D. Voet, J.G.

Voet, Biochemie (deutsche Fassung): 14 Enzymatische Katalyse

14. Enzymatische Katalyse

1. Katalysemechanismen

Katalyse erhöht die Geschwindigkeit einer Reaktion, nicht aber deren Gleichgewicht. Die
katalytischen Mechanismen von Enzymen sind mit denen von chemischen Katalysatoren
identisch. Was Enzyme zu so wirksamen Katalysatoren macht, ist die Substratbindung und
die optimale Anordnung der katalytischen Gruppen.

1.1 Säure-Base-Katalyse

Allgemeine Säurekatalyse: Eine Brønsted-

Saure (kann Protonen abgeben) erniedrigt die
Freie Enthalpie des Übergangszustandes
durch partiellen Protonentransfer.
Allgemeine Basenkatalyse: Eine Brønsted-
Base (kann Protonen aufnehmen) erniedrigt
die Freie Enthalpie des Übergangszustandes
durch teilweise Deprotonierung.
Konzentrierte allgemeine Säure-Base-
Katalyse: Beide Prozesse laufen gleichzeitig
ab.
BSP: RibonucleaseA (Rnase A)
RNase A ist ein Verdauungsenzym, das die
Hydrolyse von RNA in ihre Nucleotid-
Bausteine bewirkt. Dabei sind zwei essentielle
His-Reste an der zweistufigen Reaktion
beteiligt:
1. His 12 zieht als Base ein Proton von
einer 2'-OH-Gruppe der RNA ab und
fördert damit den nucleophilen Angriff
auf das benachbarte Phosphoratom.
His 119 wirkt gleichzeitig als Säure
und unterstützt den Bruch der Bindung Abb. 14-3 S. 351
durch Protonierung der Abgangsgruppe.
2. Das 2',3'-cyclische Zwischenprodukt
wird hydrolysiert: Wasser ersetzt die
Abgangsgruppe. Dabei wirken His 12
als Säure und His 119 als Base.

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1.2 Kovalente Katalyse

Bei der kovalenten Katalyse wird vorübergehend eine kovalente Bindung zwischen
Katalysator und Substrat gebildet.

BSP: Decarboxylierung von Acetoacetat

Diese Reaktion wird von primären Aminen katalysiert:

Das Amin greift die Carbonylgruppe des Acetoacetats nucleophil an. Es entsteht eine Schiff-
Base (Iminbindung). Das protonierte Stickstoffatom der kovalenten Zwischenverbindung
wirkt elektronenentziehend und schwächt dadurch den energiereichen Enolat-Charakter des
Übergangszustandes.

Abb. 14-4 S. 352

Die Reaktion kann also in zwei Stadien unterteilt werden:

1. Nucleophiler Angriff des Katalysators auf das Substrat. → kovalente Bindung
1. Danach zieht der nun elektorphile Katalysator Elektronen aus dem Reaktions-
zentrum ab.

Man unterteilt die kovalente Katalyse in nucleophile Katalyse und elektrophile Katalyse, je
nachdem welcher dieser beiden Effekte die grössere Antriebskraft für die Reaktion darstellt
(den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt katalysiert).
→ Decarboxylierung von Acetoacetat ist eine elektrophil katalysierte Reaktion, da die
Bildung der Schiffbase nicht geschwindigkeitsbestimmend ist.

Achtung: Im Unterschied zur allgemeinen Basen-Katalyse wird bei der nucleophilen Katalyse
nicht ein Proton vom Substrat abgezogen, sondern der Katalysator greift das Substrat
nucleophil an und bildet so eine kovalente Bindung.

Ein guter kovalenter Katalysator muss folgende Eigenschaften haben:

1. hohe Nucleophilie (für den nucleophilen Angriff)
2. Fähigkeit zur Bildung einer guten Abgangsgruppe (damit die Reaktion weiterläuft)
Diese Eigenschaften beisitzen Gruppen mit hoher Polarisierbarkeit, also mit beweglichen
Elektronen.

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1.3 Metallionen-Katalyse

Hier gibt es zwei Klassen von Enzymen:

1. Metalloenzyme: enthalten festgebundene Metall-Ionen (meist Übergangsmetalle)
2. Metallionen-aktivierte Enzyme: binden schwach Metallionen aus Lösung (meist
Alkali- oder Erdalkalimetalle)

Funktion der Metall-Ionen:

1. Bindung an Substrate, bringen diese so in die richtige Konformation
1. vermitteln Redoxreaktionen durch die reversible Änderung ihres
Oxidationszustandes
2. gleichen negative Ladungen aus → Stabilisierung und Abschirmung

Ladungsstabilisierung:
Metall-Ionen wirken als Lewis Säuren, sind aber häufig viel
wirksamere Katalysatoren als Protonen, da sie bei neutralem
pH in hohen Konzentrationen vorliegen und Ladungen >+1
haben.
Bsp: Decarboxylierung von Dimethyloxalacetat (rechts) Reaktionsablauf S. 353

Metall-Ionen unterstützen die nucleophile Katalyse durch

Erhöhung des lonisierungsgrades des Wassers:
Metall-Ionen wirken in wässriger Lösung saurer, da
koordinierende Wassermoleküle leicht Protonen abgeben.
Die entstehende, an das Metall-Ion gebundene
Hydroxygruppe ist ein starkes Nucleophil.

Ladungsabschirmung:
Bsp: Kinasen brauchen nicht freies ATP, sondem ATP-
Komplexe mit Mg2+. Letzteres hat die Aufgabe die
negativen Ladungen der Phosphatgruppen abzuschirmen,
damit diese nicht die Elektronenpaare angreifender
Nucleophile abstossen.

1.4 Elektrostatische Katalyse

Die Bindung eines Substrates an das aktive Zentrum findet im allgemeinen in Abwesenheit
von Wasser statt. Daher ähnelt die lokale Dielektizitätskonstante im aktiven Zentrum
derjenigen in einem organischen Lösungsmittel, wodurch sich elektrostatische
Wechselwirkungen viel stärker auswirken als in wässrigen Lösungen.
Die Ladungen sind im Beriech des aktiven Zentrums so angeordnet, dass sie den
Übergangszustand der katalysierten Reaktion stabilisieren. (el.statische Katalyse)

Bei manchen Enzymen treten ausserdem spezifische Ladungsverteilungen auf, um polare

Substrate zu ihren Bindungsstellen hinzuleiten. Dies bewirkt, dass diese Reaktionen scheinbar
schneller ablaufen als diffusionskontrollierte Reaktionen.

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1.5 Katalyse durch Nachbargruppen und Orientierungseffekte

Damit eine Reaktion ablaufen kann, müssen die

Reaktanten in der richtigen räumlichen Beziehung
zueinander stehen: Sie müssen sich nahe sein, und Abb. 14-6 S.356
die richtige relative Orientierung haben.
Enzyme binden ihre Substrate derart, dass diese so
immobilisiert und ausgerichtet werden, dass
optimale Reaktivität erzielt wird.

1.6 Katalyse durch Bindung des Übergangszustandes

Dieser Katalyse-Mechanismus beruht darauf, dass das Enzym den Übergangszustand mit
grösserer Affinität bindet als das entsprechende Substrat oder Produkt. Dabei ist die
Geschwindigkeit einer katalysierten Reaktion relativ zur nichtkatalysierten umso grosser, je
fester das Enzym den Übergangszustand im Verhältnis zum Substrat bindet.
→ Stabilisierung des Übergangszustandes, dadurch dass im Überganszustand bessere
Wechselwirkungen zwischen Substrat und Enzym bestehen, als im Michaelis-Komplex.
→ Ein gutes Substrat bindet nicht notwendigerweise mit hoher Affinität an sein Enzym,
sondern erst nach der Aktivierung zum Übergangszustand.

Bindet ein Enzym bevorzugt an den Übergangszustand seines Substrates, kann man davon
ausgehen, dass Analoga des Überganszustandes starke kompetitive Inhibitoren des Enzyms
sind.
Bsp: Racemisierung von Prolin (katalysiert von Prolin-Racemase)

Reaktionsablauf S. 358

Prolin-Racemase wird kompetitiv durch die planaren Prolinanaloga Pyrrol-2-carboxylat und

∆-l-Pyrrolin-2-carboxylat gehemmt. Beide Substanzen binden mit 160fach höherer Affinität
an das Enzym als Prolin, da sie Analoga des Übergangszustandes sind.

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2. Lysozym (nicht behandelt)

Lysozym ist ein Enym, das β(1→4)-Bindungen zwischen N-Acetylmuraminsäure (NAM) und
N-Acetylglucosamin (NAG) spaltet.

... ─ NAG─NAM─NAG─NAM─NAG─NAM─... →(reduzierendes Ende)

A B C D E F

NAG-Oligosaccharide mit weniger als fünf Resten werden jedoch nur sehr langsam
hydroysiert, weil Lysozym das Oligosaccharid normalerweise so bindet, dass die Spaltung
zwischen den Resten D und E vollzogen wird.

Katalysemechanismus: Phillips-Mechanismus

Die Hydrolyse eines Glycosids stellt die Umwandlung eines Acetals in ein Halbacetal dar. Glu
35 und Asp 52 sind die katalytisch aktiven Reste im Lysozym:

1. Der Rest D wird in die Halbsessel-Konformation gezwungen, weil er sonst ungünstige

Kontakte mit dem Protein eingehen würde.

2. Glu 35 überträgt sein Proton auf O(1) im D-Ring (→ allgemeine Säurekatlyse).

Dadurch wird die C(1)-O(1)-Bindung gespalten, wobei ein resonanzstabilisiertes
Oxonium-Ion an C(1) gebildet wird.

3. Die ionisierte Carboxygruppe von Asp 52 trägt zur Stabilisierung des entstandenen
Oxonium-Ions durch ionische Wechselwirkungen bei (→ elektrostatische Katalyse).
Die ursprüngliche Konformation des D-Ringes (Halbsesselkonformation) ähnelt der
des Übergangszustandes (→ Katalyse durch Bindung des Übergangszustandes)

4. Nun dissoziiert zunächst der hydrolysierte E-Ring mit dem anhängenden

Polysaccharid vom Enzym, dann löst sich auch das D-Ring-Produkt mit dem daran
geknüpften Saccharid und das Enzym wir regeneriert.

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3. Serin-Proteasen

Serin-Proteasen sind eine Gruppe von proteolytischen Enzymen, die einen gemeinsamen
katalytischen Mechanismus besitzen, dessen Kennzeichen der Besitz eines besonders
reaktiven Ser-Restes ist. Sie katalysieren die Hydrolyse von Peptid-(Amid-)bindungen,
allerdings mit unterschiedlichen Spezifitäten in bezug auf die die Peptidbindung
flankierenden Reste.

BSP: Enym Funktion spaltet nach Rest

Subtilisin (bakteriell) ev. Verdauung gross, aromatisch
Trypsin Verdauung kationisch (Arg, Lys)
Elastase Verdauung klein und unpolar (v.a. Ala)
Thrombin Blutgerinnung Arg oder Lys

3.1 Identifizierung der katalytisch aktiven Reste

Ser 195: Ein diagnostischer Test auf das Vorhandensein

eines aktiven Serins in Serin-Proteasen ist seine
Reaktion mit Diisopropylfluorphosphat (DIPF, stark Reaktionsablauf mit DIPF S. 367
neurotoxisch → Nervengas). Dabei wird das Enzym
irreversibel inaktiviert. Andere Ser-Reste reagieren nicht
mit DIPF.

His 57: Dieser zweite katalytisch wichtige Rest wurde

durch Affinitätsmarkierung entdeckt. Chymotrypsin
(eine Serin-Protease) bindet spezifisch Tosyl-L-
phenylalaninchlormethylketon (TPCK), weil es einem
Phe-Rest – einem von Chymotrypsin bevorzugten Reste
– ähnelt. Die Chlormethylketogruppe von TPCK ist ein
starkes Alkylierungsmittel. Sie reagiert nur mit His 57
(Alkyl wird an Amin gehängt) und inaktiviert dadurch
das Enzym.

3.2 Röntgenstrukturanalyse

Im aktiven Zenrum von Serin-Proteasen befinden sich die katalytisch wichtigen Aminosäuren
His, Ser und Asp. Letzteres ist in einer dem Lösungsmittel unzugänglicher Tasche verborgen.
Diese drei Reste bilden eine durch Wasserstoffbrücken getragene Anordnung, die sog.
katalytische Triade.

oberer Teil Reaktionsablauf S. 371 (kat. Triade)

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Substratspezifitäten lassen sich strukturell erklären:

1. Chymotrypsin: sperrige, aromatische Seitenketten (Phe, Trp, Tyr) passen perfekt in die
hydrophobe Tasche in der Nähe der katalytisch aktiven Gruppen
2. Trypsin: kationische Seitenketten (Arg, Lys) können mit einem anionischen Asp-Rest
an der Rückseite der Bindungstasche Ionenpaare bilden.
3. Elastase: Die Bindungstasche wird grösstenteils von den Seitenketten eines Val- und
eines Tyr-Restes abgeschlossen. (Bei Chymotrypsin und Trypsin säumen zwei Gly-
Reste (→ kleiner) die Bindungstasche). Deshalb spaltet Elastase Peptidbindungen
spezifisch hinter kleinen, unpolaren Resten (v.a. Ala).

Obwohl die in den aktiven Zentren von Serin-Proteasen befindlichen Gruppen im

wesentlichen identisch und in ihrer relativen dreidimensionalen Positionen kaum
unterscheidbar sind, unterscheiden sich Serin-Proteasen zum Teil deutlich in ihrer Primär- und
Tertiärstruktur. Somit ist es recht unwahrscheinlich , dass diese Enzyme von einer
gemeinsamen Ur-Serin-Protease abstammen. Sie sind daher Beispiele für konvergente
Evolution, durch die die Natur auf unterschiedlichem Weg zum selben katalytischen
Mechanismus gelangen konnte.

3.3 Katalysemechanismus

Die weitreichenden Homologien zwischen den aktiven Zentren der Serin-Proteasen deuten
darauf hin, dass sie alle denselben Katalysemechanismus besitzen. Er wird hier am Beispiel
von Chymotrypsin erläutert.

Geschwindigkeitsbestimmende Bildung
eines tetraedrischen Zwischenproduktes: Reaktionsablauf S. 371 oben
Wenn Chymotrypsin sein Substrat gebunden
hat (→ Michaelis-Komplex),
greift Ser 195 die Carbonylgruppe des zu
zerlegenden Peptids nucleophil an, wobei ein
tetraedrisches Zwischenprodukt entsteht
(kovalente Katalyse).
Ser 195 ist perfekt plaziert um diesen
nucleophilen Angriff auszuführen
(Nachbargruppen- und Orientierungseffekt).
Der Imidazolring des His 57 nimmt das Reaktionsablauf S. 371 unten
abgespaltene Proton unter Bildung eines
Imidazolium-Ions auf (allgemeine Basen-
Katalyse).
Dieser Vorgang wird durch den Feldeffekt
unterstützt, der vom unsolvatisierten
Carboxylat-Ion des Asp 102 ausgeht
(elektrostatische Katalyse).
Ein wesentlicher Teil der katalytischen
Effektivität des Chymotrypsins stammt aus
der bevorzugten Bindung an den
Übergangszustand des tetraedrischen
Zwischenproduktes. (Katalyse durch Bindung
des Übergangszustandes) → Siehe S. 9

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Bildung des Acyl-Enzym-Zwischen-

produktes:
Das tetraedrische Zwischenprodukt zerfällt
unter Deprotonierung von N(3) des His 57 in
das Acyl-Enzym-Zwischenprodukt
(allgemeine Säure-Katalyse). Reaktionsablauf S.372 links
Die austretende Aminogruppe (R’NH2, der
neue N-terminale Teil der geschnittenen
Polypeptidkette) löst sich vom Enzym ab und
wird durch Wasser aus dem Lösungsmittel
ersetzt. Das Acyl-Enzym-Zwischenprodukt ist
leicht hydrolytisch spaltbar.

Decarboxylierungsschritt:
Die Decarboxylierung läuft im wesentlichen
als Umkehrung der vorigen Schritte ab:
 Freisetzung des Carboxylat-Produktes
(dem neuen C-terminalen Teil der
geschnittenen Polypeptidkette) Reaktionsablauf S. 372 rechts
 Regenerierung des Enzyms
Bei diesem Prozess ist Wasser das
angreifende Nucleophil und Ser 195 die
austretende Gruppe.

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Serin-Proteasen binden bevorzugt den Übergangszustand:

Ein grosser Teil der katalytischen Aktivität von Serin-Proteasen kommt durch die bevorzugte
Bindung des Übergangszustandes an das Enzym zustande.

1. Die Konformationsverzerrung bei der Bildung des tetraedrischen Zwischenproduktes

bewirkt, dass der Carbonylsauerstoff des Peptidsubstrates tiefer in das aktive Zentrum
eindringt und so eine bis dahin freie Position besetzen kann – das sog. Oxyanion-
Loch.
2. Dort bildet er zwei Wasserstoffbrücken mit dem Enzym aus, die bei normaler
trigonaler Konformation der Carbonylgruppe nicht auftreten könnten.
3. Die tetraedrische Verzerrung erlaubt ausserdem die Bildung einer sonst nicht
bestehenden Wasserstoffbrücke zwischen dem Enzym und der Aminogruppe des
Restes vor der enzymatischen Spaltstelle. Folglich bindet das Enzym das tetraedrische
Zwischenprodukt mit höherer Affinität als den Michaelis-Komplex oder das Acyl-
Enzym-Zwischenprodukt.

DIPF ist deshalb ein so effektiver Inhibitor der Serin-Proteasen, weil es durch seine
tetraedrische Phosphatgruppe ein Analogon zum Übergangszustand der Enzyme darstellt.

3.4 Zymogene (nicht behandelt)

Proteolytische Enzyme werden in der Regel als etwas grössere inaktive Vorstufen, sog.
Zymogene, synthetisiert. (Allgemein werden Enzymvorstufen als Proenzyme bezeichnet.)
Würden z.B. Verdauungsenzyme in ihrer aktiven Form synthetisiert, käme es zu einer
Selbstverdauung innerhalb der beteiligten Gewebe. Die Bindungstaschen der Zymogene sind
so ungenau geformt, dass sie unfähig sind die Substrate produktiv zu binden und das
tetraedrische Zwischenprodukt zu stabilisieren.

1. Trypsin entsteht durch die Aktivierung von Trypsinogen (Zymogen von Trypsin).
Enteropeptidase (eine Serin-Protease) schneidet spezifisch das N-terminale
Hexapeptid von Trypsinogen ab. Es entsteht das aktive Enzym. Da diese Spaltung
zwischen den Resten Lys und Ile stattfindet, was der Substratspezifität von Trypsin
entspricht (spaltet nach Arg und Lys) ist die Trypsinogen-Aktivierung teilweise
autokatalytisch.
2. Chymotrypsin entsteht aus Chymotrypsinogen durch eine spezifische tryptische
Spaltung zwischen Arg und Ile. Es entsteht zunächst π-Chymotrypsin aus welchem
anschliessend durch Autolyse α-Chymotrypsin (kurz Chymotrypsin genannt) gebildet
wird.
3. Elastase entsteht (ähnlich wie Trypsin) durch eine einzige tryptische Spaltung aus
Proelastase.

Biochemische Strategien, die eine vorzeitige Zymogen-Aktivierung verhindern:

1. Der pankreatische Trypsin-Inhibitor bindet im wesentlichen irreversibel an sämtliches
im Pankreas gebildetes Trypsin und inaktiviert es so.
2. Die trypsinkatalysierte Aktivierung von Trypsinogen (Autokatalyse) läuft recht
langsam ab.
3. Pankreatische Zymogene werden in intrazellulären Vesikeln, den sog. Zymogen-
Granula, gespeichert, deren Membranwände wahrscheinlich enzymatischem Abbau
gegenüber resistent sind.