Kapitel 10

Für alle dazwischenliegenden Tröpfchen setzt sich die Inkubationszeit aus beiden Flussge-
schwindigkeiten zusammen. Nach Umstellen und Vereinfachen, lässt sich die Inkubationszeit
in Abhängigkeit der fortlaufenden Messzeit (𝑡𝑟𝑒𝑐 ) wie folgt berechnen:

𝑡𝑙𝑒𝑡𝑧𝑡𝑒𝑠 𝑇𝑟ö𝑝𝑓𝑐ℎ𝑒𝑛 − 𝑡𝑒𝑟𝑠𝑡𝑒𝑠 𝑇𝑟ö𝑝𝑓𝑐ℎ𝑒𝑛

𝑡𝐼𝑛𝑘 (𝑡𝑟𝑒𝑐 ) = 𝑡𝑒𝑟𝑠𝑡𝑒𝑠 𝑇𝑟ö𝑝𝑓𝑐ℎ𝑒𝑛 + 𝑡𝑟𝑒𝑐 (18)
𝑡𝑙𝑒𝑡𝑧𝑡𝑒𝑠 𝑇𝑟ö𝑝𝑓𝑐ℎ𝑒𝑛

Jedes Tröpfchen repräsentiert somit eine individuelle Inkubationszeit. Die Waschschritte für
die einzelnen Tröpfchen können weiterhin automatisiert in der Magnetfalle ablaufen. Zeitöko-
nomisch und unter minimalem Probenaufwand sind somit zeitlich hoch aufgelöste kinetische
Messungen möglich. Neben den (semi-)quantitativen Messungen von Proteinkonzentrationen
stellen auch kinetische Messungen ein großes Potential dieser Plattform dar. Das stufenför-
mige Geschwindigkeitsprofil lässt sich dabei mit beiden hier vorgestellten Aufbauten erzeu-
gen. Um den Messzeitpunkt möglichst früh beginnen zu lassen, sollte der Abstand zwischen
T-Kreuzung und Detektor deutlich kürzer (z.B. 40 cm) gewählt wählen als bei den quantitativen
Messungen.

10.2.2 Mikrofluidische Messung der Reaktionsdynamik

Zur Demonstration einer kinetischen Messung wurde die Bildung von Assayprodukten in nL-
Reaktionsräumen mit hoher zeitlicher Auflösung detektiert. Beispielhaft wurde eine solche
Kinetik zunächst für die Bindung von Streptavidin-Cy5 an Biotin-beschichtete Beads durchge-
führt. Dabei wurde die kinetische Messung wie oben beschrieben mit einer statischen Mes-
sung verglichen. Die schnelle Reaktionskinetik spiegelt sich im Kurvenverlauf wider. Zu Beginn
steigt die Kurve (orange) zunächst langsam an und wird dann zunehmend steiler, bis sie nach
etwa 30 s parallel zur Endpunktmessung (grün) ansteigt. Daraus lässt sich schließen, dass die
Bindungsreaktion unter den gegebenen Bedingungen nach etwa 30 s Messzeit bereits das
Gleichgewicht erreicht hat. Eine ähnlich schnelle Bindungskinetik für Biotin und Streptavidin
wurde in mikrofluidischen Tröpfchen auch über einen homogenen Assay ermittelt.61

117
 Alternative mikrofluidische Abläufe

a) b) Messwert
1500 quantitative Messung
kinetische Messung 1000 Fit zur unteren Hüllkurve
Resultierende Kurve
Signal [a.u.]

1000

Signal [a.u.]
800

500 600

0 400
15 30 45 3 6 9
t [s] t [min]

Abbildung 68 a) Vergleich einer Endpunktmessung (grün) mit einer dynamischen Messung (orange).
Die Abweichung der orangenen Kurve resultiert aus der Bindungskinetik von Biotin und Streptavidin.
b) Dynamische Messung einer IL-6 Bindungskinetik über einen Zeitraum von 10 Minuten. Der
Kurvenverlauf spiegelt die fortschreitende Bildung des Immunkomplexes wieder. Um die
Akkumulation von zu großen Beadmengen zu vermeiden, wurde die Magnetfalle im Abstand von 100 s
für jeweils 20 s geöffnet.

Auch die Bildung des Sandwich-Immunkomplexes von IL-6 konnte mit dieser Methode über
einen Zeitraum von 10 min aufgenommen werden (Abbildung 68 b). Obwohl alle Tröpfchen
mit den gleichen Lösungen bestückt wurden, steigt das Signal zunächst schwach an und wird
mit zunehmender Messzeit immer steiler. Die Messkurven spiegeln somit die Bildung des IL-6-
Sandwich-Immunkomplexes wider. Im Abstand von 100 s wurde die Magnetfalle für jeweils
20 s geöffnet. Die Fragmente lassen sich anschließend zu einer Gesamtkurve zusammenset-
zen. Das regelmäßige Leeren der Magnetfalle ist dabei nötig, um unerwünschte Effekte bei
der Akkumulation einer zu großen Beadmenge zu vermeiden. Durch die zunehmende Verstop-
fung des Kanals und die gegenseitige Überlagerung der Beads ist eine ungewollte Abschwä-
chung des Signals möglich (siehe Kapitel 5.4). Der Zeitraum des unverfälschten Signalanstiegs
hängt von der verwendeten Bead-Konzentration und der Extraktionsgeschwindigkeit ab. Nied-
rige Bead-Konzentrationen und langsame Extraktionsgeschwindigkeiten ermöglichen unver-
fälschte Messungen über längere Zeiträume. Um noch größere Zeiträume zu messen, müssen
die akkumulierten Beads wie oben beschrieben in regelmäßigen Abständen aus der Magnet-
falle gespült werden.

Wie bei den quantitativen Messungen spiegelt die Steigung der Kurve die Konzentration des
fluoreszierenden Assayprodukts wider. In diesem Fall wird diese jedoch zeitabhängig aufge-
löst. Das heißt, dass das Signal so lange zunimmt, bis das Reaktionsgleichgewicht erreicht

118
 Kapitel 10

wurde. An diesen einfachen Beispielen wurden zeitlich hoch aufgelöste Kinetiken mit minima-
lem Probenvolumen und zeitlichem Aufwand möglich. Die Ableitung der umhüllenden Kurve
lässt dann Rückschlüsse auf die Reaktionskinetik zu. Bei einem Tröpfchenvolumen von 20 nL
werden 50 Datenpunkte/µLReaktionsvolumen mit individuellen Inkubationszeiten erhalten. Die
zeitliche Auflösung liegt typischerweise im Bereich weniger Sekunden (2,5 s für Abbildung 68
a). Er hängt von der Flussgeschwindigkeit und dem Abstand der Tröpfchen ab.

Während kinetische Messungen in homogenen Assays bereits erfolgreich demonstriert wur-

den,32,60 stand die Demonstration kinetischer Messungen für heterogene Assays noch aus.
Mikrofluidische Messungen der Reaktionskinetik heterogener Assays können dabei besonders
nützlich sein. Während in homogenen Assays ohnehin keine Aufarbeitung nötig ist, können
einzelne Proben zu mehreren Zeitpunkten gemessen werden. Somit sind diese meist auch ma-
nuell gut durchführbar. Heterogene Assays benötigen jedoch eine Aufarbeitung vor jeder De-
tektion. Dadurch wird die manuelle Durchführung erheblich schwieriger und der Bedarf an
Reagenzien deutlich höher. In händisch durchgeführten Experimenten kann dabei eine zeitli-
che Auflösung von Minuten kaum unterschritten werden. Dies ist insbesondere für schnell
ablaufende Prozesse nicht ausreichend. Die Messintervalle bei langsameren Reaktionen wer-
den oft durch die üblichen Arbeitszeiten bestimmt. Nur in Ausnahmefällen wird das Laborper-
sonal auch nachts Proben entnehmen können. Die hier demonstrierte Strategie der kineti-
schen Messungen kommt mit wenigen Nanoliter Proben- und Reagenzien-Volumen pro Da-
tenpunkt aus. Die zeitliche Auflösung lässt sich durch die Flussgeschwindigkeiten einfach an
die Reaktionsgeschwindigkeit anpassen. Die Aufarbeitung und die Detektion des Assays ver-
laufen dabei automatisiert in der Magnetfalle ab. Dieses Potential kann sich in Zukunft auch
in weiteren Versuchsanordnungen entfalten.

119
Alternative mikrofluidische Abläufe

120
 Kapitel 11

11 Zusammenfassung und Diskussion

Miniaturisierte und automatisierte Analyseverfahren spielen heute eine größere Rolle denn je
und in vielen Bereichen der Diagnostik und der Forschung sind sie nicht mehr wegzudenken.
In der Systembiologie wird seit Jahren eine Erhöhung der Datendichte angestrebt um die kom-
plexen intrazellulären Abläufe weiter aufzuklären. Dies würde ein tiefgreifenderes Verständ-
nis und die Entwicklung von Computermodellen für die Zellsignalwege beflügeln. Die Simula-
tion der zellulären Abläufe auf molekularer Ebene sind mittlerweile eine wichtige Methode
diese nachzuvollziehen, Fehlregulationen zu erkennen und Einflussmöglichkeiten zu identifi-
zieren. Herkömmliche Methoden der Proteinanalytik, wie das Western Blotting oder Im-
munassays auf Mikrotiterplatten, haben einen zu hohen Verbrauch an Reagenzien und einen
zu geringen Probendurchsatz. Aus diesem Grund kann damit nicht die benötigte Datendichte
erreicht werden. Reagenzien für biochemische Analysen sind meist teuer und das Probenma-
terial oft stark limitiert, sodass die Analyse meist auf wenige Parameter beschränkt werden
muss.

Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb, Proteine unter minimalem Proben- und Reagenzienver-
brauch sensitiv und reproduzierbar zu detektieren. Um einen hohen Probendurchsatz zu er-
möglichen, sollte die Probenverarbeitung dabei möglichst einfach und automatisierbar sein.
Darüber hinaus sollten neben quantitativen Messungen zeitlich hochaufgelöste kinetische
Messungen möglich werden. Dies würde den Messprozess nicht nur schneller und günstiger
machen, sondern auch eine höhere Datendichte ermöglichen - insbesondere bei limitierten
Probenvolumina. Ausgehend von literaturbekannten Verfahren30,32,140 sollte eine Plattform
etabliert werden, welche heterogene Immunassays in Nanoliter-Tröpfchen ermöglicht. Fluo-
reszenz-basierte Sandwich-Immunassays sollten dabei auf der Oberfläche von magnetischen
Mikropartikeln stattfinden. Die Trennung der Magnetpartikel vom wässrigen Überstand stellt
in der Mikrofluidik eine besondere Herausforderung dar. Nach der Extraktion der Partikel kann
die Auslesung des Fluoreszenzsignals erfolgen (Abbildung 69).

121
Zusammenfassung und Diskussion

Abbildung 69 Fluoreszenz-basierte Sandwich-Immunassas werden in mikrodfluidischen Tröpfchen

durchgeführt. Die Nachweisreaktion findet auf der Oberfläche magnetischer Partikel statt. Zur
Signalauslesung werden die Partikel in einer Magnetfalle vom Überstand getrennt. Das Signal der
Tröpfchen akkumuliert sich zu einem linearen Signalanstieg. Dieser lässt dann Rückschlüsse auf die
Konzentration der Zielmoleküle zu.

Zunächst wurden grundlegende Parameter charakterisiert und der fluidische Aufbau weiter-
entwickelt. Die Zahl der nötigen Prozessschritte konnte dadurch reduziert werden. Das Herz-
stück der Plattform stellte dabei die Magnetfalle dar. Sie ermöglichte die Separation des As-
sayprodukts auf den magnetischen Partikeln vom wässrigen Überstand. Gleichzeitig fand die
optische Auslesung des Assaysignals statt. Durch die geschickte Nutzung der Benetzungsei-
genschaften der fluidischen Kanäle, gelang es dabei, minimale Partikelmengen im Magnetfeld
zu fixieren und wieder frei zu lassen. Mit Hilfe von computergesteuerten Servomotoren wur-
den das Öffnen und Schließen der Magnetfalle automatisiert. Damit war der Weg für eine
höhere Automatisierung und die Charakterisierung weiterer Parameter geebnet. Anhand ei-
nes Modellsystems wurde ein sequentielles Messverfahren entwickelt. Innerhalb von 90 Mi-
nuten konnten nun elf Proben automatisiert und mit guter Reproduzierbarkeit (CV = 6-10 %)
gemessen werden. Zur Erzeugung von ca. 50 Reaktionskompartimenten im Nanoliter-Maß-
stab waren lediglich 2 µL Probe, 1 µL Magnetpartikel-Dispersion (c = 25-100 µg/mL) und 1 µL
Detektionsantikörper-Lösung (c = 1 µg/mL) pro Sequenz nötig. Für klassische Immunassays
wird in der Regel ein Vielfaches dieses Volumens verbraucht.

Darüber hinaus war es nun möglich, die Konzentration der Magnetpartikel in den tiefen
µg/mL-Bereich zuverlässig zu extrahieren. In vergleichbaren Assay-Plattformen wurden bis zu
diesem Zeitpunkt Partikelkonzentrationen im mg/mL-Bereich verwendet.30–32,66 Das stellt eine

122
 Kapitel 11

Verringerung der Konzentration um etwa drei Größenordnungen dar. Da die Partikel maßgeb-
lich das Hintergrundsignal bestimmen, wirkte sich die Verringerung ihrer Konzentration posi-
tiv auf das Detektionslimit aus. So ließ sich das Detektionslimit im Modell-Assay auf 2 pmol/L
reduzieren. Bei dieser Konzentration befinden sich nur noch wenige tausend Zielmoleküle in
den Nanoliter-Tröpfchen. Das Detektionslimit ist damit nicht weit vom theoretischen Limit im
fmol/L-Bereich entfernt, bei dem durchschnittlich weniger als ein Zielmolekül/Tröpfchen vor-
liegt. Die automatisierten, sequentiellen Messungen wurden dann für die Detektion biologisch
relevanter Proteine angewandt. Zunächst konnte der Entzündungsmarker IL-6 erfolgreich
über einen Sandwich-Immunassay detektiert werden. Das Detektionslimit
(LoD(IL-6) = 25 pmol/L) war dabei um den Faktor 1,5-10 tiefer als in vergleichbaren mikroflui-
dischen Analyseplattformen mit kleinen Zielproteinen.30,66 Auch mTOR und AKT, zentrale Pro-
teine des zellulären Kinase-Netzwerks, ließen sich in Puffermedien bei Konzentrationen
LoD(mTOR) = 800 pmol/L und AKT ab 4 nmol/L detektieren.

In interdisziplinärer Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Kathrin Thedieck wurde
die Detektion von Proteinen aus Zelllysaten angestrebt. Dabei wurden mehrere Herausforde-
rungen identifiziert. Der hohe Tensidgehalt der Lysepuffer verringerte die Oberflächenspan-
nung, was zunächst zu instabilen Tröpfchen führte. Nach einer theoretischen Betrachtung
konnte durch die Wahl eines weniger viskosen Trägeröls wieder stabilere Tröpfchen erhalten
werden. Zudem provozierten ungewollte Adsorptionen Artefakte in den Messungen. Diesen
konnte mit maßgeschneiderten Funktionalisierungen der Oberflächen entgegengewirkt wer-
den. Im Bereich der Auslesung wurde der fluidische Kanal durch die kovalente Anbindung ei-
nes perfluorierten Silans hydrophobiert. Die hydrophobe Beschichtung verhinderte eine un-
gewollte, verfrühte Extraktion der Magnetpartikel. Im hydrophilen Bereich der Magnetfalle
wurden chemisch modifizierte Glaskapillaren mittels CHiC-Chemie durch eine kovalent ange-
bundene Hydrogel-Beschichtung vor Proteinablagerungen geschützt.

Dank der gezielten Oberflächenfunktionalisierungen und erweiterten Waschprozesse wurde

die Detektion von Atto-647N-Biotin und IL-6 aus Zelllysaten in den Tröpfchen möglich. Die
Sensitivität der Plattform war dabei abhängig vom Verdünnungsgrad des Lysats. Mit zuneh-
mender Gesamtproteinkonzentration nahm die Sensitivität ab. Die Messungen von mTOR und
AKT aus Zelllysaten waren weiterhin von schwachen Signalen und Artefakten geprägt. Dabei
konnten unter anderem Verklumpungen der magnetischen Beads als ein Auslöser von Arte-
fakten identifiziert werden. Die Verklumpungen können sowohl durch spezifische, als auch
123
Zusammenfassung und Diskussion

durch unspezifische Wechselwirkungen induziert werden. Die literaturbekannte Quartärstruk-

tur der mTOR-Komplexe erfüllt aufgrund ihrer Symmetrie die theoretischen Voraussetzungen
für spezifische Verklumpungen. Die negativen Auswirkungen der spezifischen Verklumpung
konnte in Modellexperimenten bestätigt werden. Mit Hilfe einer kompetitiven Assayführung
konnte die Clusterbildung bei Bead-basierten mTOR-Assays reduziert werden. Mit dieser As-
saystrategie ließ sich ein Peptid, welches einen Ausschnitt des mTOR-Proteins repräsentiert,
aus Zelllysaten nachweisen. Auch wenn die Messungen mit mTOR aus Zelllysaten weiterhin
keine eindeutigen Signale ergaben, können die gewonnen Erkenntnisse über die ungewollte
Beadaggregation auch in anderen Forschungsbereichen hilfreich sein. Es zeigte sich außer-
dem, dass die Reaktionsmatrix und die Lyseparameter einen wesentlichen Einfluss auf das
Verhalten der Beads haben. Möglicherweise können in Zukunft Lyseparameter gefunden wer-
den, die die Detektion der Zellproteine aus Zelllysaten zuverlässig ermöglichen.

Neben den quantitativen Messungen wurden auch zeitlich hoch aufgelöste kinetische Mes-
sungen durchgeführt. Durch stufenweise Reduktion der Flussgeschwindigkeit bildete jedes
Tröpfchen eine individuelle Inkubationszeit ab. Die Dynamik der Reaktion spiegelte sich dann
im Verlauf des Signals wider. Da nicht beliebig viele Beads angesammelt werden können, ist
die Messzeit normalerweise durch die maximal mögliche Beadmenge limitiert. Dank der au-
tomatisierten Freilassung der eingefangenen Beads kann dieses Problem geschickt gelöst wer-
den. So konnte eine kinetische Messung über 10 Minuten mit einer zeitlichen Auflösung we-
niger Sekunden und minimalem Reagenzienverbrauch demonstriert werden. Jeder Daten-
punkt beanspruchte dabei lediglich ein Proben- und Reagenzienvolumen von etwa 20 nL. Aus
einem typischen Probenvolumen von 50 µL ließen sich somit 2500 Datenpunkte erzeugen.

In dieser Arbeit wurde das Potential der heterogenen Assays in der Tröpfchen-Mikrofluidik
demonstriert und vorangetrieben. Bestehende Konzepte wurden dabei konsequent weiter-
entwickelt und charakterisiert. Durch Nutzung der Benetzungseigenschaften konnte eine
neue computergesteuerte Magnetfalle entwickelt werden, welche sensitive und automati-
sierte Immunassays in nL-Tröpfchen ermöglichte. Die Übertragung heterogener Immunassays
auf dieses zweiphasige mikrofluidische System reduziert den Probenverbrauch im Vergleich
zu herkömmlichen Immunassays17 um den Faktor 25 bei gleichzeitiger Vervielfachung der
technischen Replikate. Verglichen mit Wester Blot Messungen ist die Probenverarbeitung
deutlich einfacher und führt in einem Bruchteil der Analysezeit zu Messergebnissen. Die hier
vorgestellte Analyseplattform birgt ein hohes Potential für kinetische und semiquantitative
124
 Kapitel 11

Detektionen von Zielmolekülen und könnte eine Schlüsseltechnologie für die Systembiologie
werden.

125
Zusammenfassung und Diskussion

126
 Kapitel 12

12 Experimentelles
12.1 Materialien und Methoden
12.1.1 Reagenzien zur Durchführung der mikrofluidischen Assays
Streptavidin-beschichtete superparamagnetische Beads wurden von Invitrogen GmbH (Dy-
nabeads MyOne Streptavidin T1, #65601, USA) erhalten. Fluoreszenz-markiertes Biotin wurde
von Sigma Aldrich (Atto-647N-Biotin, #93606, Deutschland) erhalten. Die folgenden biotiny-
lierten Antikörper wurden als Fangantikörper verwendet: Anti-IL-6-Antikörper (#BAF206, in
Ziege gegen menschliches IL-6 gewonnen, Reste M1-M212, R&D, USA), Anti-mTOR-Antikörper
(Klon 3G61, in der Ratte gegen menschliches mTOR gewonnen, Reste T221-I260) und Anti-AKT
(#4821, Maus, Cell Signaling, USA). Die folgenden Alexa Fluor 647-markierten Antikörper wur-
den als Detektionsantikörper verwendet: Anti-IL-6-Antikörper (Klon 6708, Maus, #NBP2-
59771AF647, Novus, USA), Anti-mTOR-Antikörper (Klon 7C10, aus Kaninchen gegen Rück-
stände von S2481 von menschlichem mTOR, #5048, Cell Signaling, USA) und Anti-AKT (#5186,
Kanninchen, Cell Signaling, USA). Es wurden Detektionsantikörper in einer Konzentration von
1 µg/mL verwendet. Für Sandwich-Immunassays wurden rekombinantes humanes IL-6 (von E.
coli stammend, Rückstände P29-M212, #Q75MH2, F&E, US), rekombinantes AKT (human Akt1,
PK-PKBA-A010, proteinkinase.de) und rekombinantes humanes mTOR (von HEK293T stam-
mend, #TP320457, OriGene Technologies, US) verwendet.

12.1.2 Fluidischer Aufbau

Zum Aufbau des mikrofluidischen Systems wurden fluorierte Ethylen-Propylen (FEP)-Schläu-
che (Innendurchmesser 0,25 mm, Außendurchmesser 1,59 mm, #2001001, PRO LIQUID
GmbH, Deutschland) verwendet. Die Schläuche wurden mit CTFE-T-Verbindungen und Ver-
schraubungen verbunden (Mikrovolumenstecker - 1/16" - 0,25 mm Bohrung, VICI AG Interna-
tional, MT1CKF & MU1CKF, MACHEREY-NAGEL GmbH, Deutschland). Als nicht wassermisch-
bares Trägeröl wurden die Fluorkohlenstofföle FC-3283 (Perfluortripropylamin), FC-43 (Per-
fluortributylamin) (3M, #FL-0008-HP und #FL-0006-HP, Iolitec, USA) und Novec 7500 (3M, #FL-
0008-HP und #FL-0006-HP, Iolitec, USA) in Kombination mit dem Triblock-Copolymer Fluosurf
(1903-01, emulseo, Frankreich) verwendet. Der präzise und programmierbare Fluss wurde

127