Protokoll Proteinchemisches Praktikum SS22: Versuch Ellman:

Bestimmung der Gesamtzahl der Mercaptogruppen der

Alkoholdehydrogenase im Ellman-Assay

1. Einleitung
Grundsätzlich wird im Versuch Ellman mit Enzymen gearbeitet. Diese helfen
dabei, Reaktionen mit niedrigerer Aktivierungsenergie durchzuführen, als
wenn diese nicht vorhanden wären. Im Versuch werden dabei speziell die
Dehydrogenasen verwendet. Sie katalysieren dabei Reaktionen, bei denen
Wasserstoff von einem Molekül zum anderen übertragen wird. Deswegen
gehören sie auch zur Klasse der Oxidoreduktasen. Im Versuch, und auch
allgemein, findet die Übertragung der Wasserstoff-Atome mithilfe von
sogenannten Co-Enzymen statt. Diese funktionieren dabei als Donor
(Spender) bzw. Akzeptor (Empfänger) dieser Wasserstoffatome. Für den
Ellman-Versuch wird hierbei, wie in vielen anderen biochemischen
Vorgängen auch, das Coenzym NAD+ verwendet. Dieses Coenzym ist in der
Lage ein Wasserstoff-Atom aufnehmen, und damit zum reduzierten
Cofaktor NADH zu werden. Der aufgenommene Wasserstoff, befindet sich
nun am C4 Atom, zusammen mit einem „chemisch nicht äquivalenten H-
Atom“ als Susbtituent. Diese Substituenten werden nun enzymspezifisch zur
Rückreaktion abgetrennt. Dabei verwenden die Alkoholdehydrogenase und
weitere Dehydrogenasen, ausschließlich das Hr Atom. Diese Enzyme sind
hauptsächlich für die Reduktion alkoholischer Gruppen zuständig. Das
andere H-Atom (Hs) wird dabei hauptsächlich von Carboxylgruppen
verwendet.
Ein Beispiel für eine Anwendung der ADH, ist die Hefe ADH, welche auch in
diesem Versuch benutzt wird. Sie katalyisert Acetaldehyd zu Ethanol, durch
abgabe des Wasserstoffs am NADH:
(Bild von Acetaldehyd zu Ethanol)
Die Hefe-ADH ist hierbei aus vier identischen Untereinheiten aufgebaut, die
strukturell exakt gleich sind. Solch einen Aufbau nennt man Homotetramer.
In jeder dieser 4 Untereinheiten befindet sich ein aktives Zentrum, in
welchem je zwei Cystein-Reste vorhanden sind. Sie sind von Bedeutung für
die Enzymaktivität, da sie sich an die Zn2+ Ligandenpositionen heften, und
die dadurch hervorgerufene stärkere Polarisation, eine leichtere Bindung
der verschiedenen Gruppen des Acetaldehyds, ermöglicht. Zusätzlich besitzt
die Hefe-ADH auch noch 6 weitere, für Enzymaktivität allerdings
bedeutungslose Cystein-Reste.
Im Versuch soll nun mithilfe des Ellman-Assays die Anzahl der freien Cystein-
Reste der ADH ermittelt werden.
2. Durchführung
Die Durchführung des Ellman-Versuchs kann im Wesentlichen auf drei
Aufgabenstellungen aufgeteilt werden:
A. Konzentrationsbestimmung der ADH-Lösung durch UV-Absorption des
Proteins
B. Durchführung eines Ellman-Assays + Erstellen einer
Ausgleichsgeraden unter Verwendung von N-Acetylcystein als
Substrat
C. Bestimmung essentieller Thiolgruppen der ADH, und Bestimmung der
Gesamtanzahl an Mercaptogruppen
Grundsätzliche Vorarbeiten:
Dieses Vorarbeiten, diente dazu alle Lösungen und Gemische herzustellen,
um dann schnell mit ihnen arbeiten zu können, wenn nötig. Ebenfalls
verkürzt es die Wartezeit (zum Beispiel die, der Inkubation), wenn die
Lösungen am Anfang angesetzt werden. Einige Lösungen waren bereits
schon am Platz bereitgestellt, und mussten so entgegen der Anweisung im
Skript nicht selbst hergestellt werden. Folgende Lösungen/Stoffgemische
wurden am Anfang hergestellt:
- Herstellen einer ADH-Stammlösung
- Herstellung eine ADH-Lösung in 6,4M Harnstoff
- Herstellung einer Lösung aus 1,920 ml 8M Harnstoff und 480ml ADH-
Stammlösung (Anschließende Inkubation für 90min bei 30° Celsius)
 - Herstellung einer 1:10 Verdünnung von N-Acetylcystein mit PBS-
Puffer
A: Zur Konzentrationsbestimmung der ADH-Lösung, wurde lediglich die in
der Vorarbeit hergestellte ADH-Stammlösung um ein 10faches mit PBS
Puffer verdünnt, und anschließend im Photometer bei 280 nm Extinktion
gemessen.
B: Für die Auswertung zur Gesamtanzahl der Marcaptogruppen der ADH,
wird ein Ellman-Assay durchgeführt. Hierfür wird zuerst eine
Ausgleichsgerade erstellt. Die verschiedenen Konzentrationen für N-
Acetylcystein laufen dabei von 0-30 µl. Zusätzlich dazu wird jeweils DTNB-
Stammlösung (50µl) und PBS-Puffer zum Auffüllen benutzt. Jeder dieser
Ansätze wird nun dreimal hergestellt, und im Wasserbad für 30min bei 30°
inkubiert. Die im Anschluss bei 412nm gemessene Absorption wird in die
Tabelle eingetragen, und ein Mittelwert aus den drei Proben gezogen.
C: Im letzten Versuchsteil wird nun noch die Anzahl frei zugänglicher
Mercaptogruppen jeder Enzymuntereinheit bestimmt (1), sowie die
Gesamtzahl aller Mercaptogruppen pro Enzymuntereinheit (2):
(1): Zur Bestimmung der freien Mercaptogruppen wurde ein
Reaktionsansatz aus 150µl der zuvor hergestellten ADH-Stammlösung,600µl
PBS und 37,5 µl DTNB-Lösung dreimal hergestellt und die Absorption bei
412nm gemessen. Auch hier wird wieder der Mittelwert aus allen drei
Proben gezogen.
(2): Für die Gesamtanzahlbestimmung der Mercaptogruppen wurden auch 3
Proben wie in (1), dieses Mal allerdings mit 750 µl ADH-Lösung mit Harnstoff
und 37,5 µl DTNB-Lösung hergestellt

3. Ergebnisse
A: Konzentrationsbestimmung der ADH-Lösung:
Zur Bestimmung der Konzentration von ADH, in der ADH-Stammlösung
wurde die Extinktion bei 280nm gemessen. Unser Wert war dabei 0,124
E= ε *c*d (Lambert Beer´sches Gesetz)
E: gemessene Extinktion; ε: Extinktionskoeffizient v. ADH;
C: ADH-Konzentration; d: Schichtdicke der Küvette
 In unserem Versuch ist d=1cm und der Extinktionskoeffizient der ADH
beträgt 1,49 ml/mg*cm. Damit lässt sich nun die Konzentration ausrechnen:
C = E / ε*d = 0,124 / 1,49 ml/mg*cm * 1 cm =
Diese Konzentration wurde allerdings zu beginn des Versuches um ein 10-
faches verdünnt. Die eigentliche Konzentration beträgt also:

B: Ausgleichsgerade:
Die Ausgleichsgerade wurde aus folgenden Daten erstellt:

0 5 10 15 20 25 30 Konz. In µM

0 0,049 0,138 0,158 0,225 0,28 0,332 A

0,001 0,05 0,12 0,163 0,276 0,279 0,346 B

0,003 0,046 0,118 0,162 0,17 0,267 0,344 C

0,001 0,048 0,125 0,161 0,224 0,275 0,341 Durchschnitt

Ausgleichsgerade
0.4
0.341
0.35

0.3 0.275

0.25 0.224
Extinktion

0.2
0.161
0.15 0.125

0.1
0.048
0.05
0.001
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Konzentration N-Acetylcystein in µM

Berechnung des Extinktionskoeffizienten von NTB: ε = E30 -E0 / (c30-c0) * d

= 0,341-0,001/ (30-0)*10-6 M * 1 cm = 11333 l/mol*cm
C:
(1): Bei der Bestimmung der Anzahl freier Cystein-Gruppen pro
Enzymuntereinheit gilt, dass die Konzentration von NTB gleich der, der
freien Cysteingruppen entspricht, also CNTB = CCystein
C = E / ε * d = 0,133 / 11333 l/mol * cm * 1 cm = 11,736 * 10-6 M= 11,736 µM
Um letztendlich die Anzahl der einzelnen Cystein-Gruppen zu bestimmen,
muss zuerst die verdünnte Konzentration der ADH- Stammlösung
berechnen. Der Reaktionsansatz bestand hierfür aus 150 µl ADH-Lösung, in
insgesamt 787,5 µl Lösung. Also ein Verhältnis von 150/787,5. Mit der in A
berechneten ADH-Konzentration lässt sich alles wie folgt berechnen:
C = CA * 150/787,5 = XXX * 150/787,5 = XXX µM

Nun lässt sich die Anzahl berechnen aus n= CCystein / Cverdünntes ADH
= 11,824 µM/ XXX µM = XXX
Messdaten hierfür sind dieser Tabelle zu entnehmen:
Probe E412nm E412nm ΔE412nm CNTB N
Native ADH ADH+DTNB PBS+DTNB [µM]
(Mittelwert
aus 4.2)
A 0,140 - - - -
B 0,130 - - - -
C 0,131 - - - -
Durchschnitt 0,134 0,001 0,133 11,736

(2): Zur Bestimmung aller Mercaptogruppen jeder ADH-Untereinheit,

werden nun die drei durch Harnstoff denaturierten Proben ausgewertet:
Probe E412nm E412nm ΔE412nm CNTB N
denaturierte ADH + PBS + [µM]
ADH DTNB + DTNB +
Harnstoff Harnstoff
A 0,191 0,000 - - -
B 0,191 0,000 - - -
C 0,188 0,000 - - -
Durchschnitt 0,190 0,000 0,190 16,77
 C = 0,190 / 11333 l/mol*cm * 1 cm = 16,765 * 10-6 M = 16,77 µM
Die Konzentration wurde dabei wie in Abschnitt (1) berechnet. Zur
letztendlichen Bestimmung der Mercatpogruppen wird ebenfalls erneut auf
den selben Wert der ADH-Konzentration bei (1) zurückgegriffen.