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AgaroseGel-Elektrophorese

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I n f o & m o r e

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Agarose-Gel-Elektrophorese AppliChem 2009

1 Das Trennmedium Agarose und Alternativen dazu


1.1 Agarose: Die chemische Struktur und ihre Eigenschaften 1.2 Die Alternativen: Strke- und Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese 1.3 Anwendungen: Agarose in der Gel-Elektrophorese 1.4 Native und denaturierende Agarose-Gel-Elektrophorese 1.5 Modifikationen der Agarose-Gel-Elektrophorese 1.6 Isolierung von Nukleinsuren aus der Agarose-Gel-Matrix 1.7 Agarosen: Auswahlkriterien 1.8 Die Charakteristika der AppliChem-Agarosen 1.9 Anwendungstipps

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2 Puffer-Systeme
2.1 TAE-Puffer 2.2 TBE-Puffer 2.3 MOPS-Elektrophorese-Puffer (10X) 2.4 BPTE-Elektrophorese-Puffer (10X) 2.5 Alkalischer Agarose-Gel-Elektrophorese-Puffer (10X) 2.6 TAFE-Elektrophorese-Puffer 2.7 TPE-Elektrophorese-Puffer 2.8 TTE-Elektrophorese-Puffer 2.9 Low-Molarity Conductive Media

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3 Trennkapazitt 4 Farbstoffe
4.1 Nukleinsure-Farbstoffe-bersicht 4.2 Protein-Farbstoffe-bersicht

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5 Glossar 6 Verwandte Produkte

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 as Trennmedium Agarose D und Alternativen dazu

1.1 Agarose: Die chemische Struktur und ihre Eigenschaften Agarose wird aus den Zellwnden ausgewhlter Rotalgen (Rhodophyceae) gewonnen. Dazu wird Agaropektin, ein Klebstoff der Zellwand aus verzweigten, vielfach modifizierten und geladenen Polysacchariden, entfernt. Nach der weiteren chemischen Modifizierung erhlt man eine sehr reine

Abb. 1.1: Agarose ist aus 1,3-glycosidisch verbundenen Einheiten von 1,4-glycosidisch verknpfter -D-Galacto pyranose und 3,6-Anhydro-L-Galactopyranose aufgebaut.

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Agarose mit den erwnschten elektrophoretischen Eigenschaften: Das lineare, ungeladene Molekl zeigt wenig Interaktion mit anderen Moleklen wie Proteinen und Nukleinsuren. Diese Eigenschaft spiegelt sich in geringen Elektroendoosmose (EEO)-Werten wieder. Die durchschnittliche relative Molekularmasse von Agarose betrgt etwa 120.000. Wenn die Agarose geschmolzen wird, verflechten sich in den Gelen die langen unverzweigten AgaroseMolekle zu Helizes, die wiederum Suprafasern ausbilden (polymerisieren Abb. 1.2). Das so entstandene Agarose-Netzwerk bildet Poren mit 100 bis 300 nm Durchmesser (Brown 1988). Die Porengre wird durch die Agarose-Konzentration bestimmt. Neben dem Puffersystem ist sie der entscheidende Parameter fr das Trennvermgen von Agarose-Gelen (siehe Tabelle Trennkapazitten im Abschnitt 3). Die Grenzen des Auflsungsvermgens ergeben sich aus dem kleinsten Porendurchmesser; Agarose-Gele liefern gute Auftrennung bei Nukleinsuren >50 Basenpaare (bp). Kleinere Nukleinsuren trennt man meist auf Polyacrylamid-Gelen auf (siehe Abschnitt 1.2). Die Maximalgre von auftrennbarer DNA liegt bei etwa 25.000 bp. Auch grere Molekle werden noch auf Agarose getrennt. Dazu werden aber Anpassungen des Elektrophorese-Protokolls mit wechselnden Spannungsfeldern notwendig (siehe hierzu auch Pulsfeld-Gel-Elektrophorese (PFGE) im Abschnitt 1.3.4). Agarose wird in der Regel als feines Pulver geliefert. Die Lslichkeit der Agarosen ist nicht gleich. Manche lsen sich besser, manche schlechter, vor allem wenn sie in hheren Konzentrationen

eingesetzt werden. Speziell Low Melt Agarosen mssen zum Teil autoklaviert werden, damit sie berhaupt in Lsung gehen. Wenn die Agarose zum Auflsen autoklaviert wird, ist darauf zu achten, dass sie sich nicht in einer Lsung mit einem pH-Wert niedriger als pH 5,5 befindet, da sie dann hydrolysiert. Als Folge wird das Gel nicht fest! Die Lsung muss also gepuffert sein reines Wasser kann nicht verwendet werden. Aufgrund des niedrigen Gelierpunktes empfiehlt es sich die Gele bestimmter Low Melt Agarosen vor Gebrauch fr mindestens eine Stunde, manchmal auch ber Nacht bei +4C zu lagern, da dadurch bei der Elektrophorese eine maximale Auflsung erreicht wird. Selbst der Gellauf ist dann am besten im Khlraum durchzufhren, damit sie sich nicht wieder verflssigt. Literatur

[2] Brown, T.A. (1998) Molecular Biology Labfax, 2nd ed., Vol. 1. Academic Press, London [3]  Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Abb. 1.2: Lineare AgaroseMolekle lagern sich zu Doppelhelizes und miteinander verwobenen Suprafasern zusammen und bilden die Gelmatrix.

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[1]  Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) 1995 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing & Wiley-Interscience, New York.

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1.2 Die Alternativen: Strke- und Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese Leider kommt man im Labor selten mit nur einer Gelmatrix aus, da nicht alle Anwendungen mit einer Matrix durchzufhren sind. Jede Methode hat ihre Strken und Schwchen. Weitere Matrizes zur Trennung von Makromoleklen sollen hier nur kurz vorgestellt werden: Strke und Polyacrylamid. 1.2.1 Die Strke-Gel-Elektrophorese taucht in den allgemeinen, molekularbiologischen Methodenbchern von heute gar nicht mehr auf. Die Zonen-Elektrophorese mit Strke-Gelen wurde zur Trennung von Serumprotein eingefhrt (Smithies 1955). Hydrolysierte Kartoffelstrke wird zu 10-15 % (w/v) in konzentriertem Puffer gelst und nach Erhitzen zu einer 0,5-1 cm dicken Gelmatrix gegossen. Die Herstellung der Gele ist etwas auf wndiger, zudem gelten die Ergebnisse als schlecht reproduzierbar. Strke-Gele sind brchig und weniger transparent als Agarose- oder Polyacrylamid-Gele. Allerdings sind Gele aus der ber wiegend naturbelassenen Strke eine enzymfreundliche Matrix und werden in der Aufreinigung von Enzymen und Serumprotein weiterhin verwendet. Auch fr Zymogramme, bei denen der ProteinNachweis auf dem Nachweis der Enzymaktivitten im Gel beruht, werden Strke-Gele verwendet (z.B. Silva et al. 2008). Die ursprngliche Methode nach Smithies wurde vielfach modifiziert; z.B. eine zweidimensionale, vertikale Variante (Poulik & Smithies 1958). In Kombination erffnen die Eigenschaften von Strke, Agarose und Polyacrylamid zustzliche Mglichkeiten. In der Literatur finden sich zahlreiche Beispiele fr solche kombinierten Systeme, beispielsweise Strke-PAGE oder in-Gel Tests (Fontanini et al. 2007). 1.2.2 Die Polyacrylamid-Gel-Elektro phorese (PAGE) ist eine vielseitige und die am weitesten verbreitete Methode zur Trennung von Peptiden und Proteinen sowie fr Nukleinsuren. PA-Gele werden durch die Polymerisation von Acrylamid-Monomeren zu langen Ketten und deren Quervernetzung mittels bifunktionalen Moleklen (Cross-Linkern), wie Bisacrylamid (N,N'Methylenbisacrylamid), hergestellt. Ammoniumpersulfat (APS) dient als Initiator der Polymerisation von Acrylamid, TEMED katalysiert die Bildung freier Radikale des Initiators. Das Ergebnis der Poylmerisation von Acrylamid und Cross-Linkern ist eine definierte Matrix mit regelmiger Porengre. Die Porendurchmesser werden durch die Gesamtkonzentration an Acrylamid und durch das Verhltnis von Acrylamid zu Cross-Linker, welches den Vernetzungsgrad bestimmt, eingestellt.

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Die PAGE findet in zwei grundstzlich unterschiedlichen Variationen An wendung: 1.  PA-Gele fr die native Gel-Elektrophorese bestehen aus Poly acrylamid und Puffer ohne Zusatz von denaturierenden Substanzen. Damit bleiben Sekundrstruktur und Strukturen hherer Ordnung whrend der Elektrophorese weitgehend erhalten. 2.  Gele mit Zustzen, die Molekle whrend der Trennung im denaturierten Zustand erhalten, werden als denaturierende Gele bezeichnet. Beispielsweise wird die Analyse sehr kleiner RNA und Einzelstrang-DNA in Harnstoff-haltigen PA-Gelen durchgefhrt. Harnstoff unterbricht die Wasserstoffbrckenbindungen zwischen den Basen der Nukleinsuren und ermglicht damit die Trennung von Oligonukleotiden nahezu ausschlielich nach ihrer Masse ohne den Einfluss der Struktur. Vielfach wird auch mit Agarosen denaturierende Gel-Elektrophorese von RNA durchgefhrt (siehe 1.4).

Literatur
[1]  Fontanini, D. et al. (2007) J. Agric. Food Chem. 55, 4334-4339. Simplified electrophoretic assay for human salivary alpha-amylase inhibitor detection in cereal seed flours. [2]  Hames, B.D. (1990) Kapitel 3 in Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach 2nd ed. (Hames, B.D. & Rickwood, D. eds.) IRL Press [3]  Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of Bacteriophage T4. [4]  Ogden, R.C. & Adams, D.A. (1987) Methods Enzymol. 152, 61-87. Electrophoresis in agarose and acrylamide gels. [5]  Poulik, M.D. & Smithies, O. (1958) Biochem. J. 68, 636-643. Comparison and combination of the starch-gel and filter-paper electrophoretic methods applied to human sera: two-dimensional electrophoresis. [6]  Silva, C.A., et al. (2008) Genet. Mol. Res. 7, 791-805. Isoenzyme electrophoretic patterns in discus fish (Symphysodon aequifasciatus Pellegrin, 1904 and Symphysodon discus Heckel, 1840) from the Central Amazon. [7]  Smithies, O. (1955) Biochem. J. 61, 629-641. Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum proteins of normal human adults.

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Acrylamid

N,N-Methylenbisacrylamid

Aussschnitt aus der chemischen Struktur einer Polyacrylamid-Matrix.

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1.3 Anwendungen: Agarose in der Gel-Elektrophorese Die Vielfalt der zu trennenden Biomolekle erfordert entweder eine Vielfalt an Techniken oder eine flexible Technik. Gerade die Agarose hat hier viel zu bieten. Durch die Auswahl einer Agarose mit entsprechenden chemisch-physikalischen Eigenschaften und gleichzeitiger Variation des Puffersystems und der Agarose-Konzentration, knnen ein sehr breites Spektrum an Methoden abgedeckt und enorme Unterschiede in den Trenneigenschaften erzielt werden. Dies gilt sowohl fr die Auftrennung von Proteinen, als auch fr Nukleinsuren. Agarosen sind grundstzlich eher fr die Auftrennung grerer Molekle geeignet, wobei auch bei hheren Konzentrationen gute Ergebnisse fr kleinere Fragmente erzielt werden. 1.3.1 Analytische Gele dienen in der Regel dem Sichtbarmachen von Unterschieden im Wanderungsverhalten der Molekle im Gel. Man will wissen, wie gro zum Beispiel ein Nukleinsure-Fragment ist. Die Fragestellung bei Nukleinsuren heit hufig: Hat man das richtige Fragment in einen Vektor kloniert?! Die Gre wird durch Vergleich mit den Banden eines Grenstandards ermittelt. Die Fragmentgren des Standards, auch Marker genannt, sind bekannt. 1.3.2 Prparative Gele werden dann eingesetzt, wenn man ein Molekl aufreinigen mchte. Eine Mischung von Fragmenten wird elektrophoretisch aufgetrennt und gezielt die Bande mit dem gewnschten Fragment aus dem Gel herausgeholt. Hierfr gibt es verschiedene Techniken: Nach dem Ausschneiden oder Ausstanzen der Bande wird die Nukleinsure durch Elektroelution, Verdau der Agarosematrix durch -Agarase oder Schmelzen der Agarose in Natriumiodid und anschlieen-

der Bindung der Nukleinsure an eine Silikamatrix, gereinigt (s.u.). 1.3.3 Manipulationen von Nukleinsuren im Gel ersparen Zeit. Diese In-gel applications werden nach Verflssigung der Gelmatrix ohne deren Beseitigung durchgefhrt. Bei den angewendeten Temperaturen schmilzt die DNA nicht. Zu den Einsatzgebieten zhlen enzymatische Verdaus, 'Nick translation', Ligationen und DNA-Markierungen. Geeignet sind demnach Agarosen mit einem niedrigen Schmelzpunkt. 1.3.4 Die Gel-Elektrophorese im gepulsten Feld (englisch: Pulsed Field Gel Electrophoresis; PFGE) ist eine Technik zur verbesserten Auftrennung besonders groer DNA-Molekle (>20 kb). Da in der normalen Gel-Elektrophorese Molekle nach deren Lnge aufgetrennt werden, ist eine Trennung sehr groer Molekle praktisch nicht mglich. Daher wurde diese Technik modifiziert: Das elektrische Feld wird whrend des Gellaufs geographisch gendert, weshalb sich Molekle neu ausrichten mssen. Kleinere Molekle schaffen dies einfach schneller als groe. 1.3.5 Zur Identifizierung eines Individuums wird die Technik des DNA typing eingesetzt. Im menschlichen Genom, das von Mensch zu Mensch um weniger als ein Tausendstel variiert, sind variable Regionen vorhanden, in denen sich die Unterschiede hufen. Statt das Genom oder Teile davon zu sequenzieren, vergleicht man mehrere dieser Regionen und kann so ein individuelles Profil eines jeden Menschen erstellen.
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1.3.6 Kapillarelektrophorese wird in Kapillaren/Glasrhrchen durchgefhrt und nicht im Flachbett, wie die bliche Agarose-Gel-Elektrophorese. Ziel ist eine teilweise Automatisierung. 1.3.7 Bei der Immun-Elektrophorese macht man sich die Bildung von Markromoleklen, bestehend aus vielfachen Antigen-Antikrper-Einheiten, zunutze. Diese przipitieren, wenn das Mengenverhltnis Antigen-Antikrper richtig eingestellt wurde. 1.3.8 Blotting ist im engeren Sinne keine elektrophoretische Anwendung. Mit dieser Technik werden Molekle, die zuvor im Agarose-Gel aufgetrennt wurden, auf eine andere Matrix (BlottingMembran) im elektrischen Feld oder durch den Flssigkeitsstrom im Kapillar-Blot bertragen. 1.3.9 In der Zell- und Gewebekultur werden feste oder halbfeste Kulturmedien eingesetzt. Hierbei kann Agarose den hufig verwendeten Agar ersetzen. Einsatzgebiete sind die Pflanzenzchtung, dreidimensionale Zell- und Gewebekulturen, einschlielich der Klonierung von Hybridomazellen, der Herstellung von Pflanzenprotoplasten und dem viralen Plaque-Asssay.

pDNA

pDNA M
Abb. 1.3: Agarose-Gel auf einem Geltrger nach der Elektrophorese. Marker-DNA (M) und unbekannte Proben von Plasmid-DNA (pDNA) wurden getrennt und mit Ethidiumbromid gefrbt. Die dunklen Banden werden durch die so genannten tracking dyes Bromphenolblau bzw. Xylencyanol hervorgerufen. Sie erleichtern die Orientierung bezglich der bereits zurckgelegten Laufstrecke. Abb. 1.4: Beispiel eines DNA-Markers; hier: AppliChem DNA Ladder 100 bp (Artikel-Nr. A3470). Fragmentlngen und Massen der einzelnen Fragmente sind definiert und erlauben die Abschtzung der Gre und Masse einer unbekannten Probe.

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1.4 Native und denaturierende Agarose-Gel-Elektrophorese In der Regel werden Nukleinsuren unter nicht-denaturierenden (= nativen) Bedingungen aufgetrennt. D.h. bei der elektrophoretischen Auftrennung spielen Ladungsverhltnisse, Gre und Form des Molekls eine Rolle. Eine spezielle Ausnahme bildet die RNA in der Agarose-Gel-Elektrophorese. Als einzelstrngiges Molekl ist sie in der Lage durch intramolekulare Basenpaarungen eine Sekundrstruktur auszubilden, die die Auftrennung nach Moleklgre verflscht. Daher wird die RNA entweder durch Zugabe von Formaldehyd/Formamid oder deionisiertem Glyoxal/DMSO denaturiert. Formaldehyd bildet instabile Schiff-Basen mit der Iminogruppe des Guanosin, weshalb Formaldehyd im Ladepuffer und im Gel vorhanden sein muss. Es wird meist in einer Endkonzentration im Gel von 2,2 M zugegeben. Der Ladepuffer enthlt neben Formaldehyd auch Formamid (z.B. Ref. 1 Seite 4.9.3). Formaldehyd-haltige Gele werden unter dem Abzug gegossen! Achtung, die Dmpfe sind schdlich. Die Gele sind weniger stabil als nicht-denaturierende Agarose-Gele. Die hohe FormaldehydKonzentration im Gel gewhrleistet, dass whrend des gesamten langen Gellaufes (ca. 5 h) die Denaturierung der RNA erhalten bleibt. Fr krzere Lufe (2-3 h) kann die Konzentration bis auf 0,4 M reduziert werden (2). Die Denaturierung in DMSO (50-60 %)/Glyoxal (0,88-1,2 M) erfolgt erst vor dem Laden. Dies ist mglich, weil die RNA glyoxyliert wird und diese Verbindungen bei pH-Werten unter 7,0 stabil sind. Achtung: Oxidationsprodukte des Glyoxal wrden die RNA schdigen. Daher muss es immer deionisiert eingesetzt werden. Welche der beiden Denaturierungsmethoden ist vorzuziehen? Die RNA-Banden sind nach Glyoxal-Behandlung schrfer als mit Formaldehyd. Allerdings lsst sich Formaldehyd leichter von der RNA entfernen, was fr den eventuell folgenden Northern-Blot von Vorteil ist. Der Gesundheitsaspekt im Fall von Formaldehyd nimmt an Bedeutung zu! Geht es bei der RNA-Auftrennung nur darum, eine RNA-Isolierung zu prfen, gengen oft auch native Agarose-Gele ohne entsprechende Zustze. Ribosomale RNAUntereinheiten werden klar getrennt.

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Formaldehyd Guanin Schiff-Base

Formaldehyd

Guanosin

Schiff-Base

Literatur
[1]  Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) (1995) Current Protocols in Molecular Biology. Seite 4.9.1 ff Suppl. 67. Greene Publishing & Wiley-Interscience, New York. (Analyse von RNA durch Northern und Slot Blot Hybridisierung). [2]  Goda, S.K. & Minton, N.P. (1995) Nucleic Acids Res. 23, 3357-3358. (Einfache Methode fr Gel-Elektrophorese und Northern-Blotting von RNA.) [3]  Rave, N. et al. (1979) Nucleic Acids Res. 6, 3559-3567 (Identifizierung der Prokollagen-mRNA nach Transfer aus Formaldehyd-Agarose-Gelen.) [4]  Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Seite 7.28. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. (Auftrennung von RNA entsprechend der Gre; Protokolle 5 und 6).

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1.5 Modifikationen der Agarose-Gel-Elektrophorese Neben den zuvor beschriebenen Standard-Anwendungen, gibt es auch Modifikationen, die an spezielle Erfordernisse angepasst wurden. Im Folgenden werden einige dieser wahrscheinlich eher selteneren Anwendungen vorgestellt. 1.5.1 Polyvinylpyrrolidon-Agarose-Gel-Elektrophorese: Ziel dieser Modifikation ist die Isolierung von PCR-amplifizierbarer DNA aus Bodenproben. Der Zusatz von Polyvinylpyrrolidon (PVP) zur Agarose-Matrix bremst die Wanderung von denaturierenden Huminsuren mit phenolischen Gruppen aus der Probe so stark, dass sie nicht mehr mit den Nukleinsuren wandern. Auch das phenolische Bromphenolblau wird zurckgehalten, whrend Xylencyanol unverndert wandert. PVP in einer Konzentration ber 0,5 % hemmt die PCR. Laufbedingung Laufpuffer Low Melt Agarose PVP 5 V/cm (ber Nacht) TAE oder TBE (sind gleichwertig) 1,25 % (w/v) 2 % (w/v)

Young, C.C. et al. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59(6), 1972-1974

1.5.2 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) mittels Agarose-Gel-Elektrophorese: Eigentlich werden EMSAs nur in 3,5 %-5 % Polyacrylamid-Gelen durchgefhrt, weil kleine DNAFragmente und kleinere Proteine im Agarose-Gel nicht gut zu trennen sind. Eine Alternative stellen gemischte Agarose-Polyacrylamid-Gele dar. In dieser Publikation wird beschrieben, dass die Immobilisierung von Synergel, einem chemisch-modifizierten Galactomannan, in der AgaroseMatrix zu einer groen Verbesserung der Auflsungskapazitt des Agarose-Gels fhrt. Bis zu 30 bp kleine DNA-Fragmente, gebunden an den Glucocorticoid-Rezeptor, konnten getrennt werden. Laufbedingung Laufpuffer Agarose Synergel Vorlauf 70 V fr 45 min. bei +4C Auftrennung 70 V fr 3 h bei +4C 0,5X TBE 1,2 % 1,2 %

Chandrasekhar, S. et al. (1998) BioTechniques 24, 216-218

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1.5.3 SDS-Agarose-Gel-Elektrophorese fr Proteine: Die klassische SDS-PAGE fr die Auftrennung von Proteinen lsst sich auch mit Agarosen durchfhren. Dazu wird eine hochauf lsende Agarose (Resolving Gel) mit einer Agarose mit hoher Gelstrke (Stacking Gel) kombiniert. Sowohl die Sensitivitt bei Frbung mit Coomassie, als auch die Transfereffizienz beim Blotten sind bei SDS-Agarose besser, als bei der klassischen SDS-PAGE (Wu & Kusukawa 1998). Laufbedingung Laufpuffer Agarose (resolve) Agarose (stacking) 15 V/cm konstant Volt 1X TBE-SDS (89 mM Tris, 89 mM Borsure, 2 mM EDTA, 0,1 % SDS) 7 % (w/w) 1 % (w/w)

Wu, M. & Kusukawa, N. (1998) BioTechniques 24, 676-678. SDS Agarose Gels for Analysis of Proteins. [Fr das Resolving Gel kann Agarose IMG Art.-Nr. A2121 und fr das Stacking Agarose MP Art.-Nr. A1091 eingesetzt werden.]

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1.6 Isolierung von Nukleinsuren aus der Agarose-Gel-Matrix 1.6.1 Elektroelution Die Technik der Elektroelution erlaubt grundstzlich die Isolierung aller DNA-Fragmentgren aus Agarose-Gelen, aber besonders die Isolierung groer DNA-Fragmente (2 kb), da so gut wie keine Scherkrfte auf die DNA wirken. Dazu wird das gewnschte DNA-Fragment aus dem Gel ausgeschnitten, in einen Dialyse-Schlauch berfhrt und dieser mit TAE-Puffer gefllt. Der gefllte Dialyse-Schlauch wird in die mit TAE-Puffer gefllte Gelkammer gelegt. Man lsst die DNA im elektrischen Feld in den TAE-Puffer wandern.
[1]  Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) (1995) Current Protocols in Molecular Biology. Seite 2.6.1 ff Suppl. 59. Greene Publishing & Wiley-Interscience, New York. (Isolierung und Analyse groer DNA Restriktionsfragmente aus Agarose-Gelen).

1.6.2 -Agarase (Artikel-Nr. A4712) (EC 3.2.1.81 aus Pseudomonas atlantica) Wie wahrscheinlich fr jedes polymere Naturprodukt, gibt es auch Enzyme die Agarose verdauen knnen. blicherweise wird dafr rekombinante -Agarase aus Pseudomonas atlantica verwendet. Das Enzym verdaut spezifisch das Polysaccharidgerst der Agarose, bestehend aus 1,3-verknpfter -D-Galactopyranose und 1,4-verknpfter 3,6-Anhydro--L-Galactopyranose, zu Neoagaro-Oligosacchariden. Die Technik des Agarose-Verdaus ermglicht besonders die Isolierung groer DNA-Fragmente (10 kb), da so gut wie keine Scherkrfte auf die DNA wirken, die ansonsten bei allen anderen Isolierungstechniken auftreten. Die DNA bzw. RNA lsst sich durch AlkoholPrzipitation einfach isolieren. -Agarase ist im pH-Bereich zwischen 5,0-8,5 aktiv, das Optimum liegt bei 6,0. Die optimale Temperatur liegt bei 40-42C. Eine Agarase-Einheit verdaut 100 l (ca. 100 mg) geschmolzener 1%iger low melt-Agarose bei 42C innerhalb von 30 Minuten in 1X TBEPuffer. Die Erhhung der Temperatur auf 45C beschleunigt zwar die Reaktion, senkt aber die Stabilitt. ber 50C wird das Enzym schnell inaktiviert. Die so erhaltenen Nukleinsuren knnen fr viele weitere Versuche wie z.B. Restriktionsendonuklease-Verdau, Ligation, Markierung, Sequenzierung, Amplifikation etc. verwendet werden. Um eine Koprzipitation der AgaroseOligosaccharide zu vermeiden, sollte die Przipitation bei Raumtemperatur mit Ammoniumacetat (statt Natriumacetat) ausgefhrt werden. Dabei ist allerdings zu beachten, dass Ammonium-Ionen bereits in Konzentrationen ber 7 mM die Polynukleotidkinase hemmen. Falls die isolierte DNA phosphoryliert werden soll, muss Natriumacetat verwendet werden. Folgende AppliChem-Agarosen sind fr den Verdau mit -Agarase geeignet: A2121 Agarose IMG, A2119 Agarose Low Melt 3, A3762 Agarose Low Melt Large DNA grade.

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[1]  Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) (1995). Current Protocols in Molecular Biology. Suppl. 59. Seite 2.6.6-2.6.7. John Wiley & Sons, New York. [2]  Morrice, L.M. et al. (1983). Eur. J. Biochem. 135, 553-558. -Agarase I and II from Pseudomonas atlantica. Purification and some properties. [3]  Sambrock, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition; Seite 5.33-5.35. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Protokoll zum Verdau der Agarose 1.  Zur Ermittlung des Gewichtes des Agarose-Stckes wird zunchst das leere Reaktionsgef gewogen und erst dann mit dem Agarosestck, um den Differenzbetrag zu ermitteln. 2.  Fr die Isolierung der Nukleinsure wird die Bande mglichst przise aus dem Agarose-Gel geschnitten und in dem 1,5 ml Reaktionsgef bei bis zu 70C vollstndig geschmolzen.  Achtung: Hhere Temperaturen knnen zum Schmelzen der DNA fhren. Es sollten pro Ansatz nicht mehr als 200-500 mg Agarose eingesetzt werden. Nicht vollstndig geschmolzene Agarose wird auch nicht vollstndig hydro lysiert. 3.  Das Reaktionsgef wird dann fr ca. 10 Minuten in einem Wasserbad bei 40-42C inkubiert, um auf die fr den Verdau optimale Reaktionstemperatur einzustellen. 4.  Durch Zugabe von einer Einheit der -Agarase pro 100 l (ca. 100 mg) geschmolzener Agarose, wird die Agarose 30 Minuten bei 40-42C verdaut. Wenn hhere Agarose-Konzentrationen verwendet wurden, wird die Menge an Agarase proportional erhht. Reinigung der DNA (groe Fragmente) 1.  Fragmente grer als 30 kb mssen besonders vorsichtig behandelt werden, um mechanische Zerstrung durch Scherkrfte zu vermeiden. Deshalb werden nach dem Verdau durch Agarase unverdaute Kohlenhydrate fr ca. 10 Minuten bei 15000 x g abzentrifugiert. 2.  Oligosaccharide und Agarase werden durch Dialyse entfernt. Die DNA kann aber auch in der geschmolzenen Agarose weiter bearbeitet werden.

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Literatur

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Reinigung der DNA (kleine Fragmente) 1.  DNA-Fragmente kleiner als 30 kb knnen durch Ethanol-Przipitation von der verdauten Agarose abgetrennt werden. Zur hydrolysierten Agarose wird Salz zugegeben: Entweder Ammoniumacetat (Endkonzentration 2,5 M) oder Natriumacetat (Endkonzentration 0,3 M).  Achtung: Um eine Koprzipitation von Agarose-Oligosacchariden zu vermeiden, sollte die Przipitation bei Raumtemperatur mit Ammoniumacetat statt Natriumacetat ausgefhrt werden. Dabei ist allerdings zu beachten, dass Ammonium-Ionen bereits in Konzentrationen ber 7 mM die Polynukleotidkinase hemmen. Wenn also die isolierte DNA phosphoryliert werden soll, muss Natriumacetat verwendet werden. 2.  Nach Salzzugabe wird 5 Minuten auf Eis inkubiert und dann bei 15000 x g fr 10 Minuten abzentrifugiert. 3.  Der berstand wird in ein neues Reaktionsgef transferriert und entweder 1 Volumen Isopropanol oder 2-3 Volumina Ethanol zugegeben. Vorsichtig mischen und fr mindestens 30 Minuten bei 0C bis 22C inkubieren. 4.  Bei 15000 x g fr 15 Minuten zentrifugieren, den berstand verwerfen und das Pellet trocknen. Die DNA wird in Abhngigkeit von der weiteren Behandlung in einem geeigneten Puffer gelst. Folgende AppliChem-Agarosen sind fr den Verdau mit -Agarase geeignet: A2121 Agarose IMG, A2119 Agarose Low Melt 3, A3762 Agarose Low Melt Large DNA grade

-Agarase zeigt in verschiedenen Puffern eine hohe Aktivitt:


150 % Alternativ: Alternativ: 120 % Alternativ: 120 % Alternativ: 100 % Alternativ: 50 mM Bis-Tris, pH 6,5 1 mM EDTA 100 mM Bis-Tris, pH 6,5 (Ref. 2) 10 mM EDTA Filtersterilisieren; unbegrenzt haltbar bei Raumtemperatur 10 mM Tris, pH 7,6 (Ref. 1) 5 mM EDTA, pH 8,0 0,1 M NaCl 90 mM Tris-Phosphat (TPE-Puffer) 2 mM EDTA 40 mM Tris-Acetat (TAE-Puffer) 1 mM EDTA 45 mM Tris-Borat (TBE-Puffer) 1 mM EDTA

Ethidiumbromid bis zu einer Konzentration von 5 g/ml hemmt Agarase nicht!

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1.6.3 Natriumiodid Als Bestandteil eines DNA-Isolierungskits (AppliChem Art.-Nr. A3421,0300), bestehend aus einer Glaspulver-Suspension (Glasmilch), einer Natriumiodid-Lsung (6 M) und einem Wasch lsungskonzentrat, wird Natriumiodid zur Isolierung von Nukleinsuren aus Agarose eingesetzt. Das Reinigungsprinzip beruht auf der Bindung der Nukleinsure an die Glaspartikel (Silika-BatchVerfahren) nach Schmelzen der Agarose in Natriumiodid. Fragmente mit einer Gre von ber 300 Basenpaaren werden mit einer Effizienz von ber 80 % isoliert. Mit abnehmender Fragmentgre nimmt auch die Effizienz ab. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen: Die DNA-Bande von Interesse wird aus dem Agarose-Gel mglichst genau ausgeschnitten und in der Natriumiodid-Lsung bei 55C geschmolzen. Zur geschmolzenen Agarose wird Glaspulver-Suspension zugegeben und 5 Minuten inkubiert. Danach werden die Glaspartikel durch kurze Zentrifugation pelletiert und dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Die DNA wird mit Wasser oder TE-Puffer von den Glaspartikeln eluiert.

Protokoll fr die DNA-Isolierung aus Agarose mit Glaspulver (DNA Isolation Kit Art.-Nr. A3421) 1.  Die DNA-Bande wird aus dem Ethidiumbromid-gefrbten Gel mit einer Rasierklinge unter UV-Licht (312 nm) ausgeschnitten und in ein Reaktionsgef transferriert. 2.  Zu dem Gel-Stck wird das entsprechend dreifache Volumen an 6 M NaI-Lsung zugegeben. Falls TBE als Laufpuffer verwendet wurde, wird ein Volumen an 3 M Natriumacetat-Lsung (pH 5,2) und 4,5 Volumina an NaI-Lsung, bezogen auf das Volumen des Gelstckes, zugegeben. Die Endkonzentration von NaI sollte mindestens 4 M sein.  Fr 2-5 Minuten bei 55C inkubieren, den Inhalt des Reaktionsgefes mischen und es fr weitere 1-2 Minuten zurck in das Wasserbad stellen. Jetzt sollte das Agarose-Gelstck vollstndig aufgelst sein. 3.  Zur Agarose : DNA : NaI-Lsung wird jetzt die Glaspulver-Suspension gegeben. Es werden 6 l gut-gemischter Suspension fr die ersten 2 g DNA eingesetzt und zustzlich je 1 l fr jede weitere 0,5 g DNA.  Gut mischen und fr 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Alle 1-2 Minuten mischen. Um die Bindungseffizienz fr Fragmente kleiner als 1000 bp zu erhhen, bei 55C inkubieren. 4.  Fr 10 Sekunden in einer Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit abzentrifugieren und den berstand verwerfen. 5.  Das Glaspellet mit Waschpuffer waschen. Dabei 50 Volumina Waschpuffer bezogen auf das ursprngliche Glaspulver-Volumen verwenden. Das Glaspellet durch Auf- und Abpipettieren oder durch vorsichtiges Schnalzen des Gefes resuspendieren. Achtung: Sehr vorsichtig pipettieren, wenn mit groen DNA-Stcken (>15 kb) gearbeitet wird.

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6. Den Waschschritt zweimal wiederholen. 7.  Nach Entfernen des berstandes des letzten Waschschrittes, das Gef nochmal kurz abzentrifugieren und soviel Waschpuffer wie mglich mit einer Mikropipette entfernen. 8.  Das Glaspellet in 1-2 Volumina sterilem, destilliertem Wasser oder TE-Puffer (10 mM Tris pH 7,5-8,0; 1 mM EDTA) suspendieren Volumina bezogen auf das ursprngliche GlaspulverVolumen, das fr die Isolierung eingesetzt wurde. Fr 3-5 Minuten bei 55C unter gelegentlichem Mischen eluieren. 9.  In der Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit fr 30-45 Sekunden zentrifugieren. Vorsichtig den DNA-haltigen berstand in ein neues Reaktionsgef transferrieren. Die DNAAusbeute kann um 10-15 % erhht werden, wenn eine zweite zustzliche Elution durchgefhrt wird. Literatur [1]  Sambrook, J. & Russell, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Seite 1.32-34. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. [2]  Vogelstein, B. & Gillespie, D. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 615-619. Prparative und analytische Reinigung von DNA aus Agarose.

1.6.4 Crush & Soak 1.  In ein 1,5 ml Reaktionsgef wird mit einer Nadel ein Loch in den Boden gestochen. In dieses Reaktionsgef wird das Gel-Stck mit der zu isolierenden DNA gegeben und das Ganze in ein zweites 1,5 ml Reaktionsgef gestellt. In einer Tischzentrifuge wird das Gelstck durch das kleine Loch im Boden in das untere Reaktionsgef zentrifugiert und dabei zerkleinert ("crush"). 2.  Zum zerkleinerten Gelstck werden 500 l TE-Puffer gegeben und ber Nacht bei 37C geschttelt. 3.  In ein neues 1,5 ml Reaktionsgef wird ebenfalls mit einer Nadel ein Loch in den Boden gestochen. Dieses Reaktionsgef wird bis auf die Hlfte mit Glaswolle vollgestopft und dann in ein zweites 1,5 ml Reaktionsgef gestellt. Auf die Glaswolle wird das ber Nacht geschttelte zerkleinerte Gelstck gegeben und in einer Tischzentrifuge kurz durch die Glaswolle zentrifugiert.

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4.  Die aufgefangene DNA wird jetzt mit dem doppelten Volumen an Isopropanol gefllt. ca. 500 l Probe + 50 l 3 M NaOAc pH 7,4 + 4 l Acrylamid-Carrier (DNA-PrecipitAid Art.-Nr. A6587,0001) + 1 ml Isopropanol 5. ca. 1 Stunde auf Eis (aus Erfahrung reichen meist schon 10 Minuten) 6. 10 Minuten bei 13.000 rpm in der Tischzentrifuge abzentifugieren 7. Pellet mit 80 % Ethanol waschen 8. SpeedVac trocknen 9. Pellet in 20 l TE-Puffer resuspendieren. 1.6.5 Nukleinsure-Nachweis auf der EtBr-Agarose-Platte Wer kurz testen will, ob er nach einem Nukleinsure-Reinigungsschritt berhaupt DNA in seiner Lsung hat, kann 1 l auf eine Ethidiumbromid-Platte auftragen. Zur Herstellung der Platte werden 10 ml 1 % Agarose + 1 l 10 mg/ml EtBr in eine Petrischale gegossen. Nach dem Festwerden (Erkalten), mit Parafilm abdichten und in Alufolie einpacken. Umgedreht Deckel nach unten im Khlschrank lagern. Die Stellen, auf die DNA-Lsung aufgetropft wurde, makieren; am einfachsten ein Raster mit Filzstift auf den Boden zeichnen und benutzte Felder auskreuzen. Die Platte kann im Prinzip so lange ver wendet werden, bis sie eingetrocknet ist. Zum Betrachten jeweils kurz auf den UV-Tisch legen. Manchmal ist der 1 l gut investiert, denn, wenn man aus irgendwelchen Grnden die DNA verloren hat, braucht man nicht weiterarbeiten und erspart sich zum Beispiel beim Klonieren leere Agarplatten, weil evtl. gar kein Insert oder Vektor vorhanden war.

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Auswahlkriterien
Art.-Nummer

1.7 Agarosen: Auswahlkriterien Wer die Wahl hat, hat die Qual. Das muss nicht sein, denn aufgrund der speziellen Eigenschaften jeden Agarose-Typs, knnen diese entsprechenden Anwendungen zugewiesen werden. Je hher konzentriert eine Agarose zum Beispiel eingesetzt wird, desto geringer ist deren Transparenz. Diese spielt aber insofern eine groe Rolle, da das zu isolierende Molekl mittels Frbung (oder im Fall von DNA auch UV shadowing) sichtbar gemacht werden muss. Die Nachweisgrenze steigt mit zunehmender Agarose-Konzentration. Schmelzpunkt bzw. Geltemperatur sind besonders fr low melt Agarosen wichtig. Je niedriger der Schmelzpunkt, desto einfacher verflssigt sich die Agarose, desto einfacher werden die aufgetrennten Molekle freigsetzt. Im direkten Zusammenhang wird hufig die Gelstrke gesehen. Je hher diese ist, desto besser lsst sich ein gegossenes, verfestigtes Gel hantieren. low melt Agarosen zerbrechen aufgrund der niedrigen Gelstrken leicht. Es sollte daher immer auf die Konzentrationsangabe, bei der dieser Parameter bestimmt wurde, geachtet werden. Die Elektroendoosmose ist das Ma der Wechselwirkung zwischen Molekl (Protein, Nukleinsuren) und Matrix (Agarose). Mit wenigen Ausnahmen liegen die
A2114 Low EEO A2115 High EEO A2116 Medium EEO A2117 Special EEO A2118 Low Melt S A2119 Low Melt 3 A2120 Low Melt 4 A3762 Low Melt Large DNA grade A2121 IMG A2122 SMG A1091 MP

Bezeichnung

Anwendung

Analytische Trennung 1000 bp Analytische Trennung 1000 bp Prparative Elektrophorese PFGE DNA typing Blotting

Hohe Auflsung KapillarElektrophorese Immuno Elektrophorese

In-gel Anwendungen

Gewebe/Zellkultur

Agarase-Verdau

Besondere Eignungen fr bestimmte Anwendungen sind hervorgehoben.

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Agarose-Gel-Elektrophorese AppliChem 2009

Werte fr fast alle Agarosen unter 0,12. Ein weiteres, durchaus bedeutendes Auswahlkriterium, ist die Verdaubarkeit durch -Agarase, wenn groe Nukleinsuremolekle aus der Matrix isoliert werden sollen (geringe Scherkrfte!).

Agarosen fr die Gel-Elektrophorese bersicht


Art.-Nr. A2114 Bezeichnung Agarose low EEO (Agarose Stamdard) Agarose high EEO EEO 0,09-0,13 Geltemperatur (1,5 % Gel) 36 1,5C Anwendung Nukleinsure-Auftrennung analytisch, prparativ (besonders Fragmente 1000 bp), Blotting; Konzentration 0,8-2% Auftrennung von Serumproteinen, Immunoelektrophorese, Counterimmunoelektrophorese
Nukleinsure-Auftrennung; Auftrennung von Serumproteinen, Immunoelektrophorese

A2115

0,23-0,26

36 1,5C

A2116 A2117 A2118

Agarose medium EEO Agarose special EEO Agarose Low Melt S

0,16-0,19 0,3 0,12

36 1,5C 36 1,5C 17C

Immunoelektrophorese, besonders Counter immuno elektrophorese Kapillarelektrophorese, Klonierungsexperimente in der Gewebekultur (z.B. Hybridome, Pflanzenprotoplasten, viral plaque assay etc.); Nukleinsure-Auftrennung/Manipulation im Gel Prparative Elektrophorese von Nukleinsuren (DNA/RNA) und Proteinen; viral plaque assay; Gewebekultur Kapillarelektrophorese; analytische DNA-Gele (besonders Fragmente 500 bp); hohe Gelstrke fr low melt Agarose, sehr transparent bei hoher Konzentration analytische und prparative DNA-Gele (besonders groe DNA-Fragmente 1000 bp); enzymatische Manipulationen im geschmolzenen Gel (z.B. Verdau, Ligation, PCR, etc.), ideal fr den Verdau durch -Agarase analytische DNA-Gele (besonders Fragmente 1000 bp); Blotting analytische DNA/RNA-Gele (Fragmente 100-1000 bp); Blotting analytische und prparative NukleinsureElektrophorese von 0,4-2 % sehr gute Trennung (entsprechend 100 bp-50 kb); Blotting

A2119

Agarose Low Melt 3

0,12

24-28C

A2120

Agarose Low Melt 4

0,12

24-31C

A3762

Agarose Low Melt Large DNA grade

0,12

24-28C

A2121 A2122 A1091

Agarose IMG Agarose SMG Agarose MP

0,12 0,12 0,12

30C 36,5C 36C

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Auswahlkriterien
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Charakteristika

1.8 Die Charakteristika der AppliChem-Agarosen Agarose low EEO (Agarose-Standard) (Artikel-Nr. A2114) Diese Agarose besitzt einen sehr niedrigen EEO-Wert und zeichnet sich durch eine niedrige DNAbindende Aktivitt aus. Sie wird besonders fr die Herstellung prparativer und analytischer Gele (z. B. Kontrolle eines Restriktionsenzymverdaus) mit einer sehr guten Auftrennung von NukleinsureFragmenten grer als 1000 bp empfohlen. Sie ist auch fr Blot-Experimente (z.B. Northern, Southern,) geeignet und kann in Konzentrationen zwischen 0,8 % und 2 % in allen blichen Puffersystemen verwendet werden. Die Agarosen mit den Bezeichnungen low EEO, medium EEO, high EEO und special EEO unterscheiden sich hauptschlich in ihren EEO-Werten. Diese Werte sind bei der Trennung von Makromoleklen sehr wichtig, besonders bei der Auftrennung von Proteinen. Diese vier Agarosen knnen mitein ander gemischt werden, wenn man andere als die durch die einzelne Agarose vorgegebenen EEOWerte erreichen mchte.
A2114 DNasen/RNasen/Proteasen Asche Elektroendoosmose Feuchtigkeit 1200 g/cm2 2500 g/cm2 36 1,5C 88 1,5C 0,2 %

nicht nachweisbar 0,5 % 0,09-0,13 (EEO) 7 %

Gelstrke (1 %) Gelstrke (1,5 %) Geltemperatur (1,5 %) Schmelzpunkt Sulfat

Agarose medium EEO (Artikel-Nr. A2116) Die Agarose medium EEO wird fr die Elektrophorese von Serumproteinen und fr Anwendungen in der Immunoelektrophorese empfohlen. Sie ist auch fr die elektrophoretische Auftrennung von Nukleinsuren geeignet. Sie besitzt eine niedrige DNA-Bindung, ist aber im Gegensatz zur Agarose low EEO nicht fr Blotting-Experimente geeignet. Die Agarosen mit den Bezeichnungen low EEO, medium EEO, high EEO und special EEO unterscheiden sich hauptschlich in ihren EEO-Werten. Diese Werte sind bei der Trennung von Makromoleklen sehr wichtig, besonders bei der Auftrennung von Proteinen. Diese vier Agarosen knnen mitein ander gemischt werden, wenn man andere als die durch die einzelne Agarose vorgegebenen EEOWerte erreichen mchte.
A2116 DNasen/RNasen/Proteasen Asche Elektroendoosmose Feuchtigkeit 750 g/cm2 2000 g/cm2 36 1,5C 88 1,5C 0,25 %

nicht nachweisbar 0,5 % 0,16-0,19 (EEO) 7 %

Gelstrke (1 %) Gelstrke (1,5 %) Geltemperatur (1,5 %) Schmelzpunkt Sulfat

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Agarose-Gel-Elektrophorese AppliChem 2009

Agarose high EEO (Artikel-Nr. A2115) Die Agarose high EEO ist fr die Elektrophorese von Serumproteinen und fr Anwendungen in der Immunoelektrophorese und der 'Counterimmunoelektrophorese' geeignet. Die Agarosen mit den Bezeichnungen low EEO, medium EEO, high EEO und special EEO unter scheiden sich hauptschlich in ihren EEO-Werten. Diese Werte sind bei der Trennung von Makromoleklen sehr wichtig, besonders bei der Auftrennung von Proteinen. Diese vier Agarosen knnen miteinander gemischt werden, wenn man andere als die durch die einzelne Agarose vor gegebenen EEO-Werte erreichen mchte.
A2115 DNasen/RNasen/Proteasen Asche Elektroendoosmose Feuchtigkeit 750 g/cm2 1000 g/cm2 36 1,5C 88 1,5C 0,25 %

nicht nachweisbar 1,1 % 0,230,26 (EEO) 7 %

Gelstrke (1 %) Gelstrke (1,5 %) Geltemperatur (1,5 %) Schmelzpunkt Sulfat

Agarose special EEO (Artikel-Nr. A2117) Die Agarose special EEO wird besonders fr die Counterimmunoelektrophorese und fr Anwendungen in der Immunoelektrophorese (besonders IgG und IgM) empfohlen. Die Agarosen mit den Bezeichnungen low EEO, medium EEO, high EEO und special EEO unter scheiden sich hauptschlich in ihren EEO-Werten. Diese Werte sind bei der Trennung von Makromoleklen sehr wichtig, besonders bei der Auftrennung von Proteinen. Diese vier Agarosen knnen miteinander gemischt werden, wenn man andere als die durch die einzelne Agarose vor gegebenen EEO-Werte erreichen mchte
A2117 DNasen/RNasen/Proteasen Asche Elektroendoosmose Feuchtigkeit 700 g/cm2 1100 g/cm2 36 1,5C 88 1,5C 0,3 %

nicht nachweisbar 1,5 % 0,3 (EEO) 7 %

Gelstrke (1 %) Gelstrke (1,5 %) Geltemperatur (1,5 %) Schmelzpunkt Sulfat

Agarose Low Melt S (Artikel-Nr. A2118) Die Agarose Low Melt S wird besonders fr die Kapillarelektrophorese, fr die Klonierung von Hybridomazellen und Gewebezellen, fr die Herstellung von Pflanzenprotoplasten, fr den so genannten viral plaque assay und den 'verankerungsunabhngigen Wachstumsversuch' empfohlen. Sie besitzt eine niedrige DNA- Bindungkapazitt und ist fr die Herstellung hochprozentiger Gele empfehlenswert. Die Verwendung aller Puffersysteme ist mglich. Der niedrige Schmelzpunkt (60C) erlaubt die schonende Gewinnung von Nukleinsuren unterhalb deren Schmelzpunkt. Die

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Charakteristika
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Charakteristika

niedrige Geltemperatur (17C) ermglicht verschiedene Manipulationen von DNA im Gel (z.B. enzymatischer Verdau, Ligation, DNA-Markierung, Nick Translation, usw.), da bei den ent sprechenden Temperaturen das Gel im flssigen Zustand vorliegt. Die DNA muss nicht vorher extra aus einem Gelstck isoliert werden. Achtung: Die Agarose Low Melt S soll in Gelkonzentrationen hher als 1,2 % angewendet werden, da bei niedrigeren Gelkonzentrationen die Gele sehr zerbrechlich sind und kaum hantiert werden knnen. Da der Gelpunkt unterhalb der Raumtemperatur liegt, mssen Gele ber Nacht bei +4C gelieren.
A2118 DNasen/RNasen/Proteasen Asche Elektroendoosmose Feuchtigkeit 100 g/cm2 350 g/cm2 17C 60C 0,14 %

nicht nachweisbar 0,3 % 0,12 (EEO) 7 %

Gelstrke (1 %) Gelstrke (1,5 %) Geltemperatur (1,5 %) Schmelzpunkt (1,5 %) Sulfat

Agarose Low Melt 3 (Artikel-Nr. A2119) Die Agarose Low Melt 3 wird besonders fr die prparative Elektrophorese von DNA und RNA, aber auch von Proteinen empfohlen. Sie ist auch fr den sogenannten 'viral plaque assay' und Anwendungen in der Gewebekultur geeignet. Sie besitzt eine niedrige DNA-Bindungskapazitt und ist fr die Herstellung hochprozentiger Gele empfehlenswert. Die Verwendung aller Puffersysteme ist mglich. Der niedrige Schmelzpunkt (65,5C) erlaubt die schonende Gewinnung von Nukleinsuren unterhalb deren Schmelzpunkt. Die niedrige Geltemperatur (24-28C) ermglicht verschiedene Manipulationen von DNA im Gel (z.B. enzymatischer Verdau, Ligation, DNAMarkierung, Nick Translation, usw.), da bei den entsprechenden Temperaturen das Gel im flssigen Zustand vorliegt. Die DNA muss nicht vorher extra aus einem Gelstck isoliert werden. Achtung: Aufgrund des niedrigen Gelpunktes empfiehlt es sich die Gele vor Gebrauch fr eine Stunde bei +4C zu lagern, da dadurch bei der Elektrophorese eine maximale Auflsung erreicht wird. Wenn die Agarose zum Auflsen autoklaviert wird, ist darauf zu achten, dass sie sich nicht in einer Lsung mit einem pH-Wert unter pH 5,5 befindet, da sie dann hydrolysiert (Gel wird nicht fest!). Die Lsung muss also gepuffert sein reines Wasser kann nicht verwendet werden.
A2119 DNasen/RNasen/Proteasen Asche Elektroendoosmose Feuchtigkeit 300 g/cm2 550 g/cm2 2428C 65,5C 0,12 %

nicht nachweisbar 0,3 % 0,12 (EEO) 7 %

Gelstrke (1 %) Gelstrke (1,5 %) Geltemperatur (1,5 %) Schmelzpunkt (1,5 %) Sulfat

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Agarose-Gel-Elektrophorese AppliChem 2009

Agarose Low Melt 4 (Artikel-Nr. A2120) Die Agarose Low Melt 4 wird besonders fr die Kapillarelektrophorese und fr analytische DNAGele empfohlen. Sie besitzt eine niedrige DNA-Bindungskapazitt, ist auch bei hohen Gelkonzentrationen (5 %) sehr transparent und kann mit allen Puffersystemen verwendet werden. Die fr eine 'Low Melting Point'-Agarose sehr hohe Gelstrke (500 g/cm2; 3 % Gel) minimiert das Risiko des Zerbrechens des Geles beim Hantieren sehr stark. Diese Agarose wird besonders fr die Auftrennung von DNA-Fragmenten mit weniger als 500 Basenpaaren empfohlen, gerade im Bereich der Gre von Primern. Bei einer Konzentration von 3 % erreicht man eine zur Elektrophorese von DNA-Fragmenten im 8%igen Polyacrylamidgel vergleichbare Auflsung und das bei einfacherer Handhabung und ohne die Giftigkeit des Acrylamids. Achtung: Die Agarose Low Melt 4 besitzt eine sehr hohe Viskositt. Zur Herstellung von Gelen mit einer Konzentration 3 % ist das Erhitzen in einer Mikrowelle ausreichend. Fr die Herstellung von Gelen mit einer Konzentration von 4 %-5 %, aber auch allen anderen Konzentrationen, ist die Erhitzung im kochenden Wasserbad empfehlenswert. Bei Konzentrationen 5 % empfiehlt es sich die Agarose im Autoklaven (121C; 15 Minuten) zu lsen. Die mechanischen Eigenschaften und die Trennfhigkeit werden dadurch nicht verndert. Um eine hchstmgliche Auflsung mit Agarose Low Melt 4-Gelen zu erzielen, muss die Gelierung der Gele bei +4C ber Nacht bzw. bis zu 20 Stunden durchgefhrt werden. Die Verwendung dieser Agarose in Blotting-Experimenten wird nicht empfohlen.
A2120 DNasen/RNasen/Proteasen Asche Elektroendoosmose Feuchtigkeit 500 g/cm2 1000 g/cm2 2431C 75C 0,11 %

nicht nachweisbar 0,3 % 0,12 (EEO) 7 %

Gelstrke (3 %) Gelstrke (5 %) Geltemperatur (3 %) Schmelzpunkt (1,5 %) Sulfat

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Charakteristika
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Charakteristika

Agarose Low Melt Large DNA grade (Artikel-Nr. A3762) Diese Agarose ist eine low melting point-Agarose mit einer sehr hohen Trennkapazit fr groe DNA-Fragmente (1000 bp). Im geschmolzenen Gel knnen enzymatische Manipulationen vor genommen werden (z.B. Verdau, Ligation, PCR. usw.). Eine Extraktion der DNA ist daher nicht notwendig. Agarose Low Melt Large DNA grade ist hervorragend fr den Verdau mit -Agarase geeignet. Groe DNA-Fragmente knnen dadurch besonders schonend isoliert werden. Sie wird im analytischen und prparativen Bereich eingesetzt.
A3762 DNasen/RNasen/Proteasen Asche Elektroendoosmose Feuchtigkeit 250 g/cm2 2428C 65,5C entspricht 0,1 %

nicht nachweisbar 0,4 % 0,12 (EEO) 7 %

Gelstrke (1 %) Geltemperatur (1,5 %) Schmelzpunkt (1,5 %) Verdau durch Agarase Sulfat

Agarose IMG (Artikel-Nr. A2121) Die Agarose IMG verfgt ber einen intermediren Schmelzpunkt (70C; 1,5 % Gel) und Gelpunkt (30C; 1,5 % Gel) und einer niedrigen DNA-Bindungskapazitt. Ihre Anwendung empfiehlt sich besonders fr analytische DNA-Gele mit Fragmentgren 1000 Basenpaaren, wie zum Beispiel PCR-Produkte, kleine DNA-Fragmente nach Restriktionsenzymverdau und DNA-Fragmenten in Mutationsanalysen. Diese Agarose ist auch fr Blotting-Experimente mit DNA-Fragmenten 600 Basenpaare geeignet. Sie ist bei hohen Gelkonzentrationen (3-4,5 %) sehr transparent und kann mit allen Puffersystemen verwendet werden. Die hohe Gelstrke (500 g/cm2; 1,5 % Gel) minimiert das Risiko des Zerbrechens des Geles beim Hantieren sehr stark. Achtung: Zur Herstellung von Gelen mit einer Konzentration 3 % ist das Erhitzen im kochenden Wasserbad oder im Autoklaven (121C; 15 Minuten) empfehlenswert. Die mechanischen Eigenschaften und die Trennfhigkeit werden dadurch nicht gendert. Um eine hchstmgliche Auflsung mit Agarose IMG-Gelen zu erzielen, muss das Gel vor Gebrauch fr 30 Minuten bei +4C gekhlt werden.
A2121 DNasen/RNasen/Proteasen Asche Elektroendoosmose Feuchtigkeit 500 g/cm2 1500 g/cm2 30C 70C 0,11 %

nicht nachweisbar 0,35 % 0,12 (EEO) 7 %

Gelstrke (1,5 %) Gelstrke (3 %) Geltemperatur (1,5 %) Schmelzpunkt (1,5 %) Sulfat

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Agarose SMG (Artikel-Nr. A2122) Die Agarose SMG verfgt ber einen Standardschmelzpunkt (89C; 1,5 % Gel) und Standardgelpunkt (36,5C; 1,5 % Gel). Ihre Anwendung empfiehlt sich besonders fr analytische DNA/RNA-Gele mit Fragmentgren von 100-1000 Basenpaaren (bei einer Gelkonzentration von 2-5 %). Diese Agarose ist auch fr Blotting- Experimente geeignet. Bei einer Gelkonzentration von 4 % knnen DNA-Fragmente von ca. 150-2200 Basenpaare im Southern-Blot transferriert werden. Sie besitzt eine niedrige DNA-Bindungskapazitt und ist auch bei hohen Gelkonzentrationen sehr transparent und kann mit allen Puffersystemen verwendet werden. Die hohe Gelstrke (2000 g/cm2; 1,5 % Gel) gegenber vergleichbaren Agarosen minimiert das Risiko des Zerbrechens des Geles beim Hantieren sehr stark und erlaubt auch die Herstellung von Gelen mit einer Konzentration 1 % bei hervorragender Auflsung.
A2122 DNasen/RNasen/Proteasen Asche Elektroendoosmose Feuchtigkeit 2000 g/cm2 4250 g/cm2 36,5C 89C 0,11 %

nicht nachweisbar 0,35 % 0,12 (EEO) 7 %

Gelstrke (1,5 %) Gelstrke (4 %) Geltemperatur (1,5 %) Schmelzpunkt (1,5 %) Sulfat

Agarose MP (Artikel-Nr. A1091) Die Agarose MP besitzt eine hohe Gelstrke und ist in der Molekularbiologie zur Auftrennung von Proteinen und Nukleinsuren (z.B. in der PFGE) einsetzbar. Sie lsst sich sehr leicht in der Mikrowelle auflsen. Aufgrund ihrer hohen Gelstrke kann sie in sehr niedrigen (bis 0,4 %) oder hohen (ca. 2 %) Konzentrationen in allen Puffersystemen verwendet werden. Bei der Auftrennung hoch-molekularer DNA (bis ca. 50 kb lineare DNA; ca. 0,4 %iges Gel) ist die Agarose dem Acrylamid weit berlegen. Aber selbst im Bereich von nur 100 Basenpaaren erzielt man mit Agarose MP (~2%iges Gel) gute Ergebnisse. Durch entsprechende Wahl der Agarose MP- Konzentration knnen praktisch alle DNA-Fragmentgren auf getrennt werden. Die DNA-Bindungskapazitt ist sehr niedrig. Agarose MP ist fr Blotting-Experimente und prparatives Arbeiten hervorragend geeignet.
A1091 DNasen/RNasen/Proteasen Asche Elektroendoosmose Feuchtigkeit Gelpunkt 1800 g/cm2 3200 g/cm2 5,06,0 88 1,5C 0,12 %

nicht nachweisbar 0,25 % 0,12 (EEO) 7 % 36 1,5C

Gelstrke (1 %) Gelstrke (1,5 %) pH (1 %) Schmelzpunkt Sulfat

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Charakteristika
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Tipps & Tricks


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1.9 Anwendungstipps 1.9.1 Zur Herstellung eines Geles wird die Agarose meist im Laufpuffer erhitzt und zum Schmelzen gebracht. Dafr bedient man sich eines Wasserbades oder heute hufiger der Mikrowelle. Da der Aufwrmvorgang in der Mikrowelle sehr schnell geht, muss man stndig dabeibleiben, um ein berkochen zu verhindern. Achtung: Siedeverzge. Wenn man die sich lsende, heie Mischung leicht schwenkt, kocht sie hufig stark auf! Immer geeignete Hitze-resistente Handschuhe tragen. 1.9.2 Gel vor dem Gieen auf ca. 50C-55C abkhlen lassen, am einfachsten unter flieendem Leitungswasser. Erst dann EtBr zugeben. 1.9.3 Gellufe ber Nacht brauchen hohe Pufferkapazitt, daher 1X TBE. Gellufe bei hohen Volt-Zahlen (>60 V) ebenso. Pufferzirkulation ist ebenfalls eine Lsung, um die Pufferkapazitt aufrechtzuerhalten. 1.9.4 Hhere Volt-Zahlen reduzieren die Auflsung. 1.9.5 Dnnere Kmme erhhen die Auflsung, ebenso kleinere Volumina beim Beladen des Gels. Groe DNA-Mengen fhren zum Schmieren (= berladen). 1.9.6 Ethidiumbromid, anwesend whrend des Gellaufes, kann zu verndertem Laufverhalten der DNA fhren. Wenn dies als Problem bei der aktuellen Anwendung betrachtet wird, empfiehlt sich die Frbung nach dem Gellauf in 0,5-1 g/ml Ethidiumbromid. 1.9.7 Ethidiumbromid-Frbung (0,5-1 g/ml) nach dem Gellauf liefert einen besseren Kontrast, wenn das Gel in Wasser fr ca. 30 Minuten auch wieder entfrbt wird. Eine Verringerung der Ethidiumbromid-Konzentration hat u.U. einen vergleichbaren Effekt. 1.9.8 Gellufe bei zu hohen Temperaturen knnen DNA zum Schmelzen bringen. 1.9.9 Wenn zu wenig Laufpuffer in die Gelkammer gefllt wird, kann das Gel whrend des Laufes austrocknen. Der Puffer soll wenigstens 1 mm ber dem Gel stehen. 1.9.10 Wenn ganze Plasmide geladen werden, sind in der Regel mehrere Banden zu beobachten: supercoiled Plasmide sind am kleinsten gepackt und wandern am schnellsten, aufgewundene Plasmide (relaxed oder nicked) wandern langsamer als supercoiled. U.U. bilden sich Katenane (Plasmide sind wie Kettenglieder zusammenhngend und knnen ein leiterfrmiges Bild auf dem Gel ergeben, hnlich eines Grenstandards). Linearisierte Plasmid-DNA (open chain DNA) wandert etwas langsamer als die supercoiled Form des selben Plasmids. 1.9.11 Hohe Salzkonzentrationen in der Puffer-/DNA-Lsung verlangsamen die Wanderung. 1.9.12 Wenn die Geltaschen nach der EtBr-Frbung wie ein Weihnachtsbaum leuchten, ist das in der Regel chromosomale, bakterielle DNA, die zu gro war, um in das Gel zu wandern oder dort ausgefallen ist. 1.9.13 Der mit EtBr anfrbbare Schmier, der weit vor der bakteriellen DNA im Gel luft, ist RNA. Diese kann durch RNase-Behandlung in der Probe entfernt werden.

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1.9.15 Einige DNA-Gel-Extraktionsmethoden funktionieren nicht mit TBE. In diesen Fllen TAELaufpuffer verwenden. 1.9.16 Es empfiehlt sich den Erlenmeyer-Kolben mit der Agarose und dem Puffer zu wiegen, bevor die Agarose-Lsung in der Mikrowelle erhitzt wird. Je lnger erhitzt wird, desto mehr Flssigkeit geht verloren. Diese (= Wasser) kann auf der Waage einfach nachgefllt werden. 1.9.17 Luftblasen, die sich in der Agarose beim Gieen bilden, knnen mit einer Pipettenspitze zerstrt werden oder, falls das nicht geht, an den Rand manvriert werden, wo sie u.U. weniger oder gar nicht stren. 1.9.18 Bromphenolblau luft ungefhr bei 300 bp und Xylencyanol bei ca. 4 kb DNA. Es sollte bedacht werden, dass DNA-Fragmente durch die Farbstoffe quasi verdeckt und dadurch un sichtbar werden. Abhilfe verschaffen Ladepuffer, die nur die eine, nicht strende tracking dye enthalten. Beide Farbstoffe wandern (bei pH ca. 8) wie die DNA zur Anode. 1.9.19 Wenn beim Anschalten des Power Supply's keine Luftblasen an den Elektroden aufsteigen, wurde mglicherweise Wasser statt Laufpuffer eingefllt! Es findet dann auch keine Wanderung/ Auftrennung der Molekle statt. Wird versehentlich unverdnnter (konzentrierter) Puffer verwendet, heizt sich das Gel stark auf und kann schmelzen. 1.9.20 Lineare DNA wandert ungefhr invers proportional zum log10 ihres Molekulargewichtes. 1.9.21 Besonders bei der Handhabung von prparativen Gelen gilt: die UV-Licht-Exposition auf dem Leuchttisch mglichst kurz halten, da UV-Licht die Bildung von Pyrimidin-Dimeren begnstigt, die in der Folge zu Mutationen oder Strangbrchen fhren knnen. 1.9.22 Hohe Salzkonzentrationen in der Probe verschlechtern die Auflsung im Agarose-Gel: Viele DNA-Manipulationen werden unter Hochsalzbedingungen durchgefhrt. Ein direkter Auftrag des Probenansatzes fhrt dann im Agarose-Gel zu einer schlechten Auftrennung. Hierfr gibt es eine einfache Abhilfe: Ha et al. haben zum einen die Proben nach dem Auftragen auf das Gel 30 Minuten in den Geltaschen ruhen lassen, bevor der Gellauf gestartet wurde. In dieser Zeit diffundieren die Salze in den umgebenden TBE-Puffer. Ausserdem wurde die TBE-Konzentration von den blichen 0,5X oder 1X auf 2X erhht.
Ha, W.-Y. et al. (1999) BioTechniques 26, 425-426

1.9.23 Langzeit-Lagerung von DNA in Agarose-Gelen: Nach dem Gel-Lauf und der EthidiumbromidFrbung wird das Gel/Gelstck einfach in 70 % Ethanol gelegt und kann bei Raumtemperatur gelagert werden. Das Gel muss vor dem nchsten Betrachten neu gefrbt werden, da EtBr in den Ethanol diffundiert. Die DNA-Banden bleiben unverndert im Gel erhalten, wahrscheinlich einfach durch eine Ethanol-Fllung.
Jacobs, D. & Neilan, B. A. (1995) BioTechniques 19, 892-894

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Tipps & Tricks


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1.9.14 Hochprozentige Agarose-Gele (>3 %), hergestellt aus Standard-Agarosen, verlieren an Flexibilitt und sind mitunter brchig.

Puffer-Systeme

Puffer-Systeme

Neben dem Agarose-Typ ermglicht die Pufferwahl weitere Variationsmglichkeiten und Optimierungen von Anwendungen. Die sicher bekanntesten Agarose-Gel-Elektrophorese-Puffer sind TAE- und TBE-Puffer, die die meisten Anwendungen abdecken. Es stehen auerdem spezielle Puffer zur Verfgung. Dieser Abschnitt liefert Puffer-Rezepturen und einige Erluterungen dazu. Bei der Information Laufbedingung in V/cm bezieht sich die Angabe cm auf den Abstand zwischen den Elektroden.

2.1 TAE-Puffer TAE-Puffer ist heute DER Elektrophorese-Puffer fr Agarose-Gele. Ursprnglich wurde er jedoch fr die Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese mit geringfgig anderer Zusammensetzung entwickelt (40 mM Tris; 20 mM NaOAc; 2 mM EDTA Na2; pH 7,8 bei 5C mit Essigsure; Ref. 1). Natriumacetat

wurde zur Stabilisierung der Sekundrstruktur der RNA eingesetzt. Da bei der Einstellung des pHWertes mit Salzsure whrend der Elektrophorese durch Elektrolyse Hypochlorit entstehen kann, wurde als Anion Acetat gewhlt (1). Die Zugabe von EDTA zu den Elektrophorese-Puffern minimiert eine Aggregation von Nukleinsuren durch Magnesium-Ionen. Heute verwendet man den Puffer in leicht modifizierter Form (40 mM Tris-Acetat; 1 mM EDTA Na2 (~pH 8,5)). TAE hat eine niedrigere Pufferkapazitt als TBE und TPE, allerdings wandert doppelstrngige, lineare DNA 10 % schneller bei gleicher Auflsung durch TAE als durch TBE oder TPE. Supercoiled DNA wird in TAE besser aufgetrennt als in TBE. Fr lange Gellufe sollte daher der Puffer rezirkuliert werden. TAE hat gegenber TBE einen weiteren Vorteil. Er interagiert nicht mit der Agarose und in der prparativen Nukleinsure Agarose-Gel-Elektrophorese ist dadurch die Ausbeute an Nukleinsuren hoch (2). Normalerweise verwendet man den Puffer in der Arbeitskonzentration 1X (seltener 0,5X). TAE wird bei Raumtemperatur gelagert.

Laufbedingung: 1-10 V/cm (Laufbedingung Minigel: 5-20 V/cm) 50X TAE-Elektrophorese-Puffer (nach Ref. 3) 2 M Tris (242 g/L) 1 M Essigsure (57,1 ml/L Eisessig) 0,05 M EDTA-Na2 (100 ml von 0,5 M EDTA pH 8) Der finale pH-Wert des 1X Puffers liegt bei ca. 8,5.

(nach Ref. 4) 2 M Tris (242 g/L) 1 M Essigsure (57,1 ml/L Eisessig) 0,1 M EDTA-Na2 2H2O (37,2 g/L)

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Abb. 2.1: Struktur und Reaktionsschema von Tris (Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan) [1]  Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) (1995) Current Protocols in Molecular Biology. Suppl. 40 Seite A.2.5. Greene Publishing & Wiley-Interscience, New York. [2]  Loening, U.E. (1967) Biochem. J. 102, 251-257 The fractionation of high-molecular-weight Ribonucleic acid by polyacrylamide-gel electrophoresis. [3]  Ogden, R.C. & Adams, D.A. (1987) Methods Enzymol. 152, 61-87 Electrophoresis in agarose and acrylamide gels. [4]  Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Seiten 5.8 und A1.17. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

2.2 TBE-Puffer TBE-Puffer wird als Elektrophorese-Puffer fr Polyacrylamid-Gele und Agarose-Gele verwendet. TBE hat eine hhere Pufferkapazitt als TAE, allerdings wandert doppelstrngige, lineare DNA bei gleicher Auflsung 10 % schneller durch TAE als durch TBE. Supercoiled DNA wird besser in TAE als in TBE aufgetrennt. Normalerweise verwendet man den Puffer in der Arbeitskonzentration 1X fr Polyacrylamid-Gele und 0,5X fr Agarose-Gele. Fr band shifts (gel mobility shift assay) wird

Abb. 2.2: Struktur und Reaktionsschema von Borsure

ebenfalls 0,5X TBE eingesetzt. Fr die prparative Agarose-Gel-Elektrophorese mit anschlieender Isolierung von Nukleinsuren ist grundstzlich von der Verwendung von TBE-Puffer abzuraten, da dieser Puffer mit der Agarose inter agieren kann und die Ausbeute an Nukleinsuren dadurch sehr schlecht ist (2). Die Zugabe von EDTA zu den Elektrophorese-Puffern minimiert eine Aggregation von Nukleinsuren durch Magnesium-Ionen und andere schwerere Metallionen. TBE wird meistens als 10X oder 5X Konzentrat hergestellt und bei Raumtemperatur gelagert. Bei langer Lagerung bildet sich besonders im 10X Konzentrat, strker als im 5X Konzentrat, meist ein Przipitat. Filtration mit einem 0,22 m Filter verzgert die Przipitat-Bildung.

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Laufbedingung: 1-10 V/cm (Laufbedingung Minigel: 5-20 V/cm) 10X TBE-Elektrophorese-Puffer (nach Ref. 3,4) 0,89 M Tris (108 g/L) 0,89 M Borsure (55,3 g/L) 0,02 M EDTA-Na2 (40 ml von 0,5 M EDTA pH 8) Der finale pH-Wert des 10X Puffers liegt bei ca. 8,3. [1]  Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 40, Seite A.2.5. Greene Publishing & Wiley-Interscience, New York.

[2] Ogden, R.C. & Adams, D.A. (1987) Methods Enzymol. 152, 61-87. Electrophoresis in agarose and acrylamide gels. [3]  Peacock, A.C. & Dingman, C.W. (1968) Biochemistry 7, 668-674. Molecular weight estimation and separation of ribonucleic acid by electrophoresis in Agarose-Acrylamide composite gels. [4]  Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Seiten 5.8 und A.1.17. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

2.3 MOPS-Elektrophorese-Puffer (10X) Der Laufpuffer (1X) wird in denaturierenden Formaldehyd-enthaltenden Agarose-Gelen und in Gelen Glyoxal/DMSO-behandelter RNA eingesetzt. Allerdings hat er eine relativ niedrige Pufferkapazitt und wird inzwischen hufig durch den neueren BPTE-Puffer abgelst. Dieser Typ von RNA-Gel hat relativ lange Laufzeiten (4-5 h). Whrend des Gellaufes baut sich ein pH-Gradient auf. Im pH-Bereich >8,0 wrde Glyoxal von der RNA dissoziieren. Daher sollte whrend des Gellaufes der MOPS-Laufpuffer zirkulieren oder alle 30 Minuten im Puffertank durchmischt werden (1, 2).

Abb. 2.3: Struktur und Reaktionsschema von MOPS (3-Morpholinopropansulfonsure) Laufbedingung: 4-5 V/cm 10X MOPS-Elektrophorese-Puffer (nach Ref. 1) 0,2 M MOPS (pH 7,0) 20 mM Natriumacetat 10 mM EDTA (pH 8,0)

(nach Ref. 2) 0,4 M MOPS (pH 7,0) 100 mM Natriumacetat 10 mM EDTA (pH 8,0) (Lagerung 3 Monate bei +4C)

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MOPS-Lsungen werden beim Autoklavieren oder bei Lagerung unter Lichteinfluss leicht gelblich, ohne jedoch an Qualitt zu verlieren. Erst wenn sich die Lsungen dunkel verfrben, sollten sie nicht mehr verwendet werden.
1]  Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 67, Seite 4.9.15. Greene Publishing & Wiley-Interscience, New York. [2]  Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Seite 7.32. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

2.4 BPTE-Elektrophorese-Puffer (10X) Der BPTE-Laufpuffer wird fr die Trennung von RNA im Agarose-Gel eingesetzt. Die Mischung zweier Puffersubstanzen mit hnlichem pKa-Wert fhrt zu einem stabileren Laufpuffer, der nicht mehr rezirkuliert werden muss. Er soll damit das relativ giftige Formaldehyd-System ablsen.
Laufbedingung: 5 V/cm 10X BPTE-Elektrophorese-Puffer (nach Ref. 1, 2) 100 mM PIPES 300 mM Bis-Tris 10 mM EDTA (pH 8,0)

Der finale pH-Wert des 10X Puffers liegt bei ca. 6,5. Nach der DEPC-Behandlung autoklavieren.
[1]  Burnett, W.V. (1997) BioTechniques 22, 668-671. Northern Blotting of RNA Denatured in Glyoxal Without Buffer Recirculation. [2]  Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Seite 7.28. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

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2.5 Alkalischer Agarose-Gel-Elektrophorese-Puffer (10X) Dieses Puffersystem ist eigentlich veraltet. Dennoch gibt es Anwendungen, bei denen dieser einfache Puffer gute Ergebnisse liefert. Er zhlt zu den denaturierenden Systemen, da die WasserstoffbrckenBildung in der doppelstrngigen DNA unterbunden wird. Anwendung findet er heute noch bei der Lngenbestimmung der DNA in DNA-RNA-Hybriden und der von first und second strand cDNAs (1). Aufgrund des hohen pH-Wertes ist Bromphenolblau als tracking dye ungeeignet. Stattdessen wird Bromkresolgrn eingesetzt. Alkalische Agarose-Gele heizen sich strker auf und werden daher bei niedrigerer Stromstrke laufen gelassen. Es kann eine teil weise basische Hydrolyse der Agarose auftreten, die die DNA im Gel ungleichmig laufen lsst. Um dies zu verhindern, sollte das Gel vor dem Start auf Raumtemperatur abgekhlt sein.
Laufbedingung: < 3,5 V/cm 10X Alkalischer Agarose-Gel-Elektrophorese-Puffer (nach Ref. 1) 500 mM NaOH (50 ml/L 10 N NaOH) 10 mM EDTA (20 ml/L 0,5 M EDTA pH 8,0)

Der 10X Puffer wird direkt vor Gebrauch mit Wasser auf 1X verdnnt.
[1]  Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Seiten 5.36 und A1.17. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

2.6 TAFE-Elektrophorese-Puffer TAFE steht fr 'transverse alternating field electrophoresis'. Wie bei der 'Pulsed-field Gel Electrophoresis' (PFGE) wird das elektrische Feld umgeschaltet und die DNA wandert im wechselnden elektrischen Feld quasi hin und her. Entscheidend ist dafr die Puls-Lnge. Je lnger der Puls anhlt, desto grere Fragmente knnen getrennt werden. Alternativen zum 1X TAFE-Puffer sind der GTBE-Puffer, TBE mit Zusatz von Glycin, oder einfach 0,5X TBE.

Abb. 2.4: Struktur und Reaktionsschema von Glycin

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Der pH-Wert der Tris-Lsung wird mit Essigsure auf 8,2 eingestellt.
GTBE-Gel-Elektrophorese-Puffer (nach Ref. 2) 50 ml 10X TBE-Puffer (Endkonz. 0,5X) 50 ml 2 M Glycin (Endkonz. 0,1 M) 900 ml Wasser

Der Puffer wird bei Raumtemperatur gelagert.


[1]  Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 51 Seite 2.5B.1. Greene Publishing & Wiley-Interscience, New York. [2]  Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Seiten 5.74 und A1.18. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

2.7 TPE-Elektrophorese-Puffer TPE-Puffer hat hnliche Eigenschaften wie TBE-Puffer und damit eine wesentlich hhere Pufferkapazitt als TAE. Allerdings wandert doppelstrngige, lineare DNA 10 % langsamer bei gleicher Auflsung durch TPE als durch TAE. Die Trennkapazitt ist fr kleine DNA-Molekle besser in TPE und TBE als in TAE, fr groe Fragmente ist es genau umgekehrt (1). Der Puffer wird als 1X (1) oder 0,5X (2) Lsung eingesetzt.
10X TPE-Gel-Elektrophorese-Puffer (nach Ref. 1) 900 mM Tris 900 mM Phosphat 20 mM EDTA

108 g Tris 15,5 ml Phosphorsure 85 % (1,679 g/ml) 40 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0)

[1]  Li, T.-K. et al. (2003) Cancer Res. 63, 8400-8407. Characterization of ARC-111 as a Novel Topoisomerase I-Targeting Anticancer Drug. [2]  Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Seiten 5.8 und A1.17. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

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TAFE-Gel-Elektrophorese-Puffer (nach Ref. 1) 20 mM Tris-acetat (pH 8,2) 0,5 mM EDTA (die freie Sure verwenden!)

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2.8 TTE-Elektrophorese-Puffer

Tris-Taurin-EDTA-Puffer ist eine Alternative zu TBE, wenn Borsure zum Problem wird. Taurin hat einen hnlichen pKa-Wert wie Borsure. Warum Borsure austauschen? Borsure kann mit Glycerin negativ-geladene Ester bilden, die in der Elektrophorese zur Anode wandern. Glycerin wird den meisten Enzymprparationen in relativ hoher Konzentration (bis 50 %) zugesetzt, um ein Einfrieren whrend der Lagerung zu vermeiden. Auerdem enthalten verschiedene Ladepuffer Glycerin, um die Dichte der zu ladenden Lsung zu erhhen. Allerdings drfte dieses Problem primr bei empfindlichen Sequenziergelen eine Rolle spielen, wenn die Glycerin-Konzentration 8 % in der Probe berschreitet (1).
20X TTE-Gel-Elektrophorese-Puffer 1,78 M Tris 570 mM Taurin 10 mM EDTA

216 g/L Tris 72 g/L Taurin 2 g/L EDTA-Na2

[1]  Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Seiten 12.108 und 13.90. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

2.9 Low-Molarity Conductive Media Das Problem vieler Elektrophorese-Puffer ist die relativ hohe Ionenkonzentration, die whrend des Gel-Laufes zur starken Aufheizung und zum Schmelzen des Agarose-Gels fhren kann. Zustzlich sind die Laufzeiten ziemlich lang. In einem Versuch diese beiden Probleme, Temperatur und Laufzeit, zu verbessern, wurde im Laufpuffer fr DNA-Agarose-Gele die Puffersubstanz Tris einfach durch Natrium ersetzt und EDTA weggelassen. Fr RNA-Gele wurde der MOPS-Puffer und EDTA durch Li-Ionen ersetzt. Im Ergebnis konnte eine Auftrennung von nur 1 bp bei 35 bp bzw. 36 bp Oligos erzielt werden.
Laufbedingung: 29 V/cm (DNA) Laufbedingung: 40 V/cm (RNA) 1X DNA Puffer (nach Ref. 1) 1 mM Lithium-Borsure oder 10 mM Natrium-Borsure (fr DNA 100 bp-5 kb) oder 5 mM Lithiumacetat (fr DNA >3,0 kb) 0,5X RNA Puffer (nach Ref. 1) 5 mM Natrium-Borsure (pH 6,0) oder Lithiumacetat [1]  Brody, J.R. et al. (2004) BioTechniques 37, 598-602. Ultra-fast high-resolution agarose electrophoresis of DNA and RNA using low-molarity conductive media.

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Trennkapazitt

Alle AppliChem-Agarosen zeigen aufgrund der hohen chemischen Reinheit sehr gute Auflsungs vermgen und Trennkapazitten in der Gel-Elektrophorese. Als Faustregel gilt: bei geeigneter Agarosekonzentration und Pufferbedingungen sind 4 % Fragmentlngen-Unterschiede zu identifizieren. Die folgende Tabelle gibt Aufschluss ber geeignete Gelkonzentrationen. Beispiel: 1,5 % Agarose Standard (A2144) in TBE-Puffer wird zur Trennung von dsDNA mit Fragmentlngen von etwa 1000 bp verwendet. Dann sind noch Unterschiede von 40 bp leicht zu identifizieren.
1X TAE-Puffer Agarose-Konzentration [%] Trennbereich (bp) Agarose Low EEO (Agarose Standard) A2114 20000 1000 0,6 12000 500 0,8 8000 300 1,0 6000 200 1,2 3500 100 1,5 2000 50 2,0 Agarose MP A1091 40000 3000 0,3 22000 2000 0,5 15000 1000 0,8 10000 400 1,0 5000 200 1,8 Agarose Low Melt 4 A2120 500 80 3,0 300 30 4,0 200 10 5,0 Agarose SMG A2122 2500 700 2,0 1200 500 3,0 700 100 4,0 250 30 5,0 Agarose IMG A2121 1500 100 2,0 1000 50 3,0 500 20 4,0 300 10 5,0 Agarose Low Melt Large DNA grade A3762 20000 500 0,75 16000 300 1,00 10000 250 1,25 5000 200 1,50 2500 100 1,75 1500 50 2,00 1X TBE-Puffer Trennbereich (bp) 15000 1000 10000 500 7000 250 5000 200 3000 100 2000 50

20000 2000 12000 1500 9000 1000 6000 500 3000 200 300 50 100 10 < 100 1500 500 800 100 500 50 250 20 1200 100 700 40 200 20 < 100 12000 500 8000 300 4000 200 3000 150 2000 100 1000 50

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Trennkapazitt
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F a r b s t o f f e
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4
Art.-Nr. A1398 A1001 A1151 A0691 A2388 A5595 A1402 A1403 A0581 A3918 A2261 A1406 A3944 A1400

Farbstoffe

4.1 Nukleinsure-Farbstoffe-bersicht
Bezeichnung Acridinorange DAPI Ethidiumbromid Kristallviolett Malachitgrnoxalat DNA-Dye Methylenblau Methylenblau Methylgrn Methylorange Nilblau Propidiumiodid Pyronin Y Silbernitrat Stains all DNA/RNA-Farbkomplex dsDNA/RNA grne Fluoreszenz; ssDNA/RNA rote Fluoreszenz spez. Bindung an AT-Basenpaare; Interkalation in GC-Basenpaare; weilich-blaue Fluoreszenz Interkalation DNA (purpurrot) DNA DNA RNA-Frbung im sauren pH-Bereich spez. Bindung an AT-reiche Sequenzen; DNA (grn) DNA-Interkalator (blau) DNA-Interkalator; keine Aufnahme in lebende Zellen DNA/RNA (rot) DNA (braun) RNA (blau-violett) DNA (blau)

Es sind verschiedene ready-to-use-Lsungen erhltlich! A1152 Ethidiumbromid-Lsung 1 % BioChemica A2273 Ethidiumbromid-Lsung 0,07 % dropper-bottle Acridinorange wird hauptschlich fr die Frbung von ssDNA und RNA eingesetzt.  Wird hufiger in der histochemischen DNA-Frbung eingesetzt. Auch Enzymnachweise im Gel (z.B. DNase im Polyacrylamid-Gel) findet man in der Literatur. eingesetzt hauptschlich als tracking dye und als counter-dye.  eingesetzt hauptschlich fr den Nachweis von anorganischem Phosphat (= Nachweis einer ATPase-Aktivitt)

Hinweis Nicht alle Nukleinsure-Farbstoffe werden auch in der Agarose-Gel-Elektrophorese eingesetzt. Sensitivitten (Nachweisgrenzen) beziehen sich daher nicht immer auf Frbungen in AgaroseGelen. Abkrzungen DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol-Dihydrochlorid) NaOAc (Natriumacetat) PBS (Phosphate-buffered saline) TX DNA (Triple Helix DNA)

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Anregung/Emission 490 nm / 525 nm 365 nm / 450 nm 260-360 oder 546 nm / 590 nm 590 nm 626 nm 297 nm / 672 nm 638 nm 630 nm / 673 nm 530 nm / 625 nm 488-530 nm / 565-574 nm

Sensitivitt 50 ng 70 ng 0,5 ng 10 ng

empfohlene Konzentration 30 g/ml 0,1 g/ml in PBS oder andere wssrige Lsung 0,20,5 g/ml 1 g/ml

Stammlsung 10 mM Salzlsung oder 1 mg/ml in dest. Wasser (6 Monate bei 28C)

10 mg/ml in Wasser; 2-8C

RNA (lmax. 600 nm) DNA (lmax. 620 nm)

0,0025 % in 0,1x TAE-Puffer 0,2 % in 0,4 M NaOAc/0,4 M Essigsure 1 g/ml 10 ng 0,0005 % Agarose 40 ng; getr. 1 g/ml Gele 4 ng n.a. 1 g/ml 0,05 % oder 1 g/ml Agarose 2,5 ng ds DNA dsDNA (510 ng) 0,005 % TX DNA 3 ng

40 ng 4080 ng

z.B. 200X

0,25 % in Wasser 1 g/ml in 0,25X TAE-Puffer pH 8,0 28C oder RT

0,1 % in Formamid; 5,6 mg/10 ml in 50 % Dioxan; frisch ansetzen

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4.2 Protein-Farbstoffebersicht

Art.-Nr. Bezeichnung A2176 Bismarckbraun R

Bemerkung zur Erhhung der Sensitivitt von CBB R-250-Frbung

Absorptionsmaxima lmax. 468 nm

A3480 A1092 A0822 A1346 A1401 A2385 A2388

Coomassie Brillant Blau frbt auch Ampholyte im IEF-Gel! G-250 Coomassie Brillant Blau frbt auch Ampholyte im IEF-Gel! R-250 Eosin Y reversible Frbung Eriochromschwarz T Fast Green FCF Kongorot Malachitgrnoxalat

lmax. mit Protein 549 nm, ohne Protein 555 nm

560 nm Farbkomplex im sauren pH-Bereich lmax. (pH 8,3) 615; (MeOH) 620 nm lmax. (mit Protein) 635 nm Frbung im sauren pH-Bereich Phosphatase-Nachweis im Gel

A1405 A7808 A3930 A3972 A1400

Nilrot Ponceau S Proteo-Dye RuBPS Rhodamin B Silbernitrat Stains all Zink-Imidazol

saurer Diazofarbstoff

lmax. (H2O) 517823 nm lmax. 617 nm 560 nm

braun frbt verschiedene Proteintypen in unterschiedlichen Farben reverse Frbung

lmax. fr BSA 515 nm

nur in Verbindung mit Coomassie!  Nachweis auch von Phosphoproteinen: Bildung eines unlslichen Phosphat-Komplexes (Sensitivitt: 0,1 nM)  Allen, R.E. et al. (1980) Anal. Biochem. 104, 494-498. Staining Protein in Isoelectric Focusing Gels with Fast Green.  frbt zum Beispiel Sialoglycoproteine und Phosphoproteine blau, fast alle anderen Proteine rot. Abkrzungen BSA (Bovine Serum Albumin) CBB (Coomassie Brillantblau) MeOH (Methanol) RuBPS (Ruthenium(II)tris(bathophenanthrolindisulfonat)) TCA (Trichloressigsure)

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Agarose-Gel-Elektrophorese AppliChem 2009

Sensitivitt 25 ng

< 0,5 ng 10 ng hnlich CBB R-250 10 ng 400 ng weniger sensitiv als CBB

empfohlene Konzentration Stammlsung Coomassie Brillant Blau R-250 (0,2 % w/v) Lsungsmittel MeOH : Esigsure : Wasser (40:7:53) Bismarckbraun R (0,05 % w/v) Farbstoffe in getrennten Lsungen, dann 1:0,75 gemischt (v/v) 80 ml der Stammlsung werden erst vor 0,1 % w/v CBB in 2 % w/v Phosphorsure, 10 % w/v Gebrauch mit 20 ml MeOH gemischt. Ammoniumsulfat (nicht filtrieren!) 0,1 % in 20 % MeOH, 10 % Essigsure 0,25 % (w/v) in 0,1 N NaOH 0,01 % 0,25 % (w/v) in 10 % Essigsure bis 1 % (w/v) in 7 % Essigsure 0,1 % (w/v) in 0,2 M Acetat-Puffer (pH 3,5) Frbelsung = 3 Vol. Lsg.1 + 1 Vol. Lsg. 2 (3 Wochen stabil; jeweils vor Gebrauch filtrieren) Frbelsung tglich frisch ansetzen; kann fr mehrere Gele verwendet werden 0,02 % in 40 % MeOH / 7 % Essigsure; in Kombination mit Rhodamin B

1 % (w/v) in dest. Wasser Lsung 1: 0,15 g Malachitgrnoxalat in 300 ml Wasser; Lsung 2: 4,2 g Ammoniummolybdat-Tetrahydrat in 100 ml 5 N HCl vor Gebrauch frisch ansetzen 1 mM 0,02 % in 40 % MeOH / 7 % Essigsure; in Kombination mit Eriochromschwarz T 0,1 % in Formamid oder 5,6 mg/10 ml in 50 % Dioxan; frisch ansetzen

5 ng 500 ng 25 ng 10 ng 25 ng wie CBB 1020 ng SDS-PAGE 4080 ng native PAGE

0,10,5 % in 3 % TCA oder 1 ml Eisessig ad 100 ml Wasser 1 M 0,01 %

0,005 %

2009 AppliChem Agarose-Gel-Elektrophorese

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Glossar

Gelstrke (engl. Gel strength): mechanische Stabilitt eines ausgehrteten Gels unter definierten Bedingungen. Die maximale Belastbarkeit pro Flche wird ausgedrckt in g/cm. Die Gelstrken fr Agarosen liegen typischerweise zwischen 250 g/cm (wenig stabil) bis 3200 g/cm (sehr stabil und reifest). Agarose-Qualitten mit hohem Schmelzpunkt sind in der Regel stabiler als solche mit niedrigem Schmelzpunkt. Geltemperatur (engl. Gelling temperature): aufgeschmolzene Agarose verfestigt sich zur Gelmatrix nahe der Geltemperatur. Anmerkung: einzelne, hochauflsende Agarose-Qualitten zeigen ihr optimales Auflsungsvermgen erst nachdem das Gel lngere Zeit bei 4C gekhlt wurde. Hysterese, hier: unterschiedliche Temperaturen bei denen Agarose flssig oder fest wird abhngig vom Zustand aus dem das Gel kommt. Beispielsweise schmilzt Standard-Agarose bei 88C, im Temperaturbereich zwischen 3688C bleibt sie flssig und wird erst in der Nhe der Geliertemperatur von ca. 36C wieder fest. Ein ausgehrtetes Gel bleibt dagegen bis zum erneuten Aufschmelzen fest. So kann also Agarose bei z.B. 45C abhngig von der Vorbehandlung flssig oder fest sein. Schmelzpunkt (engl. Melting point): Man unterscheidet Agarose-Typen mit niedrigem oder normalem Schmelzpunkt. Standard-Agarose hat einen normalen Schmelzpunkt von ca. 88C. Agarosen mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP, low melting point) weisen typischerweise einen Schmelzpunkt bei <65C auf. Intermedire Schmelzpunkte knnen durch Mischen beider Qualitten erreicht werden. Prparative Gele werden hufig mit LMP-Agarosen durchgefhrt, um eingeschlossene Molekle bei geringeren Temperaturen mglichst schonend aus der Matrix zu trennen ohne gleichzeitig die DNA aufzuschmelzen. Elektroendoosmose (EEO): ein Grenzflchenphnomen, welches die Bewegung einer Flssigkeit relativ zu einer geladenen Oberflche in einem elektrischen Feld beschreibt. Die EEO spielt nur bei sehr dnnen Flssigkeitsschichten oder sehr kleinen Kapillaren wie den Poren eines Agarosegels eine Rolle. In der Praxis sind Agarosen mit geringen Werten (EEO <0,12) fr die Trennung von Nukleinsuren gefragt.

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Agarose-Gel-Elektrophorese AppliChem 2009

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