Methoden

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Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) Die Kenntnis der Bindungskonstanten

zur Charakterisierung biomolekularer
Wechselwirkungen
Gerrit J. K. Praefcke1 und Christian Herrmann2
1Zentrum für Molekulare Medizin, Universität zu Köln, 2Physikalische Chemie 1,
Ruhr-Universität Bochum

Kalorimetrie ist ein klassisches Verfahren,
um chemische Reaktionen quantitativ zu
untersuchen und sie thermodynamisch zu
beschreiben. Jede Reaktion ist mit einer
Enthalpie-Änderung (∆H) verbunden, das
heißt Wärme wird an die Umgebung abge-
geben (exotherme Reaktion) oder von ihr
aufgenommen (endotherme Reaktion). Die-
se universelle Eigenschaft ist unabhängig
von der Größe der Moleküle, sodass alle che-
mischen und biochemischen Reaktionen un-
tersucht werden können. Dies schließt die
Bildung von Komplexen zwischen Prote-
inen, DNA, Lipiden oder niedermolekula-
ren Biomolekülen ein, die zumeist auf nicht-
kovalenten Bindungen beruhen. Ein wei-
terer Vorteil dieser Methode ist, dass weder
Immobilisierung noch Markierung der Re-
aktionspartner erforderlich ist.
Auch komplizierte biologische Prozesse
beruhen meistens auf der Bildung eines
Komplexes zwischen zwei Partnern:
A + B O AB
Die Gleichgewichtslage dieses Komple-
xes ist durch die Bindungskonstante K de-
finiert, die auch als Affinität bezeichnet wird:
[ΑΒ]
K=
[Α] ⋅ [Β]
Diese Konstante ist durch fundamentale
Gleichungen mit der freien Reaktionsen-
thalpie ∆G verknüpft, die wiederum aus der
Reaktionsenthalpie ∆H und der Reaktions-
entropie ∆S zusammengesetzt ist:
–RT lnK = ∆G = ∆H–T∆S
K ermöglicht eine objektive Beurteilung der
Stärke einer Interaktion zwischen zwei Bio-
molekülen. Der Vergleich mit konkurrie-
renden Bindungspartnern oder verschiede-
nen Zuständen der Bindungspartner (Phos-
phorylierung etc.) definiert die Spezifität der
Wechselwirkung und damit ihre physiolo-
gische Bedeutung. Darüber hinaus erlauben
die gemessenen Enthalpie- und Entropie-
änderungen Rückschlüsse auf die moleku-
laren Grundlagen der Wechselwirkung[1].
Mit der Kalorimetrie wird die Enthalpie-
änderung direkt und daher sehr präzise er-
halten und gleichzeitig auch die abgeleite-
ten Größen wie die Änderung der Entropie
und der Wärmekapazität[2]. Darüber hinaus
ergibt die Auswertung einer kalorimetri-
schen Titration auch die stöchiometrische
Zusammensetzung eines Komplexes, lässt
also beispielsweise erkennen, ob ein Protein
eine oder zwei Bindungsstellen für einen be-
stimmten Liganden aufweist. Solche kom-
plexeren Interaktionen können dann auch
bezüglich kooperativer Eigenschaften oder
bezüglich ihrer Kopplung an andere Gleich-
gewichte oder dritte Interaktionspartner ana-
lysiert werden[3]. Insbesondere die durch ei-
ne Interaktion hervorgerufene Verschiebung
von Protonierungsgleichgewichten be-
stimmter Aminosäureseitenketten, die auf
die Stärke der Bindung oder auf die kataly-

A
B

Abb. 1: (A) Schema eines isothermen Titrationskalorimeters. Die roten und blauen Pfeile repräsentieren den exakt equilibrierten Wärmefluss von der elek-
trischen Heizung (rot) zu der Referenz- und der Probenzelle und von dort zur kühleren Umgebung (blau). Kleinste Temperaturänderungen (∆ ∆T) zwischen den
beiden Zellen werden detektiert und durch Änderung der Heizleistung kompensiert. (B) Typisches ITC Experiment. Zu Beginn wurden 54 µM des Ras-Effek-
tors RalGDS in die Probenzelle und 700 µM Ras in die Spritze vorgelegt. Im oberen Teil führen die Injektionen von Ras im Abstand von 4 Minuten zu jeweils
negativen Peaks in der Heizleistung, die aufgrund zunehmender Sättigung des Komplexes Ras-RalGDS immer kleiner werden. Offensichtlich ist diese Reak-
tion exotherm. Der untere Teil zeigt die Auswertung der Daten, die für den Komplex Ras-RalGDS eine Affinitätskonstante von 7 · 105 M–1 und eine Reak-
tionsenthalpie von – 12 kcal/mol ergibt.

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tische Wirksamkeit der beteiligten Protei-
ne einen großen Einfluss haben, ist mit die-
ser Methode vielfach untersucht worden[4].
Grundlagen der ITC
In Abbildung 1A ist die Funktionsweise eines
isothermen Titrationskalorimeters schema-
tisch dargestellt. Es besteht aus einer Refe-
renz- und einer Probenzelle, zwischen de-
nen eine sehr kleine und genau messbare
Temperaturdifferenz besteht. In der Pro-
benzelle wird eine Lösung mit dem Bin-
dungspartner B vorgelegt, während die Lö-
sung des Interaktionspartners A in die Sprit-
ze gefüllt wird. Aus dieser erfolgen schritt-
weise Injektionen in die Probenzelle hinein,
sodass B mit A vermischt und der Komplex
AB gebildet werden kann. Die Referenzzelle
wird nur mit Puffer gefüllt und fest ver-
schlossen. Sie dient als Referenzpunkt für
die empfindliche Messung einer Tempera-
turänderung, die in der Probenzelle statt-
findet. Beide Zellen weisen eine höhere
Temperatur als die sorgfältig thermostati-
sierte Umgebung auf, sodass beide Zellen
jeweils mit einem kontrollier- und messba-
ren Heizstrom versorgt werden, um ihre
Temperatur konstant (isotherm) zu halten.
Nach jeder Injektion aus der Spritze führt
die Bildung des Komplexes AB zu einer zu-
sätzlichen Wärmeaufnahme oder -abgabe
der Probe. Das Kalorimeter reagiert darauf
mit einer entsprechenden Erhöhung oder
Absenkung der elektrischen Heizleistung,
um die Temperatur in der Probenzelle ab-
solut konstant zu halten. Diese Spitzen der
Heizleistung sind im oberen Teil der Abbil-
dung 1B erkennbar. Durch Integration wird
die frei gesetzte Wärmemenge erhalten, die
im unteren Teil der Abbildung 1B gegen das
steigende Verhältnis der Konzentrationen
von A und B aufgetragen wird. Durch An-
passen einer theoretischen Kurve an diese
Daten werden die Bindungskonstante K des
Komplexes AB, dessen Bildungsenthalpie
∆H sowie seine stöchiometrische Zu-
sammensetzung erhalten. Mit Hilfe der oben
angegebenen Gleichungen kann auch die
Änderung der Entropie ∆S berechnet wer-
den. Durch Messung von ∆H bei verschie-
denen Temperaturen wird außerdem die Än-
derung der Wärmekapazität ∆Cp bei Bildung
des Komplexes erhalten.
Die Empfindlichkeit heutiger Titrations-
kalorimeter erlaubt die Verwendung von
Konzentrationen in der Probenzelle (etwa
1,5 ml) hinunter bis 2 – 5 µM. Das bedeu-
tet, dass Affinitätskonstanten bis zu 108 M–1
genau bestimmt werden können. Durch
Verdrängungsexperimente mit geeigneten
Liganden kann dieser Bereich sogar bis K =
1011 M–1 erweitert werden[5]. Für schwache
Komplexe (K < 105 M–1) werden höhere
Konzentrationen benötigt, sodass hier die
Verfügbarkeit oder Löslichkeit der Prote-
ine limitierend werden kann. Homogene
Komplexe, wie zum Beispiel Proteindimere
oder Micellen lassen sich durch Messung der
Dissoziation untersuchen[6, 7]. Die dafür not-
wendigen Verdünnungsexperimente können
mittels ITC direkt durchgeführt und ausge-
wertet werden. Sogar die Messung von Re-
aktionsgeschwindigkeiten ist innerhalb be-
stimmter Grenzen möglich, welche durch
die Antwortzeit des Kalorimeters von meh-
reren Sekunden gesetzt werden, wie an dem
zeitlichen Verlauf der Änderung der Heiz-
leistung in Abbildung 1B zu sehen ist.
Anwendung bei Proteinkomplexen
Die Untersuchung der Wechselwirkungen
des kleinen GTP-bindenden Proteins Ras
mit den zahlreichen Effektorproteinen zeigt,
dass trotz großer struktureller Ähnlichkeit
der Ras/Effektorkomplexe deutliche Unter-
schiede in der Affinität dieser Komplexe und
in den jeweiligen Beiträgen der Enthalpie-
und Entropie-Änderungen bestehen[8]. Ei-
ne Mutationsanalyse der energetischen Bei-
Methoden
träge der einzelnen Aminosäuren, die sich in
der Kontaktfläche zwischen den beiden Pro-
teinen befinden, ist mit Hilfe kalorimetri-
scher Messungen durchgeführt worden[9].
Sie zeigt eine heterogene Verteilung der Bin-
dungsenergie auf die einzelnen Aminosäu-
rereste (Abb. 2A), wobei sich die relativ gro-
ßen enthalpischen und entropischen Beiträ-
ge der einzelnen Aminosäuren zum größ-
ten Teil kompensieren (Abb. 2B und C). Ei-
ne solche Enthalpie/Entropiekompensation
ist typisch für biomolekulare Wechselwir-
kungen, die auf der Bildung von Ionenpaa-
ren, Wasserstoffbrücken und van der Waals
Wechselwirkungen beruhen und die gegen
Effekte veränderter Solvatation und Be-
weglichkeit der Moleküle aufgerechnet wer-
den müssen.
Ein anderes Beispiel zeigt (siehe Abb. 3),
wie die Untersuchung von komplexen Bin-
dungsreaktionen die Spezifität der Bin-
dungspartner in ihrem biologischen Kontext
erklären kann[10]. Die an der Endozytose be-
teiligten Proteine Epsin1 und Eps15 verfü-
gen über mehrere kurze Bindungsmotive für
eine Domäne des AP2 Adapterkomplexes
und konkurrieren in der Zelle mit anderen
Proteinen um die Bindung. Die
Titrationskurven zeigen, dass
beide Proteine über eine hoch
affine und zwei bis drei niedrig
affine Bindungsstellen für AP2
verfügen. Das erlaubt Eps15
und Epsin1 andere Bindungs-
partner von AP2 zu verdrängen,
wenn sie in großer Dichte an der
Plasmamembran vorliegen und
damit die Chance zur Vernet-
zung bieten. Gleichzeitig kann
man bei Kenntnis der relativen
Konzentrationen der Proteine
vorhersagen, welcher der mög-
lichen Komplexe in der Zelle am
häufigsten vorliegt.
Abb. 2: Die energetischen
Beiträge einzelner Aminosäure-
Seitenketten zur Wechselwir-
kung zwischen Ras und seinem
Effektorprotein RalGDS wurden
durch kalorimetrische
Messungen mit den jeweiligen
Alanin-Mutanten quantifiziert
und hier auf den Kontaktflä-
chen der beiden Proteine (je 90°
zum Betrachter gedreht) durch
einen Farbcode dargestellt. Die
Änderungen in der freien Reak-
tionsenthalpie (∆∆∆G), der
Enthalpie und der Entropie, die
sich durch die jeweilige Alanin-
Mutation im Vergleich zum
Wildtyp ergeben, sind rot für
positive Beiträge zur Interak-
tion und blau für negative.
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Abb. 3: Vergleich der Titrationen der AP2
bindenden Domänen von Eps15 (Blau) und
Epsin1 (Rot) mit ihrem Bindungspartner, einer
Domäne der α-Untereinheit des AP2 Komplexes.
Gut erkennbar verfügen beide Proteine über eine
hoch affine Bindungsstelle für AP2, die in den
ersten Titrationsschritten gesättigt wird, bevor
die anderen, niedrig affinen Bindungsstellen
besetzt werden.
Ausblick
Die abgeschlossenen Genomprojekte haben
die Möglichkeit geschaffen, mit Hilfe von
Hochdurchsatztechniken auch auf der Ebe-
ne des Proteoms die komplexe Vielfalt bio-
logischer Wechselwirkungen zu analysieren.
Ebenso hat die schnell zunehmende Zahl
dreidimensionaler Strukturen von Proteinen
und ihren Komplexen unser Verständnis bio-
molekularer Interaktionen enorm vorange-
bracht. Zusammen mit thermodynamischen
Daten, die vor allem mit Hilfe der ITC er-
halten werden, wird auch zunehmend der
quantitative Zusammenhang von Struktur
und Bindungsenergie nicht-kovalenter
Komplexe deutlich. So wird zum Beispiel
durch Berücksichtigung detaillierter Bin-
dungsdaten pharmakologisch interessanter
Leitstrukturen die Validierung und weitere
Optimierung dieser Substanzen ermöglicht.
In Zukunft wird es darauf ankommen, die
Kombination struktureller und energetischer
Daten weiter auszubauen und sie zu nutzen,
um theoretische Methoden zur Berechnung
und Vorhersage biomolekularer Interaktio-
nen zu entwickeln und zu verbessern.
Danksagung
Wir danken der Deutschen Forschungsge-
meinschaft, der Europäischen Union (Marie
Curie Programm) und der VW-Stiftung für
die Unterstützung unserer Forschungsarbeit.
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Korrespondenzadresse:
Prof. Dr. Christian Herrmann
Ruhr-Universität Bochum
Physikalische Chemie I
Arbeitsgruppe Protein-Interaktionen
Fakultät für Chemie
Universitätsstraße 150
D-44780 Bochum
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