bung 6 - Kontinuierliches Verfahren

Stand Nov 2008 (WS2008/09)

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INTERDISZIPLINRES PRAKTIKUM 6. BUNG
KONTINUIERLICHE FERMENTATION VON SACCHAROMYCES CEREVISIAE

1. Grundlagen
1.1 Kontinuierliche Fermentation
Erfolgt die Kultivierung von Mikroorganismen kontinuierlich, so wird dem Reaktor
stndig frisches Kulturmedium zugespeist und ein gleich groer Volumenstrom an
Zellsuspension aus dem Reaktor abgefhrt. Das Arbeitsvolumen des Reaktors bleibt
konstant. Im kontinuierlichen Betrieb wird das sog. Fliegleichgewicht angestrebt, bei
dem smtliche Konzentrationen im Reaktor ber die Zeit konstant sind. So knnen
ber einen lngeren Zeitraum Zellen unter gleich bleibenden Bedingungen kultiviert
werden. Dies ist fr die Erforschung der Kinetik und des Verhaltens eines biologi-
schen Systems (z.B. Einflussfaktoren auf den zellulren Metabolismus, Enzymaktivi-
tt, genetische Stabilitt) von groer Bedeutung. Kontinuierliche Verfahren werden
vor allem im Labor eingesetzt. Ihre Nutzung im technischen Mastab ist u.a. wegen
des hohen apparativen Aufwands (Sterilisation, Mess- und Regeltechnik) sowie gro-
er Kontaminationsprobleme noch relativ selten. Auerdem wird meist, um niedrige
Aufarbeitungskosten zu erhalten, eine hohe Produktendkonzentration angestrebt,
welche sich im Batch - Prozess hufig kostengnstiger realisieren lsst.

X,S
Zuluft
Abluft
V
L
V, S
f

Medien-
Feed
V, X, S

Ernte-
Abfluss

Abb.1: Schema des einstufigen, kontinuierlich betriebenen Rhrreaktors.
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Zur Bilanzierung des kontinuierlichen Prozesses wird vorausgesetzt, dass der Misch-
vorgang im Bioreaktor so gut ist, dass jedes Flssigkeitselement im Reaktor die glei-
che Zusammensetzung hat. Diese ideale Durchmischung bedeutet auch, dass die
Zusammensetzung der den Reaktor verlassenden Flssigkeit identisch mit derjeni-
gen im Reaktor ist (Abb.1).
Wird die Zulaufflssigkeit mit einer Flierate V
&
[L/h] dem Kulturvolumen V [L] zuge-
geben, so wird diese Kultur mit einer Durchflussrate D [1/h] verdnnt.

V
V
D
&
=
(1)
mit D Durchflussrate oder Volumenwechsel pro Stunde [1/h]
Zur Bilanzierung einer beliebigen Komponente wird die innerhalb des Reaktors
umgesetzte Masse dieser Komponente, sowie der aufgrund des Volumenwechsels
auftretenden nderungen im Reaktor in Form einer Differentialgleichung aus zu- und
abgefhrter Masse betrachtet. Bei sterilem Zulauf (X
F
=0) gilt fr die zeitliche
nderung der Biomassekonzentration:

X D X
dt
dX
=
(2)
mit X Biomassekonzentration [g/L]
t Zeit [h]
spezifische Wachstumsrate [1/h]
Die zeitliche nderung der Substratkonzentration ist unter anderem abhngig von
der Biomassekonzentration:

) (
1
F
S X
S S D X
Y dt
dS
=
(3)
mit S Substratkonzentration [g/L]
S
F
Substratkonzentration der Zulaufflssigkeit [g/L]
Y
X/S
Substratbezogener Ausbeutekoeffizient fr die Biomasse X [gTS/g]
Im Fliegleichgewicht sind alle Konzentrationen im Reaktor zeitlich konstant, es gilt:
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0 = =
dt
dS
dt
dX
(4)
Nach Gleichung 2 folgt damit:

D =
(5)
d.h. die spezifische Wachstums- entspricht der Durchflussrate, was einer
bereinstimmung der abgefhrten und der zugewachsenen Biomasse entspricht.
Daraus geht ein einzigartiger Vorteil der kontinuierlich gefhrten Kultur hervor,
nmlich die Mglichkeit, eine biologische Gre () durch eine physikalische
Gre (D) gezielt einstellen zu knnen.
Zur Beschreibung der kontinuierlichen Kultivierung eines Mikroorganismus wird ein
X-D Diagramm, bei dem die Biomasse sowie gegebenenfalls auch Substrat- und
Produktkonzentration in Abhngigkeit von der Durchflussrate aufgetragen erstellt.
Fr eine Kultur mit Monod-Kinetik ergibt sich beispielsweise aus den Glg. 5:

D
K D
S
S

=
max

(6)
mit K
S
Monod-Konstante [g/L]

max
maximale spezifische Wachstumsrate [1/h]
Ferner folgt im Gleichgewichtszustand aus Glg. 3 und 5:

) ( S S Y X
F S X
=
(7)
so dass ein X-D Diagramm (Abb. 2) erstellt werden kann. Die Raum-Zeit-Ausbeute
stellt dabei eine wirtschaftlich relevante Gre dar.
D X RZA = (8)
mit RZA Raum Zeit Ausbeute [g/L/h]
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0
1
2
3
4
5
6
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Durchflurate D [1/h]
X
[g/L]
RZA
[g/(L*h)]
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
S
[g/L]
Zellkonzentration X
Raum-Zeit-Ausbeute (RZA = X*D)
Substratkonzentration S
D
KRIT
D
opt

Abb. 2. X-D Diagramm einer Kultur mit Monod-Kinetik

Im linken Teil des X-D Diagramms sind Biomasse- und Substratkonzentration nur
wenig von der Durchflussrate abhngig. Hier kann die Kultur durch die Zulaufrate bei
konstanten Konzentrationen im Zulauf gut geregelt werden, was als Chemostat -
Steuerung bezeichnet wird. Kleine Unregelmigkeiten der Pumpe werden vom
System ohne weiteres toleriert. Im rechten Teil sind Zelldichte und
Substratkonzentration dagegen sehr stark von D abhngig. In diesem Bereich ist
eine Turbidostat - Regelung sinnvoll, bei der die Regelung z.B. ber die Zelldichte
(meist aufgrund von Lichtabsorption, daher drfen die Mikroorganismen nicht zur
Agglomeration neigen, der Feststoffanteil im Medium muss gering sein, u.s.w.)
erfolgt. Wird der CO
2
-Anteil in der Abluft gemessen, so kann auch dieser zur
Regelung benutzt werden.
Im Rahmen dieses Experimentes soll ein X-D Diagramm der Hefe Saccharomyces
cerevisiae erstellt werden. Die Anzucht des Mikroorganismus erfolgt submers unter
kontinuierlicher Prozessfhrung in einem 2 Liter - Fermenter.

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1.2. Stationre Methode zur OTR- und k
L
a - Bestimmung in gerhrten Fermentern
mit Abgasanalytik
Die stationre Methode beruht auf der Annahme, dass der Sauerstoffeintrag in die
Nhrlsung und die Sauerstoffaufnahmerate durch die Mikroorganismen gleich sind.
Diese Annahme ist berechtigt, solange keine aktuellen nderungen der Betriebsbe-
dingungen vorgenommen werden. Man bentigt zur Bestimmung die Sauerstoff-
bzw. Kohlendioxidkonzentration in der Zuluft und der Abluft (Abgasanalytik) sowie fr
den k
L
a-Wert den OTR, die zugefhrten Gasvolumenstrme und die Konzentration
des gelsten Sauerstoffs in der Kulturbrhe (pO
2
).
Die Sauerstofftransferrate lsst sich aus einer Stoffbilanz fr die Gasphase im stati-
onren Betriebszustand bestimmen. Vereinfachend wird angenommen, dass das
Gasgemisch nur aus den drei Stoffen Stickstoff, Sauerstoff und Kohlendioxid be-
steht, wobei Stickstoff als inert angesehen wird und nicht verbraucht oder gebildet
wird:

=
Out O
Out CO Out O
In CO In O
In O
m
In
y
y y
y y
y
V
q
OTR
,
, ,
, ,
,
2
2 2
2 2
2
1
1
(9)
mit OTR Sauerstofftransferrate [mol/(Lh)]
q
In
zugefhrter spez. Gasvolumenstrom [NL/(Lmin)]
V
m
Molares Gasvolumen 22,4 [NL/mol]
y
O2,In
O
2
-Molenbruch im zugefhrten Gas [mol/mol]
y
O2,Out
O
2
-Molenbruch in der Abluft [mol/mol]
y
CO2,In
CO
2
-Molenbruch im zugefhrten Gas [mol/mol]
y
CO2,Out
CO
2
-Molenbruch in der Abluft [mol/mol]
Bei vollstndig rckvermischter Gasphase errechnet sich der volumetrische Sauer-
stofftransferkoeffizient k
L
a damit zu:

( )
kal O OUT O abs O
L
y pO y p L
OTR
a k
, 2 ,
2 2 2
100 /
=
(10)
mit: k
L
a vol. Sauerstofftransferkoeffizient [1/s]
L
O2
O
2
-Lslichkeit [mol/L/bar]
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p
abs
Absolutdruck auf halber Reaktorhhe (hier = 1) [bar]
pO2 Partialdruck des gelsten Sauerstoffs (bezogen auf
Sttigung mit Prfgas) [%]
y
O2,kal
O
2
-Molenbruch des Prfgases (pO2-Elektrode) [mol/mol]
Bei entsprechend gut kalibrierten Messgerten ist die stationre Methode mit Ab-
gasanalytik die genaueste und zuverlssigste Methode der k
L
a-Wert-Bestimmung
und den anderen, dynamischen Methoden unbedingt vorzuziehen.

1.3 Physiologie der Hefe Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae ist mglicherweise die am meisten untersuchte Hefe.
Dies ist nicht nur eine Folge ihrer Bedeutung in der Industrie, wo sie in erster Linie
zur Erzeugung von Alkohol in der Brennerei und Brauerei und als Biomasseprodu-
zent in der Backhefeindustrie eingesetzt wird. Weitere Anwendungsgebiete dieser
Zellen liegen in der Gewinnung von Geschmacks- und Aromastoffen, Enzymen, mo-
noklonalen Antikrpern sowie in der Expression von Proteinen [HEYSE, 1995]. Aber
auch ihre besondere Art der Glucose - Verstoffwechselung hat die Neugier mancher
Wissenschaftler geweckt, so dass Saccharomyces cerevisiae zum Modellorganis-
mus fr die molekulargenetische Forschung an eukaryotischen Mikroorganismen
geworden ist. Das kleine haploide Genom, die geringe Anzahl der Chromosomen
sowie die unter Standardzuchtbedingungen erreichbare Generationszeit von nur 1,5
Stunden tragen mit dazu bei [SCHLEGEL, 1992]. In der Natur findet man Hefen an
allen Standorten, an denen vergrbare, zuckerreiche Sfte frei werden: im Nektarsaft
der Blten und auf Blttern sowie auf reifen Frchten.
Taxonomisch gehren die Hefen zur Abteilung der Pilze (Fungi) und zur Klasse der
Schlauchpilze (Ascomycetes). Die weitere Einteilung der Hefen basiert im wesentli-
chen auf ihrer Morphologie und der Art ihrer Vermehrung. Die fr Saccharomyces
cerevisiae typische Art der asexuellen Vermehrung ist die Zellsprossung oder Knos-
penbildung. Die Sprosszellen knnen miteinander verbunden bleiben, oder sich vllig
voneinander lsen. In Abbildung 3 ist schematisch das Querschnittsbild einer ein-
zelnen Hefezelle dargestellt. Sie hat eine runde bis ovale Form und einen Durch-
messer, der zwischen 6 und 14 m liegt [HEYSE, 1995].
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Die im Cytoplasma eingeschlossenen Organellen sind fr die anabolischen und ka-
tabolischen Stoffwechselvorgnge sowie deren Energiekopplung notwendig. Nach-
folgend sollen nur die im Rahmen dieser Arbeit interessierenden biologischen
Grundlagen des Stoffwechsels der Hefen in komprimierter Form beschrieben wer-
den.

Abb. 3. Schematische Darstellung einer Hefezelle

Das Wachstumsverhalten von Saccharomyces cerevisiae ist typisch fr Glucose -
sensitive Hefen, bei denen die Glucoseaufnahme nicht ber die Atmungsrate kon-
trolliert ist. Im Anschluss an die Glykolyse, die Umsetzung von Glucose zu Pyruvat,
fhrt der Pyruvat - Stoffwechsel bei einem berschuss an Glucose zu einer Bildung
von Ethanol, anstelle in den Citratzyklus und die Atmungskette zu mnden und dort
unter Energiegewinnung zu CO
2
abgebaut zu werden. Es handelt sich um eine ber-
laufreaktion (Crabtree - Effekt), die beim Abbau der berschsse durch Wiederauf-
nahme des Ethanols verschwindet. Magebend fr den vollstndigen Abbau ist die
verfgbare Atmungskapazitt [FIECHTER, 1994; PRONK ET AL, 1996]. Diese begrenzte
respiratorische Kapazitt von Hefen der Gattung Saccharomyces ist in Abbildung 4
[nach SONNLEITNER und KPPELI, 1986] als Flaschenhals illustriert.
Der als respiratorischer Flaschenhals bezeichnete Engpass in Abbildung 4 be-
stimmt den Weg der Kohlenstoffumsetzung zu Biomasse. Der oxidative Abbau der
Glucose ist bevorzugt. Der reduktive Weg wird nur als Ausweg bei entsprechend ho-
hem Glucoseangebot, und damit verbundener berlastung der Respirationskapazitt
zugeschaltet.
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Abb. 4. Erluterung der Nutzung des Substrats Glucose bzw. Ethanol bei Hefen der Gattung
Saccharomyces als respiratorischer Flaschenhals [nach SONNLEITNER und KPPELI, 1986]

Dabei wird das zwangsweise gebildete Ethanol ins Medium ausgeschieden. Dieses
kann jedoch bei Unterschreitung der aktuellen Atmungskapazitt ber den oxidativen
Weg von den Zellen verbraucht werden. Solange das berangebot an Glucose nicht
abgebaut ist, bleibt der berschssige Ethanol unangetastet im Medium [FIECHTER,
1994].
Hefen sind fakultativ anaerob, d.h. sie sind auch unter anaeroben Bedingungen le-
bens-, bzw. wachstumsfhig. Die Glucose wird dann rein reduktiv unter Bildung von
Ethanol abgebaut. Bei dieser als alkoholische Grung bezeichneten Kohlenstoffum-
setzung kommt es zu einem nur geringen Wachstum der Hefen. Die Anhufung des
Ethanols im Medium fllt entsprechend strker aus. Demzufolge werden fr Hefen
der Gattung Saccharomyces fr den Umsatz der Kohlenstoffquellen in Biomasse drei
verschiedene Stoffwechselwege unterschieden:
oxidatives Wachstum auf Glucose
reduktives Wachstum auf Glucose unter Bildung von Ethanol
oxidatives Wachstum auf Ethanol
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1.4 Modellierung und Simulation
Zur Untersttzung von Prozessentwicklung und Prozessfhrung stellt die Modellie-
rung und Simulation ein wesentliches Werkzeug dar. Sowohl fr die Auslegung neu-
er Anlagen als auch fr Verbesserung bereits bestehender Anlagen verwendet man
kommerzielle Programmsysteme, mit denen sich stationre Simulationen und Opti-
mierungen von Betriebspunkten durchfhren lassen. Zunehmend gewinnen auch
Simulationstrainer an Bedeutung fr die Aus- und Weiterbildung von Bedienungs-
personal. Oft hat die Modellbildung zur Untersttzung von Entscheidungsprozessen
weit reichende betriebliche und wirtschaftliche Folgen.
In diesem Praktikumsversuch soll Anhand eines Modells die Fermentation von Sac-
caromyces cerevisiae simuliert werden. Zunchst erfolgt eine batch - Fermentation,
die anschlieend auf kontinuierliche Betriebsfhrung umgestellt wird. Gerade das
Umschalten auf kontinuierliche Betriebsfhrung kann sich durch die Wahl des fal-
schen Umschaltzeitpunktes als problematisch erweisen. Unter Umstnden knnen
sehr lange Einschwingzeiten bis zum Erreichen eines stabilen Betriebspunktes auf-
treten. Durch eine vorherige Simulation des Vorganges soll der gnstigste Zeitpunkt
fr das Umschalten auf eine kontinuierliche Betriebsfhrung ermittelt werden. Beim
Umschalten der Durchflussrate ist man bei der Ermittlung der Zeit bis zum Erreichen
des nchsten stabilen Betriebspunktes auf grobe "Faustformeln" angewiesen. Zum
einen kann dadurch wertvolle Zeit verloren gehen, weil der Betriebspunkt bereits fr-
her erreicht wurde, zum anderen knnen sich auch wesentlich lngere Zeiten erge-
ben.







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2. Methodik
2.1. Vorbereitende Arbeiten
2.1.1 Vorbereitung des Mediums, der Vorkultur und der Probenahme
Glucosemonohydrat: 11 g/L
Pepton [pangr. verd.] 5 g/L
Hefeextrakt 5 g/L
Vorkultur. Zweimal 50 mL Medium (in 250 mL Erlenmeyerkolben) vorbereiten und
autoklavieren. Mit 2 Impfsen Saccharomyces cerevisiae (Platte wird gestellt) animp-
fen und bei 200 U/min und 30C fr ca .1,5 d inkubieren.
Vorratsfass. Es werden 40 L Medium fr die kontinuierliche Prozessfhrung
vorbereitet. 50 L Alu-Fass gut aussplen, 200 g Pepton (Roth), 200 g Hefeextrakt
(Roth) getrennt in jeweils 3 L VE (voll entsalztem) Wasser lsen. 32 L VE-Wasser in
das Fass fllen und die Pepton und Hefeextraktlsungen hinzufgen. Durch die
Zugabe von 30 mL 30%ige H
2
SO
4
(Schutzmanahmen beachten!) sollte sich der
pH-Wert auf 5 einstellen. 440 g Glucosemonohydrat werden separat in 1500 mL VE-
Wasser in einer Zulaufflasche autoklaviert. Werden die hier vorgegebenen
Flssigkeitsmengen eingehalten, ergibt sich am Ende eine Medienmenge von 40 L.
Das Fass mit allen ntigen Anschlssen versehen, einem groen Dreikant-Rhrfisch
zugeben und im Autoklaven bei 121C ber Nacht (Zeiteinstellung: 90 min) auto-
klavieren. Flaschenzug benutzen!
Bestimmung der Sauerstofflslichkeit des verwendeten Mediums. Die Bestimmung
der Sauerstofflslichkeit des Mediums unter Kulturbedingungen erfolgt ber die in
bung 2, Kapitel 1.6 beschriebenen Gleichungen.
Probenahme. Zur Verdnnung der Proben bei der OD-Messung wird 100 mL
0,9%ige NaCl-Lsung hergestellt.
Fr die Biotrockenmassebestimmung bei der kontinuierlichen Fermentation werden
10 Eppendorf-Reaktionsgefe 2,2 mL (Trockenschrank 105C, 24 h, abkhlen im
Exsikkator) beschriftet und im leeren Zustand auf der Analysenwaage gewogen.

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2.1.2. Aufbau des Fermenters
Bevor der Deckel auf das Kulturgef aufgesetzt wird, muss der O-Ring im Deckel,
bzw. die Auflageflche des Glasgefes leicht mit Silikonfett eingefettet werden. Der
Deckel wird so zu dem Gef ausgerichtet, dass die beiden Befestigungsschrauben
des Deckels in der Draufsicht oberhalb der Schlaucholiven des Glasgefes platziert
sind. Die untere Schlaucholive des Gefes befindet sich dabei auf der linken Seite.
Mit einer Schnellverschluss-Schelle wird der Deckel auf dem Glasgef befestigt.
Zuvor muss jedoch der Gaseinblasring von der Deckelunterseite durch die
entsprechende Verschraubung eingefhrt werden. Nachdem Kulturgef und Deckel
montiert sind, werden die bentigten Elektroden (die pH - Elektrode muss vorher mit
den entsprechenden Kalibrierlsungen pH 7.0 ("Nullpunkt") und pH 4.0 ("Steilheit")
kalibriert werden!) und Sonden, der Abluftkhler, sowie Zu- und Ablaufstutzen
entsprechend der Abbildung 5 in die jeweilige Deckelffnung eingesetzt und mittels
berwurfmuttern befestigt. Smtliche Dichtungsringe mssen dabei dnn eingefettet
werden. Die nicht bentigten ffnungen werden mit entsprechenden Blindstutzen
geschlossen.
Nun mssen die Stutzen mit den entsprechenden Schluchen versehen werden. An
Zulauf- und Ablaufstutzen werden ausreichend lange Schluche befestigt, der Zulauf
wird am Ende mit einer Sterilkupplung versehen, am Ablauf reicht ein fester Knoten.
Alle Schluche, die in Schlauchpumpen eingelegt werden, mssen aus
Maprenschlauch sein. Der Durchmesser des Ablaufschlauches in der Pumpe muss
grer sein als der des Zulaufschlauches, um ein berfllen des Fermenters zu
verhindern. Am Probennahmerohr wird ein Schlauch befestigt, der mit dem
Kontiprobennehmer verbunden ist. Der Rcklauf wird am 4-fach Stutzen befestigt.
Der dritte Anschluss des 4-fach Stutzens ist fr das Antischaummittel (Plurafac 1300,
1:10 verdnnen und mit einem Rhrfisch versehen!) bestimmt. Am Gaseinblasring
wird ein Membranfilter (0,2 m) befestigt, am Abluftkhler wird ein Tiefenfilter
angeschlossen, anschlieend eine Wasserfalle. Bis auf den Abluftschlauch werden
smtliche Schluche jeweils mit einer Schlauchklemme abgeklemmt. Das Ablaufrohr
muss komplett in den Fermenter eintauchen.

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Abbildung 5: Bestckung des Fermenterdeckels

Bevor der Fermenter autoklaviert werden kann, muss er einem Dichtigkeitstest
unterzogen werden. Tritt dabei keine Luft aus, wird der Fermenter mit ca. 1 L VE-
Wasser gefllt und im Autoklaven bei 121 C 20 min lang autoklaviert.
Der Fermenter wird im abgekhlten Zustand mit der Regel- und Steuereinheit
verbunden. Der Zulaufschlauch wird ber die Sterilkupplung mit dem Schlauch zum
Mediumfass verbunden. ber die Ablaufpumpe wird das Wasser aus dem Fermenter
entfernt, mittels Zulaufpumpe Medium in den Fermenter gefllt. Beim Befllen muss
die Pumpenkennlinie aufgenommen werden. Dazu wird jeweils 10 Minuten mit 50%
und 99% Pumpleistung befllt. Zuletzt werden die pO
2
-Elektrode und der
Abgasmessschrank kalibriert.
Schaumsonde
Abluftkhler
Blasenabscheider
= Probenschleife
Impfstutzen
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2.1.3. Kalibrierung der pO2-Elektrode und der Abgasanalytik zur OTR- und k
L
a-
Bestimmung
Kalibrierung der pO
2
-Elektrode. Kalibriert wird in % Sttigung, wobei eine mit Luft
gesttigte Lsung als 100% gesttigt definiert wird. Whrend der Kalibrierung muss
mit gleichem Druck und Belftungsverhltnissen gearbeitet werden, wie sie spter
bei der Fermentation vorkommen. Auerdem sollte sich die Kalibriertemperatur nicht
wesentlich von der spteren Fermentationstemperatur (30 C!) unterscheiden. Die
Kalibrierung erfolgt in zwei Schritten:
Nullpunkt-Kalibrierung:
Stickstoff in den Fermenter einleiten
Stabile Anzeige abwarten
Mit Zero-Potentiometer Anzeige auf 0% pO
2
einstellen
Steigungs-Kalibrierung:
Luft in den Fermenter einleiten
Stabile Anzeige abwarten
Mit Slope-Potentiometer Anzeige auf 100% pO
2
einstellen
Kalibrierung der Abgasanalytik (Messschrank). Die Kalibrierung des Abgasmess-
schrankes erfolgt ebenfalls in zwei Schritten:
Nullpunkt-Kalibrierung:
Stickstoff in den Messschrank einleiten
Stabile Anzeige abwarten (mind. 10 min!)
Mit Nullpunkt-Potentiometer Anzeige des O
2
- sowie des CO
2
- Messgertes auf
0% kalibrieren
Empfindlichkeits-Kalibrierung:
Prfgas in den Messschrank einleiten
Stabile Anzeige abwarten (mind. 10 min)
Mit Empfindlichkeits-Potentiometer Anzeige der O
2
und CO
2
- Messgerte je-
weils auf 25% O
2
und 5% CO
2
stellen

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2.2 Batch-Fermentation
2.2.1. Beimpfen des Fermenters
Zunchst wird die OD der Vorkultur bestimmt. Aus der gemessenen OD wird dann
die Animpfmenge fr 1 L Fermentervolumen mit einer Start-OD von 0,01 ermittelt.

2 2
2
1000 01 , 0
VK VK
Fermenter Start
VK
OD
mL
OD
V OD
V

=

=
Angeimpft wird mit V
VK2
der 2.Vorkultur, die zuvor steril in eine Einwegspritze mit
langer Kanle gefllt wurde. Die Animpfmembran des Fermenters wird mit Ethanol
bedeckt. Die Fermentation erfolgt im batch - Betrieb unter den folgenden
Einstellungen:
Begasungsrate 50% [100% = 2 L/min]
Rhrerdrehzahl 100, 250, 500, 1500 U/min
pH-Wert ungeregelt, ca. pH 5.0
Temperatur 30C (20 C fr die ersten 16 Stunden)
2.2.2 Probenahme und Analytik
Zu folgenden Zeiten wird mit einer Spritze 5 mL Probe aus dem Fermenter gezogen:
vor dem Animpfen
zum Zeitpunkt 0 (wenn der Fermenter gerade beimpft ist)
stndlich beim batch-Betrieb
OD-Bestimmung. Mikrokvette mit ca. 1 mL Probe befllen und bei 600 nm OD
(Referenz 0,9% NaCl-Lsung) bestimmen. Wenn die OD den Wert 0,3 berschreitet,
Probe mit 0,9% NaCl-Lsung entsprechend verdnnen.
pH-Wert-Bestimmung. 1 mL Probe in ein Eppendorf-Reaktionsgef fllen, pH-Wert
messen.
HPLC-Bestimmung. 2,2 mL Eppendorf Reaktionsgefe mit genau 1,5 mL Probe
befllen und 20 min bei 4000 U/min zentrifugieren. Aus dem berstand jeweils 1 mL
in weiteres beschriftetes Reaktionsgef pipettieren und bis zur Analyse sofort
einfrieren!
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2.2.3 Abschaltversuch
Zur Bestimmung der Sauerstofftransferrate OTR mit der dynamischen Methode wird
gegen Ende der batch Fermentation die Luftzufuhr geschlossen und die
Rhrerdrehzahl auf einen geringen Wert eingestellt. ber die Zeit fr die Abnahme
der Sauerstoffpartialdrucks auf Null kann die OTR berechnet werden.

2.3 Kontinuierlicher Betrieb
2.3.1 Inbetriebnahme und Vernderung der Durchflussraten
Das Anschalten der Ismatec-Pumpe startet den kontinuierlichen Prozess.
Es sollen mindestens 5 Datenpunkte aufgezeichnet werden. Je nach gewhlter
Durchflussrate muss mit unterschiedlicher Zeitdauer zur Einstellung des Fliegleich-
gewichtes gerechnet werden. Eine Faustregel besagt, dass die 3-5 fache Menge des
Arbeitsvolumens durchgesetzt werden muss, bis sich der neue Gleichgewichtszu-
stand eingestellt hat. Eine effizientere Ermittlung der Zeitpunkte zur Probennahme, in
Abhngigkeit der eingestellten Durchflussrate, gibt die vorangehende Modellierung.
Durch die Simulation des Vorganges soll im Vorfeld eine Versuchsplanung erfolgen,
dabei sollen folgende Durchflussraten bercksichtigt werden:
D = 0,05 [1/h] D = 0,1 [1/h] D = 0,15 [1/h] D = 0,2 [1/h]
D = 0,25 [1/h] D = 0,3 [1/h] D = 0,35 [1/h] D = 0,4 [1/h]
Bei der Versuchsplanung ist zu bercksichtigen, dass der Umschaltpunkt (und zu-
gleich Probenahmepunkt) nicht nachts, am Wochenende oder an Feiertagen statt-
findet.
Nach Beendigung des Versuchs muss das Flssigkeitsvolumen im Fermenter ausge-
litert werden, um damit die genauen Durchflussraten ermitteln zu knnen.





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2.3.2. Probenahme
Zu folgenden Zeiten wird mit einer 5 ml Spritze jeweils ca. 5 mL Probe aus dem
Fermenter gezogen:
vor dem Umschalten auf kontinuierliche Betriebsweise
vor jeder nderung des D-Wertes
pH-Bestimmung, OD Bestimmung und HPLC Bestimmung wie unter 2.2.2
BTM-Bestimmung. Den restlichen berstand aus dem Zentrifugenrhrchen
vorsichtig abdekantieren und das Zentrifugenrhrchen (mit dem Sediment) in den
Trockenschrank bei 105C legen. Nach 24 h erneut auf der Analysenwaage wiegen.

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Auswertung und Protokoll
Bitte achten Sie whrend des Praktikums darauf, Ihre Daten fortlaufend in einem
Laborbuch zu erfassen und benutzen Sie das Protokollblatt im Anhang.
Im Protokoll enthalten sein soll fr die Batch - Fermentation:
a) Grafische Darstellung der Glucose- und Ethanolkonzentration im batch-
Betrieb.
b) Aus den Daten der OD -Bestimmung soll die maximale Wachstumsrate
(grafisch) bestimmt werden, um so auf die kritische Durchflussrate zu
schlieen.
c) Ermittlung des OTR-Werts mittels Abschaltversuch und Vergleich mit dem
OTR aus der Abgasanalytik
d) Diskussion des zeitlichen Verlauf der verschiedenen Parameter (pO
2
, OTR,
CTR, RQ, k
L
a).
Fr die kontinuierliche Fermentation:
a) Pumpenkennlinien
b) Vergleich der geplanten Probenahmen (Grafik aus ModelMaker) gegen die
tatschlich durchgefhrten Probenahmen
c) X-D Diagramm mit OD, Glucose und Ethanolkonzentration sowie Diskussion
des Diagramms
d) X-D Diagramm mit BTM (Biotrockenmasse), Glucose und Ethanolkonzen-
tration sowie Diskussion des Diagramms.

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Anhang A: Modellierung des Wachstums der Hefe Saccharomyces cerevisiae
Das Ziel eines Wachstumsmodells ist die mathematische Beschreibung der Kultivie-
rungsverlufe eines Bioprozesses. Diese Modelle basieren prinzipiell auf Massenbi-
lanzen, die fr den betrachteten Reaktor mitsamt der mikrobiologischen und bioche-
mischen Prozesse aufgestellt werden. Fr die Lsung der Bilanzen mssen Stchi-
ometrie, Kinetik und Energetik des Bioprozesses bekannt und verstanden sein. Die
grundlegende Modellierung eines kontinuierlichen Bioprozesses wurde bereits dar-
gelegt. Hier soll nun ein komplexeres Wachstumsmodell der Hefe Saccharomyces
cerevisiae vorgestellt werden.
Von zentraler Bedeutung bei strukturierten, segregierten Modellen sind Wachstum,
Erhaltung, Stoffwechsel, Physiologie und Produktbildung bzw. Stoffwandlung der
Mikroorganismen im Reaktor. Vereinfachend dazu wird anstelle der Unterscheidung
dynamischer Vorgnge und der Unterteilung des zellulren Systems in mehrere ver-
schiedenartiger Komponenten, bei einem unstrukturierten, unsegregierten Modell ein
Mittelwert der Zelleigenschaften bzw. der physiologischen Entwicklungsprozesse
betrachtet, anhand dessen das zellulre System in Form einer gleich verteilten, ho-
mogenen Gre zusammengefasst werden kann.
Das hier eingesetzte unstrukturierte, unsegregierte Modell basiert auf bereits entwi-
ckelten Bilanzierungen [SONNLEITNER und KPPELI, 1986], die an eine Reaktorausfh-
rung in Form einer Kaskade angepasst worden sind. Mit Hilfe dieses modifizierten
Modells wurden die Kultivierungsverlufe im Voraus und versuchsbegleitend be-
stimmt. Die dadurch mgliche Vorauswahl interessanter Prozessverlufe, bzw. ent-
sprechender Betriebsbedingungen fhrte zu einer Verringerung des experimentellen
Aufwands.
Das Modell beschreibt das Wachstumsverhalten der Hefe Saccharomyces cerevisi-
ae unter Bercksichtigung der begrenzten respiratorischen Kapazitt. Bei diesem
unstrukturierten Modell wird die zur Charakterisierung der biologischen Phase be-
trachtete Biomasse als gleich verteilte, homogene, unstrukturierte Gre angesehen.
Die Ermittlung der kinetischen Parameter beruht auf Erkenntnissen bzw. Daten, die
aus experimentellen Untersuchungen [RIEGER ET AL., 1983] mit dem Stamm Saccha-
romyces cerevisiae H1022 gewonnen wurden.
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Die stchiometrischen Gleichungen fr den Umsatz der Kohlenstoffquellen in Bio-
masse fr Hefen der Gattung Saccharomyces sind wie folgt beschrieben:
oxidatives Wachstum auf Glucose (I) (A1)
O H CO N O H C NH NX O O H C
I I I I I
O H CO NX OX HX X N O 2 2 1 3 2 6 12 6
2 2 2
) ( + + + +
reduktives Wachstum auf Glucose unter Bildung von Ethanol (II) (A2)
O H C O H CO N O H C NX
II II II II
O H C O H CO NX OX HX X 6 2 2 2 1 3 X 6 12 6
6 2 2 2 II
) (NH O H C + + + +

oxidatives Wachstum auf Ethanol (III) (A3)
+ + ) (NH O O H C
3 X 2 O 6 2
III 2III
O H CO N O H C
2 O H 2 CO NX OX HX 1 X
III 2 III 2 III
+ +
mit: (NH
3
) Stickstoffquelle
stchiom. Koeffizient mit Indices fr Substanz bzw.
Wachstumswege I bis III
Die molekulare Zusammensetzung der Biomasse X wird dabei nach elementaranaly-
tischer Bestimmung des Anteils der jeweiligen Atome H, O und N an der Biomasse
HX, OX und NX in der Form C
1
H
HX
O
OX
N
NX
dargestellt. Weitere experimentell ermit-
telbare Gren sind die substratbezogenen Ausbeutekoeffizienten fr die Biomasse
Y
X/S
, die in Proportionalitt zu den stchiometrischen Koeffizienten wie folgt definiert
sind:

G
X
X
oxidativ
G X
M
M
Y
I
= (A4)

G
X
X
reduktiv
G X
M
M
Y
II
= (A5)

E
X
X
oxidativ
E X
M
M
Y
III
= (A6)


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mit Y
X/G
oxidativ
Ausbeutekoeff. fr oxidative Wachstum auf Glc. (I) [gTS/g]
Y
X/G
reduktiv
Ausbeutekoeff. fr reduktive Wachstum auf Glc. (II) [gTS/g]
Y
X/E
oxidativ
Ausbeutekoeff. fr oxidatives Wachstum auf EtOH [gTS/g]
M Molare Masse mit Index fr Substanz [g/mol]
Mit Hilfe dieser Ausbeutekoeffizienten kann unter Bercksichtigung der spezifischen
Verbrauchsraten fr das Substrat Glucose sowie der spezifischen Wachstumsrate
fr Ethanol, die absolute spezifische Wachstumsrate als Summe dieser Kompo-
nenten fr die drei verschiedenen Stoffwechselwege dargestellt werden.
bzw.
oxidativ
E
reduktiv
G
oxidativ
G
+ + = (A7)
mit
oxidativ
E
reduktiv
S
reduktiv
G X
oxidativ
S
oxidativ
G X
q Y q Y = (A8)
und Wachstumsrate (Indices fr Substrat und Stoffwechselweg) [1/h]
q
S
Index
Glucoseaufnahmerate (Index fr Stoffwechselweg) [g/(gh)]
Die Aufnahme der Glucose wird wie folgt beschrieben:

S K
S
q q
S
max , S S
+
= (A9)
wobei
reduktiv
S
oxidativ
S S
q q q + = (A10)
q
S
Glucoseaufnahmerate [g/(gh)]
q
S,max
maximale Glucoseaufnahmerate [g/(gh)]
S Glucosekonzentration [g/L]
K
S
Monod-Konstante fr Glucose [g/L]
Das Wachstum auf Ethanol verluft nach der Monod-Kinetik. Dabei muss jedoch die
Prioritt der Glucoseaufnahme gegenber der des Ethanols bercksichtigt werden.
Bei entsprechender Verfgbarkeit von Glucose wird der Ethanolverbrauch inhibiert:

i
i
E
E
oxidativ
E
K S
K
K E
E
+

+
=
max ,
(A11)


bung 6 Kontinuierliches Verfahren
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mit
E,max
maximale Wachstumsrate auf Ethanol [g/(gh)]
E Ethanolkonzentration [g/h]
K
E
Monod-Konstante fr Ethanol [g/L]
K
i
Inhibierungskonstante (Glucose) [g/L]
Die Verwertung der Glucose bzw. des Ethanols unterliegen den Regulationsmecha-
nismen der begrenzten respiratorischen Kapazitt (Vergleiche 2.1). Die verfgbare
Sauerstoffaufnahmekapazitt ist beschrnkt durch die vorhandene Gelstsauerstoff-
konzentration:

O l
l
O O
K O
O
q q
+
=
) ( 2
) ( 2
max ,
2 2
(A12)
mit q
O2
verfgbare Sauerstoffaufnahmekapazitt [mmol/(gh)]
q
O2,max
maximale respiratorische Kapazitt [mmol/(gh)]
O
2(l)
Gelstsauerstoffkonzentration [mol/L]
K
O
Monod-Konstante fr Sauerstoff [mol/L]
Solange die respiratorische Kapazitt nicht berschritten wird, d.h. wenn die Gluco-
seaufnahmerate kleiner als die zur Verfgung stehende oxidative Glucose-
verbrauchskapazitt ist,

S S
O
G
O
q q
M
q
I
=
2
2

(A13)
mit
S
q oxidative Glucoseverbrauchskapazitt [g/(gh)]
findet die Verwertung der Glucose in Biomasse auf oxidativem Wege statt (Stoff-
wechselweg I), d.h.
0 q
reduktiv
S
= und
oxidativ
S S
q q = , (A14)



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Bei einer vollstndigen Auslastung der respiratorischen Kapazitt durch das Angebot
an zu verwertender Glucose, kommt es daneben zur Produktion von Ethanol (Stoff-
wechselweg II). Eine Verwertung des Ethanols gem Gleichung A3 (Stoffwechsel-
weg III) wird dabei ausgeschlossen.
Fr
S S
q q < gilt demnach mit Glg. A10

oxidativ
S S
reduktiv
S
q q q =
und
S
oxidativ
S
q q = (A15)

reduktiv
S
G
E
0 H C
Bildung
E
q
M
M
q
II 6 2
= (A16)
mit
Bildung
E
q Bildungsrate von Ethanol [g/(gh)]
Nach dem vollstndigen Verbrauch der Glucose im Medium, wird das vorhandene
Ethanol als Kohlenstoffquelle verwendet, wobei die Umsetzung gem Gleichung
A3 abluft.
Die folgende Tabelle 2.1 gibt eine bersicht der fr die Modellierung verwendeten
Parameter. Die Mehrzahl der Zahlenwerte wurde aus den experimentell ermittelten
Daten der Literatur [SONNLEITNER und KPPELI, 1986] bernommen.
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Tabelle 2.1: bersicht der fr die Modellierung verwendeten Parameter
Parameter Bedeutung Wert Einheit
NX Anteil N-Atome an Biomasse 0,15 mol/mol
HX Anteil H-Atome an Biomasse 1,79 mol/mol
OX Anteil O-Atome an Biomasse 0,57 mol/mol

E,II
stchiom. Koeffizient 1,874 -

CO2,I
stchiom. Koeffizient 2,47 -

CO2,II
stchiom. Koeffizient 1,89 -

CO2,III
stchiom. Koeffizient 0,68 -

O2,I
stchiom. Koeffizient 2,297 -

O2,III
stchiom. Koeffizient 1,61 -

X,I
stchiom. Koeffizient 3,53 -
M
X
Molare Masse der Biomasse 0,025 g/mmol
M
G
Molare Masse der Glucose 0,180 g/mmol
M
E
Molare Masse des Ethanols 0,046 g/mmol
M
O
Molare Masse des Sauerstoffs 0,032 g/mmol
K
E
Monod-Konstante von Ethanol 0,1 g/L
K
i
Inhibierungskonstante durch Glucose 0,1 g/L
K
S
Monod-Konstante von Glucose 0,5 g/L
K
O
Monod-Konstante von Sauerstoff 0,1 mg/L

E,max
maximale Wachstumsrate auf Ethanol 0,17 g/(gh)
q
O2,max
maximale Sauerstoffsverbrauchsrate 8,0 mmol/g/h
q
S,max
Maximale Glucoseverbrauchsrate 3,5 g/(gh)
Y
X/G
oxidativ
Ausbeutekoeffizient bei oxidativem Wachstum
auf Glucose (I)
0,49 gTS/g
Y
X/G
reduktiv
Ausbeutekoeffizient bei reduktiven Wachstum
auf Glucose (II)
0,05 gTS/g
Y
X/E
oxidativ
Ausbeutekoeffizient bei oxidativem Wachstum
auf Ethanol (III)
0,72 gTS/g
y
O2,in
Sauerstoffanteil in Luft (Begasung) 0,2095 -
bung 6 - Kontinuierliches Verfahren
Stand Nov 2008 (WS2008/09)
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Anhang B: Protokollblatt fr Versuch 6 (batch+kontinuierlich)
Datum Uhrzeit Pumpen-
stellung:
Zentr.-
rhrchen,
leer

[g]
Zentr.-
rhrchen,
mit
Biomasse
[g]
Biomasse



[g/l]
pH Gemes-
seneOD
Verdn-
nung
errechnete
OD
Ethanol



[g]
Glucose



[g]
vor dem
Animpfen

direkt nach
Animpfen