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Allgemeine Methoden:

ZELLE:
Laborgrundlagen ( 11.4.2012)
Lsungen:
Allgemeines:

Lsung = homogenes Gemisch aus mindestens 2 chemischen Stoffen

Lsungsmittel (Solvens) meistens Wasser oder ein Puffer ( Puffer ist ein Gemisch aus
mehreren Substanzen) / zu lsende Substanz (Solut)

Limitierender Faktor = Lslichkeit: gibt an, in welchem Umfang eine Substanz


(Solut) im Lsungsmittel ( Solvens) gelst werden kann
o

Lslichkeit hngt ab vom eigentlichen Lsungsmittel und von weiten


gelsten Substanzen/ Co-Substanzen

Maximale Lslichkeit ist charakteristisch fr jede


Substanz (Solut)/ Lsungsmittel (Solvens) Kombination (->
Lslichkeitsprodukt)

Gesttigte Lsung -> Suspension: hchstmgliche Menge eines Stoffen ist im


Lsungsmittel bis zu Sttigungsgrenze gelst, weiter Zugabe der Substanz kann
nicht mehr aufgelst werden

Suspension: heterogenes Stoffgemisch aus mindestens zwei chemischen Stoffen


einer Flssigkeit und einem festen Stoff- der bis zur Sttigungsgrenze gelst ist

Eigenschaften von Lsungen:

PH- Wert:
o

Negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration


pH= -log c (HO)

pH <7 = saure Lsung


Lsung

Messung des pH-Wertes ber Indikatoren oder pH-Eletrode

Ionenstrke: Ma fr elektische Feldstrke gelster Ionen

pH: 7 = neutrale Lsung

pH > 7 = basische

Stoffmenge n in mol:
o

Quantitative SI-Basisgre

Gibt die Anzahl an Teilchen ( Molekle, Ionen etc.) an

1 mol = 6,02210 Teilchen (Avogadro- Konstante)

n=

n= cV

m= Masse in g

M= Molare Masse in

Molare Masse M in
o

Summe der Masse aller Atome im Molekl bezogen auf 1 mol Stoffmenge

M=

m= Masse in g

n= Stoffmenge in mol

!
!
!

Konzentration c in :
o

Stoffmengenkonzentration: c=

Massenkonzentration eines Stoffes i : p(i) =

Volumenkonzentration eines Stoffes i : (i) = keine Einheit, hufig in %

in

Verdnnen einer Lsung:


o

c=

c= Ausgangskonzentration von der zu verdnnenden Lsung


c= Endkonzentration nach Verdnnung
V = Ausgangsvolumen vor Verdnnung V= Endvolumen

Puffer:

Verwendung
o

Puffer werden verwendet um gnstige und konstante pH-Werte und


Salzkonzentrationen fr die enzymatische Aktivitt zu erhalten, Proteine vor
der Denaturierung zu schtzen und passende Bedingungen fr die Kultur von
Mikroorganismen und Geweben herzustellen

Lsungssystem, welches nderungen des pH-Wertes gegenber bestndig ist


und bei Zugabe oder Verlust von Sure oder Base die nderung minimal hlt

Bsp.: Carbonat-Puffer stabilisiert den pH-Wertes von Blut auf 7,35 7,45

Zusammensetzung : Schwache Sure + korrespondierende Base und Salzen

Wird ber seine Komponenten und den pH-Wert charakterisiert

pH-Wert ist im geringen Mae temperaturabhngig

Henderson-Hasselbach-Gleichung
o

pH = pK + log ()

Puffer ist unabhngig von seiner Gesamtkonzentration, solange das


Konzentrationsverhltnis Salz/Sure konstant bleibt

Keine wesentliche Vernderung des pH-Wertes bei Verdnnung oder


Zugabe geringer Mengen an Sure/Base

Ermglicht die Berechnung des Pufferkapazitt und die Ermittlung des pHWertes (ber die analytisch bestimmbaren Konzentrationen von Salz und
Sure und den messbaren pK-Wert), Bei gleicher Konzentration an Salz und
Sure, gilt pH=pK

Kenngre / Pufferkapazitt : =

Ausdruck fr die Wirkung eines Puffers bezglich des Zusatzes einer


Sure oder Base

Beschreibt die nderung des pH-Wertes der Pufferlsung in


Abhngigkeit vom Sure- bzw. Basezusatz

Puffersystem hat die Kapazitt = 1, wenn sich bei Zugabe von 1 mol
HO bzw. OH Ionen zu 1 Liter Pufferlsung der pH-Wert um eine
Einheit ndert

Pufferkapazitt hngt von der Gesamtkonzentration des


Puffersystems ab
-> Je konzentrierter eine Pufferlsung ist, desto
grer ist ihre Pufferkapazitt

Pufferkapazitt wird von der Zusammensetzung des Systems


bestimmt:
sie erreicht ein Maximum, wenn quimolare Mengen
an schwacher Sure und konjugierter Base enthalten sind (Verhltnis
von zwei verschiedenen Moleklen im Verhltnis 1:1) pH-Wert
enspricht dem pK-Wert der schwachen
Sure

Biologische Puffer:

!
Zentrifugieren:

Trennung einer Substanz aus einer Suspension (heterogenes Stoffgemisch bis zur
Sttigungsgrenze gelst ) in einem Zentifugalkraftfeld
o

Substanz wird hufig vorher durch Fllungsreagenzien ausgefllt

Trennung von Lsungen ( Bsp.: Trennung von Blut in seine Bestandteile ->
Auftrennung nach unterschiedlicher Sedimentationsgeschwindigkeit)

Ansetzen von Lsungen/ Puffern : Beispiele aus dem Praktikum:

100 ml einer 60 mM NaHPO x 2 HO Lsung ansetzen ( M= 178g/mol)


o

1 Liter -> 178 g (1mol)

/ : 10

(1000 ml -> 100 ml)

100 ml -> 17,8 g (1mol)

/ x0,06 (1 mol -> 60 mM)

100 ml -> 1,068 g (0,06 mol -> 60 mM)

100 ml einer 30mM NaHPO x 2 HO Lsung ansetzen (M= 156 g/mol)


o

1 Liter -> 156 g (1mol)

100 ml -> 15,6 g (1mol)

100 ml -> 0,468 g (30 mM -> 0,03mol)

/ x 0,03

50 ml der 60 mM NaHPO x 2 HO Lsung und 25 ml der 30mM NaHPO x 2 HO


Lsung mischen und die Konzentration des entstehenden Puffers berechnen:
o

c=

c= ! c= ! c= = 0,05 M

n= cV

!
Proteinaufreinigung und Bestimmung (18.4.2012)
Hintergrund:

Proteine knnen aufgrund ihrer biophysischen Eigenschaften aus Komplexen


Gemischen
( Zellextrakte) aufgereinigt werden
o

Ionenaustausch Chromatographie : Auftrennung nach Ladung

!
!
!
!
!
oGelfiltration : Auftrennung nach Gre

!
!
!
!
!
oAffinittschromatographie:
Bindung von Proteinen an bestimmte Komponenten in
der Trennungssule -> Methode aus dem Praktikum
Ziel: His p97 aus dem Zellextrakt zu gewinnen
indem man dessen hohe Affinitt zu Ni ausnutzt,
welches in der Waschsule gebunden vorliegt
Wegwaschen der ungebundenen Proteine
Elution durch Imidazol, da dieses mit dem His-p97
um die Bindung mit dem Ni konkurriert
Die Ausbeute und die Anreicherung werden anschlieend durch
Proteinbestimmung und SDS-Gelelektrophorese geprft

!
!
!
!
Proteinbestimmung nach Bradford:

Bio-Rad Protein Assay basiert auf dem Farbumschlag ( 465 nm nach 595 nm ) nach
Bindung des Farbstoffes Coomassie-Brilliant-Blau G-250 an die basischen und
aromatischen Seitenketten ( vor allem Arginin)

Der Extinktionskoeffizient (wie viel elektromagnetische Strahlung eine spezielle


Substanz bei einer bestimmten Wellenlnge absorbiert) des Farbstoff-ProteinKomplexes ist sehr viel hher als der des freien Farbstoffes

Deshalb kann die Zunahme der Absorption bei 595 nm durch die Bildung des
Komplexes gegen das freie Farbreagenz photometrisch gemessen werden

Ist ein Ma fr die Proteinkonzentration der Lsung

Strke der Farbreaktion hngt jedoch von Protein ab und ist sehr stranfllig

Zweck:
o

Charakterisierung der Aktivitt ( Bindung, Katalyse, biologische Aktivitt)

Charakterisierung der Beschaffenheit ( Sequenz, Modifikation, Struktur)

Immunisierung

Woraus und Wie?

Zell- oder Gewebe Lysate

Kulturberstnde

Endogen oder heterolog exprimierte Proteine:

Heterologe Expression:

Expressionssysteme:

Bakterien

Hefe

Insektenzellen

Sugetierzellen

Auswahl der Expressionssysteme:


o

Lslichkeit der Proteine

Codon Verstndigung ( Baktieren mssen Codon


lesen knnen)

Giftigkeit (Zelltod)

Sauberkeit (kann es komplett gereinigt werden?)

Post-translationale Modifikation

Menge, Ausbeute

Pro und Kontra der Expressionssysteme:

!
Bakterien

Hefe

Insekten

Sugetiere

Vermehrung

Schnell

Schnell

Langsam

Langsam

Zellkultur

Einfach

Einfach

Mig

Komplex

Kosten

Gering

Gering

Mig

Hoch

Expressionsgeschwind Schnell
igkeit

Langsam
Schnell

Langsam Schnell

Mig

Faltung

Mig

Gut

Exzellent

Schlecht

Elektrophorese (25.4.2012)
Definition:

Analytische Methode zur Trennung von speziellen Moleklen

Grundvoraussetzung: Die zu trennenden Molekle mssen geladen sein, da sie unter


Einfluss eines elektrischen Feldes durch das Gel wandern

Auftrennung erfolgt nach Gre und Ladung / Das Gel dient als Sieb
o

Auftrennungsverhalten = umgekehrt proportional zur (log.) Gre des


Molekls

Positiv geladene Molekle (Kationen) = wandern zur negativ geladenen


Kathode

Negativ geladene Molekle ( Anionen) = wandern zur positiv geladenen


Anode

Was wird analysiert?

DNA / RNA

Proteine

Verfahren:

Agarose(gelelektrophorese )
o

Agarose: Besteht aus glykosidisch verbundener D-Galaktose und 3,6Anhydrogalaktose

Dient als interne Matrix, in der DNA- Molekle in einem elektrischen Feld
wandern

Agarosekonzentration wird der zu analysierenden Nukleinsure angepasst

Je krzer die Ketten desto hher die Agarosekonzentration


Agarosekonzentration [%]

Kettenlnge [kb]

0,6

1- 20

1,5

0,3 - 6

DNA / RNA Analyse mittels Agarosegelelektrophorese

DNA Aufbau:

in regelmigen Abstnden ist eine negative Ladung vorhaben


-> Die DNA wandert zur Anode (+)

Masse: Ladungsverhltnis ist proportional

In freier Lsung wandern alle Nukleinsuren


grenunabhngig -> Agarose wirkt als Sieb das groe
Molekle mehr bremst als kleine

Abhngigkeiten der Nukleinsureauftrennung:

Agarosekonzentration

Gre der Nukleinsure

Form : Die DNA kann mindestens 3 Formen aufweisen


o

Ccc-Form ( circular covalently closed ) ->


Superhelikale Forme

Oc Form ( open circle) -> relaxierte Form

Linearisierte DNA

Jede Form hat die gleiche Masse aber ein anderen


gelelektrophoretisches Auftrennungsverhalten

!
!

Nachweis der Nukleinsure

Frbung durch Ethidiumbromid


o

Interkaliert mit seinen planaren Moleklen zwischen


den Basen der DNA-Doppelhelix -> Kanzerogene
(Krebserzeugende) Wirkung

Visualisierung durch Anregung mit UV/blau-Licht bei


300-500nm

Frbung mit Midori Green


o

Interagiert it dem Phosphatrckgrat der DNA -> keine


mutagene Wirkung

Visualisierung mit UV Licht

Emission bei 540nm

Proteinanalyse mittels Gelelektrophorese


o

Fhrt zur Emission von Fluoreszenzlicht bei


585nm

Analyse durch Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE)

Matrix = Acrylamid -> polymerisiert unter Freisetzung von Radikalen


und wird mit N,N-Methylenbisacrylamid quervernetzt

Initialisierung = Ammoniumpersulfat (APS)

Katalysator = N,N,N,N-Tetramethyl-Ethylendiamin (TEMED)

Native Gelelektrophorese
o

Proteine werden in geeigneten Puffer gegeben -> Denaturierung

Ladung bei Proteinen:

R = Rest der Aminosure

Isoelektrischer Punkt von Aminosuren und damit auch von


ganzen Proteinen ist wichtig

Puffer fr die Gelelektrophorese mssen einen


entsprechenden pH-Wert aufweisen, so dass das Protein
negativ geladen vorliegen kann

!
!
o

Vor- und
Nachteile
nativen Gelelektrophorese

der

Vorteil:

Proteine bleiben nativ und knnen fr weitere Assays genutzt


werden

Native Proteinkonformation kann untersucht werden


( Sekundr-, Tertirstrukturen und Oligomerisierung)

Analysen von Modifikationen : Kleiner nderungen wie


Phosphorylierung oder Ausbildung von Disulfidbrcken knnen
beobachtet werden

!
!

Nachteil

Fr jedes Protein muss ein optimaler Puffer (pH-Wert)


bestimmt werden

Analyse von Proteinkomplexen wird aufgrund der Gre und


Zusammensetzung sehr schwierig

Proteingemische knnen nicht analysiert werden

Sehr langsame elektr. Auftrennung ntig fr die


Proteinstabilitt

Diskontinuierliche SDS PAGE


o

Prinzip:

Um die konstante Ladung der Proteine zu erhalten werden die Proben


und das Polyacrylamidgel mit Sodiumdodecylsulfat (SDS) versetzt

SDS bindet mit den hydrophoben Schwanz an die hydrophoben


Regionen der Proteine und richtet die geladenen Kopfgruppen
nach auen

Sekundr,- und Tertirstruktur des Proteins werden


zerstrt
! konstantes Ladung : Masse
Verhltnis wird erzeugt

Proben werden zur weiteren Denaturierung gekocht

Detergenzien, wie Dithiothreitol (DTT) oder -Mercaptoethanol


werden hinzugegeben, um Disulfidbrcken auf zu lsen

Zur Optimierung des Auftrennungsverhaltens der SDS-PAGE werden 2


Gele bereinander gegossen und die Probe durchluft beide Bereiche
(diskontinuierliche Auftrennung)

Grundlagen:

2 verschiedene Gele : Sammel-, Trenngel

3 verschiedene Puffer: Sammel-, Trenn- und Laufpuffer

Sammelpuffer: niedrig konzentriertes TRIS/HCL pH: 6,8

Trennpuffer: hher konzentriertes TRIS/HCL

Laufpuffer: TRIS/Glycin

pH:8,8

Proteinproben (blau) werden in die Taschen pipettiert

Sammelgel = niedrige Konzentration an TRIS/HCL (grne Kugeln)

Trenngel = hohe Konzentration an TRIS/HCL

Im Sammelgel: Glycin (orange) als Zwitterion (neutrale Ladung )


Mobilitt als das negativ geladene Chlorid (grn)

-> viel geringere

Zwischen den Lauffronten des Leitions (Chlorid) und des Folgeions (Glycin) bilden
sich wegen der Potentialdifferenz Proteinstapel (blau) -> wandern gleich schnell

Trenngel: nderung des pH-Wertes und der Porengre

Glycin liegt negativ geladen vor (Glycinat) -> wandert schneller = Potentialdifferenz
hebt sich auf

Kleinere Poren: Proteinstapel verdichten sich -> werden nach Gre aufgetrennt

Nachweis von Proteinen:

Coomassie Blue R-250 -Frbung:

Bindet im sauren Milieu an Proteinen

Hintergrundfrbung wird durch Essigsure herausgewaschen

Nachweisgrenze: 100 ng

Silberfrbung

Beruht auf der Komplexbildung von Ag-Ionen mit Glutamin-,


Asparagin- und Cysteinresten von Proteinen

Detektion durch Agenzien -> reduzieren die Ag-Ionen zu


metallischem Silber

Nachweisgrenze: < 10 ng

Indirekter Nachweis:

Western-Blot
Protein wird auf eine Membran bertragen und mittels
spezieller Antikrper detektiert

Spezielle Gelelektrophoresen wie zB.: 2D- Gelelektrophorese

Nachweis von Proteinen aus einem groen Gemisch

Grundlage fr Proteom-Analysen

Unterscheid zur einfachen SDS-PAGE -> es werden zwei


Trennverfahren angewandt

1. Dimension

Isoelektrische Fokussierung (IEF)

Immobilisierter pH-Gradient wird auf einen Gelstreifen aus


Polyacrykamid angelegt

Eine Seite: Arcylamidderivate mit sauren funktionellen


Gruppen

Andere Seite: Acrylamidderivate mit alkalischen funktionellen


Gruppen

Spannung wird angelegt:


o

Auf geladene Proteine wirkt eine Kraft die sie zu einer


Seite zieht bzw.von ihr wegschiebt

Entspricht der pH-Wert dem isoelektrischen Punkt so


sind keine wirenden Ladungen mehr vorhaben
( Fokussierung)

2. Dimension:

Proben werden nach Molekulargewicht aufgetrennt


Trennung mittels SDS-PAGE
Gelstreifen der 1.Dimension wird mit in das Gel
gegossen (keine Kmme)
Nachweis mittels Silberfrbung

!
Praktikumsskript : Rechenbungen:

Wie viel NaCl mssen sie einwiegen, um 250 L einer Lsung der Konzentration 1
herzustellen?
o

Bentigte Formel : Massenkonzentration eines Stoffes i : p(i) =

V= 250 L ! 0,25ml

p= 1

m= pV = 0,25ml 1

= 0,25 mg

Man bentigt 0,25 mg NaCl

wir wollen m wissen

Wie viel L eier 100fach konzentrierten Kanamycin-Stammlsung mssen fr eine 25


ml Agarplatte verwendet werden, wenn fr die Selektion eine 1fache Konzentration
erforderlich ist?
o

Merksatz: (Volumen)

25 ml = 0,025 ml ! 25 L

Wie viel Gramm NaCl brauchen Sie, um 250 ml einer 1,16%igen Kochsalzlsung
herzustellen?
o
o
o

in

Dreisatz: 250 ml = 100%

x ml = 1,16 %

= 2,9 g
Man bentigt 2,9 g

Sie haben eine 20%ige und eine 36%ige SDS-Lsung. Wie viel ml jder Lsung braucht
man, um einen Liter einer 30%igen SDS-Lsung herzustellen?
o

Mischungsdreieck:

20%

36%
30%
6

(30%-20% ; 36% - 30% )


:

10

= 16 Teile bentigt

man insgesamt

!
!
!
!
!
!
!

6 Teile 20%ige Lsung von einem Liter Liter = 0,375 L ! 375 ml

10 Teile der 36%ign Lsung von einem Liter Liter = 0,625 L ! 625 ml

!
!
!
!
!
PCR (2.5.2012)
DNA-Aufbau:

Doppelhelix

Zucker-Phosphat-Rckgrat : 5-P / 3-OH

Vier Nukleinbasen: komplementre Paarung mittels Wasserstoffbrcken ( A-T / GC)

Replikation
! Topoisomerase entspiralisieren den DNA- Doppelstrang
! Helicasen trennen die Wasserstoffbrckenbindungen zwischen den Basenpaaren
! aufgespaltener Bereich = Replikationsgabel
! Strang in 5-3 Richtung: nicht codogener Strang: DNA Polymerase verknpft die
komplementren Nukleotide an den vorhandenen RNA-Primer und verknpft sie zu einem
Einzelstrang ( Kontinuierlicher Strang in (3-5 Richtung)
! Strang in 3-5 Richtung: codogener Strang: RNA Primer mssen von der Primerase immer neu
gebildet werden, da der Strang Diskontunierlich gebildet werden muss ( in 5-3 Richtung). Die
DNA Polymerase bildet nun wieder die komplementren Nukleotide. Die Primer werden spter
durch die DNA Polymerase durch Nukleotide ersetzt. Die Lcken die entstanden sind werden von
DNA Ligasen geschlossen

Ablauf der PCR:

3 Phasen Zyklen
o

1. Denaturierung der Doppelstrang DNA ( ca. 94C)

Wichtig: vollstndige Denaturierung zu Beginn

2. Anlagerung von Starteroligonukleotiden ( Primer) ( 50C-60C)

Zugnglichkeit der Matrizen - DNA

Wichtig: optimale Anlagerungstemperatur

Zu hoch : keine Primer-Anlagerung ! kein PCR-Produkt

Zu niedrig: unspezifische Anlagerung ! versch. PCR-Produkte

3. DNA-Strangsynthese ( Elongation, ca. 72C)

Ausreichende Elongationszeit

Unvollstndige Synthese ! Abbruchfragmente

Faustregel 1min fr 1.000 bp

Fr effiziente DNA Amplikation zu beachten:

Keine zu hohe Zyklenzahl ( meist 25 30)


o

Abschlieende Elongation
o

Anhufung von Fehlpaarunge

Vervollstndigung von Teilfragmenten

Sorgfltiges Arbeiten
o

Vermeidung von Kontaminationen

PCR-Programm fr das Praktikum :

%
Bestandteile einer PCR:

Matrizen ( Template ) meiste doppelstrngige DNA-Probe


o

Plasmid-DNA

Genomische DNA

PCR-Fragmente

Zellmaterial

Zwei Starteroligonukleotide ( Primer)


o

Meist 18-28 bp

G/C-Gehalt etwa 50%

Keine langen Sequenzwiederholungen

Nicht selbstkomplementr

Mglichst unique ( nicht verschiedene Bindestellen)

Mglichst 3 G/C Basen

hnliche Schmelztemperaturen (Tm)

Nherungsformel T(m) = 4 (G+C) + 2 (A+T)

Desoxyribonukleosid- Triphosphate (dNTPs)

Thermostabile DNA-Polymerase
o

Taq (Thermus aquaticus)

Pfu ( Pyrococcus furiosus)

Verschiedene Aktivitten z.B.: Proofreading (3 ! 5 Exonuklease)

Puffer
o

Optimale Reaktionsbedingungen fr die Enymaktivitt

MgCl / MgSO
o

Dient als Cofaktor

Erhht die dsDNA-Schmelztemperatur

Komplexiert mit Nukleotiden ! Substrat fr Polymerase

Konzentration auf Reaktionsansatz abgestimmt

Zu wenig : geringere Amplifikationseffizienz

Zu viel : ggf. unspezifische PCR-Produkte

HO:
o

Anhnge an 3-OH des Synthesestranges

Anpassung des Reaktionsvolumens und der Konzentrationen

Ggf. Enhancer (DMSO, TWEEN-20, Glycerin)


o

Erhhung der Spezifitt

Inhibierung von DNASekundrstrukturen

PCR-Ansatz im Kurs:

Plasmid-DNA als Template

Ca. 600 bp Fragmente

Test der MgCl- Abhngigkeit

Pipettierschema -> Sophie fragen !

!
!
Anwendungsaufgaben:

Vervielfltigung spezifischer Sequenzen


o

Klonierung, Sequenzierung

Nachweis bestimmter Sequenzen


o

Genexpressionsuntersuchung
o

Identifikation von Mutationen

Analyse von Transkriptleveln in verschieden Geweben

Medizinischer Diagnostik
o

Nachweis viraler/ bakterieller DNA, rechtsmedizinische Spurenanalyse,


Genotypisierung

Methoden:

PCR zu Klonierungszwecken
o

Einfgen von Restriktionsschnittstellen


mittels PCR

Megaprime-PRC
o

Verbindung von PRC-Fragmenten mit


bereinstimmender Endsequenz

PCR zu Mutantenherstellung
o

Einbringen von Deletionen, Insertionen,


Mutationen in eine DNA-Sequenz

!
!

Kolonie PCR
o

DNA Amplifikation ausgehend von Gazzellmaterial

Verwendung von wenig Zellmaterial ( Bakterien, Hefen)

Zellaufschluss ( Mikrowelle)

Zufgen des PCR-Mixes ( Bestandteile wie normale PCR, ohne


Matrizen-DNA)

Z.B. zu indirekten Identifikation von positiven Klonen,


Transformationen

ebenso mit Vollblut oder verschiedenen eukaryotischen Zelltypen


mglich (bentigt spezielle Isolierungsmethoden fr Nukleinsuren)

Nested PCR
o

Zwei aufeinander folgende PCRReaktionen

! Minimierung unspezifischer
Fragmente

Inverse PCR
o

Amplikation von unbekannten, genomischen DNA-Sequenzen

Voraussetzungen:

Bekannte, benachbarte Sequenzen

Restriktionsschnittstellen fr 300 1.00 bp Fragmente

Erkennungssequenzen fr entgegengesetzte Primer

Keine Schnittstellen zwischen den Primern

Herstellung ringfrmiger DNA

Reverse Transkriptase
o

Herstellung von copy DNA (cDNA) mittels reverser


Transkriptase

!
!
!
!
!
!
!
!

Real time PCR


o

Quantitative PCR

Analyse von gewebe- oder zell (zyklus)abhngiger Genexpression

Bestimmung der mRNA-Level sensitiver, genauer und schneller als


mittels Northern Blotting

Detektion mit Hilfe von Fluorophoren

SYBR-Green als Fluorophoren


o

Fluoreszenzstoff, der in dsDNA interkaliert

Anregung durch kurzwelliges UV-Licht

Wichtig: kann auch zwischen Primern und nicht


spezifischen PCR-Produkten interkalieren

!
!
!
!
!
!

Verwendung von Referenzproben ohne


Template DNA ( Hintergrundsignal)

Wichtig:

Verwendung eines internen Standards (z.B. Actin) mit


bekannter mRNA Menge

Test mehrerer Verdnnungsstufen der Probe ( variierende


Menge der Ausgangsmolekle)

Analyse nur im exponentiellen Bereich

Multiplex-PCR
o

Schnelle Methode zum


Nachweis chromosomaler
Aberrationen

Erfordert Kenntnis der zu


untersuchenden Sequenz

Mehrere Primerpaare in
einem Ansatz

Emission von lngerwelligem Licht ( 530nm)

!
!
Blotting (9.5.2012)
bersicht:
- berblick:

Elektrophoretisch aufgetrennte Proben von DNA, RNA oder Proteinen werden von
einem Gel auf eine Membran transferiert und dort irreversibel fixiert
( immobilisiert)

Einzige weiterfhrende Bewegungen sind auf Diffusionsvorgnge whrend des


Blottings zurckzufhren

Fr eine scharf abgegrenzte Detektion sollte man die schnelleren Verfahren


vorziehen

- Membranen:

Unterschiedliche Eigenschaften verschiedener Membran-Typen:


o

Nitrocellulosefilter (NC)

Hohe Bindekapazitt fr DNA und RNA ( 2h, 80C)

Proteine binden auch jedoch nicht kovalent und nur ein kleiner
Anteil des Proteins bleibt haften. Kleinere Proteine wandern durch
die Membran

Kleinere Porengre ! hhere Bindungskapazitt

Nachteil: brchig mechanische Instabilitt

Gelatinebeschichtung oder untersttzendes PolyesterNetzwerk als Trgermaterial

Hydrophob: Vor Verwendung mit Wasser anfeuchten

Nylonmembranen/ aktivierten Nylon

Reifest

Bindet gut Nukleinsuren, die man durch UV-Licht kovalent vernetzt

Nach dem Blotten mehrere Nachweise (Hybridisierung)

Hydrophil ! leichter handhabbar als NC

Puffersysteme mit hoher/niedriger Ionenstrke ( Elektroblotting)

Neutrale/geladene Membranen

Seiten mit unterscheidlichen Bindungskapazitten

Nachteil: hohe Bindungskapazitt (Hintergrund!)

Polyvinylidendifluoridmembranen (PVDF auf Teflonbasis)

Hohe Bindungskapazitt

Hohe mechanische Stabilitt

Hohe chemische Stabilitt

Mehrfache Verwendung

Einsatz fr direkte Proteinsequenzierung mglich

Zugnglich fr Coomassie Brilliant Blue Frbung

Nachteil: Frbungen nicht reversibel

Aktiviertes Papier (Diazo-Gruppen)

Vorteil: Kovalente Bindung von Proteinen ber primre Amine

Nachteil: Bindungsmethode mit den meisten


Gelelektrophoresesystemen nicht kompatibel

!
o

Ionenaustauschermembranen

Diethylaminoethly (DEAE) und Carboxymethly (CM)

Ionenbindung kann umgekehrt werden ! Einsatz zu prparativen


Zwecken

Nachteil : Sehr brchige Membranen

- Transfer:

Transferpuffer
o

Fr die Zusammensetzung des Puffers ist das Ausgangsmaterial entscheidend

Proteine = alkalischer Puffer

Nukleinsuren = saurer Puffer

Art des Gels muss beachtet werden

Diffusionsblotting:
o

Blotmembran wird auf die Geloberflche gelegt

bertragung der Molekle erfolgt durch Diffusion aus dem Gel

Allseitiger Vorgang: 2. Membran unter das Gel legen ! man erhlt einen
gespiegelten Transfer

Temperaturerhhung = Beschleunigung der Diffusion

Kapillarblotting
o

Standard fr RNA/DNA aus Agarose

Puffer wird ber Saugpapier durch das Gel


und die Blotmembran gesaugt
! Molekle werden aus dem Gel
mitgenommen und adsorbieren an der

Membran
o

Verschiedene Anordnung:

Einseitig gerichtetes Kapillarblotting auf eine einzelne oder mehrere


Membranen

Anordnung gegen die oder mit der Schwerkraft

Vakuumblotting / berdruckblotting:
o

Modifizierung Kapillarblotting

Druck=treibende Kraft

Apparatur mit porsem Trger, auf einer Seite geschlossen:

Unter- oder berdruck wird erzeugt der den Transferpuffer und die
Molekle durch das Gel auf die Membran treiben

Vorteil:

Zeitgewinn gegenber dem Kapillarblotting ( 30- 40 min Blotzeit)

Vermeidung von Rcktransfer

Nachteil:

Gel kann zusammenbrechen

Teure Apparatur ( Erfahrung erforderlich)

Elektrophoretischer Transfer (Elektroblotting)


o

Fr RNA/DNA + Protein aus PAA-Gelen

Wanderung von Nukleinsuren und Proteinen in einem elektrischen Feld von


dem Gel (Agarose) auf die Membran

Verfahren:

Tankblotting:

Hohe Stromstrke

hohe Salzkonzentration des Puffers fr die bertragung von


DNA auf Nitrocellulose

Starke Erwrmung

rascher Pufferabbau

Semidry-Verfahren:

Elektrodenplatten aus Platin oder Graphit

Geringere Erwrmung

!
- Blockierung:

Um zu verhindern das der Hintergrund der Membran strt, da er noch


Bindungskapazitt aufweist, werden unbesetzte Bindungsstellen mit

makromolekularen Substanzen besetzt die nicht an der Nachweis Reaktion


teilnehmen

Von Nukleinsuren:
o

Denhardts Puffer

Enthlt heterologe DNA

Fixierung : UV- Licht, 2h bei 80C

Von Proteinen :
o

Mehrere Mglichkeiten :

2 % - 10 % BSA

Magermilch oder 5% Magermilchpulver

% Gelatine

Mind. 1h bei 37C

- Nachweis Immunoblot & Hybridisierung :

Herkmmliche / unspezifische Frbemethoden


o

Proteine : Allgemeine / direkte Anfrbung von Proteinen ( direkte ProteinReportergruppen)

Schneller berblick ber die getrennten Proteine

Qualitative Beurteilung des Transferergebnisses

Methodenvalidierung von teuren/aufwendigen spezifischem Nachweis

Frbung der Blotmemben und der darauf befindlichen Strukturen

Protein-Farbkomplex unterschiedlicher Bindungsqualitten


( irreversibel (bessere Sensivitt knnen jedoch Proteinanalyse
beeintrchtigen), reversibel ( Proteine lassen sich
weiterverarbeiten))

Nachfolgende Entfrbung: Blotmembran transparent, gefrbte


Proteine treten hervor ( Proteinfrbung auch vor Blotting mglich)

Frbemethoden:

Amidoschwarz,

Coomassie-Brilliantblau

irreversibel

Ergebnis rel. Schnell sichtbar

Frbelsung stabil

Keine Hintergrundfrbung

Alle Oligopeptide werden erfasst ( < 10 15 aa)

Indian-Ink- Methode

irreversibel

Nachweisempfindlichkeit beinahe vergleichbar mit


Silber-Frbung

Ponceau S
o

Fast Green
o

Reversibel, vollstndig entfrbbar

Silber Frbung
o

Hohe Empfindlichkeit

Direkt visualisierbar

Nicht radioaktiv

Direkt- oder Nachfrbung von getrockneten nicht


ausreichend gefrbten Coomassie-Frbungen

Nukleinsuren: Allgemeine / direkte Abfrbung von Nukleinsuren


( direkte Nukleinsure-Reportergruppen)

hnlich wie bei Proteinen

Silber-Frbung
o

Reversibel, geeignet wenn Blots weiterverarbeitet


werden sollen

Hohe Empfindlichkeit

fluoreszensassoziierte Systeme
o

indirekt visualisierbar

nicht radioaktiv

Ethidiumbromid-Frbung (interkaliert in DNA/RNA)

Acridin.Orange-Frbung: emittiert gebunden an DNA


im grnen Farbbreich, an RNA im Orange/roten
Bereich ( Differenzierung DNA/RNA)

Lumineszenz
o

Indirekt visualisierbar

Nicht radioaktiv

Zeitverzgerte Abgabe von Lichtenergie nach


Energieabsorption

Aequorin

Phenanthrolin-Komplexe

(Licht-)

Spezifische Methoden ( Immuno Blotting ) und Amplifikationssysteme :


o

Einfacher jedoch teurer als unspezifische Methoden

Gesuchte Strucktur wird mit spezifischen Antikrpern/Hybrid-DNA/RNA


direkt detektiert

Spezifischer Nachweis auf molekularer Ebene

Direkte/indirekte Systeme

Direkt:

Direkte Immundetektion:

Grundlage: hochselektive Bindungsfhigkeit der Antikrper

Direkt an den unspezifischen, kristallienen Fc-Teil des


Antikrpers gekoppelte Reportereinheit

Hybridisierung:

Identifikation einer spezifischen DNA/RNA-Zielsequenz ber


ein knstlich synthetisiertes, der Zielsequenz komplementres
Oligonukleotid = Gen-Sonde
(spezifische Sonde= knstliche DNA-Sequenz)

Grundlage: Denaturierung von DNA/RNA-Helices ber


Erwrmung, Rckbildung bei langsamer Abkklung

Bei der Abkhlung bleiben die Sonden an der Zielsequenz


haften

Kopplung mit Fluoreszenzfarbstoffen, Lumineszenzfarbstoffen


oder radioaktivem Material als Reportergruppe

!
!

Indirekt:

Erstantikrper bzw. Hybridom sind nicht direkt markiert,


sondern tragen eine Gruppe, die von Detektionsmechanismen
wiedererkannt wird

Indirekt Methoden werden um Enzym-Amplifikationstechniken


erweitert

Indirekte Reportersysteme:
o

Primr-/ Sekundr- Antikrper-Systeme

Antikrper gegen Primr-Antikrper - ZweitAntikrper aus anderer Spezies oder


Probenmaterial (Kreuzreaktionen)

DIG / Anti-DIG-Systeme

DIG (Digoxygenin)-Primrmarkierung an ErstAntikrper/Gen-Sonde; Anti-DIG-Antikrper

Bio/Avidin-Systeme:

Proteine Biotin und Avidin ( Hhnereiweis)/


Streptavidin (synthetisch)von Natur aus hohe
Affinitt zueinander ( pH >7 Bio-Avidin;
pH <7 Bio-Streptavidin)

Southern Blot

DNA
o

1. Restriktionsverdau von DNA

2. Gelelektrophorese der DNA-Fragmente

3. Depurinierung mit Sure ( weitere Fragmentierung)

4. Fixierung der DNA-Fragmente auf einer Membran mittels alkalischer


Lsung

5. Kovalente Bindung der DNA an die Membran durch Hitze oder UV-Licht

6. Nachweis spezifischer DNA-Fragmente durch Hybridisierung mit


markierten Sonden ( Radioaktivitt, Fluoreszenz, Chemilumineszenz)

!
!
Northern Blot

RNA

Methode zur Untersuchung der Genexpression anhand des Nachweises von RNA

Ablauf wie bei Southern Blot:

Elektrophorese ( Agarosegele mit Formaldehyd zur Reduktion von


sekundren RNA-Strukturen)

Fixierung der Fragmente auf Membran

Kovalente Bindung

Nachweis spezifischer Fragmente mit Sonden

Western Blot

Proteine

Immunblot, weil zur Detektion spezifischer Proteine Antikrper verwendet werden

Spezifitt der Antikrper-Antigen-Interaktion ermglicht die Detektion von


Zielproteinen in komplexen Proteingemischen

Faktoren, die die Blotting-Effizienz beeinflussen


o

Elutionseffizienz von Proteinen aus der Gel-Matrix ( Transfereffizienz)

Bindungsfhigkeit der Membran:

PVDF-Membran:

Hohe Proteinbindungskapazitt

Physikalische Beanspruchung

Chemische Stabilitt

Nitrocellulose-Membran

Im trockenen Zustand brchig

Lassen kleine Proteine durch

Blot-Puffer:
o

Transfereffizienz: abhngig von der Konzentration an Acrylamid und


Quervernetzer sowie der Dicke der Gele
! es gilt: geringere Konzentration und Dicke = einfacherer Transfer

Enthlt Methanol :

Erhht die Bindung der Proteine an die Membran

Reduziert Anschwellen der Gele

Sorgt fr Khlung

Ablauf:
o

Elektrophoretische Auftrennung von Proteingemischen in Acrylamid-Gelen


mit SDS-PAGE

Elektrophoretischer Transfer der Proteine aus dem Gel auf eine Membran

Wet-Blot/ Tank Blot:

Puffergefllte Kammer

Draht-Elektrode

Nachteil:

Schwankungen im elektrischen Feld =


unterschiedliche Blotting-Effizienzen

Groes Puffervolumen bentigt

Extere Khlung notwendig

Vorteil:
o

Besserer Transfer groer Proteine

Semidry:

Stapel in Puffer getrnkter Filterpapiere

Platten Elektrode

Nachteil
o

Schlechter Transfer groer


Proteine

Vorteil:
o

Geringere Schwankungen des


elektrischen Feldes

Geringere Puffermenge

Keine externe Khlung

Geringer Pufferverbrauch

Blockieren der Membran mit Milch oder BSA

Notwendig um unspezifische Bindungen der Antikrper an der


Membran zu verhindern

Absttigung freier Bindungsstellen durch Inkubation mit einem


berschuss an Protein

5% BSA oder Milchpulver

Antikrper-Inkubation

Detektion: Reversible Visualisierung aller auf der Membran vorhandenen


Proteinbanden

Direkt:

Vorteil:
o

Schnell

Keine Kreuzreaktion durch SAK (sekundrer Antikrper)

Markierung des PAK (Primrer Antikrper) kann seine


Immunreaktivitt reduzieren

Teuer (markierter Antikrper fr jedes Protein)

Geringe Amplifikation des Signals

Indirekt:

Membran wird mit einem PAK inkubiert, der spezifisch gegen


ein Epitop des Zielproteins gerichtet ist. Nach mehrmaligem
Waschen mit dem Puffer wird die Membran mit einem
markierten SAK inkubiert, der den PAK erkennt

Vorteil:

Nachteil:

Amplifikation des Signals durch SAK

Vielfalt markierter SAK erhltlich

Markierung des SAK beeinflusst die Immunreaktivitt


des PAK nicht

Nachteil:
o

Unspezifische Bindungen des SAK mglich

Aufwendiger + zeitintensiver

Antikrper-Detektion:

Primrer Antikrper (PAK)


o

Polyklonal (rabbit or goat)

Gnstiger

Leicht zu produzieren

Monoklonal ( mouse or rabbit)

Reinheit und Spezifitt sorgen fr wenig


Hintergrund

Sekundre Antikrper (SAK)


o

Wahl abhngig von Tierspezies, in der der PAK


generiert wurde

Gekoppelt mit

Alkalischen Phosphaten (AP)

Peroxidase (HRP)

Radioaktiver Markierung

Fluorophor

Detektionsmethoden: Markierungsarten fr den SAK

Kolorimetrisch

Chemilumineszent

Radioaktiv

Fluoreszent

Kolorimetrisch:

Inkubation mit einem Substrat


o

Reagiert mit dem Reporterenzym am Antikrper

Reaktion wandelt die lsliche Form des Substrates in


einen unlslichen Farbstoff der auf der Membran
przipitiert

Bsp.: BCIP (5-Brom-4-Chlor-3-indoxylphosphat) in


Verbindung mit NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid) =
blau/violetter Farbstoff

Proteinlevel werden durch die Intensitt der Frbung


bestimmt

Chemilumineszent:

ECL (enhanced chemiluminescence)

Inkubation mit einem Substrat


o

Leuchtet wenn es mit dem Reporter in Kontakt kommt

Bsp.: Peroxidase

Luminol als Substrat wird durch HO oxidiert

Es entsteht 3-Aminophtalat im Anregezustand,


das beim Zurckfallen auf den Grundzustand
Licht emittiert

Nachweis der Lichtreaktion


o

Mittels Rntgenfilm

Durch eine CCD Kamera als digitales Foto

Analyse durch Intensitt der Frbung/Lichtreaktion


( Densitometrie)

Radioaktiv:

Durch radioaktive Markierung der Antikrper werden keine


Substrate bentigt

Direkte Verwendung eines Rntgenfilmes

Dunkle Stellen auf dem Film entsprechen den spezifischen


nachgewiesenen Proteinbanden

Immer seltener in der Verwendung da teuer und hohes


Gesundheitsrisiko

Fluoreszent:

Mit Fluoreszenz-Farbstoffen gekoppelte Antikrper

Anregung des Fluorphors mit Licht

Nachweis der Emission mittels Imaging System


o

Emission kann durch einen Photosensor (CCD-Kamera


mit passendem Emissionsfilter) detektiert werden

Fluoreszenz zhlt zu den sensitivsten Detektionsmethoden fr


Blotting

NMR (16.5.2012)
Grundlagen:

Proteine ! Aminosuren ! Atome

Aminosuren:
o

Aufbau

Besitzen ein -C Atom

Funktionelle Gruppe: Carboxylgruppe ( Coo)

Aminogruppe : HN

Variable Seitenkette ( Rest)

Einteilung der Aminosuren:

Apolare Seitenketten

Glycin (Gly , G)

Alanin (Ala, A)

Valin (Val , V)

Leucin (Leu, L)

Isoleucin (Ile, I )

Methionin ( Met, M)

Prolin (Pro, P)

Phenylalanin (Phe, F)

Tryptophan (Trp, W)

Polar, ungeladen

Tyrosin (Tyr , Y)

Serin ( Ser, S)

Threonin ( Thr, T)

Cystein (Cys, C)

Asparagin (Asn, N)

Glutamin (Gln, Q)

Polar, geladen: Sauer

Aspartat (Asp, D)

Glutamat (Glu, E)

Polar, geladen : basisch

Lysin ( Lys, K)

Arginin (Arg, R)

Histidin (His, H)

Peptid-Bindung:
o

o
o

Wasserabspaltung zwischen der Carboxylgruppe (Coo)


einer Aminosure und der Aminogruppe (NH) der
darauf folgenden Aminosure
> 100 AS= Protein
< 100 AS = Peptid

Hexapeptid:
o

Peptid aus 6 Aminosuren

Struktur von Proteinen:


o

Sekundrstruktur:

Wasserstoffbrckenbindungen zwischen den Peptidbindungen

-Helix oder -Faltblatt

Tertirstruktur:

Wechselwirkungen zwischen Aminosure-Seitenketten

Wasserstoffbrckenbindungen ( H-Brcken)

Hydrophobe Wechselwirkungen

Ionenbindung

Disulfidbrcken (nur bei Schwefel ! nur zwischen Cystein)

NMR-Spektroskopie :

Nuclear Magnetic Resonance

Aus der Midizin bekannt als MRT (Magnetresonanztomographie)

Zweck:
o

Dient der Strukturaufklrung von Proteinen (Aussehen, Funktion etc.)

Nhere Charakterisierung von Ligandenbindung an das Zielprotein (Welche


AS sind an der Bindung des Liganden beteiligt, Wie bindet der Ligand, Was
ist der Mechanismus)

! Medikament Entwicklung, Pflanzenschutz etc.

Wie funktionier die NMR


o

Beruht auf der magnetischen Eigenschaft der Atomkerne

Fr die NMR benutzt man nur halbzahlige Spins fr auswertbare Ergebnisse

Man bentigt die Abstnde zwischen den Protonen der Aminosuren der
Peptidkette

Aufnahme von Spektren die die Abstandinformationen liefern ! eindeutige


Zuordnung der sichtbaren Signale

Jedem Signal im Spektrum wird eine Kopplung zwischen zwei Protonen


zugeordnet

Voraussetzung ! Primrsequenz des Peptids/Proteins ist bekannt

NMR- Spektren:
o

1D-, 2D-, 3D- und 4D Spektren

Von Bedeutung sind die 2D-Sprektren

COSY ( Correlated Spectroscopy)

Kopplung von 2 Protonen ber maximal drei Bindungen

TOCSY ( Total Correlated Spectroscopy)

Kopplung von 2 Protonen ber meist das ganze Spinsystem

NOESY ( Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy)

Kopplung von 2 Protonen ber den Raum wenn beide


maximal 5 (= 10) voneinander entfernt sind

Tabelle:

Durch COSY+TOCSY kann man die einzelnen AS im Spektrum erkennen

Fr die sequentielle Einordnung in die Peptidkette bentigt man das NOESY

Regeln:

1. Ausgehend von HA/NH Signal sucht man nach links/rechts im Spektrum nach
reinem NOESY Signal danach nach oben /unten nach dem nchsten HA/NH Signal,
dann bewegt man sich in Richtung C-Terminus ( !)
2. Ausgehend von HA/NH Signal sucht man oben /unten im Spektrum nach einem
reinen NOESY-Signal danach nach links/rechts zu dem nchsten HA/NH Signal, dann
bewegt man sich in Richtung N-Terminus ( )
Praktikum:

"

!
Photometrie ( 23.5.2012)
Licht: Elektromagnetische Wellen

Besteht aus elektromagnetischen Wellen ( em-Wellen= kommen durch berlagerung


von einem magnetischen Feld ( B-Feld) und einem elektrischen Feld ( E-Feld)
zustande.

Em-Wellen haben eine charakteristische Frequenz bzw. eine dazugehrende


Wellenlnge

Breiten sich mit Lichtgeschwindigkeit c aus ( 300.000 m/s)

Wellen knnen im fr den Menschen sichtbaren (400-700nm) oder unsichtbaren


(unterhalb von 400 und oberhalb von 700 nm ) Bereich liegen

400 nm : bergang aus dem ultravioletten (UV) ins violette Licht

700 nm : bergang von rotem Licht ins Infrarote Licht ( IR)

Verwendung in der Chemie:


o

Substanzen/ einzelne Atomgruppen oder Bindungen sind in der Lage eine


bestimmte Wellenlnge zu absorbieren ( verschlucken)

Wie viel Licht absorbiert wird hngt von der Substanz und der Anzahl der
bestrahlten Molekle ab

Bei den betrachteten Elektronenbergngen sind stehts die Laporte-Regeln


zu beachten:

Laporte-Regeln:

1. Spinregel: Gesamtspin muss erhalten bleiben

2. Verbot von bergngen gleicher Paritt

Bsp.: bergnge zwischen verschiedenen Spinmultiplizitten


sind verboten

Bsp.:

Verboten : bergang 3s ! 4s
erlaubt : bergang 3s ! 3p/4p
Verboten: bergang gerade ! gerade (Orbital)

3. berlappungsregel: nur bei hnlicher Symmetrie und Gre

Bauweise Spektralphotometer:

%
Lambert-Beersche Gesetz:

E () = -lg () = ( ) c d
o

I = Intensitt des transmittierten Lichtes

I = Intensitt des einfallenden ( eingestrahlten ) Lichtes

c = Konzentration der absorbierenden Substanz in der Flssigkeit


(typische Einheit: mol dm oder )

() = dekadischer Extinktionskoeffizient ( spektraler


Absorptionskoeffizient) ber der Wellenlnge ( Fr die absorbierende
Substanz spezifische Gre, die vom pH-Wert oder vom Lsungsmittel
abhngen kann

d =Schichtdicke des durchstrahlten Krpers

Abnahme der Lichtintensitt beim Durchqueren eine Probelsung mit der


Konzentration c :

I = Ie*

Umformung:

Aus * wird :

-ln(

)= *cd

= lg(e) * 0,434 *

!
!
!
!
!
L-LDH aus Kaninchenmuskel:

Katalysierte Reaktion

Pyruvat + NADH + H Lactat + NAD

Photometrische Aktivittsbestimmung:

Temperatur: RT

Wellenlnge : 340nm

Aktivitt wird als dE/min gemessen

Assay-Zusammensetzung:
o

50 l NADH-Lsung (10 mg/ml)

50 l Pyruvat Lsung ( 0,1 M)

7,5 l Probe

892,5 l Imidazol-Puffer 0,1M pH: 6,5

TIM aus Kaninchenmuskel:

Katalysierte Reaktion : GAP DHAP

Indikatorreaktion:
Kaninchenmuskel

Photometrische Aktivittsbestimmung

Temperatur: RT

Wellenlnge : 366 nm

Assay Zusammensetzung:

DHAP + NADH + H Glycerin-3-Phosphat + NAD + GDH aus

75 l GAP-Lsung (0,1M)

5 l NADH Lsung (0,2M)

3 l GDH Lsung ( 260 Units/ mg Protein; 10 mg/ml)

5 l Probe

912 l 50mM Hepes-Puffer , pH = 7,0

Brandford-Test:

Farbstoff Coomassie-Brilliant-Blue G-250 ( CBBG) bildet in saurer Lsung mit


kationischen und unpolaren Seitenketten von Proteinen Komplexe

Die ungebundene (kationische) rote Form des Farbstoffes hat im


Absorptionsspektrum ein Maximum bei 470 nm

Durch die Komplexbildung mit einem Protein wird der Farbstoff in seiner blauen,
unprotonierten, anionischen Form stabilisiert und das Absorptionsspektrum
verschiebt sich auf 595 nm

Extinktionskoeffiezient des Komplexes ist hher als der des freien Farbstoffes !
Absorption kann mit hoher Empfindsamkeit gegen die es freien Farbreagenz
photometrisch gemessen werden und ist ein Ma fr die Proteinkonzentration der
Lsung

Pipettierschema: + 200 l Brandford Reagenz


Gut durchrhren

15 min. bei RT stehen lassen


Bei 595 nm vermessen

!
Kalibrierungskurve: Absorption bei 595nm gegen die Konzentration c(BSA) in [g/ml]

"
Zhlkammer nach Thoma:

"

ORGANISMUS:
Schnitt- und Frbemethoden von Geweben ( 30.5.2012)
Was ist Histologie:

Lehre von Geweben

Mikroskopische Anatomie

Feinbau der Organe

Wirkungsgefge des Organismus

Zweck:

Medizinische Diagnostik

Pathologie

Gerichtsmedizin

Grundlagenforschung

!
Ablauf:

Haltbarmachung und Aufarbeitung des Gewebes


o

Fixiermethoden:

Erhaltung des naturgetrauen Zustandes des Objektes durch die


Verhinderung des Zerfalls

Haltbarmachung von Geweben mitteln Vernetzung der im Prparat


enthaltenen Eiweie

Autolytische Vorgnge nach dem Tod werden verhindert

Zell- und Gewebsstrukturen bleiben mglichst natrlich erhalten

Hrtung des Materials

2 Methoden:

Immersionsfixierung:
o

Probe wird in Fixierlsung eingelegt

Bei kleinen, gut permablen Gewebsproben

Perfusionsfixierung:
o

Organ wird ber das eigene Gefsystem mit


Fixierlsung durchsplt und fixiert

Fr groe oder flssigkeitsgefllte Organe wie Herz,


Hirn etc.

Nur beim lebenden, betubten Organismus mglich

Fixierungsmittel:

Formalin ( 4% neutrale Formaldehydlsung)


o

Quervernetzung und Denaturierung der Proteine

Formaldehydmolekl (HCHO) wird an Proteine


gebunden und bildet Methylbrcken (-CH) zwischen
Aminosureketten, dabei wird das Formalin verbraucht

Nachteil:

Glutaraldehyd
o

Gleiche Funktion wie Formalin, strkere


Quervernetzung

Alkohol
o

Wasserentzug bewirkt Fllung der Proteine ohne


Denaturierung

Permeablisiert Membranen

Nachteil:

Lipide und nicht mit Proteinen assoziierte


Kohlenhydrate werden nicht vernetzt

Hrtung und Schrumpfung des Gewebes

Salzbildner: Sublimat (HgCl) Pikrinsure


o

Salzkristallbildung im Gewebe bewirkt Denaturierung


der Proteine, rasche Fixierung von Oberflchen

Optimale Erhaltung antigener Strukturen

Nachteil:

Schlechte Durchdringung des Gewebes

!
!
o

Einbettung

Fixierte Gewebeproben werden in ein Lsungsmittel gebracht

Vlliger Wasserentzug und Lipidlsung

Nachteil: Artefaktentstehung, das Objekt kann schrumpfen oder


zerreien

Anforderung:

Um dnne und gleichmige Schnitte anfertigen zu knnen


muss das Material Stabilitt und gleichmige Konsistenz
aufweisen

Einbettungsmedien:

Parafin
o

Gute Durchdringung des Gewebes

Schnitte bis zu 5-8 m dnn mglich

Gute histologische Beurteilung

Nachteil:

Entwsserung des Gewebes

Parafin ist nur in organischen Lsungsmitteln


lslich

Kunstharz ( Methacrylat)
o

Sehr dnne Schnittdicken (1-2 m)

Gut geeignet fr harte Gewebe

Nachteil:

Entwsserung des Gewebes

Spezialmesser ntig

Nur fr wenige Frbemethoden und nicht fr


Immunhistochemie geeigent

Gelatine
o

Wasserlslich

Gute und schnelle Durchdringung des Gewebes

Kultivierung des Gewebeschnittes mglich

Nachteil:

Alternativ: Kryomikroskopie
o

Frische Organstcke werden in flssigen Stickstoff


eingebracht

Komponenten bleiben in natrlicher Konformation


erhalten

Schnelle Methode ( z.B. bei einer Operation)

Kein Wasserentzug

Gut fr Immunhistologie geeigent

Nachteil:

Nicht fr harte Gewebe geeignet

Schlechte Morphologie der Gewebe

Schneiden

Fr mikroskopische Untersuchung und eine gute Auflsung des


Gewebes

Schneiden mit dem Mikrotom (klein schneiden)

Verwendete Mikrotome hngen von der Einbettungsart ab:

Nur sehr dicke Schnitte mglich

Schlitten- und Rotationsmikrotom:


o

Schnittdicke : 1-60 m

Einbettungsmedium: Parafin

Ultramikrotom:
o

Schnittdicke: 0,5 0,01 m

Einbettungsmedium: Kunstharz

Kryomikrotom:
o

Schnittdicke: 5 100 m

Fr Gefrierschnitte

Eindecken

Dient der Konservierung des gefrbten Schnittes

Verhindert Austrocknung

Erleichtert die mikroskopische Analyse durch spezielle Licht


brechende Eigenschaft von Deckglas und Eindeckmedium

Entwsserte Prparate:

Eindeckung mit Kunstharz

Wasserhaltige Prparate:

Frbemethoden
o

Schnitt wird zunchst durch z.B. Xylol entparaffiniert und in Wasser


eingebracht, da die meisten Farben wssrige Lsungen sind

Die Farbstoffe werden mit unterschiedlicher Affinitt aufgenommen

Elektrostatische Krfte zwischen dem Farbstoff und den Zell- und


Gewebekomponenten spielen eine entscheidende Rolle

Frbemethoden:

Chemische Frbungen

Bindung des Farbstoffes an Gewebe aufgrund


unterschiedlicher Ladungen

Bindung ist von pH-Wert der Farblsung abhngig


(Bsp.: ein alkalischer Farbstoff frbt in saurer Lsung
nur die stark sauren Strukturen : Kerne)

Progressive Frbung:

Mehrere Farbstoffe frben nacheinander verschiedene


Strukturen des Gewebes

Simultanfrbung:

Schnitten werden berfrbt und dann der berschuss an


Farbe ausgewaschen ( Differenzierung)

Succedanfrbung:

Schnitte inkubieren in der Frbelsung bis sie ausreichend


gefrbt sind

Regressive Frbung:

Farbstoff und Substrat gehen eine chemische Bindung ein


(z.B. Eisennachweis ! Fe bildet mit
Kaliumhexacyanidoferrat ein unlslichen Farbstoff)

Physiko-chemische Frbung:

Eine Farblsung enthlt mehrere Farbstoffe die gleichzeitig


frben

Endpunktfrbung:

Eindecken mit Glycerin und Glycerinderivaten

Zeitunabhngige Frbung von Teilstrukturen aufgrund ihrer


Ladung und dem pH-Wert der Farblsung

!
!
o

Hmatoxylin-Eosin-Frbung

Hmatoxylin
o

Natrlicher, farbloser Pflanzenfarbstoff aus Blauholz

Wird durch Oxidation in Hmatein berfhrt

Hmatein ist ein saurer Farbstoff mit gelb-rtlicher


Frbung

Durch Zugabe von Metallionen ! Entstehung von positiv


geladenem Hmalaun, das bei einem pH-Wert ber 3 blau
gefrbt ist

Hmalaun ist basophil und bindet an negativ geladene


Strukturen (z.B. Zellkerne (DNA)

Hmalaun wird progressiv gefrbt, beim Erreichen des


gewnschten Frbegrades wird die Frbung abgebrochen

Hmalaun ist positiv geladen und bindet an die sauren


Bestandteile der DNA ! Kernfrbung

Eosin:
o

Eosin Y- Eosin G

Wasserlsliches Eosin

Schwachsauer und gelb

Eosin S

Wasserunlslich/ alkohollslich ( s= Spritlslich)

Hohe Lichtbestndigkeit

Wird in 70%igen ETOH gelst

Eosin ist rot-oranger azidophil und wird von positiven


Ladungen angezogen ( z.B. Kollagen, Cytoplasma)

Eosin wird regressiv gefrbt, d.h. erst berfrbt und dann in


Wasser differenziert

Eosin ist negativ geladen und bindet sich an die positiven


Gewebsbestandteile ( Proteine) ! Plasmafrbung

Ergebnis: Kerne blau

--- Hintergrund rosa / rot

!
!
!
!
!

!
!
o

Toluidinblau Frbung

Basischer Thioninfarbstoff

Endpunktfrbung durch elektropolare Anlagerung des Farbstoffs im


alkalischen Milieu an saure Strukturen

Metachromasie:

Schwach saure Bestandteile des Zytoplasmas frben sich in


einer vom Farbstoff abweichenden Farbe

Zellkerne blau

---

Cytoplasma violett

Immunhistochemische (Antikrperfrbung) Nachweismethoden


o

Zweck:

Identifikation der Lokalisation und Verteilung eines Antigens


( Proteins) im Gewebe

Identifikation von infektisen Erregern

Selektive Darstellung bestimmter Zelltypen zu Beurteilung derer


Hufigkeit und Verteilung im Gewebe

Klassifizierung und Diagnose von Tumoren

Bestimmung von prognostischen und prdiktiven Faktoren

Aufbau eines Antikrpers:

Fab :

variabler Teil

bindet an das Antigen

2 Antigenbindungsstellen

Konstanter Teil

Fc:

Bindet an die Membran der Makrophagen und aktiviert die


Immunantwort

Spezifitt des Fc Fragments unterscheidet sich zwischen den


Spezies ! dient zu Bestimmung der Spezies

Direkter / Indirekter Antikrpernachweis:

Indirekter Nachweis mittels Peroxidase-AntiPeroxidase Nachweis:


o

bentigt 2 Antikrper

Sekundrer Antikrper ( Brckenantikrper) wird in einer anderen


Spezies hergestellt

Er erkennt das Fc Fragment des primren Antikrpers als Antigen

HRP: Meerrettich Peroxidase Reaktion :

Setzt durch Oxidation ein farbloses Substrat in einen


Farbstoff um, der das Prparat in der Region des
gebundenen Antikrpers durch
Niederschlagsfrbung frbt

Indirekter Nachweis eines Antigens ber Biotin-Avidin Komplexe

Avidin:

oTetrameres Glykoprotein aus Hhnereiern


oBindet Biotin
Biotin:

Vitamin aus dem B-Komplex

Vorteil:
o

!
!
!

Verstrkung der Antikrperfrbung

Molekularbiologische Nachweismethoden
o

In situ Hybridisierung:

Zweck:

Direkte Lokalisation von Gegen und anderen DNA-Sequenzen


in Chromosomen

Direkter Nachweis von RNA ( und damit Genexpression) in


Geweben und Zellen

Nachweis von Krankheitserregern ( .Viren) in Geweben und


Zellen

Identifizierung von Chromosomen durch spezifisches Anfrben

Molekularbiologische Methode, um Nukleinsuren ( DNA, RNA)


in Geweben, einzelnen Zellen oder auf MetaphaseChromosomen nachzuweisen

Prinzip:
o

radioaktiv

Knstlich hergestellte Sonde aus einer


Nukleinsure wird ber Basenpaarung an die
nachzuweisende Nukleinsure gebunden
(Hybridisiert)

Whole Mount in situ Hybridisierung:

Nachweis fr Genexpression im gesamten Organismus

Nur fr Embryonalstadien verwendbar

Keine gute Durchdringung des Gewebes

Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH):

Nachweis von numerischen Chromosomenaberrationen und


strukturellen Chromosomenvernderungen wie Translokation,
Deletionen oder Amplifikationen in zytologischen Ausstrichprparaten
und histologischen Schnittprparaten

FISH-Technik findet primr in Krebsforschung und Diagnostik


Anwendung

Markierung der DNA:


o

Radioaktive Markierung:

Nichtradioaktive Markierung:

Biotin

Digoxigenin

Fluoreszenz

!
!
!
!
!
!
!

Praktischer Teil:

!
!
!
!
!
Verhaltensbeobachtungen (6.6.2012)

Was ist Ethologie?


o

Kontrolle und Ausbung von Bewegungen oder Signalen, mit denen ein
Organismus mit Artgenossen oder anderen Komponenten seine belebten und
unbelbten Welt interagiert

3 Fragen der Ethologie:

1. Wie verhlt sich das Tier?

2. Wie wird sein Verhalten

Proximate Mechanismen
(Erklrung

gesteuert?
Explikative Ethologie

3. Warum verhlt es sich so?

Deskriptive Ethologie

(Beschreibend)

Ultimate Funktion

4 Fragen in der Ethologie:

1. Wie verhlt sich das Tier und wie wird sein Verhalten gesteuert?

2. Wie entwickelt sich das Verhaltensmuster

3. Warum verhlt es sich so?

Was ist der phylogenetische Ursprung?

Wie wird beobachtet oder gemessen?

Wie denkt der Beobachter? Was erwartet er?

Was wei der Beobachter?

Was kann/will er registrieren?

Objektivitt durch:

Systematische Datenaufnahme

Objektive Auswertung

Falsifizierbarkeit der Hypothese (sonst Dogma)

Hypothese

Vorlufige Antwort auf eine Frage

Versuchsweise Erklrungen

Vorhersagen auf dem Deduktions-Prinzip einer Wenn


dann-Logik

Eine gute Hypothese muss falsifizierbar und sparsam sein


o

Prinzip der Einfachheit:

Testen von Hypothesen


o

Annahme mglichst weniger, einfacher


Prinzipien, Gesetze, Regeln des
Naturgeschehens

Beobachtung ! Fragestellung ! Hypothese !


Vorhersage ! Test der Hypothese ! Bewertung !
Vorhersage Besttigt? (Nein ! Zurck zu Fragestellung
oder Hypothese) / Ja ! Neugier befriedigt? (Nein !
zurck zu Test der Hypothese) / Ja ! Neues Thema

Voraussetzung:
o

Kenntnis der Systematik

Recherchen

Geduld, Zeit

Reflexion von Problemen

Theorie:

System wissenschaftlich begrndeter Aussagen zur Erklrung


bestimmter Tatsachen oder Erscheinungen und der ihnen
zugrunde liegenden Gesetzmigkeiten

!
Probleme/ berlegungen:

Ethische, juristische berlegungen

Vermeidung von Artefakten


o

Anwesenheit des Beobachters?

Opel- Field-Test

Kluger Hans Effekt

Labor vs. Freiland

Stichprobengre und Statistik

Kontrollversuche und Blindversuche

Unterscheidbarkeit der Tiere


o

Markierung

Telemetrie

Natrliche Identifizierungsmerkmale

Disziplinen der Verhaltensbiologie

Deskriptive Ethologie ( Wie verhlt sich das Tier?)


o

Ethogramm = Verhaltensrepertoire

Verhaltensweisen erkennen und benennen

Katalogisierung/ Gruppierung

Routine:
o

Paarung, Fortpflanzung, Brutpflege:


o

Agonistisches Verhalten ,Revierverteidigung,


Rangordnung, Kooperation, Spielen,

Abberantes ( pathologisches) Verhalten:


o

Partnersuche, Werben, Kopulation, Sugen oder


Ftterung, Brutfrsorge,

Sozialverhalten:
o

Schlafen, Putzen (Selber/Durch andere),


Nahrungsaufnahme, Trinken, Exkretion, Koprophagie,
Einfache Bewegung, Wachsamkeit,

Hospitalismus, Desinteresse, Anzeichen von Stress

Beschreibung von Verhaltensweisen:

Mglichst objektive Formulierung

Keine interpretierende Beschreibung

Hilfsmittel:

Einfache Hilfsmittel

Technik
o

Videoberwachung ( Zeitraffermodus, Infrarotkamera) , Endoskop,


Licht-oder Ultraschallschranke, Transponder und Lesegerte,
Telemetrie, Tonbandgert/digitales Aufnahmegert,
Rumliche Orientierung: Labyrinthe, Emlen-Trichter etc.

!
Messgren:

Latenzzeiten

Dauern

Hufigkeiten

Methoden der Registrierung:

Kontinuierliche Datenregistrierung

Intervall-strukturierte Registrierung
o

Momentregistrierung

One-zero sampling

Ad libitum Registrierung

Gruppenbeobachtung
F=Fressen
o

Fokustierbeobachtung

Scan sampling ( Momentregistrieung)

Behavior sampling ( One-zero sampling)

Beobachtungsanalyse

Black-Box System
o

Zeitlicher Zusammenhang

Starre oder variable Beziehung

Problem: Korrelation

Vergleichende Ethologie:

Analogie x Homologie

Konvergenz x Divergenz

Phylogenische Analyse

Experimentelle Ethologie:

Manipulation

Attrappen

Labyrinthe

Spontanes Verhalten
o

Wahlprferenzen

Induziertes Verhalten
o

Lernen

Verhaltensphysiologie:

Stoffwechselphysiologie
o

O - Verbrauch, EKG

Manipulation (Kltestress, Wrmestress, Hunger)

L= Laufen, R= Ruhen,

Ethoendokrinologie:

Hormonanalyse ( Blut, Urin, Fzes)

Kerrelation mit Verhalten


o

Jahreszeitliche Uterscheide

Paarungsverhalten

Dominante gegen submissive Tiere

Stress

Mulle:

Systematik:
o

Ordnung: Rodentia

Unterordnung: Hystricognatha

Familie: Bathyeridae ( Sandgrber)


o

Gattung:

Strandgrber ( Bathyergus)

Graumulle ( Fukomys/ Cryptomys)

Blessmulle ( Georhychus)

Erdbohrer ( Heliophobius)

Nacktmulle ( Heterocephalus)

Nacktmulle und Graumulle leben eusozial ( Staatenbildung):


o

Reproduktive Arbeitsteilung

Nachkommen: lebenslange Philopatrie ( Brutortstreue, Brten am selben


Ort)

Nachkommen helfen bei der Aufzucht jngerer Geschwister

Unterirdische Lebensweise ! sinnesbiologische Anpassung?


o

Nahrungssuche: Mulle fressen z.B. Mhren immer nur an der Spitze an

Visuelle Fhigkeiten

Subterrane Sugetiere : funktionell blind?

Prferenz fr Nestbau in dunklen Kammern

Graumulle unterscheiden Licht und Dunkel

Raumorientierung bei unterirdisch lebenden Graumullen

Nutzen sie das Erdmagnetfeld zur Orientierung?

Sozialsystem ! Unterscheid zwischen reproduktiven und nichtreproduktiven


Tieren?
o

Reproduktive Graumulle leben lnger als nichtreproduktive

Potenzielle Faktoren

Nahrung ? ! Labortiere bekommen alle das selbe Futter

Aktivitt? ! Abhngig vom Alter und nicht von der Reproduktivitt

Dominanzverhalten?

Ruhemetabolismus ( Sauerstoffverbrauch) ?

Telomerverkrzung?

!
!
!
!
!
!
!
!
KOSYSTEM:
Fisch (13.6.2012)
Parasiten

Was ist ein Parasit?


o

Griech. Para = Bei , Sitos = Essen

Einfache Definition : Parasiten sind Lebewesen, die in oder auf einem


artfremden Organismus leben, von ihm Nahrung beziehen und ihn
schdigen

Direkte trophische Interaktion:

Wirte werden vom Parasiten geschdigt

Parasiten profitieren vom Wirt ( meist abhngig von diesem) und


bringen ihn in der Regel nicht um

Bsp.: Bandwurm im Darm

Vorteile:

Dauerhafte Zufuhr vorverdauter Nahrung

Rel. Konstanter Lebensraum

Nachteile:

Sauerstoffarmes Milieu

Verdauungsenzyme

Extremer pH-Wert

Hohe Osmolaritt

Strmung

Immunabwehr des Wirtes

Partnerfindung schwierig

Arten von Parasiten:

Protozoische Parasiten = einzellige Parasiten

Metazoische Parasiten = mehrzellige Parasiten

Ektoparasiten = leben auf dem Wirt

Endoparasiten = leben im Wirt

Lebenszyklen:

Monoxenisch: nur ein Wirt beteiligt

Heteroxen : 2 oder mehr Wirte

Begiffe:

Wirt:
o

Organismus der Nahrung und Lebensraum fr einen


anderen Organismus darstellt

Endwirt:
o

Wirt in dem sie sexuelle Fortpflanzung stattfindet

Geringere Pathologie als im Zwischenwirt

Zwischenwirt:
o

Entwicklung des Parasiten

Keine sexuelle Fortpflanzung

Oft tdlich fr den Wirt

Paratenischer Wirt:
o

Keine Entwicklung

Akkumulation von infektisen Stadien

Vektor:
o

Hufig ein steckendes Insekt

bertragung von Parasiten ( aber auch Viren,


Bakterien)

Fakten:

50 % der Pflanzen und Tiere leben parasitisch in einem


Entwicklungsstadium

100 % der Pflanzen und Tierarten sind parasitiert

Mehr als 100.000 der ca. 1,5 Mio. Metazoenarten sind


Parasiten

342 helminthische (Wrmer) Parasiten knnen Menschen


infizieren

50 % der Weltbevlkerung ist mit einer Vielzahl an Parasiten


infiziert

Parasiten im Fisch:

Plathelminthes ( Plattenwrmer)
o

Wenige freilebende Arten

Viele Endoparasiten

Ca. 14.000 Arten ! viele humanpathogene

Klassen:

Turbellaria:

Freilebend mit Wimpernkleid

Ruberisch

Trematoda:

Endoparasit

Rel. Klein ( ca. 1cm)

Meist 2 Saugnpfe

Dorsoventral abgeflacht

Generations- und Wirtswechsel

Komplizierte Zyklen

Monogenea:

Ektoparasit bei Fischen und Amphibien

Leben auf Haut und Kiemen

Haftapparat : Haken

Sehr klein 0,03 2mm

Cestoda:

Endoparasit

Rel. Gro

Haftorgane am Kopf

Polyzoisch = Krper ist unterteilt in viele Glieder

Adulte Tiere leben im Darm, Plerocercoid-Larve in


Leibeshhle

Wirts- aber kein Generationswechsel

Acanthocephale ( Kratzwrmer)

Hakenbewhrte Proboscis ( Rssel)

Eine cm lang

Gelblich

Nematoden ( Fadenwrmer)

Meist drehrund

Unsegmentiert

Adulte im Darm, Larven in Organen oder Muskulatur

Parasitische Crustacea:

Karpfenlaus

!
!
Praktikum:

Blut untersuchen
o

Trypanosomen

Fischart bestimmen
o

Altersbestimmung:

Wachstumszonen auf den Schuppen

Unterscheidung zwischen Sommer- und


Winterwachstumszonen

Dunkle Bereiche = Winterwachstum

Heller Bereiche = Sommerwachstum

Sommerwachstumszonen werden gezhlt ( Zonen nicht Ringe)

Untersuchung von Haut und Flossen


o

1. Makroskopische Untersuchung auf Ektoparasiten

Fischegel (Piscicola spec.)

Bis 5 cm gro

Zwei Saugnpfe

Zwei Augenpaare

Segmentiert

Annelida ( Ringelwrmer)

Karpfenlaus (Argulus spec.)

Einige Millimeter

Zu Haftscheiben umgewandelte Mandibeln

Crustacea (Krebstiere)

Erreger der Weipnktchenkrankheit (Ichthyophirius


multifiliis)

Weie Pnktchen auf der Fischhaut

Kugelfrmiger Ciliat ( Wimperntierchen)

Hufeisenfrmiger Makronucleus

2. Hautabstrich

Mikroskopische Untersuchung

Trichodina spec.
o

100 x fache Vergrerung

Ufofrmiges Aussehen

Ciliat ( Wimperntierchen)

Ichthyobodo ncator
o

100 x 400 fach

Nur bei frisch getteten Fischen und starkem


Befall

Flagellat (Geieltierchen)

Makroskopische Untersuchung

Gyrodactylus spec.
o

Zweizipfliger Kopf , Keine Augen

Typischer Halteapparat (Haken, Zhnchen,


Klammern)

Monogenea ( Hakensaufwrmer)

Posthodiplostomum cuticola
o

Schwarzer Punkt auf der Haut

Trematoda (Saufwrmer)

!
!
!

Untersuchung der Kiemen


o

Kiemendeckel abtrennen, Kiemenbgen aufschneiden ! Abstriche,


Quetschen

1. Makroskopische Untersuchung auf Ektoparasiten

Kiemenkrebs (Ergasilus spec.)

verankern sich mit zweitem


Antennenpaar

Crustacea

Dactylogyrus spec.

Vierzipfliger Kopf

Vier Augen

Typischer Halteapparat ( Klammern,


Zhnchen, Haken)

Monogenea ( Hakensaugwrmer)

Doppeltierchen (Diplozoon spec)

Zwei berkreuz wachsende Tiere

Monogenea ( Hakensaugwrmer)

Larven von Gromuscheln ( Glochidium gen. Spec.)

Manche Arten auch an Flossen

Mollusca (Weichtiere)

Myxozoa

Meist in Cysten

Als weie Punkte zu erkennen

Auf den Kiemenfilamenten und am Kiemenbogen

Sporen mit zwei Polkapseln

Bucephaloidae

Am Kiemenbogen

Trematoden-Larven (Saugwrmer)

Auge heraus prparieren unter untersuchen

Thylodelphis clavata

Im Glaskrper

Metacercarie (Larve) ist nicht encystiert (Bildung keiner


Zysten)

Sehr zappelig

Lnglicher Krperbau

Kalkeinschlsse lnglich

Trematoden (Saugwrmer)

Diplostomum spec.

In der Linse

Metacercarie ist nicht encystiert

Eher trge ! keine schnellen


Bewegungen

Kalkeinschlsse rund

Trematoden ( Saugwrmer)

!
!

Fisch aufschneiden und Leibeshhle auf Parasiten


absuchen
o

Bauchhhle mit Schere von Kloake bis zum Kopf


aufschneiden

Zweiter Schnitt = Entfernen des Lappens der ber


den Organen liegt

!
!

Organe ( Milz, Leber, Galle, Gonaden, Nieren) untersuchen

Philometra spec.

Leibeshhle

Enden sind sehr rund

Rtlicher Nematode(Fadenwrmer)

Paradilepis scolencia

Leber

Wenige mm gro

Cestodenlarve besitz Haken (Bandwurmlarve)

Ligula intestinalis

Bandartige Cestodenlarve

Quillt beim ffenen aus der Leibeshhle

Wird mehrere cm lang

Darm ausbreiten, ffnen und untersuchen

Bucephalus polymorphus

Saugnapf mit Tentakeln

Trematoden

Caryophyllaeus laticeps

Nelkenartiger Kopf

Cestoden (Bandwrmer)

Camallanus lacustris

Typische Kopkapsel

Nematoden ( Fadenwrmer)

Pomphorhynchus laevis

Verankert sich mit Bulbus in der Darmwand

Gelb gefrbt

Bei Fehlwirten auch frei in der Leibeshhle oder in


der Leber zu finden

Acanthocephalen (Kratzwrmer)

Myxidum spec.

Niere

Polkapsel an gegenberliegenden Enden der Sporen

Sporen oval mit spitzen Enden

Myxozoa

Sphaerospora spec.

Niere

Runde Sporen

Deutliche Naht zwischen Sporenschalen

Schwimmblase untersuchen

Anguillicola crassus

4,5 cm Lnge und 5 mm im Durchmesser

Mundffnung besteht aus einem Zahnkranz

Nematoden (Fadenwrmer)

!! In allen Organgen knnen Cysten von Mircospora, Myxozoa oder anderer


Protozoen gefunden werden
o

Microspora und Myxozoa-Cysten sind als weie Punkte erkennbar

Einzelen Sporen erst bei 40 100facher Vergrerung zu sehen

Zustandsparameter:

Zustand des Fisches :


o

Konditionsfaktor : Ma fr den Ernhrungszustand eines Fisches


K=

Hepatosomatischer Index : Ma fr des Stresszustand eines Organismus


HSI=

Gonadosomatischer Index: Aussage ber die Reproduktion, Reifegrad


GSI=

Variablen:
o

m(ges)= Fischmasse in [g]

m(G) = Masser der Gonaden in [g]

= Masse der Leber in [g]

= Fischlnge in [cm]

Intensitt und Prvalenz:

Beschreibung der Parasitengemeinschaft :


o

Intensitt (I) = Zahl der Parasitenindividuen einer Art pro Wirt

Prvalenz (P) = prozentueller Anteil an Wirtsfischen, die mit einer oder


mehreren
Individuen einer Parasitenart infiziert sind

P = 100%

Variablen:
o

W(inf)

= Anzahl aller Wirte, die mit Parasit I infiziert sind

W (alle) = Anzahl aller untersuchten Wirte

W(i)

= Anzahl der Individuen einer Parasitenart auf Wirt i

= Gesamtindividuenzahl in einem Habitat

N(max) = Anzahl der Individuen der dominanten Parasitenart

n(i)

= Individuenzahl der Parasitenart i

= Gesamtartenzahl ( der Parasiten) eines Standortes

p(i)

= relative Hufigkeit der Parasitenart i

!
!
Messmethoden im Freiland (20.6.2012)
Chlorophyllfluoreszenz

Erscheinung, dass nach der Anregung die absorbierte Energie in Form von
langwelligem Licht wieder abgegeben wird

Absorption von blauen oder rotem Licht bewirkt im Chlorophyllmolekl die


Anhebung eines Elektrons aus dem Grundzustand in einen angeregten Zustand

Beim bergang eines Elektrons vom angeregten in den Grundzustand wird


elektromagnetische Strahlung emittiert ( = Fluoreszenz)

Quenching:

Anregungsenergie kann durch 3 unterschiedliche Mglichkeiten abgebaut (dissipiert,


gequenscht) werden:
o

1. Nutzung der Energie in der Photochemie

2. Strahlungslose Umwandlung in Wrme

Photochemische Fluoreszenzlschung P (photochemical quenching)

Nicht photochemische Fluoreszenzlschung D

3. Durch Fluoreszenz F

Energieerhaltungssatz: Fluoreszenz (F)+ Photochemie(P) + Wrme (D) = 1


o

Wenn unter Stress ( Trockenstress, Schadstoffe) die Photochemie gestrt


wird, steigt der Fluoreszenzanteil an

Er bleibt gering, wenn die Umwandlung in chemische Energie optimal


abluft oder andererseits die thermische Energieabgabe gefrdert wird

Ausbreitung von DCMU (Diuron) im Blatt

DCMU = Phenylharnstoff-Derivat, das als Herbizid verwendet wird und die


Photosynthese von Pflanzen hemmt (! elektronentransport zwischen Photosystem
II und Plastochinon wir inhibiert)

Wirkung ist messbar, da die Chlorophylle der Pflanze eine erhhte Fluoreszenz
zeigen

Stressindikatoren:

Photosynthese allgemein:

Elektronentransportkette ! lichtabhngige Reaktion


o

Elektronentransport wird durch mehrere groe Enzymkomplexe in der


Thylakoidmembran vermittelt

Ablaufende Prozesse:

Wasserspaltung: (Photolyse des Wassers)

Reduktion von NADP zu NADH + H

ATP-Bildung ( Photophosphorylierung)

Normalbedingungen :
o

Absorbierte Lichtenergie wird hauptschlich in biochemische


Energie( ATP,NADH/H) umgewandelt

Nur wenig ( 0,5 3% ) werden als Fluoreszenz angestrahlt

Stress: Behinderung der Photosynthese


o

Schutzmechanismen (Wrme) werden aktiviert und deutlich mehr


Fluoreszenzlicht abgegeben

Strungen der Photosynthese, vor allem beim Elektronentransport, knnen


sich als Verstrkung der Fluoreszenz uern und dadurch quantifiziert
werden

Messung der Chlorophyllfluoreszenz bietet eine Mglichkeit die


Leistungsfhigkeit der Photosynthese und ihrer Reaktion auf Stress zu
untersuchen

Fluorometer:

Junior PAM

Standard Imaging PAM

Maxi Imaging PAM

Fluoreszenzparameter:
o

Sttigungsimpulsmethode

Nach einschalten des Messlichtes ( ML) wird die minimale Fluoreszenz


gemessen (F)

Licht-Sttigungsimpuls (SP ) bewirkt kurzzeitig eine vollstndige


Reduktion aller Reaktionszentren ( simuliert knock-out der
Photosynthese)

Messung des maximalen Fluoreszenz-Levels im Dunkel-adaptierten


(Fm) oder Licht-adaptierten Zustand (Fm)

o Maximale Quantenausbeute von PS II:

Ma fr die maximale Effizienz mit der Anregungsenergie aus


den Antennenkomplexen von offenen Reaktionszentren im PS
II bernommen wird

o Effektive Quantenausbeute von PS II im belichteten Zustand (yield) :

Spiegelt den momentanen Aktivittszustand des


Photosyntheseapparates wieder

Non-photochemical quenching (NPQ) =

Bei Kenntnis der effektiven Quantenausbeute von PS II und der


eingestrahlten Quantenflussdichte ( PFD) kann die relative
Elektronentrasportrate (ETR) von PS II berechnet werden :

ETR =

PFD abs 0,5

Fluoreszenzbildanalyse : Anwendungsbeispiele

Demonstration 1: Rosenblatt wird 2 Minuten in 45 C warmes Wasser getaucht


o

Beobachtungen:

Das F.image zeigt nur geringe Unterscheider / Heterogenitten

Eingetauchter Blattbereich (Hitzeschdigung ) ist deutlich mittel


und yield-image zu diagnostizieren

Demonstration 2 : Abszisinsure (ABA) appliziert ber die Petiolen von Arabidopsis


! Stomataschluss

!
!
Kartiermethoden im
Freiland (27.6.2012)
Faunistische
Untersuchungen am
Beispiel des kosystems
Fliegewsser:

Ziel: Reprsentative Stichprobe der an einen Ort vorkommenden Fauna

Methoden: Fallen, Zhlen, Handaufsammlungen

Kurs : Untersuchung des Makrozoobenthos von Fliegewssern, wegen der hohen


Dichte
o

Makrozoobenthos = Kleintiere ( Krebse, Muscheln, Insektenlarven) der


Gewssersohle

Werden bei Bestimmung der Wasserqualitt eingesetzt

Hufigkeit und Artenvielfalt sind vom Habitat abhngig


! 1. Schritt ist die Abschtzung der Lebensrume auf der Sohle
! 2.Schritt : Mischprobe mit Fangnetzt entnehmen (Verteilung
der Einzelproben richtet sich nach der Zusammensetzung der Habitate )
! Probe enthlt neben Tieren auch Steine, Sand und Pflanzenteile aus
denen die vorkommenden Tierarten semiquantitativ erfasst werden knnen

1. Schritt: Habitatkartierung:
Kartierung aller im Bereich der Probestelle vorkommenden Habitate

o
o

Ergebnisse im Feldprotokoll festhalten ( in 5% Schritten, bei unter 5% ein x


eintragen)

Die Summer des Deckungsgrades aller Substrattypen muss 100 % ergeben

Feldprotokollbeispiel:

Erklrung der Spalten:


Deckungsgrad (5% Stufen)

Abschtzung der
Deckungsgrade vorkommender
Substrattypen

Ist mineralisches Substrat von


organischem bedeckt ist das
bedeckende Substrat
ausschlaggebend

Anzahl der Teilproben:

Basierend auf der


Deckungsgrad-Abschtzung
wird die Anzahl der Teilproben
bestimmt

Auf jeweils 5% Deckungsgrad


entfllt eine Teilprobe

Gesamtzahl der Teilproben = 20

Bsp.: 5% Akal = 1 Teilprobe


25% Psammal = 5 Proben

Bemerkungen:

Welches mineralische Substrat von


organischem verdeckt ist

Mineralische Substrate:

Megalithal
o

> 40 cm

Groe Steine, Blcke, anstehender Fels

Makrolithal:
o

> 20 cm 40 cm

Steine von Kopfgre

Mesolithal:
o

> 6 cm 20 cm

Faustgroe Steine

Mikrolithal:
o

> 2cm 6 cm

Grobkies

Gre eines Taubeneis bis Gre einer Kinderfaust

Akal:
o

> 0,2 cm 2 cm

Fein - bis Mittelkies

Psammal / Psammopelal
o

> 6 m 2mm

Sand und / oder Schlamm

Argyllal
o

< 6 m

Lehm und Ton

Knstliche Substrate:

Technolithal 1
o

Steinschttungen

Technolithal 2

Geschlossener Verbau ( betonierte Sohle)

!
Organische Substrate:

Algen
o

Filamentse Algen , Algenbschel

Submerse Makrophyten
o

Makrophyten inkl. Moose und Characeae

Emerse Makrophyten
o

Lebende Teile terrestrischer Pflanzen


o

Typha, Carex, Phragmites

Feinwurzeln, schwimmende Ufervegetation

Xylal ( Holz)
o

Baumstmme, Totholz, ste, grere Wurzeln

CPOM
o

Ablagerungen von grobpartikulrem organischen


Material (Falllaub)

FPOM
o

Ablagerungen von feinpartikulrem organischen Material


(Holzstaub)

Abwasserbakterien und Pilze, Sapropel


o

Debris

Abwasserbedingter Aufwuchs und /oder organischer Schlamm

In Uferzone abgelagertes organisches und anorganisches Material ( durch


Wellenbewegungen abgelagerte Mollukenschalen)

!
2. Schritt : Beprobung

Basierend auf der Abschtzung des Deckungsgrades wird die Zahl der Teilproben fr
jeden Substrattyp bestimmt

5% Deckungsgrad = 1 Teilprobe ; 100% = 20 Teilproben maximal

Beprobung erfolgt entgegen der Flierichtung beginnend am unteresten Ende der


Probestelle

Entnahme einer Teilprobe auf einer Flche von 25 x 25 cm (Rahmenmae des


Keschers)

Kescher wird senkrecht zum Gewsserboden aufgesetzt und das Substrat in


Flierichtung vor dem Kescher aufgewirbelt ( Kicksampling)

Beispeil:

!
!
!
!
!
!
!
!
3. Schritt:
Sortierung und Abschtzung der Hufigkeiten

Individuenzahl der klar unterscheidbaren Taxa werde gezhlt und auf die
Gesamtprobe hochgerechnet

Individuen seltener Taxa ( bis 10 Individuen) werden gezhlt, Hufigkeit anderer


Taxa wird geschtzt

Vegetationsaufnahme:

Reprsentative Stichprobe der an einem Standort vorkommenden Flora

Pflanzen werden nicht gezhlt sondern Deckungsgrade bestimmt, weil


o

Auszhlung schwierig, da Pflanzen Auslufer bilden und Individuen ber


unterirdische Organe mit einander verbunden sind

Anzahl der Individuen hat wenig Aussagekraft , da die Individuen einer


Pflanzenart sich betrchtlich in ihrer Gre unterscheiden knnen

Relevant: Anteil einer Pflanzenart an der pflanzlichen Biomasse

!
!
!
1. Schritt: Flche

Probeflche ausmessen und markieren (feuchte Wiese = 5 25 m)

Die Gre der Untersuchten Flche richtet sich nach den untersuchten Pflanzen

2. Schritt: Pflanzenliste

Vorkommende Arten werden erfasst ( Feldnamen fr


jede unterscheidbare Art)

3. Schritt: Abschtzung des Deckungsgrades

Einteilung der Deckungsgrade in Klassen entsprechend


der Skala von Braun-Blanquet

!
!
!
!

Deckungsgrade:

!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
Statische Auswertung
Vegetationskundlicher und
faunischer Daten

Liste der vorkommenden Arten sowie ggf. Angaben zur Hufigkeit:

Man unterscheidet:

Qualitative Artenliste (Angaben zu Vorkommen / Nicht-Vorkommen)

Semiquantitative Artenliste ( zustzlich Angaben zur Hufigkeitsklasse)

!
!
!
!
!
!
oQuantitative Artenliste ( Angaben zur
Individuenzahl, Abundanz = Individuen/Flche)

!
!
!
!
!
Diversittsberechnung:
Kennwerte einer einzelnen Artenliste:

Abundanz ( Individuen / m) bzw. Deckungsgrad in %

Artenzahl

Diversitt:

Shannon-Wiener-Index:

Ds-w =

ln ()

ni= Individuenzahl einer Art bzw. Deckungsgrad

A= Abundanz (Gesamtzahl) aller Individuen

Bsp:

Taxon

A (Gesamtzahl)

Art 1

Art 2

Art 3

10

Summe

19

!
o

Ds-w= ((4/19) ln (4/19))+((5/19) ln (5/19)) + ((10/19) ln (10/19)) =


0,3+0,3+0,5 = 1,1

Bercksichtigt Artenzahl und die Gleichverteilung der Arten

Niedrig wenn wenige Arten vorkommen bzw. einzelne Arten stark


dominieren

Hoch wenn viele Arten vorkommen und alle Arten hnlich Hufig sind

Margalef-Index:
o

Dm= (i-1) / ln (A)

i= Arten

A= Gesamtzahl der Individuen

Bsp.:

Taxon

Art 1

Art 2

Art 3

10

Summe

19

Dm= (3-1) / ln (19) = 0,68

!
!
Vergleich von mehreren Artenlisten:

Anhand hnlichkeits- und Unhnlichkeitsmaen (Distanzmaen)

Man unterscheidet:

Arten Identitt: Welche Arten kommen nur in einer Probe vor, welche Arten
kommen in beiden Proben vor?

Quantitative Identitt : Wie hnlich sind sich Hufigkeiten der


vokommenden Arten

Varibalen:
o

a = Variable ( z.B. Art) kommt in beiden Proben vor

b = Variable kommt in Probe 1, aber nicht in Probe 2 vor

c = Variable kommt in Probe 2, aber nicht in Probe 1 vor

d = Variable kommt weder in Probe 1 noch in 2 vor, aber in anderen Proben


der Reihe

Jaccard-Index: ( Arten Identitt):

JAC =

Bsp:
Taxon

Art 1

Art 2

Art 3

JAC = = 0,33

Srenson-Index: ( Arten Identitt)

SOR=

Renkonen-Index (Dominanten Identitt )

Taxon

Gesamt

Art 1

200 (0,88)

65

(0,49)

265

Art 2

25 (0,11)

65

(0,49)

90

Art 3

1
(0,004)

(0,016) 3

Art 4

1
(0,004)

--

Art 5

1
(0,004)

--

Summe

228

132

360

!
!
!

J,k = zu vergleichende Proben

X = relative Hufigkeit der Art

i = Arten

Bsp:

Relative Hufigkeit ausrechen: Artenzahl = 200 = 87,7 %

Beim Vergleich nimmt man nur die niedrige Hufigkeit (min) und addiert diese !

RENjk= 0,49 + 0,11 + 0,004 = 0,604