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Versuch 1








ADH: Der enzymatisch-optische Test
Alkoholdehydrogenase-Reaktion
















Praktikant: Praktikumnummer:

Praktikant: Praktikumnummer:














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I. Einleitung

In der enzymatischen Analyse wird die Reaktions- und Substratspezifitt von Enzymen
ausgenutzt um Substratbestimmungen vorzunehmen. Der Vorteil ist, dass Stoffgemische
meist nicht getrennt werden mssen, da das Enzym sein Substrat selektiv umsetzt. Die
Konzentrationsnderung whrend der Umsetzung wird photometrisch verfolgt, hufig durch
die Coenzyme NAD
+
/ NADP
+
, beziehungsweise deren reduzierte Form (
max,oxid
=264nm und

max,red
=339nm). Eine Bestimmung ist fr alle Substrate mglich, die mit diesen
Redoxbertrgern reagieren.


Der nukleophile Angriff des Hydridions am C4-Atom des NAD
+
-Pyridinrings bedingt die
nderung der spektralen Eigenschaft durch Verschiebung des konjugierten Systems.


In einigen Mikroorganismen wird das Glykolyse-Produkt Pyruvat durch die
Pyruvatdecarboxylase zu Acetaldehyd umgesetzt. Anschlieend katalysiert die Alkohol-
Dehydrogenase (ADH) die Reaktion zu Ethanol, wobei sie das NAD
+
/NADH-System anwendet
um das bei der Glykolyse verbrauchte NAD
+
(nun NADH) zu regenerieren.
Das Gleichgewicht der Reaktion liegt deutlich auf Seiten des Ethanols, im Versuch wurde die
Reaktion in Richtung des Acetaldehyds betrachtet um spter Vergleiche der spezifischen
Aktivitt gegenber anderen Alkoholen anzustellen.

*Zu bedenken ist, dass Enzyme lediglich die Einstellung des Gleichgewichts beschleunigen,
indem sie die Aktivierungsenergie herabsetzen. Auf die Lage des Gleichgewichts haben sie
keinen Einfluss.



Zur Analyse von Konzentrationen und Reaktiongeschwindigkeiten muss die
Ethanolumsetzung zu Ethanal quantitativ werden, d.h. ohne Rckreaktion vollstndig
ablaufen. Zur Frderung dessen wurden einerseits berschusskonzentrationen verwendet
und andererseits die Rckreaktion ber eine Kopplung mit einer Semicarbazid-Reaktion
(Bildung des mesomeriestabilisierten Ethanalsemicarbazon) verhindert.
3

Die Bestimmung der Konzentration geschieht ber die Endwertmethode, sie ist sicherer als
eine Michaelis-Menten-Kinetik. Die Berechnung erfolgt mit E, da von vornherein eine
Extinktion bei 339nm zu messen ist (

).


ADH ist ein gruppenspezifisches Enzym, d.h. es setzt Molekle mit bestimmten
stereochemischen Eigenschaften um. Im Fall des ADH bezieht sich das auf seine prochiralen
(Co-)Substrate (NAD
+
/ NADH, Aldehyd/Alkohol).

Es gibt zwei Arten der Prochiralitt:
planare Molekle mit drei verschiedenen Substituenten (1)
tetraedische Molekle mit hchstens zwei gleichen Substituenten (2)

Molekle sind per Definition prochiral, wenn sie (1) durch eine Additionsreaktion oder (2)
durch Substitution ein Chiralittszentrum ausbilden.
Das Hefe-ADH ist fr die Reaktion mit Ethanol/Acetaldehyd ausgelegt, es kann aber auch
andere primre Alkohole, bzw. Aldehyde in einem verminderten Umfang umsetzen. Eine
Aussage ber relative Spezifitt des ADH ist durch einen Vergleich der
Umsatzgeschwindigkeiten in einer Enzymlsung definierter Konzentration mglich. Da
stchiometrisch gleich viel Alkohol abgebaut wird, wie NADH entsteht, lsst sich die
Volumenaktivitt auch als Geschwindigkeit des entstehenden NADH, anstelle des
abgebauten Alkohol-Substrats, darstellen:




Unter Bercksichtigung des Kvettenvolumens der jeweiligen Analysenlsung ergibt sich fr
die Aktivitt/Reaktionsgeschwindigkeit:




Im Versuch wurden zuerst die Absorptionsspektren von NAD
+
und NADH aufgenommen und
anhand der Absorptionsmaxima die Exktinktionskoeffizienten errechnet.
Anschlieend wurden die Konzentrationen unbekannter NAD
+
- und Ethanol-
Lsungen bestimmt. Zudem wurde die Gleichgewichtskonstante der Alkohol-
Dehydrogenase-Reaktion bei unterschiedlichen Konzentrationen ermittelt.
Zuletzt wurde die spezifische Aktivitt von ADH gegenber unterschiedlichen Alkoholen
untersucht.






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II. Durchfhrung


1. Aufnahme der Absorptionsspektren von NAD
+
und NADH

Es wurden 1,95 ml 50 mM Na-Diphosphatpuffer pH 8,8 / Semicarbazid und 0,05 ml absolutes
Ethanol in eine 1 cm Quarzkvette gefllt. Dabei wurde ein Referenzspektrum von 360 bis
240 nm aufgenommen. Nachdem dies gemacht wurde, entleerte man die Kvette und fllte
sie wieder mit 1,9 ml desselben Puffers, mit 0,05 ml 5 mM NAD
+
und mit 0,05 ml absolutem
Ethanol. Es wurde das Absorptionsspektrum des NAD
+
zwischen 360 und 240 nm
aufgenommen. Nachdem 5 l Hefe-ADH-Lsung (500 U/mol) hinzugegeben wurde, startete
die Reaktion. Nach 15 min nahm man anschlieend wieder das Spektrum auf, wobei hier
NAD
+
zu NADH reagierte.


2. Endpunkt-Bestimmung unbekannter NAD
+
- und Ethanol-
Konzentrationen

Um die Endpunkt-Bestimmung unbekannter NAD
+
- und Ethanol-Konzentrationen
durchzufhren, brauchte man jeweils 9 Kvetten (insgesamt 18). Das Spektralphotometer
wurde auf eine Wellenlnge von 339 nm eingestellt. Man musste verschiedene Lsungen
hinzugeben, welche im folgenden Pipettierschema erlutert werden. Diese Abbildung
entspricht der Abbildung auf Seite 12 des Skripts des Biochemischen Grundpraktikums fr
Studierende der Biologie aus dem Sommersemester 2014.

Pipettierschema fr die
unbekannte Ethanol-
Lsung
Referenz Kalibrierungswerte
(6,25 mM Ethanol)
Unbekannte Ethanol-
Lsung
Kvette 1 Kvette
2,3
Kvette
4,5
Kvet
te 6,7
Kvette 8,9
50 mM Na-
Diphosphatpuffer pH =
8,8 mit Semicarbazid
1,85 1,85 1,85 1,85 1,85
5 mM NAD
+
-Lsung 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
6,25 mM Ethanol-Lsung 0,05 0,05 0,025 - -
unbekannte Ethanol-
Lsung
- - - 0,05 0,025
dest. Wasser 0,35 0,30 0,325 0,30 0,325
Hefe-ADH (500 U/ml) - 0,05 0,05 0,05 0,05
Verdnnung der
Substratlsung
(Gesamtvolumen: 2,5 ml)
- 1:50 1:100 1:50 1:100
Tabelle 1: Pipettierschema fr die unbekannte Ethanol-Lsung


5

Pipettierschema fr die
unbekannte NAD
+
-Lsung
Referenz Kalibrierungswerte
(5 mM NAD
+
)
Unbekannte NAD
+
-
Lsung
Kvette 1 Kvette
2,3
Kvette
4,5
Kvette
6,7
Kvette
8,9
50 mM Na-
Diphosphatpuffer pH =
8,8 mit Semicarbazid
1,85 1,85 1,85 1,85 1,85
5 mM NAD
+
-Lsung 0,05 0,05 0,025 - -
unbekannte NAD
+
-Lsung - - - 0,05 0,025
absolutes Ethanol 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05
dest. Wasser 0,55 0,50 0,525 0,50 0,525
Hefe-ADH (500 U/ml) - 0,05 0,05 0,05 0,05
Verdnnung der
Substratlsung
(Gesamtvolumen: 2,5 ml)
- 1:50 1:100 1:50 1:100
Tabelle 2: Pipettierschema fr die unbekannte NAD
+
-Lsung


3. Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten fr die ADH-Reaktion

Es wurden 9 Kvetten mit folgenden Komponenten bentigt. Dabei beinhaltete die Kvette
1 eine Vergleichslsung zum Nullpunktabgleich am Spektralphotometer. Die
Inkubationsdauer betrug 15 min und die Messung war bei der Wellenlnge 339 nm.
Folgendes Pipettierschema entspricht ebenfalls der Abbildung auf der Seite 13 des
biochemischen Grundpraktikumskripts.

Kvette 1 Kvette
2,3
Kvette
4,5
Kvette
6,7
Kvette
8,9
50 mM Na-
Diphosphatpuffer
pH 9,8
- - 2,25 - -
50 mM Na-
Diphosphatpuffer
pH 8,8
2,30 2,25 - 2,15 2,15
5 mM NAD
+
-
Lsung
0,10 0,10 0,10 0,10 0,20
6,25 mM
Ethanol-Lsung
0,10 0,10 0,10 0,20 0,10
ADH-Lsung (500
U/ml)
- 0,05 0,05 0,05 0,05
Verdnnung der
NAD
+
-Lsung
(Gesamtvolumen:
2,5 ml)
1:25 1:25 1:25 1:25 1:12,5
Tabelle 3: Pipettierschema fr die Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten fr die
ADH-Reaktion
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4. Bestimmung der relativen spezifischen Aktivitt von ADH
gegenber verschiedenen Alkoholen

Bei diesem Versuch wurde eine 1:10 Verdnnung der ADH erstellt. Es wurden 10 l der ADH-
Stammlsung (500 U/ml) in einem 1,5 ml Eppendorfreaktionsgef mit 90 l dest. Wasser
vermischt.
Danach wurden 4 Kvetten mit jeweils 1,85 ml 50 mM Na-Diphosphatpuffer pH8,8, 0,1 ml
5mM NAD
+
-Lsung und mit 0,5 ml dest. Wasser gefllt. Die verschiedenen Alkohole
(absolutes Methanol, Ethanol, n-Propanol und n-Butanol) wurden jeweils, mit der Menge
von 0,05 ml, in die 4 Kvetten hinzugegeben. Die einzelnen Proben wurden in das
Photometer gestellt und mit 5 l der verdnnten ADH-Lsung versetzt. Dadurch startete die
Reaktion in der Kvette und am Photometer wurde unmittelbar ein neuer Leerwert
eingestellt. Nach 2 min wurde die Extinktion bei 339 nm notiert.



III. Ergebnisse und Auswertungen

1. Aufnahme der Absorptionsspektren von NAD
+
und NADH



Sowohl NAD
+
als auch NADH weisen bei 260nm ein Absorptionsmaximum auf, da sie einen
identischen Adeninbereich besitzen. Die Absorption des NAD
+
liegt hher als die des NADH,
weil es weiterhin einen mesomeren Nikotinamidring besitzt, der ebenfalls bei 260nm
absorbiert und sich so die Absorptionen berlagern. Das NADH besitzt dafr ein weiteres
Absorptionsmaximum bei 339nm, das durch die bertragung des Hydrid-Anions und damit
Reduktion des Nikotinamidrings entsteht.
Die Extinktionskoeffizienten werden mit dem Lambert-Beerschen Gesetz berechnet:






7

Zunchst muss die Konzentration in den Kvetten berechnet werden:






Eingesetzt: (Extinktionswerte siehe Abbildung)








2. Endpunkt Bestimmung unbekannter NAD
+
- und Ethanol-
Konzentration


Um die Konzentration des Ethanols zu bestimmen, erfolgte die Reaktion im NAD
+
-
berschuss. Das gleiche gilt fr die Bestimmung des NAD
+
. Diese Reaktion findet im
berschuss von Ethanol statt. Dadurch wird gewhrleistet, dass eine vollstndige Umsetzung
der Substrate erfolgt. Das Gleichgewicht liegt jedoch stark auf der Eduktseite (Ethanol und
NAD
+
). Aus diesem Grund wurde die ADH-Reaktion mit einer Semicarbazonbildung
gekoppelt. Das im Puffer enthaltene Semicarbazid reagierte mit dem Ethanal zu Ethanal-
semicarbazon, welches mesomerie-stabilisiert ist. Somit ist eine Rckreaktion verhindert.
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Berechnung der unbekannten Ethanolkonzentrationen:

Ethanol-Bestimmung C
ber
bzw.
C
unb

[*10
-3
M]
Extinktion
E
Mittelwert
der
Extinktion
E
C
spektr,2-5
Bzw.
C
spektr,6-9
[mM]
C
Pr

[*10
-3
M]
Kv. 2 6,25 mM
Lsung;
1:50
0,125 1,023 0,950 0,153 -
Kv. 3 0,877
Kv. 4 6,25 mM
Lsung;
1:100
0,0625 0,740 0,775 0,066 -
Kv. 5 0,810
Kv. 6 unbekannte
Lsung;
1:50
0,126 0,914 0,956 0,154 6,3
Kv. 7 0,998
Kv. 8 unbekannte
Lsung;
1:100
0,063 0,799 0,726 0,117 6,3
Kv. 9 0,725
Tabelle 4: Bestimmung der unbekannten Ethanolkonzentration

Aus der Tabelle ist eine Ethanolkonzentration von 6,3 mM zu entnehmen. Die jeweiligen
Schritte der Berechnungen werden nun erlutert, wobei immer nur ein Beispiel
vorgerechnet wird.

Berechnung von c
ber
:

Zunchst wird die Konzentration der verdnnten Lsung anhand der ersten Verdnnung
berechnet.

, wobei V
f
der Verdnnungsfaktor ist.




Berechnung von c
spektr,2-5
:

Mithilfe des Lambert-Beersche Gesetz wird c
ber
berprft.








9

Berechnung von c
spektr,6-9
:

Mithilfe des Lambert-Beersche Gesetz wird c
ber
berprft:






Berechnung von c
unb
:

[]


Berechnung von c
Pr
:



Berechnung der unbekannten NAD
+
-Konzentration:

NAD
+
-Bestimmung C
ber
bzw.
C
unb

[*10
-3
M]
Extinktion
E
Mittelwert
der
Extinktion
E
C
spektr,2-5
Bzw.
C
spektr,6-9
[mM]
C
Pr

[*10
-3
M]
Kv. 2 5 mM
Lsung;
1:50
0,1 0,496 0,524
0,085
-
Kv. 3 0,552
Kv. 4 5 mM
Lsung;
1:100
0,05 0,255 0,266 0,043 -
Kv. 5 0,276
Kv. 6 unbekannte
Lsung;
1:50
0,072 0,383 0,379 0,061

3,6
Kv. 7 0,375
Kv. 8 unbekannte
Lsung;
1:100
0,035 0,178 0,185 0,030 3,5
Kv. 9 0,192
Tabelle 5: Bestimmung der unbekannten NAD
+
-Konzentration

Aus der Tabelle ist eine NAD
+
-Konzentration von 3.55 mM zu entnehmen. Die Rechenschritte
entsprechend hierbei genau den Schritten fr die Konzentrationsbestimmung des Ethanols.
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3. Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten der ADH-Reaktion

Nach dem Massenwirkungsgesetz gilt fr die Gleichgewichtskonstante der ADH-Reaktion:


[] [] [

]
[] [

]


Der pH-Wert ist der negative dekadische Logharithmus der Protonenkonzentration:
[

]
Damit ergibt sich fr [H
+
]:
[


Der zugegebene Puffer stellt den pH-Wert und damit die Konzentration der Protonen ein:
Kvette 1,2,3,6,7,8,9:
[


Kvette 4,5:
[



Fr die Berechnung von [NADH] wird das Lambert-Beersche Gesetz verwendet und die
Mittelwerte der gemessenen Extinktionen aus den jeweils gleichen Mischungen eingesetzt:
[]



Da Ethanal und NADH stchiometrisch im selben Verhltnis gebildet werden gilt:
[] []

[NAD
+
] errechnet sich aus der eingesetzten Menge und dem entstehenden NADH:
[

] [

[]
[NAD
+
]
Stammlsung
= 5 mM

Kvetten 1-7:
[


Kvetten 8,9:
[



Genauso errechnet man [Ethanol] aus der zu Beginn eingesetzten Menge und dem
entstehenden Ethanal (bzw. [NADH], aufgrund des stchiometrischen Verhltnisses):
[] []

[]

[Ethanol]
Stammlsung
= 6,25 mM

Kvetten 1,2,3,4,5,8,9:
[]


Kvetten 6,7:
[]


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Beispielrechnung Kvetten 2+3:

[



[]



[]

] [

[]



[] []

[]



Analog werden die restlichen Werte berechnet, sie sind in der nachfolgenden Tabelle
einzusehen.
Eingesetzte
Konzentration

Mittelwert
der
Extinktion
E
Berechnete Gleichgewichtskonzentration

Berechnete
Konstante

NAD
+
5*10
-3


Ethanol
6,25*10
-3


[NADH]=
[Ethanal]
[

]
[NAD
+
]

[

]
[Ethanol]

[

]
[H
+
]

[

]
K

[

]
Kv.
2,3
0,1ml 0,1ml 0,0845 0,0136 0,1864 0,2364 1,58 4,66
Kv.
4,5
0,1ml 0,1ml 0,142 0,0229 0,1771 0,2271 0,158 2,06
Kv.
6,7
0,1ml 0,2ml 0,079 0,0127 0,1873 0,4873 1,58 2,79
Kv.
8,9
0,2ml 0,1ml 0,212 0,0342 0,3658 0,2158 1,58 23,41
Tabelle 6: Berechnung der Gleichgewichtskonstante K bei verschiedenen Konzentrationen



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4. Bestimmung der relativen spezifischen Aktivitt von ADH
gegenber verschiedenen Alkoholen

Berechnung der Reaktionsgeschwindigkeit:



Alkohol Extinktion (t = 2
min)
Extinktionsnderung
[E/min]
V [*10
-2
mol/min]
Ethanol 0,360 0,18 7,27
Methanol 0,004 0,002 0,08
1-Propanol 0,182 0,091 3,68
1-Butanol 0,058 0,029 1,17
Tabelle 7: Bestimmung der relativen spezifischen Aktivitt von ADH

Aus der Tabelle ist zu erkennen, dass das Enzym ADH die grte Aktivitt mit dem Ethanol
besitzt. Daraus schliet man, dass es sich hierbei um das Hauptsubstrat handelt.
Methanol wird kaum umgesetzt. Dies liegt an der fehlenden Prochiralitt. Dadurch wird
Methanol nicht durch das Enzym umgesetzt und es entsteht auch kein NADH. Somit ist keine
Extinktion zu notieren.
Die Aktivitt von ADH bzgl. Propanol ist hher als bzgl. Butanol. Dies ist mit der Kettenlnge
zu erklren. Dadurch dass das Butanol eine CH
2
-Gruppe mehr besitzt, ist seine rumliche
Anordnung flexibler und verhindert aus rumlichen Grnden teilweise die Reaktion mit dem
ADH.



















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IV. Diskussion

Allgemein

Die Messwerte unterliegen den blichen Fehlerquellen. Ergebnisse die nicht den
Erwartungen entsprechen knnen durch unsauberes Arbeiten wie Pipettierfehler verflscht
worden sein. Es mussten Kvetten benutzt werden, die vorher schon einmal benutzt worden
waren. Es kann also sein, dass die Kvetten nicht ausreichend gewaschen wurden und somit
Rckstnde vorhanden waren. Ein weiterer Grund fr die Verflschung der Ergebnisse kann
die Zeit sein. Man sollte mit Enzymen schnell und sauber arbeiten. Dies war nicht immer der
Fall.

Extinktionsspektren von NAD+ und NADH

Im Nikotinamidring des oxidierten NAD
+
liegen das C
4
-und das N- Atom
trigonal-planar sp2-hybridisiert vor (siehe mesomere Grenzformel in der Einleitung).
Bei der Reduktion greift das Hydridion an das C
4
-Atom nukleophil an, welches dadurch sp3-
hybridisiert (keine Doppelbindung oder unbesetzte Orbitale gleichmige
Ladungsverteilung in den Orbitalen) wird und eine tetraedische Form einnimmt. Das N-Atom
erhlt ein freies Elektronenpaar, die mesomere Struktur des konjugierten Systems ist nicht
mehr vorhanden. Die neue chinoide Struktur hat andere Absorptionseigenschaften.

In der Literatur:



Gemessen und berechnet:



Die Abweichung von 14,7% ist nicht gering, aber auch nicht sehr hoch. Die Annahme ist, dass
kleine Fehler gemacht wurden oder das Gef verschmutzt war. Zudem war die
Quarzkvette beschdigt, was zustzlich eine Verflschung der Ergebnisse verursacht haben
knnte.


Bestimmung der Konzentration einer unbekannten NAD+- und Ethanollsung

Die ermittelten Konzentration aus beiden Verdnnungen (1:50, 1:100) sind in Tabelle 4
identisch und in Tabelle 5 kaum unterschiedlich, was ein schnes Ergebnis ist es weist
darauf hin, dass sauber gearbeitet wurde und keine Fehler unterlaufen sind.
Die Konzentrationen von 6,3 mM (Ethanol) und 3,55 mM (NAD
+
, Mittelwert) erscheinen
realistisch. Derartige Konzentrationen finden hufig in Laboren Anwendung, die geringe
Streuweite der Ergebnisse besttigt den Erfolg des Versuchs.




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Gleichgewichtskonstante K der ADH-katalysierten Reaktion

Die Gleichgewichtskonstante K beschreibt das Verhltnis von Produkt- und
Eduktkonzentrationen einer Reaktion im Gleichgewicht. Zur Bestimmung von K wurden
verschiedene Konzentrationen der an der Reaktion beteiligten Stoffe verwendet.

Ist K<1, dann liegen mehr Edukte (Ethanol und NAD
+
) vor.

Im Fall K>1 liegt das Gleichgewicht auf Seiten der Produkte (Ethanal, NADH und H
+
).

Jeder der errechneten Werte liegt weiter unter 1, was bedeutet, dass die Reaktion kaum in
Richtung des Ethanals stattfindet.
Literaturwert von K der ADH-Reaktion:
K = 8*10
-12

Die Abweichungen streuen in einem groen Bereich (einer der Werte scheint sehr
unrealistisch eine Verfehlung um 193%). Interessanterweise betrgt der Mittelwert der
errechneten K-Werte 8,23*10
-12
, was dem Literaturwert sehr nahe kommt. Der Grund fr die
starken Abweichungen sind die einzelnen Versuchsaufbauten. In den Kvetten 4 und 5
wurde ein Puffer mit einem hheren pH-Wert eingesetzt, dem Gemisch werden Protonen
entzogen. Das daraus resultierende K ist deshalb besonders klein.
Eine Reduzierung der Abweichung erreicht man durch Einsetzen von Ethanol- und NAD
+
-
berschusskonzentrationen, die Reaktion ist dann nicht limitiert und kann frei ablaufen.
Dadurch sollte es mglich sein, dem Literaturwert nahe zu kommen.
Weitere Abweichungen ergeben sich durch Rundungen in der Berechnung. Leider konnten
keine Ergebnisse mit nur geringen Abweichungen (geringste: 41,75%) erzeugt werden. Aus
den oben beschriebenen Grnden und wie immer fehlerhaftem, unsauberem Arbeiten
lassen sich die groben Abweichungen erklren. Der Erfolg des Versuchs war daher mig.
7

Relative spezifische Aktivitt der ADH bei verschiedenen Alkoholen

Aus Tabelle 7 lsst sich fr die Umsetzungsgeschwindigkeiten folgende Beziehung ablesen:



Ethanol besitzt als Hauptsubstrat die hchste Umsatzgeschwindigkeit. Im Fall von 1-Propanol
und 1-Butanol sinkt die Umsatzgeschwindigkeit mit der Lnge des Molekls. Als prochirale,
primre Alkohole sind sie zwar auch als Substrat geeignet, jedoch steigt die sterische
Hinderung mit der Gre des Molekls, es kommt seltener zu wirksamen Zusammensten
der Molekle und einer Bindung an das aktive Zentrum des Enzyms.
Methanol wird mit einer kaum messbaren Geschwindigkeit umgesetzt, weil dem Molekl
der prochirale Charakter (zwar tetraedisch, aber 3 gleiche Substituenten; siehe Definition in
der Einleitung) fr die Umsetzung durch das stereospezifische ADH fehlt.