vorlesung/Konzept

Die chemischen/biochemischen Hintergründe der Methoden sollen vermittelt

Bakterienkolonien. Jede Kolonie ist ein Klon.

1. Identische Kopien von (ganzen) Lebewesen

2. Identische Kopien eines beliebigen Abschnitts der DNA

abgeändert nach: http://www.biologie-lexikon.de/lexikon/klon.php

Das Schaf Dolly (* 5.

Nomenklatur der Bakterien

• Gattungsnamen werden groß geschrieben und als lateinisches Substantiv behandelt

• Die Bezeichnungen werden typischerweise kursiv geschrieben.

Aufbau von Bakterien (Prokaryoten)

Müller-Esterl, Biochemie, 3. Auflage

Gram-positive Bakterien Gram-negative Bakterien haben

Serin Ethanolamin Cholin Inosit

Struktur des Peptidoglycans der Zellwand

N-Acetylmuraminsäure (auch N-Acetylglucosamin (auch

Die Aminogruppe der Diaminopimelinsäure des einen Peptids

Schematische Darstellung der Mureinschicht von gramnegativen

Struktur des Peptidoglycans der Zellwand

Schematische Darstellung der

Die Aminogruppe der Seitenkette des Lysins ist an die

Schematische Darstellung der Mureinschicht von

Aufbau von Bakterien

Modul Bioanalytische Chemie

Prof. Dr. Norbert Sträter

Woher kommt die DNA?

► Isolierung genomischer bakterieller DNA aus dem kultivierten Bakterium

(1) Bereitstellen und Aufschließen des Zellmaterials

(A) Isolierung von genomischer DNA

erster Schritt: Aufbrechen der Zellen

trennt äße % und innere Zelle keine Zelten

zylindrischer Stäbchen mit runden Enden. Der

The French Press

Methoden zur Isolierung von Nukleinsäuren

Lysozym ist ein in Speichel, Schweiß, Tränen, Ohrenschmalz sowie

HEW-Lysozym besteht aus 129 Aminosäuren, mit einer molaren Masse

Katalysemechanismus des HEW-Lysozyms ↓

*Die Katalyse des Austritts einer Abgangsgruppe durch Protonierung ist

CTAB: Cetyltrimethylammoniumbromid: CTAB ist ein kationisches Tensid, das als

Proteinase K: Protease, die unspezifisch Proteine hydrolysiert

Methoden zur Isolierung von Nukleinsäuren

Lagerung der aufgereinigten DNA:

Tris (pKs = 8,2) HEPES (pKs = 7,5) MES (pKs = 6,1)

(C) Präparation von Plasmid-DNA ausgehend

Inkubation der Platte über Nacht bei 37 °C (Inkubator, Brutschrank)

über Nacht im Inkubationsschrank (37 Grad C)

Versucht einzelne Ketone

→ aus streicheln ein

Dann eintauchen und Abbkühlen

Präparation von Plasmid-DNA ausgehend von

Problematisch ist die Inokulation direkt mit der

Petrischale mit Agar

Wachstum LB Medium von FBabeterien

Lysogeny: Infektion von Bakterien durch Bakteriophagen (Viren), broth: Brühe

(1) Anzucht von Bakterienzellen in Escherichia coli

a) Phenol-Chloroform-Extraktion (klassisch aber kaum noch verwendet, hier nicht

Isolierung von Plasmid-DNA durch alkalische Lyse

Infolge des stark alkalischen