Beruflich Dokumente
Kultur Dokumente
Molekularbiologie beschftigt sich mit der Grundlage des Lebens auf molekularer Ebene
Betrachtung der Funktion, Regulierung und Interaktion verschiedener Biomolekle
Basis der Genetik = Vererbungslehre bildet das Genom ( = Bauplan zur Bildung eines Lebewesens)
- molekulare Grundlagen der Vererbung (Molekulargenetik)
- Verteilung bestimmter genetischer Ausprgungen in unterschiedlichen Populationen
(Populationsgenetik)
- Weitergabe von Information, die nicht in der DNA gespeichert ist, an Tochterzelle (Epigeneik)
Gentechnik = Teilgebiet Biotechnologie, wo biologische Vorgnge technologisch angewendet
werden Erforschung von Methoden, deren Grundlagen Eingriffe in die Erbsubstanz bilden,
Gentechnik = technische Anwendung dieser Methoden
Zellen (Adipozyt, Myozyt, Immunzelle)
Grundeinheiten des Lebens, unterschiedlich in Form und Funktion
Alle Organismen bestehen aus Zellen
bestehen aus Makromoleklen und sind funktionelle Bausteine
Molekle (DNA, Lipid, Protein, ..) = aus Atomen aufgebaut und Zellen aus Moleklen
Gewebe (Muskel, Fett, BG) = geordnete Ansammlung hnlicher Zellen mit koordinierter Funktion
Organe = aus mehreren Geweben, die im Zusammenspiel funktionieren, sie bilden Organsysteme
(Herzkreislaufsystem) wie das Nervensystem
vielzelliger Organismus = wiedererkennbares, in sich geschlossenes Individuum, Komplexe aus Organen
und Organsystemen aufgebaut
Population = Gesamtheit der Individuen einer Art in einem bestimmten Lebensraum
Matrix
vermutlich aus Prokaryoten entwickelt
Erwachsener aus 1014 Zellen, 50 x 106 sterben pro Sekunde
stndige Neubildung
Verschiedene Lebenszyklen: Darmepithelzelle (1-2 Tage), Leber (8 Monate), Knochen (30 Jahre)
Zellkern (Nucleus)
enthlt DNA
Ort der DNA- Replikation
kleine Molekle diffundieren frei durch die Poren, Proteine z.B. brauchen bestimmte ASsequenz
(Kernlokalisierungssequenz, NLS)
Nucleolus (Zusammenbau der Ribosomen- Untereinheiten aus Proteinen und rRNA)
Kernhlle bildet ein Kontinuum mit dem ER
Kernlamina (Netzwerk aus Proteinfilamenten, das sich unmittelbar an der Innenseiet der Kernhlle
befindet und an diese angeheftet ist) steht in Wechselwirkung mit dem Chromatin und sttzt die
Kernhlle
Kernporen sind von 8 Proteinkomplexen umgeben, Proteinfibrillen auf der Kerninnenseite bilden eine
kfighnliche Struktur
Zellkern ist von Doppelmembran umgeben, typische Strukturen des Kerns = aus Doppelmembran
bestehende Kernhlle, Kernlamina, Kernporen, Nucleolus, manchmal mehrere Nucleoli
Poren = Pforte fr Protein, die aus Cytoplasma in den Kern und fr genetisches Material und
zusammengebaute Ribosomen- Untereinheiten, die aus Zellkern ins Cytoplasma
DNA + Protein = Chromatin besteht aus bestimmter Anzahl an Chromosomen (Mensch 2n = 46,
Maus 2n = 40, Nashorn 2n = 84, Hund 2n = 78)
Bei Zellteilung: Verdichtung des Chromatins, dass Chromosomen sichtbar werden
Endomembransystem aus:
Zwischenraum der Kernhlle
Endoplasmatische Retikulum:
Raues (enthlt Ribosome, Ort der Proteinbiosynthese)
glattes (chemische Modif ikation von Proteinen, Lipid- und Steroidsynthese, Glykogenabbau)
Golgi-Apparat (weitere Modif ikation, Verpacken von Proteinen in Vesikeln, Glykosylierung)
Proteinhaltige Vesikel aus ER befrdern Substanzen zur cis- Seite des Golgi-Apparat, der modif iziert
die Proteine im Lumen chemisch und verschickt sie an die korrekten Adressen
Lysosome
Transportvesikel
Golgi-Apparat und Lysosom
Lysosom in Tierzellen
Zerlegung von Makromoleklen in Monomere
Primres Lysosom (Verdauungsenzyme)
Stoffe oft von auen in die Zelle (Phagosom, Phagozytose)
1a) das primre Lysosom wird vom Golgi-Apparat gebildet
1b) Nahrungspartikel werden durch Phagozytose aufgenommen
2) das primre Lysosom fusioniert mit dem Phagosom
3) durch die Verdauung gebildete kleine Molekle diffundieren in das Cytoplasma
Cytoskelett
Halt, Reifestigkeit, Form
Fixierung von Zellorganellen in ihrer Position
tritt mit extrazelluren Strukturen in Wechselwirkung
ermglicht: rasche Transportvorgnge in den Zellen, Formvernderung und Fortbewegung,
Kontraktion
Actinfilamente
Zellbewegung
Intermedirfilamente
nur in Tierzellen
Mensch: mehr als 50 verschiedene Typen (in 6 versch. Klassen) von Intermedirfilamentproteinen
z.B. - Keratin (Haare, Ngel,...)
Verankerung von Zellstrukturen an ihrem Bestimmungsort
Widerstand gegen Zugspannungen (Desmin in Muskelzellen, Neurofilamente, )
Mikrotubuli
stabiles inneres Skelett in manchen Zellen
Bauen Schienensystem fr Motorproteine auf (Tubulin (alpha, beta), Dimere, Ketten)
Mikrotubuli- Organisationszentrum (MTOC); Centriolen
Spindelapparat
Zellteilung
Peptidbindungen
relativ starre C- N- Bindung
benachbarte - CAtome knnen nicht frei rotieren
Einschrnkungen
der Faltungsmglichkeiten
Asymmetrische Ladungsverteilung
begnstigt
Wasserstoffbrcken
hohe Anzahl an mglichen Verbindungen
Molekulare Chaperone
z.B.
Hitzeschockproteine (untersttzende Rollen in Stressphasen (Denaturierung), aber auch allgemeine
Proteinfaltung)
Tertirstruktur (Konformation)
Wechselwirkung zwischen den Seitenketten und AS
Quartrstruktur
Viele Proteine enthalten 2 oder mehr
Polypeptidketten, Selbstassemblierung
Hmoglobin
Sauerstoffbindung
Konformationsnderung
Affinitt fr Sauerstoff
Erhhung
der
Enzymklassen
EC 1 Oxidreduktasen (Dyhydrogenasen, Oxidasen, Reduktasen)
EC 2 Transferasen (bertragung von Atomen oder Moleklgruppen auf andere Substanzen, z.B.
DNA- Polymerase)
EC 3 Hydrolasen (Proteasen, Nucleasen, Phosphatasen)
EC 4 Lyasen (Lsen oder Bildung chem. Bind. z.B. Citrat- Synthase)
EC 5 Isomerasen (Neuanordnung von Bindungen innerhalb eines Molekls)
EC 6 Ligasen (Bilden Bindungen, frher Synthtasen, z.B. Pyruvat- Carboxylase)
Kohlehydrate Biologische Funktion
Transportable und speicherbare Energieform
Kohlenstoffgerst
Signal- oder Erkennungsstruktur bei vielen molekularen Prozessen
100- 100.000 Dalton
Monosaccharide: Glucose, Ribose, Fructose
Disaccharide: 2 Monosaccharide ber kovalente (glykosidische) Bindung verknpft, Saccharose,
Lactose
Oligosaccharide: 3- 20 Monosaccharide
Polysaccharide: mehrere 100 Monosaccharide (Strke, Glykogen, Cellulose, Chitin)
Monosaccharide
Glucose (C6H12O6): 4 chirale C- Atome
24 =
16 Stereoisomere (D-/ L- Glucose, D-/ LMannose, D-/ L- Galactose, )
Fructose: Strukturisomer
Disaccharide
Polysaccharide
Lipide
Hydrophobe Kohlenwasserstoffe aggregieren miteinander ( Meidung der polaren Wassermolekle)
durch schwache Van der Waals Krfte zusammengehalten
keine Polymere im engeren Sinn
wirken allerdings als funktionelle Einheit
Funktionelle Eigenschaften
Engergiespeicher
Phospholipide
Membranen
Carotinoide
Pflanzen (Einfangen von Lichtenergie)
Steroide und modif izierte FS
Hormone, Vitamine
Lipidmantel bei Nerven
elektrische Isolierung
Wrmeisolator
An der Hautoberflche
wasserabstoend
Esterbindung zwischen FS und Glycerol
Sttigung: Doppelbindungen
Knicke
bestimmen die Packung
Phospholipide
biologische Membranen (Phospholipid- Doppelschicht)
eine der FS wird durch Phosphat ersetzt
Carotinoide
Unpolare Struktur
Licht absorbierende Pigmente (Photosynthese, Frbung)
Basenpaarung
Wasserstoffbrckenbindung
RNA
Denaturierung
Hemmende Mechanismen
Wachstumsfaktoren (WF)
WF sind Proteine
Binden an spezif ische Rezeptoren an Zelloberflche
Induzieren Signalwege
Synthese von Cyclinen
Aktivierung von Cdk
PDGF (platelet derived growth factor): von Thrombozyten produziert
Wundheilung
Interleukine: zur Bildung von roten und weien Blutkrperchen aus hmatopoetischen
Vorluferzellen
Limitation der Zellteilung
Viele Zellen unterliegen einer Beschrnkung der Anzahl der Teilungen
replikative Zellalterung
Vernderungen der Telomerstruktur (repititive Wiederholung an den Enden der DNA)
bei Zellen ohne Telomerase werden die Telomere immer krzer (Hayflick Limit)
Telophase I: die Chromosomen sammeln sich in Zellkernen, die ursprngliche Zelle teilt sich
Meiose II:
Prophase II: Chromosomen kondensieren wieder nach einer kurzen Interphase, in der die DNA nicht
repliziert wird
Metaphase II: die Centromere der Chromosomen ordnen sich in jeder Zelle in der quatorialebene an
Anaphase II: die Chromatiden trennen sich und werden eigenstndige Chromosomen, sie werden zu den
entgegengesetzten Polen gezogen. Aufgrund des Crossing- overs und der unabhngigen Verteilung erhlt
jede neue Zelle eine andere genetische Ausstattung
Telophase II: die Chromosomen sammeln sich in neuen Zellkernen und die Zellen teilen sich
Endergebnis: jeder Zellkern der 4 Tochterzellen trgt einen haploiden Chromosomensatz
bei der Meiose werden die 2 Chromosomenstze auf 4 Tochterzellen aufgeteilt, jede erhlt halb so viele
wie die ursprngliche Zelle
4 haploide Zellen
Unterschiedliche Lebenszyklen
Pflanzen
Abbildung 4: Deutung
Deutung der Ergebnisse:
Unformittsregel (1. Mendelsche Regel): Kreuzt man 2 reinerbige Eltern, die sich nur in einem Merkmal
unterscheiden, so sind die Individuen der F1 Generation phnotypisch und genotypisch gleich.
Spaltungsregel (2. Mendelsche Regel): Kreuzt man Individuen der F1 Generation, so gehen daraus
Nachkommen hervor, die sich einem bestimmten Zahlenverhltnis aufspalten.
Abbildung 5: Ergebnisse
Abbildung 6: Rckkreuzungsexperimente
Abbildung
Unabhngigkeitsregel (3. MR)
Dihybridkreizungen aus der F2 Generation
Unabhngige Segregation von S/s und Y/y
Auftreten der Phnotypen im Verhltnis 9:3:3: 1
(nicht mehr allg. gltig)
7: Trennung Allele
G- 6- PD- Mangel,
Hmophilie A und B
(Bluterkrankung),
Muskeldystrophie, RotGrn- Blindheit
familire phosphatmische
Rachitis
Codominanz
beide Formen treten in der
heterozygoten Form auf
AB0 Locus (Glykoproteine,
Oberflche der Erythrozyten)
Struktur der DNA
Watson/ Crick/ Frankling
Doppelhelix
Antiparallele Strnge
Rechtsgngige Helixachse
Nucleotidbasen im Inneren
Chargaff Regel
(Anzahl Purine = Anzahl
Pyrimidine)
Pyrimidin
Purin
Basenpaarung
DNA- Polymerase
1. die Primase bindet an den Matrizenstrang und synthetisiert einen RNA- Primer
2. Sobald der Primer fertig gestellt ist, wird die Primase freigesetzt, die DNA Polymerase bindet und
synthetisiert neue DNA
Telomer- Replikation
DNA Reparatur:
a) DNA Korrekturlesen
1. whrend der DNA Replikation kann eine falsche Base in die wachsende Kette eingebaut werden
2. die Proteine des Replikationskomplexes schneiden die falsche Base sofort heraus
3. die DNA Polymerase fgt die richtige Base ein, die Replikation wird fortgesetzt
b) Fehlpaarungsreparatur
1. es kann zu einer Basenfehlpaarung kommen
2. die Fehlpaarungsreparaturproteine schneiden die fehlgepaarte Base und benachbarte Basen heraus
3. die DNA Polymerase fgt die richtige Base ein
4. im letzten Schritt repariert die DNA Ligase den verblieben Strangbruch
c) Excisionsreparatur
1. eine Base wird beschdigt, ist funktionslos
2. die Excisionsreparaturproteine schneiden die beschdigte Base und benachbarte Basen heraus
3. die DNA Polymerase fgt die richtigen Basen durch 5'
3' Replikation des kurzen DNA Abschnitts ein
Informationsfluss von der DNA zum Protein
Transkription: die Information eines Genes (einer DNA- Sequenz) wird auf eine komplementre
RNA- Sequenz berschrieben
Translation: die RNA- Sequenz dient als Vorlage fr das Polypeptid
DNA
(Transkription)
RNA
(Translation)
Protein
Einbau
RNA (Ribonucleinsure)
Einzelstrngig
Zucker = Ribose
Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil (statt Thymin)
mRNA (Transkript): Info von der DNA zum Ort der Proteinbiosynthese (Ribosom)
tRNA: trgt AS zum Ribosom
rRNA: Katalysiert die Bildung der Peptidbindung
Wo Genexpression?
Transkription und Prozessierung im Zellkern
Translation im Cytoplasma
Transkription
Initiation
startet am Promotor (spezielle DNA- Sequenz, Initiationsstelle)
Promotor richtet die RNA Polymerase aus (welcher Strang soll abgelesen werden)
Elongation
RNA- Polymerase entspiralisiert die DNA
Ablesen der DNA in 3'
5' Richtung
Neue Nukelotide werden ans 3' Ende gehngt
Keine Korrekturlesefunktion
Fehler (1:104 bis 105)
Termination
1. kleine nuclere Ribonucleoproteinpartikel binden an die Consensussequenzen in der Nhe der 5'
und 3' Spleistelle
2. durch Wechselwirkungen zwischen den beiden snRNPs und anderen Proteinen bildet sich ein
Spleiosom
3. Zwischen den 5' Exon und dem Intron erfolgt ein Schnitt
4. Nach dem ersten Schnitt am 5' Ende bildet das Intron einen geschlossenen Ring, hnlich einem
Lasso
5. die freie 3' OH Gruppe am Ende des geschnittenen Exons reagiert mit der 5' Phosphatgruppe am
anderen Ende
6. das 3' Exon wird geschnitten und das 5' Exon gespleit; danach wird die reife mRNA fr die
Translation exportiert
7. das gespleite Intron wird im Zellkern abgebaut
Alternatives Spleien
Wobble Effekt
Nicht 64 verschiedene tRNAs
Spezif itt am 3' Ende des Codons wird nicht immer genau eingehalten
GCA, GCC und GCU werden von derselben tRNA erkannt ABER: nur jede tRNA trgt eine
bestimmte AS
Kopplung der tRNA mit AS
1. das Enzym aktiviert die AS, indem es eine Reaktion mit ATP katalysiert, sodass eine energiereiche
AMP- AS und ein Pyrophosphation entstehen.
2. Das Enzym katalysiert eine Reaktion der aktivierten AS mit der richtigen tRNA.
3. Die Spezif itt des Enzyms stellt sicher, dass die richtige AS mit der zugehrigen tRNA
zusammengebracht wird.
4. Die beladene tRNA bringt bei der Translation die passende AS zum sich verlngernden
Polypeptidprodukt.
Ribosom
Tausende Ribosomen pro Zelle, d = 25nm
4,2 x 106 Dalton
Groe und kleine Untereinheit:
Groe UE: 3 verschiedene rRNAs + 49 Proteinmolekle
kleine UE: 1 rRNA + 33 Proteinmolekle
3 Stellen an denen tRNA binden kann (Codon- Anticodon- Wechselwirkungen zwischen tRNA und
mRNA nur zwischen P- und A- Stelle)
A: Aminosure Stelle
P: Polypeptidstelle
E: Exitstelle
sind unregelmig geformt
Translation
Initiation
1. die kleine ribosomale UE bindet an ihre Erkennungssequenz auf der mRNA
2. die mit Methionin beladene tRNA bindet an das Startcodon AUG und vervollstndigt damit
den Initiationskomplex
die groe ribosomale UE tritt zum Initiationskomplex hinzu, sodass die mit Methionin
beladene tRNA jetzt die P- Stelle besetzt
Elongation
Erkennen des Codons: Anticodon einer ankommenden tRNA bindet an das Codon, das an
der A- Stelle zugnglich ist
Bilden der Peptidbindung: Pro wird durch die Peptidyltransferase- Akitivitt der groen UE
mit Met verknpft
Elongation: Whrend sich das Ribosom um ein Codon weiterbewegt, gelangt die freie tRNA
in die E- Stelle und wird dann freigesetzt; das wachsende Polypeptid bewegt sich zur PStelle.
Wiederholung
Termination
Binden eines Release- Faktors (Stopp Codon) an den Komplex, wenn ein Stoppcodon an
die A- Stelle gelangt.
Freisetzung der tRNA aus der P- Stelle und trennt das Polypeptid ab.
Zerfallen der UE
Polysome
Mehrere Ribosomen knnen gleichzeitig aktiv sein
Vielzahl an Kopien des Proteins werden erzeugt
Poly(ribo)som
die Polypeptide wachsen weiter whrend die Ribosomen zum 3' Ende der mRNA wandern
Bestimmungsorte der
Proteine
Bestimmungsort: Zellkern
z.B. Histonproteine
Kernlokalisierungssequenz (- Pro Pro- Lys- Lys- Lys- Arg- Lys- Val-), NLS (nuclear localisation
signal)
Signalsequenz bindet an Docking Protein (an der ueren Membran des Organells bedindet)
Bildet nach Bindung einen Kanal
Bestimmungsort: ER
15- 30 hydrophobe AS
Translation unterbrochen und Ribosom wird zum ER gelenkt
Signalsequenz bindet an Signalerkennungspartikel (SRP)
Blockiert Synthese bis Ribosom an Rezeptorprotein in der Membran des rauen ER gebunden hat
Bildung eines Membrankanals
Fortsetzung der Proteinsynthese
Protein
ER
Golgi- Apparat
endgltiger Bestimmungsort
Punktmutation
Chromosomenmutation
Deletion: durch Verlust eines Chromosomenabschnittes
Duplikation mit Deletion: wenn homologe Chromosomen an 2 ungleichen Stellen zerbrechen und die
Abschnitte austauschen
Inversion: wenn ein herausgebrochener Abschnitt in umgekehrter Orientierung wieder eingefgt wird
reziproke Translokation: wenn nicht- homologe Chromosomen Abschnitte austauschen
Genommutation
Vernderung der Anzahl der Chromosomen: Trisomie 21
Positive Regulation: die Bindung des Aktivatorproteins stimuliert die Transkription
Negative Regulation: die Bindung des Repressorproteins blockiert die Transkription
Regulierung der Genexpression
Epigenetische Vernderungen
DNA- Methylierung
meist neben CpG Inseln
stark methylierte Gene in der Regel inaktiver
Histonmodif ikationen
die Modif izierung der Histone durch die HistonAcetyltransferase lockert die Befestigung des
Nucleosoms an der DNA
Remodeling- Proteine binden und lsen die
Nucleosomenstruktur auf
dann kann der Transkriptionskomplex binden und die
Transkription beginnt
Genomische Prgung
fr jedes Geschlecht spezif ische Methylierungsmuster
Gen bei Mann aktiv, bei Frau inaktiv
Signaltransduktionswege
Umsetzen eines extrazellulren Signals in eine zellulre Reaktion
Signale knnen physikalischer (Licht, Schall, ..) oder chemischer Natur sein
STW regulieren beinahe alle bekannten zellulren Prozesse
Steuerung krperlicher Funktionen ber Botenstoffe
Nervensystem
Hormonsystem
Immunsystem
Grundschema der Signaltransduktion
Rezeption
Transfer in das Zellinnere
Signalamplif ikation
Rezeptor- Guanylatzyklasen
Rezeptoren ohne instrinsische Enzymaktivitt: Zytokinrezeptoren
Zytoplasmatische Rezeptoren
Nuklere Rezeptoren
Lsliche Guanylatzyklase- Rezeptoren
Ionenkanle
Transmitter- kontrollierte Ionenkanle
Acetylcholin- kontrollierte Kationenkanle
Serotonin- kontrollierte Kationenkanle
Glutamat- kontrollierte Kationenkanle
GABA- kontrollierte Cl- Kanle
Glycin kontrollierte Cl- Kanle
Spannungsunabhngige Ionenkanle
Vernderungen im Membranpotenzial
Na+, Ca2+, K+ Kanle
Ionenkanal
Gesteuerter Ionenkanal (Acetylcholinrezeptor)
fr Na- Ionen
aus 5 UE
steuert Membranpolaritt
1. 2 Acetylcholinmolekle binden an AchR- UE, wodurch sich die Struktur des Kanals ndert und er
sich ffnet.
2. Der Kanal ist mit negativ geladenen AS ausgekleidet, sodass es Na + - Ionen mglich ist, in die
Zelle zu strmen.
3. Die Na+ - Zunahme in der Zelle fhrt zur Muskelkontraktion.
G- Protein gekoppelter Rezeptoren
G- Protein fungiert als Vermittler zwischen Rezeptor und Effektor
1. Die Bindung des Hormons an den Rezeptor aktiviert das G- Protein. GTP ersetzt GDP.
2. ein Teil des aktivierten G- Proteins aktiviert ein Effektorprotein, das Tausende von Reaktanden in
Produkte umwandelt und so die Aktivitt eines einzigen Signalmolekls verstrkt.
3. Das GTP am G- Protein wird zu GDP hydrolisiert, bleibt aber am Protein gebunden.
GTP bindende Proteine
Heterotrimere G- Proteine
Kleine G- Proteine (Ras, Rho, Arf, Ran)
Cofaktoren der Translation (Initiationsfaktor elF2a, Elongationsfaktor eEF1a, Translokationsfaktor
elF2a)
G- Protein-gekoppelter Rezeptor
aus 3 UE ( , , )
knnen zwischen aktivem (GTP) und inaktivem GDP Zustand wechseln
ca. 1000 verschiedene GCPs (50% zur Erkennung von Geruchsstoffen)
Struktur
Aktvierung
Nach Aktivierung
Dissoziation
Vermittlung des Signals an Effektorproteine (Adenylatcyclase oder Phospholipase C)
Bildung von second messengers (cAMP, DAG, IP3) und/ oder Beeinflussung von Ionenkanlen
Adrenorezeptor Signaling
Adrenalin/ Noradrenalin
Fight-and-Flight- Reaktion
Stimulation der Herzaktion
Erhhung des Blutdrucks
Bereitstellung von Glucose und FS
Drosselung der Verdauungsaktivitt
Adrenorezeptoren (Adrenerge Rezeptoren)
- Rezeptoren ( 1-3)
- Rezeptoren ( 1, 2 )
Adrenorezeptor Signaling
Kleine G- Proteine
1.
Ein Wachstumsfaktor bindet an seinen Rezeptor, der
sich selbst phosphoryliert
2.
der aktivierte Rezeptor lst eine Kette von Ereignissen
aus, durch die Ras GTP binden kann und aktiviert wird
3.
das aktivierte Ras bindet an Raf und aktiviert es
4.
das aktivierte Raf ist eine Proteinkinase, die viele MEKMolekle phosphoryliert.
5.
Das aktivierte MEK- Protein ist eine Proteinkinase, die
viele Molekle der MAP- Kinase phosphoryliert.
6.
Wenn die MAP- Kinase durch Phosphorylierung
aktiviert, wurde, kann sie in den Zellkern gelangen
Signaltransduktion & Krebs
Ras = G- Protein, das Zellteilung reguliert
Dauerhafte Aktivierung bei einigen Tumorarten
Zellteilung
unkontrollierte
b) Dimerisierung
c) Transphosphorylierung
d) Bindung von Adapter- und Substratproteinen
Spezif itt
Signaldiversif izierung durch Homo- und Heterodimere von PDGF und PDGFR
Insulinrezeptor
Heterotetramer (2 extrazellulre - UE, 2 transmembrane - UE)
Insulinrezeptorsubstrat 1
PI3K
PDK- 1
PKB oder PKC (z.B. GLUT4 Transport zur
Membran)
Serin/ Threonin Kinasen
TGF- Pathway (Hemmung der Zellteilung in differenzierten Zellen)
BMPs (Bone morphogenic proteins, induziert Differenzierung von Knochenzellen)
Zytokinrezeptoren
wichtig v.a. Im Immunsystem
Zytokin bindet gleichzeitig an 2 Rezeptorketten
Dimerisierung
Viele unterschiedliche Zytokine und Rezeptoren, aber Familien mit gleichen UE
JAK- STAT- Signalweg
JAK (Janus- Kinasen)
Transaktvierung + Phosphorylierung an Tyrosinresten
STAT (signal transducers and activators of transcription)
Zytoplasmatischer Rezeptor
z.B. Cortisonrezeptor
an ein Chaperonprotein gebunden
bei Bindung von Cortison
Eindringen in Zellkern
Bindung an DNA
Zyklische Nukleotide
cAMP
cGMP
aus GTP (katalysiert von Guanylatcyclasen)
Geftonus der glatten Muskelzelle
Phospholipidderivate
Phosphatidylinostiol an der Membran
Phosphorylierung durch PI3K (Phosphatidylinositol- 3- kinase)
PI3P (- phosphatase)
Signalfunktion ber PKB (Protein- Kinase B)
Phospholipase C
PIP2
DAG + IP3
DAG
Protein- Kinase C
IP3
Mobilisierung von Ca- Ionen
Sekundre Messenger IP3/ DAG
Phospholipase C spaltet Phopholipid (PIP2) in IP3 und DAG
1. Der Rezeptor bindet an das Hormon.
2. die aktivierte UE des G- Proteins dissoziiert und aktiviert die Phospholipase C.
3. das aktivierte Enzym produziert die sekundren Messenger DAG und IP3 aus PIP2
4. IP3 ffnet Ca2+- Kanle.
5. DAG und Ca2+ aktivieren die Proteinkinase C (PKC).
6. Die PKC phosphoryliert Enzyme und andere Proteine
Signaltransduktion
Hintereinanderschaltung von Signalen
Signalkaskade
Steuerung vieler physiologischer Prozesse
postitive und negative Signale
Vernderung der Enzymaktivitt
Sinneswahrnehmung
RTK- Signalkaskade
keine Glykogenreserven
Glutamat
Lichtantwort: Signalkaskade
Abbau von cGMP, CNG schliet, K- Ausstrom berwiegt
Hyperpolarisierung
signalisiert Licht
Endokrine Regulation
Signaltransduktion
Regulierung Genexpression
1. Remodelling des Chromatins
2.
Kontrolle bei der Transkription
3.
Kontrolle durch Prozessierung
4.
Kontrolle durch Transport
5.
Kontrolle durch Stabilitt der
mRNA
6.
Translationale Kontrolle der
Proteinsynthese
7.
posttranslationale Kontrolle
der Proteinaktivitt
8.
Proteinabbau
Transkriptionsfaktoren binden
an der TATA- Box an den
Promotor
RNA- Polymerase II bindet
Weitere Transkriptionsfaktoren
kommen dazu
Beginn der Genexpression
Acetyl- Lysin
Ladungsnderung
Agouti Mausmodell
Folat
Genetische Prgung
fr eine kleine Anzahl von Genen ist es wichtig, ob sie vom Vater oder von der Mutter vererbt wurde
Vterlich vererbte Kopie aktiv, whrend die mtterliche Kopie still gelegt wurde
Genomic
imprinting
Chromosom 15, Region 15q11
unterschiedliche Prgung in den weiblichen und mnnlichen Gameten
Chromosomale Deletion
nur weibl. Oder mnnliches Prgungsmuster wird vererbt
Nur Mnnliches Muster vorhanden: Angelman- Syndrom (Epilepsie, Tremor, stndig lachender
Gesichtsausdruck)
nur weibliches Muster vorhanden: Prader- Willi- Syndrom (Muskelschwche, Fettleibigkeit)
Inaktivierung des X- Chromosoms
Euchromatin (aktive DNA) Heterochromatin (kondensiert)
weibliches Individuum 2 X- Chromosomen, mnnliches Individuum nur 1 X- Chromosom
Inaktivierung einer Kopie des X- Chromosoms bei weiblichem Embryo (Barr- Krperchen, stark
methylierte DNA)
MicroRNAs (miRNAs)
TCF7L2 (TCF4)
Transkriptions Faktor 4
Wnt signaling pathway
Assoziiert mit DMT2
Mediterrane Dit und (Epi-) Genetik
Polymorphismus
Risiko
Epigenetische Mechanismen
DNA Methylierung
Histon Modif ikation
miRNA Expression
FS- Zusammensetzung
Studienteilnehmer
TMD (Traditional Mediterranean Diet)
VOO (virgin olive oil, polyphenols
328mg/kg)
WOO (washed olive oil, polyphenols
55mg/kg)
Intervention (5 Wochen)
hard gelatin capsule containing
6.3 mg reservatrol (daily dose
equivalent to 4l red wine)
tomato extract containing
3.75mg lycopene (like 500ml
tomate juice)
94.5mg green tea extract
90.7mg a- tocopherol
125mg vitamin C
soft gel capsule containing
1200mg cold water fish oil (380mg EPA, 260mg DHA, 60mg other polyunsaturated fatty
acids)
Placebo contained
365mg microcrystalline cellulose
1360mg soy lecithin
Nutrigenetik: Zusammenhang zwischen genetischer Varianz und ihre Auswirkung auf ernhrungsbedingte
Prozesse
Nahrungsbedingt Einflsse
Genotypisierung:
meist Zellen der Mundschleimhaut oder Blutzellen
Identif ikation von genetischen Varianten
Kandidatengene (ernhrungsrelevante Gene)
Arrays, Sequenzierung (genomweite Assoziationsstudien)
vom Human Genome Project zum HapMap- Projekt
Sequenzierung von 1000 Personen (unterschiedliche Ethnien und geographische Regionen)
SNPs in kodierenden Regionen mit einer Hufigkeit >1% werden katalogisiert
Haplotypen
Genetische Varianten/ Polymorphismen
Single Nucleotid Polymorphismen (SNPs)
ca. 2/3 der SNPs durch Austausch von Cytosin durch Thymin (Cytosin hufig methyliert (5Methylcytosin)
spontan auftretende Desaminierung
Thymin)
Insertion/ Deletion
Tandemrepeats
Copy number variations
kodierende Gene knnen mehrfach bzw. unterschiedlich hufig im Genom vorkommen
Ernhrungsrelevante SNPs
Lactase
Neugeborene: Lactase- Phlorizin- Hydrolase (LPH)
Verwertung der Lacots (Muttermilch) als KHquelle
Bleibt nicht bei allen Menschen erhalten:
Lactoseintoleranz (ausgeprgte geographische Verteilung v.a. Sdliche Hemisphre, OAsien)
Lactasepersistenz v.a. In Nordeuropa (geht in Hand mit der Domestizierung von Rindern von
ca. 5000 Jahren
Selektionsvorteil)
Minichromosome Maintenance Gene 6 (MCM6)
LCT 1390 C > T Polymorphismus zu 90% mit dem Auftreten Lactasepersistenz assoziiert, aber 35%
hheres Risiko fr bergewicht
Speichel- Amylase (AMY1)
K a nditatengenansatz
Genetische Determinanten
Sensor fr Nhrstoffangebot
je nach Nhrstoffangebot Anpassung der Zellen
Koordinierung von anabolen (energieverbrauchenden) und katabolen (-gewinnenden) Prozessen
mTOR Signalweg im Zentrum dieser Prozesse: frher: Mammalian Target of Rapamycin, heute
Mechanistic
Grundstzlich
Nhrstoffreiche Umgebung
Aktivierung von mTOR und damit von anabolen Prozessen
(Protein-, Lipid-, Nukleotidsynthese), Inhibierung von katabolen Prozessen (Autophagie)
Nhrstoffarme Umgebung
Inhibierung von mTOR
mTOR: Serin/ Threonin Kinase
mTORC1: Zellwachstum
Protein-, Lipid-, Nukleotidsynthese
Inhibierung von Autophagie
Substrate: Ribosomale S6 Kinase (S6K), Translations- Initiierungsfaktor 4E
Bindungsprotein (4E BP)
mTORC2:
Actinpolymerisation
Phosphorylierung von Akt, PKC , SGK
Nicht sensitiv fr Rapamycin
Glucose und Energieregulation
fr anabole Prozesse ist ATP notwendig
aus Glucose
Verringerung der Glucose oder der mitochondrialen Atmung
Intrazellulre ROS
Antioxidative Verteidiung
Nf B- Signalweg
Transkriptionsfaktor
Weitgehend in allen Zelltypen experimentiert
Vielzahl von Stimuli
Westenliche Rolle bei Immunantwort, entzndlichen Prozesse, Stessantwort,
ROS- Nf B Crosstalk
Nf B Aktivierung
Leukozyten
Akutphaseproteine: Hs- CRP, Serum amyloid A (SAA)
Gerinnungsfaktoren: Plasminogen Activator Inhibitor 1, Fibrinogen
Pro- inflammatorische Zytokine: TNF- a, IL1- b, IL6
Inflammation und Fettgewebe
+ EDTA)
Strstoffe
Grundlegende Schritte:
Lyse (Aufbrechen der Zelle/ Zellkerns) & Homogenisierung (Detergenz)
Denaturierung von Proteinen und Nukleoprotein- Komplexen (Protease/
Denaturierungsagenz)
Inaktivierung von endogenen Nukleasen (sog. DN asen)
Isolierung und Aufreinigung der DNA (Abtrennung von Proteinen, RNAs, )
Denaturierungssubstanzen
ionische Detergentien (SDS) brechen hydrophobe Bindungen und Wasserstoffbrcken auf
Chaotrope Reagenzien (Harnstoff, Guanidinhydrochlorid, Phenol) entfernen Hydrathllen von
Biomoleklen, pos. geladene Salze knnen Salzbrcken bilden
Reduzierende Agenzien zum Aufbrechen von Disulf idbindungen
Salze interagieren mit geladenen Gruppen und erhhen die Proteinlslichkeit
Wrme bricht Wasserstoffbrckenbindungen und unpolare Bindungen auf
(Protease (Proteinase K) und RN ase)
Mglichkeiten zur Abtrennung von Proteinen und Zellrckstnden:
Organische Extraktion
DNA ist polar (neg. geladen durch Phosphatrckgrat)
unlslich in organischen LM
Traditoniell: Phenol/ Chloroform Extraktion
DNA
wssrigen Phase (oben)
Denaturierte Proteine
organische Phase
(unten)
1:1 Phenol: Chloroform oder 25: 24 : 1
Phenol: Chloroform : Isoamyl- Alkohol
Phenol: denaturiert Proteine
Bildung einer
festen Interphase zwischen organischer und
wssriger Phase
Chloroform: erhht die Dichte der
organischen Phase
Isoamyl- Alkohol: verhindet Schaumbildung
Aussalzen/ Ethanolfllung
am hufigsten verwendet
70% EtOH (1 vol DNA Lsg + 2vol 96% (v/v)
Ethanol
Ethanol entzieht der DNA die Hydrathlle,
neg. geladene Phosphatgruppen bilden z.B.
mit Na+ ein Salz
DNA wird przipitiert
Reinigungschritt
unerwnschte Stoffe werden entfernt
DNA/ RNA wird konzentriert
berfhrung in neuen Puffer mglich
Isopropanolfllung
Finale Konzentration 40-50%
Hufig eiskalt, 30 min. bei -20
Zentrifugation
waschen mit 70%
Ethanol
Zucker und NaCl
werden mitgefllt
nicht so effizient
PEG (Polyethylenglykol)
Fllung
schwer zu entfernen
strt viele Enzymreaktionen
Selektive Bindung von DNA an
Hilfsmaterial
Anionenaustauscher
(Dextran, Cellulose mit
pos. geladenen
Gruppen): Strke der
Bindung fr DNA, RNA
und Proteine ist
unterschiedlich und vom pH
und der Ionenstrke des
Puffers abhngig
Silikat Sulchen: binden in
der Gegenwart hoher
Konzentrationen chaotroper
Salze spezif isch DNA, die
nach dem Waschen
problemlos mit H2O oder TePuffer eluiert und direkt
weiterverwendet werden
kann
+ Schnell, einfach, keine org.
LM, automatisierbar
- DNA Fragmentierung
Vielzahl an Kits
meist spezif isch fr bestimmte
Gewebe/ Ausgangsproben
fr verschiedene Gren (Mini/ Midi/ Maxi Preps)
Low budget- Marktfhrer
Automatisierung
RNA- Isolierung
hnliche Prinzipien wie bei DNA Isolierung
Aber: hohe Sensitivitt gegenber RN asen
Handschuhe
eigener Laborbereich
eigene Reagenzien (RN ase frei, nur fr diesen Zweck)
Autoklavieren von Gefen, dann backen
Ev. Verwendung von Gefen von DEPC vor dem Autoklavieren
asen, zerfllt in H2O und EtOH
DEPC Behandlung
Inaktivierung der RN
Qualittsbestimmung
Polymerasekettenreaktion (PCR)
Prinzip der PCR
Denaturierung: Trennung der
doppelstrngigen Ausgangs- DNA
(Template DNA)
Anlagerung (Annealing): kurze DNAStcke (Primer, Sense- Antisense)
lagern sich an komplementren
Sequenzen der Ausgangs- DNA an
Elongation (Extension):
Thermostabile DNA Polymerase
baut die vorhandenen dNTPs
komplementr zur Ausgangs- DNA
beginnend bei den Primern ein
(72C)
Thermostabile DNA- Polymerasen
notwendig, damit man nicht nach
jedem Denatuierungsschritt die
Polymerase neu zugeben muss
Saiki et. al. Thermus aquaticus (thermostabiles grampos.
Bakterium, heie Quellen)
Taq Polymerase
Vielzahl an Polymerasen
Proofreading Polymerase (mit Exonuclease Aktivitt)
PhusionTM (fusioniert mit dsDNA Bindedomne
sehr
lange Amplif ikate und hohe Synthesegeschwindigkeit)
Puffer und Primer
blicher Weise vom Hersteller der Polymerase mitgeliefert
Tris- Hcl
MgCl2, Kcl
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Primer (DNA- Stcke)
Typischer Weise zwischen 15 und 30 Basen lang (-150
Basen)
selbst designed
kommerziell erhltlich
Annealing Temperatur 3-5C unter der Schmelztemp.,
ergibt ishc aus Basensequenz und Lnge des Primers
PCR Gerte
Thermocycler: zyklisch arbeitende Thermoelemente
Gradientcycler: Temperaturbereich (z.B. wenn die genaue
Annealingtemp. Unbekannt ist)
Speedcycler: schnellere Heizraten (10C/s statt 2C/s)
Gradienten PCR:
mehrere gleiche PCR Anstze
Annealing Temp. Fr jede Probe unterschiedlich
Nested PCR:
wenn unspezfische Amplif ikate auftreten
bei niedriger Effizienz der Amplif ikation
erste PCR wie Standard PCR
1/10 bis 1/100 der des ersten PCR Ansatzes fr 2. PCR mit
neuen Primern, die innerhalb des
amplif izierten DNA- Bereiches liegt
Multiplex PCR
verschiedene Breiche der Ausgangs DNA durch
unterschiedliche Primerpaare amplif iziert
Reverse Transkriptions PCR (RT- PCR)
2 Reaktionen, die nacheinander im gleichen
Reaktionsgef stattfinden
Reverse Transkription (Reverse
Transkriptase wandelt RNA in cDNA
(complementary DNA) um
PCR: Amplif ikation der cDNA
Quantitative PCR (qPCR)
Thermocycler + Fluereszenzphotometer
Messung der Menge der gebildeten DNA schon whrend der Amplif ikation in Echtzeit am Ende jedes
Zyklus (Real time PCR), bei herkmmlicher nur am Ende der Gesamtreaktion (Endpunkt PCR)
Kombination von RT und qPCR erlaubt die Quantif izierung von mRNA
Fluoreszenzfarbstoffe
SYBR Green (unspezfisch)
TaqMan (spezif isch)
Weitere Methoden
Identif ikation einer bestimmten Nukleinsure aus einem Gemisch an Nukleinsuren
Southern Blot (DNA)
Proteinaufreinigung
Homogenisation
Extraktion von Proteinen
Dialyse und Konzentrierung
Weitere Aufreinigungsschritte
Quantif izierung von Proteinen
Ausgangsmaterial?
Welche Menge des Proteins wird
bentigt?
Wie rein muss das gesuchte
Protein sein?
Muss das Protein noch
biologisch aktiv sein?
Vorerfahrung (eigenes Labor,
Literatur)?
Aufschlussverfahren
mechanisch und nicht
mechanisch
Proteasen & Phenoloxidasen
Bauen Proteine ab (Hydrolyse der Peptidbindung)
Endopeptidasen (Trypsin Arg, Lys; Chymotrypsin
Trp, Tyr, Phe; Pepsin, )
Exopeptidasen (nicht spezif isch, bauen Proteine vom Ende her ab)
uerst stabil
normale Funktion: Abwehr von Phatogenen
interagiert)
Affinittschromatographie (sehr spezif ische Interaktionen z.B. Enzym Ligand)
Gelf iltration (porse Matrix, groe Mol wandern schnell durch, kleine verfangen sich
in der Matrix)
Detektion der Proteine (Chromatogramm)
UV- Detektor
Fluoreszenzdetektor
Quantif izierung
Absorption bei 280nm
ungenau
Farbstoffe, die mit Protein reagieren
Proteinbestimmung nach Bradford: Bindung von Coomassie Brilliant Blue an Proteine (eig.
Arg) Absorptionsmax. Bei 595nm
Proteinbestimmung nach Lowry
BCA- Test (Bicinchoninsure): Proteine bilden mit Cu2+ im alkalischen Milieu einen
Komplex, Reduktion des Cu2+ zu Cu+, Bilden mit BCA einen Farbkomplex, Absorptionsmax.
Bei 562nm
Tests und Strstoffe
der zu verwendende
Test ist abhngig
von Stoffen aus der
Isolierung
Gelektrophorese
Gellauf wird durch folgende
Eigenschaften bestimmt:
Gre, Ladung (abh. Von
pH), Form
Polyacrylamidelektrophorese
(PAGE)
Ablauf
Probenvorbereitung
Herstellen des Gels:
Ansetzen Gellsung
(Acrylamid, Bisacrylamidm,
APS, TEMED)
Auftragen der Proben
Gellauf
Sichtbarmachen der
Proteinbanden im Gel
SDS- Page
Auftrennung nach Gre
Maskierung der anderen Eigenschaften
Denaturierungs der Proteine (Aufkochen)
Frbemethoden
Immunprzipition
Antigen und Antikrper (polyklonal)
werden in Lsung vermischt
Bildung von Aggregaten
fallen in
Abh. Von Konz. An Antigen und
Antikrper aus: optimale Konz. In der
quivalenzzone
Zentrifugation
IEP
basisch
Immunbiochemische Methoden
Trgerbasierte Immunfrbung
Trgermaterialen
Makierungsverfahren
Meist werden mehrstufige Verfahren eingesetzt, die zu Verstrkung des primren Signals fhren. Es muss
ausgeschlossen werden, dass der sekundre Detektionsantiokrper unspezif isch an weitere Proteine bindet.
Sandwich ELISA: der Fngerantikrper wird an Platte gebunden. Das Antigen im Proteingemisch bindet an
diesen. Alle anderen Proteine werden ausgewaschen. Die Detektion erfolgt mit einem 2. makiertem
Antikrper, dem Detektionsantikrper, dessen Signal proportional zur Menge des gebundenem Antigens ist.
Kompetitiver ELISA: eine bekannte Menge eines makeritem Anitgens konkurriert mit unmakiertem Antigen
der zu untersuchenden Probe um die Bindun gan den gekoppelten Antikrper. Je mehr Antigen in der Probe,
desto weniger makiertes Antigen kann binden und desto schwcher ist die resultierende Frbung. Je
weniger Antigen in der Probe, desto strker die Signalstrke. Viele Varianten
wichtig: Nachweis von
Antigenen im Blut Antikrper aus der Blutprobe kompetieren mit den makierten um das immobilisierte
Antigen. Wenn Infektion (viele Antikrper im Blut)
Signal schwach.
Western Blot: nach eigentlichem Transfer aus dem Gel
auf eine Membran werden alle freien Bindungsstellen
abgesttigt und nachfolgend durch den Einsatz von
Antikrpern wird ein spezif isches Protein identif iziert.
Selterner: Dot Plot
das Proteine wird ohne vorherige
Auftrennung im Gel auf eine Nitrozellulosemembran
getropft
danach Immunfrbung
Durchlfusszytometrie
FACS Zellsorter
Die Zellen werden aufgrund ihrer OberflchenAntigene durch fluoresenzgekoppelte Antikrper
makiert. Die Fluoreszenz wird in einer
Durchflusskapillare detektiert und die Zellen am Ende
der Kapillare in elektrisch geladene Trpfchen
eingefasst. Im elektrischen Feld werden die makierten
Zellen abgelenkt, whrend leere Tropfen und
unmakierte Zellen unbeeinflusst das Feld passieren.