Fakultät für Chemie und Mineralogie

Institut für Bioanalytische Chemie

Modul Bioanalytische Chemie

Molekularbiologische Methoden zur rekombinanten Proteinexpression
Übungen zu den Vorlesungsinhalten

Prof. Dr. Norbert Sträter

KATALYSE-
MECHANISMUS
BETA-
LACTAMASEN
 Zwei Typen von β-Lactamasen: Serinhydrolasen und Metallohydrolasen

Sci Rep 10, 10205 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-66431-w Structure of Streptomyces albus beta-lactamase

Zwei Typen von β-Lactamasen: Serinhydrolasen und Metallohydrolasen

Vereinfacht dargestellt sind die Mechanismen der zweier Typen von β-Lactamasen.

Grundsätzlich gibt es zwei häufig verwendete Möglichkeiten der Katalyse von Hydrolysereaktionen:
(A) Ein gutes Nukleophil greift an, es bildet sich ein Intermediat, welche im zweiten Schritt durch Wasser hydrolysiert wird.
(B) Wasser greift als Nukleophil direkt die zu hydrolysierende Bindung an.
Um welche Art von Mechanismus handelt es sich in den zwei Typen von β-Lactamasen?

Weitere Fragen:
a) Typ Serinhydrolase
Welche Aufgabe hat Lys73? Ist eine Lysinrest ein typischer und gut geeigneter Rest für diese Aufgabe?
Welche Aufgabe hat das Serin? Ist es ein gut geeigneter und typischer Rest für diese Aufgabe? Welche Alternativen gibt es?
Welche Aufgabe hat Glu166 in dem Katalysemechanismus?

b) Typ Metallohydrolase
Welche Aufgabe(n) hat das Metallion in dem Mechanismus?
- Wie wirkt es?
Plasmidkonformationen

INTERPRETATION
EINES AGAROSE-
GELELEKTRO-
PHORESE-
EXPERIMENTS

Preparation von "nicked DNA" durch Nukleasen

Deutscher Ausdruck?

P39 nuclease activity on ΦX174

circular ssDNA (A) and supercoiled
pBR322 DNA (B). I, supercoiled DNA;
II, nicked DNA. Linear DNA is
indicated by the arrow. In lane T, DNA
was incubated without P39 for 15 min.

ssDNA: single stranded DNA,

Einzelstrang-DNA
dsDNA: double stranded DNA,
Doppelstrang-DNA
 Preparation von "nicked DNA" durch Nukleasen
Zeitabhängige Einwirkung der Nuklease P39 auf
A) B) Welche Eigenschaften besitzt die Protease
ΦX174 circular ssDNA pBR322
P39?

ssDNA = single stranded DNA (Einzelstrang-

DNA)

Was passiert in Experiment A) mit der DNA?

Warum werden keine Produktbanden
sichtbar?

Was passiert in Experiment B) mit der DNA?

Interpretieren Sie vor allem die
Konzentrationsänderungen der unteren drei
Banden (I, II und ◄). Die Identität der
darüber befindlichen Banden ist schwer zu
deuten.

PCR-Reaktion/Primerdesign

KLONIERUNG

Übungszettel
separate Präsentation Primerdesign
Mutageneseprimer
Die folgende Sequenz zeigt einen Ausschnitt aus dem Gen des Enzyms 5'-
Nukleotidase aus E. coli. Entwerfen Sie Vorwärts-Primer für:
1. Mutation von His-45 zu einem Alanin (H45A-Mutante)
2. Insertion der Sequenz Ser-Cys-Ser nach His-45
3. Deletion von His-45