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PRAKTIKUM CHEMIE II

ORGANISCHE UND PHYSIKALISCHE CHEMIE


BACHELOR BIOLOGIE

4 SWS
4 CREDITS

TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN


DEPARTMENT CHEMIE
LEHRSTUHL FÜR BIOCHEMIE
LEHRSTUHL FÜR BIOTECHNOLOGIE

LEITUNG: PD Dr. Wolfgang Eisenreich

Lichtenbergstraße 4
85747 Garching
Tel + 49-89-289-13336
Fax + 49-89-289-13363
E-Mail: wolfgang.eisenreich@mytum.de

Auflage 2012  2012


Redaktionelle Bearbeitung: Dr. Eisenreich Lehrstuhl für Biochemie
Technische Universität München
i

1 EINFÜHRUNG IN DAS PRAKTIKUM ........................................................................................................... 1

1.1 SICHERHEITSVORKEHRUNGEN ............................................................................................................................... 2


1.2 PROTOKOLLFÜHRUNG, PERSÖNLICHE ARBEITSMITTEL........................................................................................... 3

2 REINIGUNG ORGANISCHER VERBINDUNGEN....................................................................................... 4

2.1 UMKRISTALLISIEREN ............................................................................................................................................. 4


 Versuch: Umkristallisieren von Benzoesäure (1. Versuchstag) .............................................................................................. 5
2.2 EXTRAKTION ......................................................................................................................................................... 5
 Versuch: Trennung von Naphthalin und Benzoesäure durch Extraktion (1. Versuchstag) ..................................................... 5
2.3 DESTILLATION .........................................................................................................................................................
 Versuch: Destillation eines Methanol–/Wassergemisches mit und ohne Kolonne (2. Versuchstag) ........................................

3 CHROMATOGRAPHIE .....................................................................................................................................

3.1 ADSORPTIONSCHROMATOGRAPHIE (DÜNNSCHICHT) ...............................................................................................


 Versuch: Trennung von Aminosäuren (3. Versuchstag) ...........................................................................................................
 Versuch: Chromatographie einer Tinte (3. Versuchstag) ..........................................................................................................
 Versuch: Chromatographie von ätherischen Ölen (3. Versuchstag)…………………………………............................ ...
3.2 Adsorptionschromatographie (Säulentrennung)
 Versuch: Trennung eines Farbstoffgemisches (3. Versuchstag)
3.3 HPLC
 Versuch: Analyse einer Flavinmischung mittels RP-HPLC (erst am 4. Versuchstag Teil 2)

4 BIOORGANISCHE REDOXSYSTEME............................................................................................................

 Versuch: Redoxspektren an Riboflavin (4. Versuchstag Teil 1) ...............................................................................................

5 REDOXSYSTEME/DIFFUSIONSPOTENTIAL...............................................................................................

5.1 KONZENTRATIONSABHÄNGIGKEIT DES REDOXPOTENTIALS .....................................................................................


 Versuch: Messung des Diffusionspotentials (5. Versuchstag) .................................................................................................
 Versuch: Quantitative Chloridbestimmung (Potentiometrische Titration) (5. Versuchstag) ....................................................
5.2 CHINON–HYDROCHINON-SYSTEM ...........................................................................................................................
 Versuch: pH–Messung mit der Chinhydron–Elektrode (5. Versuchstag) .................................................................................

6 KINETIK ...............................................................................................................................................................

6.1 REAKTION 0. ORDNUNG:..........................................................................................................................................


6.2 REAKTION 1. ORDNUNG...........................................................................................................................................
6.3 MOLEKULARITÄT .....................................................................................................................................................
6.4 TEMPERATURABHÄNGIGKEIT DER REAKTIONSGESCHWINDIGKEIT ...........................................................................
6.5 ALKALISCHE HYDROXYLIERUNG VON KRISTALLVIOLETT ........................................................................................
 Versuch: Abhängigkeit der Hydroxylierungsgeschwindigkeit von der NaOH–Konzentration (6. Versuchstag) .....................

7 ESTERBILDUNG UND ESTERVERSEIFUNG ...............................................................................................

 Versuch: Veresterung von Essigsäure (1. Gruppe) (7. Versuchstag) ........................................................................................


 Versuch: Hydrolyse von Essigsäureethylester (2. Gruppe) (7. Versuchstag) ...........................................................................
7.1 QUANTITATIVE ORGANISCH–CHEMISCHE ANALYSE .................................................................................................
 Versuch: Bestimmung des Äquivalentgewichts eines Esters (Verseifungszahl) (8. Versuchstag)............................................

8 ENZYMATISCHE HYDROLYSE EINES ORGANISCHEN PHOSPHORSÄUREESTERS ......................

8.1 ENZYMATISCHE HYDROLYSE EINES ORGANISCHEN PHOSPHORSÄUREESTERS ..........................................................


ii

 Versuch: alkalische Phosphatase (9. Versuchstag) ...................................................................................................................

9 REVERSIBLE KONKURRENZREAKTIONEN: SIMULTAN–GLEICHGEWICHTE ..............................

 Versuch: Identifizierung des kinetischen bzw. thermodynamischen Produkts der Reaktion von Semicarbazid mit
Furfural bzw. Cyclohexanon (10. Versuchstag) ........................................................................................................................

10 NMR- UND GC/MS-SPEKTROSKOPIE

 Versuch: Struktur- und Sequenzbestimmung eines unbekannten Dipetids anhand von NMR (8. bis 10. Versuchstag)
 Versuch: Struktur- und Sequenzbestimmung eines unbekannten Dipetids anhand von MS (8. bis 10. Versuchstag)

11 ANHANG: PHOTOMETRIE ..............................................................................................................................

11.1 BEDIENUNGSANLEITUNG DES NOVASPEC II – PHOTOMETERS ..................................................................................


11.1.1 Extinktionsmessung bei einer konstanten Wellenlänge ......................................................................................
11.1.2 Aufnahme eines Spektrums.................................................................................................................................
11.1.3 Bestimmung der zeitabhängigen Extinktion (Kinetik) ........................................................................................
11.2 BEDIENUNGSANLEITUNG DES ULTROSPEC 1000 – PHOTOMETERS ...........................................................................
11.2.1 Extinktionsmessung bei einer konstanten Wellenlänge ......................................................................................
11.2.2 Aufnahme eines Absorptionsspektrums in einem vorgegebenen Wellenlängenbereich .....................................
11.2.3 Bestimmung der zeitabhängigen Extinktion (Kinetik) ........................................................................................

12 ANHANG: PH– UND SPANNUNGSMESSUNG ..............................................................................................

12.1 PH–MESSUNG..........................................................................................................................................................
12.2 SPANNUNGSMESSUNG..............................................................................................................................................

13 ANHANG: GERÄTEKUNDE
1

1 Einführung in das Praktikum


Dieses Grundpraktikum in organischer und physikalischer Chemie soll Studierende der
Fachrichtungen Biologie (Bachelor und Lehramt) mit den grundlegenden Methoden zur Beurteilung
(z.B. spektroskopische Kontrolle) und der Analytik organisch–chemischer Verbindungen bekannt
machen. Physikalisch–chemische Versuche sind weitgehend mit organisch–chemischen Reaktionen
verknüpft.
Das Hauptaugenmerk dieses Praktikums liegt auf modernen analytischen Methoden der organischen
Chemie. Es sei darauf hingewiesen, dass hierfür das Erlernen der zugrunde liegenden organisch–
chemischen Reaktionen unerlässlich ist.
Am Ende dieses Praktikums werden Sie einen Einblick in die Denkweise der organischen,
analytischen und physikalischen Chemie gewonnen haben. Moderne Biologie entwickelt sich mehr
und mehr in Richtung Molekularbiologie, die wiederum, soweit sie das rein reaktive Verhalten
dieser "biologischen Moleküle" betrifft, mittels organischer Chemie beschrieben wird.
Qualifikation für einen erfolgreichen Abschluss des Praktikums ist die erfolgreiche Durchführung
der Versuche, die Ihnen durch Testate bestätigt werden. Eine zusätzliche Leistungskontrolle Ihrer
Vorbereitung und Ihres Wissensstands zu den Versuchen wird jederzeit durch die Betreuer
vorgenommen. Kommen Sie deshalb nicht unvorbereitet zu den Versuchen. Die Veranstaltung
schließt mit einer Klausur ab. Zulassungsvoraussetzung zu dieser Klausur ist der erfolgreiche
Abschluss der Versuche. Das Bestehen der Klausur ist Voraussetzung für einen erfolgreichen
Abschluss. Die Gesamtnote setzt sich aus dieser Klausur und den einzelnen Bewertungen der
Einzelversuche zusammen.
In diesem Praktikum werden Sie mit einer Reihe von Gefahrstoffen (z.B. brennbare oder giftige
Stoffe) in Berührung kommen. Sie sind deshalb dringend gebeten, die am Beginn dieses Praktikums
vorgestellten Sicherheitsrichtlinien strikt einzuhalten. Es ist Ihre Pflicht, sich über die Risiken der
gestellten Aufgaben ausreichend zu informieren. Beachten Sie die bei den einzelnen Versuchen
angegebenen Sicherheitsmaßnahmen. Bei Unklarheiten erkundigen Sie sich (vorher!) bei Ihren
Betreuern. Dazu gehört auch die Einhaltung des korrekten Entsorgungsweges Ihrer
Abfallchemikalien. Der Abschluss einer Laborversicherung ist für jeden Teilnehmer Pflicht.

Für die einzelnen Aufgaben wurde auf folgende Literatur zurückgegriffen:

Empfohlene Lehrbücher
 S. Hauptmann, Organische Chemie, DVG, Leipzig, 1991;
 B. Schrader, Kurzes Lehrbuch der Organischen Chemie, de Gruyter, Berlin 1985.
 M. A. Fox und J. K. Whitesell, Organische Chemie, Spektrum Akad. Verlag, Heidelberg, 1995.
 A. Zeeck, S. Eick, B. Krone und K. Schröder, Chemie für Mediziner, Urban & Schwarzenberg
Verlag, München, 3. Auflage, 1997.
 P. W. Atkins, Physikalische Chemie, Verlag Chemie, Weilheim usw., 2. Auflage, 1999
 Wikipedia

Spektroskopische Methoden
 Williams/Fleming, Strukturaufklärung in der organischen Chemie, 6. Auflage, Thieme,
Stuttgart, 1991
 Chromatographie In: Aced/Möckel, Liquidchromatographie, Verlag Chemie, Weinheim, 1991
2

1.1 Sicherheitsvorkehrungen
 Eine einzelne Person darf niemals allein im Labor arbeiten.
 In den Labors ist das Essen, Trinken und Rauchen nicht gestattet!
 Alle Unregelmäßigkeiten im Labor sind unverzüglich zu melden.
 Prägen Sie sich außerdem gut ein: Wo ist
der nächste Feuerlöscher
die nächste Löschdecke
die nächste Augendusche
eine Notbrause erreichbar und
welche Fluchtwege gibt es im Labor.
 Es wird davon ausgegangen, dass jeder Praktikant von der Laborordnung Kenntnis genommen
hat (hängt in jedem Labor aus!).
 Im Labor ist stets eine Schutzbrille mit Seiten- und Stirnblende zu tragen. Dies gilt vor allem bei
Arbeiten mit Laugen (organischen Aminen) und konzentrierten Säuren sowie bei Arbeiten unter
Vakuum und Druck.
 Brennbare Lösungsmittel nicht bei offener Flamme handhaben. Bei Arbeiten mit Ether ist
höchste Vorsicht geboten. Keine Flamme im Umkreis von einigen Metern. Etherdämpfe sind
schwerer als Luft und kriechen auf der Tischplatte entlang. Am besten bei laufender Lüftung im
Abzug arbeiten. Ether stets im Dunkeln aufbewahren!
 Beim Ausschütteln mit niedrig siedenden Lösungsmitteln Scheidetrichter nach jedem Schütteln
belüften. Bei Bedarf vom Assistenten zeigen lassen.
 Zur Füllung von Ölbädern ist Siliconöl zu verwenden. Bei Arbeiten mit ihnen ist stets ein
Thermometer zur Kontrolle der Badtemperatur anzubringen. Vorsicht beim Wechsel vom
Wasser– zum Ölbad: Kolben sorgfältig trocknen. Wasser im Ölbad sinkt zu Boden und spritzt
bei Temperaturen über 100 °C.
 Ölbäder, die über 190-200 °C betrieben werden müssen, sollten wegen der damit verbundenen
Qualmentwicklung im Abzug benutzt werden. Auf ihre erhöhte Zündfähigkeit wird besonders
verwiesen.
 Als Kühlerschläuche nur fest sitzende, nicht poröse Gummischläuche verwenden.
 Bei Destillationen sind sämtliche Teile vorher auf evtl. vorhandene Schäden, insbesondere
Sprünge an den Kolben (Sternsprünge), zu untersuchen. Die aufgebaute Apparatur muss vor
Inbetriebnahme vom Assistenten abgenommen werden! Zur Destillation wird die Temperatur
langsam gesteigert. Vorsicht vor Siedeverzügen! Abhilfe durch Verwendung von
Siedesteinchen.
 Versuchsaufbauten, die über Nacht oder länger stehen bleiben müssen, sind deutlich mit Namen,
Inhaltsangabe und Datum zu kennzeichnen.
 Ätzende oder toxische Lösungen niemals mit dem Mund pipettieren, sondern Pipettierball
(Peleus), Pasteur– oder Fortuna–Pipette verwenden.
 Spritzflaschen mit Lösungsmitteln sind deutlich zu kennzeichnen. Unetikettierte Flaschen und
Büchsen werden konfisziert.
 Informieren Sie sich über die Regeln zur Abgabe von Lösungsmitteln und festen Reagenzien.
 Etikettieren Sie Ihren Arbeitsplatz mit einem Namensschild (Name, Vorname).
 Im Praktikumssaal ist kein Platz für Straßenkleidung.

Beschreibung der Geräte: Siehe Anhang


3

1.2 Protokollführung, persönliche Arbeitsmittel


 Während des Praktikums ist ein Laborjournal zu führen, in dem jeder Versuch aufzuzeichnen
ist. Insbesondere sind zu formulieren:
 Ergebnisberechnung aus den von Ihnen erarbeiteten Messdaten
 Reaktionsgleichungen mit Bezeichnung des Reaktionsmechanismus. Dazu, wenn nötig nicht nur
Summenformel, sondern Strukturformel und Reaktionsschritte (Elektronenverschiebung, Proto-
nierung, Abspaltung u.a.) angeben.
 Mögliche Nebenreaktionen und wodurch sie gefördert bzw. zurückgedrängt werden können.
 Besondere Vorkommnisse während der Versuchsdurchführung, z.B. Auftreten von Verfärbun-
gen, Niederschlägen, usw.
 Verwendete Chemikalien mit Angabe der eingesetzten Mengen (Angabe in Gramm und Mol).
Angabe der Molmassen und anderer physikalischer Konstanten (Schmelz– und/oder Siedepunkt,
Dichte, Brechungsindex) der Reaktanden bzw. der Produkte in Form einer tabellarischen Über-
sicht. Hierzu gehören auch die Ziffern der R– und S–Sätze aller Reaktionspartner. Diese Tabelle
ist vor Beginn des Versuches anzulegen!

Außerdem benötigen Sie:

 Taschenrechner
 Millimeterpapier (DIN A4)
 Lineal und Zeichendreieck
 Filzstift (wasserfest)
 Schere
 Klebeetiketten
 Schutzhandschuhe (Handwerkerhandschuhe)
 Labormantel
 Schutzbrille
4

2 Reinigung organischer Verbindungen


Chemische Verbindungen sind für bestimmte Anwendungen (z.B. zur Verabreichung als Arznei-
mittel) oft nicht sauber genug. Sie sind häufig – bedingt durch den chemischen Produktionsprozess
oder die Isolierung aus natürlichen Vorkommen – mit mehr oder weniger großem Anteil an Fremd-
substanzen verunreinigt. Je nachdem für welche Zwecke chemische Verbindungen eingesetzt
werden, sind die Ansprüche an deren Reinheit unterschiedlich. Man unterscheidet grob nach
folgenden Reinheitsgraden:

 technische Qualität (mittlere Reinheit)


 Lebensmittelqualität (hohe Reinheit)
 Analysenqualität (höchste Reinheit; p.a. pro analysi)

Zur Reinigung von chemischen Verbindungen nutzt man häufig die unterschiedlichen
physikalischen Eigenschaften der zu reinigenden Verbindungen und der Verunreinigungen aus, z.B.:

 Löslichkeit
 Siedepunkt/Schmelzpunkt
 Verteilungsgrad in unterschiedlichen Lösungsmitteln

Die meistangewendeten Methoden zur Reinigung sind Umkristallisieren (von Feststoffen), Destilla-
tion (von Flüssigkeiten) und die Extraktion.

2.1 Umkristallisieren
Beim Umkristallisieren nutzt man die Tatsache aus, dass Verunreinigungen bedingt durch ihren
mengenmäßig kleinen Anteil (<5–10 %) besser in bestimmten Lösungsmitteln löslich sind als die
eigentliche Substanz (> 90 %). Für das vollständige Auflösen der Substanz ist daher eine relativ
große Lösungsmittelmenge notwendig. Durch Wärmezufuhr wird die Löslichkeit der Substanz
beträchtlich erhöht, wodurch die notwendige Lösungsmittelmenge erheblich reduziert wird.

Der Vorgang des Umkristallisierens wird nun genauer beschrieben:


Man gibt zur Substanz, die man umkristallisieren möchte, eine bestimmte Menge eines
Lösungsmittels und erwärmt bis zum Siedepunkt des Lösungsmittels (das ist die höchste,
erreichbare Temperatur unter Normalbedingungen). Die Menge des Lösungsmittels soll so gewählt
werden, dass sich die Substanz in der Siedehitze noch nicht vollständig lösen kann. Anschließend
gibt man in kleinen Portionen solange von dem Lösungsmittel zu, bis sich die Substanz gerade
gelöst hat. Auf diese Weise hat man eine gesättigte Lösung der Substanz hergestellt, die man nun
abkühlen lässt. (Die geeignete Wahl des Lösungsmittels und dessen Menge kann zwar aus
Löslichkeitstabellen ermittelt werden, es gehört allerdings eine gewisse Portion an Erfahrung dazu,
um diesen Vorgang optimal zu gestalten.)
Beim Abkühlen sinkt die Löslichkeit der Substanz und sie kristallisiert langsam aus. Die Kristalle
sinken zu Boden und das über den Kristallen stehende Lösungsmittel enthält jetzt die gelösten Ver-
unreinigungen, sowie geringe Menge der eigentlichen Substanz. Die Kristalle können dann
abfiltriert und getrocknet werden, und die Substanz besitzt jetzt eine höhere Reinheit als vorher.
5

 Versuch: Umkristallisieren von Benzoesäure (1. Kurstag)


(a) Eine (in einem 50 mL Erlenmeyerkolben) abgewogene Menge an Benzoesäure (ca. 0,5 g) wird
mit 5 mL H2O versetzt und auf der Heizplatte zum Sieden erhitzt. Achten Sie darauf, dass die
Heizplatte nicht zu hoch eingestellt wird. Meist reicht die Einstellung auf Stufe 2, um 100 °C zu
erreichen. Langsam weiteres Wasser in ca. 1 mL Portionen (über 10 mL Messzylinder) zugeben
und weiter erhitzen, bis alles gelöst ist. Das Volumen des zugegebenen Wassers protokollieren.
Abkühlen lassen. Auf dem Hirschtrichter mit passendem (!) Rundfilter (nicht Faltenfilter) und
Saugfinger wird die ausgefallene Benzoesäure abfiltriert, die Substanz in ein kleines Becherglas
(vorher Tara bestimmen) überführt (d.h. vom Rundfilter und Nutsche mit Spatel gesammelt),
getrocknet (Trockenschrank benützen) und zurückgewogen (Ausbeute in % bestimmen).
(b) Ca. 0,5 g mit etwas Farbstoff verunreinigte Benzoesäure (ein Körnchen oder einige Tropfen
Methylorange) wird mit Zusatz einer gehäuften Spatelspitze feinpulvriger Aktivkohle
umkristallisiert. Dazu benützen Sie das im Versuch (a) bestimmte Volumen. Noch heiß schnell
durch einen (mit heißem Wasser oder im Trockenschrank vorerhitzten) Faltenfilter filtrieren.
Zur Auskristallisation Filtrat gut abkühlen lassen. Weiter wie bei a). Der Rückstand wird nach
dem Trocken zurückgewogen. Bestimmen Sie den Schmelzpunkt wie weiter unten beschrieben.
(c) Ermitteln Sie den Schmelzpunkt von Harnstoff (133 °C) und Zimtsäure (133 °C). Stellen Sie
danach eine homogene Mischung (im Verhältnis 1:1) aus den beiden Substanzen her und
ermitteln Sie deren Schmelzpunkt. Erläutern Sie Ihre Beobachtungen.

Ein Kriterium für die Reinheit einer (festen) Substanz ist deren Schmelzpunkt. Reine Substanzen
besitzen einen definierten Schmelzpunkt (±1 C). Ist eine Substanz erheblich verunreinigt, sinkt ihr
Schmelzpunkt (Schmelzpunkterniedrigung) und der Schmelzbereich nimmt zu (±10–20 C).

2.2 Extraktion
Bei der Extraktion nutzt man die unterschiedliche Löslichkeit von Verbindungen in
unterschiedlichen Lösungsmitteln aus. Beispielsweise ist die Löslichkeit von Fett in Wasser gering,
in Chloroform allerdings hoch. Im Gegensatz dazu lösen sich die (polaren) Zucker in Chloroform
praktisch nicht, in Wasser jedoch sehr gut.
Für die Extraktion verwendet man ein Lösungsmittelsystem aus zwei unterschiedlich polaren, nicht
mischbaren Lösungsmitteln (z.B. Wasser/Chloroform). Eine Substanz wird sich nun je nach Präfe-
renz in einem Lösungsmittel (= Phase) besser lösen als im anderen. Das Konzentrationsverhältnis
der Substanz in den zwei Phasen ist durch den Nernst’schen Verteilungskoeffizienten (K =
konstant) vorgegeben. Unterschiedliche Substanzen haben unterschiedliche Verteilungskoeffi-
zienten und deshalb reichern sie sich in der einen oder anderen Phase an. Das ist das Trennprinzip
der Extraktion.

 Versuch: Trennung von Naphthalin und Benzoesäure durch Extraktion (1. Kurstag)
Ca. 0,5 g des 1:1 Gemischs (Naphthalin:Benzoesäure) werden genau abgewogen und in einen 25
mL Schütteltrichter überführt und in ca. 5 mL Ether gelöst. Die Etherlösung wird mit ca. 5 mL 0,5
M NaOH ausgeschüttelt.
Vorsicht: Hierzu vorsichtig die Mischung im Schütteltrichter schütteln (dazu oben mit
Plastikstopfen verschließen. Stopfen mit Hand andrücken, umschwenken, sodass Flüssigkeit auf der
Stopfenseite ist und das Ventil frei ist, Ventil zum Belüften öffnen und wieder schließen. Das
Procedere mehrmals wiederholen). Schütteltrichter wieder in Stativ befestigen, Deckel runter.
Untere Phase (Natronlauge) in ein Becherglas ablassen. Auslass mit Wischtuch trocknen und
Etherphase auf ein (vorher ausgewogenes) Uhrglas langsam tropfen lassen.
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Im Ether bleibt Naphthalin zurück, das nach Verdampfen des Ethers bei Raumtemperatur (Uhrglas
dabei in Abzug stellen) auskristallisiert. Das mit Naphthalin gefüllte Uhrglas wird gewogen und die
Masse an Naphthalin protokolliert.
Bei Ansäuern des alkalischen Extraktes mit wenig halbkonzentrierter Salzsäure (~ 5 N) fällt
Benzoesäure aus (warum?) Kontrollieren Sie den pH Wert nach dem Ansäuern. Benzoesäure wird
dann wie oben beschrieben mittels Hirschtrichter abfiltriert, mit wenig (!!) kaltem Wasser neutral
gewaschen, im Trockenschrank bei ca. 80 °C getrocknet. Wiegen Sie anschließend beide
Substanzen zurück.
Bei Extraktionen sollten stets die einzelnen Phasen durch Zusatz des gleichen Lösungsmittels
identifiziert werden, da durch die gelösten Stoffe eine Umkehrung der Dichteverhältnisse auftreten
kann.

Welche Voraussetzungen muss ein gutes Extraktionsmittel erfüllen? Welche organischen


Stoffklassen erwarten Sie in der sauren, basischen und Neutralfraktion eines Zellhomogenates?
Geben Sie je ein Beispiel mit Strukturformeln an.

2.3 Destillation
Reine Substanzen besitzen einen definierten Siedepunkt. Das ist die Temperatur bei der die
Moleküle der (flüssigen) Substanz in die Gasphase übertreten können. Kühlt man diese Gasphase
ab, so kondensiert die Substanz wieder. Der Siedepunkt ist druckabhängig. Bei hohem Druck ist der
Siedepunkt höher (z.B. Schnellkochtopf: Siedepunkt von Wasser  120 °C) und bei niedrigem
Druck ist der Siedepunkt geringer (z.B. auf dem Mount Everest: Siedepunkt von Wasser  70 °C).
Bei der Angabe des Siedepunktes muss daher immer auch der Druck angegeben werden.
Die Abhängigkeit des Siedepunktes vom (Dampf–)druck wird durch die Clausius–Clapeyron–
Gleichung beschrieben:
  ΔH vap,m  1 1  
 
    


R  T2 T1  

p  p e Gleichung 2-1
2 1

wobei
p1  Dampfdruck bei der Temperatur T1
-1
H vap,m  molare Verdampfun gsenthalpie (J Mol )
–1 –1
R  allgemeine Gaskonstan te ( 8,314 JMol K )

Mit Hilfe dieser Gleichung kann man den Siedepunkt einer Flüssigkeit bei einem bestimmten Druck
(z.B. bei 20 hPa) errechnen, wenn der Siedepunkt dieser Flüssigkeit z.B. bei Atmosphärendruck
(1013 hPa) und die Verdampfungsenthalpie bekannt sind.

Ist eine Substanz verunreinigt, kommt es ähnlich wie bei der Schmelzpunkterniedrigung hier zu
einer Siedepunkterhöhung.
Zwei Substanzen mit einem Unterschied von > 60 °C in ihren Siedepunkten können durch
Destillation einfach von einander getrennt werden. Liegen die Siedepunkt näher beieinander, so
gelingt die Destillation nicht so gut. Man findet im Kondensat der einen Substanz immer auch einen
gewissen Anteil der zweiten Substanz.
Um solche Verbindungen voneinander destillativ zu trennen, bedient man sich einer sogenannten
Kolonne (z.B.: Füllkörperkolonne, Vigreux–Kolonne). Das sind Glasrohre mit Schikanen oder
gefüllt mit Glasringen oder anderem Material, durch welche die in die Gasphase übergetretene
Substanz streicht. Da die Kolonne nicht erhitzt wird, kondensiert die Substanz zum Teil wieder und
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läuft zurück. Ein geringer Teil der Substanz erreicht aber das Kolonnenende noch in der Gasphase
und ist damit von dem Rest getrennt. Mit dieser Methode können Substanzen mit nahe beieinander
liegenden Siedepunkten getrennt werden. Je länger eine Kolonne ist, desto besser gelingt die
Trennung. (Kolonnen, die in der chemischen Industrie eingesetzt werden sind z. T. über 50 m hoch).

Anleitung zur Destillation


Zuerst baut man die Destillationsapparatur wie in Abbildung 1 oder Abbildung 2 auf. Stellen Sie
unter das Heizbad eine Hebebühne. Für den kommenden Versuch wird allerdings die
Wechselvorlage gegen einen Messzylinder ausgetauscht. Die Kühlschläuche werden am Kühler
montiert und einer dieser Schläuche mit der Wasserleitung verbunden (welcher?). Die Apparatur
wird mit Hilfe von Klammern am Stativ befestigt. Am besten bringt man eine Klammer am Schliff
des Sumpfkolbens an, die man relativ fest zieht (nicht zu fest) und eine zweite Klammer unter dem
Kühler, die aber nur leicht angezogen ist. Man füllt nun die zu destillierende Flüssigkeit (1:1
Gemisch von Methanol und entionisiertes Wasser) in den Sumpfkolben (maximal halbvoll!) und
fügt den Magnetfisch hinzu, der durch Rühren einen Siedeverzug verhindert. Jetzt wird das
Kühlwasser langsam aufgedreht und so stark eingestellt, dass ein mäßiger Wasserstrom durch den
Kühler läuft. Die Vigreux-Kolonne und der Kopf der Destillationsbrücke sollte mit Alufolie
umwickelt werden, um Wärmeverluste zu vermeiden. Man taucht nun den Kolben in das Heizbad
(Ölbad) (mit Hilfe der Hebebühne) und heizt langsam das Heizbad auf (Plattentemperatur auf ca.
180 °C einstellen). Die Badtemperatur sollte ca. 30–40 °C über der Siedetemperatur liegen. Bei
konstant gehaltener Heizbadtemperatur destilliert man nun die Substanz. Die Destillation bitte nie
bis zur Trockene durchführen! Bei der fraktionierten Destillation wird die Temperatur des
Heizbades dann wieder gesteigert (Plattentemperatur: ca. 250°C), wenn die erste Komponente
abdestilliert ist. Am Ende der Destillation wird das Heizbad entfernt und die Heizquelle
ausgeschaltet. Abkühlen lassen.

Allgemeine Vorsichtsmaßnahmen
Destillationen werden grundsätzlich nicht bis zur Trockene durchgeführt, wegen der Gefahr von
Überhitzung und Verätzung des Kolbens, Ansammlung explosiver Rückstände (z.B. Peroxide bei
Ethern) u.a.
Heizbäder müssen immer mit einem Kontrollthermometer überwacht werden. Ölbäder können
wegen Qualmens nur bis ca. 180 °C benutzt werden. Über 200 °C sind Ölbäder zündfähig. Heiße
Ölbäder dürfen nie mit Wasser in Berührung kommen (explosionsartiges Verdampfen des
Wassers!)!
8
Fraktionierte Destillationsapparatur

Destillations-
Einfache Destillationsapparatur thermometer

Destillationsbrücke

Vorstoß

Destillations-
thermometer Wechselvorlage

Destillat
Destillationsbrücke
Kolonne
Vorstoß

Wechselvorlage
Sumpfkolben Sumpfkolben mit
Siedeperlen
Destillat

Heizbad mit Thermometer Heizbad mit Thermometer

Abbildung 1: einfache Destillation Abbildung 2: fraktionierte Destillation


9

Versuch: Destillation eines Methanol–/Wassergemisches mit und ohne Kolonne (2.


Kurstag)
Jeweils zwei Gruppen nehmen gemeinsam

(a) eine einfache (d.h. ohne Kolonne) und


(b) eine fraktionierte Destillation

eines 1:1 Gemisches Wasser/Methanol vor. (Für eine NS1 14.5 Apparatur, 50 ml Kolben werden 20
ml Gemisch benötigt, 10 ml Methanol und 10 ml entionisiertes Wasser; Destillation aus Ölbad, in
beiden Fällen Temperatur langsam und gleichmäßig steigern.)

Zur besseren Isolierung umwickeln Sie die oberen Teile der Destillationsapparatur (Kopf bis
Kühlung) mit einer Alufolie.

(a) Das Destillat wird in Fraktionen von 1 ml mit einem Messzylinder (ersetzt die Wechselvorlage)
aufgefangen und gleichzeitig die Übergangstemperatur notiert. Die Resultate werden in einem
Volumen-/Temperaturdiagramm (Siedekurve) aufgezeichnet. X-Achse: Volumen; Y-Achse:
Siedetemperatur
(b) Für die fraktionierte Destillation wird eine ca. 20 cm lange Füllkörper– oder Vigreux–Kolonne
verwendet und ebenso wie oben verfahren. Hierbei vorsichtig erhitzen, damit die Kolonne nicht
"absäuft". Wechselvorlage wie bei (a) durch Messzylinder ersetzen.

Diskutieren Sie die beiden Diagramme.

BITTE TESTAT EINHOLEN

1
NS ist die Abkürzung für Normschliff
10

3. Chromatographie

Unter Chromatographie versteht man die Trennung von Substanzgemischen aufgrund der
Verteilung zwischen zwei Phasen. Gemeinsames Merkmal der vielen unterschiedlichen Verfahren
in der Chromatographie ist das Vorbeiströmen einer beweglichen (mobilen) Phase an einer
unbeweglichen (stationären) Phase (Nernst’sche Verteilung).
Die mobile Phase ist flüssig (Flüssigchromatographie, LC) oder gasförmig (Gaschromatographie,
GC). Die stationäre Phase ist fest (Adsorptionschromatographie) oder flüssig (Verteilungschromato-
graphie). Jeder mit der mobilen Phase mitgeführte Stoff besitzt einen charakteristischen
Verteilungs- und/oder Adsorptionskoeffizienten. Daraus resultiert für jeden Stoff eine individuelle
Wanderungsgeschwindigkeit. Je fester ein Stoff an die stationäre Phase bindet, desto langsamer
wandert er.

Insbesondere die Flüssigchromatographie bedient sich einer Vielzahl unterschiedlicher stationärer


Phasen:

Stationäre Phase Beispiel Chromatographie–Typ


polar SiO2, Al2O3 Adsorption
unpolar kovalent gebundene Paraffinschicht auf Verteilung
z.B. SiO2, sog. reverse Phasen
ionisch sulfoniertes aromatisches Polymer Ionenaustausch
definiert porös synthetische, poröse Gele Ausschluß
(biologische) Rezeptoren Serum–Albumin auf z.B. SiO2 Affinität

In diesem Praktikum werden Sie zwei Beispiele für die Anwendung der Adsorptionschroma-
tographie kennen lernen. Je nach der geometrischen Anordnung der stationären Phasen
unterscheidet man:

1) Papierchromatographie: stationäre Phase ist Cellulose oder deren Derivate


2) Dünnschichtchromatographie: die stationäre Phase ist als Pulver auf einer inerten Trägerplatte
aufgebracht
3) Säulenchromatographie: stationäre Phase wird in einer Säule von der mobilen Phase
(Flüssigkeit: Liquid chromatography = LC; Gas: Gas chromatography = GC) durchströmt.

3.1 Adsorptionschromatographie (Dünnschicht)

Eine wichtige analytische Methode zur Substanztrennung ist die Dünnschichtchromatographie. Sie
ist einfach zu handhaben, hochempfindlich und arbeitet sehr schnell. Es wird aufsteigend, d.h.
gegen die Schwerkraft chromatographiert.
Die stationäre Phase wird hier von einer dünnen Schicht eines Trägermaterials (z.B. Kieselgel
(polar), Cellulose (gering polar)) dargestellt, wobei sowohl die H2O–Moleküle, die diese Schicht
gebunden enthält, als auch das feste Material selbst als Verteilungs– bzw. Adsorptionspartner der
11

Substanzen in Frage kommen.


Als mobile Phase fungiert in der Regel eine Mischung verschiedener Flüssigkeiten (selten reine
Flüssigkeiten oder Lösungen), welche durch Kapillarwirkung an der Dünnschichtplatte hochläuft.
Das spezifische Wanderungsverhalten einer Substanz lässt sich durch den sogenannten Rf–Wert aus-
drücken:

Entfernung (Startpunkt – Fleckmittelpunkt)


Rf  Gleichung 2-2
Entfernung (Startpunkt – Lösungsmittelfront)

Die Rf–Werte liegen also zwischen Null und Eins und sind für schnell wandernde Stoffe größer als
für langsam wandernde.

Aufgrund der sehr leichten Anwendbarkeit der DC-Methode wird diese auch heute noch weit
verbreitet zur Routineanalytik eingesetzt. Beispiele sind die Analytik von Aminosäuren oder
ätherischen Ölen in der pharmazeutischen Chemie (zahlreiche DC-Verfahren im DAB zur
Bestimmung von Drogen) und in der Lebensmittelbranche. Als Beispiel sehen Sie unten eine DC-
Trennung von verschieden ätherischen Ölen.

Im Praktikum werden Sie Analysen von Aminosäuren, Farbstoffen (Tinte) und ätherischen Ölen
mittels DC durchführen. Wiederholen Sie vor dem Versuch die Grundlagen/Anwendungen von
Aminosäuren und ätherischen Ölen.

DC von ätherischen Ölen. Platte: Kieselgel. Laufmittel: Toluol – Essigester (93:7 v/v), Anfärbung
mit schwefelsaurem Vanillin. Von links nach rechts Öle aus: Bergamot, Zedern, Eukalyptus,
Myrthe, Teebaum, Lavendel, Minze, Orange, Pinie, Fichte.
B1 und L1 – Linalool, B2 and L2 - Linaloylacetat, E1 – Cineol=Eucalyptol, G1 - Eugenol, G2 -
Caryophyllen. C1 – Cedrol?, M3 – Menthol?, P1 – Limonen?
12

 Versuch: Trennung von Aminosäuren

Herstellung des Fließmittels


Zuerst wird das Fließmittel angesetzt: 70 ml iso-Propanol + 30 ml entionisiertes Wasser. Das
Gemisch wird in eine Glaskammer gegeben (Füllhöhe ca. 0,5 cm) und darin vermischt, indem bei
geschlossenem Deckel umgeschwenkt wird (DC–Kammer ist mit Fließmittel dampfgesättigt).
Jeweils zwei oder drei Gruppen benutzen zusammen eine DC–Kammer, so dass in jeder Kammer
zwei oder drei Platten gleichzeitig entwickelt werden.

Auftragung auf der DC–Platte (Kieselgel)


Markieren Sie vor dem Auftragen die Auftragspunkte auf der DC–Platte (Kieselgel 60 F254, 0,2 mm
Schicht auf Alufolie, Originalplatte 20  20 cm vierteln) ganz leicht mit einem Bleistift. Die Punkte
sollen in gleichmäßigen Abständen auf der ganzen Breite aufgetragen werden. Sie sollen von der
Unterkante der Platte einen Abstand von etwa 2 cm haben; die äußeren Punkte rechts und links
einen ebenso großen Randabstand.

Die Auftragung erfolgt mit einer Kapillare (z.B. beidseitig offenes Schmelzpunkt–Röhrchen). Die
Kapillare ist vorsichtig auf die Kieselgel–Schicht aufzusetzen und nicht in die Schicht
einzudrücken. Dabei läuft die zuvor in die Kapillare aufgezogene Flüssigkeit aus. Der entstehende
Fleck soll einen geringeren Durchmesser als 2 mm aufweisen (für jede Lösung eine eigene
Kapillare). Tragen Sie Proben der sechs Referenzsubstanzen und Ihre Analysenprobe entsprechend
der Abbildung 3 auf. Die Analysenprobe enthält eine unbekannte Mischung aus diesen
Referenzsubstanzen. Nach dem Auftragen wird die Platte in etwa 3–4 Minuten durch Schwenken in
der Luft oder mit Hilfe eines Föns gut getrocknet.

Startlinie
Valin

Histidin

Leucin

Prolin

Serin

Alanin

Analysenprobe

Abbildung 3: Auftrag der Probe auf die DC–Platte Abbildung 4: Entwicklung der DC–Platte

Entwicklung der DC-Platte


Die Platten werden zur gleichen Zeit in die Kammer wie in Abbildung 4 eingesetzt und ca. 1,5
Stunden entwickelt. Dann werden die 3 Platten gleichzeitig entnommen, die Lösungsmittelfront
markiert und im Abzug mit Hilfe eines Föns getrocknet.
13

O
COOH
HO
H2N C H Ninhydrin
HO
R
O

– CO2 2 [H]

HN H O
C
Schiff'sche Base H
R
H2O HO

O
H NH3
C

O R HO

HO reduziertes
HO
HO Ninhydrin
O O
– 3 H2O
+
–H

O O–

O O

violetter Farbstoff

Abbildung 5: Farbreaktion von Ninhydrin mit Aminosäuren

Nachweis der Aminosäuren


Die Platte wird mit wenig Ninhydrinlösung (0,3 %ig in n-Butanol) mit einem Sprayer gleichmäßig
besprüht (Besprühen nur im Abzug! Handschuhe tragen!) und einige Minuten im
Trockenschrank auf 110 °C erhitzt. Dabei läuft wahrscheinlich die in Abbildung 5 dargestellte
Reaktion ab.

Hinweis: Dieses Reaktionsschema gilt nicht für Prolin (warum?).

Die DC–Platte muss beim Testat vorgelegt werden. Berechnen Sie die Rf–Werte aller Aminosäuren
und ermitteln Sie die Aminosäuren in Ihrer Analysenprobe.

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 Versuch: Chromatographie einer Tinte


Die Herstellung des Fließmittels erfolgt wie im Versuch „Trennung von Aminosäuren“.
Die DC–Platten (Kieselgel) werden nochmals geteilt, so dass Sie eine Platte der Größe von ca. 5 
10 cm besitzen. Auf der schmalen Seite markieren Sie mit Abstand von der Unterkante die
Auftragungslinie mit Bleistift. Nun tragen Sie verschiedenfarbige Tinten auf, indem Sie mit
entsprechenden Filzstiften Punkte auf die Auftragungslinie tupfen.
14

Füllen Sie die DC–Kammer mit dem Laufmittel (ca. 0,5 cm hoch), stellen Sie dann die Platte in die
DC–Kammer und entwickeln Sie die Platte so lange, bis die Laufmittelfront ca. 1 cm von der
Oberkante entfernt ist. Markieren Sie anschließend die Laufmittelfront, und notieren Sie Farbe und
Rf–Werte aller sichtbaren Komponenten.

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 Versuch: Chromatographie einer Mischung von etherischen Ölen mittels DC und


GC/MS

Sie erhalten die Lösungen von etherischen Ölen (z.B. Limette, Minze, Pfefferminzöl, Spearmint,
Eukalyptusöl) und die Lösung eines chemischen Reinstoffs (Eukalyptol), sowie als Lösungsmittel
Toluol.
Stellen sie zuerst wieder das Fließmittel her (falls keine eigenen Kammern für dieses Laufmittel
bereitgestellt werden: Fließmittel vom Versuch mit den Aminosäuren aus den Kammern
VORSICHTIG (die Dinger sind schwer! auch die Deckel sicher ablegen) in Abfallkanister für nicht
halogenhaltige, organische Lösungsmittel entsorgen, mit etwas Ethylacetat nachschwenken)

Im Abzug arbeiten (Toluol ist giftig!)

Zusammensetzung des Fließmittels: (VT = Volumenteil)


Ethylacetat : Toluol = 5 VT : 95 VT,
bei 100mL Fließmittel also 5 mL Ethylacetat + 95 mL Toluol, Füllhöhe in der Entwicklungskammer
etwa 0.5 cm.

Befeuchten sie die Wände der Entwicklungskammer durch vorsichtiges Schwenken und setzen sie
die Glasabdeckung auf die Kammer, damit sich ein gleichmäßiger Dampfdruck einstellen kann.
Kammer im Abzug stehen lassen.
Fertigen sie sich eine DC-Platte mit den ungefähren Maßen Länge = 11 cm, Breite = 6 cm an,
markieren sie die Auftragspunkte (Abstand von der Unterkante 2 cm, Abstand von den Seitenkanten
1 cm) und machen sie die DC-Platte ihrer Arbeitsgruppe kenntlich (an der oberen Kante), damit sie
sie in der Entwicklungskammer identifizieren können.
Tüpfeln sie dann pro Probe mit einer Auftragskapillare auf die markierten Punkte, trocknen sie die
Auftragspunkte kurz mit dem Fön, und stellen sie die DC-Platte in die Entwicklungskammer
(Pinzette benutzen, DC-Platte am obersten Rand greifen), Abdeckung nicht vergessen.
Vorsicht: die Entwicklung verläuft rasch, ca. 10 Min. nach dem Einbringen in die
Entwicklungskammer steht die Laufmittelfront am oberen Ende der DC-Platte. Wenn die
Laufmittelfront noch ca. 0.5 cm vom oberen Ende der Platte entfernt ist, Platte rausnehmen
(Pinzette, nicht das Laufmittel inhalieren, Toluol!!), die Laufmittelfront mit einem Bleistift leicht
nachziehen, und mit dem Fön im Abzug trocknen. So fönen, dass die Luft in den Abzug geht
(Toluol!!).
Anschließend die Platte in einem Karton (liegt im Abzug bereit) im Abzug mit dem Anisaldehyd-
Reagens gleichmäßig einsprühen. Handschuhe!

Anisaldehyd = 4-Methoxy-benzaldehyd

Zusammensetzung des Anisaldehyd-Reagens:


15

- 0,5 mL Anisaldehyd
- 10,0 mL Eisessig (konzentrierte Essigsäure)
- 85 mL Methanol
- 5 mL H2SO4conc.

Danach die Platte mit einem Fön trocknen und im Trockenschrank auf 100 - 120 oC erhitzen. Nach
5 – 10 Minuten tauchen verschieden gefärbte Banden auf.
Analysieren Sie, ob in den ätherischen Ölen Eukalyptol=Cineol (Struktur nachschauen) vorkommt.
Dokumentieren Sie die Ergebnisse (zeichnen oder per Photo-Handy). Vergleichen Sie Ihre
Ergebnisse mit der oben gezeigten Abbildung und versuchen Sie anhand der Angaben weitere
Komponenten zu identifizieren.
Zur Validierung Ihrer Ergebnisse erhalten Sie Ausdrücke von GC/MS Spektren (Theorie von
GC/MS siehe Versuch 10) der entsprechenden Mischungen, sowie von einer Referenzprobe für
Eucalyptol. Diskutieren Sie im Protokoll die Befunde im Vergleich, sowie die Stärken/Schwächen
der unterschiedlichen Methoden.

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3.2 Adsorptionschromatographie (Säulentrennung)

Eine Methode zur Substanztrennung im analytischen wie auch im präparativen Maßstab stellt die
Säulenchromatographie dar. Sie kann absteigend (mit der Schwerkraft) oder schneller mit Hilfe
einer Pumpe betrieben werden. Bei der absteigenden Methode sickert die mobile flüssige Phase
durch eine locker in die Säule eingefüllte fest Phase (die wiederum Flüssigphasen–Anteile in Form
von adsorbierten H2O–Molekülen enthalten kann).

 Versuch: Trennung eines Farbstoffgemisches


Sie erhalten eine Lösung der Farbstoffe Methylenblau (I) und Fluorescein (Dikaliumsalz) (II) unbe-
kannten Gehalts. Trennen Sie die beiden Farbstoffe mittels Säulenchromatographie und bestimmen
Sie den Gehalt der jeweiligen Komponenten in der Mischung.
16

KO O O

O
N
C
H3C CH3 OK
N S+ N
Cl – x 3 H2O
CH3 CH3

(I) MW = 373,9 (II) MW = 408,5

Abbildung 6: Chemische Struktur von Methylenblau (I) und Fluorescein (II).

Als Säule verwenden Sie eine 10 ml (Mess–)pipette o.ä., die am Ende mit Watte abgedichtet ist. Sie
erhalten bereits gefüllte Säulen. Das Füllmaterial ist basisches Al2O3. Lassen Sie die Flüssigkeit bis
knapp zum Trägermaterial ablaufen (nicht trockenlaufen lassen!). Tragen Sie dann mit einer
Pasteurpipette die gesamte Farbstoffmischung vollständig auf die Säule auf. Spülen Sie so lange Ihr
Analysengefäß (Cap) mit sehr wenig Ethanol nach, bis das Farbstoffgemisch vollständig
aufgetragen ist. Lassen Sie die Farbstofflösung vollständig in die Säule einsickern, aber nicht
trockenlaufen lassen. Anschließend geben Sie noch ca. 1 ml Ethanol zu, indem Sie den Alkohol die
Säulenwand herunter laufen lassen. Lassen Sie erneut einsickern und füllen Sie die Säule dann ganz
mit Ethanol. Eluieren Sie den apolareren Farbstoff unter Verwendung von Ethanol als mobile
Phase. Sammeln Sie das Eluat so lange in einem 100 ml Messkolben, bis der Farbstoff vollständig
von der Säule eluiert ist.
Zur Elution des polareren Farbstoffes verwenden Sie 0,1 N NaOH als mobile Phase. Wenn das
Ethanol der vorherigen Elution eingesickert ist, geben Sie vorsichtig 3 mal ca. 1 ml 0,1 N NaOH zu,
indem Sie die Lauge an der Säulenwand herunter laufen lassen. Füllen Sie nun die ganze Säule mit
0,1 N NaOH. Eluieren Sie so lange, bis das Eluat farblos ist. Fangen Sie das Eluat in einem zweiten
100 ml Meßkolben auf. Füllen Sie die beiden Kolben bis zur Marke auf (Methylenblau mit Ethanol,
Fluorescein mit 0,1 N NaOH) und messen Sie die Extinktion bei 655 nm (Methylenblau) und bei
490 nm (Fluorescein). Kalibrieren Sie bitte am Photometer jeweils vorher die Basislinie, indem Sie
eine Küvette, gefüllt mit dem entsprechenden reinen Eluens (Ethanol bzw. 0,1 N NaOH) (ca. ¾
voll; achten Sie darauf, dass die klare Seiten der Küvette im Lichtgang stehen) einstellen (Anhang
Photometrie S.56). Bestimmen Sie die Konzentration (Mol/l) der beiden Farbstoffe über das
Lambert–Beer'sche Gesetz und die jeweilige Farbstoffmenge in mg.

Methylenblau: 655nm = 8,91  104 l mol-1 cm-1 in Ethanol


Fluorescein: 490nm = 6,96  104 l mol-1 cm-1 in 0,1 N NaOH

Erklären Sie die Reihenfolge der Elution. Hilfe: Basisches Al2O3 ist ein polares Adsorbens und
regiert mit Phenolen und Säuren unter Ausbildung von Anionen.

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17

3.3 HPLC

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl. high performance liquid chromatography,


HPLC) –auch Hochdruckflüssigchromatographie (engl. high pressure liquid chromatography)
genannt – ist eine der wichtigsten analytischen Methoden in der Chemie. Praktisch in allen
Laboratorien, Untersuchungsämtern, Kliniken und chemischen Firmen wird diese Methode zur
qualitativen und quantitativen Analytik eingesetzt. In vielen Fällen hat HPLC die klassischen
Verfahren der Chromtographie ersetzt.

Die HPLC ist ein LC-Verfahren, mit dem man nicht nur Substanzen trennt, sondern diese auch über
Referenzproben (Standards) identifizieren und quantifizieren (die genaue Konzentration bestimmen)
kann. Im Unterschied zur Gaschromatographie (GC), die eine sehr gute Trennmethode für
verdampfbare Stoffe ist, können mittels HPLC auch nicht flüchtige Substanzen analysiert werden.
Die HPLC kann auch präparativ genutzt werden. Bei HPLC wird die zu untersuchende Substanz
zusammen mit dem Laufmittel, der mobilen Phase (auch „Elutionsmittel“ oder „Eluent“ genannt)
durch eine sogenannte Trennsäule, welche die stationäre Phase in sehr dichter Packung enthält,
gepumpt wird. Eine Trennsäule in einer HPLC-Anlage ist zwischen 18 und 300 mm lang und hat
zumeist einen Innendurchmesser von 2 bis 4,6 mm im Falle von analytischen HPLC-Systemen. Das
Trennvermögen einer HPLC-Chromatographie ist etwa 100-mal größer als in der
Säulenchromatographie.

Wechselwirkt ein Bestandteil der zu untersuchenden Substanz stark mit der stationären Phase,
verbleibt er relativ lange in der Säule. Wechselwirkt er hingegen schwach mit der stationären Phase,
verlässt er die Säule früher. Je nach Stärke dieser Wechselwirkungen erscheinen die Bestandteile
der Substanz zu verschiedenen Zeiten (den sogenannten Retentionszeiten, meist angegeben in
Minuten) am Ende der Trennsäule, wo sie dann mit einem geeigneten Detektor (meist mit einem
UV-Durchflussphotometer) nachgewiesen werden können.

Es werden zwei Methoden unterschieden: Normalphase (NP) und Umkehrphase (engl. reversed
phase, RP). Bei der NP-HPLC wird eine polare stationäre Phase (z. B. Kieselgel oder Silicagel)
genutzt. Polare Moleküle werden auf der Säule länger adsorbiert/retardiert (zurückgehalten) als
unpolare Moleküle und verlassen deshalb die Säule später.

Die RP-HPLC ist in der Praxis die gängigste Methode. Etwa 70 % aller analytischen HPLC-
Trennungen sind RP-Trennungen. Hier wird eine unpolare stationäre Phase verwendet, und die
Elutionskraft steigt mit steigender Polarität. D.h. je polarer eine Verbindung ist, desto schneller wird
18

diese von der RP-Säule eluiert. Die stationäre Phase wird hergestellt, indem man Silane, welche mit
langkettigen Kohlenwasserstoffen substituiert wurden, mit Silicagel reagieren lässt. Dabei wird die
polare Oberfläche der Silicagel-Partikel mit einer unpolaren Schicht aus Alkanen überzogen, also
die Polarität umgekehrt. Als mobile Phase werden meist Mischungen aus Wasser oder Puffer und
Acetonitril (Achtung: sehr giftig!) oder Methanol eingesetzt. Bei „isokratischen“ Trennungen bleibt
die Zusammensetzung der mobilen Phase während der gesamten Zeit gleich. Bei
„Gradiententrennungen“ wird die Polarität des Fließmittelgemisches während der Analyse
verändert. Besondere Anwendung findet die RP-HPLC bei der Auftrennung von polaren Analyten,
die auf Normalphasen zu hohe Retentionszeiten aufweisen würden. Dafür wird meist eine C18-
Säule (also ein Octadecylsilan als Derivatisierungsreagens für das Silicagel, daher auch die häufige
Bezeichnung ODS-Säule) eingesetzt.

Eine chemische Verbindung kann man mittels HPLC nur bedingt identifizieren, indem man die
Retentionszeit der unbekannten Substanz mit der eines Standards (einer bekannten Substanz)
vergleicht (externer Standard). Ist die Retentionszeit gleich, kann man der Probe mit der
unbekannten Substanz auch etwas Standard zusetzen und untersuchen, ob beim Chromatogramm
nach wie vor nur eine Spitze („Peak“) sichtbar ist, ob ein „Doppel-Peak“ entstanden ist oder ob am
Chromatogramm zwei getrennte „Peaks“ mit sehr ähnlicher Retentionszeit sichtbar werden (interner
Standard). Ein weiterer Parameter zur Identifikation ist der Abgleich des UV-Spektrums oder der
Massenspur bei einem gekoppelten Massenspektrometer. Allerdings bieten Retentionszeit, UV-
Spektrum und MS-Spektrum bei Isomeren oft nur unzureichende Identifikationsmerkmale. Für eine
eindeutige Identifizierung werden daher häufig weitere analytische Methoden herangezogen, wie
z.B. die NMR Spektroskopie (siehe später).

Will man die Konzentration einer chemischen Substanz bestimmen (z. B. von Riboflavin in einem
Futtermittel), so kann man dies, indem man Standards dieser chemischen Substanz mit bekannten
Konzentrationen herstellt und die Peak-Fläche (Integral) der Standards mit den Peak-Flächen der
Substanz in den Proben vergleicht.

Eine praktische Anwendung von HPLC wird am 4. Versuchstag durchgeführt.


19

Bioorganische Redoxsysteme
Redoxreaktionen spielen in der organischen Chemie eine große Rolle. Während sich der Chemiker
bei derartigen Reaktionen recht "rabiater" Reagenzien bedienen kann (z.B. Chromate, Wasserstoff-
peroxid) verlaufen im physiologischen Geschehen diese Umsetzungen nahezu ausschließlich unter
enzymatischer Katalyse mittels spezieller Cofaktoren bzw. prosthetischer Gruppen. Sie bewirken
zweierlei:

1) katabole bzw. anabole Synthesen


2) Vermeidung der Vergeudung von freiwerdenden Energiebeträgen.

Beispielhaft soll hier der Redoxübergang am Riboflavin (Vitamin B2) betrachtet werden. Formal
kann die Struktur des Riboflavins vom Pteridin abgeleitet werden.

O
N H3C N
N NH

N N H3C N N O
CH2
Pteridin H C OH
H C OH
H C OH
H2C OH

Riboflavin

Abbildung 7: Struktur von Pteridin und Riboflavin

Das mit der Nahrung aufgenommene Riboflavin wird vom menschlichen Organismus in Riboflavin-
5'-phosphat = FMN (= Flavinmononukleotid) bzw. in Flavindinukleotid (FAD) umgewandelt. Diese
Verbindungen wirken als Cofaktoren zahlreicher Redoxenzyme.

O H O
H3C N + 2 [H] H3C N
NH NH

H3C N N O – 2 [H] H3C N N O


H
CH2 CH2
H C OH H C OH
H C OH H C OH

H C OH O H C OH

H2C O P P = P O H2C O P
O
oxidiert reudziert

Flavinmononukleotid (FMN)

Abbildung 8: Flavinmononukleotid (FMN). Reduzierte (farblos) und oxidierte (gelb) Form.


20

O
H3 C N
NH

H3 C N N O
CH2
H C OH
NH2
H C OH
H C OH N
N
H2C O P P O CH2
O N N

OH OH

Flavinadenindinukleotid (FAD)

Abbildung 9: Struktur von Flavinadenindinukleotid (FAD).

Als Modell behandeln wir die Umsetzung von Riboflavin mit dem anorganischen Reduktionsmittel
Dithionit (Anmerkung: Dithionit hat keine physiologische Bedeutung).

– – +
Riboflavin + S2O42 + 2 H2O  Dihydroriboflavin + 2 SO32 + 2 H

Alle Flavine sind intensiv gelb gefärbt (flavus = gelb). Durch Reduktion entstehen farblose
Dihydroflavine, in denen die Konjugation des Doppelbindungssystems unterbrochen ist.
Dihydroflavine reagieren leicht mit vielen Oxidationsmitteln, u.a. mit molekularem Sauerstoff, der
bekanntlich bei Raumtemperatur aus kinetischen Gründen mit den meisten organischen Substanzen
nicht reagiert.

Dihydroriboflavin + O2  Riboflavin + H2O2

Der Oxidations– bzw. Reduktionszustand lässt sich sehr leicht spektralphotometrisch darstellen.

 Versuch: Redoxspektren an Riboflavin


Nehmen Sie das Absorptionsspektrum von Riboflavin und Dihydroriboflavin auf. Bestimmen Sie
max im langwelligen Bereich des Riboflavinspektrums und über das Lambert–Beer'sche–Gesetz den
dazugehörigen molaren Extinktionskoeffizienten . Anschließend ermitteln Sie die Konzentration
einer unbekannten wässrigen Riboflavinlösung.
Sie erhalten eine wässrige Standardlösung von Riboflavin bekannter und eine Riboflavinlösung
unbekannter Konzentration. Beachten Sie, dass Sie zuerst für den gesamten Wellenlängenbereich
das Photometer gegen das reine Lösungsmittel (Wasser) abgleichen müssen (im Scan-Modus, beide
Tasten für die Wellenlängeneinstellung gleichzeitig gedrückt halten bis 5-6 erscheint, warten; siehe
dazu auch Anhang). Füllen Sie nun die Standardlösung in eine Küvette (ca. ¾ voll). Messen Sie das
Spektrum von Riboflavin zwischen 330 und 550 nm in 5 nm Schritten (siehe dazu auch
Beschreibung im Anhang). Zeichnen Sie die Extinktion als Funktion der Wellenlänge
21

(Millimeterpapier; Abszisse: Wellenlänge, Ordinate: Extinktion) und bestimmen Sie aus der
Graphik das Absorptionsmaximum (in nm) Ihrer Probe.
Geben Sie anschließend in die Küvette mit der Standardlösung eine Spatelspitze Natriumdithionit,
verschließen die Küvette mit einem Parafilm, schütteln gründlich um, warten ca. 2 Minuten, und
messen Sie das Spektrum zwischen 400 und 550 nm in 5 nm Schritten (aufpassen, dass keine
Luftblasen in der Küvette sind, die die Messung stören). Notieren Sie die Werte und zeichnen Sie
sie anschließend auf ein Millimeterpapier. Wieviele Absorptionsmaxima besitzt das
Riboflavinspektrum für die oxidierte und reduzierte Form in dem ausgemessenen Bereich?
Ermitteln Sie für das langwelligste Maximum max und für diese Wellenlänge das .
Zur Bestimmung der Konzentration der unbekannten Riboflavinlösung bestimmen Sie den Extink-
tionswert der Lösung bei der bestimmten max. Berechnen Sie daraus die Konzentration Ihrer
Analysenlösung in mol/l und in g/l. Molekulargewicht von Riboflavin: 376,4 g/mol.

 Versuch: Analyse einer Flavinmischung mittels RP-HPLC

Sie erhalten je eine wässrige FAD-Lösung und eine wässrige Riboflavin-Lösung mit bekannter
Konzentration (Strukturen von Riboflavin und FAD siehe oben). Außerdem erhalten Sie eine
unbekannte, wässrige Analysenlösung (Flavingemisch bestehend aus Riboflavin und FAD).

Aufgabenstellung

Nehmen Sie das Absorptionsspektrum von FAD (bekannter Konzentration) am Photometer auf.
Siehe dazu auch vorherigen Versuch. Bestimmen Sie λMax. im langwelligen Bereich. Berechnen Sie
über das Lambert-Beersche-Gesetz den molaren Extinktionskoeffizienten ε. Diskutieren Sie die
Befunde im Vergleich zu den Werten von Riboflavin.

Ermitteln Sie anschließend durch eine HPLC-Analyse die Zusammensetzung und die
Konzentrationen von Riboflavin bzw. FAD in der Analysenlösung, die sie erhalten haben.

Vergleichen Sie die durch die HPLC ermittelten Konzentrationen an Riboflavin und FAD mit einer
Photometermessung der Analysenmischung. Machen Sie sich Gedanken über die einzustellende
Wellenlänge. Berechnen Sie die Gesamtkonzentration der Flavine über das Lambert-Beersche-
Gesetz, falls möglich.
22

Anleitung zur rechnergesteuerten HPLC-Analyse

Es steht Ihnen eine rechnergesteuerte HPLC-Anlage zur Verfügung, die Peaks verschiedener
Verbindungen mittels ihrer Retentionszeiten erkennt, identifiziert und die vorliegende
Konzentration dieser Verbindungen mittels einer Kalibriergeraden, die schon angefertigt wurde und
im Computer gespeichert ist, errechnet.

In der Praxis werden ähnliche Anlagen sehr häufig eingesetzt. Zusätzlich besitzen diese Systeme
noch einen Autosampler (= automatischer Probengeber), sodass oft ein Startbefehl genügt für das
automatische Abarbeiten von großen (bis max. 100 Proben) Probenserien. Bei der Ihnen zu
Verfügung stehenden Anlage müssen die Proben über den Injektor mittels einer HPLC-Spritze auf
die Säule injiziert werden (siehe Punkt 2 der Anleitung).

Punkt 1 Aufrufen der entsprechenden Datenbank und der Dateien

Wenn Sie zu den HPLC-Anlagen kommen, sehen sie am Display ein Fenster „Eurochrom 2000 for
Windows“ mit verschiedenen Icons. Es ist die Starttafel des Programms „Eurochrom 2000 for
Windows“ der Firma Knauer, mit dem sie ihre HPLC-Analyse anfertigen werden.

Doppelklick mit linker Maustaste


( bei der Erwähnung Klick oder Doppelklick ist immer die linke Maustaste gemeint, es sei denn
es steht explizit „rechte Maustaste“ da)
auf das Icon „Base viewer“ => es erscheint die Tafel „Data Base Viewer“, die in 2 Hälften aufgeteilt
ist. Links ist die Datenbank „WSTPrakt“ mit verschiedenen Dateien aufgelistet.

In der linken Hälfte der Tafel die Datei „Methoden“ 1 x anklicken


 in der rechten Hälfte erscheint noch einmal die Datei „Methoden“, mit 2 Unterdateien,
„Methode1“ und „Methode2“
 in der rechten Hälfte Doppelklick auf „Methode1“
 Tafel „Method – Methode1“ erscheint
 Klicken sie 1 x auf das Pumpensymbol in der Menueleiste oder klicken sie auf
„Measurement“ und dann auf „Pump on“
 Computer meldet „Check net configuration“, nach kurzer Zeit muss sich die Pumpe
einschalten (Flow: 1mL/min, am Display der Pumpe überprüfen) und der Detektor muss eine
Wellenlänge von 445 nm anzeigen
 Das System ist nun startbereit, lassen sie die Pumpe 5 Min. laufen, um einen gleichmäßigen
Fluss zu erreichen.

HPLC-Anleitung Korrektur

Punkt 2 Vorbereitung zum Start der Analyse

- klicken sie in der Menuleiste 1 x auf das Symbol „blaues Dreieck“ = „Start“ oder klicken sie
zunächst 1 x auf „Measurement“ und dann auf „Start“ => Computer meldet: „Check net
konfiguration“
23

- es erscheint ein Dialogfenster mit einem weißen Textfeld, in das sie den Namen eingeben
müssen, unter dem sie ihre Daten speichern möchten:  geben sie mit Hilfe der Tastatur
z.B. ein: „Gruppe xy“ oder ihren Namen
- dann sollten sie sich noch vergewissern, dass ihr Chromatogramm in der richtigen Datei
gespeichert wird, in der Datei „Chromatogramme-Proben“
- Dazu klicken sie auf den Schalter „change directory“, erscheint im Schriftfeld der Pfad
„WSTPrakt“  „Methoden“, klicken sie nochmals den „change directory“-Schalter an, =>
auf dem Bildschirm erscheint die „Base viewer“-Tafel
- Klicken sie nun in der linken Hälfte der Tafel 1 x auf die Datei „Kalibrierdaten“
- => in der rechten Hälfte der Tafel erscheinen mehrere Dateien, Doppelklick in der rechten
Hälfte der Tafel auf die Datei „Chromatogramme-Proben“ =>
- im Schriftfeld neben dem Schalter „change directory“ muß nun der Pfad „WSTPrakt“ 
„Kalbibrierdaten“  „Chromatogramme-Proben“ erscheinen, anschließend injizieren sie
ihre Analysenlösung in den Injektor

Punkt 3 Injektion ihrer Analysenlösung in den Injektorkopf

Vorbemerkung: Versuchen sie keinesfalls die Spritze mit Gewalt in die Injektionsöffnung zu
bekommen! Sollten sie einen Widerstand spüren, die Spritze zurückziehen und neu ansetzen.

- spülen sie die Spritze mind. 5 x mit H2Oention. aus (H2O in Spritze ziehen, Inhalt
rausdrücken, über einem Zewa-Tuch)
- ziehen sie 3 x ihre Analysenlösung in die Spritze und drücken sie den Inhalt wieder über
einem Zewa-Tuch aus
- füllen sie nun ihre HPLC-Spritze deutlich über die 10 μL-Marke, dann den Spritzenkolben
langsam vordrücken, bis der Stahlstempel genau an der 10 μL-Marke steht, wenn kleiner
Tropfen an der Spritzenspitze hängt, mit Zewa abtupfen
- drehen sie nun den Injektor von Position „Inject“ auf Position „Load“
- führen sie die HPLC-Spritze gerade und vorsichtig in die Injektionsöffnung des Injektors,
gegen Ende ist ein leichter Widerstand spürbar, Spritze sanft durchdrücken bis Anschlag
erreicht ist, achten sie dabei darauf, dass sie nicht an den Stempel der Spritze kommen, sonst
kann ein kleiner Teil der Analysenlösung verloren gehen
- drücken sie nun den Spritzenkolben in kontinuierlichem Tempo (nicht zu schnell, nicht zu
langsam) rein, dadurch wird der Spritzeninhalt in die Ladeschleife gedrückt.
- Wichtig: wenn sie den Stempel ganz durchgedrückt haben, lassen sie die Spritze unbedingt
stecken, bewegen sie sie nicht und ziehen sie sie keinesfalls aus der Injektionsöffnung
- Wenn der Stahlstempel ganz in die Spritze eingedrückt ist, und damit der Spritzeninhalt
komplett in die Ladeschleife überführt wurde, halten sie mit der einen Hand die Spritze fest,
und drehen mit der anderen Hand den Injektor wieder auf die Position „Inject“
- Erst jetzt die Spritze vorsichtig aus der Injektionsöffnung ziehen und Methode1 starten
- bestätigen sie nun ihre Eingaben siehe Punkt 2 und starten sie ihre Analyse, indem sie 1 x
auf den „ok-Schalter“ mit dem grünen Haken klicken =>
- es erscheint die Meldung „Please wait for conditioning the system“ und die Analyse startet,
kurz danach wird das „Datenaufnahmefenster“ eingeblendet. An diesem Fenster können sie
den aktuellen Stand ihrer Analyse ablesen und sehen die aktuellen Peaks, die das Gerät
gerade aufzeichnet.
- Nach 25 Min. ist die Analyse beendet, im Display des Photometers blinkt die Zeitangabe bei
der Position „Time“, die Pumpen laufen automatisch weiter
- Klicken sie auf das „Exit“-Symbol in der Menueleiste oder auf „File“ und „exit“ =>
Datenaufnahmefenster wird ausgeblendet.
24

Punkt 4 Auswertung des Chromatogramms und Erstellung des Peakreports

- klicken sie in der linken Hälfte der Tafel „Base viewer“ die Datei „Analysenparameter“ 1x
an => in der rechten Hälfte der Tafel erscheint wieder die Datei „Analysenparameter“ mit
der Unterdatei „Analysenparameter 01“
- Doppelklick auf Datei „Analysenparameter 01“ in der rechten Hälfte der Tafel => Tafel
„Parameter 01“ erscheint.
- Klicken sie auf den Schalter „Detection parameters“ => Tafel „Detection parameters“
erscheint  vergewissern sie sich, dass im Textfeld des Schalters „Determination method“
„unknown external“ eingetragen ist.

- Wenn nein: klicken sie 1 x auf den senkrechten Pfeil rechts neben dem Textfeld und suchen
sie in der aufgetauchten Liste nach dem Eintrag „unknown external“, klicken sie diesen
Eintrag 1 x an, im Textfeld des Schalters „Determination method“ sollte dann der Eintrag
„unknown external“ stehen.
- Klicken sie dann zur Bestätigung auf den „ok-Schalter“ mit dem grünen Haken => es
erscheint wieder die Tafel „Parameter 01“
- Klicken sie 1 x auf den Schalter „set global“ und dann auf das Speicherungszeichen =
Diskettensymbol in der Menueleiste oder klicken sie auf „File“ und „save“
- Durch 1 x klicken auf das „exit“-Symbol verlassen sie die Tafel „Parameter 01“

- Wenn ja: klicken sie auf den „ok-Schalter“ mit dem grünen Haken => und gehen sie vor wie
oben beschrieben.

- Klicken sie nun 1 x in der linken Hälfte der Tafel „Base viewer“ auf die Datei
„Chromatogramme-Proben“ =>
- In der rechten Hälfte der „Base viewer“-Tafel muss nun der Name, den sie ihrem
Chromatogramm gegeben haben, auftauchen, vor dem Namen muss das Symbol für ein
Chromatogramm eingetragen sein
- Durch Doppelklick auf diesen Namen in der rechten Hälfte der Tafel öffnen sie ihr
Chromatogramm
- Klicken sie in der Menueleiste auf das Chromatogrammsymbol mit dem Fragezeichen, oder
klicken sie auf „Chromatography“ und „Peak Detection“ =>
- Tafel „Base viewer“ wird eingeblendet
- Doppelklick auf Datei „Kalibrierdaten“ in der linken Hälfte der Tafel
- Klicken sie 1 x auf die Unterdatei „externer Standard“ in der rechten Hälfte der Tafel => in
der rechten Hälfte der Tafel „Select Compound Table object“ erscheint die Unterdatei
„externer Standard“ mit der Subdatei „FAD Ribo Standard“ =>
- Doppelklick auf „FAD Ribo Standard“ =>
- Tafel verschwindet, ihr Chromatogramm mit dem Peak, neben dem jetzt die Retentionszeit
eingetragen ist, wird eingeblendet
- Klicken sie auf „File“ und „print“, stellen sie über den Schalter „Eigenschaften“ das
Querformat ein und klicken sie auf „ok“ und nochmals auf „ok“ => ihr Chromatogramm
wird ausgedruckt.
- Schließen sie danach ihr Chromatogramm über „Exit“
- Im „Base viewer“ ist in der rechten Hälfte der Tafel der Name ihres Chromatogramms 2 mal
eingetragen. 1 mal mit dem Chromatogramm-Symbol am Anfang und einmal mit einem
Tabellensymbol in das ein großes „R“ eingetragen ist. Das ist der Peakreport zu ihrem
gerade ausgedruckten Chromatogramm. Im Peakreport ist unter anderem der Name der
25

Verbindung, die sie zu analysieren hatten, die Retentionszeit des Peaks und die
Konzentration der Verbindung eingetragen.
- Öffnen sie den Peakreport durch Doppelklick und drucken sie ihn auf die gleiche Weise im
Querformat wie ihr Chromatogramm aus.

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26

4 Redoxsysteme/Diffusionspotential
„Redox“–Reaktionen sind Elektronenübertragungs–Reaktionen. Stets ist eine Reduktion mit einer
Oxidation gekoppelt. Der elektronenabgebende Stoff (= Elektronendonator) heißt Reduktionsmittel,
d.h. er reduziert den mit ihm reagierenden Reaktionspartner. Durch die Abgabe von Elektronen wird
er selbst oxidiert. Der elektronenaufnehmende Stoff (= Elektronenakzeptor) heißt Oxidationsmittel.
Der mit ihm reagierende Reaktionspartner wird oxidiert, er selbst reduziert. Es besteht weitgehende
formale Analogie mit Säure –Base–Reaktionen:
 Säure–Base–Reaktion = Protonenübergang von einem Protonendonator zu einem
Protonenakzeptor
 Redoxreaktion = Elektronenübergang von einem Elektronendonator zu einem
Elektronenakzeptor
Ein einfaches Beispiel für eine Redoxreaktion ist gegeben, wenn man einen Zinkstab in eine Lösung
von Kupfersulfat eintaucht. Dann läuft folgende Reaktion ab:
Zn + Cu2+  Zn2+ + Cu
d.h., Zinkionen gehen in Lösung, elementares Kupfer scheidet sich auf dem Metallstab ab. Dabei ist
Zn das Reduktionsmittel und Cu2+ das Oxidationsmittel.
Formal kann man diese Reaktion in folgende Teilgleichungen zerlegen:
Zn  Zn2+ + 2 e–

Cu2+ + 2 e–  Cu
Solche Teilgleichungen lassen sich für alle Redoxreaktionen formulieren. Sie sind für die
Aufstellung von Redoxgleichungen sehr hilfreich. Einige weitere Beispiele zeigt Tabelle 1.

Tabelle 1: Wichtige Redoxsysteme

reduzierte Form oxidierte Form korrespondierendes Redoxpaar


Reduktionsmittel Oxidationsmittel + n  e– Red./Ox.
H2  2 H+ + 2  e– ½ H2/H+
Fe  Fe2+ + 2  e– Fe/Fe2+
Fe2+  Fe3+ + 1  e– Fe2+/Fe3+
2 Cl–  Cl2 + 2  e– Cl–/ ½ Cl2
Ag  Ag+ + 1  e– Ag/Ag+

Die Teilgleichungen haben nicht nur formalen Charakter. Man kann durchaus einen experimentellen
Aufbau wählen, bei dem die beiden Halbreaktionen räumlich getrennt ablaufen. Eine entsprechende
Vorrichtung nennt man ein Galvanisches Element oder elektrochemische Zelle (Abbildung 10).
27

Abbildung 10: Schematische Darstellung eines galvanischen Elements

In eine Lösung von Kupfersulfat taucht ein Kupferstab. Die Kupfersulfatlösung steht über eine
poröse Filterplatte in Verbindung mit einer Zinksulfatlösung. In die Zinksulfatlösung taucht ein
Zinkstab. Abgekürzt schreibt man
Cu/Cu2+//Zn2+/Zn
Dabei bezeichnet der schräge Strich jeweils eine Phasengrenze. Verbindet man nun den Zinkstab
mit dem Kupferstab durch einen metallischen Leiter, so können durch diesen Elektronen vom
Zinkstab zum Kupferstab fließen. In den beiden Halbzellen können dann die beiden Halbreaktionen
gemäß den oben genannten Gleichungen ablaufen, d.h. an der Zinkelektrode werden Zinkionen
freigesetzt (Zn wird oxidiert), an der Kupferelektrode wird Kupfer abgeschieden (Cu2+ wird
reduziert). Diese elektrochemische Zelle wird auch Daniell–Element genannt.
Schließen wir an die beiden Elektroden unseres Daniell–Elementes ein Spannungsmeßgerät an, so
können wir die elektrische Spannung E zwischen den beiden Elektroden messen (um
thermodynamisch verwertbare Resultate zu erhalten, muss die Spannungsmessung so vorgenommen
werden, dass während der Messung nur minimal Strom fließt. Die unter diesen Bedingungen
gemessene Spannung bezeichnet man als elektromotorische Kraft (EMK).
Würden wir an unserem Element so lange einen Strom durch einen metallischen Leiter vom Zink
zum Kupfer fließen lassen, bis an beiden Elektroden jeweils 1 Mol Kupfer bzw. Zink umgesetzt ist,
so würde die transportierte Ladungsmenge entsprechend dem Faradayschen Gesetz


n  F  2  96500 Coulomb  Mol
–1
  193000 CMol –1
Zn bzw. Cu  Gleichung 4-1

mit F = Faradaykonstante = 96500 [CMol–1]


1C = 1As
n = Zahl der Elektronen
28

betragen.
Die von unserem Element geleistete elektrische Arbeit wäre dann A = E  2F. Sie ist gleich der
bei der Umsetzung aufgetretenen Änderung der freien Enthalpie
A  ΔE  2F   ΔG Gleichung 4-2

und allgemein ΔG  n  ΔE  F Gleichung 4-3

Wir wollen jetzt weiter annehmen, dass wir solange Strom durch unser Element fließen lassen, bis
die Spannung auf Null absinkt, was bekanntlich bei jeder Batterie früher oder später passiert. Das
Absinken der Spannung auf Null zeigt uns an, dass in unserem System keine weitere chemische
Veränderung mehr ablaufen kann und dementsprechend keine Elektronen mehr durch unseren
metallischen Leiter transportiert werden können, d.h. dass unser System einen chemischen
Gleichgewichtszustand erreicht hat.
Man sieht nun unmittelbar ein, dass wir mit der EMK ein Maß für die Triebkraft der in unserem
Galvanischen Element ablaufenden chemischen Reaktionen gewonnen haben bzw. ein Maß dafür,
wie weit unser System vom chemischen Gleichgewicht entfernt ist – je weiter das System vom
chemischen Gleichgewicht entfernt ist, desto größer ist die gemessene EMK. Bei bestehendem
Gleichgewicht ist die EMK gleich Null.
Wählt man die Konzentrationen aller an der Reaktion beteiligten gelösten Stoffe so, dass sie in 1 M
Lösung vorliegen (Standardzustand), so bezeichnet man die so gemessene EMK als Standard–EMK.
Streng genommen sind die Standardzustände so definiert, dass die sogenannte Aktivität der gelösten
Stoffe gleich 1 sein soll, wobei die Aktivität gegeben ist durch a = f  c. Dabei ist c die
Konzentration und f ein Korrekturfaktor, der sogenannte Aktivitätskoeffizient. Wir werden im
Folgenden vereinfachend von den Konzentrationen ausgehen. Die Standard–EMK kann man für
beliebige Kombinationen von Halbelementen messen und tabellieren, etwa für die Beispiele in
Tabelle 2.

Tabelle 2: Standard–EMK für gängige Kombinationen von Halbelementen

Standard–EMK [V]
Cu/ 1M Cu2+ // 1M H+/H2/Pt 0,35
Ag/ 1M Ag+ // 1M Fe2+/Fe 1,24
Cu/ 1M Cu2+ // 1M Hg2+/Hg 0,45

Aus messtechnischen Gründen kann man nur Potentialdifferenzen und keine Absolutpotentiale
messen. Man kann aber willkürlich einer bestimmten Elektrode durch Vereinbarung das Potential
E = 0 zuordnen und die Potentiale aller anderen Elektroden auf diese Elektrode beziehen.
Definitionsgemäß hat man der Standard–Wasserstoffelektrode das Potential Null zugeordnet. Die
Standard–Wasserstoffelektrode besteht aus einem platinierten Platinblech, das in eine Lösung von
1M H3O+–Konzentration eintaucht und von Wasserstoffgas mit Atmosphärendruck umspült wird.
An dieser Elektrode läuft die folgende Reaktion ab:
2 H+ + 2 e–  H2
Das Platin ist nicht an der Reaktion beteiligt, es dient nur zur Ableitung der Elektronen. Verbindet
man nun ein beliebiges Halbelement unter Standardbedingungen (Aktivität = 1) mit der Platin–
Wasserstoffelektrode zu einem Galvanischen Element, wie in folgender Abbildung gezeigt,
29

Abbildung 11: Platin–Wasserstoffelektrode

so ist die gemessene EMK identisch mit dem Standardpotential der Halbelektrode, z.B. für den Fall
Pt/H2, 1 M H3O+ // 1M Ag+/Ag. Die so gemessenen Standardpotentiale (= Normalpotential) kann
man in einer Spannungsreihe anordnen (siehe Tabelle 3).

Tabelle 3: Spannungsreihe ausgewählter Halbzellen

Halbzelle Elektrodenreaktion Normalpotential E0 [V]


Na/Na+ Na+ + e–  Na -2,71
Al/Al3+ Al3+ + 3 e–  Al -1,69
Zn/Zn2+ Zn2+ + 2 e–  Zn -0,76
Ni/Ni2+ Ni2+ + 2 e–  Ni -0,24
Pt/H2/H+ 2 H+ + 2 e–  H2 0,000
Cu/Cu2+ Cu2+ + 2 e–  Cu +0,35
Pt/Fe2+/ Fe3+ Fe3+ + e–  Fe2+ +0,77
Pt/Co2+/Co3+ Co3+ + e–  Co2+ +1,84

Wir haben bisher ausschließlich von den Standardpotentialen gesprochen, d.h. also von den
Potentialen, die wir messen, wenn alle an der Reaktion beteiligten gelösten Stoffe in 1 molarer
Lösung vorliegen. Das wird in der Praxis nicht immer der Fall sein. Das Potential einer Elektrode
bzw. die EMK eines Galvanischen Elements ist nun aber von der Konzentration der
Reaktionspartner abhängig. Diese Abhängigkeit wird durch die Nernst’sche Gleichung
beschrieben:
30

E  E0 
RT oxidierte Form Gleichung 4-4
reduzierte Form
ln
n F

wobei
E 0  Normalpotential  Standardpo tential V 
-1
F  96500 [AsMol ]
n  Zahl der an der Reaktion beteiligten Elektronen
R  allgemeine Gaskonstan te
 –1
 8 ,314 JK Mol
–1
( 1J  1VAs)
T  absolute Temperatur K  
Für Raumtemperatur (25 °C = 298 K) gilt:

E  E0 
0 ,059
log
Ox. V  Gleichung 4-5
n Re d.
R T
wobei 2,303  0,059V (T  298 K ) (  Nernst - Faktor) Gleichung 4-6
F

Anmerkung
Liegt ein Reaktionspartner in fester Phase vor, so ist c = 1. Auf Details der Festlegung für
Standardzustände wird hier nicht eingegangen.

Beispiele
Wir betrachten als Beispiel für die Konzentrationsabhängigkeit die folgende galvanische Zelle:
Pt/Fe2+,Fe3+//Co2+,Co3+/Pt

Abbildung 12: Galvanische Zelle (Pt/Fe2+,Fe3+//Co2+,Co3+/Pt)


31

Für die Potentiale gilt:

E Fe   E 0 Fe  
R T Fe 
3

F
ln
Fe 
2
Gleichung 4-7

E Co  E 0 Co 
R T Co 
3

F
ln
Co 
2
Gleichung 4-8

Die Zahl der beteiligen Elektronen ist n = 1. Das Platin (Elektrode) ist an der Reaktion nicht
beteiligt.
Die Potentialdifferenz – also die EMK oder Zellenspannung – ist dann
EMK  E Fe  ECo Gleichung 4-9

EMK  E 0 Fe   E 0 Co 


R T Fe  Co 
3 2

F
ln
Fe  Co 
2 3
Gleichung 4-10

R T Fe  Co 
3 2
EMK  EMK 0 
F
ln
Fe  Co 
2 3
Gleichung 4-11

mit EMK0 = Standard–EMK.


Wir hatten oben besprochen, dass im Falle des chemischen Gleichgewichts die Spannungsdifferenz
Null wird. Für diesen Fall ergibt sich somit:
R T Fe  Co 
3 2
 EMK 0 
F
ln
Fe  Co 
2 3
Gleichgewicht
Gleichung 4-12

Nun gilt aber andererseits für den Gleichgewichtszustand der Reaktion


Co3+ + Fe2+  Co2+ + Fe3+
das Massenwirkungsgesetz:
Fe  Co 
3 2

Fe  Co 
2 3
Gleichgewicht
K Gleichung 4-13

Aus den Gleichungen 7-12 und 7-13 erhalten wir durch Einsetzen:
R T
 EMK 0  ln K Gleichung 4-14
F

Es wird somit möglich, die Gleichgewichtskonstante aus einer elektrochemischen Messung


abzuleiten.
32

Wir betrachten nun das folgende Galvanische Element:


Ag/ 1M Ag+// 0,1M Ag+/Ag

Abbildung 13: Galvanische Zelle (Ag/ 1M Ag+// 0,1M Ag+/Ag)

In diesem System besteht kein chemisches Gleichgewicht, da wir zwei unterschiedliche


Silberkonzentrationen miteinander in Verbindung haben. Wenn wir lange genug abwarten, wird sich
der Konzentrationsunterschied durch spontane Diffusion ausgleichen. Die chemische Triebkraft
dieses Vorgangs können wir wiederum durch eine EMK–Messung ermitteln.
Nach der Nernst’schen Gleichung sind die Potentiale der beiden Elektroden gegeben durch:
 
E1  E0  0,059 log Ag1

Gleichung 4-15

E2  E0  0,059 log Ag 2  

Gleichung 4-16

Damit ergibt sich EMK zu:

EMK  E1  E 2  0,059 log


Ag1     
 
für Ag1  Ag 2
Ag 2  Gleichung 4-17

Die gemessene Spannung bezeichnen wir als das sogenannte Diffusionspotential.

5.1 Konzentrationsabhängigkeit des Redoxpotentials

 Versuch: Messung des Diffusionspotentials


WICHTIG: Silberabfälle nur in die speziellen Silberabfall-Flaschen geben!!
Für die Ermittlung der Konzentrationsabhängigkeit des Redoxpotentials E (Diffusionspotential)
benützen Sie das pH–Meter als Spannungsmeßgerät. Als Messelement dienen zwei Ag/Ag+–Halb-
zellen (A und B) unterschiedlicher Ag+–Konzentrationen, die über eine sogenannte Strombrücke
miteinander verbunden sind.
33

Abbildung 14: Versuchsaufbau zur Messung des Diffusionspotentials.

Erläuterung:
Als Strombrücke verwenden wir ein U–Rohr, das mit einem Agar–Gel mit hohem Salzgehalt (3 M
KNO3) gefüllt ist. Diese Vorrichtung sorgt für eine leitende Verbindung der beiden Halbelemente.
Die zwei Elektroden werden mit Gummiringen an den beiden Schenkeln des U–Rohres befestigt, so
dass eine Klammer zum Heben und Senken beider Elektroden ausreicht (Abbildung 14). Als Gefäße
A und B sollen 50 ml Bechergläser eingesetzt werden, die mit je etwa 15 ml der entsprechenden
AgNO3–Lösungen zu füllen sind. Eventuell muss von der U–Rohröffnung eine Schicht Parafilm
abgezogen werden, die den Agar vor dem Austrocknen schützt. Achten Sie beim Eintauchen darauf,
dass sich keine Luftblasen zwischen Agar–Brücke und der AgNO3–Lösung befinden (Isolierung!).
Nach dem Eintauchen klemmen Sie das Voltmeter vorzeichenrichtig an. Die Spannungsmessung ist
im Anhang beschrieben. Notieren Sie nach halbwegs stabilisierter Anzeige (evtl. beide Gefäße
leicht schwenken; jeweils ca. 1 Minute abwarten) den Messwert. Welche Elektrode entspricht dem
Plus– bzw. Minuspol (Erklärung)? Vor jeder weiteren Messung ist das Becherglas von B zu säubern
und auszutrocknen, U-Rohr-Ende und Elektrode abzuspülen und trocken zu tupfen.

Folgende Messungen werden durchgeführt:

Messung Gefäß A Gefäß B


1 15 ml 0,03 M AgNO3 15 ml 0,03 M AgNO3
2 „ 15 ml 0,01 M AgNO3
3 „ 15 ml 0,003 M AgNO3
4 „ 15 ml 0,001 M AgNO3
5 „ 15 ml 0,0003 M AgNO3
6 „ 15 ml 0,0001 M AgNO3

 c Ag
Zeichnen Sie die Funktion EMK  f  log A
 
 c
  
Ag B
34

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Am Ende des Versuchs werden die Agar-Brücken gespült und beide Rohrenden werden in
Wasser eingetaucht. So gelagert, können die Agar-Brücken für den nächsten Versuch
wiederverwendet werden.

 Versuch: Quantitative Chloridbestimmung (Potentiometrische Titration)


Meßprinzip:

Die unbekannte Cl –Lösung wird mit 0,02 M AgNO3 titriert. Dabei läuft eine Fällungsreaktion ab:
Ag+ + Cl

 AgCl 
Für die Konzentration der gelösten Silberionen im Gleichgewicht mit dem Niederschlag gilt das
Massenwirkungsgesetz:

[Ag+]  [Cl ] = L (Löslichkeitsprodukt)

Im Bereich des Äquivalenzpunktes (zugegebene Menge an Ag+ = Menge der vorgelegten Cl –
Ionen) steigt die Konzentration der gelösten Ag+–Ionen stark an. Als Indikator für die Titration
benutzen wir das Potential einer Silberelektrode, die in das Titriergefäß eintaucht. Als
Referenzelektrode für die Potentialmessung benutzen wir eine 2. Silberelektrode, die in eine
AgNO3–Lösung eintaucht. Die Ag+–Ionenkonzentration der Referenzelektrode ändert sich nicht
während der Titration. Die beiden Halbzellen werden durch eine Strombrücke verbunden.
Sie erhalten eine NaCl–Lösung unbekannter Konzentration (dabei die Lösung im Messkolben mit
Wasser exakt auf 100 ml auffüllen und gut umschütteln; davon brauchen Sie 40 mL – siehe unten).
Bevor Sie mit der Titration beginnen, befestigen Sie zwei Ag–Elektroden wie beim vorigen
Versuch an dem mit KNO3–Agar gefüllten U–Rohr (säubern sie vorher die U-Rohr-Enden und die
Elektroden durch Abspülen mit entionisiertem Wasser). Der eine Schenkel des U–Rohrs und die
zugehörige Elektrode tauchen in ein 50 ml Becherglas mit etwa 15 ml einer ca. 0,01 M AgNO3–
+
Lösung (Pluspol) ein. Die Ag –Konzentration der Referenzelektrode geht nicht in das Messergebnis
ein, da sie sich während des Versuchs nicht ändert. Der andere Schenkel (Minuspol) des U–Rohres
taucht in ein 400 ml Becherglas. In dieses Becherglas pipettieren Sie mit der 20 ml Vollpipette
exakt 40 ml der Analysenlösung aus dem 100 mL Kolben (siehe oben). Zusätzlich geben Sie ca.
100 ml entionisiertes Wasser in das Becherglas. Die Menge an zugegebenem Wasser geht nicht in
das Analysenergebnis ein. Mit ca. 100–150 ml lässt es sich bequemer arbeiten als mit 40 ml.
Verbinden Sie die Elektroden mit dem pH–Meter wie im Anhang beschrieben, Spannungsmessung
wie dort beschrieben.
Füllen Sie eine Bürette mit 0,02 M AgNO3–Lösung (Maßlösung). Titriert wird durch schrittweise
Zugabe von AgNO3. Nach jeder Zugabe muss die Lösung durch vorsichtiges, aber intensives
Schütteln durchmischt werden. Die Ablesung am mV–Meter erfolgt unter leichtem, gleichmäßigem
und andauerndem Rühren. Titrieren Sie zunächst mit Portionen von ca. 1 ml AgNO3. Nach jeder
Zugabe notieren Sie die insgesamt verbrauchte Menge an AgNO3 und das am Messgerät abgelesene
Potential. Zeichnen Sie jeden Messpunkt sofort in ein Diagramm auf Millimeterpapier ein.
DIN A4/hoch; Abszisse: Verbrauch an AgNO3, (kurze Achse) 1 ml = 1 cm; Ordinate: Potential
[mV], 10 mV = 1 cm.
Das Potential nimmt ab (warum?), deshalb den ersten Spannungswert links oben auftragen (s.
Abbildung 15)! Je steiler die Messkurve wird, desto kleinere AgNO3–Portionen müssen zugegeben
werden (in der Nähe des Äquivalenzpunktes muss tropfenweise titriert werden). Bestimmen Sie
den Äquivalenzpunkt graphisch (Tangentenmethode, vgl. 15).
35

E [mM]
1/2

ÄP

0,02 M AgNO3 [ml]

Abbildung 15: Titration einer NaCl–Lösung mit AgNO3

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Berechnen Sie die Chloridkonzentration in der Analysenlösung (d.h. im 100 mL Messkolben)in


Mol/Liter.

5.2 Chinon–Hydrochinon-System
1,4-Dihydroxybenzol oder Hydrochinon kann leicht zu Chinon (= p–Benzochinon) oxidiert werden.
Das "chinoide" System ist nicht mehr aromatisch.

OH O

+ –
2H +2e +

OH O

Hydrochinon Chinon = p–Benzochinon

Abbildung 16: Redoxpaar Hydrochinon/Chinon

Aus der Teilchengleichung für das Redoxpaar Chinon/Hydrochinon ergibt sich folgender Ansatz für
die Nernst'sche Gleichung:

Chinon  H 
 2
0 ,059
E  E0   log
Hydrochino n
Gleichung 4-18
2

Durch Umformung erhält man:

E  E0  0 ,03  log
Chinon  
 0 ,03 log H
2

Hydrochino n
Gleichung 4-19
36

 E 0  0 ,03  log
Chinon  0 ,059 pH
Hydrochino n
Gleichung 4-20

Nun bilden Chinon und Hydrochinon im Verhältnis 1:1 ein schön kristallisierendes Addukt, das
Chinhydron (koplanarer –Komplex).
Es ist also möglich, ein Chinhydron–Halbelement aufzubauen, dessen Redoxpotential dann nur
noch vom pH–Wert der Lösung abhängt, wie sich durch Einsetzen des Verhältnisses
Chinon:Hydrochinon = 1:1 ergibt:
EChinhydron  E0 - 0,059 pH Gleichung 4-21

Das Halbelement, die sogenannte Chinhydron–Elektrode, liegt vor, wenn Chinhydron den Boden-
satz einer wässrigen Lösung bildet und in die Lösung eine chemisch inerte Elektrode (z.B.
Platindraht oder Graphitstab) eintaucht. Man hat somit eine Messvorrichtung für pH–Werte
wässriger Lösungen in einem pH–Bereich zwischen 0 und 8 zur Verfügung (in Lösungen von pH >
8 ist Chinhydron instabil).

 Versuch: pH–Messung mit der Chinhydron–Elektrode


WICHTIG: Chinhydronabfälle nur in die speziellen Chinhydronabfall-Flaschen geben!!
Bauen Sie zuerst folgende Versuchsanordnung auf:

Abbildung 17: Chinhydron–Elektrode

Halbelement A stellt die Messzelle dar. In ein 50 ml Becherglas wird mit einem Spatel Chinhydron
in 20–30 ml der zu messenden Lösung gegeben (so, dass Bodensatz an Chinhydron entsteht und
sowohl die Salzbrücke als auch der Graphitstab in die Lösung eintauchen).
Halbelement B stellt die Bezugselektrode dar. Sie besteht aus einem Silberdraht, der in ca. 15 ml
0,001 M AgNO3–Lösung eintaucht (auch hier ist das Volumen so zu bemessen, dass Draht und
Salzbrücke in die Lösung eintaucht).
Gemessen wird die Potentialdifferenz zwischen beiden Halbelementen mit Hilfe des pH–Meters (als
mV–Meter; Ag–Elektrode = Pluspol). Bis zur Ablesung sollte 2–3 Minuten gewartet werden!
37

Folgende Lösungen sind zu messen: 5 Standardpuffer, eine unbekannte Lösung. Abfälle nicht in
den Ausguss! Geben Sie die Chinhydron-Abfälle in die speziellen gekennzeichneten
Abfallkanister!!
Die Funktion EMK = f(pH) ist graphisch darzustellen und über die Eichgerade der pH–Wert der un-
bekannten Lösung zu bestimmen (Abszisse: pH 0–8; Ordinate: EMK -200 bis +400 mV).
- Extrapolieren Sie Ihre Gerade bis auf pH = 0 und diskutieren Sie die so ermittelte EMK.
- Berechnen Sie mit dem extrapolierten Wert von E0 das Standardpotential von Chinhydron
(Standardbedingungen: [Hydrochinon] = [Chinon], [H+] = 1 M) (vgl. 5.1).
Benutzen Sie dazu die Beziehungen:

EMK = EAg - EChinhydron


EAg = E0,Ag + 0,059 log [Ag+]
E0,Ag = +0,80 V
- Ermitteln Sie zusätzlich das Standardpotential der Chinhydronelektrode anhand eines graphisch
gemittelten Wertepaares (pH, EMK) aus der oben erhaltenen Eichgerade. Folgende Beziehungen
sind dabei hilfreich:
EChinhydron = E0,Chinhydron – 0.059pH

BITTE TESTAT EINHOLEN

Anmerkung:
Ein Derivat des Chinons, das Coenzym Q oder Ubichinon (weil in Zellen ubiquitär, also allgemein
verbreitet), ist ein wichtiger Elektronenträger in der Zelle (Atmungskette).

Abbildung 18: Struktur von Ubichinon (n = 6: CoQ6; n = 10: CoQ10)


38

6 Kinetik
Die chemische Kinetik untersucht den zeitlichen Ablauf chemischer Reaktionen. Kinetische
Untersuchungen bilden einen wichtigen Beitrag zur Untersuchung von Reaktionsmechanismen,
insbesondere auch Reaktionsmechanismen enzymatischer Reaktionen. Es ist zwar grundsätzlich
unmöglich, einen vermuteten Reaktionsmechanismus allein durch kinetische Messungen zu
beweisen, hingegen gelingt es häufig, falsche Reaktionsmechanismen aufgrund kinetischer Daten
auszuschließen.

Die Messgröße der Kinetik ist die Reaktionsgeschwindigkeit. Gegeben sei die Reaktion
A + B  C + D
Es sei cA die Konzentration der Substanz A (mol/l). Die Reaktionsgeschwindigkeit (Abnahme der
Konzentration von A als Funktion von der Zeit t) ist definiert durch
dc A
V  . Gleichung 6-1
dt

Da die Konzentrationsänderungen aller Substanzen durch die Reaktionsgleichung verknüpft sind,


gilt auch
dc A dc B dcC dc D
    Gleichung 6-2
dt dt dt dt

Zur Messung der Konzentrationsänderung einer Substanz gibt es verschiedene Möglichkeiten:

1) Man lässt die Reaktion bei konstanter Temperatur ablaufen und entnimmt zu verschiedenen
Zeitpunkten eine Probe, die man sofort mit einem geeigneten chemischen Analysenverfahren
analysiert. Dabei muss verhindert werden, dass die Reaktion in der entnommenen Probe in der
Zeit zwischen Probenentnahme und Analyse weiter läuft. Das lässt sich häufig schon durch
starkes Abkühlen erreichen, da die Reaktionsgeschwindigkeit mit fallender Temperatur
abnimmt (s. unten). Wir werden von dieser Methode in einem späteren Versuch Gebrauch
machen (Carbonsäureveresterung, Esterverseifung Kapitel 7).
2) Man benutzt ein physikalisches Verfahren, um die Konzentrationsänderung einer Reaktions-
komponente fortlaufend zu messen. Als Messgröße kann je nach Problemstellung etwa die
Lichtabsorption, das Volumen oder eine andere physikalische Größe dienen. Kinetische
Messungen, bei denen die Konzentrationsänderung photometrisch erfolgt, zeichnen sich durch
hohe Genauigkeit aus.

In günstigen Fällen gelingt es, die empirisch gefundene Zeitabhängigkeit des Reaktionsverlaufs
durch eine einfache mathematische Gleichung zu beschreiben. Dies ist jedoch nicht in allen Fällen
möglich. Als typische Beispiele behandeln wir die Reaktion 0. Ordnung, 1. Ordnung und
2. Ordnung.
39

6.1 Reaktion 0. Ordnung:


Bei der Reaktion 0. Ordnung ist die Reaktionsgeschwindigkeit unabhängig von der Konzentration
der Reaktionspartner. Es gilt:
dc A
 K Gleichung 6-3
dt

Es sei cA0 die Konzentration zum Zeitpunkt null. cA sei die Konzentration zur variablen Zeit t.
Durch Integration erhält man:
dc A   k  dt Gleichung 6-4

cA t

 dcA   kdt
cA0 t0
Gleichung 6-5

c A  c A, 0  k  t (t 0  0) Gleichung 6-6

12

10

8
cA

0
0 20 40 60 80 100

Abbildung 19: Reaktion 0. Ordnung

Trägt man cA = f (t) in ein Diagramm ein (s. Abbildung 19), so erhält man eine Gerade. Die
Reaktion 0. Ordnung folgt also einem besonders einfachen Zeitgesetz. Daraus folgt jedoch nicht
notwendigerweise, dass die Reaktion auch nach einem einfachen Mechanismus verläuft.
Zeitgesetze 0. Ordnung findet man häufig bei heterogen–katalysierten Reaktionen, z.B. bei der
Katalyse an einer Metalloberfläche. Um überhaupt in Reaktion gehen zu können, müssen die
Reaktionspartner zunächst an der Metalloberfläche gebunden werden. Limitierend für die
Reaktionsgeschwindigkeit ist die zeitlich konstante Größe der Oberfläche des Metalls.
Bei enzymkatalysierten Reaktionen kann man häufig einen Verlauf nach einer Reaktion 0. Ordnung
dadurch erreichen, dass man die Konzentrationen der Edukte ausreichend groß wählt. Davon macht
man bei der klinisch–chemischen Routineanalytik Gebrauch, weil eine Kinetik 0. Ordnung
besonders leicht ausgewertet werden kann (Kapitel 8).
Bei niedriger Konzentration der Edukte verlaufen enzymkatalysierte Reaktionen allgemein nach
einer höheren als der 0. Ordnung. (Für Einzelheiten wird auf die Lehrbücher verwiesen.)
40

6.2 Reaktion 1. Ordnung


Für eine Reaktion 1. Ordnung gilt definitionsgemäß das Geschwindigkeitsgesetz:
dc A
  k  cA Gleichung 6-7
dt

dc A
  k  dt Gleichung 6-8
cA

cA t
dc
Durch Integration erhält man c cAA  t kdt Gleichung 6-9
A, 0 0

c
ln c A cA   kt (t0 = 0 ) Gleichung 6-10
A,0

cA
ln   kt Gleichung 6-11
c A, 0

ln c A  ln c A, 0  k  t Gleichung 6-12

k t
log c A  log c A,0  Gleichung 6-13
2 ,3

Für die Halbwertszeit (= die Zeit, nach der die Hälfte des Edukts ins Produkt übergeführt wird)
(cA = 0,5 cA,0) erhält man
1
ln  k  t 1 Gleichung 6-14
2
2

ln 2 0 ,693
t1   Gleichung 6-15
2
k k

Das heißt, die Halbwertszeit ist bei der Reaktion 1. Ordnung (und nur bei der Reaktion 1. Ordnung)
unabhängig von der Ausgangskonzentration.

12 10

10

8 1
cA

cA

4 0,1

0 0,01
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60

t t
41

Abbildung 20: Reaktion 1. Ordnung (links: zweifach lineare Auftragung; rechts: halblogarithmische Auftragung)

Trägt man den Logarithmus von cA gegen die Zeit auf (s. Abbildung 20), so erhält man in diesem
Fall eine Gerade. Es ist charakteristisch für Reaktionen 1. Ordnung, dass die Halbwertszeit
unabhängig von der Konzentration der Ausgangsstoffe ist. Ein typisches Beispiel für eine Reaktion
1. Ordnung ist der radioaktive Zerfall. Geschwindigkeitsgesetze 1. Ordnung findet man häufig
bei enzymkatalysierten Reaktionen bei relativ niedriger Konzentration der Edukte.
Über die besprochenen Beispiele hinaus gibt es auch zahlreiche Reaktionen, die nach wesentlich
komplizierteren Geschwindigkeitsgesetzen ablaufen. Insbesondere gibt es Geschwindigkeitsgesetze
mit gebrochenen Exponenten. Dass die Reaktionsordnung von den Arbeitsbedingungen abhängen
kann, haben wir bereits angesprochen.
Die Untersuchung von Reaktionen mit einer höheren als der 1. Ordnung kann man sich häufig
dadurch erleichtern, dass man die Konzentrationen aller Edukte bis auf eine konstant hält. Das kann
man erreichen, indem man

1) die verbrauchte Menge eines Edukts fortlaufend ersetzt oder


2) ein Edukt von vornherein in sehr großem Überschuss einsetzt.

Unter diesen Bedingungen verläuft dann eine Reaktion 2. Ordnung formal als eine Reaktion 1. Ord-
nung (Pseudo–1.–Ordnung). Man erreicht durch diese Maßnahme also eine wesentliche Vereinfa-
chung der rechnerischen Behandlung.

Zu 1):
Der fortlaufende Ersatz des verbrauchten Edukts sei erläutert am Beispiel einer Reaktion, an der
Protonen beteiligt sind. Man kann die verbrauchten Protonen dadurch ersetzen, dass man die Reak-
tion in einem Puffer ausreichender Pufferkapazität ablaufen lässt. Die verbrauchten Protonen
werden dann durch Dissoziation der Säure fortlaufend nachgeliefert. Oder man kann die
Konzentration der Protonen (den pH–Wert) mit der Glaselektrode messen und mit Hilfe einer
geeigneten Vorrichtung fortlaufend soviel Säure zugeben, dass der pH–Wert exakt gleich bleibt.

Zu 2):
Wir wollen annehmen, dass wir im Fall der Reaktion
A + B  C + D
die Komponente A im 100fachen stöchiometrischen Überschuss gegenüber der Komponente B
eingesetzt hätten. Wenn die Komponente B restlos verbraucht ist, haben wir von der Komponente A
erst 1 % umgesetzt, d.h. die Konzentration der Komponente A hat sich während der gesamten
Reaktion nicht nennenswert geändert.

6.3 Molekularität
Die makroskopisch gemessene Reaktionsgeschwindigkeit stellt einen Mittelwert über die
Reaktionen sehr vieler einzelner Moleküle dar. Zur Beschreibung auf molekularer Ebene gehört
zunächst die Frage nach der Anzahl der an der elementaren Reaktion beteiligten Moleküle.
Als monomolekulare Reaktionen bezeichnet man Reaktionen, an denen nur ein einziges Molekül
beteiligt ist. Monomolekulare Reaktionen sind außerordentlich selten, sie kommen z.B. vor bei der
Fragmentierung von Molekülen im Vakuum. (Alle radioaktiven Zerfälle verlaufen gleichfalls mono-
molekular.)
42

An einer bimolekularen Reaktion sind definitionsgemäß 2 Moleküle beteiligt. Bei weitaus der
Mehrzahl aller chemischen Reaktionen besteht die Elementarreaktion in einem hinreichend
energiereichen Zusammenstoß zwischen zwei Teilchen. Gegebenenfalls können in einem
Reaktionsablauf mehrere bimolekulare Elementarschritte aufeinander folgen.
Trimolekulare Reaktionen, d.h. Reaktionen, bei denen im Elementarschritt drei Teilchen
gleichzeitig zusammenstoßen, sind außerordentlich selten.
Wie bereits betont, besteht kein einfacher Zusammenhang zwischen der makroskopisch
beobachteten Reaktionsordnung und der Molekularität einer Reaktion.

6.4 Temperaturabhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit


Die Geschwindigkeit chemischer Reaktionen ist in hohem Maße von der Temperatur abhängig.
Nach einer Faustregel führt eine Erhöhung der Temperatur um 10° zu einer Verdoppelung bis
Verdreifachung der Reaktionsgeschwindigkeit. Für reproduzierbare Messungen ist
dementsprechend die Konstanthaltung der Temperatur absolut unerlässlich. Genauer als
durch die oben genannte Faustregel wird die Temperaturabhängigkeit einer chemischen Reaktion
durch die sogenannte Arrheniusgleichung beschrieben:
 EA
RT
k  A e Gleichung 6-16

Dabei ist k die Geschwindigkeitskonstante, R die allgemeine Gaskonstante, T die absolute Tempera-
tur, EA die Aktivierungsenergie und A der Häufigkeitsfaktor (= maximal mögliche Geschwindig-
keitskonstante, die sich ergäbe, wenn jeder Zusammenstoß zu einer chemischen Umsetzung führen
würde).
Neben der Temperatur ist die Reaktionsgeschwindigkeit von zahlreichen anderen Faktoren
abhängig, z.B. von der Art des Lösungsmittels, der Beimengung von Verunreinigungen und in
manchen Fällen sogar von Form, Größe und Wandbeschaffenheit des Reaktionsgefäßes. Für
reproduzierbare Messungen, wie sie im physikalisch–chemischen Bereich gefordert werden müssen,
ist daher die sorgfältige Standardisierung aller Reaktionsbedingungen unerlässlich.

6.5 Alkalische Hydroxylierung von Kristallviolett



Kristallviolett (Abbildung 21, A) lagert in alkalischer Lösung ein OH –Ion an. Dabei entsteht die
farblose Substanz (B). Die Reaktion folgt einem Zeitgesetz 2. Ordnung.
dc A
  k  cA  c 2. Ordnung Gleichung 6-17
dt OH 

 k 'c A (k '  k  c ) 1. Ordnung Gleichung 6-18


OH –

Wählt man die Reaktionsbedingungen so, dass der eine Reaktionspartner (NaOH) in großem Über-
schuss eingesetzt wird im Vergleich zum Kristallviolett, so beobachtet man formal eine Reaktion 1.
Ordnung, da sich die Konzentration der NaOH während des Experiments nicht merklich ändert (s.
oben).
43

CH3
CH3 H3C
H3C N
H3C N N CH
3

Cl– CH
3
C N+ + NaOH C
CH3
OH

H3C N
H3C N
CH3
CH3

(A) (B)

Abbildung 21: Alkalische Hydroxylierung von Kristallviolett. (A) violette Form; (B) farblose Form.

Untersuchen Sie die Hydroxylierungsgeschwindigkeit für verschiedene NaOH–Konzentrationen.


Für die Messungen benutzen Sie das Photometer. Führen Sie zunächst die Eichung durch, wie im
Anhang beschrieben.

 Versuch: Abhängigkeit der Hydroxylierungsgeschwindigkeit von der NaOH–Konzen-


tration
Die Messungen zur Ermittlung der Abhängigkeit der Hydroxylierungsgeschwindigkeit von der
NaOH–Konzentration werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Achten Sie darauf, dass alle zu
den Messungen verwendeten Lösungen Raumtemperatur haben! Eichen Sie das Photometer nach
der Bedienungsanleitung bei 590 nm (Leerwert: entionisiertes H2O). Führen Sie die Messung wie
im Anhang „Bedienungsanleitung des Novaspec II – Photometers“ „Bedienungsanleitung des
Ultrospec 1000 – Photometers“ durch. Pipettieren Sie dazu in ein trockenes Reagenzglas exakt 5 ml
Kristallviolettlösung (Vollpipette!). Geben Sie dazu möglichst schnell exakt 5 ml von einer
angegebenen NaOH–Lösung (Vollpipette!) (für jede weitere Messung muss diese Pipette sauber und
trocken vorliegen) und mischen Sie schnell sehr gründlich durch. Anschließend schütten Sie rasch
einen Teil dieser Mischung in eine Küvette (luftblasenfrei, ca. 2/3 voll) und messen die
Zeitabhängigkeit der Extinktionsänderung bei 590 nm. Messen Sie die Zeitabhängigkeit (siehe
Kapitel 11.1.3 bzw. 11.2.3) der Extinktionsänderung für folgende NaOH–Konzentrationen:

Messung NaOH– Meßzeit Intervall


Konzentration
(Stammlösung)
1 20 mM für 30 s
2 40 mM alle 30 s
3 60 mM Ansätze 30 s
4 80 mM 7 min 15 s
5 Analysenprobe 15 s

Eichen Sie bitte vor jeder Messreihe das Photometer nach. Messprotokoll: wie weiter hinten
beschrieben.
44

Auswertung:
Zeichnen Sie für alle NaOH–Konzentrationen (inklusive der NaOH mit unbekannter Konzentration)
log cKristallviolett = f(t) und cKristallviolett = f(t) in jeweils 1 Diagramm (also 2 Diagramme mit jeweils 5
Kurven/Geraden)

Berechnen Sie durch graphische Extrapolation die Geschwindigkeitskonstante k' (min-1) für jede
NaOH–Konzentration nach der Gleichung

k' 

2 ,303  log c A,0  log c A  Gleichung 6-19
t

Zeichnen Sie außerdem k' = f (cNaOH). Theoretisch ergibt diese Darstellung eine Gerade. Mögliche
Abweichungen deuten auf eine geringfügige Änderung der Reaktionsordnung mit der Konzentration
der NaOH (exakte Gültigkeit des Zeitgesetzes 1. Ordnung = Idealfall, s. theoretischer Vorspann).
Berücksichtigen Sie diese eventuellen Abweichungen vom geraden Verlauf, indem Sie eine Aus-
gleichsgerade durch die einzelnen Punkte legen.
Bestimmen Sie aus dem Schaubild die Konzentration der unbekannten NaOH–Lösung.
Bestimmen Sie die Geschwindigkeitskonstante k [M-1min-1] der Hydroxylierung, wenn die Reaktion
nach 2. Ordnung verläuft.

BITTE TESTAT EINHOLEN

Meßprotokoll: Kinetik (Hydroxylierung von Kristallviolett)

Kristallviolett: c = E590  10,58  10-6 Mol l-1


E
(c  ; 590 = 9,45  104 l Mol-1cm-1; d = 1 cm)
εd

t [min] (steps) E590 c [µM] log c [µM]


wenn E < 0,020
Messreihe abbrechen

Grafik für jede NaOH Konzentration (Ordinateneinteilung):


y (log c): 1,1 bis -0,7 (0,1 E = 1 cm)
x (min): 0 bis 7 (1 Min. = 2 cm)
45

7 Esterbildung und Esterverseifung


Die Veresterung von Essigsäure mit Ethanol führt zu einem Gleichgewicht

O O
H3C C + C2H5OH H3C C + H2O
OH OC2H5

Essigsäure Ethanol Essigester

Abbildung 22: Gleichgewicht der Esterbildung und Esterverseifung.

Der Gleichgewichtszustand ist unabhängig davon, ob zu Beginn der Reaktion Essigsäure und
Ethanol oder Essigester und Wasser vorliegen. Hin– und Rückreaktion verlaufen spontan sehr lang-
sam, werden aber durch Protonenkatalyse erheblich beschleunigt. In vereinfachter Form kann man
die Verhältnisse wie folgt beschreiben:
Das empirische Geschwindigkeitsgesetz für die Hinreaktion lautet:
dc Essigsäure
  k1 c Essigsäurec Ethanol Gleichung 7-1
dt

Das empirische Geschwindigkeitsgesetz für die Rückreaktion lautet:


dc Ester
  k -1 c Ester cWasser Gleichung 7-2
dt

Im Gleichgewichtszustand gilt:
dc Essigsäure dc Ester
  Gleichung 7-3
dt dt

Damit ergibt sich anhand des Massenwirkungsgesetzes die Gleichgewichtskonstante einer Reaktion:
c Ester cWasser k1
 K Gleichung 7-4
c Essigsäurec Ethanol k 1

Die Kenntnis der Gleichgewichtskonstante erlaubt die Berechnung der freien


Standardreaktionsenthalpie G0 (Gibbs-Helmholtz-Beziehung):
G0   RT ln K Gleichung 10-4a
(R = allgemeine Gaskonstante = 8,314 [JK-1Mol-1]; T = absolute Temperatur [K])

Messen Sie die Geschwindigkeit der Hin– und Rückreaktion und die Gleichgewichtskonstante der
oben dargestellten Reaktion. Verfolgen Sie dazu durch wiederholte Titration die zeitliche Änderung
der Essigsäurekonzentration.

Für alle Versuche ist das Tragen von Schutzbrillen zwingend erforderlich!
46

 Versuch: Veresterung von Essigsäure (1. Gruppe)


Eine Mischung von genau 58 ml (1,0 Mol) Ethanol (100 ml Messzylinder), 66 ml Aceton (100 ml
Messzylinder) und 0,4 ml konzentrierter Schwefelsäure (1 ml Messpipette, mit Pipettierball; evt.
Vorher mit Wasser üben) wird nach Zugabe von 2–3 Siedesteinen in einem 250 ml Zweihalskolben
mit aufgesetztem Rückflusskühler mit einer elektrischen Heizhaube (Heizpilz) oder in einem Ölbad
(Aluminiumtopf) unter Rückflusskühlung zum Sieden erhitzt (s. Abbildung 23).

Schlaucholiven

Dimroth–Kühler

Laborthermometer
für Heizbadtemperatur

Heizbad (Öl als Wärmeüberträger)


Zweihals–Rundkolben
Siedesteine

©
LaboBib 0 U/m in
1500

Heizung
300 50 250
AN AN

100 500
o
C
200 150 AUS AUS 1000 750

Hebebühne

Abbildung 23: Reaktionsaufbau für Esterbildung und Esterverseifung.

Zur leicht siedenden Mischung gibt man nun mit Hilfe eines Trichters genau 57 ml (1,0 Mol)
konzentrierte Essigsäure, die man vorher in einem 200 ml Becherglas auf ca. 50 °C erwärmt hat (im
Abzug). Vorsicht! Schutzbrille! Die Zugabe der Essigsäure ist der Startpunkt der Reaktion. Bitte
notieren Sie sofort die Zeit. Nachdem man durch leichtes Schwenken des Stativs die
Reaktionslösung gut durchmischt hat, wird zur Messung der Anfangskonzentration eine erste Probe
(6–7 ml) entnommen. Dazu wird der Schliffstopfen am Zweihalskolben kurz entfernt und mit der 10
ml–Meßpipette und einem Pipettierball ca. 6–7 ml angesaugt (bitte nicht in den Pipettierball
saugen!) und die Probe in einem trockenen Reagenzglas sofort im Eiswasserbad abgekühlt.
Nach einigen Sekunden misst man nun mit einer trockenen 5 ml Vollpipette genau 5 ml ab,
überführt diese Menge in einen 100 ml Messkolben und füllt mit entionisiertem Wasser exakt auf
100 ml auf. Nachdem man den Messkolben gut umgeschüttelt hat, misst man nun mit einer
trockenen 10 ml Vollpipette genau 10 ml der verdünnten Probenlösung ab und titriert mit 0,1 N
Natronlauge nach Zugabe von 2–3 Tropfen Phenolphthaleinlösung bis zum Farbumschlag nach Rot.
Die weiteren Proben werden nach 15, 30, 45, 60, 80, 110, 140 Minuten der siedenden Reaktionslö-
sung entnommen und analog titriert (250 ml Erlenmeyerkolben).
Nach jeder Probenentnahme sind alle Pipetten mit entionisiertem Wasser und Aceton zu spülen und
an der Wasserstrahlpumpe trocken zusaugen. Der Messkolben und der Erlenmeyerkolben werden
sorgfältig mit entionisiertem Wasser ausgespült (brauchen nicht getrocknet zu werden).
47

 Versuch: Hydrolyse von Essigsäureethylester (2. Gruppe)


Die Esterhydrolyse wird von der zweiten Gruppe durchgeführt. Dazu wird die gleiche Apparatur
wie bei der Veresterung benutzt.
Man erhitzt eine Mischung von genau 98 ml (1,0 Mol) Essigsäureethylester, 65 ml Aceton und 1 ml
konzentrierte Schwefelsäure (1 ml Messpipette, Pipettierball; evt. Vorher mit Wasser üben), nach
Zugabe von 3–4 Siedesteinen im Zweihalskolben unter Rückflusskühlung (Wasserbad) und gibt zur
siedenden Mischung 18 ml (10 ml Messzylinder) entionisiertes Wasser, das vorher in einem 100 ml
Becherglas auf ca. 50 °C erwärmt wurde. Dies ist der Startpunkt der Reaktion. Die Proben werden
analog wie bei der Veresterungsreaktion gezogen und titriert. Alle Messergebnisse werden zwischen
beiden Gruppen ausgetauscht.
Zum Vortestat zeichnen Sie die zeitliche Änderung der Essigsäure-Konzentration (Mol l-1) für die
Hin- und Rückreaktion. Berechnen Sie aus den Gleichgewichtswerten die Gleichgewichts-
konstanten sowohl für die Veresterung, wie auch für die Hydrolyse.

BITTE TESTAT EINHOLEN

Auswertung (am selben Versuchstag noch durchführen):


 Rechnen Sie bitte von verbrauchten ml 0,1 N NaOH auf die Essigsäurekonzentration im
Reaktionskolben (Ansatz) um.
 Die von Ihnen durchgeführte Titration erfasst sowohl die Essigsäure als auch die zugefügte
Schwefelsäure, die bei der Reaktion als Katalysator notwendig ist und nicht verbraucht wird.
Um die Menge an unverbrauchter Essigsäure ermitteln zu können, müssen Sie das
Titrationsergebnis korrigieren.
 Achten Sie bei der Berechnung darauf, dass die Schwefelsäuremengen bei Veresterung und
Esterhydrolyse unterschiedlich sind. Eine größere Katalysatormenge bei der Esterhydrolyse ist
deshalb erforderlich, damit Hin– und Rückreaktion etwa innerhalb der gleichen Reaktionszeit
(vor allem innerhalb der Praktikumszeit) ablaufen. Ein Katalysator katalysiert zwar sowohl Hin-
als auch Rückreaktion, das heißt aber nicht, dass beide Reaktionen gleich schnell ablaufen. In
diesem Fall läuft die Esterhydrolyse unter sonst gleichen Bedingungen langsamer ab als die
Veresterung.
 Außerdem ist der Verdünnungsschritt zu berücksichtigen. 5 ml der Probe werden auf 100 ml
aufgefüllt. Von dieser verdünnten Lösung werden 10 ml titriert.

Veresterung:
Gesamtvolumen der Lösung = 181,4 ml
darin enthaltene Schwefelsäure = 0,4 ml

Hydrolyse:
Gesamtvolumen der Lösung = 182 ml
darin enthaltene Schwefelsäure = 1 ml

Dichte der konzentrierte Schwefelsäure = 1,84 g ml-1 (MW = 98,04 g Mol-1; Konzentration =
98 Gew.%)

Aus diesen Angaben kann man die Schwefelsäuremenge berechnen, die in jeder Titrationsprobe ent-
halten ist. Zur Berechnung siehe unten.
48

 Fertigen Sie eine Tabelle an, in die Sie den Verbrauch an 0,1 N NaOH für CH3COOH + H2SO4
(ml), den Verbrauch an 0,1 N NaOH für CH3COOH ohne H2SO4 (ml) sowie die in der Reak-
tionslösung jeweils herrschende Essigsäurekonzentration in Mol l-1 eintragen.
 Zeichnen Sie die Essigsäurekonzentration (Mol l-1) als Funktion der Zeit (Minuten). (Maßstab:
Abszisse: 10 Minuten = 1 cm; Ordinate: 1 Mol l-1 = 4 cm; DIN A4 für hoch)
 Berechnen Sie die Gleichgewichtskonstante.
 Aus der Essigsäurekonzentration im Gleichgewichtszustand und der Menge der Edukte sind
sämtliche Gleichgewichtskonzentrationen leicht zu berechnen.

BITTE AUSARBEITUNG FÜR TESTAT VORLEGEN!

Berechnung der Essigsäurekonzentration im Reaktionsansatz

HAc ANS  HAc MK Gleichung 7-5


VF

 
HAc MK 
VNaOH,kor NaOH
Gleichung 7-6
V

ANS  Ansatz
MK  Meßkolben
VF  Verdünnungsfaktor

VNaOH,kor  VNaOH,total  VNaOH, H 2 SO4 Gleichung 7-7

gegeben sind folgende Parameter:

VF = 0,05

[NaOH] = 0,1 M

V = 10 ml

V NaOH,totalV NaOH,H2 SO4 ml  0,1M 


HAc ANS   
 VNaOH,totalVNaOH,H2 SO4  0 ,2  M  Gleichung 7-8
5  10
2
 10 ml 

NaOH–Verbrauch, bedingt durch H2SO4 im Reaktionsansatz (Korrektur der Essigsäuretitra-


tion):

Veresterung

0,4 ml konzentrierte H2SO4 in 181,4 ml Ansatz

H 2 SO4 ANS V ml   ρ g/ml   %Konz.g/ 100 g  Gleichung 7-9


MW g/Mol   V ANS l 

gegeben ist:  = 1,84 g/ml; Konz. = 98 %; MW = 98,04 g/Mol


49

g
0 ,4ml  1,84  0 ,98
H 2 SO4 ANS  ml  0 ,0406M Gleichung 7-10
g
98,04  0 ,1814 l
Mol

H 2 SO4 MK  H 2 SO4 ANS  VF  0,0406M  0,05  2,028  10 3 M Gleichung 7-11

mit VF  0,05

Unter Berücksichtigung der Zweibasigkeit von H2SO4:


2V  H 2 SO4MK
VNaOH,H2 SO4  Gleichung 7-12
NaOH 
mit V  10ml

und NaOH  0,1M
3
2  10ml  2 ,028  10 M
VNaOH,H2 SO4   0 ,406ml Gleichung 7-13
0 ,1M

Hydrolyse
1 ml konzentrierte H2SO4 in 182,0 ml Ansatz (Berechnung [H2SO4] ANS wie vorher)
g
1,0 ml  1,84  0 ,98
H 2 SO4 ANS  g
ml  0 ,101M Gleichung 7-14
98,04  0 ,182 l
Mol

H 2 SO4 MK  5,053  10 3 M (Berechnung von H 2 SO4 MK wie vorher) Gleichung 7-15

V  1,01ml (Berechnung vo n V wie vorher) Gleichung 7-16


NaOH,H2 SO4 NaOH,H2 SO4

7.1 Quantitative organisch–chemische Analyse

Die quantitative Erfassung der Elementzusammensetzung von organischen Stoffen leistet die orga-
nische Elementaranalyse, die durch Verbrennung der organischen Substanz mit O2 oder anderen
Oxidationsmitteln zu CO2, H2O und N2 den Gehalt der Probe an Kohlenstoff, Wasserstoff und
Stickstoff liefert. Man kann so die Bruttozusammensetzung eines Reinstoffes, oder bei bekannter
Summenformel seine Reinheit bestimmen.
Wesentlich schwieriger noch ist die quantitative Analyse von Substanzklassen oder funktionellen
Gruppen. Für die in der Biochemie äußerst wichtige Bestimmung des Proteingehaltes einer Probe
wurden beispielsweise Dutzende von Verfahren ausgearbeitet (Lowry, Bradford, Petersen etc.), die
alle zwar eine spezifische Reaktion der Proteine zur Grundlage haben, aber dennoch empirisch
anhand von bekannten Proben geeicht werden müssen. Der Grund liegt in der Komplexität der Kon-
stitution organischer Moleküle, so dass eine mit einem Satz von Proben quantitativ ablaufende
Reaktion mit anderen Verbindungen aufgrund der gegenseitigen Beeinflussung funktioneller
Gruppen (Nachbargruppeneffekte) oder dem Auftreten von Nebenreaktionen nur geringe Umsätze
bringen mag. Vielfach sind deshalb instrumentelle Bestimmungsmethoden an die Stelle von
quantitativen chemischen Verfahren getreten. Diese werden heute nur noch angewandt, wenn sie
50

eindeutig verlaufen, leicht durchzuführen sind und zuverlässige Ergebnisse liefern. Ein Beispiel
hierfür ist die Äquivalentgewichts–Bestimmung eines Esters.
Carbonsäureester können durch Wasser in ihre Bestandteile Carbonsäure und Alkohol zerlegt
(hydrolysiert) werden. Die Hydrolyse lässt sich durch Säuren oder Basen beschleunigen. Bei
Anwendung von wässrigem Alkali findet eine quantitative stöchiometrische Umsetzung gemäß

O O
R C + OH– R C + R' OH
OR' O–


statt. 1 Mol Ester verbraucht also 1 Mol OH . Wenn man die Esterspaltung in Gegenwart eines
Basenüberschusses durchführt, kann man nach vollständiger Reaktion aus der Estereinwaage und
dem Basenverbrauch das Äquivalentgewicht des Esters erhalten.

Die in der Natur weit verbreiteten Fette sind konstitutionell Ester des dreiwertigen Alkohols
Glycerin mit langkettigen Carbonsäuren (sog. Fettsäuren). Meist sind alle 3 Hydroxyfunktionen des
Glycerins verestert (Triglyceride), wobei die Kette der einzelnen Carbonsäuren 14–22 C–Atome
lang sein kann und auch häufig Doppelbindungen enthält. Die alkalische Esterspaltung der Fette
liefert die Alkalisalze der Fettsäuren (sog. Seifen, daher der Ausdruck "Verseifung" für Hydrolyse).
Die Menge der dabei verbrauchten Base (mg KOH/g Fett = Verseifungszahl) gibt einen
Anhaltspunkt für die mittlere Molmasse des Triglycerids und damit für den Gehalt an langkettigen
Fettsäuren.

 Versuch: Bestimmung des Äquivalentgewichts eines Esters (Verseifungszahl)


Darstellung der Reagenzlösung
2 g KOH werden in 10 ml Diethylenglykol (Messzylinder) in einem 50 ml Schliffkolben heiß gelöst
(Ölbad nicht über 130 °C erwärmen), wieder abgekühlt und mit 24 ml Diethylenglykol verdünnt,
gut gemischt (zu einer homogenen Lösung) und mit einem Gummistopfen gut verschlossen.

Hydrolyse
Man bringt genau 10 ml (Vollpipette) der vorher hergestellten Lauge in einen 100 ml Schliffkolben,
fügt 8 ml der vom Assistenten ausgegebenen Esterlösung (= 0,5 g eines Diethylesters) zu und setzt
einen gefetteten Schliffkühler mit einem Ätznatronrohr (zum Ausschluss von CO2; Erklärung!) auf.
Die Mischung wird unter gelegentlichen vorsichtigen Schwenken im Ölbad für 40 min auf 120–130
°C erhitzt. Man lässt den Kolben unter 80 °C abkühlen, spült Alkalireste im Kühler mit ca. 20 ml
entionisiertem Wasser in die Mischung, überführt den gesamten Kolbeninhalt vollständig
(Nachspülen mit Wasser) in einen 300 ml Weithals–Erlenmeyerkolben und titriert die nicht
verbrauchte Base mit 0,5 N Salzsäure (Maßlösung!) gegen Phenolphthalein. Ca. 1 ml der
ausstehenden Indikatorlösung (0,1 % in Ethanol) verwenden. Umschlag von Purpurrot nach farblos
(bzw. leicht gelblich aus der ursprünglich gefärbten Laugenlösung). Säureverbrauch notieren =
VHydr.
In der gleichen (!!) Weise führt man eine Blindbestimmung durch, bei der anstatt des Esters 8 ml
Diethylenglykol zugegeben werden. Säureverbrauch notieren = VBlind.
Berechnung:
E  1000
x Gleichung 7.1-1
V  N
51

mit
x  Äquivalentgewicht des Esters (g/Val)
E  Einwaage des Esters (in g)
V  Differenzv erbrauch an Säure
 VBlind  V Hydr ( ml )
N  Normalität der Säurelösung (Val/l)

Für die verwendete HCl (einprotonige Säure) ist die Normalität (Einheit N) identisch mit der
Molarität (Einheit M).

Wie hoch ist die Molmasse des Diethylesters (d.h. eines Esters aufgebaut mit einer zweiprotonigen
Säure)? Machen Sie einen Strukturvorschlag für den Diester aufgrund des bestimmten
Äquivalentgewichts bzw. seiner Molmasse.

Struktur von Diethylenglycol: (geht nicht in die Reaktion


ein! Warum?)

BITTE TESTAT EINHOLEN


52

8 Enzymatische Hydrolyse eines organischen Phosphorsäureesters


Ermitteln Sie die Reaktionsgeschwindigkeit für die enzymkatalysierte Hydrolyse eines organischen
Phosphorsäureesters mit alkalischer Phosphatase bekannter Aktivität unter den angegebenen
Versuchsbedingungen und bestimmen Sie anhand dieser Messung die Phosphatase–Aktivität in
einer Analysenlösung.
Die Geschwindigkeit aller enzymatischen Reaktionen ist stark vom pH–Wert abhängig. Das pH–
Optimum der alkalischen Phosphatase liegt bei einem pH–Wert von 9–10,6. Das Enzym benötigt
Magnesiumionen und Zinkionen als Cofaktoren. Alkalische Phosphatase hydrolysiert eine Vielzahl
von organischen Phosphorsäureestern.
Als Substrat wird häufig Phenolphthaleinmonophosphat verwendet. Die Verbindung wird durch
alkalische Phosphatase in freies Phenolphthalein und Phosphat überführt. Alternativ kann para-
Nitrophenolphosphat als Substrat eingesetzt werden, das durch alkalische Phosphatase in das gelbe
para-Nitrophenolat und Phosphat umgesetzt wird.

O– O–

alkalische
O Phosphatase

C O P O C
O O – + OH–, - HPO42–
C
C O

O O O

Phenolphthalein–Phosphat Phenolphthalein
farblos rot

Abbildung 24: Chemische Struktur von Phenolphthaleinmonophosphat und Phenolphthalein

Aufgabe: Stellen Sie die entsprechende Reaktionsgleichung für die Umsetzung von Para-
Nitrophenolphosphat in vollständigen Strukturformeln auf.

Beim alkalischen pH–Wert unserer Reaktionslösung ist Phenolphthalein intensiv rot gefärbt,
während der Phosphorsäureester farblos erscheint. Aus messtechnischen Gründen ist allgemein
üblich, die Aktivität der Phosphatase nicht mit einem natürlich vorkommenden Substrat, sondern
mit einem chromogenen Substrat vom Typ des Phenolphthaleinphosphats oder des p-Nitro-
phenylphosphats zu ermitteln.

O
O2N O P O–
O–

p–Nitrophenylphosphat

Abbildung 25: Chemische Struktur von p–Nitrophenylphosphat


53

Bei unserem Versuch benützen wir eine hohe Substratkonzentration, sodass die Reaktionsgeschwin-
digkeit während der Reaktion konstant bleibt. Dadurch erreichen wir, dass die Umsetzung nach
einem Zeitgesetz 0. Ordnung abläuft und die Beziehung

RG  
 k
d A
Gleichung 8-1
dt

gilt (vgl. Kapitel 6).

8.1 Enzymatische Hydrolyse eines organischen Phosphorsäureesters

Versuch 1: Bestimmung des molaren Extinktionskoeffizienten ε von para-Nitro-Phenolat

Um die Reaktionsgeschwindigkeit eines Enzyms zu ermitteln, eignet sich die kontinuierliche


Verfolgung (Aufzeichnung) der Farbänderung eines Substrats sehr gut.
Indem man die Zunahme der Farbintensität im Photometer verfolgt, die durch die
Konzentrationszunahme des Reaktionsprodukts in der Küvette bewirkt wird, und diese
Konzentrationszunahme wiederum durch die Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms verursacht
wird, kann aus der Zunahme der Farbintensität direkt auf die Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms
zurückgeschlossen werden. Der Zusammenhang zwischen der Farbintensität und der Konzentration
des Substratprodukts wird durch das Lambert-Beersche-Gesetz hergestellt.

Lambert-Beersches-Gesetz: ΔE = ε x c x d
ΔE = Extinktionswert, wird vom Photometer angezeigt
ε = molarer Extinktionskoeffizient, muss für jedes Substrat bestimmt werden
c = Konzentration des Substratprodukts in der Küvette
d = Schichtdicke der Küvette = Wegstrecke, die das Licht bis zur Photozelle zurücklegt

Vor Beginn der Aktivitätsmessung müssen sie zunächst den molaren Extinktionkoeffizienten des
Substratprodukts para-Nitrophenolat (p-NP) bestimmen. p-Nitrophenolat entsteht bei der
Dephosphorylierung von para-Nitrophenol-monophosphat durch das Enzym Alkalische
Phosphatase.

1. Stellen sie sich zunächst aus der 1M Natronlauge (Vorsicht! Stark ätzend! Handschuhe und
Schutzbrille benutzen), steht auf den Seitentischen, 200 mL einer 20 mM Natronlauge her, indem
sie 4 mL der 1 M Natronlauge mit 196 mL H2Oention. mischen. Messzylinder und Becherglas
benutzen.

2. Fertigen sie dann aus der 1 millimolaren Lösung von p-Nitrophenol und der 20 millimolaren
NaOH-Lösung. eine 0.01 millimolare Lösung von p-Nitrophenol an (1 ml der 1 mM Lösung im
Messkolben auf genau 100 mL mit 20 mM NaOH auffüllen). Lösung gut mischen.

3. Stellen sie sich 10 Reagensgläser bereit und stellen sie folgende Verdünnungen her:
1 mL 0.01 mM p-NP-Lsg. + 9 mL 20 mM NaOH = 0.001 mM = 1 μM p-NP-Lösung
2 mL 0.01 mM p-NP-Lsg. + 8 mL 20 mM NaOH = 0.002 mM = 2 μM p-NP-Lösung
3 mL 0.01 mM p-NP-Lsg. + 7 mL 20 mM NaOH = 0.003 mM = 3 μM p-NP-Lösung
usw. bis zur 10. Lösung = unverdünnte 0.01 mM p-NP = 10 μM p-NP-Lösung

3. Decken sie jedes Reagensglas mit einem Parafilm ab, und durchmischen sie die Lösung gut
54

indem sie sie etliche Male auf den Kopf stellen, Parafilm dabei mit dem Daumen gut festhalten!
4. Stellen sie am Photometer die Wellenlänge 410 nm (Siehe Versuch 4, Ermittlung des
Absorptionsmaximums) ein und gleichen sie das Gerät mit 20 mM NaOH auf Null ab.
5. Messen sie nun den Extinktionswert aller 10 Lösungen in jeweils ungebrauchten Küvetten mit
einer Schichtdicke von 1 cm. Fertigen sie eine Tabelle mit Spalten für die Konzentrationswerte, die
jeweiligen Extinktionswerte und die zu berechnenden molaren Extinktionskoeffizienten-Werte an.
Berechnen sie für jede Konzentration den ε-Wert. Tragen sie zusätzlich die Extinktionswerte als
Funktion der Konzentrationen von p-NP in ein Diagramm ein. Legen sie eine Ausgleichsgerade
durch alle Punkte, die Mehrzahl der eingetragenen Punkte sollten auf dieser Gerade legen. Punkte
im oberen Konzentrationsbereich, die zu sehr von der Geraden abweichen nicht berücksichtigen.
Der molare Extinktionskoeffizient von p-Nitrophenol ist die Steigung dieser Geraden.
Bilden sie zusätzlich den Durchschnittswert aller ε-Werte und vergleichen sie diesen Wert mit der
Steigung ihrer Ausgleichsgeraden. Die Werte werden vermutlich etwas voneinander abweichen, was
auch auf die nur relativ genaue Einpassung der Ausgleichsgeraden durch alle Messwerte
zurückzuführen ist.
6. Berechnen sie den Umrechnungsfaktor von der Änderung der Extinktion pro Minute auf die
Enzymaktivität = Stoffmengenumsatz pro Minute, indem sie das Volumen ihrer Reaktionsmischung
= 8 mL durch den ermittelten Durchschnittswert von ε und der Schichtdicke von 1 cm teilen.
Fertigen sie dann die Kinetiken der Enzymstandard-Lösung und ihrer Enzym-Analysenlösung an
und berechnen sie mit Hilfe des Umrechnungsfaktors die Enzymaktivität der alkalischen
Phosphatase sowie die Teilaktivität ihrer Enzym-Analysenlösung. Geben sie die Teilaktivität ihrer
Analysenlösung in Prozent an.

 Versuch 2: Reaktionsgeschwindigkeit der alkalische Phosphatase


Sie erhalten eine Phosphatase–Standardlösung (= 100 %) und eine verdünnte Lösung als Analyse.
Ziel ist es, durch Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität (U/ml) die prozentuale Verdünnung
Ihrer Analyse zu ermitteln. Der Ablauf der Reaktion wird photometrisch verfolgt. Stellen Sie die
Wellenlänge am Photometer auf 410 nm ein und eichen Sie das Photometer mit entionisiertem H2O
wie im Anhang beschrieben. Bereiten Sie das Photometer für eine 30 s Kinetik vor.

In ein Reagenzglas geben Sie jetzt der Reihe nach (alle Lösungen müssen Raumtemperatur
besitzen):

 5 ml Reaktionspuffer (0,1 M Glycin, 1 mM Zn2+, 0,1 mM Mg2+; pH = 10,6) (5 ml Vollpipette)


 2 ml ca. 1 mM para-Nitrophenolphosphat (2 ml Vollpipette)
 1 ml Enzymstandardlösung (1 ml Vollpipette)

Mischen Sie sehr gründlich und rasch den Inhalt des Reagenzglases durch Umschütteln und füllen
Sie damit eine Photometerküvette ca. 2/3 voll. Setzen Sie sofort die Küvette in das Photometer ein.
Starten Sie Ihre Messung durch Drücken der entsprechenden Funktionstaste und bestimmen Sie die
Extinktion alle 30 Sekunden bis der Extinktionswert von 1,0 erreicht ist bzw. 7 Min. vergangen
sind. Zeichnen Sie die Extinktion als Funktion der Zeit.
(Abszisse: Zeit; 1 min. = 2 cm; Ordinate: Extinktion; 0,1 E = 2 cm; DIN A4 für hoch)

Führen Sie anschließend genau denselben Versuch mit Ihrer Analysenlösung aus. Zeichnen Sie
ebenfalls die Extinktion als Funktion der Zeit.
Ermitteln Sie bei beiden Graphiken die Steigung m (E min-1) der erhaltenen Geraden in ihrem
linearen Bereich und errechnen Sie daraus die beiden Phosphatase-Aktivitäten. Die Phosphatase-
55

Aktivität ist proportional zur Reaktionsgeschwindigkeit.


Berechnung der Enzymaktivität U (µMol min-1) im Reaktionsansatz aus der experimentell ermittel-
ten Steigung (E min-1) (hierzu verwenden Sie den oben bestimmten Wert für den
Extinktionskoeffizienten von para-Nitrophenolat):

U 
dc
dt
 
v  m E 
v
min ε  d
Gleichung 8-2

dc 1 1
 Reaktionsgeschwindigkeit ( μMol  ml  min ) Gleichung 8-3
dt

wobei
v = Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes = 8 ml
und
d = Schichtdicke = 1 cm

Formulieren Sie die Enzymaktivität Ihrer Analyse relativ zu der der Standardlösung als Prozentwert.

BITTE TESTAT EINHOLEN

Die Aktivität der alkalischen Phosphatase im Serum gesunder Erwachsener beträgt 4–17 Units/100
ml Serum. Die alkalische Phosphatase ist bei bestimmten Knochenerkrankungen, z.B.
Skelettmetastasen von Tumoren erhöht.
56

9 Reversible Konkurrenzreaktionen: Simultan–Gleichgewichte

Ein Gemisch miteinander reaktionsfähiger organischer Stoffe besitzt im Allgemeinen mehrere


alternative Wege, auf denen es zu stabileren Produkten abreagieren kann. Vielfach laufen die
einzelnen Konkurrenzreaktionen zwar parallel, jedoch mit deutlich unterschiedlichen
Geschwindigkeiten ab, so dass es von der Reaktionsführung abhängt, welches Produkt letztlich
isoliert wird. Werden Bedingungen angewendet, die die Rückreaktion der zunächst gebildeten
Produkte zu den Startverbindungen nicht zulassen, wird man das Produkt in hoher Ausbeute
isolieren, das sich am schnellsten bildet. Man sagt dann, die Reaktion befindet sich unter kinetischer
Kontrolle und nennt das bevorzugte Produkt das kinetische Produkt. Wenn man umgekehrt der
Reaktionsmischung ausreichend Zeit lässt, um alle Gleichgewichte von Hin- und Rückreaktionen
tatsächlich einzustellen, wird man in der Hauptsache das Produkt mit dem geringsten Energiegehalt,
das thermodynamische Produkt, erhalten. Das Energiediagramm (vgl. Abbildung 27) verdeutlicht
diese Verhältnisse für die verzweigten Reaktionen des u. g. Schemas, wobei die Länge der Pfeile die
Geschwindigkeit der einzelnen Schritte bzw. ihr Längenverhältnis das Gleichgewicht der jeweiligen
Reaktion wiedergibt.

P1
k1
k –1

R + (E1 bzw. E2)


k –2
k2
P2

Abbildung 26: Reversible Konkurrenzreaktion

P ist das kinetische Produkt, da


1
k  k bzw. G  1  G  2
1 2  

P2 ist das thermodynamische Produkt, da


k1 k
 K 1  2  K 2 bzw.  R G (1)   R G (2)
k –1 k –2

mit
G   freie Aktivierungsenthalphie
 R G  freie Reaktionsenthalpie
57

G (2)

G (1) G (1) G (2)

RG (1)
RG (2)

Reaktionskoordinate

___
Abbildung 27: Energiediagramm einer verzweigten Konkurrenzreaktion. Kinetische Kontrolle ( ), thermodynamische
Kontrolle (.......).

Thermodynamische Produkte werden bei hohen Reaktionstemperaturen (beschleunigt Hin- und


Rückreaktion gleichermaßen) und langen Reaktionszeiten zu beobachten sein. Kinetische
Bedingungen erfordern dagegen niedrige Temperaturen (bis –75 °C) und vor allem kurze
Reaktionszeiten. Als Modell für den vorgestellten Sachverhalt betrachten wir die
Konkurrenzreaktion zweier Carbonylverbindungen (E1 und E2) mit dem Reagenz Semicarbazid (R)
zu den entsprechenden Semicarbazonen (P1 und P2) (s. Abbildung 28).

H H H H
H H H H
H – H2O H
O + H2N NH C NH2 N NH C NH2
H + H2O H
O O
H H H H
H H H H

Cyclohexanon Semicarbazid Cyclohexanonsemicarbazon

H H H H
– H2O
+ H2N NH C NH2
C O + H2O C N NH C NH2
H O O H O
H H O

Furfural Semicarbazid Furfuralsemicarbazon

Abbildung 28: Reaktion von Cyclohexanon und Furfural mit Semicarbazid


58

 Versuch: Identifizierung des kinetischen bzw. thermodynamischen Produkts der


Reaktion von Semicarbazid mit Furfural bzw. Cyclohexanon
Reagenzlösung: 2,2 g (30 mmol) Semicarbazid Hydrochlorid und 4,4 g K2HPO4 (wasserfrei)
werden in 45 ml Wasser gelöst und mit 5 ml Ethanol gemischt.

Eduktlösung: In einem Becherglas werden 3,1 ml (30 mmol) Cyclohexanon, 2,5 ml (30 mmol)
frisch destilliertes Furfural und 15 ml Ethanol gemischt und zu 3 gleichen Teilen auf Reagenzgläser
aufgeteilt (mit Messpipette dosieren).
Mit diesen Lösungen werden folgende Versuche durchgeführt:

a) 25 ml Reagenzlösung (enthält ca. 15 mmol Semicarbazid) werden in einem Rundkolben mit


aufgesetztem Kühler und Siedesteinchen im Ölbad auf 80 – 90 °C (Ölbadtemperatur: ca. 120
°C) erwärmt. Eines der Reagenzgläser mit Eduktlösung (enthält ca. 10 mmol je
Carbonylverbindung) wird nach Zugabe eines Siedesteinchens ebenfalls im Ölbad erwärmt.
Wenn die Eduktlösung leicht siedet, lüftet man den Kühler und gießt sie in den Rundkolben.
Die Mischung wird mindestens weitere 15 Minuten am Rückfluss gekocht, dann auf
Raumtemperatur und schließlich in Eis gekühlt. Man filtriert den entstandenen Niederschlag
auf einem Hirschtrichter ab, wäscht 3 x mit je ca. 3 ml kaltem Wasser nach und saugt
möglichst trocken. Die Kristalle werden im Trockenschrank bei 50 °C getrocknet und der
Schmelzpunkt bestimmt (Produkt A).

b) 25 ml Reagenzlösung im Erlenmeyerkolben sowie das zweite Reagenzglas mit Eduktlösung


werden separat unter gelegentlichem Umschwenken für mindestens 20 Minuten in
Eiswasser gekühlt. Dann gießt man die Eduktlösung schnell zur kalten Reagenzlösung im
Erlenmeyerkolben und lässt 5 Minuten absitzen. Die abgeschiedenen Kristalle werden wie
unter a) beschrieben gesammelt, getrocknet und ihr Schmelzpunkt bestimmt (Produkt B).

c) 0,3 g Produkt A werden mit 10 ml Wasser und der Hälfte der Eduktlösung des dritten
Reagenzglases in einem Rundkolben mit aufgesetztem Kühler im Ölbad 5 Minuten auf ca.
90 °C erwärmt. Die Kristalle werden wie beschrieben gesammelt und ihr Schmelzpunkt
bestimmt (Produkt C).

d) Dieselbe Operationsfolge wie bei c) wird mit dem Produkt B und der zweiten Hälfte der
verbliebenen Eduktlösung durchgezogen (Produkt D).

Durch Vergleich der Schmelzpunkte der Produkte mit den Angaben in der Einleitung soll
entschieden werden, welche Semicarbazidreaktionen zum thermodynamischen bzw. kinetischen
Produkt führen. Formulieren Sie den Reaktionsmechanismus, besonders den Einfluss des pH-
Wertes und versuchen Sie eine Erklärung für die beobachteten Stabilitäten/Bildungsraten der Semi-
carbazone zu finden.

Schmelzpunkte: Furfuralsemicarbazon 197 °C; Cyclohexanonsemicarbazon 166 °C.

BITTE TESTAT EINHOLEN


59

10 NMR und GC/MS-Spektrometrie


Zielsetzung:
Ziel dieses Versuchs ist es, Dipeptide anhand von NMR- und MS-Spektren zu identifizieren und
deren Struktur (Identität der beiden Aminosäuren im Dipeptid, sowie deren Sequenz) zu ermitteln.
Sie sollten in diesem Versuch lernen, grundlegende NMR- und MS-Parameter (chemische
Verschiebung, skalare Kopplung, Signalintensität, Fragmentierung, Masse) anzuwenden.
Die NMR- und Massenspektren erhalten sie als Ausdruck. In die Theorie der NMR und der MS-
Spektrometrie werden Sie im Rahmen eines Seminars eingeführt. Die Besprechung und Auswertung
der Daten erfolgt über mehrere Kurstage. Wenden Sie sich dazu an Ihre Assistenten.

NMR Spektroskopie
Atome mit einem Kernspin (z.B. 1H, 13C) absorbieren in Gegenwart eines Magnetfelds Energie im
Radiofrequenzbereich. Dieses Phänomen der Kernspinresonanz ist die Grundlage der NMR-
Spektroskopie, einer der wichtigsten Methoden zur Aufklärung der Struktur von Stoffen. Die
physikalischen Grundlagen der NMR-Spektroskopie entnehmen Sie den einschlägigen Lehrbüchern.
Als Anwender wird man mit mehreren NMR-Parametern konfrontiert, die Informationen zur
Struktur liefern (chemische Verschiebung, skalare Kopplung, Signalintensität, dipolare
Wechselwirkung, NOE). In den letzten 20 Jahren war die NMR-Spektroskopie einer stürmischen
Weiterentwicklung unterworfen, die sich in einer Vielzahl von neuen experimentellen Techniken
und wesentlich weiterentwickelten NMR-Geräten mit hoher Feldstärke ausdrückt. Ein großer Teil
dieser Entwicklung wurde durch mehrdimensionale Messverfahren ausgelöst, die es im
Zusammenhang mit moderner Computertechnologie erlauben, die Struktur von komplexen
organischen Molekülen, bis hin zu Proteinen aufzuklären.

Gaschromatographie-Massenspektrometrie
Die Gaschromatographie ist eine Verteilungschromatographie, die nur für gasförmige oder
verdampfbare, stabile Komponenten zugängig ist. Hierzu ist oft eine Derivatisierung von ansonsten
nicht flüchtigen Verbindungen notwendig. Als mobile Phase dient ein Inertgas (meist Helium),
stationäre Phasen sind oft Polyorganosiloxane (z.B. 5% Phenyl-/ 95% Dimethylsiloxan) in
kapillarartigen, gewickelten Säulen aus beschichtetem Quarzglas (in der Regel mehrere Meter lang).
Abhängig von Polarität und Größe der zu untersuchenden Moleküle adsorbieren diese
unterschiedlich lange an der Säule und werden dadurch getrennt. Gaschromatographie ist häufig
mit der Massenspektrometrie gekoppelt. Am Eingang des Massenspektometers werden die
flüchtigen Komponenten ionisiert (z.B. durch Elektronenstoßionisation (EI) M + e-  M+ • + 2e- ).
Im Inneren des Massenspektrometers werden die Ionen dann nach Massenzahl bzw. Verhältnis
Masse (m) zu Ladung (z) getrennt (m/z). Die Ladung ist nahezu immer 1, m/z kann deswegen mit
der Masse in der Regel gleichgesetzt werden. Ein Massenspektrum zeigt dann die Auftrennung der
einzelnen Ionen im elektrischen oder magnetischen Feld. Als Detektor dient oft ein kontinuierlicher
Sekundär-ionenvervielfacher (SEV).

Physikalische Methoden zur Aufklärung der Struktur von Proteinen und Peptiden
Die Ermittlung der Raumstruktur von Biomolekülen ist heute eines der aktuellsten
Forschungsgebiete der Biowissenschaften. Im Wesentlichen liefern vier unabhängige physikalische
Methoden Informationen zur Raumstruktur von Proteinen:

1. Die Elektronenmikroskopie an mit Metallen bedampften oder beschatteten Gefrier-


bruchpräparaten kann Informationen über die Topologie (z.B. Symmetrie) und die Topochemie der
60

Oberfläche (z.B. Polarität) des Proteinmoleküls im Kristallgitter liefern.

2. Die analytische Ultrazentrifugation liefert Informationen zur Quartärstruktur des nativen


Proteins in Lösung (z.B. Monomer oder Dimer).

3. Die Röntgenstrukturanalyse an Proteinkristallen kann die Raumstruktur mit hoher Auflösung


(bis auf wenige Å) liefern. Die meisten bekannten Proteinstrukturen wurden durch
Röntgenstrukturanalyse gelöst, wobei die Messung an Proteinkristallen erfolgt. Die Kristallbildung
von Proteinen ist häufig schwierig und zeitaufwendig.

4. Die Raumstruktur von Proteinen in Lösung kann durch die NMR-Spektroskopie analysiert
werden. Durch geeignete NMR-Experimente (i.A. mehrdimensional) können Abstände von
Wasserstoffatomen in einem Protein (über sog. NOE-Effekte), sowie Diederwinkel des
Proteingerüstes (über Kopplungskonstanten und die Karplus-Beziehung) ermittelt werden. In
Kombination mit Rechenverfahren (molecular dynamics) kann dann die Lösungsstruktur des
Proteins mit hoher Auflösung (bis auf wenige Å) bestimmt werden. Die NMR-Analyse ist in der
Regel beschränkt auf in Lösung stabile Proteine mit kleinem, bzw. mittlerem Molekulargewicht (bis
ca. 100 kDa).
Die Voraussetzung der Ermittlung von Strukturinformation aus NMR-Spektren ist eine gesicherte
Zuordnung der NMR-Signale auf Atompositionen im Protein. Die NMR-Analyse eines Proteins
oder Peptids beginnt daher in der Regel mit der Zuordnung der 1H-NMR Signale.

5. In der Proteinanalytik haben sich massenspektrometrische Techniken in den letzten Jahren zu


einem wertvollen Instrument entwickelt mit dem Proteine identifiziert werden können. Bei
Proteinen benötigt man sehr schonende Ionisierungsverfahren wie z.B. matrix assisted laser
desorption (MALDI) oder Elektrospray Ionisierung.
Massenanalysatoren funktionieren nach verschiedenen Prinzipien. Bei Flugzeitanalysatoren (TOF =
time of flight) werden Proteine beschleunigt und im Hochvakuum über eine Strecke von 1 bis 3 m
geschickt. Über die Flugzeit kann die exakte Masse bestimmt werden. In der Ionenfalle (ziemlich
klein ~10 cm) werden die ionisierten Proteine gesammelt und nach Ihrer Masse sortiert wieder
ausgeworfen. Ein Quadrupolmassenanalysator besteht aus 4 diagonal angeordneten Magneten, die
an eine Gleichspannungsquelle angeschlossen sind. Hochfrequenzspannung ist zwischen den beiden
Magnetpaaren 180° Phasen-verschoben. Bei dem Durchlauf der Ionen werden Spannung und
Frequenz geändert, so dass Ionen mit gleicher Masse über eine bestimmte Bahn den Detektor
erreichen. Die anderen werden in die Stäbe abgeleitet (erreichen den Detektor nicht).

Verschiedene Konformationen desselben Proteins haben zwar die gleiche Masse, aber durch die
verschiedenen elektrischen Ladungen, die sie während des Ionisierungsprozesses aufnehmen,
können sie voneinander getrennt werden. Zum Beispiel. werden kompakte Moleküle weniger stark
geladen als lang-gestreckte Moleküle, deswegen kann der Faltungsprozess eines Proteins mittels
Messung stationärer oder transienter Zustände verfolgt werden.
Auch über die Masse allein kann eine Untersuchung der Konformation erfolgen. Hierfür werden
Proteine in Deuteriumoxid gelöst. Außen liegende Protonen können ausgetauscht werden, die
Austauschgeschwindigkeit ist von der Konformation abhängig.
61

 Versuch: Strukturbestimmung eines Dipeptids mittels NMR


Im Rahmen des Praktikums wird zunächst das eindimensionale 1H-NMR Spektrum eines
unbekannten Dipeptids analysiert. Die einzelnen Signale bzw. Signalgruppen sollen mit den
chemischen Verschiebungen von freien Aminosäuren (Tabelle) verglichen und soweit als möglich
zugeordnet werden. Dabei muss beachtet werden, dass die chemische Verschiebung von
Aminosäuren in Peptiden je nach Peptidzusammensetzung z.T. relativ weit streut, und die
tabellierten Werte deshalb nur als Richtwerte zu sehen sind. Es ist bei der Diskussion der Sequenz
auch zu beachten, dass die Signale von den -H-Atomen für die Aminosäure am C-Terminus
(meist) stärker Tieffeld-verschoben sind (also zu größeren ppm-Werten). Da die NMR-Messungen
im Rahmen des Praktikums in D2O durchgeführt wurden, sind austauschbare H-Atome (also N-H,
O-H) nicht beobachtbar. Aus den NMR-Daten soll versucht werden, die Primärstruktur des
Dipeptids abzuleiten.

Anmerkungen: Bitte beachten Sie, dass die tabellierten Werte für freie Aminosäuren gelten und die
entsprechenden Werte für Aminosäuren gebunden in einem Peptid abweichen können. Generell ist
die Zuordnung der Signale aus einem eindimensionalen Spektrum durch Vergleich mit tabellierten
Verschiebungsdaten limitiert in Bezug auf die Aussagegenauigkeit (z.B. auf Grund von pH-,
Temperatur- oder Konzentrationseffekten auf die chemische Verschiebung) und in Bezug auf die
Molekülgröße (Signalüberlagerungen im eindimensionalen Spektrum). Nur im Falle von wenigen
Aminosäureeinheiten in Peptiden (z.B. Dipeptid) können aus eindimensionalen Daten belastbare
Strukturinformationen erhalten werden.
62

Tabelle: Chemische Verschiebungen der 1H-NMR Signale von freien Aminosäuren in ppm. Es
sind Aminosäuren aufgeführt, die in der Analysensubstanz auftreten können)
63
64

Im Falle von größeren Peptiden oder Proteinen gelingt die Auflösung und damit Zuordnung
überlagerter Signale durch Anwendung spezieller NMR-Experimente unter Einbeziehung weiterer
Frequenzdimensionen (zwei-, drei- oder vierdimensionale NMR-Spektroskopie). Im Allgemeinen
erfolgt im ersten Schritt der NMR-Analyse die Einteilung der Signale in sog. Spinsysteme (d.h. in
Atome bzw. Kernspins, die gekennzeichnet sind durch gegenseitige Wechselwirkung über
Bindungen im Atomgerüst = skalare Kopplung). Ein häufig angewandtes Experiment zur Einteilung
der Signale auf Aminosäureeinheiten ist das sog. zweidimensionale TOCSY-Experiment. Ein
Spinsystem umfasst hier häufig sämtliche 1H-Signale einer Aminosäure.
Das Erkennen von Spinsystemen in einem zweidimensionalen TOCSY-Spektrum ist am Beispiel
von Lys-Asp in der folgenden Abbildung gezeigt:
65

Abbildung: TOCSY-Spektrum von Lys-Asp in D2O. Spinysteme sind gekennzeichnet N-H


oder O-H Signale tauschen mit dem Lösungsmittel D2O aus und werden daher nicht
beobachtet

Die eingesetzte TOCSY-Spektroskopie ist ein sog. Homo-Korrelationsverfahren, bei dem identische
Kernarten (hier: 1H) aufeinander korreliert werden. In beiden Richtungen des zweidimensionalen
Spektrums ist die chemische Verschiebung der 1H-Kerne aufgetragen. Die Diagonale der
zweidimensionalen Matrix reflektiert das eindimensionale 1H-Spektrum des Dipeptids (hier
zusätzlich über beide Achsen projiziert). Die skalare Wechselwirkung von 1H-Kernspins wird von
den zur Diagonale symmetrischen Signalen, den sog. Kreuzsignalen, reflektiert. Signale auf der
Diagonale, die über Kreuzsignale verknüpft sind, umfassen ein zusammenhängendes Spinsystem (in
der Abbildung markiert). Im Falle des TOCSY-Experiments umfasst ein Spinsystem 1H-Atome, die
durch skalare Kopplung (über Bindungen) in einem zusammenhängenden Netzwerk verknüpft sind
(siehe Abbildung). Skalare Kopplungen über quartäre C-Atome sind klein und werden im TOCSY-
Experiment in der Regel nicht beobachtet.
66

Abbildung: TOCSY-Transfer am Beispiel von Lys-Asp in D2O, gekennzeichnet durch Pfeile

In Falle eines COSY-Spektrums können nur die direkten Nachbarn in einem Spinsystem korreliert
werden, sodass ein gegebenes Spinsystem über die COSY-Korrelationen weiter zugeordnet werden
können. Im Falle von einfachen Spinsystemen in Aminosäuren reicht häufig das COSY-Spektrum
bereits für eine eindeutige Strukturzuordnung aus.

Abbildung: COSY Spektrum von Ala-Ser mit dem entsprechenden 1D-Spektrum als
Projektion

Im Rahmen des Praktikums sollen zweidimensionale COSY- und TOCSY-Spektren der


67

Analysensubstanz (unbekanntes Dipeptid) analysiert werden. Die durch Vergleich mit tabellierten
Verschiebungswerten aus dem eindimensionalen Spektrum vermutete Signalzuordnung soll
bewiesen werden durch Analyse von Spinsystemen in den zweidimensionalen Experimenten.

Durchführung der NMR Aufgabe:

Sie bearbeiten das 1H-NMR Spektrum eines unbekannten Dipeptids. Mit Hilfe des
eindimensionalen Spektrums, den zweidimensionalen COSY- und TOCSY Spektren soll die
Zusammensetzung des Dipeptids ermittelt und protokolliert werden.

Eindimensionales 1H-NMR Spektrum:


Die NMR-Messung erfolgte im vollautomatischen Messbetrieb bei 500 MHz in D2O als
Lösungsmittel. Sie erhalten von Ihrem Assistenten ein gedrucktes Spektrum mit expandierten
Signalen.

Folgende Datenanalyse soll in Form einer Tabelle aus dem Spektrum erstellt werden:
- Chemische Verschiebung von Signalen (Signale in laufenden Nummern von links nach rechts in
der Tabelle von oben nach unten anordnen; hierzu den Schwerpunkt eines Multipletts verwenden)
- Multiplizität von Signalen (Singulett, Dublett, etc.)
- Vorgeschlagene Zuordnung durch Vergleich mit tabellierten Daten von Aminosäuren
(Mehrfachnennung möglich falls keine eindeutige Zuordnung möglich ist).

Beispiel einer Ergebnistabelle für die NMR-Analyse. Die beiden letzten Spalten werden nach
Analyse des zweidimensionalen TOCSY-Spektrums (siehe unten) ausgefüllt.

Signal- chemische Multiplizität Spinsystem- Spinsystem- Signalzuordnung


Nr. Verschiebung Nr. im Nr. im
(ppm) TOCSY COSY

Zweidimensionales COSY- und TOCSY-Spektrum:


Die Datenanalyse soll erfolgen durch Kennzeichnung aller beobachteten Spinsysteme im Spektrum
(siehe Abbildung oben) und Ergänzung der Ergebnistabelle aus dem eindimensionalen Spektrum
durch Einteilung der Signale in Spinsysteme (in laufenden Nummern). Die Analyse der Spinsysteme
soll dokumentiert werden in einer abschließenden Signalzuordnung. Bitte vergessen Sie nicht, Ihren
Strukturvorschlag (inkl. Sequenz) anzugeben!
68

 Versuch: Strukturbestimmung eines Dipeptids mittels GC/MS


Sie sollen das bereits durch die NMR Spektroskopie untersuchte Dipeptid weiter durch GC/MS
analysieren. Dabei soll der Strukturvorschlag verifiziert und insbesondere die Sequenz abgesichert
werden. Um Dipeptide mittels GC-MS analysieren zu können, müssen diese erst derivatisiert
werden, d.h., die polaren, funktionellen Gruppen werden mit einer unpolaren Schutzgruppe
verknüpft. Hier eignet sich besonders Trimethylsilan (TMS). Während der Trimethylsilylierung
formen Dipeptide, die N-terminales Aspartat enthalten, normalerweise zyklische Imide und manche
Gly-X ( X = Gly, Ala, Met, Glu, Gln) bilden Diketopiperazine.

Durchführung der GC/MS Aufgabe:

Anhand der Masse können sowohl die Aminosäuren als auch die Sequenz identifiziert werden. Es
entstehen hauptsächlich 2 Fragmente bei der Ionisierung. Zum einen durch den Bruch der zentralen
CH-CO Bindung in der N-terminalen Aminosäure (Fragment a in Abb.), zum anderen durch den
Verlust einer (manchmal auch zwei) Methylgruppe von den TMS-Resten des Molekülions
(Fragment b in Abb.).
Berechnen Sie zunächst die Masse des derivatisierten (alle freien OH und NH2 Gruppen besitzen
TMS-Reste) Dipeptids (identifiziert durch die NMR-Spektren) und suchen sie nach der
entsprechenden Masse (minus 1 oder 2 mal Masse von CH3, Fragment b) im Massenspektrum.
Suchen Sie nach der Masse von Fragment a und sichern Sie dadurch die (durch NMR) postulierte
Sequenz ab. Dokumentieren Sie Ihre Ergebnisse möglichst genau.

Abbildung: Schematische Fragmentierung der Dipeptide durch Ionenstoß Ionisierung


69

11 Anhang: Photometrie
Das Photometer ist ein wichtiges und zugleich sehr genaues Messinstrument im Laborbetrieb. Man
unterscheidet

 Filterphotometer, bei denen man nur Messungen bei einer begrenzten Zahl von Wellenlängen,
entsprechend den vorhandenen Filtern, ausführen kann
 Spektralphotometer, bei denen eine beliebige Wellenlänge eingestellt werden kann.

Es sei I0 die in eine Messzelle eingestrahlte Lichtintensität und I die durchgelassene Intensität. Unter
der Absorption einer Messprobe bei einer bestimmten Wellenlänge versteht man den Anteil des von
der Probe absorbierten Lichts in %. Es gilt:
I 0 I
Absorption   100 (% ) Gleichung 11-1
I0

wo I0 = eingestrahlte Intensität und I = von der Probe durchgelassene Intensität.

Meistens benützt man jedoch eine logarithmische Messgröße, die sogenannte Extinktion (E). Sie ist
folgendermaßen definiert
I0
E  log Gleichung 11-2
I

Sie ist direkt proportional zu der Konzentration der gemessenen Substanz, entsprechend dem
Lambert-Beer‘schen-Gesetz
E   cd Gleichung 11-3

wobei
  molarerExtinktionskoeffizient ( l  mol
-1 -1
 cm ),
1
c  Konzentration ( mol  l ),
d  Schichtdicke (cm ).

Der Extinktionskoeffizient ist wellenlängenabhängig.

Meist werden Extinktionsmessungen an Lösungen ausgeführt (aber auch an Reinsubstanzen oder


Gasen). Bei allen Messungen muss deshalb der Extinktionsbeitrag des Lösungsmittels
berücksichtigt werden. Man bestimmt die Extinktionsdifferenz zwischen Lösung und reinem
Lösungsmittel (E). Die Konzentration der gelösten Substanz ergibt sich dann aus
E
c Gleichung 11-4
 d

Praktisch verfährt man meist so, dass man zunächst das reine Lösungsmittel mißt und diesem durch
entsprechende Einstellung des Photometers die Extinktion 0 zuordnet.
Zur Messung füllt man das Lösungsmittel bzw. die Messprobe in eine sogenannte Messküvette. Im
Praktikum steht ein Spektralphotometer zur Verfügung, das mit Messküvetten aus Polystyrol
(Schichtdicke 1 cm) arbeitet.
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Die optischen Flächen der Messküvetten sollten sehr sauber gehalten werden. Fingerabdrücke und
Schmutz verfälschen die Messungen. Will man Messungen im UV–Spektralbereich unterhalb 320
nm durchführen (mit dem im Praktikum vorhandenen Gerät nicht möglich), so können Küvetten aus
Polystyrol nicht verwendet werden, da sie UV–Licht nicht durchlassen. Stattdessen verwendet man
Küvetten aus Quarz.

11.1 Bedienungsanleitung des Novaspec II – Photometers


Das Novaspec II Photometer wird durch Drücken des ON/OFF–Schalters an der Rückseite des
Gerätes eingeschaltet. Nach Beendigung des nun einsetzenden automatischen Kalibrierungspro-
grammes steht die Wellenlängenanzeige auf 360 nm und die „Abs“–Anzeige (engl. absorbance =
Extinktion) leuchtet auf (Probeneinführung muss geschlossen sein). Das Photometer ist nun
betriebsbereit.
Achten Sie darauf, dass im Anzeigenfeld die „Abs“–Anzeige während der gesamten Messung
aufleuchtet. Andernfalls kann durch Drücken der „MODE“–Funktionstaste diese eingestellt werden.

11.1.1 Extinktionsmessung bei einer konstanten Wellenlänge


1) Durch leichtes Drücken der Funktionstasten „Wavelength -/+“ wird die gewünschte
Wellenlänge eingestellt.
2) Geben Sie das reine Lösungsmittel in eine Messküvette und führen Sie diese in den Küvetten-
halter ein. Schließen Sie den Deckel. Achtung: Die Küvetten nur an den geriffelten
Seitenflächen anfassen. Die glatten Küvettenseiten müssen in die Richtung des Strahlenganges
zeigen. (Für einen vor dem Gerät stehenden Betrachter weist der Strahlengang senkrecht auf den
Betrachter zu.)
3) Durch Drücken der „SET–REF“-Taste wird das Photometer für das jeweilige Lösungsmittel auf
Null–Absorption eingestellt.
4) Entnehmen Sie die Küvette mit dem reinen Lösungsmittel.
5) Setzen Sie eine Küvette mit der Messlösung ein und schließen Sie die Abdeckung. Lesen Sie
den Messwert im Anzeigenfeld ab und notieren Sie ihn.
6) Um weitere Messungen bei der gleichen Wellenlänge durchzuführen wiederholen Sie Punkt 5.

11.1.2 Aufnahme eines Spektrums


Hierfür müssen Sie zunächst das Photometer innerhalb des gesamten Wellenlängenbereichs gegen
das Lösungsmittel abgleichen. Das Novaspec II Photometer ermöglicht dies durch automatische
Speicherung einer Basislinie. Setzen Sie eine mit dem reinen Lösungsmittel gefüllte Küvette in das
Photometer ein. Halten Sie beide Wellenlängen–Tasten gleichzeitig gedrückt. Auf dem Display
erscheint nach kurzer Zeit „Scn“. Drücken Sie die Tasten, solange bis „5-6“ auf dem Display
erscheint und lassen Sie diese dann los. Das Instrument fährt jetzt den gesamten
Wellenlängenbereich in 1 nm Intervallen ab und speichert den Referenzwert für jede Wellenlänge.
Nach einigen Minuten erscheint auf dem Display wieder die vorher eingestellte Wellenlänge. Setzen
Sie jetzt Ihre mit Standardlösung gefüllte Küvette ein und bestimmen Sie die Extinktion bei der
niedrigsten Wellenlänge. Notieren Sie in Schritten von jeweils 5 nm die weiteren Extinktionswerte.
Zeichnen Sie die Extinktion als Funktion der Wellenlänge (Millimeterpapier; Abszisse:
Wellenlänge, Ordinate: Extinktion) und bestimmen Sie aus der Graphik das Absorptionsmaximum
(in nm) Ihrer Probe.
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11.1.3 Bestimmung der zeitabhängigen Extinktion (Kinetik)


Für die Versuche mit einer zeitabhängigen Änderung der Extinktion bietet das Gerät die
Möglichkeit, den genaueren Extinktionswert in Zeitintervallen (15, 30 oder 60 Sekunden) exakt
abzulesen. Gehen Sie folgendermaßen vor:

1) Stellen Sie die entsprechende Wellenlänge ein und bestimmen Sie den Nullwert (s.o.)
2) Drücken Sie die Taste „FUNCTION“ solange bis eine der Zeitfunktionen erscheint:

linkes Anzeigenfeld rechtes Anzeigenfeld


Fn 3 t 15 = 15 s Intervall
Fn 4 t 30 = 30 s Intervall
Fn 5 t 60 = 60 s Intervall
Die jeweilige Funktion wird am Versuchstag angegeben.

3) Drücken Sie die Taste „MODE“: Im rechten Anzeigenfeld erscheint ein kleines „r“ hinter der
Intervallangabe. Das Gerät zeigt dann nach jedem Intervall die Gesamtextinktion an (falls „r“
nicht erscheint, wird nur die Differenz zwischen zwei Intervallen angezeigt!).
4) Setzen Sie Ihre Küvette ein und schließen Sie den Deckel.
5) Starten Sie die Messung durch Drücken der Taste „PRT/ENT“: Im rechten Anzeigenfeld
erscheint die Anfangsextinktion, im linken Anzeigenfeld erscheinen abwechselnd das
Zeitintervall (t 15 etc.) und die Nummer des Messwertes (beginnend mit 000). Im Abstand des
gewählten Intervalls ändern sich die Werte entsprechend (Zeittakt: 5 s innerhalb eines
Intervalls). Notieren Sie sich die Nummer des Messwertes und den entsprechenden
Extinktionswert.
6) Um die Zeitfunktion zu stoppen, drücken Sie solange auf die „FUNCTION“–Taste, bis im
linken Anzeigenfeld „Fn 0“ aufleuchtet und anschließend auf „PRT/ENT“. Das Gerät befindet
sich dann wieder im Normalmodus.

11.2 Bedienungsanleitung des Ultrospec 1000 – Photometers


Nach dem Einschalten des Ultrospec 1000 Photometers den Küvettenhalter freimachen und mit der
Funktionstaste F2 quittieren. Bitte warten Sie die nun folgende Gerätekalibrierung ab (Dauer: ca.
2 Minuten).

11.2.1 Extinktionsmessung bei einer konstanten Wellenlänge

1) Mit der Funktionstaste F2 die Menüliste und auf dem Ziffernfeld Modus 1 anwählen
(absorbance = engl. Extinktion).
2) Taste  drücken, die gewünschte Wellenlänge auf dem Ziffernfeld eingeben und mit der
Funktionstaste F3 (  ) bestätigen.
3) Referenzküvette in das Gerät stellen und Taste drücken.
4) Die zu messende Probe(n) gegen die Referenz austauschen und die Extinktion(en) notieren.

Soll bei einer veränderten Wellenlänge gemessen werden, muss man die neue Wellenlänge (wie
vorher beschrieben) eingeben. Nach dem Referenzabgleich können dann die Probenmessungen
ausgeführt werden.
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11.2.2 Aufnahme eines Absorptionsspektrums in einem vorgegebenen Wellenlängen-


bereich

1) Mit der Funktionstaste F2 die Menüliste und auf dem Ziffernfeld Modus 5 anwählen
(wavescan).
2) Startwellenlänge eingeben und mit der Funktionstaste F3 (  ) bestätigen.
3) Endwellenlänge eingeben und mit der Funktionstaste F3 (  ) bestätigen.
4) Der Bildschirm zeigt nun an: OUTPUT TO DISPLAY. Mit drücken auf F3 (  ) weiter.
5) Die Referenzküvette in das Gerät stellen und die Taste drücken.

Das Gerät gleicht jetzt die Basislinie im vorgewählten Wellenlängenbereich ab. Danach muss der wavescan-
Modus verlassen werden und manuell im absorbance-Modus die Extinktionen der Probe gemessen und notiert
werden. Die wellenlängenabhängige Messung einer Referenzprobe entfällt, da bereits die Basislinie (s.o.) vom
Gerät abgespeichert wurde.

6) F1 (ESCape) drücken. Der Wavescan-Modus wird verlassen.


7) Dazu mit der Funktionstaste F2 die Menüliste und auf dem Ziffernfeld Modus 1
anwählen.
8) Die Referenz gegen die zu messende Probe austauschen.
9) Taste  drücken, die gewünschte Wellenlänge auf dem Ziffernfeld eingeben, mit der
Funktionstaste F3 (  ) bestätigen und die Extinktion notieren.
10) Es schließt sich jetzt der manuelle Scan über den vorgegebenen Wellenlängenbereich der zu
messenden Probe an. Zur Messung der nächsten Wellenlänge weiter bei 9).

11.2.3 Bestimmung der zeitabhängigen Extinktion (Kinetik)

1) Mit der Funktionstaste F2 die Menüliste und auf dem Ziffernfeld Modus 4 anwählen
(time intervalls).
2) Taste  drücken, die gewünschte Wellenlänge auf dem Ziffernfeld eingeben, mit der
Funktionstaste F3 (  ) bestätigen.
3) Zeitintervall (sec) eingeben und mit der Funktionstaste F3 (  ) bestätigen.
4) Referenz mit F3 (  ) aufrufen, Referenzprobe in das Gerät stellen, die Taste drücken,
und die Referenzprobe entfernen.

Das Gerät ist nun für eine Kinetikbestimmung messbereit. Ab jetzt ist zügig zu arbeiten!

5) Die mit der gestarteten Reaktionslösung gefüllte Küvette unverzüglich in das Gerät stellen
und die Messung mit der Taste starten.

6) Protokollieren Sie E = f(t). Stellen Sie auch gleichzeitig den Extinktionsverlauf graphisch
dar.
7) Mit drücken der Taste F1 (ESCape) wird die Messung beendet. Damit ist das Gerät wieder
für eine nächste Kinetikmessung (unter den gleichen Versuchsparametern) messbereit.
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12 Anhang: pH– und Spannungsmessung

12.1 pH–Messung
1) Messkette an das Messgerät anschließen, und an der Messkette den Verschlussschieber der
Nachfüllöffnung öffnen.
2) Messgerät mit einschalten.
3) Meßsystem kalibrieren bzw. überprüfen.
a) Mit pH-Messmodus und mit Cal-Verfahren wählen (mit AutoCal TEC arbeiten)
b) Messkette in die erste Pufferlösung tauchen (mit Standardpuffer pH 4,01 und pH 7,00
kalibrieren).
c) Taste drücken, AR blinkt – stabilen Meßwert abwarten.
d) Messkette spülen.
e) Messkette in die zweite Pufferlösung tauchen.
f) Taste drücken, AR blinkt – stabilen Messwert abwarten.
g) Zurück zum Messmodus: Taste drücken
4) Messkette in das Messmedium eintauchen.
5) Messmodus mit auswählen.
Im Display erscheint der pH-Wert bzw. die Redoxspannung (mV) der Messlösung.
6) Am Ende der Messungen zur Aufbewahrung der Messkette den Verschlussschieber wieder
schließen, die mit 3 M KCl gefüllte Wässerungskappe anbringen und senkrecht auf-
bewahren.

Beim Wechsel von einer Messlösung/Kalibrierpuffer zur nächsten sollte nach dem Abspülen der
Elektrode diese mit weichem, sauberem Fließpapier (z. B. Papiertaschentuch) vorsichtig trocken
getupft werden.

12.2 Spannungsmessung
Am Gerät sind mit den Kabeln die Eingänge pH/U und Ref zu belegen. Gerät einschalten und mit
den mV-Modus wählen.
Die Kabel können jetzt mit Hilfe der Klemmen an die zu messende Spannungsquelle angeschlossen
werden. (Der pH/U Eingang am Gerät ist der + Pol.)
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13 Anhang: Gerätekunde
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