Pflanzenphysiologiepraktikum

Versuch 5
Induktion der Nitratreduktase in den Kotyledonen des Senfkeimlings

Versuchstag: 13.05.2015

1 Einleitung

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Die Nitratreduktase reduziert Nitrat zu Nitrit, wobei NADH zu NAD + oxidiert wird und Wasser
entsteht. Sie befindet sich im Gegensatz zur Nitritreduktase, die in den Plastiden vorliegt, im
Cytosol.
Das Ziel des Versuchs ist es, die Abhängigkeit vom Licht, dem Vorhandensein von Chloroplasten
und der Anwesenheit von Nitrat, die Nitratreduktaseinduktion zu untersuchen. Die Nitratreduktase
unterliegt einer strengen Kontrolle, was unbedingt notwendig ist, damit sich das toxische Produkt
Nitrit nicht in der Zelle anreichert. Dies würde ohne Regulierung geschehen, weil die
Nitratreduktase nicht auf die Produkte aus der Photosynthese angewiesen ist, die Nitritreduktase
schon.
Die Nitritreduktase ist auf den Elektronendonor Ferredoxin angewiesen, der als Produkt des
photosynthetischen Elektronentransports von Photosystem I zur Verfügung gestellt wird. Zur
Vermeidung einer Nitritanreicherung kann die Nitratreduktase kompetitiv gehemmt werden. Dafür
wird das Serin in der Nitratreduktase phosphoryliert, woraufhin sie eine Interaktion mit einem
Inhibitorprotein eingeht. In diesem Zustand ist die Nitratreduktase inaktiv. Durch hydrolytische
Abspaltung des Phosphatrestes löst sich das Inhibitorprotein wieder ab und die Nitratreduktase ist
wieder voll funktionsfähig. Weiterhin wird die Nitratreduktasesynthese von Licht gefördert und
durch Glutamin und andere Aminosäuren und 14-3-3-Proteine gehemmt [1].
Zur Untersuchung der Induktion der Nitratreduktase durch Substrat und Licht wurden
Senfkeimlinge im Licht und Dunkel jeweils mit Wasser oder KNO 3 angezogen und zusätzlich eine
Pflanze mit Chloramphenicol, ein Antibiotikum, das selektiv die Proteinsynthese an den 70S-
Ribosomen und damit die Plastidenentwicklung hemmt.
Um die Aktivität der Nitratreduktase zu bestimmen, muss zunächst die Nitritkonzentration bestimmt
werden. Dies geschieht über eine Farbreaktion. Nitrit reagiert mit Sulfanilamid zu einem
Diazoniumsalz, welches zusammen mit Naphthylethylendiamin einen roten Azofarbstoff bildet.
Mittels Extinktionsmessung kann so die Menge an Nitrit ermittelt werden.
Für die Bestimmung der Nitratreduktaseaktivität wird zuerst eine Eichgerade benötigt, mit deren
Gleichung aus den Extinktionswerten die Nitritkonzentrationen bestimmt werden können.
Zweiwertige Kupferionen reagieren mit Proteinen zu einwertigen Kupferionen, die wiederum mit
Bicinchoninsäure zu einem violetten Komplex reagieren. Dadurch wird die photometrische
Bestimmung bei 562 nm ermöglicht.

2 Durchführung
Die Durchführung erfolgte weitgehend nach dem Skript [2]. Es wurden jedoch nur vier
Kotyledonenpaare anstelle von zehn verwendet.
Aufgrund mangelnder Zeit wurde die Messwerte zur Bestimmung der Eichgerade zur Ermittlung
der Nitritgehalte nicht aufgenommen. Für die Auswertung werden uns gegebene Werte
vorangegangener Versuche verwendet.

3 Ergebnisse

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3.1 Eichgerade zur Ermittlung der Nitritgehalte

Tabelle 1: Ergebnisse der photometrischen Messung der Proben mit unterschiedlichem Nitritgehalt
zur Bestimmung der Eichgeraden
[NO 2-] [μM] E1 E2 E3
0,15 0,004 0,005 0,005 0,005
0,3 0,008 0,008 0,009 0,008
0,6 0,019 0,019 0,019 0,019
0,9 0,027 0,027 0,03 0,028
1,2 0,039 0,04 0,041 0,040
1,5 0,049 0,046 0,047 0,047
0,050
f(x) = 0,032x
0,045 R² = 0,999
0,040
0,035
0,030
Exttinktion

0,025
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6
Nitratkonzentration in μM
Diagramm 1: Eichgerade mit den Werten aus Tabelle 1

3.2. Bestimmung der Nitritkonzentration aus den Extinktionswerten der photometrischen

Messung

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Aus den gemessenen Extinktionswerten wurde zuerst der Mittelwert berechnet und anschließend
der Blindwert abgezogen. Aus diesem Wert wurde mit der Gleichung der Eichgeraden der
Nitritgehalt berechnet.

Beispielrechnung für Wasser/Licht (Extinktion: y = 0,023):

y 0,023
y = 0,032x x= x= =0,719
0,032 0,032

Tabelle 2: Ergebnisse der photometrischen Messung der verschiedenen Messansätze zum Nachweis
des gebildeten Nitrits
Ansatz Extinktion Extinktion Mittelwert Blindwert Differenz Nitritkonzentration
Messwert 1 Messwert 2 in μM
Wasser/Licht 0,032 0,033 0,033 0,010 0,023 0,719
Wasser/Dunkel 0,031 0,033 0,032 0,004 0,028 0,875
KNO3/Licht 0,151 0,147 0,149 0,033 0,116 3,625
KNO3/Dunkel 0,030 0,026 0,028 0,007 0,021 0,656
Chloramphenicol 0,005 0,005 0,005 0,001 0,004 0,125

Dieser Nitritgehalt muss nun auf die im Nitratreduktasetest eingesetzte Extraktmenge

hochgerechnet werden. Dafür muss die Verdünnung der gemessenen Proben beachtet werden:

Verdünnung Ansatz der Reduktion von Nitrat zu Nitrit:

Es wurden 100 μl Enzymextrakt zu 500 μl Phosphatpuffer + 100 μl NADH-Lösung + 100 μl KNO3-

Lösung bzw. 100 μl Wasser gegeben. Daraus ergibt sich ein Verdünnungsfaktor von
100 μl + 500 μl+ 100 μl + 100 μl 800 μl
= =8 .
100 μl 100 μl

Verdünnung beim Ausfällen des NADH mit Zinkacetat-Lösung:

Es wurden 200 μl Extrakt zu 25 μl Zinkacetat-Lösung gegeben. Daraus ergibt sich ein

200 μl+ 25 μl 225 μl
Verdünnungsfaktor von = =1,125 .
200 μl 200 μl

Verdünnung bei der Diazotierungsreaktion zur Farbstoffbildung: Es wurden 150 μl des mit oben
bestimmten Verdünnungsfaktoren verdünnten Extrakts mit 350 μl Wasser, 250 μl
Sulfanilamidlösung und 250 μl Naphthylethylendiaminlösung vermischt. Daraus ergibt sich ein
150 μl+ 350 μl+ 250 μl+ 250 μl 1000 μl
Verdünnungsfaktor von = =6,67 .
150 μl 150 μl

Da die Verdünnung hier fortlaufend ist, müssen die einzelnen Verdünnungsfaktoren noch
multipliziert werden und ergeben dann als Produkt mit den Nitritkonzentrationen aus Tabelle 2 die
im Ausgangsextrakt enthaltene Konzentration. Der Gesamtverdünnungsfaktor beträgt demnach
8⋅1,125⋅6,67 = 60 .
Beispielrechnung für Wasser/Licht (Nitritkonzentration in der verdünnten Probe 0,727μM):

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 0,719 μM⋅60=43,14 μM

Tabelle 3: Nitritkonzentrationen in μM der Ausgangsextrakte

Ansatz Nitritkonzentration in der Nitritkonzentration im
verdünnten Probe in μM Ausgangsextrakt in μM
Wasser/Licht 0,727 43,14
Wasser/Dunkel 0,881 52,50
KNO3/Licht 3,580 217,50
KNO3/Dunkel 0,666 39,36
Chloramphenicol 0,144 7,50

3.3 Berechnung der spezifischen Enzymaktivität

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Die Enzymaktivität wird in μmol pro Minute, Units, angegeben. Daher müssen die
Nitritkonzentrationen noch mit dem Volumen (150 μl) multipliziert, um die Stoffmenge zu
berechnen, und die durch die Reaktionszeit (20 Minuten) geteilt werden. Um die Enzymaktivität
pro Kotyledonenpaar zu berechnen, muss die errechnete Enzymaktivität noch durch die Anzahl der
Kotyledonenpaare (4) geteilt werden.

Beispielrechnung für Wasser/Licht:

μmol
Berechnung der Stoffmenge: 43,14 ⋅1,5⋅10−4 l=6,471⋅10−3 μmol
l
−3
6,471⋅10 μmol
Berechnung der Enzymaktivität in 100 μl: =3,236 10˙−4 U
20 min
3,236⋅10−4 U −5
Berechnung der Enzymaktivität pro Kotyledonenpaar: =8,089⋅10 U
4

Tabelle 4: Stoffmenge und Enzymaktivität der verschiedenen Ansätze

Ansatz Nitritkonzentration Stoffmenge in Enzymaktivität in Enzymaktivität in
im Ausgangsextrakt μmol von Nitrit Units (in 150 μl) Units pro
in μM in 150 μl Extrakt Kotyledonenpaar
Wasser/Licht 43,14 6,471·10-3 3,236·10-4 8,089·10-5
Wasser/Dunkel 52,50 7,875·10-3 3,938·10-4 9,844·10-5
KNO3/Licht 217,50 32,625·10-3 16,313·10-4 40,781·10-5
KNO3/Dunkel 39,36 5,904·10-3 2,952·10-4 7,380·10-5
Chloramphenicol 7,50 1,125·10-3 0,563·10-4 1,406·10-5

Tabelle 5: Ergebnisse der photometrischen Messung zur Bestimmung des Proteingehalts der
Extrakte
Ansatz 10:90 20:80 30:70
Wasser/Licht 0,115 0,192 0,230
Wasser/Dunkel 0,143 0,275 0,537
KNO3/Licht 0,161 0,338 0,440
KNO3/Dunkel 0,166 (0,795) 0,529
Chloramphenicol 0,240 0,337 0,347
Der Wert in Klammern ist ein Ausreißer, daher wird er nicht in die weitere Berechnung mit
einbezogen.

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Diagramm 2: Eichgerade aus dem Skript

Mit der im Skript vorgegeben Eichgeraden (Diagramm 2) y = 0,0177x können nun die
Proteingehalte der Extrakte bestimmt werden.

y 0,115
Beispielrechnung für Wasser/Licht 10:90: x= = =6,5 μg
0,0177 0,0177

Anschließend muss die berechnete Proteinmenge noch auf das Volumen bezogen werden, also die
Konzentration berechnet werden.

6,5 μg μg mg
Beispielrechnung für Wasser/Licht 10:90: =0,65 =0,65
10 μl μl ml

Die anderen Werte wurden nach dem gleichen Prinzip berechnet und in folgender Tabelle
zusammengefasst.

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Tabelle 6: Proteingehalte der Extrakte verschiedener Ansetzungen
Ansatz Verdünnung Extinktion Masse des Konzentration Mittelwert der
Proteins im des Proteins im Proteinkonzentrationen
Extrakt in μg mg mg
Extrakt in in
ml ml
Wasser/Licht 1:10 0,115 6,5 0,65
2:10 0,192 10,8 0,54 0,54

3:10 0,230 13,0 0,43

Wasser/Dunkel 1:10 0,143 8,1 0,81
2:10 0,275 15,5 0,78 0,87

3:10 0,537 30,3 1,01

KNO3/Licht 1:10 0,161 9,1 0,91
2:10 0,338 19,1 0,95 0,90

3:10 0,440 24,9 0,83

KNO3/Dunkel 1:10 0,166 9,4 0,94
2:10 (0,795) (44,9) (2,25) 0,97

3:10 0,529 29,9 1,00

Chloramphenicol 1:10 0,240 13,6 1,36
2:10 0,337 19,0 0,95 0,99

3:10 0,347 19,6 0,65

Aus den ermittelten Enzymaktivitäten und Proteinkonzentrationen kann nun die spezifische
Enzymaktivität der Nitratreduktase berechnet werden. Diese wird in Units pro mg angegeben.
Daher müssen die Konzentrationen aus Tabelle 6 noch mit dem Volumen des Testansatzes (1,5 ml)
multipliziert werden. Durch die dann erhaltene Masse werden die vorher ermittelten
Enzymaktivitäten geteilt, um einen vergleichbaren Wert zu erhalten.
−4 −4
3,236⋅10 U 3,236⋅10 U U
Beispielrechnung für Wasser/Licht: = =3,995⋅10−4
mg 0,81 mg mg
0,54 ⋅1,5 ml
ml

Tabelle 7: spezifische Enzymaktivitäten der Nitratreduktase in den unterschiedlichen Ansätzen

Ansatz Enzymaktivität in Mittelwert der Spezifische Enzymaktivität
Units (in 150 μl) Proteinkonzentrationen in U
in
mg mg
ml
Wasser/Licht 3,236·10-4 0,54 3,995·10-4
Wasser/Dunkel 3,938·10-4 0,87 3,018·10-4
KNO3/Licht 16,313·10-4 0,90 12,084·10-4
KNO3/Dunkel 2,952·10-4 0,97 2,029·10-4
Chloramphenicol 0,563·10-4 0,99 0,379·10-4

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4 Diskussion
Wie Tabelle 7 klar zu entnehmen ist, ist die spezielle Enzymaktivität der Nitratreduktase in der
KNO3/Licht-Probe am höchsten. Dieses Ergebnis entspricht den Erwartungen, da, wie in der
Einleitung bereits erwähnt, die Aktivität der Nitratreduktase von dem Vorhandensein des Substrats
und vom Licht abhängt.
In den beiden Wasser-Ansätzen wurde kein Substrat dazugegeben, wodurch die Aktivität der
Nitratreduktase gering bleibt.
Die Nitratreduktaseaktivität ist von der Nitritreduktaseaktivität abhängig, da sich das toxische Nitrit
nicht in der Zelle anreichern darf [1]. Da die Nitritreduktase auf Reduktionskraft, besonders das
Photosyntheseprodukt Ferredoxin, als Elektronendonor angewiesen ist, ist sie im Dunkeln fast
inaktiv. In geringem Umfang kann das für die Nitritreduktion im Blatt erforderliche Ferredoxin
jedoch auch im Dunkeln durch NADPH reduziert werden. NADPH kann in den Chloroplasten und
in den Leukoplasten im Dunkeln durch den oxidativen Pentosephosphatweg geliefert werden [1].
Da die Aktivität der Nitratreduktase im Dunkeln jedoch deutlich höher ist als die der
Nitritreduktase, wird die Aktivität der Nitratreduktase im Dunkeln vermindert, um eine
Nitritanreicherung zu vermeiden.
Dieses Ergebnis lieferte auch der Versuch, wie Tabelle 7 deutlich zu entnehmen ist. Sowohl beim
Vergleich der Wasser/Licht-Probe mit der Wasser/Dunkel-Probe als auch beim Vergleich der
KNO3/Licht-Probe mit der KNO3/Dunkel-Probe ist zu erkennen, dass die Lichtproben eine höhere
spezifische Enzymaktivität aufweisen.
Chloramphenicol hemmt die Plastidenentwicklung und damit maßgeblich die Nitritreduktase, da
sich diese ausschließlich in den Plastiden, vor allem Chloroplasten und Leukoplasten, befindet. Wie
bereits erwähnt, hat dies einen entscheidenden Einfluss auf die Aktivität der Nitratreduktase. Aus
Tabelle 7 kann man entnehmen, dass die Aktivität der Nitratreduktase sehr gering ist. Sie ist auch
geringer als in den Dunkelproben, da in diesen auch NADPH Ferredoxin reduzieren kann und
dieses dann als Elektronendonor für die Nitritreduktase wirkt. Aufgrund dessen, dass die
Nitratreduktaseaktivität hauptsächlich vom Licht und dem Vorhandensein von Plastiden abhängig
ist, lässt sich schließen, dass die Regulation hauptsächlich mittels kompetitiver Hemmung erfolgt,
da eine Regulierung auf der Transkriptionsebene zu lange dauern würde.
Zusammenfassend kann mit diesem Versuch bewiesen werden, dass die Nitratreduktaseaktivität
sowohl von der zur Verfügung stehenden Substratmenge als auch von der Photosynthese abhängt.

Der Ausreißerwert bei der Extinktionsmessung der Proteingehaltbestimmung ist möglicherweise auf
einen Pipettierfehler oder eine nicht genaue Einhaltung der Inkubationszeit zurückzuführen.
Die unerwartete höhere Proteinkonzentration in den Dunkel-Ansätzen ist wahrscheinlich eher mit
einem ungleichartigen Anwachsen der Keimlinge zu begründen.

Literaturangaben:

[1] : „Pflanzenbiochemie“, 5. Auflage, Hans Walter Heldt und Birgit Piechulla, Springer
Spektrum
[2]: Pflanzenphysiologie Praktikumsskript
[3]: „Strasburger Lehrbuch der Pflanzenwissenschaften“, 37. Auflage, Joachim W. Kadereit,
Springer Spektrum