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LODISH et al.

MOLEKULARE ZELLBIOLOGIE

4. Auflage

LÖSUNGEN DER ÜBUNGSAUFGABEN

Brian Storrie, Muriel Lederman, Eric A. Wong, Richard A. Walker und

Glenda Gillaspy

Virginia Polytechnic Institute and State University

2001 Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg · Berlin

Lodish et al.: Molekulare Zellbiologie, 4. Aufl. - Lösungen

Inhaltsverzeichnis

Teil I: Grundlagen

2. Chemische Grundlagen

3

3. Struktur und Funktion von Proteinen

5

4. Nucleinsäuren, der genetische Code und die Synthese von Makromolekülen

8

5. Biologische Membranen und die innere Struktur eukaryotischer Zellen

10

6. Zellen und Viren in Kultur

12

7. Rekombinierte DNA und Genomik

13

8. Genetische Analyse in der Zellbiologie

15

Teil II: Regulation der Zellaktivitäten durch den Zellkern

9.

Die molekulare Struktur von Genen und Chromosomen

17

10.

Regulation der Initiation der Transkription

20

11.

RNA-Prozessierung, zellkernspezifischer Transport und posttranskriptionale

23

Regulation

12. Replikation, Reparatur und Rekombination von DNA

25

13. Regulation des eukaryotischen Zellzyklus

28

14. Genregulation bei Entwicklungsvorgängen

30

Teil III: Aufbau und Energieversorgung der Zelle

15. Transport durch Zellmembranen

32

16. Der Energiehaushalt der Zelle: Glykolyse, aerobe Oxidation und Photosynthese

34

17. Proteinsortierung bei der Biogenese von Organellen und bei der Proteinsekretion

36

18. Zellbewegung und Zellgestalt I: Mikrofilamente

38

19. Zellbewegung und Zellgestalt II: Mikrotubuli und Intermediärfilamente

40

Teil IV: Wechselwirkung zwischen Zellen

20. Signalübertragung zwischen Zellen: Hormone und Rezeptoren

42

21. Nervenzellen

44

22. Integration von Zellen in Geweben

46

23. Zell-Zell-Wechselwirkungen bei Entwicklungsvorgängen

48

 

24. Krebs

50

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Chemische Grundlagen

Verständnisfragen

1. Die Umwandlung von ADP zu ATP besitzt eine freie Standardenergie von 7,3 kcal. Unter aeroben Bedingungen entstehen 36 Mol ATP pro Mol Glucose (263 kcal/7,3 kcal pro Mol ATP). Unter anaeroben Bedingungen werden 2 Mol ATP pro Mol Glucose gebildet (14,6 kcal/7,3 kcal pro Mol ATP). Die Gesamtener-gieausbeute bei der Oxidation von Glucose beträgt 686 kcal. Der Metabolismus von Glucose zu Milchsäure ergibt nur 2,1 Prozent dieses Betrags (14,6 kcal/686 kcal x 100).

2. Beim sauren pH-Wert eines Lysosoms wird Ammoniak in das Ammoniumion umgewandelt. Das Ammoniumion kann aufgrund seiner positiven Ladung die Membran nicht durchqueren und verbleibt dadurch im Lysosom. Die Akkumu-lation von Ammoniumionen verringert die Protonenkonzentration innerhalb der Lysosomen und erhöht so den lysosomalen pH-Wert. Bei neutralem pH zeigt Ammoniak nur eine geringe Neigung, zum Ammoniumion protoniert zu werden, beeinflusst also nicht den pH-Wert im Cytosol.

3. Die Einführung einer Doppelbindung (Desaturierung) verursacht einen Knick in der Fettsäurekette. Dadurch kann die ungesättigte Kette mit anderen Fett-säureketten nicht so gut eine starre, dicht gepackte Struktur bilden Wenn die Temperatur absinkt, erhält E. coli einen relativ ungeordneten, flüssigen Zustand der Membranen aufrecht, indem die Zelle das Verhältnis von gesättigten zu gesättigten Fettsäureketten erniedrigt (also die Zahl der ungesättigten Fettsäuren relativ zu den gesättigten erhöht).

4. Zur strukturellen Diversität tragen mindestens drei Eigenschaften bei. Erstens können Monosaccharide über jede der verschiedenen Hydroxylgruppen miteinander verknüpft werden. Zweitens kann die C-1-Bindung entweder in a- oder b - Konfiguration vorliegen. Drittens können die Kohlenhydratketten stark verzweigt sein.

Prüfungsfragen

1. a; 2. c; 3. d; 4. b; 5. b; 6. b; 7. a; 8. d; 9. a; 10. c; 11. d; 12. b; 13. c; 14. a

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Struktur und Funktion von Proteinen

Verständnisfragen

1. Die Struktur von Proteinen beschreibt man im Allgemeinen in Form von vier hierarischen Organisationsebenen. Die Primärstruktur ist die lineare Anord-nung oder die Sequenz der Aminosäuren, welche die Polypeptidkette bilden. Die Sekundärstruktur umfasst spezielle Strukturen, wie beispielsweise a-Helices oder b-Faltblätter, die von bestimmten Bereichen der Polypeptidkette gebildet werden. Wasserstoffbrücken halten diese Strukturen zusammen und stabilisieren sie. Mit Tertiärstruktur ist die Gesamtkonformation des Proteins beziehungsweise die dreidimensionale Anordnung aller Aminosäuren gemeint. Die Tertiärstruktur wird stabilisiert durch hydrophobe Wechselwirkungen zwischen nichtpolaren Seitenketten und manchmal auch durch Disulfidbrücken zwischen Cysteinresten. Die Quartärstruktur beschreibt die Anzahl und die Organisationsstruktur von Polypeptidketten oder Untereinheiten eines multimeren Proteins. Nichtkovalente Bindungen halten die Untereinheiten zusammen.

2. Ein Enzym ist ein Protein, das durch Erniedrigung der Aktivierungsenergie und die Stabilisierung von Übergangszuständen die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht. Ein Enzym enthält ein aktives Zentrum, das aus zwei funktionellen Teilen besteht: eine Substratbindungsstelle und einen katalytischen Bereich. Die Aminosäuren, welche das aktive Zentrum bilden, müssen in der Polypeptidkette nicht nebeneinander liegen, sondern können von verschiedenen Bereichen der Kette stammen, wobei die Proteinfaltung sie zusammenbringt. Ein zelluläres Enzym muss seine Reaktion in einer Umgebung durchführen können, in der sich die Zelle normalerweise aufhält, also zum Beispiel bei einem pH von 6,5-7,5 und bei 37 ° C. Ein zelluläres Enzym kann auch allosterisch sein. Ein solches Enzym besitzt nicht nur eine Bindungsstelle für das Substrat (das aktive Zentrum), sondern auch mindestens eine Bindungsstelle für Effektormoleküle, welche die Aktivität des Enzyms verändern können.

3. Membranproteine teilt man aufgrund ihrer Wechselwirkungen mit den Membranen in zwei große Gruppen ein: integrale und periphere Proteine. Integrale Membranproteine, die man auch als intrinsische Proteine bezeichnet, besitzen mindestens einen Bereich, der von der Phospholipiddoppelschicht der Membran umgeben ist. Diese membrandurchspannenden Regionen liegen als a-Helices oder mehrfache b-Stränge vor und enthalten hydrophobe Aminosäuren, die mit den

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hydrophoben Fettsäuregruppen der Phospholipiddoppelschicht in Wechselwirkung treten. Andere integrale Membranproteine durchspannen die Phospholipiddoppelschicht nicht, sondern sind kovalent mit Fettsäuren verknüpft, die in die Membran eingebettet sind. Periphere Membranproteine durchspannen die Phospholipiddoppelschicht nicht, sondern sind stattdessen indirekt durch Wechselwirkungen mit integralen Membranproteinen oder direkt durch Wechselwirkungen mit den polaren Kopfgruppen der Phospholipide an die Membran gebunden.

4. Proteine lassen sich aufgrund ihrer Masse oder Ladung auftrennen. Zu den Methoden für die Auftrennung von Proteinen aufgrund ihrer Masse gehören die Dichtegradientenzentrifugation, die SDS-Gelelektrophorese und die Gel- filtrationschromatographie. Bei der Dichtegradientenzentrifugation werden die Proteine durch eine Lösung von steigender Dichte zentrifugiert (normalerweise Saccharose). Große Proteine wandern schneller durch den Dichtegradienten und lassen sich so von kleineren Proteinen abtrennen. Bei der SDS-Gelelektro-phorese behandelt man die Proteine zuerst mit dem ionischen Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS). SDS denaturiert Proteine und bringt sie in eine gestreckte Konformation, in der sie immer ein ähnliches Verhältnis von Ladung zu Masse aufweisen. Eine SDS- Behandlung maskiert die Ladungen der Aminosäureseitengruppen, sodass sich die Proteine aufgrund ihrer Kettenlänge, die ihrer Masse entspricht, auftrennen lassen. Kleine Proteine wandern im Polyacrylamidgel schneller zum positiven Pol. Bei der Gelfiltrationschroma-tographie strömen die Proteine durch poröse Kügelchen aus Polyacrylamid, Dextran oder Agarose, die in eine Säule gepackt sind. Kleinere Proteine können in die Kügelchen besser eindringen, sodass sie langsamer durch eine Gelfiltrationssäule wandern als größere Proteine. Große Proteine kommen also zuerst aus der Säule.

Zu den Methoden für die Auftrennung von Proteinen aufgrund ihrer Ladung gehören die isoelektrische Fokussierung und die Ionenaustauschchromato-graphie. Bei der isoelektrischen Fokussierung werden die Proteine durch eine Elektrophorese in Polyacrylamid aufgetrennt, das mit Ampholyten gesättigt ist. Ampholyte sind ein Gemisch aus positiv und negativ geladenen Molekülen. Während der Elektrophorese trennen sich die Ampholyte auf und bilden einen pH-Gradienten. Die Proteine wandern durch diesen Gradienten, bis sie ihren isoelektrischen Punkt erreichen, das heißt den pH-Wert, bei dem die Netto-ladung der Proteine gleich null ist. Bei der Ionenaustauschchromatographie können sich geladene Proteine an Kügelchen binden, deren Oberfläche eine entgegengesetzte Ladung trägt. So binden sich an ein positiv geladenes Kügelchen beispielsweise negativ geladene Proteine, nicht jedoch neutrale oder positiv geladene Proteine. Die gebundenen Proteine kann man von den Kügelchen mithilfe eines Gradienten mit ansteigender Salzkonzentration eluieren. Schwach geladene Proteine werden zuerst eluiert, stark geladene Proteine zuletzt.

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Prüfungsfragen

1. b; 2. d; 3. a; 4. d; 5. b; 6. d; 7. c; 8. c; 9. b; 10. c; 11. a; 12. c

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Nucleinsäuren, der genetische Code und die Synthese

von Makromolekülen

Verständnisfragen

1. Wenn man die Enzyme, die für die Synthese oder Replikation der DNA erforderlich sind, einmal außer Acht lässt, besteht die Minimalausstattung aus RNA-Polymerasen, welche die DNA zu RNA transkribieren, rRNAs, Riboso-men, tRNAs, Aminosäuren, Aminoacyl-tRNA-Synthetasen sowie Initiations-, Elongations- und Terminationsfaktoren. Wenn wir darüber hinaus den Infor-mationsfluss bei einem Eukaryoten betrachten, kommen noch die Mechanismen für das Anfügen der Cap- Struktur, für die Polyadenylierung und das Spleißen von mRNA hinzu, außerdem für den Transport in das Cytosol.

2. Primer müssen mit einem spezifischen DNA-Strang hybridisieren, sodass sie eine komplementäre Sequenz enthalten müssen, um sich anlagern zu können. Der T m - Wert eines jeden Primers bildet die Grundlage zur Berechnung der Anlagerungstemperatur für die Reaktion. Je höher die Reaktionstemperatur, umso größer die Spezifität der Amplifizierung; die Temperatur darf jedoch den T m -Wert des Primers nicht übersteigen, da es sonst zu keiner Anlagerung kommt. Und schließlich muss es wie bei der DNA-Replikation mit jedem Oligonucleotidprimer möglich sein, neue Desoxyribonucleotide in 5´-3´-Richtung anzuhängen; Primer müssen also ein freies 3´-Ende besitzen.

3. Die Mutation kann außerhalb des codierenden Bereichs liegen. So beeinflussen beispielsweise Mutationen in Introns oder in 5´- und 3´-UTR-Sequenzen möglicherweise nicht die Transkription des Gens und auch nicht die Translation des Proteins. Andererseits führen nicht alle Mutationen im codierenden Bereich zu einem Verlust der Genfunktion. Wenn der Austausch einer einzelnen Base an der Wobble- Position eines Codons auftritt, kommt es nicht zwangsläufig zu einem Austausch der Aminosäure. Wenn jedoch dieser Basenaustausch einen Austausch der Aminosäure verursacht, muss dies noch nicht dazu führen, dass sich die Konformation des fertigen Proteins ändert, das Protein kann also normal funktionieren. Selbst der Austausch einer einzelnen Base, der ein neues Stopcodon einführt, muss nicht die Funktion des Proteins beeinflussen, wenn er in der Nähe des Carboxylendes auftritt und der deletierte Bereich für die Aktivität nicht erforderlich ist.

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1. d; 2. b; 3. d; 4. a; 5. c; 6. a; 7. a; 8. c; 9. a; 10 d; 11. c

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Biologische Membranen und die innere Struktur

eukaryotischer Zellen

Verständnisfragen

1. Die Elektronemikroskopie besitzt ein besseres Auflösungsvermögen als die Lichtmikroskopie, viele lichtmikroskopische Verfahren ermöglichen jedoch die Beobachtung und Beeinflussung von lebenden Zellen.

2. Durch einen fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS), in dem die Zellen zuerst mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper „beladen“ werden, lassen sich spezifische Zelltypen in Suspension von anderen Zellen abtrennen, die der Antikörper nicht erkennt. Dabei wählt man einen Antikörper, der für den gesuchten Zelltyp spezifisch ist. Organellen lassen sich durch Zentrifugation lysierter Zellen spezifisch auftrennen. Eine Folge von Zentrifugationen der jeweiligen Überstandsfraktionen mit zunehmender Geschwindigkeit und demzufolge stärkeren Kräften dient dazu, die zellulären Organellen aufgrund ihrer Größe und Masse voneinander zu trennen (größere und schwerere Zellbestandteile pelletieren bei niedrigerer Geschwindigkeit). Dies erfolgt häufig in Kombination mit Auftrennungen in Dichtegradienten, um spezifische Organellen aufgrund ihrer Schwebedichte zu reinigen.

3. Durch die amphiphile Struktur von Phospholipidmolekülen (ein hydrophiler Kopf und ein hydrophober Schwanz) können sich diese Moleküle in einer wässrigen Umgebung spontan zu geschlossenen Doppelschichtstrukturen zusammenlagern. Die Phospholipiddoppelschicht schafft eine Barriere mit selektiver Durchlässigkeit, welche die Bewegung von hydrophilen Molekülen und Makromolekülen in das Kompartiment hinein und dort heraus verhindert. Die verschiedenen Arten von Proteinen, die auf den beiden Seiten einer Doppel-schicht vorhanden sind, tragen zu den unterschiedlichen Funktionen bei, die das Innere und das Äußere eines Kompartiments charakterisieren. Außerdem steuern sie die Bewegung selektiver hydrophiler Moleküle und Makromoleküle durch die Doppelschicht.

4. Die vielfachen Membranen der Mitochondrien und Chloroplasten schaffen innerhalb dieser Organellen weitere Kompartimente mit spezialisierten Funktionen. Der polarisierte Stapel von Kompartimenten, die den Golgi-Apparat bilden, steht mit der Tatsache in Zusammenhang, dass die Enzyme, welche zahlreiche Produkte des ER

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modifizieren, in Form einer Fertigungs-straße organisiert sind.

Prüfungsfragen

1. c; 2. b; 3. b; 4. a; 5. c; 6. c; 7. a; 8. b; 9. a; 10. d; 11. c; 12. b; 13. d

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Zellen und Viren in Kultur

Verständnisfragen

1. Sie bilden einen Zellklon, sind also identisch; sie sind immortalisiert, so dass sie

unbegrenzt in Kultur wachsen können; sie erzeugen den monoklonalen Antikörper, der für ihren B-Lymphocyten-Vorläufer spezifisch ist.

2. Um zweifach auxotrophe Zellen wie diese zu erzeugen, kann man Zellen muta-genisieren

und dann mithilfe einer Replikaplattierung zuerst die Mutanten suchen, die auf Minimalmedium ohne Leucin wachsen. Das Verfahren entspricht dem in Abbildung 6.2, welche die Isolierung von Bakterien beschreibt, die ausschließlich einen Defekt in der Argininsynthese aufweisen. Von diesen Zellen wird ein Klon isoliert, den man in großer Menge wachsen lässt und dann mutagenisiert. Schließlich identifiziert man durch Replikaplattierung einen Klon, der auf Minimalmedium mit Leucin und Adenin wachsen kann, nicht jedoch auf Minimalmedium ohne Leucin oder Adenin.

3. Das Einteilungsprinzip basiert auf dem Mechanismus der viralen mRNA-Synthese und

der Art des Stranges (+, - oder doppelsträngig) des viralen Genoms, nicht auf der Art des Viruswirtes, der Form des Virions oder der Art der viralen Proteine (Abbildung 6.20).

Prüfungsfragen

1. c; 2. c; 3. b; 4. b; 5. d; 6. a; 7. a; 8. b; 9. b; 10. b; 11. d; 12. a; 13. a; 14. d

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Rekombinierte DNA und Genomik

Verständnisfragen

1. Durch die Genomik können Wissenschaftler Informationen über das Vorhan-densein oder Fehlen von Stoffwechselwegen, die Funktionen von im Genom codierten Proteinen und über den Anteil des Genoms, der für speziellen Funktionen verantwortlich ist, erhalten. Untersuchungen an den Archaea zeigen, dass sie aufgrund bestimmter essenzieller Funktionen wie Replikation, Transpkription und Translation mit den Eukaryoten näher verwandt sind als mit den Prokaryoten. S. cerevisiae besitzt zahlreiche Proteine, die sezerniert oder in Membranen eingebaut werden. Dies hängt damit zusammen, dass diese Zellen einen Zellkern und cytoplasmatische Organellen besitzen. Das Genom von C. elegans zeigt eine weitere Form der Komplexität, da hier Proteine vorkommen, die für die Wechselwirkungen zwischen den Zellen in einem vielzelligen Organismus erforderlich sind.

2. Die beiden Gruppen von Enzymen, mit deren Hilfe die Klonierung von DNA möglich ist, sind die Restriktionsendonucleasen und die DNA-Ligasen. Jede Restriktionsendonuclease erkennt eine bestimmte DNA-Sequenz in jeder DNA, in der diese Sequenz vorkommt. Aufgrund dieses Mechanismus und aufgrund der Eigenschaft der DNA-Ligasen, DNA-Fragmente verknüpfen zu können, lassen sich zwei beliebige DNA-Fragmente mit entsprechenden Enden mitein-ander verbinden. Um eine bestimmte DNA-Sequenz genauer analysieren zu können, verknüpft man diese mit einem DNA-Molekül, das sich in großen Mengen erzeugen lässt. Die Polynucleotidkinase ist das Enzym, das die DNA-Sequenzierung ermöglicht; es hängt ein nachweisbares Molekül an das 5´-Ende des Primers, mit dem die DNA- Synthese bei der Sanger-Methode beginnt. Ohne diese Markierung lassen sich die Größen der erzeugten Fragmente nicht bestimmen. Durch die Verwendung einer thermostabilden DNA-Polymerase konnte man die PCR-Methode automatisieren. Solch eine Polymerase wird bei den Temperaturen, die zum Aufschmelzen der DNA erforderlich sind, nicht inaktiviert, sodass zahlreiche Zyklen aus Primer- Hybridisierung und DNA-Synthese möglich sind. Die Reverse Transkriptase, die aus einer einzelsträngigen RNA-Matrize doppelsträngige DNA erzeugt, verwendet man zum Erzeugen von cDNA, die man dann klonieren kann.

3. Da das Protein von Bedeutung ist, besteht die Wahrscheinlichkeit, dass es bereits

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isoliert und charakterisiert wurde. Wenn ein Antikörper gegen das Protein zur Verfügung steht, kann man damit eine cDNA-Expressions-Bibliothek durchsuchen. Die cDNA lässt sich dann in einem System exprimieren, das große Proteinmengen erzeugt, wie beispielsweise das Zwei-Phasen-System, bei dem die hinzugefügte T7- RNA-Polymerase induziert wird, um Proteine von einem T7-Promotor aus zu exprimieren. Eukaryotische Proteine, für die bestimmte Modifikationen erforderlich sind, beispielsweise eine Glykosylierung, kann man in aktiver Form in Bakterien nicht erzeugen; mit anderen Expressionssystemen, die sich beispielsweise von Insektenzellen ableiten, lassen sich solche Proteine herstellen.

4. Die Gegenwart einer bestimmten DNA oder RNA in einem Gemisch lässt sich durch Elektrophoses dieses Gemisches und einen anschließenden Southern-Blot (für DNA) oder Northern-Blot (für RNA) nachweisen. Zuerst wird die DNA vor der Elektrophorese mit mindestens einer Restriktionsendonuclease geschnitten. Man kann eine bestimmte DNA-Sequenz klonieren und eine Bak-terienkolonie oder einen Plaque des l-Phagen, die jeweils nur den Klonier-ungsvektor mit der eingefügten gewünschten DNA enthält. Um eine spezifi-sche mRNA zu isolieren, präpariert man zuerst mithilfe einer Oligo(dT)-Chromatographie die Gesamt-RNA. Man nutzt den Poly(A)-Schwanz der mRNA, um mithilfe eines Oligo(dT)-Primers cDNA herzustellen. Die klo-nierten cDNAs bilden dann eine Bibliothek; auch hier führt das Klonierungsverfahren dazu, dass jeder Vektor eine cDNA enthält.

Prüfungsfragen

1. a; 2. b; 3. d; 4. a; 5. a; 6. b; 7. c; 8. b; 9. d; 10. d

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Genetische Analyse in der Zellbiologie

Verständnisfragen

1. Sowohl die Mitose als auch die Meiose beginnen mit einer Verdopplung des Chromosomensatzes, sodass eine Zelle mit einem 4n-Chromosomensatz entsteht. Für eine vollständige Mitose ist eine Zellteilung erforderlich, damit jede Tochterzelle einen 2n-Satz erhält. Bei der Mitose lagert sich jedes Paar von Schwesterchromatiden unabhängig an die Spindel an; die Chromatiden jedes Paares trennen sich und wandern jeweils in die entgegengesetzte Tochterzelle. Bei der Meiose lagern sich während der ersten meiotischen Teilung die homologen Chromosomenpaare so aneinander, dass je ein Paar von Schwesterchromatiden in die eine Zelle und das andere Paar in die andere Zelle gelangt. Bei der zweiten meiotischen Teilung werden die Chromatidenpaare wie bei der Mitose getrennt. Außerdem kommt es bei somatischen Zellen zur Mitose, während die Meiose spezialisierte Zellen betrifft, die zu Gameten werden.

2. Die weiblichen Nachkommen aus dieser Kreuzung entsprechen phänotypisch dem Wildtyp. Die Hälfte der Weibchen ist heterozygot für die rezessive Mutation, die andere Hälfte homozygot für das Wildtypallel. Die Hälfte der Männchen ist mutiert, die andere Hälfte zeigt den Wildtyp. Unter der Annahme, dass sich alle Männchen der F1-Nachkommen normal paaren, weisen sieben Achtel der weiblichen F2- Nachkommen phänotypisch den Wildtyp auf, ein Achtel ist mutiert. Von sieben Wildtypweibchen sind drei für das Wildtypallel homozygot, vier sind heterozygot. Von den männlichen F2-Nachkommen zeigen drei Viertel den Wildtyp und ein Viertel ist mutiert.

3. Um Knockout-Mäuse als Modell für Krankheiten des Menschen verwenden zu können, muss man beim Menschen das Gen isolieren, dessen Mutation die jeweilige Krankheit verursacht, und dann das gleiche Gen bei der Maus isolieren. Dann mutiert man das Gen der Maus spezifisch in vitro und führt es in Mäuse ein, wie in den Abbildungen 8.33 bis 8.36 dargestellt ist. Man geht davon aus, dass der Phänotyp bei Mäusen, die für die Mutation homozygot sind, mit dem menschlichen Phänotyp übereinstimmt. Bei den mutierten Mäusen lassen sich dann die physiologischen Grundlagen für die Krankheit untersuchen.

4. Das Verfahren, bei denen die Reihenfolge von Genen auf einem Chromosom

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aufgrund ihrer Rekombinationshäufigkeit bestimmt wird, basiert darauf, dass es umso häufiger zu einer Rekombination zwischen zwei Genen kommt, je weiter sie voneinander entfernt sind (Abbildung 8.18).

Prüfungsfragen

1. b; 2. c; 3. b; 4. d; 5. b; 6. a; 7. d; 8. a; 9. d; 10. d; 11. b; 12. b; 13. b

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Die molekulare Struktur von Genen und

Chromosomen

Verständnisfragen

1. Gene lassen sich in einfache und komplexe Transkriptionseinheiten einteilen. Eine einfache Transkriptionseinheit codiert eine einzige mRNA, die ein einziges Protein codiert. Eine Mutation in einem Exon einer einfachen Transkriptions-einheit betrifft nur ein Protein. Ein komplexe Transkriptionseinheit codiert eine mRNA, die durch die Verwendung alternativer Poly(A)- oder Spleißstellen auf mehr als eine Weise prozessiert werden kann. Eine Transkriptionseinheit, die zwei oder mehr Poly(A)- Stellen enthält, kann mRNAs erzeugen, welche dieselben 5´-Exons, aber unterschiedliche 3´-Exons enthalten. Durch eine weitere Variante des alternativen RNA-Spleißens, die man auch als Auslassen von Exons (exon skipping) bezeichnet, können mRNAs entstehen, die dieselben 5´- und 3´-Exons, aber unterschiedliche interne Exons enthalten. Diese mRNAs mit verschiedenen Kombinationen von Exons codieren wahrscheinlich Proteine mit unterschiedlichen Aminosäuresequenzen. Mutationen in einem alternativ gespleißten Exon beeinflussen nur solche Proteine, die das mutierte Exon enthalten. Ein Vorteil komplexer Transkriptionseinheiten besteht darin, dass auf diese Weise aus einem einzigen Gen eine Reihe verschiedener Proteine entstehen können.

2. Mobile Elemente lassen sich aufgrund ihrer Art der Transposition in zwei Gruppen einteilen. Mobile Elemente, die direkt als DNA-Zwischenstufe transpositioniert werden, bezeichnet man als Transposons, mobile Elemente, die über eine RNA- Zwischenstufe transpositioniert werden, als Retro-transposons. Ein Insertionssequenz-Element (IS) enthält an jeder Seite der Insertionssequenz eine umgekehrte Sequenzwiederholung. Dazwischen liegt eine Sequenz, die eine Transposase codiert; dieses Enzym bewirkt die Transposition. Bei der nichtreplikativen Transposition schneidet die Transposase das IS-Element an einer Position aus der DNA heraus und fügt es an anderer Stelle wieder ein. Einige IS- Elemente transpositionieren sich über einen replikativen Mechanismus. Dabei wird eine Kopie des Elements synthetisiert und an einer anderen Position eingefügt, während das ursprüngliche IS-Element erhalten bleibt. Bakterielle Transposons bestehen normalerweise aus einem Gen für eine Antibiotikumresistenz, das von zwei Kopien desselben Typs von IS-Element flankiert wird. Sowohl bei IS-Elementen als

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auch bei Transposons kommt es durch Transposition zu einer Verdopplung der Zielsequenz an jeder Seite des eingefügten mobilen Elements.

Retrotransposons werden über eine RNA-Zwischenstufe transpositioniert. Sie lassen sich in virale und nichtvirale Retrotransposons einteilen. Virale Retro-transposons enthalten am 5´- und 3´-Ende kurze direkte Sequenzwiederho-lungen und lange endständige Wiederholungssequenzen (LTR) mit 250-600 bp Länge, welche die zentrale proteincodierende Region flankieren. Die „linke“ LTR-Sequenz wirkt als Promotor für die Transkription der proteincodierenden Gene. Diese Proteine – Reverse Transkriptase und Integrase – sind für die Umwandlung der RNA- Zwischenstufe in DNA und dann für das Einfügen der DNA in die Zielsequenz erforderlich. Im Gegensatz dazu ist der Mechanismus für die Transposition nichtviraler Retrotransposons, die keine LTR-Sequenzen aufweisen, weniger gut bekannt. Promotorsequenzen am „linken“ Ende des Elements steuern die Transkription der Retrotransposons einschließlich des Gens für die Reverse Transkriptase. Dieses Enzym synthetisiert eine DNA-Kopie, und durch einen bestimmten Mechanismus wird das Retrotransposon in die Zielsequenz eingefügt. Beispiele für nichtvirale Retrotransposons sind die langen verstreuten Elemente (long interspersed elements, LINES) mit 6-7 kb Länge sowie die kurzen verstreuten Elemente (short interspersed elements, SINES) mit 300 bp.

3. Antikörper bestehen aus zwei identischen schweren Ketten (55 kDa) und zwei identischen leichten Ketten (23 kDa). Sowohl die schweren als auch die leichten Ketten bestehen aus konstanten und variablen Domänen. Die DNA-Region, welche die Gene für die leichten k-Ketten enthält, umfasst etwa 100 variable Abschnitte (V) und fünf Verbindungsabschnitte (J). Die zufällige Verknüpfung eines variablen Abschnitts mit einem Verbindungsabschnitt durch eine positionsspezifische Rekombinase kann bis zu 500 verschiedene Kombinationen hervorbringen. Eine noch größere Verschiedenheit entsteht aufgrund der ungenauen Verknüpfung der V- und J-Abschnitte. Dabei geht eine geringe, aber unterschiedliche Anzahl von Nucleotiden verloren oder wird hinzugefügt, sodass an der V-J-Verknüpfungsstelle verschiedene Aminosäuresequenzen entstehen. Nach einem ähnlichen Mechanismus wird die Verschiedenheit der Gene für die schwere Kette erzeugt. Der variable Bereich der Gene für die schwere Kette besteht nicht nur aus 100 variablen und 6 Verknüpfungselementen, sondern er enthält auch noch 30 Diversitätsabschnitte (D). Durch zufällige Verknüpfung der V-, D- und J-Abschnitte können 18 000 verschiedene Kombinationen entstehen. Auch hier kommt es durch zufälligen Verlust oder durch zufälliges Anfügen einer unterschiedlichen Zahl von Nucleotiden zu einer noch größeren Verschiedenheit. Da ein Immunglobulin-molekül eine schwere und eine leichte Kette enthält, lassen sich insgesamt neun Millionen (500 x 18 000) verschiedene Antikörper erzeugen. Die somatische Mutation, die in diesem Kapitel nicht behandelt wurde, ist ein weiterer Mechanismus für die Entstehung einer noch größeren Diversität der Antikörper.

4. Metaphasechromosomen enthalten mehrere Ebenen der Organisation und Faltung des DNA-Doppelstranges. Zuerst wird ein Abschnitt des DNA-Doppelstranges um einen Histonoktamerkern gewickelt, sodass ein Nucleosom entsteht. Diesen

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Histon:DNA-Komplex bezeichnet man als Chromatin; die Struktur ähnelt einer Perlenschnur. Diese wird weiter gefaltet und bildet eine Spiral- oder Solenoidstruktur in Form einer 30 nm-Chromatinfaser. Diese Faser bindet in Abständen von mehreren Millionen Basenpaaren an ein flexibles Proteingerüst, sodass lange Chromatinschleifen entstehen, die von dem Gerüst ausgehen. Die Verdrillung des Gerüst:DNA-Komplexes in eine Helix und die weitere Verpackung der Spiralstruktur führt schließlich zu einer stark kondensierten Struktur, die für Metaphasechromosomen charakteristisch ist.

Drei für die Replikation und die stabile Vererbung der Chromosomen verantwortliche Strukturelemente sind Replikationsursprünge, Centromer und zwei Telomere. Replikationsursprünge oder autonom replizierende Sequenzen (ARS) sind DNA-Sequenzen, an denen die Initiation der DNA-Synthese stattfindet. Centromere sind kurze, relativ stark konservierte Sequenzen, die für die korrekte Verteilung der Chromosomen erforderlich sind. Centromere lagern sich bei Mitose und Meiose an die Mikrotubuli der Spindel (Kapitel 19). Telo-mere sind spezialisierte Strukturen an den Enden von linearen Chromosomen. Die DNA-Sequenzen von Telomeren bestehen aus kurzen Oligomeren, die sich mehrere Hundert bis Tausend mal wiederholen. Die telomerischen Wieder-holungen werden von einem Enzym angefügt, das man als Telomerase bezeichnet.

Prüfungsfragen

1. b; 2. d; 3. a; 4. d; 5. b; 6. a; 7. b; 8. c; 9. a; 10. c; 11. d; 12. b

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Regulation der Initiation der Transkription

Verständnisfragen

1. Wenn E. coli in einem Medium ohne Lactose wächst, werden die Enzyme, die für den Lactosemetabolismus notwendig sind, nur in unbedeutenden Mengen synthetisiert. Die Expression des lac-Operons wird durch ein Protein unterdrückt, das vom lacI-Gen codiert wird: Der lac-Repressor bindet an die Operatorsequenz des lac-Operons und blockiert so die Transkription des Operons durch die RNA- Polymerase. In einem Medium mit Lactose werden die Enzyme des lac-Operons induziert. Lactose dringt in die Zelle ein und bindet an den lac-Repressor, sodass sich die Konformation des Repressormoleküls verändert und dieser sich nicht mehr an den Operator binden kann. Die RNA-Polymerase kann dann frei an die Promotorsequenz binden und die Transkription des lac-Operons in Gang setzen (Abbildung 10.2).

2. Für die Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen verwendet man im Allgemeinen zwei Verfahren: den DNase I-Footprinting-Test und den Gel- elektrophoresemobilitätstest (EMSA). Bei der Methode des DNase I-Foot-printing markiert man zuerst das DNA-Fragment, dessen Protein-Bindungs-stellen untersucht werden sollen, an einem Ende radioaktiv. Dann lässt man das Protein an die so markierte DNA binden und führt dann eine partielle Spaltung mit DNase I durch. Dabei werden die Bedingungen so eingestellt, dass im Durchschnitt jedes DNA- Molekül nur einmal geschnitten wird. Dann denaturiert man die DNA-Fragmente und trennt sie in einem Gel auf. Der DNA-Bereich mit dem daran gebundenen Protein ist für die DNase I nicht zugänglich und erscheint so in der Autoradiographie als Lücke oder „Fußabdruck“ (Abbildung 10.6). Bei der EMSA-Methode markiert man zuerst das DNA-Fragment radioaktiv, dessen Protein-Bindungsstellen untersucht werden sollen. Dann lässt man das Protein daran binden und trennt die DNA in einem nichtdena-turierenden Gel auf. Die Bindung eines Proteins an das DNA-Fragment verringert die Mobilität des Fragments und führt zu dessen Verschiebung im Gel, die sich mithilfe einer Autoradiographie feststellen lässt (Abbildung 10.7).

Die Position von DNA-Steuerungselementen in einem regulatorischen Bereich kann man durch die Deletion verschiedener Abschnitte in diesem regulatorischen Bereich (5´-Deletionsanlyse) oder durch Einfügen von beliebigen DNA-Sequenzen an

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verteilten Positionen (linker scanning-Mutationstest) bestimmen. Bei der 5´- Deletionsanalyse kloniert man DNA-Fragmente, welche die stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt liegende Sequenz in verschiedenen Längen enthalten, vor ein Reportergen. Diese Konstrukte aus regulatorischem Element und Reportergen werden in Zellen transfiziert; anschließend misst man die Aktivität des Reportergens in den Zellextrakten. Die ungefähren Positionen wichtiger regulatorischer Elemente bestimmt man aufgrund der relativen Aktivität des Reportergens bei den einzelnen DNA-Konstrukten (Abbildung 10.24). Beim linker scanning-Mutationstest kloniert man einen systematisch entwickelten Satz von Konstrukten mit überlappenden Mutationen vor ein Reportergen. Diese Konstrukte werden in Zellen transfiziert; anschließend misst man die Aktivität des Reportergens in den Zellextrakten (Abbildung 10.31). Bei beiden Test-methoden ermöglicht die Korrelation zwischen der Aktivität des Reportergens und der Position der 5´-Deletion beziehungsweise der Position der eingefügten DNA-Sequenz eine ungefähre Positionsbestimmung des regulatorischen Elements.

3. Bei den Prokaryoten transkribiert eine einzige RNA-Polymerase die gesamte RNA; bei den Eukaryoten transkribiert hingegen die RNA-Polymerase II die mRNA. Die Hauptform der bakteriellen RNA-Polymerase besteht aus fünf Untereinheiten: b, b- ´, zwei Kopien a und eine Kopie s 70 . Die Transkription beginnt, wenn die s 70 - Untereinheit mit den Promotorsequenzen in etwa -10 und -35 Basenpaaren Entfernung von der Transkriptionsstartstelle in Wechsel-wirkung tritt. Der Polymerasekomplex synthetisiert etwa 10 Nucleotide, dann wird die s-Untereinheit freigesetzt.

Bei Eukaryoten beginnt die Transkription normalerweise an der TATA-Box, die 25- 35 Basenpaare stromaufwärts des Transkriptionsstartpunktes liegt, oder an einem Initiatorelement. Bei Genen, die eine TATA-Box enthalten, beginnt die Initiation der Transkription mit der Bindung von TFIID, der ein TATA-Box-bindendes Protein (TBP) enthält. Anschließend binden andere Transkriptions-faktoren (TFIIB, TFIIF, TFIIE und TFIIH) und die RNA-Polymerase und bilden einen großen DNA- Protein-Komplex. Wenn sich die Polymerase mit fortschreitender Transkription von der Startstelle entfernt, wird die C-terminale Domäne der RNA-Polymerase II phosphoryliert.

4. Transkriptionsaktivator- und -repressorproteine bestehen aus zwei funktio-nellen Domänen: einer DNA-Bindungsdomäne und einer Aktivierungs- oder Repressionsdomäne. Eine Besonderheit ist dabei, dass die Domänen unab-hängig voneinander wirken können. So kann man beispielsweise eine DNA- Bindungsdomäne auf ein Protein übertragen, das normalerweise nicht an DNA bindet, und erhält so ein Protein, das jetzt an DNA bindet. Die DNA-bindenden Domänen zeigen eine Vielfalt von Strukturen. Zu den häufigsten Strukturen gehören die Homöodomäne, die Basic Zipper-Struktur (Leucin-Zipper), Helix-Schleife-Helix und die Zinkfingerstruktur. Auch die Aktivierungsdomänen zeigen recht verschiedene Strukturen. Als Aktivierungsdomänen können eine Reihe verschiedener Aminosäuresequenzen fungieren, aber viele Aktivierungs-domänen enthalten einen hohen Anteil an sauren Aminosäuren (Asparagin- und Glutaminsäure), sodass man

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sie als saure Aktivierungs-domänen bezeichnet. Ebenso können eine Reihe verschiedener Aminosäuresequenzen als Repressionsdomänen fungieren. Einige dieser Repressionsdomänen enthalten einen hohen Anteil an hydrophoben Aminosäuren, während bei anderen ein hoher Anteil an basischen Aminosäuren vorkommt.

Prüfungsfragen

1. c; 2. d; 3. a; 4. d; 5. b; 6. d; 7. a; 8. b; 9. a; 10. c; 11. b; 12. c

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11

RNA-Prozessierung, zellkernspezifischer Transport

und posttranskriptionale Regulation

Verständnisfragen

1. Differenzielles Spleißen kann verschiedene mRNAs hervorbringen, die alternative codierernde Bereiche enthalten. Die Regulation der mRNA-Stabilität kann die Menge des erzeugten Proteins steuern, das von dem Gen codiert wird. Auch die Regulation der Translationsinitiation bestimmt die Proteinmenge. Bei einigen Organismen steuert die Regulation des trans-Spleißens die Synthese bestimmter mRNAs. Bei der U1A-mRNA wird die Polyadenylierung reguliert und steuert so die Menge der erzeugten mRNA. Bei Bakterien reguliert die Erzeugung von Antisense- RNA die Translation bestimmter mRNAs.

2. Wenn die genomische Kopie des menschlichen Gens als Matrize für die RNA- Transkription dient, werden die Introns nicht herausgespleißt. Um eine mRNA zu erhalten, die in vitro translatiert werden kann, muss man einen cDNA-Klon als Matrize für die mRNA-Transkription verwenden. Da zur Transkription des cDNA- Klons eine gereinigte RNA-Polymerase eines Bakteriophagen dient, enthält die transkribierte RNA keine 5´-Cap-Struktur, wenn man nicht die Transkription mit einem Cap-Analogon beginnt. Dies erreicht man im Allgemeinen durch die Zugabe einer hohen Konzentration von GpppG in den Reaktionsanstz für die in vitro- Transkription. Unter diesen Bedingungen dient dieses Cap-Analogon dazu, die Transkription vom Promotor der T7-RNA-Polymerase zu starten. Da die Synthese eines vollständigen cDNA-Klons normalerweise mit einer Oligo(dT)-Sequenz beginnt (Abbildung 7.15), enthält ein cDNA-Klon an seinem 3´-Ende eine Poly(dA)/Poly(dT)-Sequenz. Diese Sequenz wird bei der Transkription des cDNA- Klons durch die T7-RNA-Polymerase zu einem Poly(A)-Schwanz transkribiert.

3. Alle drei Arten von eukaryotischer RNA werden als Vorstufen synthetisiert, die modifiziert werden, sodass schließlich die gereiften RNAs entstehen. Bei allen drei RNA-Typen werden bestimmte Teile entfernt, Introns werden aus den Vorstufen herausgespleißt. Bei einigen Organismen werden auch aus den rRNA-Vorstufen Introns herausgespleißt, genauso wie kurze Introns aus der Anticodon-Schleife von einigen tRNA-Vorstufen, wobei sich bei letzteren der Spleißmechanismus vom Spleißen von Prä-mRNAs und Prä-rRNAs unterscheidet. Proteine katalysieren das

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Spleißen von Prä-tRNAs, während Prä-mRNAs und Prä-rRNAs von Ribozymen

gespleißt werden. Enzyme, die mit der phosphorylierten CTD der RNA-Polymerase

II assoziieren, hängen an das 5´-Ende einer naszierenden Prä-mRNA eine Cap-

Struktur. Das 3´-Ende des transkribierten Teils einer mRNA entsteht durch Spaltung an einer Poly(A)-Stelle. Daran werden dann A-Reste gehängt, sodass ein Poly(A)- Schwanz entsteht. Bei rRNA entstehen durch die Spaltung einer langen Prä-rRNA eine 28S-, 18S und 5,8S-rRNA. snoRNAs, die zu bestimmten Bereichen der rRNA komplementär sind, steuern die Methylierung von spezifischen Basen und Ribosen in diesen Bereichen. Das 5´-Ende von Prä-tRNAs wird durch das Ribozym der RNase

P abgespalten. Das gereifte 3´-Ende einer tRNA entsteht durch Spaltung der Prä-

tRNA und das anschließende Anhängen der Sequenz CCA. Dann werden noch spezifische Basen der tRNA durch für jede Reaktion spezifische Enzyme modifiziert.

4. Der Zellkern lässt es normalerweise nicht zu, dass nicht prozessierte mRNAs exportiert werden, da die Prä-mRNAs mit snRNPs in den Spleißosomen assoziiert sind und diese nicht in das Cytosol transportiert werden. Die 9 kb- und die 4 kb- RNA des HIV enthalten Spleißstellen und werden in HIV-infizierten Zellen in das Cytosol transportiert. Mutationen des HIV-Rev-Proteins verhindern einen Export; Rev muss also am Export dieser ungespleißten RNAs beteiligt sein. Außerdem führt eine Mutation der Rev-Bindungsstelle RRE dazu, dass die 9 kb- und die 4 kb-RNA des HIV nicht exportiert werden. Für den Rev-vermittelten Transport ist also die Bindung von Rev an die RRE-Sequenz erforderlich.

Prüfungsfragen

1. d; 2. a; 3. f; 4. f; 5. a; 6. e; 7. d; 8. e; 9. d; 10. d; 11. c

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12

Replikation, Reparatur und Rekombination von DNA

Verständnisfragen

1. Der Mechanismus für die DNA-Replikation bei Prokaryoten ist dem Mechanismus bei Eukaryoten ähnlich. Bei E. coli ist der erste Schritt die Bindung des DnaA- Proteins an den Replikationsursprung oriC. DnaB ist eine Helikase, die als nächstes bindet und die doppelsträngige DNA aufschmilzt. Die Bindung des einzelstrangbindenden Proteins verhindert, dass sich die so entstandenen Einzelstränge wieder zusammenlagern. Die E. coli-Primase bindet und katalysiert die Synthese der RNA-Primer für die Synthese der Okazaki-Fragmente durch die DNA-Polymerase III. Die b -Untereinheit bindet als Dimer an die Polymerase III und wirkt dabei als Klammer, welche die Polymerase mit der DNA-Matrize zusammenhält. Wenn sich das neu synthetisierte Okazaki-Fragment dem 5´-Ende des nächsten Okazakifragments nähert, dissoziiert die DNA-Polymerase III; die DNA-Polymerase I bindet, entfernt den RNA-Primer und füllt die Lücke auf. Schließlich verknüpft die DNA-Ligase die aneinandergrenzenden Fragmente des Folgestranges.

Bei den Eukaryoten gibt es einen ähnlichen Mechanismus. Als Modell für ein eukaryotisches System eignet sich SV40. Ein virales Protein mit der Bezeichnung T- Antigen bindet an den Replikationsursprung und schmilzt mithilfe seiner Helikaseaktivität die doppelsträngige DNA auf, ähnlich der DnaB-Helikase von E. coli. Dann bindet sich das Replikationsprotein A an die getrennten DNA-Stränge, entsprechend dem einzelstrangbindenden Protein in der Polymerase a; dabei ist das Replikationsprotein A fest mit der Primase verbunden. Die Bindung des Replikationsfaktors C (RFC) stimuliert die Aktivität von Pol a. Dann bindet das Zellkernantigen proliferierender Zellen (PCNA) der Wirtszelle und verdrängt den Primase-Pol a-Komplex. PCNA wirkt analog zur Klammer der b-Untereinheit, die mit der Polymerase III assoziiert ist. Beide erhöhen die Prozessivität der DNA- Polymerase. Polymerase d bindet sich an den PCNA/RFC-Komplex und vervollständigt die DNA-Synthese.

2. Ein DNA-Molekül, das Basenfehlpaarungen oder beschädigte Basen enthält, kann durch eine Reihe verschiedener Mechanismen repariert werden. Während der Synthese entfernt die Korrekturlesefunktion der DNA-Polymerase III fehlerhafte Basenpaarungen. Eine 3´Æ5´-Exonuclease entfernt die fehlgepaarte Base, und die

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DNA-Synthese setzt sich fort. Schäden in der DNA können durch zahlreiche Mechanismen korrigiert werden, beispielsweise durch Reparatur von Fehlpaarungen (mismatch repair), Excisionsreparatur und Reparatur von Doppelstrangbrüchen. Die Reparatur von einzelnen Basenfehlpaarungen hängt davon ab, dass die DNA direkt nach der Replikation nur zur Hälfte methyliert ist. Bei E. coli wird die DNA am Adenin von GATC-Sequenzen durch die Dam-Methylase methyliert. Dabei ist nur der Elternstrang methyliert, während der neu synthetisierte Strang kurzzeitig nicht methyliert ist. Demnach kann der Methylierungszustand als Marker dienen, um zwischen Eltern- und Tochterstrang zu unterscheiden. Das MutHLS-System erkennt Basenfehl-paarungen und kann zwischen Eltern- und Tochterstrang unterscheiden. Eine Endonuclease-Aktivität im MutH-Protein bindet spezifisch an die DNA und spaltet den unmethylierten Tochterstrang. Die falsch eingebaute Base wird entfernt und durch die richtige Base ersetzt. Als Beispiel für die Excisions-reparatur ist das UvrABC-System von E. coli am besten bekannt; hier werden Thymindimere entfernt. Ein UvrA-UvrB-Komplex bindet an die DNA-Helix und „sucht“ nach Störungen der Helixstruktur. Bei einer beschädigten Base dissoziiert UvrA und UvrC bindet. UvrC besitzt eine Endonucleaseaktivität, welche die DNA an beiden Seiten der beschädigten Stelle schneidet. Das beschädigte Fragment wird durch eine Helikase entfernt und dann abgebaut; anschließend füllen Polymerase I und Ligase die Lücke. Bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen kommt es zu einer Endenverknüpfung nichthomologer DNAs. Ein Komplex aus dem Ku-Protein und einer Proteinkinase bindet an die Enden der DNA-Moleküle. Die Helikaseaktivität des Ku-Proteins entspiralisiert beide Enden, bis ein kurzer homologer Bereich der beiden DNA-Moleküle freiglegt ist. Die ungepaarten Einzelstrangenden werden entfernt und die beiden DNA-Moleküle miteinander verknüpft. Der Vorgang kann Mutationen hervorrufen, da an den Enden der verknüpften Moleküle Nucleotide verloren gehen.

3. Bei der genetischen Rekombination kommt es zu einem Austausch von DNA- Information zwischen DNA-Molekülen. Das Holliday-Modell beschreibt den molekularen Mechanismus. Im ersten Schritt lagern sich zwei homologe DNA- Moleküle aneinander. In jeweils einem Strang der beiden DNAs wird ein Einzelstrang erzeugt. Die beiden geschnittenen Einzelstränge dringen in das andere DNA-Molekül ein und bilden Doppelstränge durch einen Mechanismus, den man als Strangaustausch bezeichnet. An den Stellen der Einzelstrangbrüche werden die 3´- und 5´-Enden verknüpft, sodass eine Holliday-Struktur entsteht (Abbildung 12.29); die Verzweigungsstelle wandert nun und erzeugt so einen Heteroduplexbereich. Danach kann die Holliday-Struktur durch Isomerisierung zwei verschiedene Konfigurationen annehmen. Abhängig davon, welche der DNA-Stränge geschnitten und wieder verknüpft werden, sind die entstehenden getrennten Doppelstränge entweder rekombiniert oder nichtrekombiniert. Ein nichtrekombiniertes Molekül enthält Allele von beiden Seiten der Crossing-over-Stelle, die alle vom ursprünglichen DNA-Molekül stammen, während bei einem rekombinierten Molekül die Allele „links“ von der Crossing-over-Stelle von dem einen DNA-Molekül und die Allele „rechts“ von dem anderen abgeleitet sind.

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Prüfungsfragen

1. a; 2. c; 3. b; 4. a; 5. d; 6. d; 7. a; 8. c; 9. d; 10. c; 11. b; 12. c; 13. a

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13

Regulation des eukaryotischen Zellzyklus

Verständnisfragen

1. Das unidirektionale und irreversible Durchlaufen des Zellzyklus wird durch den Abbau spezifischer Proteine zu entscheidenden Zeitpunkten dieses Zyklus bewerkstelligt. Beispiele dafür sind die Proteolyse des Anaphase-Inhibitors zu Beginn der Anaphase, die Proteolyse von Cyclin B in der späten Anaphase und die Proteolyse des S-Phasen-Cdk-Inhibitors zu Beginn der S-Phase. Die Proteine werden von einem Multiproteinkomplex abgebaut, den man als Proteasom bezeichnet. Dieser Abbau wird auch durch Anlagerung zahlreicher Moleküle Ubiquitin an mindestens einen Lysinrest des Zielproteins eingeleitet. Der APC- Komplex polyubiquitinyliert sowohl den Anaphase-Inhibitor als auch Cyclin B. Der S-Phasen-Cdk-Inhibitor wird über den Cdc34-Weg polyubiquitinyliert.

2. Der wee-Phänotyp der Hefe S. pombe bildet kleinere Zellen als normal. Die Ursache des Phänotyps ist ein vorschneller Eintritt in die Mitose, bevor die Zelle die Größe erreicht hat, bei der normalerweise das Signal zur Zellteilung ausgelöst wird. Wee-Zellen entstehen aufgrund einer Überaktivität der cylinabhängigen Kinase Cdc2 des MPF von S. pombe. Die erhöhte Cdc2-Aktivität kann die Folge einer Mutation im cdc2- Gen sein (die Folge ist eine Unempfindlichkeit gegenüber Wee) oder im wee1-Gen. Das wee1-Gen codiert eine Kinase, die Tyr-15 der Cdc2-Kinase phosphoryliert. Das Vorhandensein einer Phosphatgruppe an dieser Aminosäure hemmt die Cdc2-Aktivität, sodass eine Mutation im wee1-Gen diese Hemmung verhindert und es zu einer Überaktivität kommt. Andererseits kann ein Überschuss der Phosphatase Cdc25, die das Phosphat von Tyr-15 entfernt, auch zum wee- Phänotyp führen.

3. Für die Zellteilung ist eine sehr genaue Replikation der chromosomalen DNA erforderlich. Die Synthese der DNA erfolgt während der S-Phase, nachdem die Zelle START beziehungsweise den Restriktionspunkt durchlaufen hat. Die Phosphorylierung durch die S- Phasen- Cyclin- Cdks aktiviert Präreplikatio ns- komplexe, die bereits während der G 1 -Phase entstanden sind. Die Phosphorylierung setzt die DNA-Synthese in Gang und verhindert außerdem, dass sich weitere Präreplikationskomplexe bilden; auf diese Weise wird das Genom bei jedem Zellzyklus nur ein einziges Mal repliziert. Wenn die Chromosomen Brüche aufweisen, verhindert ein G 2 -Kontrollpunkt, dass die Zelle in die Mitose eintritt.

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Während der M-Phase regulieren Cdk-Cyclin-Komplexe den Ablauf der Mitose, die Kondensation der Chromosomen, die Spindelbildung und das Anheften der Chromosomen an die Mikrotubuli der Spindel. Wenn die Zelle erkennt, dass diese Reaktionen korrekt durchgeführt wurden, aktivieren mitotische Cdk-Komplexe den Anaphase-stimulierenden Komplex (APC), der den Anaphase-Inhibitor und schließlich auch die mitotischen Cdk-Komplexe angreift, sodass sie letztendlich zerstört werden.

In der anschließenden G 1 -Phase werden zuerst die Präreplikationskomplexe und der APC wieder zusammengebaut, allerdings noch in inaktiver Form. Auch gibt es in der G 1 -Phase einen weiteren Kontrollmechanismus, um die Integrität der DNA festzustellen, damit beschädigte DNA nicht repliziert wird.

4. Einige Proteine des Zellzyklus führen ihre Funktion bei der Regulation des Zellzyklus aus, wenn sie phosphoryliert sind, andere sind im dephosphorylierten Zustand aktiv. Zu ersteren gehören der Anaphase-stimulierende Komplex (APC), Cdc2 von S. pombe (das Protein ist nur aktiv, wenn Threonin-161 phosphoryliert ist, nicht aber, wenn zusätzlich noch Tyrosin-15 eine Phosphatgruppe trägt) und die Lamine, die im phosphorylierten Zustand depolymerisieren. Die Phosphorylierung von Rb führt zur Dissoziation des Transkriptionsfaktorheterodimers Rb-E2F, sodass E2F freigesetzt wird und die Transkription von Genen unterstützt, die für den Eintritt in die S-Phase erforderlich sind. Bei einer Variante dieses Mechanismus wird der S-Phase-Inhibitor SicI durch den cdc34-Weg nur dann zum Abbau markiert, wenn SicI phosphoryliert ist; dadurch wird die DNA-Synthese in Gang gesetzt.

Für die erneute Bildung der Kernhülle nach der Mitose ist die Dephosphorylierung der Lamine erforderlich. Die Dephosphorylierung der inhibitorischen Bereiche in der leichten Myosinkette ermöglicht das Einsetzten der Cytokinese. Die Dephosphorylierung von Tyrosin-15 im zweifach phosphorylierten Cdc2-Protein durch Cdc25 aktiviert Cdc2.

5. Nach dem START-/Restriktionspunkt in G 1 treten die Zellen in die S-Phase ein, selbst wenn Induktoren wie Nährstoffe, Mitogene oder Wachstumsfaktoren entfernt werden.

Prüfungsfragen

1. b; 2. d; 3. a; 4. a; 5. a; 6. d; 7. c; 8. b; 9. c; 10. d; 11. d

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14

Genregulation bei Entwicklungsvorgängen

Verständnisfragen

1. Ein häufiges Verfahren, um bei Modellorganismen Entwicklungsvorgänge zu analysieren, ist die Erzeugung von Mutanten dieses Organismus, die man dann in Hinblick auf eine veränderte Entwicklung untersucht. So kann man beispielsweise nach Mutanten von Arabidopsis mit veränderten Blüten suchen. Hat man eine solche Mutante identifiziert, ist davon auszugehen, dass mindestens ein Gen für die Blütenentwicklung mutiert ist. Der nächste Schritt ist die Klonierung des mutationsdefinierten Gens sowie die Bestimmung des mRNA-Expressionsmusters und der räumliche Verteilung der codierten Proteine in den verschiedenen Regionen des Organismus. Mit dieser Analyse lässt sich feststellen, in welchen Teilen des Organismus das klonierte Gen aktiv ist.

Da eine solche genetische Vorgehensweise nicht bei allen Organismen anwendbar ist, kann man auch mit einem klonierten Gen beginnen, von dem bekannt ist, dass es bei anderen Organismen die Entwicklung beeinflusst, und dann das homologe Gen in einem neuen Organismus suchen. Dies ist ein häufiges Verfahren für die Untersuchung der Entwicklung beim Menschen.

2. Der Drosophila-Embryo ist vor dem Blastulastadium ein Syncytium. Vor dem Blastulastadium kommt es bereits zu ersten Ereignissen der Musterbildung, die auf der Diffusion von RNAs und Transkriptionsfaktoren beruhen, sodass schließlich die Gradienten der Morphogene entstehen. Der gereifte Myotubus ist ebenfalls ein Syncytium. In beiden Zellen sind Transkription und Translation nicht kompartimentiert, sodass Faktoren frei zu ihrem Wirkungsort diffundieren können.

3. MCM1 ist ein Faktor, der bei der Paarungstypkonversion der Hefe eine Rolle spielt; der Faktor bindet an die P-Box in den URS-Sequenzen und erhöht die Transkription a-spezifischer Gene. MEFs sind Proteine, die bei der Entwicklung der Skelettmuskulatur von Bedeutung sind; sie binden an eine muskelspezifische Enhancer-Sequenz und treten mit MRFs In Wechselwirkung, um die Gen- transkription im Muskel zu unterstützen. APETELA-1 (Gen der A-Klasse) und AGAMOUS (Gen der C-Klasse) sind MADS-Box-Proteine, die möglicherweise die Transkription von Blütengenen regulieren.

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4. A-B-Doppelmutanten: eine Blüte mit vier Wirteln, die aus Fruchtblättern, Fruchtblättern, Fruchtblättern, Fruchtblättern bestehen. B-C-Doppelmutante: eine Blüte mit vier Wirteln, die aus Staubblättern, Staubblättern, Staubblättern, Staubblättern bestehen. A-C-Doppelmutante: Blätter, Kronblätter/Staubblätter- Hybride, Kronblätter/Staubblätter-Hybride, neues Primordium (dies entsteht durch den Verlust der C-Funktion und führt zu einer mehrfachen Struktur-wiederholung).

5. Bei der Hefe unterdrücken die SIN-Genprodukte, die Teil des Chromatins sind, die HO-Transkription und die Paarungstypkonversion, möglicherweise durch Stabilisierung der regulatorischen HO-Region in einer Konfiguration, welche die Bindung von Transkriptionsfaktoren verhindert. Bei Säugetieren können MyoD, Myf5 und Myogenin das Chromatin umstrukturieren, sodass die Muskelgene für Transkriptionsfaktoren zugänglich werden. Bei Drosophila wird die Expression der Hox-Gene durch zwei Klassen von Genen reguliert, welche die Chromatinstruktur beeinflussen: die bithorax-Gruppe und die polycomb-Gruppe. Polycomb-Proteine binden an mehrere chromosomale Positionen und inaktivieren das Chromatin, das bei Genen des Entwicklungsblockes die Transkription verhindert. Trithorax-Proteine sind für die Aufrechterhaltung der Transkriptionsaktivität von homöotischen Genen notwendig.

6. Id verhindert die Heterodimerisierung von MyoD-E2A, die für die Aktivierung der Transkription von Muskelgenen und die Muskelentwicklung erforderlich ist. Id verhindert diese Heterodimerisierung, da es an MyoD und E2A bindet und so deren Wechselwirkung untereinander blockiert. EMC ist in der Funktion analog zu Id, da es sich an Ac- und Sc-Proteine bindet und so deren Assoziation mit Da und die Aktivierung von nervenzellspezifischen Genen verhindert.

Prüfungsfragen

1. a; 2. c; 3. b; 4. a; 5. a; 6. b; 7. d; 8. b; 9. b; 10. d; 11. a; 12. b; 13. d; 14. d

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15

Transport durch Zellmembranen

Verständnisfragen

1. Der K m -Wert sollte etwa 1 mM betragen. Bei K m = 10 -6 M wäre der Glucosetransporter über den gesamten Konzentrationsbereich von 3-7 mM Glucose im Blut mit gebundener Glucose vollkommen abgesättigt. Bei K m = 1 mM kommt es zu einer vergleichsweisen geringen Abnahme der Glucose-aufnahme, wenn man keine Nahrung zu sich nimmt. Bei Nahrungszufuhr ist noch eine gewisse Geschwindigkeitssteigerung der Glucoseaufnahme möglich. Der K m -Wert für den GLUT1-Glucosetransport in der Erythrocytenmembran beträgt 1,5 mM.

2. Steroidhormone sollten wie Lipide erwartungsgemäß biologische Membranen leicht durchdringen und sich darin lösen. Sie können deshalb mit einem intrazellulären Rezeptorprotein in Wechselwirkung treten, aber auch mit einem Rezeptor an der Zelloberfläche. In der Natur sind Steroidhormonrezeptoren cytosolische, wasserlösliche Proteine. Im Gegensatz dazu müssen Hormone, welche eine Membran nicht durchdringen können, mit einem Zelloberflächen-rezeptor interagieren. Sie können nicht zu einem intrazellulären Rezeptorprotein gelangen.

3. Membrantransportproteine transportieren normalerweise hydrophile Substanzen durch biologische Membranen. Die Transmembranhelices der Transportproteine können miteinander assoziieren und so eine wässrige Domäne bilden, durch die Substanzen transportiert werden können, ohne dass sie der hydrophoben Umgebung der Membranlipide ausgesetzt sind.

4. Der Glucosetransport ist energetisch ungünstig, aber der Transport von Na + in die Zellen energetisch günstig. Die Konzentration von Na + innerhalb der Zelle ist im Vergleich zur Außenseite niedrig. Die Summe beider Transportvorgänge, die der Symport bewerkstelligt, besitzt netto einen Wert DG < 0, ist also energetisch günstig. Der Konzentrationsgradient für Na + wird durch die Na/K + -ATPase aufrechterhalten, die ATP als Energiequelle nutzt.

5. Für die Öffnung der Stomata ist der Einstrom von Wasser ausschlaggebend. Damit Wasser schnell eindringen kann, sind Wasserkanalproteine in den Plasmamembranen der Pflanzen notwendig.

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Prüfungsfragen

1. d; 2. a; 3. b; 4. a; 5. a; 6. d; 7. a; 8. b; 9. b; 10. d; 11. b; 12. d; 13. a

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Der Energiehaushalt der Zelle: Glykolyse, aerobe

Oxidation und Photosynthese

Verständnisfragen

1. Die PMK entsteht durch einen elektrischen und chemischen (Protonen-) Gradienten über der inneren Membran der Mitochondrien und der Thylakoidmembran der Chloroplasten. Wie ATP ist auch die PMK eine Energiespeicherform; die gespeicherte Energie kann durch die Aktivität der ATP-Synthase in ATP umgewandelt werden.

2. Neben der Energie, um die ATP-Sythese anzutreiben, liefert die PMK auch die Energie für verschiedene Proteine des aktiven Transports, die Substrate in die Mitochondrien hinein und Produkte wieder heraus bringen. Der OH - -Gradient, der aufgrund der Erzeugung der PMK durch den Elektronentransport entsteht, dient dem Transport von HPO 4 2- in die Matrix; der Beitrag von der PMK zum Spannungsgradienten begünstigt den Austausch von ADP gegen ATP.

3. Die O 2 -erzeugende Photosynthese nutzt die Energie des absorbierten Lichtes, um durch Elektronenübertragung auf Chinon die energiereiche oxidierte P + -Form des Reaktionszentrums Chlorophyll zu erzeugen. Dieses wiederum entfernt Elektronen aus H 2 O, das ein schwacher Elektronendonor ist. Die Elektronen werden dann entlang einer Elektronentransportkette weiterbewegt, die gespeicherte Energie wird in andere Formen umgewandelt und dient in weiteren Reaktionen der ATP-Synthese und Kohlenstofffixierung. O 2 wird in den folgenden Schritten dieses Reaktionsweges nicht verwendet und ist deshalb ein Nebenprodukt beim Entfernen der Elektronen aus dem Wassermolekül.

4. Die Reaktionen des Calvin-Zyklus werden wahrscheinlich in der Dunkelheit inaktiviert, um das ATP zu konservieren, das für die Synthese anderer zellulärer Moleküle notwendig ist. Der Inaktivierungsmechanismus hängt vom jeweiligen Enzym ab; Beispiele sind die pH-abhängige und Mg 2+ -abhängige Enzym-regulierung sowie die reversible Reduktion/Oxidation von Disulfidbrücken in bestimmten Enzymen des Calvin-Zyklus.

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Prüfungsfragen

1. c; 2. b; 3. d; 4. d; 5. b; 6. b; 7. d; 8. b; 9. c; 10. b; 11. d; 12. c; 13. d; 14. a

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Proteinsortierung bei der Biogenese von Organellen

und bei der Proteinsekretion

Verständnisfragen

1. Ohne Signal- oder Zielsequenz bleiben Proteine in dem Kompartiment, in dem sie synthetisiert wurden, beispielsweise im Cytosol, in der Matrix der Mitochondrien oder im Stroma der Chloroplasten. Dabei ist zu beachten, dass Proteine mit niedrigem Molekulargewicht, die im Cytosol synthetisiert wurden, durch die Kernporen in den Zellkern diffundieren können, ohne dass eine Signal- oder Zielsequenz erforderlich ist.

2. Der Import von Proteinen in Chloroplasten, Mitochondrien und Peroxisomen erfolgt posttranslational, während der Import in das ER während der Translation stattfindet. Beim ER-Transport erfolgt jegliche Einwirkung von Proteinen der Chaperonklasse auf der Lumenseite des ER. Bei der Hefe, jedoch nicht in tierischen Zellen sind Chaperone (hsp70) aktiv am cotranslationalen Import in das ER beteiligt. Beim Proteinimport in Chloroplasten und Mitochondrien spielen Chaperone im Cytosol ebenfalls eine Rolle, indem sie ein Protein während des Imports und dann im Lumen des Organells in einer gestreckten Form stabilisieren, wobei sie möglicherweise die Translokation antreiben und auch zu einer korrekten Faltung des Proteins beitragen. Peroxisomale Proteine werden in gefaltetem Zustand importiert; hier haben Chaperone keine Bedeutung.

3. Ein solcher Beweis findet sich im Abschnitt „Polypeptide wandern durch das Translocon in das ER-Lumen" (S. 757-759). Der entscheidende experimentelle Hinweis war dabei, dass sich die naszierende Proteinkette mit TRAM und dem Sec61-Komplex chemisch quervernetzen ließ. Durch eine Folge von genetischen und biochemischen Experimenten konnte man zeigen, dass der Sec61-Komplex den eigentlichen Translocon-Kanal bildet.

4. Da das Protein Disulfidbrücken enthält, muss es vom Cytosol in das ER transportiert worden sein, wo sich die Disulfidbrücken bilden. Da das Protein keine hydrophoben Abschnitte enthält, die für membrandurchspannende a-Helices charakteristisch sind und auch nicht die Möglichkeit besteht, dass das Protein einen GPI-Anker besitzt, ist es wahrscheinlich kein Membranprotein. Wenn das Protein über einen GPI-Anker

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verfügen würde, befände es sich wahrscheinlich an der Zelloberfläche. Andererseits ist es aufgrund der verfügbaren Daten ein lösliches Protein, das entweder innerhalb eines sekretorischen Organells (ER, Golgi-Apparat, Transportvesikel oder Lysosom) vorkommt oder in die extrazelluläre Flüssigkeit freigesetzt wurde.

5. Kohlenhydratgruppen können antigen sein und deshalb eine Immunreaktion auslösen, was zu gravierenden Gesundheitsstörungen führen kann. Wenn Proteine bestimmte exponierte Kohlenhydrate enthalten, wie beispielsweise Galactose oder Mannose, werden sie schnell aus dem Blut entfernt, indem sie sich an zuckerspezifische endocytische Rezeptoren binden. Es kann auch sein, dass sich das Protein ohne die normale beziehungsweise vollständige Glykosylierung nicht korrekt faltet und deshalb der „Qualitätskontrolle“ im Sekretionsweg unterliegt.

6. Dies stellt man sich so vor, dass die Vesikel sowohl Membrankomponenten als auch lösliche Lumenproteine innerhalb des Golgiapparats in retrograder Richtung transportieren – also von der trans- über die mediale zur cis-Seite des Golgi- Apparats sowie von cis-Golgi zurück in das raue ER.

7. Wahrscheinlich ist die Eintrittsstelle in ein saures Endosom. An der Zelloberfläche herrscht normalerweise ein neutraler pH. Nur wenn das Virus von der Zelle aufgenommen wurde und in das saure Endosom gelangt ist, wird das HA- Fusionsprotein durch den sauren pH-Wert aktiviert.

Prüfungsfragen

1. b; 2. c; 3. a; 4. d; 5. d; 6. c; 7. b; 8. d; 9. a; 10. c; 11. d; 12 b; 13. a; 14. c

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Zellbewegung und Zellgestalt I: Mikrofilamente

Verständnisfragen

1. Actinfilamente können zur Zellbewegung durch Actinpolymerisierung beitragen oder, indem sie als Transportschienen für andere zelluläre Bestandteile dienen. Die Actinpolymerisierung kann als Kraft wirken, die eine Bewegung hervorruft. Die Actinpolymerisierung ist wichtig für die Ausdehnung des Leitsaums von sich bewegenden Zellen, für die Acrosomenreaktion im Sperma von Echinodermen sowie bei intrazellulären Bewegungen bestimmter infektiöser Bakterien und Viren. Actinfilamente unterstützen auch die Bewegung von Nicht-Muskelzellen, indem sie als Bahnen fungieren, entlang derer verschiedene motorische Myosine Vesikel und andere Actinfilamente transportieren. Beispiel für diese Art von Bewegung sind der vesikuläre Transport während der Sekretion und beim axonalen Transport, die Strömung des Cytoplasmas bei Algen, die Kontraktion des Adhäsionsgürtels, wodurch die Zellform geändert wird, das Zusammenziehen des kontraktilen Rings bei der Cytokinese, die Regulierung der Cortexspannung und die Cortexkontraktion bei der Zellbewegung.

2. Aufgrund der großen Zahl von Proteinen, die mit Actinfilamenten interagieren, können Actinfilamente mit identischer Struktur und Zusammensetzung an verschiedenen Vorgängen innerhalb desselben Cytoplasmas mitwirken. Zu den Proteinen gehören quervernetzende Proteine, membranbindende Proteine, motorische Myosinproteine, den Zusammenbau von Untereinheiten regulierende Proteine, Filamentfragmentierungsproteine und Filament-Capping-Proteine.

3. Alle Arten von Myosin bestehen aus einer oder zwei schweren und mehreren leichten Ketten. Die schweren Kette enthalten jeweils eine verwandte Kopfdomäne, die aus der Hydrolyse von ATP Energie gewinnen kann, um sich zum Plus-Ende eines Actinfilaments zu bewegen. Für jede Art von Myosin kann es mehrere leichte Ketten geben, aber alle assoziieren mit der Halsregion, die sich direkt an die Kopfdomäne anschließt. Die verschiedenen Myosintypen unterscheiden sich primär durch verschiedene Schwanzdomänen, welche die spezifische Zellkomponente bestimmen, die ein Myosin erkennt und die sich dadurch relativ zu den Actinfilamenten bewegt.

4. Bei der Skelettmuskulatur beruht die Ca 2+ -abhängige Kontraktion auf vier Proteinen - Tropomyosin und den Troponinen C, I und T, die mit den dünnen

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Filamenten assoziieren. Troponin C bindet Ca 2+ und positioniert in Abhängigkeit von der cytosolischen Ca 2+ -Konzentration Tropomyosin über Troponin T und I auf dem dünnen Filament, so dass bei niedriger Ca 2+ -Konzentration die Myosinbindungsstellen auf dem dünnen Filament blockiert oder bei hoher Ca 2+ - Konzentration freigelegt werden. So kann das Myosin im dicken Filament bei hoher Ca 2+ -Konzentration mit dem dünnen Filament interagieren und am dünnen Filament entlangwandern, so dass es zu einer Kontraktion kommt. In der glatten Muskulatur kann Ca 2+ die Kontraktion nach einem von zwei Mechanismen regulieren. Der erste Mechanismus gleicht dem bei der Skelettmuskulatur, allerdings übernimmt das Protein Caldesmon eine ähnliche Funktion wie die drei Troponine. Zudem kann die Proteinase C durch Phosphorylierung die Aktivität von Caldesmon beeinflussen. Beim zweiten Mechanismus reguliert die Ca 2+ -Konzentration die Myosinaktivität. Das kann entweder durch direkte Bindung von Ca 2+ an die regulatorischen leichten Ketten des Myosins oder eine Ca 2+ -abhängige Phosphorylierung der regulatorischen Ketten erfolgen. In beiden Fällen bewirkt ein Ansteigen der cytosolischen Ca 2+ - Konzentration eine Aktivierung der Myosinbewegung über die regulatorischen leichten Ketten.

Prüfungsfragen

1. d; 2. b; 3. b; 4. b; 5. d; 6. b; 7. a; 8. b: 9. c; 10. d; 11. b; 12. d; 13. c; 14. d; 15. c

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Zellbewegung und Zellgestalt II: Mikrotubuli und

Intermediärfilamente

Verständnisfragen

1. Die Polarität der Mikrotubuli beruht auf der Kopf-Schwanz-Assoziation von Heterodimeren aus a- und b -Tubulin. Dadurch entsteht am (-)-Ende ein Ring von a -Tubulin und am (+)-Ende ein Ring von b -Tubulin. In nichtpolarisierten tierischen Zellen sind die (-)-Enden normalerweise mit MTOCs assoziiert, und die (+)-Enden können sich bis in die peripheren Bereiche der Zelle erstrecken. In verschiedenen Zelltypen kommen auch andere Anordnungen vor, aber meistens sind die (-)-Enden mit den MTOCs assoziiert. Motorische Proteine der Mikrotubuli können die Polarität eines Mikrotubulus erkennen; ein spezifisches motorisches Protein transportiert dann seine „Fracht“ entweder an den (+)- oder an den (-)-Pol des Mikrotubulus.

2. Die MAP-Proteine sind die am besten untersuchten Proteine für die Regulation des Zusammenbaus von Mikrotubuli. Diese Proteine, die man in Typ I- und Typ II- MAPs einteilt, binden an Mikrotubuli; sie unterstützen deren Zusammenbau, verbessern die Stabilität und vernetzen Mikrotubuli manchmal zu Bündeln. Andere Proteine, die bei der Regulation des Zusammenbaus mitwirken, sind Katinin, das Mikrotubuli fragmentieren kann, sowie Op18, das die Häufigkeit des Mikrotubuliabbaus erhöht.

3. Die Zellanhangsorgane (Flagellen und Cilien), mit denen eine Zelle schwimmen kann, enthalten einen hoch organisierten Kern von Mikrotubuli und assoziierten Proteinen. Dieser Kernbereich, den man als Axonem bezeichnet, besteht normalerweise aus neun äußeren Doppelmikrotubuli und zwei zentralen Mikrotubulipaaren (die so genannte 9+2-Anordnung). Jedes äußere Dublett besteht aus einem 13- Protofilamente- und einem 10-Protofilamente-Mikrotubulus, während die zentralen Paare von Mikrotubuli jeweils 13 Protofilamente enthalten. Die Bewegung der Zelle beruht auf der Krümmung des Anoxems, die wiederum durch eine Kraft hervorgerufen wird, welche die Dyneine des Axonems erzeugen. Diese motorischen Proteine bewirken, dass die Mikrotubuli der äußeren Dubletts gegeneinander verschoben werden; diese Gleitbewegung wird aufgrund von Blockaden, die Vernetzungsproteine im Axonem erzeugen, in eine Verkrümmung umgewandelt;

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möglicherweise sind daran auch die Dyneine der inneren Arme beteiligt.

4. Der erste Schritt bei der Assoziation einer bipolaren Spindel ist die Trennung der duplizierten Centrosomen. Motorische Proteine der Mikrotubuli lagern sich aneinander und gleiten an überlappenden, entgegengesetzt orientierten Mikrotubuli entlang, die von jedem Centrosom ausgehen. Bei der Aneinanderlagerung kann ein zum (-)-Ende orientiertes KRP mitwirken, während bei der Gleitbewegung ein zum (+)-Ende orientiertes KRP beteiligt ist. Das Auseinandergleiten der Centrosomen kann auch vom cytoplasmatischen Dynein im Zellcortex unterstützt werden, das möglicherweise die Astralmikrotubuli „aufwickelt“. Nach Bildung der bipolaren Spindel strukturieren Dynein und/oder die KRPs in der Nähe der (-)-Enden der Spindelmikrotubuli die Spindelpole und stabilisieren die Befestigung der Pole an den Centrosomen. Motorische Proteine der Mikrotubuli an den Kinetochoren „fangen“ Mikrotubuli-(+)-Enden, die von den Spindelpolen ausgehen, indem sie (über Kinetochormikrotubuli) zwischen den Chromosomen und den Spindelpolen stabile Bindungen ausbilden; außerdem sind diese Proteine für die Positionierung der Chromosomen in der Metaphaseplatte von Bedeutung. Die Funktion der motorischen Proteine am Kinetochor während der Anaphase A ist noch umstritten. Es gibt Hinweise darauf, dass die Bewegung der Chromosomen zum Pol kein ATP erfordert, aber möglicherweise motorische Proteine daran beteiligt sind, die Befestigung des Kinetochors an depolymerisierenden Mikrotubuli aufrechtzuerhalten. Während der Anaphase B bewegen sich die Spindelpole auseinander; dies kann durch motorische Proteine erfolgen, die sich auf den überlappenden polaren Mikrotubuli auf die (+)-Enden zu bewegen, und/oder durch Zugkräfte von motorischen Proteinen der Astralmikrotubuli in Richtung auf das (-)-Ende am Zellcortex.

5. Der Abbau der verschiedenen Intermediärfilamente (Keratin, Vimentin, Lamin) wird durch Phosphorylierung eines Serinrestes in der N-terminalen Domäne induziert. Dies erfolgt normalerweise früh in der Mitose, und die Cdc2-Kinase katalysiert wahrscheinlich die Phosphorylierung. Der Abbau der cytoplasmatischen Intermediärfilamente erleichtert wahrscheinlich die Umstrukturierung des Cytoplasmas bei Mitose und Cytokinese, während der Abbau der Kernlamina zum Abbau der Kernhülle beiträgt. Das phosphataseabhängige Entfernen der Phosphatgruppe ermöglicht die erneute Assoziation der Filamente, wenn die Zellen aus der Mitose hervorgehen.

Prüfungsfragen

1. a; 2. d; 3. d; 4. b; 5. a; 6. d; 7. c; 8. d; 9. b; 10. d; 11. c; 12. c; 13. d; 14. a

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20

Signalübertragung zwischen Zellen: Hormone und

Rezeptoren

Verständnisfragen

1. Die Ligandenbindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren aktiviert das assoziierte trimere G-Protein, das daraufhin die Adenylatcyclase aktiviert, welche cAMP als intrazelluläres Sekundärsignal erzeugt. Die Bindung eines Liganden an den Rezeptor führt zu einer Konformationsänderung des Rezeptors. Dieser veränderte Rezeptor bindet sich so an das trimere G-Protein, dass GDP aus dem inaktiven GDP-G sa - Komplex entfernt wird. Die anschließende Bindung von GTP aktiviert das G-Protein. Dieser GDP-G sa -Komplex dissoziiert vom G b g -Komplex, bindet an die Adenylatcyclase und aktiviert das Enzym. Die Cyclase wandelt ATP in cAMP um. Die Aktivierung der Adenylatcyclase ist aufgrund der intrinsischen GTPase-Aktivität von G-Proteinen nur kurzfristig. Die Hydrolyse des an G sa gebundenen GTP zu GDP führt zur Reassoziation von G sa mit G bg und zur Inaktivierung der Adenylatcyclase (Abbildung 20.16).

2. Rezeptortyrosinkinasen (RTK) enthalten eine extrazelluläre Domäne zur Bindung von Liganden, eine einzige hydrophobe Transmembrandomäne und eine cytosolische Domäne, die einen Bereich mit einer Proteinkinaseaktivität enthält. Die Bindung des Liganden an den Rezeptor führt bei vielen RTKs zu einer Dimerisierung. Die Proteinkinase von jedem Rezeptormonomer phosphoryliert daraufhin spezifische Tyrosinreste in der cytosolischen Domäne des anderen Rezeptormoleküls im Dimer; diesen Vorgang bezeichnet man als Autophosphorylierung. Dabei ist der erste Schritt die Phosphorylierung von Tyrosinen in einem Bedreich nahe dem katalytischen Zentrum, das man als „Phosphorylierungslippe“ bezeichnet. Dies erleichtert die Bindung von ATP oder Proteinsubstraten. Beim zweiten Schritt werden andere cytosolische Bereiche phosphoryliert, die als Bindungsstellen für andere Proteine dienen. Cytosolische Phosphotyrosine treten über SH2-Domänen mit dem Adapterprotein GRB2 in Wechselwirkung. GRB2 interagiert mit Sos, das wiederum mit Ras wechselwirkt. Ras ist ein intrazelluläres GTPase-Schalterprotein, das zwischen einer inaktiven Form mit gebundenem GDP und einer aktiven GTP-Form wechselt. Für den Ras-Zyklus ist die Unterstützung durch einen Guaninnucleotidaustauschfaktor (GEF) und ein GTPase-aktivierendes Protein (GAP) erforderlich. Die Bindung von Sos, das als GEF fungiert, an das inaktive Ras-Protein

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verändert die Konformation von Ras, sodass GDP freigesetzt und GTP gebunden wird. Das aktivierte Ras induziert dann eine Kinasekaskade, die schließlich zur Aktivierung der MAP-Kinase führt (Abbildungen 20.22 und 20.23).

3. Die Bindung von Liganden an bestimmte G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GCRP) und Rezeptortyrosinkinasen (RTK) aktiviert die membranassoziierte Phospholipase C (PLC). Die Spaltung von membrangebundenem Phosphoinositid (PIP 2 ) durch die PLC führt zu 1,2-Diacylglycerin (DAG; dieses lipophile Molekül bleibt mit der Membran verbunden) und freiem Inosit-1,4,5-trisphosphat (IP 3 ), das in das Cytosol diffundieren kann. IP 3 bindet an ein Ca 2+ -Kanalprotein und induziert die Öffnung des Kanals, sodass Ca 2+ -Ionen aus dem Endoplasmatischen Reticulum (ER) in das Cytosol diffundieren können. Der Anstieg des cytosolischen Ca 2+ -Spiegels führt dazu, dass Proteinkinase C an die cytosolische Seite der Plasmamembran bindet, wo das Enzym von dem membranassoziierten DAG aktiviert werden kann. Die aktivierte Proteinkinase C löst dann eine Reihe verschiedener zellulärer Reaktionen aus. Ein nachhaltiger Anstieg der Ca 2+ -Konzentration durch IP 3 erfordert auch die Öffnung von Ca 2+ -Kanälen in der Plasmamembran, die man als speicherregulierte Kanäle (SOC) bezeichnet. Der Anstieg der Ca 2+ -Konzentration erfolgt nur temporär, da Ca 2+ -ATPasen in der Plasma- und ER-Membran Ca 2+ aktiv aus dem Cytosol an die Zellumgebung beziehungsweise in das ER-Lumen transportieren. Außerdem wird IP 3 schnell zum 1,4-Bisphosphat hydrolysiert, das die Ca 2+ -Freisetzung aus dem ER nicht stimuliert (Abbildung 20.39).

Prüfungsfragen

1. b; 2. c; 3. a; 4. c; 5. b; 6. a; 7. d; 8. c; 9. a; 10. d; 11. b; 12. c; 13. d

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21

Nervenzellen

Verständnisfragen

1. Nervenzellen übertragen Signale entlang der Axons durch das unidirektionale Fortschreiten einer temporären elektrischen Störung, die man als Aktions-potenzial bezeichnet. Das Aktionspotenzial beruht auf der aufeinanderfolgenden Öffnung von spannungsregulierten Na + - und K + -Kanälen, sodass ein begrenzter Bereich der Plasmamembran zuerst depolarisiert und dann repolarisiert wird. Das Aktionspotenzial ist gerichtet, da sich die spannungsregulierten Na + -Kanäle zeitlich abgestimmt schließen. Wenn das Aktionspotenzial das Ende des Axons erreicht, können in Abhängigkeit von der Beziehung zwischen präsynaptischer und postsynaptischer Zelle zwei verschiedene Mechanismen einsetzen. Wenn eine elektrische Synapse die beiden Zellen verbindet, wandert das Aktions-potenzial von der präsynaptischen Zelle als Membrandepolarisierung weiter, da Ionen durch die gap junctions zur postsynaptischen Zelle gelangen können. Wenn eine chemische Synapse die beiden Zellen verbindet, wandelt die präsynaptische Zelle das elektrische Signal (das Aktionspotenzial) durch die ausgelöste Freisetzung von Neurotransmittern in den synaptischen Spalt in ein chemisches Signal um. Die Rezeptoren der postsynaptischen Zelle erkennen die Neurotransmitter, und das chemische Signal wird wieder in ein elektrisches Signal umgewandelt, indem sich regulierte Ionenkanäle in der postsynaptischen Zelle öffnen.

2. Myelin ist ein Bereich einer spezialisierten Plasmamembran, die von Gliazellen stammt und die Axons der Wirbeltiere umgibt. Myelin verhindert die Bewegung von Ionen zwischen dem axonalen Cytosol und der extrazellulären Flüssigkeit, umhüllt aber das Axon nicht auf seiner gesamten Länge. Nichtmyelierte Bereiche, die man als Knoten bezeichnet, kommen entlang des Axons in bestimmten Intervallen vor; die Proteine, welche die Ionenbewegung durch die Membran steuern, kommen in diesen Knoten gehäuft vor. Bei myelierten Axons springt das Aktionspotenzial zwangsläufig von einem Knoten zum nächsten, da die große Zahl von Ionen, die bei der Depolarisierung an einem Knoten beteiligt sind, sich schnell ohne Abschwächung zum nächsten Knoten ausbreiten kann. Die Myelinierung bewirkt also eine schnellere Bewegung des Aktionspotenzials und kann auch den Durchmesser der Nervenzelle verringern, der für die Übertragung des Aktionspotenzials mit einer bestimmten Geschwindigkeit notwendig ist. Nervenkrankheiten wie beispielsweise Multiple Sklerose stehen im Zusammenhang mit dem Verlust des Myelins und der

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anschließenden Verringerung der Aktionspotenzialgeschwindigkeit.

3. Acetylcholin kann erregend (exzitatorisch) oder hemmend (inhibitorisch) wirken, da es mehr als nur einen Typ des Acetylcholinrezeptors mit einer stromabwärts wirkenden Signalkaskade gibt. Acteylcholin wirkt exzitatorisch, wenn auf der postsynaptischen Zelle nicotinische Acetylcholinrezeptoren vorhanden sind. Diese Rezeptoren sind ligandengesteuerte Na + - und K + -Kanäle, die sich durch die Ligandenbindung öffnen, sodass ein Einstrom von positiven Ionen erfolgt. Dieser führt zu einer Depolarisierung der Membran, die ein Aktionspotenzial hervorruft. Die Stimulierung der Skelettmuskelkontraktion ist ein Beispiel für diesen Signalweg. Im Gegensatz dazu wirkt Acetylcholin inhibitorisch, wenn muskarinische Acetylcholin- Rezeptoren auf der post-synaptischen Zelle vorhanden sind. Dabei aktiviert die Bindung von Acetylcholin an einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor eine Signalkaskade, die zur Öffnung von K + -Kanälen und zur Hyperpolarisierung der Membran führt, sodass das Auslösen eines Aktionspotenzials weniger wahrscheinlich wird. Das Absinken der Herzfrequenz ist ein Beispiel für diesen Signalweg.

4. Die Lichtwahrnehmung erfordert einen Rezeptor, der ein Lichtphoton absorbieren kann, während die Geruchswahrnehmung über Rezeptoren erfolgt, die für einen bestimmten Duftstoff spezifisch sind. Es gibt vier Typen von Lichtrezeptoren und etwa 1000 Typen von Geruchsrezeptoren. Bei beiden Gruppen jedoch gehören die Rezeptoren zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, sodass die Reizwahrnehmung zur Aktivierung einer Signalkaskade führt, die durch G-Proteine reguliert wird. Im Dunkeln enthalten die Zellen der Lichtwahrnehmung (Stäbchen und Zapfen) den second messenger cGMP, der ligandengesteuerte Na + -Kanäle offen hält. Diese Zellen sind also depolarisiert und setzen in der Abwesenheit von Licht kontinuierlich Neurotransmitter für postsynaptische Zellen frei. Die Aufnahme von Photonen aktiviert den G-Protein-Signalweg, der den Abbau von cGMP, das Schließen der Na + -Kanäle sowie die Hyperpolarisierung der Membran auslöst und das Aussenden von Signalen an die postsynaptische Zelle beendet. Letzteres wird als Licht-wahrnehmung interpretiert. Im Gegensatz dazu haben ruhende Geruchs- rezeptoren ein ähnliches Membranpotenzial wie die meisten anderen Nervenzellen und senden in Abwesenheit eines Geruchstoffes keine Signale an die postsynaptischen Zellen. Nach der Bindung eines Liganden an den Rezeptor aktiviert das gekoppelte G-Protein die Erzeugung eines second messengers (cAMP), der sich an ligandengesteuerte Kationenkanäle in der Plasmamembran bindet und diese öffnet. Der Einstrom positiv geladener Ionen in die Zelle depolarisiert die Membran, sodass ein Aktionspotenzial entsteht und es schließlich zur Signalübertragung an die postsynaptische Zelle kommt; dies wird dann als Wahrnehmung eines bestimmten Geruchs interpretiert.

Prüfungsfragen

1. d; 2. d; 3. a; 4. c; 5. b; 6. c; 7. b; 8. b; 9. a; 10. d; 11. a; 12. c; 13. c; 14. b

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Integration von Zellen in Geweben

Verständnisfragen

1. Zwischen Zellen desselben Typs kommt es zu homophiler Adhäsion („Gleiches bindet Gleiches“), zwischen Zellen unterschiedlicher Typen zu heterophiler Adhäsion. Als Ursache für die Clusterbildung („Reißverschlussbildung“) von Cadherinen in speziellen Adhäsionsstellen (beispielsweise Gürteldesmosomen und Desmosomen) hat man zwei mögliche Wechselwirkungen postuliert: Kopf-an-Kopf und Seite-an- Seite. Seite-an-Seite-Wechselwirkungen sind für die Bildung von Cadherindimeren erforderlich, können aber auch bei der Cadherin-Clusterbildung eine Rolle spielen. Kopf-an-Kopf-Wechselwirkungen treten zwischen Cadherindimeren in benachbarten Zellmembranen auf.

2. Die Ca 2+ -Konzentration im Cytosol ist mit weniger als 10 -6 M gering, während die extrazelluläre Ca 2+ -Konzentration normalerweise im millimolaren Bereich liegt. Die Erhöhung des Ca 2+ -Spiegels führt zu einer Konformationsänderung in den gap junctions, sodass sich der Kanal schließt. Dies verhindert das Ausströmen von kleinen Molekülen des Zellinhalts benachbarter Zellen, wenn eine Zelle der vernetzten Zellschicht beschädigt wird.

3. Kollagen ist ein Glykoprotein, während Cellulose ein Zuckerpolymer (aus Glucose) ist. Die Kollagensynthese beginnt wie bei anderen sezernierten Proteinen im ER und findet ihre Fortsetzung mit einer Reihe von sekundären Modifikations- und Polymerisationsreaktionen (Trimerbildung) im ER sowie mit weiteren Modifikationen im Golgi- Apparat. Am N- und C- Terminus werden Peptide entfernt. Die Polymerisierung des Kollagens in großer Menge erfolgt dann außerhalb der Zelle, genauso die Kollagenquervernetzung. Cellulose wird von einem Enzym an der Zelloberfläche aus Glucose synthetisiert; Synthese und Polymerisation der Cellulose finden vollständig außerhalb der Zelle statt.

4. Proteoglykane weisen ein sehr hohes Verhältnis von Kohlenhydraten zu Protein auf. Die Grundstruktur von Proteoglykan besteht aus einem Kernprotein, das durch mehrere „Linker“ aus je drei Zuckermolekülen modifiziert ist, an denen Glykosaminoglykane (GAG) wie beispielsweise Heparansulfat befestigt sind. GAGs sind lange lineare Wiederholungspolymere von spezifischen Disacchariden. Anzahl, Länge und Zusammensetzung der GAG-Ketten, die an jedem Kernprotein befestigt

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sind, können variieren. Ein typisches Beispiel für solch eine Struktur ist das Aggrecan, bei dem die Proteoglykaneinheiten über das Kernprotein mit einem langen Molekül des Saccharids Hyaluronan verknüpft sind. Die Aggregation mit Hyaluronan ist spezifisch für das Aggrecan. Dadurch entsteht ein Makromolekül, das – einem Gel ähnlich – ein großen Volumen einnimmt und gegenüber Verformungen stabil ist. Dies ist für die Kräfteverteilung in belasteten Gelenken von grundlegender Bedeutung.

5. Zellen sind an der EZM befestigt, wodurch die Zellwanderung eingeschränkt ist. Die Aktivitäten von Proteasen wie beispielsweise Fibrinogen und matrixspezifischen Metalloproteinasen (MMP), die Matrixbestandteile abbauen, lockern die EZM auf und ermöglichen die Zellwanderung.

Prüfungsfragen

1. c; 2. d; 3. b; 4. a; 5. a; 6. d; 7. b; 8. a; 9. c; 10. c; 11. a; 12. b; 13. d

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Zell-Zell-Wechselwirkungen bei Entwicklungs-

vorgängen

Verständnisfragen

1. Im Prinzip kann ein induktives Signal entweder durch einen Gradienten oder durch das Auslösen einer Signalkaskade (Relais-Modell) wirken. Experimente mit präparierten Neuralrohren vom Huhn zeigen, dass Hh über einen Gradienten wirkt. Wenn man dem Präparat Hh in einer von vier Konzentrationen zusetzt, bildet sich einer von vier verschiedenen Zelltypen, das heißt, bei jeder Konzentration entsteht ein anderer Zelltyp. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass sich in vivo als Reaktion aufgrund eines ventral zu dorsal verlaufenden Hh-Konzentrationsgradienten verschiedene Zelltypen ausbilden. Der genaue Mechanismus, nach dem die Hh- Konzentration unterschiedliche Zellschicksale bestimmt, ist unbekannt. Untersuchungen in verschiedenen anderen Systemen liefern jedoch möglicherweise Hinweise darauf, wie Zellen auf verschiedene Konzentrationen eines Morphogens reagieren. So deuten beispielsweise Experimente mit Xenopus unter Verwendung von Activin, das zur TGFb-Familie gehört, darauf hin, dass Zellen auf die Anzahl der Rezeptoren reagieren, die von einem Liganden besetzt sind, und nicht auf den Anteil der besetzten Rezeptoren. Die Anzahl der besetzten Rezeptoren muss letztendlich in Veränderungen des Genexpressionsmusters übersetzt werden. Während über die Mechanismen nur wenig bekannt ist, durch die verschiedene Hh-Konzentrationen die Genexpression beeinflussen, hat es bei der Untersuchung der Mechanismen, durch die Drosophila-Zellen auf eine gradientenförmige Expression des Spaetzle-Faktors reagieren, große Fortschritte gegeben. Der Spaetzle-Faktor ist ein Ligand des Toll- Rezeptors, der die frühen Phasen der Musterbildung entlang der dorsolventralen Körperachse reguliert, wobei dorsal hohe und ventral niedrige Spaetzle- Konzentrationen herrschen. Die Expression spezifischer Gene wird durch Unterschiede in cis-aktiven Regulationsbereichen bestimmt. So enthalten beispielsweise verschiedene Zielgene Bindungsstellen für Dorsal, die unterschiedliche Affinitäten besitzen; Bereiche mit hoher Affinität fördern bei niedrigen Dorsal- Konzentrationen die Expression von Zielgenen, Stellen mit niedriger Affinität unterstützen eine Dorsal-abhängige Expression nur bei hoher Dorsal-Konzentration. Die Expression spezifischer Gene kann auch die Anzahl von cis-regulatorischen Bereichen und die Funktion zusätzlicher, in ihrer räumlichen Verteilung begrenzter Transkriptionsfaktoren widerspiegeln.

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2. Die Induktionsaktivität von Hh liegt in einem N-terminalen Polypeptidfragment von 20 kDa, das durch einen endoproteolytischen Mechanismus aus dem vollständigen Hh-Molekül mit 45 kDa entsteht. Nach der Endoproteolyse kommt es zur Anheftung eines Cholesterinmoleküls an das Carboxylende des 20 kDa-Fragments. Aufgrund der Hydrophobizität von Cholesterin ist Hh an der extrazellulären Seite der Plasmamembran befestigt. Die Befestigung an einer Membran über Cholesterin kommt nur bei wenigen anderen Proteinen vor. Der eigentliche Effekt dabei besteht darin, dass das induktive Fragment an der Zelloberfläche befestigt wird, sodass die Ausdehnung seiner induktiven Aktivität begrenzt ist.

3. Die drei Proteine CED-9, CED-4 und CED-3 besitzen Schlüsselfunktionen bei der Regulation der Apoptose während der normalen Entwicklung von C. elegans. Sie wirken als Regulator, Adapter beziehungsweise Effektor. Die pro-apoptotische Funktion von CED-4 wird direkt durch die anti-apoptotische Funktion von CED-9 unterdrückt. CED-3 ist eine Caspase, eine Cystein-protease, die Proteine selektiv an Stellen spaltet, welche C-terminal zu Aspartatresten liegen. CED-3 wird durch CED-4 aktiviert. Funktionsverlust-mutationen im ced-9-Gen führen zum Tod aller Zellen. Im Gegensatz dazu führen Funktionsverlustmutationen im ced-3- und ced-4- Gen zum Überleben von Zellen, die normalerweise durch den programmierten Zelltod absterben.

4. Man nimmt an, dass intermediäre Zielzellen Signale erzeugen, die Wachstumskegel an sich ziehen; die Wachstumskegel wandern entlang eines Lockstoffgradienten aufwärts zu ihrem Ziel. Sobald die Wachstumskegel an einer intermediären Zielzelle angekommen sind, müssen sie an einem umgekehrten Gradienten von der hohen zur niedrigen Konzentration des Lockstoffes entlang wachsen. Untersuchungen mit Netrinen lassen einen möglichen Mechanismus erkennen, der dieses Merkmal im Verhalten von Wachstumskegeln erklären könnte. Während ein Netringradient Axone aus Retinaganglionzellen in Gewebekultur anzieht, werden Wachstumskegel, die mit einem Inhibitor der cAMP-abhängigen Proteinkinase (cAPK) behandelt wurden, von Netrin abgestoßen. Aufgrund dieser Beobachtung lässt sich folgendes Modell postulieren: Nach Erreichen der Intermediärzielzellen sinkt der cAMP- Spiegel im Wachstumskegel, sodass die Reaktion auf den Lockstoff zur Abstoßung führt. Demnach wird das Signal, das ursprünglich als Lockstoff wirkte, aufgrund einer Veränderung in den zellinternen Signalwegen im Wachstumskegel in ein abstoßendes Signal umgewandelt.

Prüfungsfragen

1. d; 2. a; 3. c; 4. a; 5. b; 6. c; 7. a; 8. a; 9. d; 10.a; 11. c; 12. b

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Krebs

Verständnisfragen

1. Rezeptoren an der Zelloberfläche reagieren auf extrazelluläre Wachstumssignale und bringen diese Information durch Signalübertragungswege an ihre intra-zellulären Bestimmungsorte. Die Veränderung einer dieser Komponenten kann zur Onkogenese führen. Eine Veränderung von Rezeptoren (Mutation, Überxpression, ungeeignete subzelluläre Lokalisierung) kann eine konstitutive Empfindlichkeit gegenüber dem Liganden hervorrufen (im Gegensatz zu einem An-/Aus- Mechanismus). Auch bei Komponenten der Signalübertragungs-kaskade kann es zu solchen Veränderungen kommen. Ein häufiges Ergebnis all dieser Veränderungen ist die unregulierte Aktivität von Proteintyrosinkinasen oder die Phosphorylierung von neuen Substraten.

2. Funktionsgewinnmutationen wandeln Protoonkogene in Onkogene um oder verursachen eine Überexpression von Protoonkogenen. Diese Mutationen sind dominant, das heißt, dass die Veränderung in einem Allel für das Entstehen des Phänotyps ausreicht. Im Gegensatz dazu sind Funktionsverlustmutationen rezessiv, so dass beide Allele verändert werden müssen, um den Phänotyp hervorzurufen. Funktionsverlustmutationen treten in Tumorsuppressorgenen auf und verhindern so beispielsweise, dass Kontrollpunkte, die DNA-Reparatur, die Inhibition der Zellproliferation oder Apoptosemechanismen funktionieren. Eine Ausnahme ist das Tumorsuppressorgen p53, bei dem eine einzige Mutation für einen Funktionsgewinn ausreicht.

3. Die gegenwärtigen Vorstellungen von den genetischen Grundlagen bei der Krebsentstehung stellen Gene in den Mittelpunkt, die Zellwachstum und -teilung regulieren. Der „Kopf“ ist das Gen. Im Wildtypzustand sind Wachstum und Teilung stark reguliert; im mutierten Zustand ist das Protein, das von dem Gen erzeugt wird, geschädigt, es wird in größerer Menge synthetisiert, oder es hat eine höhere Aktivität als im Normalfall. Jede dieser Veränderungen kann die Kontrollpunkte und das Gleichgewicht in der Physiologie einer Zelle stören.

4. Die erhöhte Häufigkeit von Krebs im Alter lässt sich durch ein „Mehrfach-Treffer“- Modell erklären. Dabei führen aufeinanderfolgende Mutationen oder Veränderungen der Genexpression, die definierten Zuständen entsprechen, schließlich zur Entstehung

Lodish et al.: Molekulare Zellbiologie, 4. Aufl. - Lösungen

eines tödlichen Tumors. So enthalten beispielsweise viele Dickdarmtumoren Mutationen in den Tumorsuppressorgenen ACD, DCC und p53 sowie im ras-Gen. Die APC-Mutation, die zu einer Überexpression des myc-Gens führt, findet man in Polypen, die eine Vorform des Dickdarmkrebses darstellen, während für die Malignität eine p53-Mutation erforderlich ist. Bei Mäusen führt die Überexpression von myc oder die Expression von ras D nur nach einer langen Verzögerungsphase zu Krebs. Diese beiden Gene wirken jedoch synergistisch, sodass Mutationen in beiden Genen in einem Drittel der Zeit Krebs verursachen, als wenn nur ein Gen betroffen ist.

Prüfungsfragen

1. b; 2. c; 3. d; 4. c; 5. b; 6. c; 7. c; 8. d; 9. c; 10. d; 11. d