Gruppe

Protokoll zum Praktikum

Basismodul Biologie Praxis I:

Biochemie

Enzymtest: Lactatdehydrogenase
[WS 2020/21]

angefertigt von

Name: Si Kien, Ho Email-Adresse:

si.ho@uni-bielefeld.de
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung …………………………………………………………………1
2. Einleitung …………………………………………………………………………… 2
3. Material und Methode ………………………………………………………………2
4. Ergebnisse …………………………………………………………………………. 5
5. Diskussion ………………………………………………………………………….. 7
6. Inhaltsverzeichnis …………………………………………………………………. 9

I. Zusammenfassung

Enzyme haben eine entscheidende Rolle in unserem Leben: Sie dienen als
Katalysator für chemische Reaktionen. Enzyme sind katalytisch wirkende Proteine
mit einem pH- und Temperatur-Optimum. Im durchgeführten Versuch wurde die
Eigenschaften von Enzymen am Beispiel des Enzyms Lactatdehydrogenase (LDH)
untersucht. Es wurde hierbei der Zusammenhang zwischen der
Substratkonzentration und der Reaktionsgeschwindigkeit erforscht. Zudem wurde
die Bestimmung der Pyruvat-Konzentration mit Hilfe von Photometer und Lambert-
Beer’schen Gesetz berechnet. Für die Auswertung wird die Abhängigkeit der

1
Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration grafisch dargestellt. Eine
Auswertung erfolgt mittels Michaelis-Menten-Modell. Daraus ergibt sich, dass sich
die Erhöhung der Substratkonzentration proportional zu der
Reaktionsgeschwindigkeit verhält.

II. Einleitung

Warum können viele chemische Reaktionen in unserem Körper ablaufen, obwohl

ihnen verschiedene Bedingungen (z.B. Temperatur, Aktivierungsenergie, …) fehlt?
Es liegt daran, dass Enzyme, also Proteinmoleküle, daran teilnehmen, um die
Reaktionsgeschwindigkeit vieler chemischen Reaktionen zu beschleunigen. Die
Wirkungen von Enzymen sind vielseitig und hochspezifisch. Enzyme fungieren als
Biokatalysator, welches aus einer Reaktion unverändert hervorgeht.

Das Enzym Laktatdehydrogenase ist ein sehr wichtiger Biokatalysator. Es hat die
bedeutende Funktion, NAD+ trotz Sauerstoffmangel zu produzieren. Dadurch kann
die Glykolyse für eine gewisse kurze Zeit ablaufen, um ATP unter anaeroben
Bedingungen zu gewinnen. Im folgenden Versuch „Enzymtest:
Lactatdehydrogenase“ werden die Eigenschaften von Enzymen bei der
enzymatischen Katalyse am Beispiel von Lactatdehydrogenase bei der Umsetzung
des Substrats Pyruvat demonstriert werden. Dazu soll die Messung mit
unbestimmter Konzentration des Substrats Pyruvat berücksichtigt werden. Hierfür
soll es auch untersucht werden, wie die Reaktionsgeschwindigkeit von
Substratkonzentrationen abhängt.
Eine Hypothese könnte aufgestellt werden: Je höher die Substratkonzentration in
der Lösung vorhanden wäre, umso größer wäre die Reaktionsgeschwindigkeit. Es
würde also auch erwartet, dass die Reaktionsgeschwindigkeit maximal sein könnte.

III. Material und Methode

Der Enzymtest wurde immer bei bestimmten Bedingungen sorgfältig und

sachgerecht durchgeführt, da enzymatische Aktivitäten auf vielen Faktoren

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angewiesen und sehr empfindlich mit der neuen Umgebung sind. Bei unserem
Versuch wurde das Enzym bei einem pH-Wert von 7,5 und bei Raumtemperatur
experimentiert.

Um die Reaktion von Lactatdehydrogenase (LDH) nachzuweisen, erfolgte es durch

den optischen Test mit Hilfe von Photometer. Die Voraussetzung für die Analyse
einer enzymatischen Reaktion mittels Photometer ist, dass die Extinktion eines der
Substrate sich während der Reaktion bei einer im Messbereich des Photometers
liegenden Wellenlängen ändern kann. Die Funktionsweise von Photometer ist auch,
dass die Konzentration bekannter Substanz (hier Pyruvat) bestimmt werden kann.
Die LDH-Reaktion lautet:
besser in die Einleitung

Da Pyruvat mit NADH im Verhältnis von 1:1 reagiert, wurde hier die Konzentration
von NADH errechnet und deshalb soll NADH auch im Überschuss sein. Die
Konzentrationsänderung von NADH pro Zeiteinheit dient als Maß für die Aktivität der
LDH.

In diesem Versuch wurden drei verschiedene Proben (A, B, C) mit entsprechendem

Pyruvat mit unbekannten Konzentrationen untersucht. Die Proben A und B wurden
erstmal jeweils mit 100 µl Imidazolpuffer (1M), 75 µl NADH (12mM), 1.750 µl H2O
und 50 µl Pyruvat in einer Küvette pipettiert. Die Probe C wurde nur mit 50 µl
Pyruvat pipettiert. Alle diese drei Pyruvat-Lösungen besaßen unterschiedliche
Konzentrationen, die aber noch nicht bekannt waren und gemessen werden musste.
Es wurde auch eine sogenannte „Blindwert“-Probe mit 50 µl Pyruvat erzeugt, bei der
aber NADH fehlte. Ein wichtiger Arbeitsschritt ist, dass die Küvetten mit Parafilm
verschlossen und gut gemischt wurden.

Die Vorgehensweise ist Folgendes:

1. Zuerst wurde die „Blindwert“-Probe, welche keine NADH enthielt, in dem
Photometer bei einer Wellenlänge von 366 nm gestellt. Mit Hilfe von dem

3
 Blindwert wurde der Messbereich auf Null geeicht, damit die Extinktion
gemessen werden konnte.

2. Dann wurde der erste Ansatz, also die Probe A, welche noch keine LDH
enthielt, im Photometer gelegt und die Extinktion wurde 1 Minute lang alle 15s
abgelesen und aufgeschrieben. Am Ende ergab sich daraus der Endwert E1.

3. Nun wurde der Reaktionsansatz aus dem Photometer genommen. Dann

wurde 25 µl LDH-Lösung in die Küvette zugegeben Die Küvette wurde nun
mit Parafilm abgedichtet und gut geschüttelt musste so schnell wie möglich in
das Photometer gestellt werden, da die LDH die Reaktion katalysiert. Die
Küvette wurde nun mit Parafilm abgedichtet und gut geschüttelt. Die
Extinktion wurde in 15 Minuten alle 15s verfolgt und notiert bis es keine
Veränderung mehr gezeigt wurde. Nach 15 Minuten zeigte der Endwert E2
als Ergebnis.

Für den zweiten Reaktionsansatz, also die Probe B mit entsprechendem Pyruvat
(mit einer anderen Pyruvat-Konzentration) wurde es schrittweise genauso wie bei
dem ersten Reaktionsansatz durchgeführt. Die Extinktion wurde auch erstmal in 1
Minute alle 15s abgelesen, nach der Zugabe von LDH-Lösung dann wurde die
Extinktionsveränderung weiter bis maximal 15 Minuten beobachtet und alle 15s
notiert.

Nachdem der zweite Ansatz zum Stillstand gekommen war, (die Extinktion
veränderte sich nicht mehr), wurde die Probe C zu dem zweiten Ansatz pipettiert
und die Extinktion wurde anschließend weiter abgelesen und aufgeschrieben. Und
damit war der Versuch beendet.
Die Messwerte wurden anschließend in die vorgegebene Tabelle eingetragen. Dabei
wurden die Pyruvat-Konzentrationen, also die Konzentrationen des Ausgangsstoffs
im Zusammenhang mit den gemessenen Extinktionswerten berechnet, der mit einer
Kurve mittels Lambert-Beer’schen Gesetz dargestellt wurde:

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E: die gemessene Extinktion mittels Photometer

C: Konzentration der Lösung in

d: Schichtdichte der Küvette in cm

ε: molarer, dekadischer Extinktionskoeffizient in

Nach der Umformung:

ist der Extinktionskoeffizient von NADH (Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid) bei einer

Lichtwellenlänge von 366 nm und wurde angegeben.

Darüber hinaus wurde die Reaktionsgeschwindigkeit im Zusammenhang mit

Substratkonzentrationen berücksichtigt. Die Messdaten wurden in eine Tabelle
eingetragen, in der die Gesamtänderung der Extinktion errechnet wurde:
∆E = E1 – E2
Die Werte der Gesamtänderung der Extinktion ∆E pro Zeiteinheit wurden in ein
Diagramm eingetragen. Die Reaktionsgeschwindigkeit wurde in einem kurzen
Intervall nach dem Start der Reaktion gemessen. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist
eben die Ableitung der Kurve. Der lineare Teil soll möglichst steil sein und konstant
bleiben. Die Reaktionsgeschwindigkeit wurde mit Hilfe der folgenden Formel
berechnet:
n

Die Einheit der Reaktionsgeschwindigkeit lautet . Hierbei stellt V (ml) für das

Volumen der Küvette, d (cm) für den Durchmesser der Küvette, (ml.μmol-1 .cm-1)
für den Extinktionskoeffizient von NADH (wurde angegeben).

IV.Ergebnisse

Um die anfängliche Pyruvat-Konzentration zu berechnen, wurden die

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Konzentrationen von NADH errechnet, da der Verbrauch von NADH genauso groß
wie von Pyruvat (Umsetzung 1:1). Die Messdaten werden zusammen in eine Tabelle
eingetragen (Tab.1):
Tab. 1: Berechnung der Konzentrationen der Probe.
E1 E2 d C= Verdünnuns- Konzen-
(
(cm) Konzen- faktor tration
tration in der Probe
der Küvette
genau anders (
( ) herum

Probe A 1,157 0,607 1 3,4 6,4 40 0,16

Probe B 1,701 1,110 1 3,4 6,8 40 0,17
Probe C 1,701 0,685 1 3,4 12,3 41 0,30
1,110

Die Extinktion wurde zuvor gemessen. Mittels Lambert-Beer’sches Gesetz kann die
Konzentration der Probe errechnet werden. Die Konzentration in der Küvette kann
ausgerechnet werden, indem man die Konzentration der Pyruvatprobe mal den
Verdünnungsfaktor rechnet.

Die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration wird

grafisch dargestellt. Zuerst wurden die Messwerte in einer Tabelle ausgefüllt (Tab.2)
und dann wird die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der
Substratkonzentration grafisch dargestellt (Abb. 1).
Tab.2: Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit
linear (min) VKüvette (ml) d (cm) (ml.μmol-1 (
.cm-1)
Probe A 0,061 0,45 2 1 3,4 0,079
Probe B 0,546 0,45 2 1 3,4 0,71
Probe C 1,101 0,45 2,05 1 3,4 1,44

Es wurde eine Kurve dargestellt. Am Verlauf der Kurve ist ein Trend zu beobachten:
In der ersten Minute blieb die Extinktion konstant, da noch keine LDH-Lösung
zugegeben wurde. Nach der Zugabe von LDH sank kontinuierlich die Extinktion pro
Minute, aber die Steigung jeweils war unterschiedlich groß. Die Steigung entspricht
der Reaktionsgeschwindigkeit. Damit wurde es bewiesen, dass die
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Substratkonzentration einen großen Einfluss auf die Reaktionsgeschwindigkeit hat.

Die Kurve der Probe A hatte nur eine leichte Abnahme, die Werte sanken aber ganz
langsam. Im Vergleich zu der Kurve der Probe B war es bemerkenswert, dass es
eine große Senkung nach der Zugabe von LDH-Lösung gab. Die Extinktion nahm
schrittweise kontinuierlich ab. Die Reduzierung der Extinktion der Probe C war noch
stärker als die beiden Proben. Es war sehr auffällig, dass die starke Reduzierung
der Kurve anfing zu verlaufen von 60 Sekunden auf 75 Sekunden, also direkt nach
der Zugabe von LDH-Lösung. (Abb. 1)

Einen kleinen Hinweis, warum bei der Probe A die Kurve so verläuft: Ich habe an
dem Tag des Versuchs die Probe A aus Versehen eine Minute lang aus dem
Photometer genommen, da ich im Skript nicht genau gelesen habe, daher verläuft
die Kurve so mit einer Lücke.

Abb.1: Die Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit. Der Messintervall wurde im

Rahmen von 0s bis 300s bestimmt.

V. Diskussion

Hiermit wird es bestätigt, dass Enzyme eine ganz wesentliche Funktion dazu
beitragen, eine chemische Reaktion unter bestimmten Bedingungen zu katalysieren.

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Dies bedeutet, dass durch Zugabe von Lactatdehydrogenase (LDH) die Umsetzung
von Pyruvat und NADH zu NAD+ eindeutig schneller ablief, und dies wurde mit der
angewandten Methode, also mit Hilfe des Photometers veranschaulicht.

Die ermittelten Messdaten lassen auf einen Zusammenhang zwischen

Reaktionsgeschwindigkeit und Substratkonzentration schließen. Die aufgestellte
Hypothese wurde nachgewiesen: Je mehr Substrate in der Lösung eingesetzt
werden, desto höher ist die Reaktionsgeschwindigkeit bis sie ihr Maximum erreichen
würde. Diese Hypothese auch mit dem dritten Ansatz (also die Probe C) bewiesen
und zwar: Nach der Zugabe von Pyruvat-Konzentration C in dem vorherigen Ansatz
(Probe B) nahm die Extinktion drastisch ab und somit ist die Steigung der Kurve
auch steiler, also die Veränderung der Geschwindigkeit ist leicht erkennbar. Dies
lässt sich auch anhand des Diagramms verdeutlichen: Je steiler das Linear ist, umso
größer ist die Reaktionsgeschwindigkeit. Jedoch wird die Reaktionsgeschwindigkeit
in unserem Versuch nicht ihr Maximum erreichen kann, sondern nur
annährungsweise.

Dazu ist das Ergebnis auf das Michaelis-Menten-Modell zurückzuführen. Dies

besagt: Wenn die Enzymkonzentration unverändert bleibt, steigt die
Reaktionsgeschwindigkeit kontinuierlich mit steigender Substratkonzentration an, bis
eine maximale Geschwindigkeit erreicht ist. Dabei ist eine Sättigungskurve zu
erhalten. Wie bereits erwähnt war in unserem Versuch keine maximale
Geschwindigkeit zu erreichen und zu bestimmen. Für die Bestimmung der
maximalen Geschwindigkeit müsste mehrere Ansätze durchgeführt werden, also
müsste die Reaktionsgeschwindigkeit mit unterschiedlichen Substratkonzentrationen
gemessen, um einen besseren Überblick zu bekommen. In unserem Versuch lagen
nur wenige Punkte vor, damit könnte kein Michaelis-Menten-Diagramm erstellt
werden. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit ist für jedes Enzym typisch.

Angenommen würde anstatt Pyruvat von Probe C weiter Lactatdehydrogenase

(LDH) oder NADH pipettiert, was würde dann passieren? Die Absorption würde
wieder steigen, der Wert ist nach oben und danach wird nichts passieren, da es kein

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Pyruvat mehr in der Lösung gibt, um mit Enzym oder NADH zu reagieren, also es
bildet sich kein Enzym-Substrat-Komplex. Dies bedeutet, die Substratkonzentration
einer Substanz eine bedeutende Rolle in einer Reaktion spielt, da viele Faktoren
davon abhängig sind.

VI.Literaturverzeichnis
Neil A. Campbell, Jane B. Pearson, Reece, Lisa A. Urry, Michael L. Cail, Steven A.
Wasserman, Peter V. Minorsky, Robert B. Jackson, Campbell Biologie, aktualisierte
Auflage 8

Hiermit versichere ich, dass ich das vorliegende Protokoll eigenständig und nur unter
Benutzung der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Alle zitierten oder sinngemäß
übernommenen Textstellen aus der Literatur bzw. dem Internet sind als solche
gekennzeichnet und die benutzten Quellen vollständig angegeben.

Name Si Kien Ho Datum Unterschrift

28.11.2020
Kien