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4 SWS
4 CREDITS
Lichtenbergstraße 4
85747 Garching
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Fax + 49-89-289-13363
E-Mail: wolfgang.eisenreich@mytum.de
3 CHROMATOGRAPHIE .....................................................................................................................................
4 BIOORGANISCHE REDOXSYSTEME............................................................................................................
5 REDOXSYSTEME/DIFFUSIONSPOTENTIAL...............................................................................................
6 KINETIK ...............................................................................................................................................................
Versuch: Identifizierung des kinetischen bzw. thermodynamischen Produkts der Reaktion von Semicarbazid mit
Furfural bzw. Cyclohexanon (10. Versuchstag) ........................................................................................................................
Versuch: Struktur- und Sequenzbestimmung eines unbekannten Dipetids anhand von NMR (8. bis 10. Versuchstag)
Versuch: Struktur- und Sequenzbestimmung eines unbekannten Dipetids anhand von MS (8. bis 10. Versuchstag)
12.1 PH–MESSUNG..........................................................................................................................................................
12.2 SPANNUNGSMESSUNG..............................................................................................................................................
13 ANHANG: GERÄTEKUNDE
1
Empfohlene Lehrbücher
S. Hauptmann, Organische Chemie, DVG, Leipzig, 1991;
B. Schrader, Kurzes Lehrbuch der Organischen Chemie, de Gruyter, Berlin 1985.
M. A. Fox und J. K. Whitesell, Organische Chemie, Spektrum Akad. Verlag, Heidelberg, 1995.
A. Zeeck, S. Eick, B. Krone und K. Schröder, Chemie für Mediziner, Urban & Schwarzenberg
Verlag, München, 3. Auflage, 1997.
P. W. Atkins, Physikalische Chemie, Verlag Chemie, Weilheim usw., 2. Auflage, 1999
Wikipedia
Spektroskopische Methoden
Williams/Fleming, Strukturaufklärung in der organischen Chemie, 6. Auflage, Thieme,
Stuttgart, 1991
Chromatographie In: Aced/Möckel, Liquidchromatographie, Verlag Chemie, Weinheim, 1991
2
1.1 Sicherheitsvorkehrungen
Eine einzelne Person darf niemals allein im Labor arbeiten.
In den Labors ist das Essen, Trinken und Rauchen nicht gestattet!
Alle Unregelmäßigkeiten im Labor sind unverzüglich zu melden.
Prägen Sie sich außerdem gut ein: Wo ist
der nächste Feuerlöscher
die nächste Löschdecke
die nächste Augendusche
eine Notbrause erreichbar und
welche Fluchtwege gibt es im Labor.
Es wird davon ausgegangen, dass jeder Praktikant von der Laborordnung Kenntnis genommen
hat (hängt in jedem Labor aus!).
Im Labor ist stets eine Schutzbrille mit Seiten- und Stirnblende zu tragen. Dies gilt vor allem bei
Arbeiten mit Laugen (organischen Aminen) und konzentrierten Säuren sowie bei Arbeiten unter
Vakuum und Druck.
Brennbare Lösungsmittel nicht bei offener Flamme handhaben. Bei Arbeiten mit Ether ist
höchste Vorsicht geboten. Keine Flamme im Umkreis von einigen Metern. Etherdämpfe sind
schwerer als Luft und kriechen auf der Tischplatte entlang. Am besten bei laufender Lüftung im
Abzug arbeiten. Ether stets im Dunkeln aufbewahren!
Beim Ausschütteln mit niedrig siedenden Lösungsmitteln Scheidetrichter nach jedem Schütteln
belüften. Bei Bedarf vom Assistenten zeigen lassen.
Zur Füllung von Ölbädern ist Siliconöl zu verwenden. Bei Arbeiten mit ihnen ist stets ein
Thermometer zur Kontrolle der Badtemperatur anzubringen. Vorsicht beim Wechsel vom
Wasser– zum Ölbad: Kolben sorgfältig trocknen. Wasser im Ölbad sinkt zu Boden und spritzt
bei Temperaturen über 100 °C.
Ölbäder, die über 190-200 °C betrieben werden müssen, sollten wegen der damit verbundenen
Qualmentwicklung im Abzug benutzt werden. Auf ihre erhöhte Zündfähigkeit wird besonders
verwiesen.
Als Kühlerschläuche nur fest sitzende, nicht poröse Gummischläuche verwenden.
Bei Destillationen sind sämtliche Teile vorher auf evtl. vorhandene Schäden, insbesondere
Sprünge an den Kolben (Sternsprünge), zu untersuchen. Die aufgebaute Apparatur muss vor
Inbetriebnahme vom Assistenten abgenommen werden! Zur Destillation wird die Temperatur
langsam gesteigert. Vorsicht vor Siedeverzügen! Abhilfe durch Verwendung von
Siedesteinchen.
Versuchsaufbauten, die über Nacht oder länger stehen bleiben müssen, sind deutlich mit Namen,
Inhaltsangabe und Datum zu kennzeichnen.
Ätzende oder toxische Lösungen niemals mit dem Mund pipettieren, sondern Pipettierball
(Peleus), Pasteur– oder Fortuna–Pipette verwenden.
Spritzflaschen mit Lösungsmitteln sind deutlich zu kennzeichnen. Unetikettierte Flaschen und
Büchsen werden konfisziert.
Informieren Sie sich über die Regeln zur Abgabe von Lösungsmitteln und festen Reagenzien.
Etikettieren Sie Ihren Arbeitsplatz mit einem Namensschild (Name, Vorname).
Im Praktikumssaal ist kein Platz für Straßenkleidung.
Taschenrechner
Millimeterpapier (DIN A4)
Lineal und Zeichendreieck
Filzstift (wasserfest)
Schere
Klebeetiketten
Schutzhandschuhe (Handwerkerhandschuhe)
Labormantel
Schutzbrille
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Zur Reinigung von chemischen Verbindungen nutzt man häufig die unterschiedlichen
physikalischen Eigenschaften der zu reinigenden Verbindungen und der Verunreinigungen aus, z.B.:
Löslichkeit
Siedepunkt/Schmelzpunkt
Verteilungsgrad in unterschiedlichen Lösungsmitteln
Die meistangewendeten Methoden zur Reinigung sind Umkristallisieren (von Feststoffen), Destilla-
tion (von Flüssigkeiten) und die Extraktion.
2.1 Umkristallisieren
Beim Umkristallisieren nutzt man die Tatsache aus, dass Verunreinigungen bedingt durch ihren
mengenmäßig kleinen Anteil (<5–10 %) besser in bestimmten Lösungsmitteln löslich sind als die
eigentliche Substanz (> 90 %). Für das vollständige Auflösen der Substanz ist daher eine relativ
große Lösungsmittelmenge notwendig. Durch Wärmezufuhr wird die Löslichkeit der Substanz
beträchtlich erhöht, wodurch die notwendige Lösungsmittelmenge erheblich reduziert wird.
Ein Kriterium für die Reinheit einer (festen) Substanz ist deren Schmelzpunkt. Reine Substanzen
besitzen einen definierten Schmelzpunkt (±1 C). Ist eine Substanz erheblich verunreinigt, sinkt ihr
Schmelzpunkt (Schmelzpunkterniedrigung) und der Schmelzbereich nimmt zu (±10–20 C).
2.2 Extraktion
Bei der Extraktion nutzt man die unterschiedliche Löslichkeit von Verbindungen in
unterschiedlichen Lösungsmitteln aus. Beispielsweise ist die Löslichkeit von Fett in Wasser gering,
in Chloroform allerdings hoch. Im Gegensatz dazu lösen sich die (polaren) Zucker in Chloroform
praktisch nicht, in Wasser jedoch sehr gut.
Für die Extraktion verwendet man ein Lösungsmittelsystem aus zwei unterschiedlich polaren, nicht
mischbaren Lösungsmitteln (z.B. Wasser/Chloroform). Eine Substanz wird sich nun je nach Präfe-
renz in einem Lösungsmittel (= Phase) besser lösen als im anderen. Das Konzentrationsverhältnis
der Substanz in den zwei Phasen ist durch den Nernst’schen Verteilungskoeffizienten (K =
konstant) vorgegeben. Unterschiedliche Substanzen haben unterschiedliche Verteilungskoeffi-
zienten und deshalb reichern sie sich in der einen oder anderen Phase an. Das ist das Trennprinzip
der Extraktion.
Versuch: Trennung von Naphthalin und Benzoesäure durch Extraktion (1. Kurstag)
Ca. 0,5 g des 1:1 Gemischs (Naphthalin:Benzoesäure) werden genau abgewogen und in einen 25
mL Schütteltrichter überführt und in ca. 5 mL Ether gelöst. Die Etherlösung wird mit ca. 5 mL 0,5
M NaOH ausgeschüttelt.
Vorsicht: Hierzu vorsichtig die Mischung im Schütteltrichter schütteln (dazu oben mit
Plastikstopfen verschließen. Stopfen mit Hand andrücken, umschwenken, sodass Flüssigkeit auf der
Stopfenseite ist und das Ventil frei ist, Ventil zum Belüften öffnen und wieder schließen. Das
Procedere mehrmals wiederholen). Schütteltrichter wieder in Stativ befestigen, Deckel runter.
Untere Phase (Natronlauge) in ein Becherglas ablassen. Auslass mit Wischtuch trocknen und
Etherphase auf ein (vorher ausgewogenes) Uhrglas langsam tropfen lassen.
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Im Ether bleibt Naphthalin zurück, das nach Verdampfen des Ethers bei Raumtemperatur (Uhrglas
dabei in Abzug stellen) auskristallisiert. Das mit Naphthalin gefüllte Uhrglas wird gewogen und die
Masse an Naphthalin protokolliert.
Bei Ansäuern des alkalischen Extraktes mit wenig halbkonzentrierter Salzsäure (~ 5 N) fällt
Benzoesäure aus (warum?) Kontrollieren Sie den pH Wert nach dem Ansäuern. Benzoesäure wird
dann wie oben beschrieben mittels Hirschtrichter abfiltriert, mit wenig (!!) kaltem Wasser neutral
gewaschen, im Trockenschrank bei ca. 80 °C getrocknet. Wiegen Sie anschließend beide
Substanzen zurück.
Bei Extraktionen sollten stets die einzelnen Phasen durch Zusatz des gleichen Lösungsmittels
identifiziert werden, da durch die gelösten Stoffe eine Umkehrung der Dichteverhältnisse auftreten
kann.
2.3 Destillation
Reine Substanzen besitzen einen definierten Siedepunkt. Das ist die Temperatur bei der die
Moleküle der (flüssigen) Substanz in die Gasphase übertreten können. Kühlt man diese Gasphase
ab, so kondensiert die Substanz wieder. Der Siedepunkt ist druckabhängig. Bei hohem Druck ist der
Siedepunkt höher (z.B. Schnellkochtopf: Siedepunkt von Wasser 120 °C) und bei niedrigem
Druck ist der Siedepunkt geringer (z.B. auf dem Mount Everest: Siedepunkt von Wasser 70 °C).
Bei der Angabe des Siedepunktes muss daher immer auch der Druck angegeben werden.
Die Abhängigkeit des Siedepunktes vom (Dampf–)druck wird durch die Clausius–Clapeyron–
Gleichung beschrieben:
ΔH vap,m 1 1
R T2 T1
p p e Gleichung 2-1
2 1
wobei
p1 Dampfdruck bei der Temperatur T1
-1
H vap,m molare Verdampfun gsenthalpie (J Mol )
–1 –1
R allgemeine Gaskonstan te ( 8,314 JMol K )
Mit Hilfe dieser Gleichung kann man den Siedepunkt einer Flüssigkeit bei einem bestimmten Druck
(z.B. bei 20 hPa) errechnen, wenn der Siedepunkt dieser Flüssigkeit z.B. bei Atmosphärendruck
(1013 hPa) und die Verdampfungsenthalpie bekannt sind.
Ist eine Substanz verunreinigt, kommt es ähnlich wie bei der Schmelzpunkterniedrigung hier zu
einer Siedepunkterhöhung.
Zwei Substanzen mit einem Unterschied von > 60 °C in ihren Siedepunkten können durch
Destillation einfach von einander getrennt werden. Liegen die Siedepunkt näher beieinander, so
gelingt die Destillation nicht so gut. Man findet im Kondensat der einen Substanz immer auch einen
gewissen Anteil der zweiten Substanz.
Um solche Verbindungen voneinander destillativ zu trennen, bedient man sich einer sogenannten
Kolonne (z.B.: Füllkörperkolonne, Vigreux–Kolonne). Das sind Glasrohre mit Schikanen oder
gefüllt mit Glasringen oder anderem Material, durch welche die in die Gasphase übergetretene
Substanz streicht. Da die Kolonne nicht erhitzt wird, kondensiert die Substanz zum Teil wieder und
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läuft zurück. Ein geringer Teil der Substanz erreicht aber das Kolonnenende noch in der Gasphase
und ist damit von dem Rest getrennt. Mit dieser Methode können Substanzen mit nahe beieinander
liegenden Siedepunkten getrennt werden. Je länger eine Kolonne ist, desto besser gelingt die
Trennung. (Kolonnen, die in der chemischen Industrie eingesetzt werden sind z. T. über 50 m hoch).
Allgemeine Vorsichtsmaßnahmen
Destillationen werden grundsätzlich nicht bis zur Trockene durchgeführt, wegen der Gefahr von
Überhitzung und Verätzung des Kolbens, Ansammlung explosiver Rückstände (z.B. Peroxide bei
Ethern) u.a.
Heizbäder müssen immer mit einem Kontrollthermometer überwacht werden. Ölbäder können
wegen Qualmens nur bis ca. 180 °C benutzt werden. Über 200 °C sind Ölbäder zündfähig. Heiße
Ölbäder dürfen nie mit Wasser in Berührung kommen (explosionsartiges Verdampfen des
Wassers!)!
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Fraktionierte Destillationsapparatur
Destillations-
Einfache Destillationsapparatur thermometer
Destillationsbrücke
Vorstoß
Destillations-
thermometer Wechselvorlage
Destillat
Destillationsbrücke
Kolonne
Vorstoß
Wechselvorlage
Sumpfkolben Sumpfkolben mit
Siedeperlen
Destillat
eines 1:1 Gemisches Wasser/Methanol vor. (Für eine NS1 14.5 Apparatur, 50 ml Kolben werden 20
ml Gemisch benötigt, 10 ml Methanol und 10 ml entionisiertes Wasser; Destillation aus Ölbad, in
beiden Fällen Temperatur langsam und gleichmäßig steigern.)
Zur besseren Isolierung umwickeln Sie die oberen Teile der Destillationsapparatur (Kopf bis
Kühlung) mit einer Alufolie.
(a) Das Destillat wird in Fraktionen von 1 ml mit einem Messzylinder (ersetzt die Wechselvorlage)
aufgefangen und gleichzeitig die Übergangstemperatur notiert. Die Resultate werden in einem
Volumen-/Temperaturdiagramm (Siedekurve) aufgezeichnet. X-Achse: Volumen; Y-Achse:
Siedetemperatur
(b) Für die fraktionierte Destillation wird eine ca. 20 cm lange Füllkörper– oder Vigreux–Kolonne
verwendet und ebenso wie oben verfahren. Hierbei vorsichtig erhitzen, damit die Kolonne nicht
"absäuft". Wechselvorlage wie bei (a) durch Messzylinder ersetzen.
1
NS ist die Abkürzung für Normschliff
10
3. Chromatographie
Unter Chromatographie versteht man die Trennung von Substanzgemischen aufgrund der
Verteilung zwischen zwei Phasen. Gemeinsames Merkmal der vielen unterschiedlichen Verfahren
in der Chromatographie ist das Vorbeiströmen einer beweglichen (mobilen) Phase an einer
unbeweglichen (stationären) Phase (Nernst’sche Verteilung).
Die mobile Phase ist flüssig (Flüssigchromatographie, LC) oder gasförmig (Gaschromatographie,
GC). Die stationäre Phase ist fest (Adsorptionschromatographie) oder flüssig (Verteilungschromato-
graphie). Jeder mit der mobilen Phase mitgeführte Stoff besitzt einen charakteristischen
Verteilungs- und/oder Adsorptionskoeffizienten. Daraus resultiert für jeden Stoff eine individuelle
Wanderungsgeschwindigkeit. Je fester ein Stoff an die stationäre Phase bindet, desto langsamer
wandert er.
In diesem Praktikum werden Sie zwei Beispiele für die Anwendung der Adsorptionschroma-
tographie kennen lernen. Je nach der geometrischen Anordnung der stationären Phasen
unterscheidet man:
Eine wichtige analytische Methode zur Substanztrennung ist die Dünnschichtchromatographie. Sie
ist einfach zu handhaben, hochempfindlich und arbeitet sehr schnell. Es wird aufsteigend, d.h.
gegen die Schwerkraft chromatographiert.
Die stationäre Phase wird hier von einer dünnen Schicht eines Trägermaterials (z.B. Kieselgel
(polar), Cellulose (gering polar)) dargestellt, wobei sowohl die H2O–Moleküle, die diese Schicht
gebunden enthält, als auch das feste Material selbst als Verteilungs– bzw. Adsorptionspartner der
11
Die Rf–Werte liegen also zwischen Null und Eins und sind für schnell wandernde Stoffe größer als
für langsam wandernde.
Aufgrund der sehr leichten Anwendbarkeit der DC-Methode wird diese auch heute noch weit
verbreitet zur Routineanalytik eingesetzt. Beispiele sind die Analytik von Aminosäuren oder
ätherischen Ölen in der pharmazeutischen Chemie (zahlreiche DC-Verfahren im DAB zur
Bestimmung von Drogen) und in der Lebensmittelbranche. Als Beispiel sehen Sie unten eine DC-
Trennung von verschieden ätherischen Ölen.
Im Praktikum werden Sie Analysen von Aminosäuren, Farbstoffen (Tinte) und ätherischen Ölen
mittels DC durchführen. Wiederholen Sie vor dem Versuch die Grundlagen/Anwendungen von
Aminosäuren und ätherischen Ölen.
DC von ätherischen Ölen. Platte: Kieselgel. Laufmittel: Toluol – Essigester (93:7 v/v), Anfärbung
mit schwefelsaurem Vanillin. Von links nach rechts Öle aus: Bergamot, Zedern, Eukalyptus,
Myrthe, Teebaum, Lavendel, Minze, Orange, Pinie, Fichte.
B1 und L1 – Linalool, B2 and L2 - Linaloylacetat, E1 – Cineol=Eucalyptol, G1 - Eugenol, G2 -
Caryophyllen. C1 – Cedrol?, M3 – Menthol?, P1 – Limonen?
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Die Auftragung erfolgt mit einer Kapillare (z.B. beidseitig offenes Schmelzpunkt–Röhrchen). Die
Kapillare ist vorsichtig auf die Kieselgel–Schicht aufzusetzen und nicht in die Schicht
einzudrücken. Dabei läuft die zuvor in die Kapillare aufgezogene Flüssigkeit aus. Der entstehende
Fleck soll einen geringeren Durchmesser als 2 mm aufweisen (für jede Lösung eine eigene
Kapillare). Tragen Sie Proben der sechs Referenzsubstanzen und Ihre Analysenprobe entsprechend
der Abbildung 3 auf. Die Analysenprobe enthält eine unbekannte Mischung aus diesen
Referenzsubstanzen. Nach dem Auftragen wird die Platte in etwa 3–4 Minuten durch Schwenken in
der Luft oder mit Hilfe eines Föns gut getrocknet.
Startlinie
Valin
Histidin
Leucin
Prolin
Serin
Alanin
Analysenprobe
Abbildung 3: Auftrag der Probe auf die DC–Platte Abbildung 4: Entwicklung der DC–Platte
O
COOH
HO
H2N C H Ninhydrin
HO
R
O
– CO2 2 [H]
HN H O
C
Schiff'sche Base H
R
H2O HO
O
H NH3
C
O R HO
HO reduziertes
HO
HO Ninhydrin
O O
– 3 H2O
+
–H
O O–
O O
violetter Farbstoff
Die DC–Platte muss beim Testat vorgelegt werden. Berechnen Sie die Rf–Werte aller Aminosäuren
und ermitteln Sie die Aminosäuren in Ihrer Analysenprobe.
Füllen Sie die DC–Kammer mit dem Laufmittel (ca. 0,5 cm hoch), stellen Sie dann die Platte in die
DC–Kammer und entwickeln Sie die Platte so lange, bis die Laufmittelfront ca. 1 cm von der
Oberkante entfernt ist. Markieren Sie anschließend die Laufmittelfront, und notieren Sie Farbe und
Rf–Werte aller sichtbaren Komponenten.
Sie erhalten die Lösungen von etherischen Ölen (z.B. Limette, Minze, Pfefferminzöl, Spearmint,
Eukalyptusöl) und die Lösung eines chemischen Reinstoffs (Eukalyptol), sowie als Lösungsmittel
Toluol.
Stellen sie zuerst wieder das Fließmittel her (falls keine eigenen Kammern für dieses Laufmittel
bereitgestellt werden: Fließmittel vom Versuch mit den Aminosäuren aus den Kammern
VORSICHTIG (die Dinger sind schwer! auch die Deckel sicher ablegen) in Abfallkanister für nicht
halogenhaltige, organische Lösungsmittel entsorgen, mit etwas Ethylacetat nachschwenken)
Befeuchten sie die Wände der Entwicklungskammer durch vorsichtiges Schwenken und setzen sie
die Glasabdeckung auf die Kammer, damit sich ein gleichmäßiger Dampfdruck einstellen kann.
Kammer im Abzug stehen lassen.
Fertigen sie sich eine DC-Platte mit den ungefähren Maßen Länge = 11 cm, Breite = 6 cm an,
markieren sie die Auftragspunkte (Abstand von der Unterkante 2 cm, Abstand von den Seitenkanten
1 cm) und machen sie die DC-Platte ihrer Arbeitsgruppe kenntlich (an der oberen Kante), damit sie
sie in der Entwicklungskammer identifizieren können.
Tüpfeln sie dann pro Probe mit einer Auftragskapillare auf die markierten Punkte, trocknen sie die
Auftragspunkte kurz mit dem Fön, und stellen sie die DC-Platte in die Entwicklungskammer
(Pinzette benutzen, DC-Platte am obersten Rand greifen), Abdeckung nicht vergessen.
Vorsicht: die Entwicklung verläuft rasch, ca. 10 Min. nach dem Einbringen in die
Entwicklungskammer steht die Laufmittelfront am oberen Ende der DC-Platte. Wenn die
Laufmittelfront noch ca. 0.5 cm vom oberen Ende der Platte entfernt ist, Platte rausnehmen
(Pinzette, nicht das Laufmittel inhalieren, Toluol!!), die Laufmittelfront mit einem Bleistift leicht
nachziehen, und mit dem Fön im Abzug trocknen. So fönen, dass die Luft in den Abzug geht
(Toluol!!).
Anschließend die Platte in einem Karton (liegt im Abzug bereit) im Abzug mit dem Anisaldehyd-
Reagens gleichmäßig einsprühen. Handschuhe!
Anisaldehyd = 4-Methoxy-benzaldehyd
- 0,5 mL Anisaldehyd
- 10,0 mL Eisessig (konzentrierte Essigsäure)
- 85 mL Methanol
- 5 mL H2SO4conc.
Danach die Platte mit einem Fön trocknen und im Trockenschrank auf 100 - 120 oC erhitzen. Nach
5 – 10 Minuten tauchen verschieden gefärbte Banden auf.
Analysieren Sie, ob in den ätherischen Ölen Eukalyptol=Cineol (Struktur nachschauen) vorkommt.
Dokumentieren Sie die Ergebnisse (zeichnen oder per Photo-Handy). Vergleichen Sie Ihre
Ergebnisse mit der oben gezeigten Abbildung und versuchen Sie anhand der Angaben weitere
Komponenten zu identifizieren.
Zur Validierung Ihrer Ergebnisse erhalten Sie Ausdrücke von GC/MS Spektren (Theorie von
GC/MS siehe Versuch 10) der entsprechenden Mischungen, sowie von einer Referenzprobe für
Eucalyptol. Diskutieren Sie im Protokoll die Befunde im Vergleich, sowie die Stärken/Schwächen
der unterschiedlichen Methoden.
Eine Methode zur Substanztrennung im analytischen wie auch im präparativen Maßstab stellt die
Säulenchromatographie dar. Sie kann absteigend (mit der Schwerkraft) oder schneller mit Hilfe
einer Pumpe betrieben werden. Bei der absteigenden Methode sickert die mobile flüssige Phase
durch eine locker in die Säule eingefüllte fest Phase (die wiederum Flüssigphasen–Anteile in Form
von adsorbierten H2O–Molekülen enthalten kann).
KO O O
O
N
C
H3C CH3 OK
N S+ N
Cl – x 3 H2O
CH3 CH3
Als Säule verwenden Sie eine 10 ml (Mess–)pipette o.ä., die am Ende mit Watte abgedichtet ist. Sie
erhalten bereits gefüllte Säulen. Das Füllmaterial ist basisches Al2O3. Lassen Sie die Flüssigkeit bis
knapp zum Trägermaterial ablaufen (nicht trockenlaufen lassen!). Tragen Sie dann mit einer
Pasteurpipette die gesamte Farbstoffmischung vollständig auf die Säule auf. Spülen Sie so lange Ihr
Analysengefäß (Cap) mit sehr wenig Ethanol nach, bis das Farbstoffgemisch vollständig
aufgetragen ist. Lassen Sie die Farbstofflösung vollständig in die Säule einsickern, aber nicht
trockenlaufen lassen. Anschließend geben Sie noch ca. 1 ml Ethanol zu, indem Sie den Alkohol die
Säulenwand herunter laufen lassen. Lassen Sie erneut einsickern und füllen Sie die Säule dann ganz
mit Ethanol. Eluieren Sie den apolareren Farbstoff unter Verwendung von Ethanol als mobile
Phase. Sammeln Sie das Eluat so lange in einem 100 ml Messkolben, bis der Farbstoff vollständig
von der Säule eluiert ist.
Zur Elution des polareren Farbstoffes verwenden Sie 0,1 N NaOH als mobile Phase. Wenn das
Ethanol der vorherigen Elution eingesickert ist, geben Sie vorsichtig 3 mal ca. 1 ml 0,1 N NaOH zu,
indem Sie die Lauge an der Säulenwand herunter laufen lassen. Füllen Sie nun die ganze Säule mit
0,1 N NaOH. Eluieren Sie so lange, bis das Eluat farblos ist. Fangen Sie das Eluat in einem zweiten
100 ml Meßkolben auf. Füllen Sie die beiden Kolben bis zur Marke auf (Methylenblau mit Ethanol,
Fluorescein mit 0,1 N NaOH) und messen Sie die Extinktion bei 655 nm (Methylenblau) und bei
490 nm (Fluorescein). Kalibrieren Sie bitte am Photometer jeweils vorher die Basislinie, indem Sie
eine Küvette, gefüllt mit dem entsprechenden reinen Eluens (Ethanol bzw. 0,1 N NaOH) (ca. ¾
voll; achten Sie darauf, dass die klare Seiten der Küvette im Lichtgang stehen) einstellen (Anhang
Photometrie S.56). Bestimmen Sie die Konzentration (Mol/l) der beiden Farbstoffe über das
Lambert–Beer'sche Gesetz und die jeweilige Farbstoffmenge in mg.
Erklären Sie die Reihenfolge der Elution. Hilfe: Basisches Al2O3 ist ein polares Adsorbens und
regiert mit Phenolen und Säuren unter Ausbildung von Anionen.
3.3 HPLC
Die HPLC ist ein LC-Verfahren, mit dem man nicht nur Substanzen trennt, sondern diese auch über
Referenzproben (Standards) identifizieren und quantifizieren (die genaue Konzentration bestimmen)
kann. Im Unterschied zur Gaschromatographie (GC), die eine sehr gute Trennmethode für
verdampfbare Stoffe ist, können mittels HPLC auch nicht flüchtige Substanzen analysiert werden.
Die HPLC kann auch präparativ genutzt werden. Bei HPLC wird die zu untersuchende Substanz
zusammen mit dem Laufmittel, der mobilen Phase (auch „Elutionsmittel“ oder „Eluent“ genannt)
durch eine sogenannte Trennsäule, welche die stationäre Phase in sehr dichter Packung enthält,
gepumpt wird. Eine Trennsäule in einer HPLC-Anlage ist zwischen 18 und 300 mm lang und hat
zumeist einen Innendurchmesser von 2 bis 4,6 mm im Falle von analytischen HPLC-Systemen. Das
Trennvermögen einer HPLC-Chromatographie ist etwa 100-mal größer als in der
Säulenchromatographie.
Wechselwirkt ein Bestandteil der zu untersuchenden Substanz stark mit der stationären Phase,
verbleibt er relativ lange in der Säule. Wechselwirkt er hingegen schwach mit der stationären Phase,
verlässt er die Säule früher. Je nach Stärke dieser Wechselwirkungen erscheinen die Bestandteile
der Substanz zu verschiedenen Zeiten (den sogenannten Retentionszeiten, meist angegeben in
Minuten) am Ende der Trennsäule, wo sie dann mit einem geeigneten Detektor (meist mit einem
UV-Durchflussphotometer) nachgewiesen werden können.
Es werden zwei Methoden unterschieden: Normalphase (NP) und Umkehrphase (engl. reversed
phase, RP). Bei der NP-HPLC wird eine polare stationäre Phase (z. B. Kieselgel oder Silicagel)
genutzt. Polare Moleküle werden auf der Säule länger adsorbiert/retardiert (zurückgehalten) als
unpolare Moleküle und verlassen deshalb die Säule später.
Die RP-HPLC ist in der Praxis die gängigste Methode. Etwa 70 % aller analytischen HPLC-
Trennungen sind RP-Trennungen. Hier wird eine unpolare stationäre Phase verwendet, und die
Elutionskraft steigt mit steigender Polarität. D.h. je polarer eine Verbindung ist, desto schneller wird
18
diese von der RP-Säule eluiert. Die stationäre Phase wird hergestellt, indem man Silane, welche mit
langkettigen Kohlenwasserstoffen substituiert wurden, mit Silicagel reagieren lässt. Dabei wird die
polare Oberfläche der Silicagel-Partikel mit einer unpolaren Schicht aus Alkanen überzogen, also
die Polarität umgekehrt. Als mobile Phase werden meist Mischungen aus Wasser oder Puffer und
Acetonitril (Achtung: sehr giftig!) oder Methanol eingesetzt. Bei „isokratischen“ Trennungen bleibt
die Zusammensetzung der mobilen Phase während der gesamten Zeit gleich. Bei
„Gradiententrennungen“ wird die Polarität des Fließmittelgemisches während der Analyse
verändert. Besondere Anwendung findet die RP-HPLC bei der Auftrennung von polaren Analyten,
die auf Normalphasen zu hohe Retentionszeiten aufweisen würden. Dafür wird meist eine C18-
Säule (also ein Octadecylsilan als Derivatisierungsreagens für das Silicagel, daher auch die häufige
Bezeichnung ODS-Säule) eingesetzt.
Eine chemische Verbindung kann man mittels HPLC nur bedingt identifizieren, indem man die
Retentionszeit der unbekannten Substanz mit der eines Standards (einer bekannten Substanz)
vergleicht (externer Standard). Ist die Retentionszeit gleich, kann man der Probe mit der
unbekannten Substanz auch etwas Standard zusetzen und untersuchen, ob beim Chromatogramm
nach wie vor nur eine Spitze („Peak“) sichtbar ist, ob ein „Doppel-Peak“ entstanden ist oder ob am
Chromatogramm zwei getrennte „Peaks“ mit sehr ähnlicher Retentionszeit sichtbar werden (interner
Standard). Ein weiterer Parameter zur Identifikation ist der Abgleich des UV-Spektrums oder der
Massenspur bei einem gekoppelten Massenspektrometer. Allerdings bieten Retentionszeit, UV-
Spektrum und MS-Spektrum bei Isomeren oft nur unzureichende Identifikationsmerkmale. Für eine
eindeutige Identifizierung werden daher häufig weitere analytische Methoden herangezogen, wie
z.B. die NMR Spektroskopie (siehe später).
Will man die Konzentration einer chemischen Substanz bestimmen (z. B. von Riboflavin in einem
Futtermittel), so kann man dies, indem man Standards dieser chemischen Substanz mit bekannten
Konzentrationen herstellt und die Peak-Fläche (Integral) der Standards mit den Peak-Flächen der
Substanz in den Proben vergleicht.
Bioorganische Redoxsysteme
Redoxreaktionen spielen in der organischen Chemie eine große Rolle. Während sich der Chemiker
bei derartigen Reaktionen recht "rabiater" Reagenzien bedienen kann (z.B. Chromate, Wasserstoff-
peroxid) verlaufen im physiologischen Geschehen diese Umsetzungen nahezu ausschließlich unter
enzymatischer Katalyse mittels spezieller Cofaktoren bzw. prosthetischer Gruppen. Sie bewirken
zweierlei:
Beispielhaft soll hier der Redoxübergang am Riboflavin (Vitamin B2) betrachtet werden. Formal
kann die Struktur des Riboflavins vom Pteridin abgeleitet werden.
O
N H3C N
N NH
N N H3C N N O
CH2
Pteridin H C OH
H C OH
H C OH
H2C OH
Riboflavin
Das mit der Nahrung aufgenommene Riboflavin wird vom menschlichen Organismus in Riboflavin-
5'-phosphat = FMN (= Flavinmononukleotid) bzw. in Flavindinukleotid (FAD) umgewandelt. Diese
Verbindungen wirken als Cofaktoren zahlreicher Redoxenzyme.
O H O
H3C N + 2 [H] H3C N
NH NH
Flavinmononukleotid (FMN)
O
H3 C N
NH
H3 C N N O
CH2
H C OH
NH2
H C OH
H C OH N
N
H2C O P P O CH2
O N N
OH OH
Flavinadenindinukleotid (FAD)
Als Modell behandeln wir die Umsetzung von Riboflavin mit dem anorganischen Reduktionsmittel
Dithionit (Anmerkung: Dithionit hat keine physiologische Bedeutung).
– – +
Riboflavin + S2O42 + 2 H2O Dihydroriboflavin + 2 SO32 + 2 H
Alle Flavine sind intensiv gelb gefärbt (flavus = gelb). Durch Reduktion entstehen farblose
Dihydroflavine, in denen die Konjugation des Doppelbindungssystems unterbrochen ist.
Dihydroflavine reagieren leicht mit vielen Oxidationsmitteln, u.a. mit molekularem Sauerstoff, der
bekanntlich bei Raumtemperatur aus kinetischen Gründen mit den meisten organischen Substanzen
nicht reagiert.
Der Oxidations– bzw. Reduktionszustand lässt sich sehr leicht spektralphotometrisch darstellen.
(Millimeterpapier; Abszisse: Wellenlänge, Ordinate: Extinktion) und bestimmen Sie aus der
Graphik das Absorptionsmaximum (in nm) Ihrer Probe.
Geben Sie anschließend in die Küvette mit der Standardlösung eine Spatelspitze Natriumdithionit,
verschließen die Küvette mit einem Parafilm, schütteln gründlich um, warten ca. 2 Minuten, und
messen Sie das Spektrum zwischen 400 und 550 nm in 5 nm Schritten (aufpassen, dass keine
Luftblasen in der Küvette sind, die die Messung stören). Notieren Sie die Werte und zeichnen Sie
sie anschließend auf ein Millimeterpapier. Wieviele Absorptionsmaxima besitzt das
Riboflavinspektrum für die oxidierte und reduzierte Form in dem ausgemessenen Bereich?
Ermitteln Sie für das langwelligste Maximum max und für diese Wellenlänge das .
Zur Bestimmung der Konzentration der unbekannten Riboflavinlösung bestimmen Sie den Extink-
tionswert der Lösung bei der bestimmten max. Berechnen Sie daraus die Konzentration Ihrer
Analysenlösung in mol/l und in g/l. Molekulargewicht von Riboflavin: 376,4 g/mol.
Sie erhalten je eine wässrige FAD-Lösung und eine wässrige Riboflavin-Lösung mit bekannter
Konzentration (Strukturen von Riboflavin und FAD siehe oben). Außerdem erhalten Sie eine
unbekannte, wässrige Analysenlösung (Flavingemisch bestehend aus Riboflavin und FAD).
Aufgabenstellung
Nehmen Sie das Absorptionsspektrum von FAD (bekannter Konzentration) am Photometer auf.
Siehe dazu auch vorherigen Versuch. Bestimmen Sie λMax. im langwelligen Bereich. Berechnen Sie
über das Lambert-Beersche-Gesetz den molaren Extinktionskoeffizienten ε. Diskutieren Sie die
Befunde im Vergleich zu den Werten von Riboflavin.
Ermitteln Sie anschließend durch eine HPLC-Analyse die Zusammensetzung und die
Konzentrationen von Riboflavin bzw. FAD in der Analysenlösung, die sie erhalten haben.
Vergleichen Sie die durch die HPLC ermittelten Konzentrationen an Riboflavin und FAD mit einer
Photometermessung der Analysenmischung. Machen Sie sich Gedanken über die einzustellende
Wellenlänge. Berechnen Sie die Gesamtkonzentration der Flavine über das Lambert-Beersche-
Gesetz, falls möglich.
22
Es steht Ihnen eine rechnergesteuerte HPLC-Anlage zur Verfügung, die Peaks verschiedener
Verbindungen mittels ihrer Retentionszeiten erkennt, identifiziert und die vorliegende
Konzentration dieser Verbindungen mittels einer Kalibriergeraden, die schon angefertigt wurde und
im Computer gespeichert ist, errechnet.
In der Praxis werden ähnliche Anlagen sehr häufig eingesetzt. Zusätzlich besitzen diese Systeme
noch einen Autosampler (= automatischer Probengeber), sodass oft ein Startbefehl genügt für das
automatische Abarbeiten von großen (bis max. 100 Proben) Probenserien. Bei der Ihnen zu
Verfügung stehenden Anlage müssen die Proben über den Injektor mittels einer HPLC-Spritze auf
die Säule injiziert werden (siehe Punkt 2 der Anleitung).
Wenn Sie zu den HPLC-Anlagen kommen, sehen sie am Display ein Fenster „Eurochrom 2000 for
Windows“ mit verschiedenen Icons. Es ist die Starttafel des Programms „Eurochrom 2000 for
Windows“ der Firma Knauer, mit dem sie ihre HPLC-Analyse anfertigen werden.
HPLC-Anleitung Korrektur
- klicken sie in der Menuleiste 1 x auf das Symbol „blaues Dreieck“ = „Start“ oder klicken sie
zunächst 1 x auf „Measurement“ und dann auf „Start“ => Computer meldet: „Check net
konfiguration“
23
- es erscheint ein Dialogfenster mit einem weißen Textfeld, in das sie den Namen eingeben
müssen, unter dem sie ihre Daten speichern möchten: geben sie mit Hilfe der Tastatur
z.B. ein: „Gruppe xy“ oder ihren Namen
- dann sollten sie sich noch vergewissern, dass ihr Chromatogramm in der richtigen Datei
gespeichert wird, in der Datei „Chromatogramme-Proben“
- Dazu klicken sie auf den Schalter „change directory“, erscheint im Schriftfeld der Pfad
„WSTPrakt“ „Methoden“, klicken sie nochmals den „change directory“-Schalter an, =>
auf dem Bildschirm erscheint die „Base viewer“-Tafel
- Klicken sie nun in der linken Hälfte der Tafel 1 x auf die Datei „Kalibrierdaten“
- => in der rechten Hälfte der Tafel erscheinen mehrere Dateien, Doppelklick in der rechten
Hälfte der Tafel auf die Datei „Chromatogramme-Proben“ =>
- im Schriftfeld neben dem Schalter „change directory“ muß nun der Pfad „WSTPrakt“
„Kalbibrierdaten“ „Chromatogramme-Proben“ erscheinen, anschließend injizieren sie
ihre Analysenlösung in den Injektor
Vorbemerkung: Versuchen sie keinesfalls die Spritze mit Gewalt in die Injektionsöffnung zu
bekommen! Sollten sie einen Widerstand spüren, die Spritze zurückziehen und neu ansetzen.
- spülen sie die Spritze mind. 5 x mit H2Oention. aus (H2O in Spritze ziehen, Inhalt
rausdrücken, über einem Zewa-Tuch)
- ziehen sie 3 x ihre Analysenlösung in die Spritze und drücken sie den Inhalt wieder über
einem Zewa-Tuch aus
- füllen sie nun ihre HPLC-Spritze deutlich über die 10 μL-Marke, dann den Spritzenkolben
langsam vordrücken, bis der Stahlstempel genau an der 10 μL-Marke steht, wenn kleiner
Tropfen an der Spritzenspitze hängt, mit Zewa abtupfen
- drehen sie nun den Injektor von Position „Inject“ auf Position „Load“
- führen sie die HPLC-Spritze gerade und vorsichtig in die Injektionsöffnung des Injektors,
gegen Ende ist ein leichter Widerstand spürbar, Spritze sanft durchdrücken bis Anschlag
erreicht ist, achten sie dabei darauf, dass sie nicht an den Stempel der Spritze kommen, sonst
kann ein kleiner Teil der Analysenlösung verloren gehen
- drücken sie nun den Spritzenkolben in kontinuierlichem Tempo (nicht zu schnell, nicht zu
langsam) rein, dadurch wird der Spritzeninhalt in die Ladeschleife gedrückt.
- Wichtig: wenn sie den Stempel ganz durchgedrückt haben, lassen sie die Spritze unbedingt
stecken, bewegen sie sie nicht und ziehen sie sie keinesfalls aus der Injektionsöffnung
- Wenn der Stahlstempel ganz in die Spritze eingedrückt ist, und damit der Spritzeninhalt
komplett in die Ladeschleife überführt wurde, halten sie mit der einen Hand die Spritze fest,
und drehen mit der anderen Hand den Injektor wieder auf die Position „Inject“
- Erst jetzt die Spritze vorsichtig aus der Injektionsöffnung ziehen und Methode1 starten
- bestätigen sie nun ihre Eingaben siehe Punkt 2 und starten sie ihre Analyse, indem sie 1 x
auf den „ok-Schalter“ mit dem grünen Haken klicken =>
- es erscheint die Meldung „Please wait for conditioning the system“ und die Analyse startet,
kurz danach wird das „Datenaufnahmefenster“ eingeblendet. An diesem Fenster können sie
den aktuellen Stand ihrer Analyse ablesen und sehen die aktuellen Peaks, die das Gerät
gerade aufzeichnet.
- Nach 25 Min. ist die Analyse beendet, im Display des Photometers blinkt die Zeitangabe bei
der Position „Time“, die Pumpen laufen automatisch weiter
- Klicken sie auf das „Exit“-Symbol in der Menueleiste oder auf „File“ und „exit“ =>
Datenaufnahmefenster wird ausgeblendet.
24
- klicken sie in der linken Hälfte der Tafel „Base viewer“ die Datei „Analysenparameter“ 1x
an => in der rechten Hälfte der Tafel erscheint wieder die Datei „Analysenparameter“ mit
der Unterdatei „Analysenparameter 01“
- Doppelklick auf Datei „Analysenparameter 01“ in der rechten Hälfte der Tafel => Tafel
„Parameter 01“ erscheint.
- Klicken sie auf den Schalter „Detection parameters“ => Tafel „Detection parameters“
erscheint vergewissern sie sich, dass im Textfeld des Schalters „Determination method“
„unknown external“ eingetragen ist.
- Wenn nein: klicken sie 1 x auf den senkrechten Pfeil rechts neben dem Textfeld und suchen
sie in der aufgetauchten Liste nach dem Eintrag „unknown external“, klicken sie diesen
Eintrag 1 x an, im Textfeld des Schalters „Determination method“ sollte dann der Eintrag
„unknown external“ stehen.
- Klicken sie dann zur Bestätigung auf den „ok-Schalter“ mit dem grünen Haken => es
erscheint wieder die Tafel „Parameter 01“
- Klicken sie 1 x auf den Schalter „set global“ und dann auf das Speicherungszeichen =
Diskettensymbol in der Menueleiste oder klicken sie auf „File“ und „save“
- Durch 1 x klicken auf das „exit“-Symbol verlassen sie die Tafel „Parameter 01“
- Wenn ja: klicken sie auf den „ok-Schalter“ mit dem grünen Haken => und gehen sie vor wie
oben beschrieben.
- Klicken sie nun 1 x in der linken Hälfte der Tafel „Base viewer“ auf die Datei
„Chromatogramme-Proben“ =>
- In der rechten Hälfte der „Base viewer“-Tafel muss nun der Name, den sie ihrem
Chromatogramm gegeben haben, auftauchen, vor dem Namen muss das Symbol für ein
Chromatogramm eingetragen sein
- Durch Doppelklick auf diesen Namen in der rechten Hälfte der Tafel öffnen sie ihr
Chromatogramm
- Klicken sie in der Menueleiste auf das Chromatogrammsymbol mit dem Fragezeichen, oder
klicken sie auf „Chromatography“ und „Peak Detection“ =>
- Tafel „Base viewer“ wird eingeblendet
- Doppelklick auf Datei „Kalibrierdaten“ in der linken Hälfte der Tafel
- Klicken sie 1 x auf die Unterdatei „externer Standard“ in der rechten Hälfte der Tafel => in
der rechten Hälfte der Tafel „Select Compound Table object“ erscheint die Unterdatei
„externer Standard“ mit der Subdatei „FAD Ribo Standard“ =>
- Doppelklick auf „FAD Ribo Standard“ =>
- Tafel verschwindet, ihr Chromatogramm mit dem Peak, neben dem jetzt die Retentionszeit
eingetragen ist, wird eingeblendet
- Klicken sie auf „File“ und „print“, stellen sie über den Schalter „Eigenschaften“ das
Querformat ein und klicken sie auf „ok“ und nochmals auf „ok“ => ihr Chromatogramm
wird ausgedruckt.
- Schließen sie danach ihr Chromatogramm über „Exit“
- Im „Base viewer“ ist in der rechten Hälfte der Tafel der Name ihres Chromatogramms 2 mal
eingetragen. 1 mal mit dem Chromatogramm-Symbol am Anfang und einmal mit einem
Tabellensymbol in das ein großes „R“ eingetragen ist. Das ist der Peakreport zu ihrem
gerade ausgedruckten Chromatogramm. Im Peakreport ist unter anderem der Name der
25
Verbindung, die sie zu analysieren hatten, die Retentionszeit des Peaks und die
Konzentration der Verbindung eingetragen.
- Öffnen sie den Peakreport durch Doppelklick und drucken sie ihn auf die gleiche Weise im
Querformat wie ihr Chromatogramm aus.
4 Redoxsysteme/Diffusionspotential
„Redox“–Reaktionen sind Elektronenübertragungs–Reaktionen. Stets ist eine Reduktion mit einer
Oxidation gekoppelt. Der elektronenabgebende Stoff (= Elektronendonator) heißt Reduktionsmittel,
d.h. er reduziert den mit ihm reagierenden Reaktionspartner. Durch die Abgabe von Elektronen wird
er selbst oxidiert. Der elektronenaufnehmende Stoff (= Elektronenakzeptor) heißt Oxidationsmittel.
Der mit ihm reagierende Reaktionspartner wird oxidiert, er selbst reduziert. Es besteht weitgehende
formale Analogie mit Säure –Base–Reaktionen:
Säure–Base–Reaktion = Protonenübergang von einem Protonendonator zu einem
Protonenakzeptor
Redoxreaktion = Elektronenübergang von einem Elektronendonator zu einem
Elektronenakzeptor
Ein einfaches Beispiel für eine Redoxreaktion ist gegeben, wenn man einen Zinkstab in eine Lösung
von Kupfersulfat eintaucht. Dann läuft folgende Reaktion ab:
Zn + Cu2+ Zn2+ + Cu
d.h., Zinkionen gehen in Lösung, elementares Kupfer scheidet sich auf dem Metallstab ab. Dabei ist
Zn das Reduktionsmittel und Cu2+ das Oxidationsmittel.
Formal kann man diese Reaktion in folgende Teilgleichungen zerlegen:
Zn Zn2+ + 2 e–
Cu2+ + 2 e– Cu
Solche Teilgleichungen lassen sich für alle Redoxreaktionen formulieren. Sie sind für die
Aufstellung von Redoxgleichungen sehr hilfreich. Einige weitere Beispiele zeigt Tabelle 1.
Die Teilgleichungen haben nicht nur formalen Charakter. Man kann durchaus einen experimentellen
Aufbau wählen, bei dem die beiden Halbreaktionen räumlich getrennt ablaufen. Eine entsprechende
Vorrichtung nennt man ein Galvanisches Element oder elektrochemische Zelle (Abbildung 10).
27
In eine Lösung von Kupfersulfat taucht ein Kupferstab. Die Kupfersulfatlösung steht über eine
poröse Filterplatte in Verbindung mit einer Zinksulfatlösung. In die Zinksulfatlösung taucht ein
Zinkstab. Abgekürzt schreibt man
Cu/Cu2+//Zn2+/Zn
Dabei bezeichnet der schräge Strich jeweils eine Phasengrenze. Verbindet man nun den Zinkstab
mit dem Kupferstab durch einen metallischen Leiter, so können durch diesen Elektronen vom
Zinkstab zum Kupferstab fließen. In den beiden Halbzellen können dann die beiden Halbreaktionen
gemäß den oben genannten Gleichungen ablaufen, d.h. an der Zinkelektrode werden Zinkionen
freigesetzt (Zn wird oxidiert), an der Kupferelektrode wird Kupfer abgeschieden (Cu2+ wird
reduziert). Diese elektrochemische Zelle wird auch Daniell–Element genannt.
Schließen wir an die beiden Elektroden unseres Daniell–Elementes ein Spannungsmeßgerät an, so
können wir die elektrische Spannung E zwischen den beiden Elektroden messen (um
thermodynamisch verwertbare Resultate zu erhalten, muss die Spannungsmessung so vorgenommen
werden, dass während der Messung nur minimal Strom fließt. Die unter diesen Bedingungen
gemessene Spannung bezeichnet man als elektromotorische Kraft (EMK).
Würden wir an unserem Element so lange einen Strom durch einen metallischen Leiter vom Zink
zum Kupfer fließen lassen, bis an beiden Elektroden jeweils 1 Mol Kupfer bzw. Zink umgesetzt ist,
so würde die transportierte Ladungsmenge entsprechend dem Faradayschen Gesetz
n F 2 96500 Coulomb Mol
–1
193000 CMol –1
Zn bzw. Cu Gleichung 4-1
betragen.
Die von unserem Element geleistete elektrische Arbeit wäre dann A = E 2F. Sie ist gleich der
bei der Umsetzung aufgetretenen Änderung der freien Enthalpie
A ΔE 2F ΔG Gleichung 4-2
Wir wollen jetzt weiter annehmen, dass wir solange Strom durch unser Element fließen lassen, bis
die Spannung auf Null absinkt, was bekanntlich bei jeder Batterie früher oder später passiert. Das
Absinken der Spannung auf Null zeigt uns an, dass in unserem System keine weitere chemische
Veränderung mehr ablaufen kann und dementsprechend keine Elektronen mehr durch unseren
metallischen Leiter transportiert werden können, d.h. dass unser System einen chemischen
Gleichgewichtszustand erreicht hat.
Man sieht nun unmittelbar ein, dass wir mit der EMK ein Maß für die Triebkraft der in unserem
Galvanischen Element ablaufenden chemischen Reaktionen gewonnen haben bzw. ein Maß dafür,
wie weit unser System vom chemischen Gleichgewicht entfernt ist – je weiter das System vom
chemischen Gleichgewicht entfernt ist, desto größer ist die gemessene EMK. Bei bestehendem
Gleichgewicht ist die EMK gleich Null.
Wählt man die Konzentrationen aller an der Reaktion beteiligten gelösten Stoffe so, dass sie in 1 M
Lösung vorliegen (Standardzustand), so bezeichnet man die so gemessene EMK als Standard–EMK.
Streng genommen sind die Standardzustände so definiert, dass die sogenannte Aktivität der gelösten
Stoffe gleich 1 sein soll, wobei die Aktivität gegeben ist durch a = f c. Dabei ist c die
Konzentration und f ein Korrekturfaktor, der sogenannte Aktivitätskoeffizient. Wir werden im
Folgenden vereinfachend von den Konzentrationen ausgehen. Die Standard–EMK kann man für
beliebige Kombinationen von Halbelementen messen und tabellieren, etwa für die Beispiele in
Tabelle 2.
Standard–EMK [V]
Cu/ 1M Cu2+ // 1M H+/H2/Pt 0,35
Ag/ 1M Ag+ // 1M Fe2+/Fe 1,24
Cu/ 1M Cu2+ // 1M Hg2+/Hg 0,45
Aus messtechnischen Gründen kann man nur Potentialdifferenzen und keine Absolutpotentiale
messen. Man kann aber willkürlich einer bestimmten Elektrode durch Vereinbarung das Potential
E = 0 zuordnen und die Potentiale aller anderen Elektroden auf diese Elektrode beziehen.
Definitionsgemäß hat man der Standard–Wasserstoffelektrode das Potential Null zugeordnet. Die
Standard–Wasserstoffelektrode besteht aus einem platinierten Platinblech, das in eine Lösung von
1M H3O+–Konzentration eintaucht und von Wasserstoffgas mit Atmosphärendruck umspült wird.
An dieser Elektrode läuft die folgende Reaktion ab:
2 H+ + 2 e– H2
Das Platin ist nicht an der Reaktion beteiligt, es dient nur zur Ableitung der Elektronen. Verbindet
man nun ein beliebiges Halbelement unter Standardbedingungen (Aktivität = 1) mit der Platin–
Wasserstoffelektrode zu einem Galvanischen Element, wie in folgender Abbildung gezeigt,
29
so ist die gemessene EMK identisch mit dem Standardpotential der Halbelektrode, z.B. für den Fall
Pt/H2, 1 M H3O+ // 1M Ag+/Ag. Die so gemessenen Standardpotentiale (= Normalpotential) kann
man in einer Spannungsreihe anordnen (siehe Tabelle 3).
Wir haben bisher ausschließlich von den Standardpotentialen gesprochen, d.h. also von den
Potentialen, die wir messen, wenn alle an der Reaktion beteiligten gelösten Stoffe in 1 molarer
Lösung vorliegen. Das wird in der Praxis nicht immer der Fall sein. Das Potential einer Elektrode
bzw. die EMK eines Galvanischen Elements ist nun aber von der Konzentration der
Reaktionspartner abhängig. Diese Abhängigkeit wird durch die Nernst’sche Gleichung
beschrieben:
30
E E0
RT oxidierte Form Gleichung 4-4
reduzierte Form
ln
n F
wobei
E 0 Normalpotential Standardpo tential V
-1
F 96500 [AsMol ]
n Zahl der an der Reaktion beteiligten Elektronen
R allgemeine Gaskonstan te
–1
8 ,314 JK Mol
–1
( 1J 1VAs)
T absolute Temperatur K
Für Raumtemperatur (25 °C = 298 K) gilt:
E E0
0 ,059
log
Ox. V Gleichung 4-5
n Re d.
R T
wobei 2,303 0,059V (T 298 K ) ( Nernst - Faktor) Gleichung 4-6
F
Anmerkung
Liegt ein Reaktionspartner in fester Phase vor, so ist c = 1. Auf Details der Festlegung für
Standardzustände wird hier nicht eingegangen.
Beispiele
Wir betrachten als Beispiel für die Konzentrationsabhängigkeit die folgende galvanische Zelle:
Pt/Fe2+,Fe3+//Co2+,Co3+/Pt
E Fe E 0 Fe
R T Fe
3
F
ln
Fe
2
Gleichung 4-7
E Co E 0 Co
R T Co
3
F
ln
Co
2
Gleichung 4-8
Die Zahl der beteiligen Elektronen ist n = 1. Das Platin (Elektrode) ist an der Reaktion nicht
beteiligt.
Die Potentialdifferenz – also die EMK oder Zellenspannung – ist dann
EMK E Fe ECo Gleichung 4-9
F
ln
Fe Co
2 3
Gleichung 4-10
R T Fe Co
3 2
EMK EMK 0
F
ln
Fe Co
2 3
Gleichung 4-11
Fe Co
2 3
Gleichgewicht
K Gleichung 4-13
Aus den Gleichungen 7-12 und 7-13 erhalten wir durch Einsetzen:
R T
EMK 0 ln K Gleichung 4-14
F
E2 E0 0,059 log Ag 2
Gleichung 4-16
Erläuterung:
Als Strombrücke verwenden wir ein U–Rohr, das mit einem Agar–Gel mit hohem Salzgehalt (3 M
KNO3) gefüllt ist. Diese Vorrichtung sorgt für eine leitende Verbindung der beiden Halbelemente.
Die zwei Elektroden werden mit Gummiringen an den beiden Schenkeln des U–Rohres befestigt, so
dass eine Klammer zum Heben und Senken beider Elektroden ausreicht (Abbildung 14). Als Gefäße
A und B sollen 50 ml Bechergläser eingesetzt werden, die mit je etwa 15 ml der entsprechenden
AgNO3–Lösungen zu füllen sind. Eventuell muss von der U–Rohröffnung eine Schicht Parafilm
abgezogen werden, die den Agar vor dem Austrocknen schützt. Achten Sie beim Eintauchen darauf,
dass sich keine Luftblasen zwischen Agar–Brücke und der AgNO3–Lösung befinden (Isolierung!).
Nach dem Eintauchen klemmen Sie das Voltmeter vorzeichenrichtig an. Die Spannungsmessung ist
im Anhang beschrieben. Notieren Sie nach halbwegs stabilisierter Anzeige (evtl. beide Gefäße
leicht schwenken; jeweils ca. 1 Minute abwarten) den Messwert. Welche Elektrode entspricht dem
Plus– bzw. Minuspol (Erklärung)? Vor jeder weiteren Messung ist das Becherglas von B zu säubern
und auszutrocknen, U-Rohr-Ende und Elektrode abzuspülen und trocken zu tupfen.
c Ag
Zeichnen Sie die Funktion EMK f log A
c
Ag B
34
Am Ende des Versuchs werden die Agar-Brücken gespült und beide Rohrenden werden in
Wasser eingetaucht. So gelagert, können die Agar-Brücken für den nächsten Versuch
wiederverwendet werden.
E [mM]
1/2
ÄP
5.2 Chinon–Hydrochinon-System
1,4-Dihydroxybenzol oder Hydrochinon kann leicht zu Chinon (= p–Benzochinon) oxidiert werden.
Das "chinoide" System ist nicht mehr aromatisch.
OH O
+ –
2H +2e +
OH O
Aus der Teilchengleichung für das Redoxpaar Chinon/Hydrochinon ergibt sich folgender Ansatz für
die Nernst'sche Gleichung:
Chinon H
2
0 ,059
E E0 log
Hydrochino n
Gleichung 4-18
2
E E0 0 ,03 log
Chinon
0 ,03 log H
2
Hydrochino n
Gleichung 4-19
36
E 0 0 ,03 log
Chinon 0 ,059 pH
Hydrochino n
Gleichung 4-20
Nun bilden Chinon und Hydrochinon im Verhältnis 1:1 ein schön kristallisierendes Addukt, das
Chinhydron (koplanarer –Komplex).
Es ist also möglich, ein Chinhydron–Halbelement aufzubauen, dessen Redoxpotential dann nur
noch vom pH–Wert der Lösung abhängt, wie sich durch Einsetzen des Verhältnisses
Chinon:Hydrochinon = 1:1 ergibt:
EChinhydron E0 - 0,059 pH Gleichung 4-21
Das Halbelement, die sogenannte Chinhydron–Elektrode, liegt vor, wenn Chinhydron den Boden-
satz einer wässrigen Lösung bildet und in die Lösung eine chemisch inerte Elektrode (z.B.
Platindraht oder Graphitstab) eintaucht. Man hat somit eine Messvorrichtung für pH–Werte
wässriger Lösungen in einem pH–Bereich zwischen 0 und 8 zur Verfügung (in Lösungen von pH >
8 ist Chinhydron instabil).
Halbelement A stellt die Messzelle dar. In ein 50 ml Becherglas wird mit einem Spatel Chinhydron
in 20–30 ml der zu messenden Lösung gegeben (so, dass Bodensatz an Chinhydron entsteht und
sowohl die Salzbrücke als auch der Graphitstab in die Lösung eintauchen).
Halbelement B stellt die Bezugselektrode dar. Sie besteht aus einem Silberdraht, der in ca. 15 ml
0,001 M AgNO3–Lösung eintaucht (auch hier ist das Volumen so zu bemessen, dass Draht und
Salzbrücke in die Lösung eintaucht).
Gemessen wird die Potentialdifferenz zwischen beiden Halbelementen mit Hilfe des pH–Meters (als
mV–Meter; Ag–Elektrode = Pluspol). Bis zur Ablesung sollte 2–3 Minuten gewartet werden!
37
Folgende Lösungen sind zu messen: 5 Standardpuffer, eine unbekannte Lösung. Abfälle nicht in
den Ausguss! Geben Sie die Chinhydron-Abfälle in die speziellen gekennzeichneten
Abfallkanister!!
Die Funktion EMK = f(pH) ist graphisch darzustellen und über die Eichgerade der pH–Wert der un-
bekannten Lösung zu bestimmen (Abszisse: pH 0–8; Ordinate: EMK -200 bis +400 mV).
- Extrapolieren Sie Ihre Gerade bis auf pH = 0 und diskutieren Sie die so ermittelte EMK.
- Berechnen Sie mit dem extrapolierten Wert von E0 das Standardpotential von Chinhydron
(Standardbedingungen: [Hydrochinon] = [Chinon], [H+] = 1 M) (vgl. 5.1).
Benutzen Sie dazu die Beziehungen:
Anmerkung:
Ein Derivat des Chinons, das Coenzym Q oder Ubichinon (weil in Zellen ubiquitär, also allgemein
verbreitet), ist ein wichtiger Elektronenträger in der Zelle (Atmungskette).
6 Kinetik
Die chemische Kinetik untersucht den zeitlichen Ablauf chemischer Reaktionen. Kinetische
Untersuchungen bilden einen wichtigen Beitrag zur Untersuchung von Reaktionsmechanismen,
insbesondere auch Reaktionsmechanismen enzymatischer Reaktionen. Es ist zwar grundsätzlich
unmöglich, einen vermuteten Reaktionsmechanismus allein durch kinetische Messungen zu
beweisen, hingegen gelingt es häufig, falsche Reaktionsmechanismen aufgrund kinetischer Daten
auszuschließen.
Die Messgröße der Kinetik ist die Reaktionsgeschwindigkeit. Gegeben sei die Reaktion
A + B C + D
Es sei cA die Konzentration der Substanz A (mol/l). Die Reaktionsgeschwindigkeit (Abnahme der
Konzentration von A als Funktion von der Zeit t) ist definiert durch
dc A
V . Gleichung 6-1
dt
1) Man lässt die Reaktion bei konstanter Temperatur ablaufen und entnimmt zu verschiedenen
Zeitpunkten eine Probe, die man sofort mit einem geeigneten chemischen Analysenverfahren
analysiert. Dabei muss verhindert werden, dass die Reaktion in der entnommenen Probe in der
Zeit zwischen Probenentnahme und Analyse weiter läuft. Das lässt sich häufig schon durch
starkes Abkühlen erreichen, da die Reaktionsgeschwindigkeit mit fallender Temperatur
abnimmt (s. unten). Wir werden von dieser Methode in einem späteren Versuch Gebrauch
machen (Carbonsäureveresterung, Esterverseifung Kapitel 7).
2) Man benutzt ein physikalisches Verfahren, um die Konzentrationsänderung einer Reaktions-
komponente fortlaufend zu messen. Als Messgröße kann je nach Problemstellung etwa die
Lichtabsorption, das Volumen oder eine andere physikalische Größe dienen. Kinetische
Messungen, bei denen die Konzentrationsänderung photometrisch erfolgt, zeichnen sich durch
hohe Genauigkeit aus.
In günstigen Fällen gelingt es, die empirisch gefundene Zeitabhängigkeit des Reaktionsverlaufs
durch eine einfache mathematische Gleichung zu beschreiben. Dies ist jedoch nicht in allen Fällen
möglich. Als typische Beispiele behandeln wir die Reaktion 0. Ordnung, 1. Ordnung und
2. Ordnung.
39
Es sei cA0 die Konzentration zum Zeitpunkt null. cA sei die Konzentration zur variablen Zeit t.
Durch Integration erhält man:
dc A k dt Gleichung 6-4
cA t
dcA kdt
cA0 t0
Gleichung 6-5
c A c A, 0 k t (t 0 0) Gleichung 6-6
12
10
8
cA
0
0 20 40 60 80 100
Trägt man cA = f (t) in ein Diagramm ein (s. Abbildung 19), so erhält man eine Gerade. Die
Reaktion 0. Ordnung folgt also einem besonders einfachen Zeitgesetz. Daraus folgt jedoch nicht
notwendigerweise, dass die Reaktion auch nach einem einfachen Mechanismus verläuft.
Zeitgesetze 0. Ordnung findet man häufig bei heterogen–katalysierten Reaktionen, z.B. bei der
Katalyse an einer Metalloberfläche. Um überhaupt in Reaktion gehen zu können, müssen die
Reaktionspartner zunächst an der Metalloberfläche gebunden werden. Limitierend für die
Reaktionsgeschwindigkeit ist die zeitlich konstante Größe der Oberfläche des Metalls.
Bei enzymkatalysierten Reaktionen kann man häufig einen Verlauf nach einer Reaktion 0. Ordnung
dadurch erreichen, dass man die Konzentrationen der Edukte ausreichend groß wählt. Davon macht
man bei der klinisch–chemischen Routineanalytik Gebrauch, weil eine Kinetik 0. Ordnung
besonders leicht ausgewertet werden kann (Kapitel 8).
Bei niedriger Konzentration der Edukte verlaufen enzymkatalysierte Reaktionen allgemein nach
einer höheren als der 0. Ordnung. (Für Einzelheiten wird auf die Lehrbücher verwiesen.)
40
dc A
k dt Gleichung 6-8
cA
cA t
dc
Durch Integration erhält man c cAA t kdt Gleichung 6-9
A, 0 0
c
ln c A cA kt (t0 = 0 ) Gleichung 6-10
A,0
cA
ln kt Gleichung 6-11
c A, 0
ln c A ln c A, 0 k t Gleichung 6-12
k t
log c A log c A,0 Gleichung 6-13
2 ,3
Für die Halbwertszeit (= die Zeit, nach der die Hälfte des Edukts ins Produkt übergeführt wird)
(cA = 0,5 cA,0) erhält man
1
ln k t 1 Gleichung 6-14
2
2
ln 2 0 ,693
t1 Gleichung 6-15
2
k k
Das heißt, die Halbwertszeit ist bei der Reaktion 1. Ordnung (und nur bei der Reaktion 1. Ordnung)
unabhängig von der Ausgangskonzentration.
12 10
10
8 1
cA
cA
4 0,1
0 0,01
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
t t
41
Abbildung 20: Reaktion 1. Ordnung (links: zweifach lineare Auftragung; rechts: halblogarithmische Auftragung)
Trägt man den Logarithmus von cA gegen die Zeit auf (s. Abbildung 20), so erhält man in diesem
Fall eine Gerade. Es ist charakteristisch für Reaktionen 1. Ordnung, dass die Halbwertszeit
unabhängig von der Konzentration der Ausgangsstoffe ist. Ein typisches Beispiel für eine Reaktion
1. Ordnung ist der radioaktive Zerfall. Geschwindigkeitsgesetze 1. Ordnung findet man häufig
bei enzymkatalysierten Reaktionen bei relativ niedriger Konzentration der Edukte.
Über die besprochenen Beispiele hinaus gibt es auch zahlreiche Reaktionen, die nach wesentlich
komplizierteren Geschwindigkeitsgesetzen ablaufen. Insbesondere gibt es Geschwindigkeitsgesetze
mit gebrochenen Exponenten. Dass die Reaktionsordnung von den Arbeitsbedingungen abhängen
kann, haben wir bereits angesprochen.
Die Untersuchung von Reaktionen mit einer höheren als der 1. Ordnung kann man sich häufig
dadurch erleichtern, dass man die Konzentrationen aller Edukte bis auf eine konstant hält. Das kann
man erreichen, indem man
Unter diesen Bedingungen verläuft dann eine Reaktion 2. Ordnung formal als eine Reaktion 1. Ord-
nung (Pseudo–1.–Ordnung). Man erreicht durch diese Maßnahme also eine wesentliche Vereinfa-
chung der rechnerischen Behandlung.
Zu 1):
Der fortlaufende Ersatz des verbrauchten Edukts sei erläutert am Beispiel einer Reaktion, an der
Protonen beteiligt sind. Man kann die verbrauchten Protonen dadurch ersetzen, dass man die Reak-
tion in einem Puffer ausreichender Pufferkapazität ablaufen lässt. Die verbrauchten Protonen
werden dann durch Dissoziation der Säure fortlaufend nachgeliefert. Oder man kann die
Konzentration der Protonen (den pH–Wert) mit der Glaselektrode messen und mit Hilfe einer
geeigneten Vorrichtung fortlaufend soviel Säure zugeben, dass der pH–Wert exakt gleich bleibt.
Zu 2):
Wir wollen annehmen, dass wir im Fall der Reaktion
A + B C + D
die Komponente A im 100fachen stöchiometrischen Überschuss gegenüber der Komponente B
eingesetzt hätten. Wenn die Komponente B restlos verbraucht ist, haben wir von der Komponente A
erst 1 % umgesetzt, d.h. die Konzentration der Komponente A hat sich während der gesamten
Reaktion nicht nennenswert geändert.
6.3 Molekularität
Die makroskopisch gemessene Reaktionsgeschwindigkeit stellt einen Mittelwert über die
Reaktionen sehr vieler einzelner Moleküle dar. Zur Beschreibung auf molekularer Ebene gehört
zunächst die Frage nach der Anzahl der an der elementaren Reaktion beteiligten Moleküle.
Als monomolekulare Reaktionen bezeichnet man Reaktionen, an denen nur ein einziges Molekül
beteiligt ist. Monomolekulare Reaktionen sind außerordentlich selten, sie kommen z.B. vor bei der
Fragmentierung von Molekülen im Vakuum. (Alle radioaktiven Zerfälle verlaufen gleichfalls mono-
molekular.)
42
An einer bimolekularen Reaktion sind definitionsgemäß 2 Moleküle beteiligt. Bei weitaus der
Mehrzahl aller chemischen Reaktionen besteht die Elementarreaktion in einem hinreichend
energiereichen Zusammenstoß zwischen zwei Teilchen. Gegebenenfalls können in einem
Reaktionsablauf mehrere bimolekulare Elementarschritte aufeinander folgen.
Trimolekulare Reaktionen, d.h. Reaktionen, bei denen im Elementarschritt drei Teilchen
gleichzeitig zusammenstoßen, sind außerordentlich selten.
Wie bereits betont, besteht kein einfacher Zusammenhang zwischen der makroskopisch
beobachteten Reaktionsordnung und der Molekularität einer Reaktion.
Dabei ist k die Geschwindigkeitskonstante, R die allgemeine Gaskonstante, T die absolute Tempera-
tur, EA die Aktivierungsenergie und A der Häufigkeitsfaktor (= maximal mögliche Geschwindig-
keitskonstante, die sich ergäbe, wenn jeder Zusammenstoß zu einer chemischen Umsetzung führen
würde).
Neben der Temperatur ist die Reaktionsgeschwindigkeit von zahlreichen anderen Faktoren
abhängig, z.B. von der Art des Lösungsmittels, der Beimengung von Verunreinigungen und in
manchen Fällen sogar von Form, Größe und Wandbeschaffenheit des Reaktionsgefäßes. Für
reproduzierbare Messungen, wie sie im physikalisch–chemischen Bereich gefordert werden müssen,
ist daher die sorgfältige Standardisierung aller Reaktionsbedingungen unerlässlich.
Wählt man die Reaktionsbedingungen so, dass der eine Reaktionspartner (NaOH) in großem Über-
schuss eingesetzt wird im Vergleich zum Kristallviolett, so beobachtet man formal eine Reaktion 1.
Ordnung, da sich die Konzentration der NaOH während des Experiments nicht merklich ändert (s.
oben).
43
CH3
CH3 H3C
H3C N
H3C N N CH
3
Cl– CH
3
C N+ + NaOH C
CH3
OH
H3C N
H3C N
CH3
CH3
(A) (B)
Abbildung 21: Alkalische Hydroxylierung von Kristallviolett. (A) violette Form; (B) farblose Form.
Eichen Sie bitte vor jeder Messreihe das Photometer nach. Messprotokoll: wie weiter hinten
beschrieben.
44
Auswertung:
Zeichnen Sie für alle NaOH–Konzentrationen (inklusive der NaOH mit unbekannter Konzentration)
log cKristallviolett = f(t) und cKristallviolett = f(t) in jeweils 1 Diagramm (also 2 Diagramme mit jeweils 5
Kurven/Geraden)
Berechnen Sie durch graphische Extrapolation die Geschwindigkeitskonstante k' (min-1) für jede
NaOH–Konzentration nach der Gleichung
k'
2 ,303 log c A,0 log c A Gleichung 6-19
t
Zeichnen Sie außerdem k' = f (cNaOH). Theoretisch ergibt diese Darstellung eine Gerade. Mögliche
Abweichungen deuten auf eine geringfügige Änderung der Reaktionsordnung mit der Konzentration
der NaOH (exakte Gültigkeit des Zeitgesetzes 1. Ordnung = Idealfall, s. theoretischer Vorspann).
Berücksichtigen Sie diese eventuellen Abweichungen vom geraden Verlauf, indem Sie eine Aus-
gleichsgerade durch die einzelnen Punkte legen.
Bestimmen Sie aus dem Schaubild die Konzentration der unbekannten NaOH–Lösung.
Bestimmen Sie die Geschwindigkeitskonstante k [M-1min-1] der Hydroxylierung, wenn die Reaktion
nach 2. Ordnung verläuft.
O O
H3C C + C2H5OH H3C C + H2O
OH OC2H5
Der Gleichgewichtszustand ist unabhängig davon, ob zu Beginn der Reaktion Essigsäure und
Ethanol oder Essigester und Wasser vorliegen. Hin– und Rückreaktion verlaufen spontan sehr lang-
sam, werden aber durch Protonenkatalyse erheblich beschleunigt. In vereinfachter Form kann man
die Verhältnisse wie folgt beschreiben:
Das empirische Geschwindigkeitsgesetz für die Hinreaktion lautet:
dc Essigsäure
k1 c Essigsäurec Ethanol Gleichung 7-1
dt
Im Gleichgewichtszustand gilt:
dc Essigsäure dc Ester
Gleichung 7-3
dt dt
Damit ergibt sich anhand des Massenwirkungsgesetzes die Gleichgewichtskonstante einer Reaktion:
c Ester cWasser k1
K Gleichung 7-4
c Essigsäurec Ethanol k 1
Messen Sie die Geschwindigkeit der Hin– und Rückreaktion und die Gleichgewichtskonstante der
oben dargestellten Reaktion. Verfolgen Sie dazu durch wiederholte Titration die zeitliche Änderung
der Essigsäurekonzentration.
Für alle Versuche ist das Tragen von Schutzbrillen zwingend erforderlich!
46
Schlaucholiven
Dimroth–Kühler
Laborthermometer
für Heizbadtemperatur
©
LaboBib 0 U/m in
1500
Heizung
300 50 250
AN AN
100 500
o
C
200 150 AUS AUS 1000 750
Hebebühne
Zur leicht siedenden Mischung gibt man nun mit Hilfe eines Trichters genau 57 ml (1,0 Mol)
konzentrierte Essigsäure, die man vorher in einem 200 ml Becherglas auf ca. 50 °C erwärmt hat (im
Abzug). Vorsicht! Schutzbrille! Die Zugabe der Essigsäure ist der Startpunkt der Reaktion. Bitte
notieren Sie sofort die Zeit. Nachdem man durch leichtes Schwenken des Stativs die
Reaktionslösung gut durchmischt hat, wird zur Messung der Anfangskonzentration eine erste Probe
(6–7 ml) entnommen. Dazu wird der Schliffstopfen am Zweihalskolben kurz entfernt und mit der 10
ml–Meßpipette und einem Pipettierball ca. 6–7 ml angesaugt (bitte nicht in den Pipettierball
saugen!) und die Probe in einem trockenen Reagenzglas sofort im Eiswasserbad abgekühlt.
Nach einigen Sekunden misst man nun mit einer trockenen 5 ml Vollpipette genau 5 ml ab,
überführt diese Menge in einen 100 ml Messkolben und füllt mit entionisiertem Wasser exakt auf
100 ml auf. Nachdem man den Messkolben gut umgeschüttelt hat, misst man nun mit einer
trockenen 10 ml Vollpipette genau 10 ml der verdünnten Probenlösung ab und titriert mit 0,1 N
Natronlauge nach Zugabe von 2–3 Tropfen Phenolphthaleinlösung bis zum Farbumschlag nach Rot.
Die weiteren Proben werden nach 15, 30, 45, 60, 80, 110, 140 Minuten der siedenden Reaktionslö-
sung entnommen und analog titriert (250 ml Erlenmeyerkolben).
Nach jeder Probenentnahme sind alle Pipetten mit entionisiertem Wasser und Aceton zu spülen und
an der Wasserstrahlpumpe trocken zusaugen. Der Messkolben und der Erlenmeyerkolben werden
sorgfältig mit entionisiertem Wasser ausgespült (brauchen nicht getrocknet zu werden).
47
Veresterung:
Gesamtvolumen der Lösung = 181,4 ml
darin enthaltene Schwefelsäure = 0,4 ml
Hydrolyse:
Gesamtvolumen der Lösung = 182 ml
darin enthaltene Schwefelsäure = 1 ml
Dichte der konzentrierte Schwefelsäure = 1,84 g ml-1 (MW = 98,04 g Mol-1; Konzentration =
98 Gew.%)
Aus diesen Angaben kann man die Schwefelsäuremenge berechnen, die in jeder Titrationsprobe ent-
halten ist. Zur Berechnung siehe unten.
48
Fertigen Sie eine Tabelle an, in die Sie den Verbrauch an 0,1 N NaOH für CH3COOH + H2SO4
(ml), den Verbrauch an 0,1 N NaOH für CH3COOH ohne H2SO4 (ml) sowie die in der Reak-
tionslösung jeweils herrschende Essigsäurekonzentration in Mol l-1 eintragen.
Zeichnen Sie die Essigsäurekonzentration (Mol l-1) als Funktion der Zeit (Minuten). (Maßstab:
Abszisse: 10 Minuten = 1 cm; Ordinate: 1 Mol l-1 = 4 cm; DIN A4 für hoch)
Berechnen Sie die Gleichgewichtskonstante.
Aus der Essigsäurekonzentration im Gleichgewichtszustand und der Menge der Edukte sind
sämtliche Gleichgewichtskonzentrationen leicht zu berechnen.
HAc MK
VNaOH,kor NaOH
Gleichung 7-6
V
ANS Ansatz
MK Meßkolben
VF Verdünnungsfaktor
VF = 0,05
[NaOH] = 0,1 M
V = 10 ml
Veresterung
g
0 ,4ml 1,84 0 ,98
H 2 SO4 ANS ml 0 ,0406M Gleichung 7-10
g
98,04 0 ,1814 l
Mol
mit VF 0,05
2V H 2 SO4MK
VNaOH,H2 SO4 Gleichung 7-12
NaOH
mit V 10ml
und NaOH 0,1M
3
2 10ml 2 ,028 10 M
VNaOH,H2 SO4 0 ,406ml Gleichung 7-13
0 ,1M
Hydrolyse
1 ml konzentrierte H2SO4 in 182,0 ml Ansatz (Berechnung [H2SO4] ANS wie vorher)
g
1,0 ml 1,84 0 ,98
H 2 SO4 ANS g
ml 0 ,101M Gleichung 7-14
98,04 0 ,182 l
Mol
H 2 SO4 MK 5,053 10 3 M (Berechnung von H 2 SO4 MK wie vorher) Gleichung 7-15
Die quantitative Erfassung der Elementzusammensetzung von organischen Stoffen leistet die orga-
nische Elementaranalyse, die durch Verbrennung der organischen Substanz mit O2 oder anderen
Oxidationsmitteln zu CO2, H2O und N2 den Gehalt der Probe an Kohlenstoff, Wasserstoff und
Stickstoff liefert. Man kann so die Bruttozusammensetzung eines Reinstoffes, oder bei bekannter
Summenformel seine Reinheit bestimmen.
Wesentlich schwieriger noch ist die quantitative Analyse von Substanzklassen oder funktionellen
Gruppen. Für die in der Biochemie äußerst wichtige Bestimmung des Proteingehaltes einer Probe
wurden beispielsweise Dutzende von Verfahren ausgearbeitet (Lowry, Bradford, Petersen etc.), die
alle zwar eine spezifische Reaktion der Proteine zur Grundlage haben, aber dennoch empirisch
anhand von bekannten Proben geeicht werden müssen. Der Grund liegt in der Komplexität der Kon-
stitution organischer Moleküle, so dass eine mit einem Satz von Proben quantitativ ablaufende
Reaktion mit anderen Verbindungen aufgrund der gegenseitigen Beeinflussung funktioneller
Gruppen (Nachbargruppeneffekte) oder dem Auftreten von Nebenreaktionen nur geringe Umsätze
bringen mag. Vielfach sind deshalb instrumentelle Bestimmungsmethoden an die Stelle von
quantitativen chemischen Verfahren getreten. Diese werden heute nur noch angewandt, wenn sie
50
eindeutig verlaufen, leicht durchzuführen sind und zuverlässige Ergebnisse liefern. Ein Beispiel
hierfür ist die Äquivalentgewichts–Bestimmung eines Esters.
Carbonsäureester können durch Wasser in ihre Bestandteile Carbonsäure und Alkohol zerlegt
(hydrolysiert) werden. Die Hydrolyse lässt sich durch Säuren oder Basen beschleunigen. Bei
Anwendung von wässrigem Alkali findet eine quantitative stöchiometrische Umsetzung gemäß
O O
R C + OH– R C + R' OH
OR' O–
–
statt. 1 Mol Ester verbraucht also 1 Mol OH . Wenn man die Esterspaltung in Gegenwart eines
Basenüberschusses durchführt, kann man nach vollständiger Reaktion aus der Estereinwaage und
dem Basenverbrauch das Äquivalentgewicht des Esters erhalten.
Die in der Natur weit verbreiteten Fette sind konstitutionell Ester des dreiwertigen Alkohols
Glycerin mit langkettigen Carbonsäuren (sog. Fettsäuren). Meist sind alle 3 Hydroxyfunktionen des
Glycerins verestert (Triglyceride), wobei die Kette der einzelnen Carbonsäuren 14–22 C–Atome
lang sein kann und auch häufig Doppelbindungen enthält. Die alkalische Esterspaltung der Fette
liefert die Alkalisalze der Fettsäuren (sog. Seifen, daher der Ausdruck "Verseifung" für Hydrolyse).
Die Menge der dabei verbrauchten Base (mg KOH/g Fett = Verseifungszahl) gibt einen
Anhaltspunkt für die mittlere Molmasse des Triglycerids und damit für den Gehalt an langkettigen
Fettsäuren.
Hydrolyse
Man bringt genau 10 ml (Vollpipette) der vorher hergestellten Lauge in einen 100 ml Schliffkolben,
fügt 8 ml der vom Assistenten ausgegebenen Esterlösung (= 0,5 g eines Diethylesters) zu und setzt
einen gefetteten Schliffkühler mit einem Ätznatronrohr (zum Ausschluss von CO2; Erklärung!) auf.
Die Mischung wird unter gelegentlichen vorsichtigen Schwenken im Ölbad für 40 min auf 120–130
°C erhitzt. Man lässt den Kolben unter 80 °C abkühlen, spült Alkalireste im Kühler mit ca. 20 ml
entionisiertem Wasser in die Mischung, überführt den gesamten Kolbeninhalt vollständig
(Nachspülen mit Wasser) in einen 300 ml Weithals–Erlenmeyerkolben und titriert die nicht
verbrauchte Base mit 0,5 N Salzsäure (Maßlösung!) gegen Phenolphthalein. Ca. 1 ml der
ausstehenden Indikatorlösung (0,1 % in Ethanol) verwenden. Umschlag von Purpurrot nach farblos
(bzw. leicht gelblich aus der ursprünglich gefärbten Laugenlösung). Säureverbrauch notieren =
VHydr.
In der gleichen (!!) Weise führt man eine Blindbestimmung durch, bei der anstatt des Esters 8 ml
Diethylenglykol zugegeben werden. Säureverbrauch notieren = VBlind.
Berechnung:
E 1000
x Gleichung 7.1-1
V N
51
mit
x Äquivalentgewicht des Esters (g/Val)
E Einwaage des Esters (in g)
V Differenzv erbrauch an Säure
VBlind V Hydr ( ml )
N Normalität der Säurelösung (Val/l)
Für die verwendete HCl (einprotonige Säure) ist die Normalität (Einheit N) identisch mit der
Molarität (Einheit M).
Wie hoch ist die Molmasse des Diethylesters (d.h. eines Esters aufgebaut mit einer zweiprotonigen
Säure)? Machen Sie einen Strukturvorschlag für den Diester aufgrund des bestimmten
Äquivalentgewichts bzw. seiner Molmasse.
O– O–
alkalische
O Phosphatase
–
C O P O C
O O – + OH–, - HPO42–
C
C O
–
O O O
Phenolphthalein–Phosphat Phenolphthalein
farblos rot
Aufgabe: Stellen Sie die entsprechende Reaktionsgleichung für die Umsetzung von Para-
Nitrophenolphosphat in vollständigen Strukturformeln auf.
Beim alkalischen pH–Wert unserer Reaktionslösung ist Phenolphthalein intensiv rot gefärbt,
während der Phosphorsäureester farblos erscheint. Aus messtechnischen Gründen ist allgemein
üblich, die Aktivität der Phosphatase nicht mit einem natürlich vorkommenden Substrat, sondern
mit einem chromogenen Substrat vom Typ des Phenolphthaleinphosphats oder des p-Nitro-
phenylphosphats zu ermitteln.
O
O2N O P O–
O–
p–Nitrophenylphosphat
Bei unserem Versuch benützen wir eine hohe Substratkonzentration, sodass die Reaktionsgeschwin-
digkeit während der Reaktion konstant bleibt. Dadurch erreichen wir, dass die Umsetzung nach
einem Zeitgesetz 0. Ordnung abläuft und die Beziehung
RG
k
d A
Gleichung 8-1
dt
Lambert-Beersches-Gesetz: ΔE = ε x c x d
ΔE = Extinktionswert, wird vom Photometer angezeigt
ε = molarer Extinktionskoeffizient, muss für jedes Substrat bestimmt werden
c = Konzentration des Substratprodukts in der Küvette
d = Schichtdicke der Küvette = Wegstrecke, die das Licht bis zur Photozelle zurücklegt
Vor Beginn der Aktivitätsmessung müssen sie zunächst den molaren Extinktionkoeffizienten des
Substratprodukts para-Nitrophenolat (p-NP) bestimmen. p-Nitrophenolat entsteht bei der
Dephosphorylierung von para-Nitrophenol-monophosphat durch das Enzym Alkalische
Phosphatase.
1. Stellen sie sich zunächst aus der 1M Natronlauge (Vorsicht! Stark ätzend! Handschuhe und
Schutzbrille benutzen), steht auf den Seitentischen, 200 mL einer 20 mM Natronlauge her, indem
sie 4 mL der 1 M Natronlauge mit 196 mL H2Oention. mischen. Messzylinder und Becherglas
benutzen.
2. Fertigen sie dann aus der 1 millimolaren Lösung von p-Nitrophenol und der 20 millimolaren
NaOH-Lösung. eine 0.01 millimolare Lösung von p-Nitrophenol an (1 ml der 1 mM Lösung im
Messkolben auf genau 100 mL mit 20 mM NaOH auffüllen). Lösung gut mischen.
3. Stellen sie sich 10 Reagensgläser bereit und stellen sie folgende Verdünnungen her:
1 mL 0.01 mM p-NP-Lsg. + 9 mL 20 mM NaOH = 0.001 mM = 1 μM p-NP-Lösung
2 mL 0.01 mM p-NP-Lsg. + 8 mL 20 mM NaOH = 0.002 mM = 2 μM p-NP-Lösung
3 mL 0.01 mM p-NP-Lsg. + 7 mL 20 mM NaOH = 0.003 mM = 3 μM p-NP-Lösung
usw. bis zur 10. Lösung = unverdünnte 0.01 mM p-NP = 10 μM p-NP-Lösung
3. Decken sie jedes Reagensglas mit einem Parafilm ab, und durchmischen sie die Lösung gut
54
indem sie sie etliche Male auf den Kopf stellen, Parafilm dabei mit dem Daumen gut festhalten!
4. Stellen sie am Photometer die Wellenlänge 410 nm (Siehe Versuch 4, Ermittlung des
Absorptionsmaximums) ein und gleichen sie das Gerät mit 20 mM NaOH auf Null ab.
5. Messen sie nun den Extinktionswert aller 10 Lösungen in jeweils ungebrauchten Küvetten mit
einer Schichtdicke von 1 cm. Fertigen sie eine Tabelle mit Spalten für die Konzentrationswerte, die
jeweiligen Extinktionswerte und die zu berechnenden molaren Extinktionskoeffizienten-Werte an.
Berechnen sie für jede Konzentration den ε-Wert. Tragen sie zusätzlich die Extinktionswerte als
Funktion der Konzentrationen von p-NP in ein Diagramm ein. Legen sie eine Ausgleichsgerade
durch alle Punkte, die Mehrzahl der eingetragenen Punkte sollten auf dieser Gerade legen. Punkte
im oberen Konzentrationsbereich, die zu sehr von der Geraden abweichen nicht berücksichtigen.
Der molare Extinktionskoeffizient von p-Nitrophenol ist die Steigung dieser Geraden.
Bilden sie zusätzlich den Durchschnittswert aller ε-Werte und vergleichen sie diesen Wert mit der
Steigung ihrer Ausgleichsgeraden. Die Werte werden vermutlich etwas voneinander abweichen, was
auch auf die nur relativ genaue Einpassung der Ausgleichsgeraden durch alle Messwerte
zurückzuführen ist.
6. Berechnen sie den Umrechnungsfaktor von der Änderung der Extinktion pro Minute auf die
Enzymaktivität = Stoffmengenumsatz pro Minute, indem sie das Volumen ihrer Reaktionsmischung
= 8 mL durch den ermittelten Durchschnittswert von ε und der Schichtdicke von 1 cm teilen.
Fertigen sie dann die Kinetiken der Enzymstandard-Lösung und ihrer Enzym-Analysenlösung an
und berechnen sie mit Hilfe des Umrechnungsfaktors die Enzymaktivität der alkalischen
Phosphatase sowie die Teilaktivität ihrer Enzym-Analysenlösung. Geben sie die Teilaktivität ihrer
Analysenlösung in Prozent an.
In ein Reagenzglas geben Sie jetzt der Reihe nach (alle Lösungen müssen Raumtemperatur
besitzen):
Mischen Sie sehr gründlich und rasch den Inhalt des Reagenzglases durch Umschütteln und füllen
Sie damit eine Photometerküvette ca. 2/3 voll. Setzen Sie sofort die Küvette in das Photometer ein.
Starten Sie Ihre Messung durch Drücken der entsprechenden Funktionstaste und bestimmen Sie die
Extinktion alle 30 Sekunden bis der Extinktionswert von 1,0 erreicht ist bzw. 7 Min. vergangen
sind. Zeichnen Sie die Extinktion als Funktion der Zeit.
(Abszisse: Zeit; 1 min. = 2 cm; Ordinate: Extinktion; 0,1 E = 2 cm; DIN A4 für hoch)
Führen Sie anschließend genau denselben Versuch mit Ihrer Analysenlösung aus. Zeichnen Sie
ebenfalls die Extinktion als Funktion der Zeit.
Ermitteln Sie bei beiden Graphiken die Steigung m (E min-1) der erhaltenen Geraden in ihrem
linearen Bereich und errechnen Sie daraus die beiden Phosphatase-Aktivitäten. Die Phosphatase-
55
U
dc
dt
v m E
v
min ε d
Gleichung 8-2
dc 1 1
Reaktionsgeschwindigkeit ( μMol ml min ) Gleichung 8-3
dt
wobei
v = Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes = 8 ml
und
d = Schichtdicke = 1 cm
Formulieren Sie die Enzymaktivität Ihrer Analyse relativ zu der der Standardlösung als Prozentwert.
Die Aktivität der alkalischen Phosphatase im Serum gesunder Erwachsener beträgt 4–17 Units/100
ml Serum. Die alkalische Phosphatase ist bei bestimmten Knochenerkrankungen, z.B.
Skelettmetastasen von Tumoren erhöht.
56
P1
k1
k –1
mit
G freie Aktivierungsenthalphie
R G freie Reaktionsenthalpie
57
G (2)
RG (1)
RG (2)
Reaktionskoordinate
___
Abbildung 27: Energiediagramm einer verzweigten Konkurrenzreaktion. Kinetische Kontrolle ( ), thermodynamische
Kontrolle (.......).
H H H H
H H H H
H – H2O H
O + H2N NH C NH2 N NH C NH2
H + H2O H
O O
H H H H
H H H H
H H H H
– H2O
+ H2N NH C NH2
C O + H2O C N NH C NH2
H O O H O
H H O
Eduktlösung: In einem Becherglas werden 3,1 ml (30 mmol) Cyclohexanon, 2,5 ml (30 mmol)
frisch destilliertes Furfural und 15 ml Ethanol gemischt und zu 3 gleichen Teilen auf Reagenzgläser
aufgeteilt (mit Messpipette dosieren).
Mit diesen Lösungen werden folgende Versuche durchgeführt:
c) 0,3 g Produkt A werden mit 10 ml Wasser und der Hälfte der Eduktlösung des dritten
Reagenzglases in einem Rundkolben mit aufgesetztem Kühler im Ölbad 5 Minuten auf ca.
90 °C erwärmt. Die Kristalle werden wie beschrieben gesammelt und ihr Schmelzpunkt
bestimmt (Produkt C).
d) Dieselbe Operationsfolge wie bei c) wird mit dem Produkt B und der zweiten Hälfte der
verbliebenen Eduktlösung durchgezogen (Produkt D).
Durch Vergleich der Schmelzpunkte der Produkte mit den Angaben in der Einleitung soll
entschieden werden, welche Semicarbazidreaktionen zum thermodynamischen bzw. kinetischen
Produkt führen. Formulieren Sie den Reaktionsmechanismus, besonders den Einfluss des pH-
Wertes und versuchen Sie eine Erklärung für die beobachteten Stabilitäten/Bildungsraten der Semi-
carbazone zu finden.
NMR Spektroskopie
Atome mit einem Kernspin (z.B. 1H, 13C) absorbieren in Gegenwart eines Magnetfelds Energie im
Radiofrequenzbereich. Dieses Phänomen der Kernspinresonanz ist die Grundlage der NMR-
Spektroskopie, einer der wichtigsten Methoden zur Aufklärung der Struktur von Stoffen. Die
physikalischen Grundlagen der NMR-Spektroskopie entnehmen Sie den einschlägigen Lehrbüchern.
Als Anwender wird man mit mehreren NMR-Parametern konfrontiert, die Informationen zur
Struktur liefern (chemische Verschiebung, skalare Kopplung, Signalintensität, dipolare
Wechselwirkung, NOE). In den letzten 20 Jahren war die NMR-Spektroskopie einer stürmischen
Weiterentwicklung unterworfen, die sich in einer Vielzahl von neuen experimentellen Techniken
und wesentlich weiterentwickelten NMR-Geräten mit hoher Feldstärke ausdrückt. Ein großer Teil
dieser Entwicklung wurde durch mehrdimensionale Messverfahren ausgelöst, die es im
Zusammenhang mit moderner Computertechnologie erlauben, die Struktur von komplexen
organischen Molekülen, bis hin zu Proteinen aufzuklären.
Gaschromatographie-Massenspektrometrie
Die Gaschromatographie ist eine Verteilungschromatographie, die nur für gasförmige oder
verdampfbare, stabile Komponenten zugängig ist. Hierzu ist oft eine Derivatisierung von ansonsten
nicht flüchtigen Verbindungen notwendig. Als mobile Phase dient ein Inertgas (meist Helium),
stationäre Phasen sind oft Polyorganosiloxane (z.B. 5% Phenyl-/ 95% Dimethylsiloxan) in
kapillarartigen, gewickelten Säulen aus beschichtetem Quarzglas (in der Regel mehrere Meter lang).
Abhängig von Polarität und Größe der zu untersuchenden Moleküle adsorbieren diese
unterschiedlich lange an der Säule und werden dadurch getrennt. Gaschromatographie ist häufig
mit der Massenspektrometrie gekoppelt. Am Eingang des Massenspektometers werden die
flüchtigen Komponenten ionisiert (z.B. durch Elektronenstoßionisation (EI) M + e- M+ • + 2e- ).
Im Inneren des Massenspektrometers werden die Ionen dann nach Massenzahl bzw. Verhältnis
Masse (m) zu Ladung (z) getrennt (m/z). Die Ladung ist nahezu immer 1, m/z kann deswegen mit
der Masse in der Regel gleichgesetzt werden. Ein Massenspektrum zeigt dann die Auftrennung der
einzelnen Ionen im elektrischen oder magnetischen Feld. Als Detektor dient oft ein kontinuierlicher
Sekundär-ionenvervielfacher (SEV).
Physikalische Methoden zur Aufklärung der Struktur von Proteinen und Peptiden
Die Ermittlung der Raumstruktur von Biomolekülen ist heute eines der aktuellsten
Forschungsgebiete der Biowissenschaften. Im Wesentlichen liefern vier unabhängige physikalische
Methoden Informationen zur Raumstruktur von Proteinen:
4. Die Raumstruktur von Proteinen in Lösung kann durch die NMR-Spektroskopie analysiert
werden. Durch geeignete NMR-Experimente (i.A. mehrdimensional) können Abstände von
Wasserstoffatomen in einem Protein (über sog. NOE-Effekte), sowie Diederwinkel des
Proteingerüstes (über Kopplungskonstanten und die Karplus-Beziehung) ermittelt werden. In
Kombination mit Rechenverfahren (molecular dynamics) kann dann die Lösungsstruktur des
Proteins mit hoher Auflösung (bis auf wenige Å) bestimmt werden. Die NMR-Analyse ist in der
Regel beschränkt auf in Lösung stabile Proteine mit kleinem, bzw. mittlerem Molekulargewicht (bis
ca. 100 kDa).
Die Voraussetzung der Ermittlung von Strukturinformation aus NMR-Spektren ist eine gesicherte
Zuordnung der NMR-Signale auf Atompositionen im Protein. Die NMR-Analyse eines Proteins
oder Peptids beginnt daher in der Regel mit der Zuordnung der 1H-NMR Signale.
Verschiedene Konformationen desselben Proteins haben zwar die gleiche Masse, aber durch die
verschiedenen elektrischen Ladungen, die sie während des Ionisierungsprozesses aufnehmen,
können sie voneinander getrennt werden. Zum Beispiel. werden kompakte Moleküle weniger stark
geladen als lang-gestreckte Moleküle, deswegen kann der Faltungsprozess eines Proteins mittels
Messung stationärer oder transienter Zustände verfolgt werden.
Auch über die Masse allein kann eine Untersuchung der Konformation erfolgen. Hierfür werden
Proteine in Deuteriumoxid gelöst. Außen liegende Protonen können ausgetauscht werden, die
Austauschgeschwindigkeit ist von der Konformation abhängig.
61
Anmerkungen: Bitte beachten Sie, dass die tabellierten Werte für freie Aminosäuren gelten und die
entsprechenden Werte für Aminosäuren gebunden in einem Peptid abweichen können. Generell ist
die Zuordnung der Signale aus einem eindimensionalen Spektrum durch Vergleich mit tabellierten
Verschiebungsdaten limitiert in Bezug auf die Aussagegenauigkeit (z.B. auf Grund von pH-,
Temperatur- oder Konzentrationseffekten auf die chemische Verschiebung) und in Bezug auf die
Molekülgröße (Signalüberlagerungen im eindimensionalen Spektrum). Nur im Falle von wenigen
Aminosäureeinheiten in Peptiden (z.B. Dipeptid) können aus eindimensionalen Daten belastbare
Strukturinformationen erhalten werden.
62
Tabelle: Chemische Verschiebungen der 1H-NMR Signale von freien Aminosäuren in ppm. Es
sind Aminosäuren aufgeführt, die in der Analysensubstanz auftreten können)
63
64
Im Falle von größeren Peptiden oder Proteinen gelingt die Auflösung und damit Zuordnung
überlagerter Signale durch Anwendung spezieller NMR-Experimente unter Einbeziehung weiterer
Frequenzdimensionen (zwei-, drei- oder vierdimensionale NMR-Spektroskopie). Im Allgemeinen
erfolgt im ersten Schritt der NMR-Analyse die Einteilung der Signale in sog. Spinsysteme (d.h. in
Atome bzw. Kernspins, die gekennzeichnet sind durch gegenseitige Wechselwirkung über
Bindungen im Atomgerüst = skalare Kopplung). Ein häufig angewandtes Experiment zur Einteilung
der Signale auf Aminosäureeinheiten ist das sog. zweidimensionale TOCSY-Experiment. Ein
Spinsystem umfasst hier häufig sämtliche 1H-Signale einer Aminosäure.
Das Erkennen von Spinsystemen in einem zweidimensionalen TOCSY-Spektrum ist am Beispiel
von Lys-Asp in der folgenden Abbildung gezeigt:
65
Die eingesetzte TOCSY-Spektroskopie ist ein sog. Homo-Korrelationsverfahren, bei dem identische
Kernarten (hier: 1H) aufeinander korreliert werden. In beiden Richtungen des zweidimensionalen
Spektrums ist die chemische Verschiebung der 1H-Kerne aufgetragen. Die Diagonale der
zweidimensionalen Matrix reflektiert das eindimensionale 1H-Spektrum des Dipeptids (hier
zusätzlich über beide Achsen projiziert). Die skalare Wechselwirkung von 1H-Kernspins wird von
den zur Diagonale symmetrischen Signalen, den sog. Kreuzsignalen, reflektiert. Signale auf der
Diagonale, die über Kreuzsignale verknüpft sind, umfassen ein zusammenhängendes Spinsystem (in
der Abbildung markiert). Im Falle des TOCSY-Experiments umfasst ein Spinsystem 1H-Atome, die
durch skalare Kopplung (über Bindungen) in einem zusammenhängenden Netzwerk verknüpft sind
(siehe Abbildung). Skalare Kopplungen über quartäre C-Atome sind klein und werden im TOCSY-
Experiment in der Regel nicht beobachtet.
66
In Falle eines COSY-Spektrums können nur die direkten Nachbarn in einem Spinsystem korreliert
werden, sodass ein gegebenes Spinsystem über die COSY-Korrelationen weiter zugeordnet werden
können. Im Falle von einfachen Spinsystemen in Aminosäuren reicht häufig das COSY-Spektrum
bereits für eine eindeutige Strukturzuordnung aus.
Abbildung: COSY Spektrum von Ala-Ser mit dem entsprechenden 1D-Spektrum als
Projektion
Analysensubstanz (unbekanntes Dipeptid) analysiert werden. Die durch Vergleich mit tabellierten
Verschiebungswerten aus dem eindimensionalen Spektrum vermutete Signalzuordnung soll
bewiesen werden durch Analyse von Spinsystemen in den zweidimensionalen Experimenten.
Sie bearbeiten das 1H-NMR Spektrum eines unbekannten Dipeptids. Mit Hilfe des
eindimensionalen Spektrums, den zweidimensionalen COSY- und TOCSY Spektren soll die
Zusammensetzung des Dipeptids ermittelt und protokolliert werden.
Folgende Datenanalyse soll in Form einer Tabelle aus dem Spektrum erstellt werden:
- Chemische Verschiebung von Signalen (Signale in laufenden Nummern von links nach rechts in
der Tabelle von oben nach unten anordnen; hierzu den Schwerpunkt eines Multipletts verwenden)
- Multiplizität von Signalen (Singulett, Dublett, etc.)
- Vorgeschlagene Zuordnung durch Vergleich mit tabellierten Daten von Aminosäuren
(Mehrfachnennung möglich falls keine eindeutige Zuordnung möglich ist).
Beispiel einer Ergebnistabelle für die NMR-Analyse. Die beiden letzten Spalten werden nach
Analyse des zweidimensionalen TOCSY-Spektrums (siehe unten) ausgefüllt.
Anhand der Masse können sowohl die Aminosäuren als auch die Sequenz identifiziert werden. Es
entstehen hauptsächlich 2 Fragmente bei der Ionisierung. Zum einen durch den Bruch der zentralen
CH-CO Bindung in der N-terminalen Aminosäure (Fragment a in Abb.), zum anderen durch den
Verlust einer (manchmal auch zwei) Methylgruppe von den TMS-Resten des Molekülions
(Fragment b in Abb.).
Berechnen Sie zunächst die Masse des derivatisierten (alle freien OH und NH2 Gruppen besitzen
TMS-Reste) Dipeptids (identifiziert durch die NMR-Spektren) und suchen sie nach der
entsprechenden Masse (minus 1 oder 2 mal Masse von CH3, Fragment b) im Massenspektrum.
Suchen Sie nach der Masse von Fragment a und sichern Sie dadurch die (durch NMR) postulierte
Sequenz ab. Dokumentieren Sie Ihre Ergebnisse möglichst genau.
11 Anhang: Photometrie
Das Photometer ist ein wichtiges und zugleich sehr genaues Messinstrument im Laborbetrieb. Man
unterscheidet
Filterphotometer, bei denen man nur Messungen bei einer begrenzten Zahl von Wellenlängen,
entsprechend den vorhandenen Filtern, ausführen kann
Spektralphotometer, bei denen eine beliebige Wellenlänge eingestellt werden kann.
Es sei I0 die in eine Messzelle eingestrahlte Lichtintensität und I die durchgelassene Intensität. Unter
der Absorption einer Messprobe bei einer bestimmten Wellenlänge versteht man den Anteil des von
der Probe absorbierten Lichts in %. Es gilt:
I 0 I
Absorption 100 (% ) Gleichung 11-1
I0
Meistens benützt man jedoch eine logarithmische Messgröße, die sogenannte Extinktion (E). Sie ist
folgendermaßen definiert
I0
E log Gleichung 11-2
I
Sie ist direkt proportional zu der Konzentration der gemessenen Substanz, entsprechend dem
Lambert-Beer‘schen-Gesetz
E cd Gleichung 11-3
wobei
molarerExtinktionskoeffizient ( l mol
-1 -1
cm ),
1
c Konzentration ( mol l ),
d Schichtdicke (cm ).
Praktisch verfährt man meist so, dass man zunächst das reine Lösungsmittel mißt und diesem durch
entsprechende Einstellung des Photometers die Extinktion 0 zuordnet.
Zur Messung füllt man das Lösungsmittel bzw. die Messprobe in eine sogenannte Messküvette. Im
Praktikum steht ein Spektralphotometer zur Verfügung, das mit Messküvetten aus Polystyrol
(Schichtdicke 1 cm) arbeitet.
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Die optischen Flächen der Messküvetten sollten sehr sauber gehalten werden. Fingerabdrücke und
Schmutz verfälschen die Messungen. Will man Messungen im UV–Spektralbereich unterhalb 320
nm durchführen (mit dem im Praktikum vorhandenen Gerät nicht möglich), so können Küvetten aus
Polystyrol nicht verwendet werden, da sie UV–Licht nicht durchlassen. Stattdessen verwendet man
Küvetten aus Quarz.
1) Stellen Sie die entsprechende Wellenlänge ein und bestimmen Sie den Nullwert (s.o.)
2) Drücken Sie die Taste „FUNCTION“ solange bis eine der Zeitfunktionen erscheint:
3) Drücken Sie die Taste „MODE“: Im rechten Anzeigenfeld erscheint ein kleines „r“ hinter der
Intervallangabe. Das Gerät zeigt dann nach jedem Intervall die Gesamtextinktion an (falls „r“
nicht erscheint, wird nur die Differenz zwischen zwei Intervallen angezeigt!).
4) Setzen Sie Ihre Küvette ein und schließen Sie den Deckel.
5) Starten Sie die Messung durch Drücken der Taste „PRT/ENT“: Im rechten Anzeigenfeld
erscheint die Anfangsextinktion, im linken Anzeigenfeld erscheinen abwechselnd das
Zeitintervall (t 15 etc.) und die Nummer des Messwertes (beginnend mit 000). Im Abstand des
gewählten Intervalls ändern sich die Werte entsprechend (Zeittakt: 5 s innerhalb eines
Intervalls). Notieren Sie sich die Nummer des Messwertes und den entsprechenden
Extinktionswert.
6) Um die Zeitfunktion zu stoppen, drücken Sie solange auf die „FUNCTION“–Taste, bis im
linken Anzeigenfeld „Fn 0“ aufleuchtet und anschließend auf „PRT/ENT“. Das Gerät befindet
sich dann wieder im Normalmodus.
1) Mit der Funktionstaste F2 die Menüliste und auf dem Ziffernfeld Modus 1 anwählen
(absorbance = engl. Extinktion).
2) Taste drücken, die gewünschte Wellenlänge auf dem Ziffernfeld eingeben und mit der
Funktionstaste F3 ( ) bestätigen.
3) Referenzküvette in das Gerät stellen und Taste drücken.
4) Die zu messende Probe(n) gegen die Referenz austauschen und die Extinktion(en) notieren.
Soll bei einer veränderten Wellenlänge gemessen werden, muss man die neue Wellenlänge (wie
vorher beschrieben) eingeben. Nach dem Referenzabgleich können dann die Probenmessungen
ausgeführt werden.
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1) Mit der Funktionstaste F2 die Menüliste und auf dem Ziffernfeld Modus 5 anwählen
(wavescan).
2) Startwellenlänge eingeben und mit der Funktionstaste F3 ( ) bestätigen.
3) Endwellenlänge eingeben und mit der Funktionstaste F3 ( ) bestätigen.
4) Der Bildschirm zeigt nun an: OUTPUT TO DISPLAY. Mit drücken auf F3 ( ) weiter.
5) Die Referenzküvette in das Gerät stellen und die Taste drücken.
Das Gerät gleicht jetzt die Basislinie im vorgewählten Wellenlängenbereich ab. Danach muss der wavescan-
Modus verlassen werden und manuell im absorbance-Modus die Extinktionen der Probe gemessen und notiert
werden. Die wellenlängenabhängige Messung einer Referenzprobe entfällt, da bereits die Basislinie (s.o.) vom
Gerät abgespeichert wurde.
1) Mit der Funktionstaste F2 die Menüliste und auf dem Ziffernfeld Modus 4 anwählen
(time intervalls).
2) Taste drücken, die gewünschte Wellenlänge auf dem Ziffernfeld eingeben, mit der
Funktionstaste F3 ( ) bestätigen.
3) Zeitintervall (sec) eingeben und mit der Funktionstaste F3 ( ) bestätigen.
4) Referenz mit F3 ( ) aufrufen, Referenzprobe in das Gerät stellen, die Taste drücken,
und die Referenzprobe entfernen.
Das Gerät ist nun für eine Kinetikbestimmung messbereit. Ab jetzt ist zügig zu arbeiten!
5) Die mit der gestarteten Reaktionslösung gefüllte Küvette unverzüglich in das Gerät stellen
und die Messung mit der Taste starten.
6) Protokollieren Sie E = f(t). Stellen Sie auch gleichzeitig den Extinktionsverlauf graphisch
dar.
7) Mit drücken der Taste F1 (ESCape) wird die Messung beendet. Damit ist das Gerät wieder
für eine nächste Kinetikmessung (unter den gleichen Versuchsparametern) messbereit.
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12.1 pH–Messung
1) Messkette an das Messgerät anschließen, und an der Messkette den Verschlussschieber der
Nachfüllöffnung öffnen.
2) Messgerät mit einschalten.
3) Meßsystem kalibrieren bzw. überprüfen.
a) Mit pH-Messmodus und mit Cal-Verfahren wählen (mit AutoCal TEC arbeiten)
b) Messkette in die erste Pufferlösung tauchen (mit Standardpuffer pH 4,01 und pH 7,00
kalibrieren).
c) Taste drücken, AR blinkt – stabilen Meßwert abwarten.
d) Messkette spülen.
e) Messkette in die zweite Pufferlösung tauchen.
f) Taste drücken, AR blinkt – stabilen Messwert abwarten.
g) Zurück zum Messmodus: Taste drücken
4) Messkette in das Messmedium eintauchen.
5) Messmodus mit auswählen.
Im Display erscheint der pH-Wert bzw. die Redoxspannung (mV) der Messlösung.
6) Am Ende der Messungen zur Aufbewahrung der Messkette den Verschlussschieber wieder
schließen, die mit 3 M KCl gefüllte Wässerungskappe anbringen und senkrecht auf-
bewahren.
Beim Wechsel von einer Messlösung/Kalibrierpuffer zur nächsten sollte nach dem Abspülen der
Elektrode diese mit weichem, sauberem Fließpapier (z. B. Papiertaschentuch) vorsichtig trocken
getupft werden.
12.2 Spannungsmessung
Am Gerät sind mit den Kabeln die Eingänge pH/U und Ref zu belegen. Gerät einschalten und mit
den mV-Modus wählen.
Die Kabel können jetzt mit Hilfe der Klemmen an die zu messende Spannungsquelle angeschlossen
werden. (Der pH/U Eingang am Gerät ist der + Pol.)
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13 Anhang: Gerätekunde
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