Kapitel 13

13.3 Unabhängige Variation der Tröpfchengröße und Abstände

Mit der oben beschriebenen Methode lassen sich Tröpfchengröße und deren Abstände nicht
unabhängig voneinander variieren. Außerdem kann der Abstand über einen weitaus größeren
Bereich variiert werden als die Tröpfchengröße selbst. Große Tröpfchen haben zwangsläufig
einen sehr geringen Abstand. Größere Tröpfchen und eine unabhängige Variation der Ab-
stände kann durch abwechselnde Pulse der Flussströme erreicht werden. In Abbildung 73
wurde der Abstand der Tröpfchen bei konstanter Tröpfchengröße variiert. Es erscheint insbe-
sondere bei dieser Methode vorteilhaft, wenn beide Schlauchlängen zwischen Spritzenpumpe
und T-Kreuzung gleich lang sind, um die gleichen fluidischen Eigenschaften in den zur T-Kreu-
zung führenden Kanälen zu gewährleisten.

Auch diese Methode hat ihre Einschränkung. Die Frequenz, mit der die Tröpfchen produziert
werden können, ist limitiert. Für kleine Tröpfchengrößen wird dabei zunehmend Inhomogeni-
täten beobachtet. Sie eignet sich also insbesondere für große Tröpfchen.

Abbildung 73 Tröpfchen, welche durch abwechselnde kurze Impulse an einer T-Kreuzung hergestellt
wurden. Die Pulsdauer der Ölphase wurde dabei schrittweise vergrößert. Der Abstand der Tröpfchen
nimmt mit zunehmender Pulsdauer der Ölphase zu. Die Tröpfchengröße bleibt konstant.

139
Anhang

13.4 Die Wahl der magnetischen Beads

Mehrere Unternehmen bieten Streptavidin-beschichtete magnetische Beads aus verschiede-
nen Materialien und in verschiedenen Größen an. Sie wurden hinsichtlich der Signalintensität
und der Stabilität der Dispersion getestet. Wenn nicht anders angegeben, betrug der durch-
schnittliche Durchmesser der getesteten Beads 1 µm.

Tabelle 8 Auflistung der hier getesteten Streptavidin-beschichteten Partikel

Name des Produkts Hersteller Produktnummer - Lot

A Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Invitrogen catalog No 65601 – Lot 00583409
B Pierce™ Streptavidin Magnetic Beads Pierce Beads Prod # 88816 – Lot # SG249234
C Streptavidin Magnetic (0,65 µm) Sphero Tech Cat No: SVM-5-5H - Lot AJ01
D Streptavidin Magnetic (0,21 µm) Sphero Tech Cat No: SVM-025-5H- Lot AG 03
E ScreenMAG/G-Streptavidin Chemicell Prod # 2205-1 - Lot: 1007/17

Um die Eignung der verschiedenen magnetischer Beads die Anwendung in der Analyseplatt-
form zu testen, wurden, wie in Kapitel 6.3.2 beschrieben, sequenzielle Messungen mit jeder
Art der magnetischen Beads durchgeführt. Dabei betrug c(Beads) = 100 µg/mL für alle Beads.
Die Proben waren Verdünnungsreihen von Atto-647N-Biotin in PBST (Abbildung 74 a)).

Um die Stabilität der Dispersionen zu testen, wurden Eppendorf-Röhrchen mit der jeweiligen
Bead-Dispersion in PBST (c(Beads) = 100 µg/mL) gleichzeitig suspendiert und dann aufrecht
stehen gelassen. In regelmäßigen Abständen wurden Fotos aufgenommen. Für 0,65 µm -
Streptavidin Beads wurde die höchste Sedimentationsrate beobachtet. Alle anderen Beads
bildeten mehrere Minuten lang eine stabile Dispersion.

140
 Kapitel 13

a) 40 A - Dynabeads b)
B - Pierce Beads
C - Spherotech 0,65 µm
D - Spherotech 0,21 µm
32 min
slope [a.u.]
E - Chemicell Beads
20

128 min

0
1E-4 0,001 0,01 0,1 1 10
c(Atto-647N-Biotin) [ng/ml]

Abbildung 74 Die Steigung des Signals in Abhängigkeit von der Zielkonzentration für Streptavidin-
beschichtete Beads verschiedener Hersteller. Dynabeads MyOne Streptavidin T1 zeigen die höchste
Sensitivität für Atto-647N-Biotin. b) Die Stabilität der Dispersion der verschiedenen magnetischen
Beads in PBST. Die Stabilität der Partikel hängt stark von ihrer Zusammensetzung ab. Nach 128 Minuten
sind die Spherotech-Partikel (0,65 µm) vollständig sedimentiert, während die anderen Partikel noch als
Dispersion erkennbar waren.

Dynabeads MyOne Streptavidin T1 zeigte die beste Eigenschaftskombination, da sie die höchs-
ten Signale durch die Zielmolekülen zeigen und ausreichend stabile Dispersionen in PBST bil-
den (Abbildung 74 a)). Streptavidin-beschichtete Partikel der Firma Spherotech (0,65 µm) zeig-
ten zwar eine vergleichsweise gute Empfindlichkeit gegenüber dem Zielmolekül, aber eine
deutlich stärkere Tendenz zur Sedimentation. Bereits nach 4 Minuten war eine Sedimentation
dieser Dispersion Partikel erkennbar (Abbildung 74 b). Die hohe Tendenz zur Sedimentation
erhöht das Risiko falscher Partikelkonzentrationen und erschwert die Handhabung erheblich.
Die Dispersion der Dynabeads war dagegen für einige Minuten stabil.

141
Anhang

13.5 Steuerung der Magnetfalle

Die Steuerung der Magnetfalle kann auch in den Ablauf integriert werden. Dafür wird ein Sig-
nal genutzt, welches vom Hersteller zur Ansteuerung eines Ventils gedacht war. Dafür wird
die elektrische Spannung (24 V) über einen Optokoppler auf 5 V reduziert. Dieses Signal kann
von einem Arduino-Mikrokontroller ausgelesen werden, um die Servomotoren der Magnet-
falle anzusteuern. Zu diesem Zweck wurde der Mikrokontroller mit folgendem Skript betrie-
ben:

Valve-controlled-Magnetic-Trap.ino

// include the servo library

#include <Servo.h>

// create servo object to control a servo

Servo Servo_1;
Servo Servo_2;

// constants: input and output pins

const int VALVE_INPUT_PIN = A0;
const int SERVO_1_PIN = 9;
const int SERVO_2_PIN = 10;

// constant: the threshold if the valve is open or closed

// the analog input is read (0 - 1023), the threshold is in the middle

const int THRESHOLD = 512;

// constants: the trap can be open or close.

// easier to understand than HIGH or LOW
const int CLOSED = LOW;
const int OPEN = HIGH;

// constants: positions of servo end points and positioning delay in microseconds

const int SERVO_1_CLOSED = 7;
const int SERVO_1_OPEN = 100;
const int SERVO_2_CLOSED = 159;
const int SERVO_2_OPEN = 64;
const int SERVO_DELAY = 10;

// variables
int switch_state = LOW; // the current state of the input pin
int trap_state = OPEN; // will a high switch state change the servo position

void setup() {
// setup code here, run once after reset or power on:

// setting pins to input, and output

pinMode(VALVE_INPUT_PIN, INPUT);
pinMode(LED_BUILTIN, OUTPUT);

// attach the servos

Servo_1.attach(SERVO_1_PIN);
Servo_2.attach(SERVO_2_PIN);

142
 Kapitel 13

// moving servos to defined position

open_trap();

// get the current state of the valve

switch_state = get_valve_state();
}

void loop() {
// main code, run repeatedly:

// VALVE SWITCH STATE

// -------------------

// read the current state of the input

int current_valve_state = get_valve_state();

// change trap position if the switch state has changed

if (current_valve_state != switch_state) {

// register the change

switch_state = current_valve_state;

if (switch_state == HIGH) {
// show that there is currently a input signal
// and close the trap
digitalWrite(LED_BUILTIN, HIGH);
trap_state = close_trap();
} else {
// show that there is currently no input signal
// and open the trap
digitalWrite(LED_BUILTIN, LOW);
trap_state = open_trap();
}
}
}

int get_valve_state() {
// returns either HIGH or LOW depending on the analog signal on the input pin
int current_valve_input = analogRead(VALVE_INPUT_PIN);
if (current_valve_input < THRESHOLD) {
return HIGH;
} else {
return LOW;
}
}

int open_trap() {
Servo_1.write(SERVO_1_OPEN);
Servo_2.write(SERVO_2_OPEN);
return OPEN;
}

int close_trap() {
Servo_1.write(SERVO_1_CLOSED);
Servo_2.write(SERVO_2_CLOSED);
return CLOSED;
}

Dieses Skript wurde von Holger Frey im Auftrag erstellt.

143
Anhang

13.6 Programmierter Ablauf der sequentiellen Messung

Die Software QMix Elements erlaubt es, zahlreiche Pumpschritte der Spritzenpumpen zu pro-
grammieren. So werden sequentielle Messung mit hoher Reproduzierbarkeit ermöglicht. Ei-
ner der Schlüsselschritte ist die alternierende Zusammenführung der Proben mit dem Tröpf-
chenzug der Magnetpartikel. Dieser Ablauf ist in Abbildung 75 dargestellt und wird hier im
Detail beschrieben.

i) Positionierung der Probe: Ein Überschuss der ersten Probe wird vorausgeschickt,
um zu gewährleisten, dass anschließend ab dem ersten Tröpfchen die gleiche Pro-
benmenge enthalten sein wird. Dabei wird zunächst nur Q2 betätigt.
(Q1 = 0 µL/min, Q2 = 1 µL/min, V2 = 0,5 µL)
ii) Dosierschritt: Q1 und Q2 werden gleichzeitig betätigt, sodass zu dem vorbereiteten
Tröpfchenzug der Magnetpartikeldispersion (gelb) jeweils eine Probenlösung
(blau) hinzudosiert wird (Q1 = 5 µL/min, V1 = 5 µL Q2 = 1 µL/min, V2 = 1 µL).
iii) Positionierung der Samples: Q1 stoppt nun wieder, während Q2 die nächste Probe
in Position bringt (Q1 = 0 µL/min, Q2 = 6 µL/min, V2 = 3 µL,). Phase ii) und iii) wer-
den so lange wiederholt, bis alle Proben mit dem vorgelegten Tröpfchenzug zusam-
mengeführt wurden. Die beiden Flussgeschwindigkeiten sind dabei so aufeinander
abgestimmt, dass die Flussgeschwindigkeit in der Summe konstant ist (4).

144
 Kapitel 13

Abbildung 75 Schematische Darstellung des mikrofluidischen Ablaufs für sequenzielle Messungen.

a) An der ersten T-Kreuzung werden mehrere Proben (blaue Farbtöne) nacheinander mit dem
Tröpfchenzug der Bead-Dispersion (gelb) zusammengeführt. Die alternierenden
Flussgeschwindigkeiten von Flow 1 und Flow 2 dargestellt. Die Summe der beiden
Flussgeschwindugkeiten bleibt über den gesammten Zeitraum Konstant. b) Zusammenführung des
Reaktionsgemischs mit dem Detektionsantikörper (rot). Weitere Farben kennzeichnen Mischungen
der wässrigen Phasen: Grün, Probe + Beads. Braun, Probe + Beads + Detektionsantikörper. Violett,
Probe + Detektionsantikörper. c) Darstellung des gesamten Prozesses. Abbildung mit Genehmigung
aus Metzler et al. 2020 übernommen (Supporting Information).139

Die Proben werden dabei in alternierenden Pumpschritten zu den Tröpfchen der Magnetpar-
tikeldispersion dosiert. Um zu gewährleisten, dass alle Tröpfchen einer Sequenz die gleiche
Ladung tragen, wird ein kleiner Überschuss jeder Probe in den Kanal vorgelegt. Q1 und 2 wer-
den dabei in alternierenden Schritten folgendermaßen betätigt:

i) Positionierung der Probe, ii) Dosierung der Probe, iii) Positionierung der nächsten Probe

Phase ii) und iii) werden so lange wiederholt, bis alle Proben mit dem vorgelegten Tröpfchen-
zug zusammengeführt wurden. Die beiden Flussgeschwindigkeiten sind dabei so aufeinander
abgestimmt, dass die Summe der Flussgeschwindigkeiten zu jeder Zeit konstant ist (4).

145
Anhang

An der zweiten T-Kreuzung wird Q3 mit konstanter Flussgeschwindigkeit hinzudosiert

(Q1 + Q2 = 6 µL/min, Q3 = 1 µL/min, Abbildung 75 b). Zu den Proben-Tröpfchen wird an dieser
die Detektionsantikörperlösung hinzugefügt. Zwischen den Seqeunzen entstehen Tröpfchen
mit reiner Detektionsantikörperlösung (rot). Die unverdünnte Detektionsantikörperlösung er-
scheint heller als die anderen Tröpfchen und kann bei der Synchronisation des Ablaufs als Ori-
entierung dienen.

146
 Kapitel 13

13.7 Auflistung einzelner Pumpschritte sequentieller Messungen

Abbildung 76 Schemazeihnung mit relevanten Schlauchlängen Bezeichnung der Pumpen wie sie im Skript vor-
kommen. P8 Dient zum Spülen des ganzen Systems nach Ablauf einer sequentiellen Messung („final wash“, Ta-
belle 9).

Abbildung 76 zeigt den fluidischen Aufbau schematisch. Die Pumpen sind wie im folgenden
Skript (Tabelle 9) bezeichnet. In der folgenden Tabelle sind alle in der Software QMix Elements
programmierten Pumpschritte aufgelistet. Die aufgelisteten Pumpschritte werden automa-
tisch ausgeführt.

147
Anhang

Tabelle 9 Der Ablauf einer sequentiellen Messung mit der Software QMix Elements. Die
Programmierung des Ventils wurde zum Umschalten der Magnetfalle genutzt.

148
 Kapitel 13

13.8 Berechnung der Farbstoffdichte auf den magnetischen Beads

In Kapitel 7 wurde die Farbstoffdichte auf den magnetische Beads diskutiert. Die folgenden
Werte lagen der Überlegung zu Grunde:

1. Berechnung der Beads pro Well

V(Beads) = 30 µl
c(Beads) = 100 µg/mL
m(Beads) = 3 µg
aus Herstellerangaben 850000 Beads/µg
daraus ergibt sich 2,55 x 106 Beads/Well

2. Berechnung der Moleküle pro Well

V(Atto-647N-Biotin) 30 µL
c(Atto-647N-Biotin) Variabel
M(Atto-647N-Biotin) 1057 g/mol
Avogadrozahl N 6,02E+23 1/mol

3. Daraus ergeben sich folgende Werte

c(Atto-647N-Biotin) c(Atto-647N-Biotin)
Anzahl Moleküle Moleküle/Bead Moleküle/µm²
/pg/mL /nmol/L
200000 189,2 3,42E+12 1,34E+06 106.679
100000 94,6 1,71E+12 6,70E+05 53.339
50000 47,3 8,55E+11 3,35E+05 26.670
25000 23,7 4,27E+11 1,68E+05 13.335
12500 11,8 2,14E+11 8,38E+04 6.667
6250 5,9 1,07E+11 4,19E+04 3.334
3125 3,0 5,34E+10 2,09E+04 1.667
1563 1,5 2,67E+10 1,05E+04 833
781 0,7 1,34E+10 5,24E+03 417
391 0,4 6,68E+09 2,62E+03 208
195 0,185 3,34E+09 1,31E+03 104
98 0,092 1,67E+09 6,55E+02 52
49 0,046 8,35E+08 3,27E+02 26

149